CN113234735A - 杨树PtNF-YC1基因及其在促进植物提前开花中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杨树PtNF‑YC1基因，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。本发明还提供了杨树PtNF‑YC1基因在提前植物开花中的应用。应用杨树PtNF‑YC1基因序列，可以促进杨树提前开花，从而加快杨树的育种进程。

Description

杨树PtNF-YC1基因及其在促进植物提前开花中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杨树PtNF-YC1基因及其在促进植物提前开花中的应用。
背景技术
NF-Y(nuclear factor-Y)作为一类重要的转录因子，普遍存在于真核生物中，也被称为亚铁血红素激活蛋白。它由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成。通常形成异源二聚体或三聚体来发挥作用，一类是由NF-YC和NF-YB在细胞质中结合，然后转移至细胞核中，与NF-YA形成异源三聚体进而结合下游基因表达；另外由NF-YC和NF-YB先形成异源二聚体，并与特定转录因子形成复合物来发挥作用。NF-Y转录因子参与了植物的整个生长发育过程，如胚胎形成、种子萌发、根的伸长、开花时间、果实成熟等过程。开花是植物从营养生长转变为生殖生长的重要标志。目前，关于拟南芥的开花调控网络已十分清晰。然而，对于木本植物花发育调控分子机制的研究相对较为薄弱。毛白杨作为一类重要的乡土树种，在生态保护、城乡绿化、工业用材中都具有重要作用，但是它具有较长的童期，严重影响了杨树的育种进程。针对以上问题，本发明选取了毛白杨作为材料，来探讨杨树PtNF-YC1基因的功能在开花调控中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杨树PtNF-YC1基因，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。
在一个实施方案中，所述杨树PtNF-YC1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明还提供了含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
在一个实施方案中，上述重组菌为将上述基因插入表达载体得到的重组菌。
本发明还提供了一种提前植物开花的方法，该方法包括上述基因导入到植物细胞中，得到转基因植株。
进一步地，本发明还提供了杨树PtNF-YC1基因在提前植物开花中的应用，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。
在一个实施方案中，上述杨树PtNF-YC1基因的成熟序列为SEQ ID NO：1。
在一个实施方案中，上述植物为拟南芥或烟草；优选地，所述植物是拟南芥。
在一个实施方案中，将杨树PtNF-YC1基因连接到载体上，有利于转化实现，因此上述应用包括：将所述杨树PtNF-YC1基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。
本发明还提供了杨树PtNF-YC1基因在提前植物开花中的应用。应用杨树PtNF-YC1基因序列，可以促进杨树提前开花，从而加快杨树的育种进程。
附图说明
图1为杨树叶片的总RNA提取电泳图；
图2为毛白杨PtNF-YC1基因克隆的电泳图；
图3为毛白杨PtNF-YC1基因的表达载体菌液PCR检测和双酶切鉴定；
图4为转PtNF-YC1基因的拟南芥DNA水平的PCR检测；
图5为转PtNF-YC1基因的拟南芥和野生型的转录水平；
图6为转PtNF-YC1基因的拟南芥的蛋白检测；
图7为转PtNF-YC1基因的拟南芥和野生型的开花对比；
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.材料
1.1实验材料
实验材料取自山西省林业和草原科学研究院实验室，一年生的毛白杨叶片，时间2019年10月份，样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。拟南芥野生型种子使用哥伦比亚生态型(Columbia-0)。
1.2实验试剂与仪器
DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自北京天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700 PCR仪，荧光定量PCR仪为7500fast。
1.3引物合成及测序
引物合成及测序均由北京睿博生物科技公司完成。
2.方法
2.1杨树叶片总RNA的提取(改良后的CTAB法)
(1)在2ml离心管中加入800ml CTAB和30ml的β-巯基乙醇，放入65℃水浴锅中预热；
(2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，将磨好的样品分装于预热好的离心管中，每管大概300mg，涡旋仪上涡旋混匀。然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀，加热20-30min；
(3)在加热好的混合物中加入等体积的酸性饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混合均匀后12000rpm离心10min；
(4)将离心后的上清液转入新的2ml离心管中，然后再加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，上下颠倒混匀后12000rpm离心10min；
(5)重复第4步一次；
(6)第5步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，然后加入0.6ml的异丙醇，此时能看到一些白色的沉淀。上下颠倒混匀后放入-20℃冰箱中冷冻过夜；
(7)第二天将冷冻过夜的离心管在4℃条件下12000rpm离心15min，完成后将液体倒掉，再加入65℃预热好的SSTE 0.5ml，待沉淀溶解完全后再加入0.5ml的酸性饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后12000rpm离心10min；
(8)将离心后的上清液转移至新的离心管中，再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)。混匀后12000rpm离心10min；
(9)重复第8步一次；
(10)将上清液分装到1.5ml的离心管中，然后加入3倍体积的无水乙醇和1/3体积的10mol/L的醋酸钠(NaAc)，混匀后放入-70℃冰箱中冷冻3h以上；
(11)冷冻完成后-4℃12000rpm离心20min收集沉淀；
(12)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75％乙醇0.5ml；将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子；
(13)12000rpm离心10min后，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据沉淀的量加入100μl DEPC水将沉淀溶解。
2.2cDNA合成
使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：
cDNA的合成将相应试剂加入PCR离心管中，进行反转录反应，体系如下：
Figure BDA0003103360020000041
混合后在金属浴中70℃反应5min，随后冰浴5min，低速离心10s，再按照下表混合。
Figure BDA0003103360020000042
将第一步反应好的溶液与之后的混合液混合，置于PCR仪中，37℃下反应15min，短暂离心即可用于PCR反应。
2.3基因序列的引物设计
依据杨树PtNF-YC1的基因序列SEQ ID NO：1(766bp)，使用Primer Primer5.0设计引物，
表1 PtNF-YC1克隆引物
Figure BDA0003103360020000043
2.4PCR扩增反应
以杨树cDNA为模板扩增，反应体系如下：
Figure BDA0003103360020000051
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性25s，57℃退火30s，72℃延伸1min。34个循环后，72℃延伸5min。PCR反应完成后4℃暂时保存。
2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
将PCR反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并将检测结果的目的条带切胶回收。利用北京天根公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶不完全；
(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例加入Buffer B2；
(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为止；
(4)当目的片段<500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若≥500bp，则此步骤可以省略；
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000rpm离心30sec，倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中；
(6)加入500μL Wash Solution，9000rpm离心30sec，再次倒掉收集管中的液体；
(7)重复一次步骤6；
(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000rpm离心1min，扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mL EP管中；
(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min，为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果；
(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O，室温静置5min，9000rpm离心1min。1.5mLEP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。
2.6DNA回收片段与pGEMT-Easy载体连接
根据pGEMT-Easy载体使用说明书，在无菌的PCR反应管中将质粒载体与回收DNA片段进过夜连接，反应体系如下：
Figure BDA0003103360020000061
轻轻混匀后16℃过夜连接并转化至Top10大肠杆菌感受态。
2.7连接产物转化DH5α感受态
转化感受态具体操作步骤如下：取出适量Top10感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内将连接产物与感受态融合，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰上30min。42℃水浴中热激90s，并迅速放入冰中冰浴2min，使细胞膜关闭。在无菌条件下，加入500μL无抗LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min，弃掉上清，留100μL即可，并吹打混匀，涂于氨苄抗性平板，37℃导致培养14h-16h。
2.8重组子的筛选和鉴定
用白色枪头挑取白色单菌落分别置于含有800μL LB培养基(含相应抗生素)的离心管中，37℃振荡培养5-7h左右进行培养，并进行PCR检测，将检测结果送北京睿博生物科技公司进行测序检测。利用BLAST、DANMAN等软件对序列进行分析，最终确定克隆序列。
2.9超表达载体的构建
(1)用限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ同时对PtNF-YC1和空载体Super1300-GFP进行双酶切，酶切反应体系如下(50μl)：
Figure BDA0003103360020000062
37℃条件下酶切3-4h,反应结束后电泳检测并回收片段、测定浓度。
(2)将回收的目的片段和载体片段进行连接，体系如下：
Figure BDA0003103360020000071
进行转化和菌检，得到正确的阳性克隆，提取测序结果正确的菌株质粒，待用。
2.10农杆菌转化
(1)将GV3101农杆菌感受态在冰上融化，在融化的感受态细胞中加10μl质粒；
(2)液氮速冻5min，迅速置于37℃水浴5min，最后再冰浴5min；
(3)加入500μl无抗YEB液体培养基并在28℃下震荡培养3h；
(4)取100μl菌液涂板，并置于在28℃条件下倒置培养36-48h；
(5)最后对转化结果进行PCR鉴定，并将正确的单菌落摇菌培养后以菌液和50％甘油1:1体积保存于-80℃冰箱。
2.11亚细胞定位分析
(1)将所有观察定位的载体进行摇菌培养，对于注射烟草的菌液OD 600值通常为1左右；
(2)将各个质粒的菌液分别以5000rpm，2min离心集菌，在富集后的菌体中分别加入烟草转化液(15μM AS，10mM MES，10mM MgCl 2)重悬菌体，OD600的值调至1左右，并在室温下静置2小时以上；
(3)用去掉针头的1ml注射器，吸取菌液并注入叶片表面，注射后做好标记，暗处理24小时后移至光照培养箱培养，通常注射3-5天后的烟草即可观察；
(4)观察时剪下注射孔周围的叶片，下表面朝上进行制片，置于激光共聚焦显微镜下观察结果。
2.12拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选
2.12.1拟南芥的种植
(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中；
(2)4℃冰箱避光春化处理2天；
(3)4天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lx，光照12小时，黑暗8小时；
(3)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。
2.12.2拟南芥的遗传转化
(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板，划线以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为橙色，测其OD值达到1.2时停止培养；
(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体；
(3)浸花法转化拟南芥。
a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约10-20秒；
b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时；
c.第二天，放置正常条件下继续培养；
d.收获拟南芥种子，干燥。
2.12.3拟南芥转基因种子的筛选及种植
(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照；
(2)4℃避光春化处理2天；
(3)4天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则避光培养；
(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长；
(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养；
(6)观察对照拟南芥(野生型拟南芥)和转杨树PtNF-YC1基因的拟南芥的生长开花情况，并统计开花时间以及莲座叶数目。
3.实验结果
3.1杨树叶片的总RNA提取
首先提取毛白杨叶片总RNA并对其中的mRNA进行了纯化，并通过1％琼脂糖电泳进行纯化，结果见图1，具有28S RNA和18S rRNA条带，表明提取的总RNA很完整，基本没有降解。并通过，测定提取RNA的浓度为800ng/ul,可用于后续实验。
3.2杨树PtNF-YC1基因克隆和载体构
依据毛白杨PtNF-YC1基因的引物序列，以毛白杨的cDNA为模板进行基因克隆(图2)，进行表达载体的构建，将杨树PtNF-YC1序列连接到pSuper-1300表达载体上，转化到Top10感受态细胞中，同时对其进行菌液PCR检测，菌液PCR检测的条带单一(图3)；将连接成功的单克隆提取质粒，转化到农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对杨树PtNF-YC1转基因拟南芥植株进行抗性筛选，将筛选出的转基因拟南芥体取DNA，进行PCR检测(图4)，并进一步对其转录水平(图5)和蛋白水平(图6)进行观察和分析，结果发现转基因植株的表达水平明显高于野生型植株。此外，通过对其亚细胞定位观察显示PtNF-YC1在细胞核和细胞膜均中明显表达。
3.3杨树PtNF-YC1转基因拟南芥鉴定及表型观察
观察野生型拟南芥和转杨树PtNF-YC1基因的拟南芥在2020年4月20日-2020年4月30日期间开花情况发现(图7)，转杨树PtNF-YC1基因比野生型拟南芥提早开花一周。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 山西省林业和草原科学研究院
<120> 杨树PtNF-YC1基因及其在促进植物提前开花中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 766
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacaaca ccaccaccaa tcaccagcct cagcccacgg catacccaac gcaatccatc 60
accaccactc caccactacc tccagcaggt ggagcaccat cctcaacccc attccaccac 120
ctcctccaac aacaacagca gcaacttcaa atgttttggt cttaccaacg tcaagaaatt 180
gaacaagtta atgatttcaa gaaccatcaa ctccctttag caagaatcaa gaaaatcatg 240
aaagctgacg aggatgtgcg catgatctct gctgaagcac ctattctctt tgctaaagca 300
tgtgagcttt tcattttaga actgacaatt cgttcttggc ttcacgctga ggaaaacaag 360
agaaggactt tacagaagaa tgacattgct gctgctatta caagaactga catttttgat 420
ttcttggttg atattgtacc tagagatgag atcaaagagg aagctgctgg tcttggtgga 480
attgtcggtg ctacggctag tggggtgcca tattattacc ctccgatggg acagcctgcc 540
gctgccactg gagggatgat gatcggaagg ccagccatgg atcctgccac tggggtgtat 600
gttcaaccac cttctcaggc ttggcagtct gtttggcaga cagctgccac cgaagatggt 660
tcttatggga gtggtggtgc tagtggtgga caagggaatc ttgatggaca agattaagct 720
tctcggatgc agaggtgcga cagaggctaa caagggcctt ggctaa 766
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggacaaca ccaccaccaa 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttagccaagg cccttgttag c 21

Claims (9)

1.一种杨树PtNF-YC1基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述杨树PtNF-YC1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
3.含有权利要求1所述的基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.一种提前植物开花的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1所述的基因导入到植物细胞中，得到转基因植株。
5.杨树PtNF-YC1基因在提前植物开花中的应用，其特征在于，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杨树PtNF-YC1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述杨树PtNF-YC1基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。
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