CN109355297B - 铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛DcWOX4基因，该DcWOX4基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。本发明还提供了一种提高植物茎分蘖的方法及上述的DcWOX4基因在提高植物茎分蘖中的应用。依据铁皮石斛WOX4基因在模式植物拟南芥中过表达的表现型观察与统计，应用DcWOX4，有望调控铁皮石斛的分蘖数，使得铁皮石斛的分枝增多，提高最具药用价值的枝条数量。

Description

铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用

技术领域

本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用。

背景技术

铁皮石斛Dendrobium catenatum(或称为D.officinale)为兰科石斛属珍稀名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热之传统功效。铁皮石斛始载于《神农本草经》，为保健滋补之上品；唐代开元《道藏》则把其列为“中华九大仙草之首”，倍受历代医家和典籍推崇。2010版《中华人民共和国药典》特将其从药材石斛中单列出来独立标准；2018年浙江省更是将其确定为新“浙八味”中药材培育品种之首，体现其广泛的应用价值、市场潜力和社会效益。野生铁皮石斛生长环境苛刻，常附生于具丹霞地貌的悬崖峭壁上，喜温、湿、通风、半阴环境，且铁皮石解自交不育、种子无胚乳、萌发率极低，再加上民间毁灭性采挖与栖息地的破坏，使其野生资源极度稀缺并被列为国家二级保护中药材。20世纪90年代以来，随着铁皮石斛组培快繁和设施栽培等产业化关键技术的突破，铁皮石斛及相关产品已在全国，特别是浙江省，快速发展为百亿级产业。

WUSCHEL RELATED HOMEOBOX(WOX)家族是植物干细胞维持的主控因子，负责调控植物初生分生组织(茎尖和根尖分生组织)和次生分生组织(维管形成层)等各级干细胞的维持和分化，从而进一步影响器官分化和发育进程。在番茄中，SlWOX4过表达系表现出更高程度的复叶形态。因此，不同植物的WOX4基因除了拥有祖先的共同角色外，还进化出新的物种特异的功能。

铁皮石斛的药用部位主要是茎秆。铁皮石斛可以在基部通过分蘖产生新的枝条，枝条的多寡直接决定了铁皮石斛茎秆的产量。然而，铁皮石斛DcWOX4基因在植物发育中的功能尚未可知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用。

本发明提供了一种铁皮石斛DcWOX4基因，该DcWOX4基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。优选地，所述的DcWOX4基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述的DcWOX4基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

在一个实施方案中，上述的重组菌为将DcWOX4基因插入表达载体得到的重组菌。

另一方面，本发明还提供了一种提高植物茎分蘖的方法，该方法包括将上述的DcWOX4基因导入到植物细胞中，得到茎分蘖增多的转基因植株。

在一个实施方案中，上述植物为拟南芥。

在一个实施方案中，上述方法还包括：将包含所述DcWOX4基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。

本发明还提供了上述的DcWOX4基因在提高植物茎分蘖中的应用。

在一个实施方案中，上述植物为拟南芥。

本发明的优点在于，依据铁皮石斛WOX4基因在模式植物拟南芥中过表达的表现型观察与统计，应用DcWOX4，有望调控铁皮石斛的分蘖数，使得铁皮石斛的分枝增多，提高最具药用价值的枝条数量。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中的铁皮石斛幼苗中的总RNA；

图2为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4的基因克隆PCR后电泳检测；

图3为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4的中间载体菌液PCR后电泳检测；

图4为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4的中间载体重组质粒双酶切后电泳检测；

图5为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4的表达载体菌液PCR后电泳检测；

图6为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4的表达载体重组质粒双酶切后电泳检测；

图7为本发明的一个实施例中的铁皮石斛DcWOX4转基因拟南芥植株的抗性筛选；

图8为本发明的一个实施例中的野生型(WT)和铁皮石斛DcWOX4转基因拟南芥的分蘖数目统计；

图9为本发明的一个实施例中的观察到的野生型(WT)和铁皮石斛DcWOX4转基因拟南芥的表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.材料

1.1实验材料

铁皮石斛品种“晶品一号”幼苗采自浙江省杭州市临安区浙江农林大学温室大棚。样品采下后液氮速冻，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。拟南芥种子使用哥伦比亚生态型(Columbia-0)。

1.2实验试剂与仪器

DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和RNAiso plus试剂均为TAKARA品牌，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒均为TRANSGEN品牌，购自北京全式金生物技术有限公司。PCR仪为BIO-RAD S1000ThermalCycler PCR仪，超净工作台购自苏州净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.方法

2.1铁皮石斛的无菌苗晶品一号根中的总RNA的提取

采用CTAB+RNAiso plus法提取根中样品总RNA，步骤如下：

(1)在2mL离心管中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(2％CTAB，2％PVP-k30，0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，2M NaCl，0.025M EDTA(pH 8.0))，加入200μLβ-巯基乙醇；

(2)取-80℃保存的幼苗2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至白色粉末；

(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴20min，期间振荡3-5次；

(4)12000rpm4℃离心10min后取上清于新的2ml离心管中，加入等体积的10M LiCl混匀后放置于4℃冰箱，过夜；

(5)次日，打开40℃水浴，后将SSTE(1M NaCl，0.5％SDS，1mM EDTA(pH8.0)，10mMTris-HCl(pH 8.0))放入水浴中，离心机预冷到4℃，再将过夜的混合液12000rpm 4℃离心20min，得到沉淀；

(6)加入0.5mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，12000rpm 4℃离心5min，弃掉上清；(可以重复步骤6一次)；

(7)加入0.5mL的SSTE溶解沉淀，剧烈震荡，再加0.8mL的RNAiso plus，混合均匀后再加入200μL氯仿摇匀，12000rpm 4℃离心10min后取上清；

(8)取上清转入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀，12000rpm 4℃离心10min后取上清；

(9)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm 4℃离心10min加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，

(10)弃掉上清，加入0.5mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，12000rpm 4℃离心5min，弃掉上清；(可以重复步骤10一次)；

(11)4℃12000rpm离心5min，获得RNA沉淀；

(12)用10μL枪头尽量吸净残留的酒精，置于超净工作台中吹干，获得干燥的总RNA；加入适量DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用。

2.2cDNA第一链合成

使用TAKARA试剂盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：

(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:

(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)

(3)继续配置反应体系如下：

(4)缓慢摇匀。

(5)42℃反应30-60min。

(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。

(7)获得cDNA后，用DEPC水稀释5倍使用。

2.3基因序列的引物设计

依据铁皮石斛WOX4基因序列：

TAGTGGTAAGTATACCATGAAGTTTCAGCAGTTGGAATTAGCCTTTTTGAATAAAAATTCCTCAACGTCTTCTTCCTCTTCGTCTTCCTTGACTCTTGGATTTAAGCGTCTTCGGCCGGTCGTACCGGCTGCATCCACTGTCAAGCCTGTTACTTCTCTGGAACTCAAGAGCTTCAGCTTCTCTAAGGCTTCTTCCGCACCTCTGCAACATCAACATGTCACTCTGTCAGGAGGGGGAACAAGATGGAACCCAACTCAAGAACAGATAAGGAAACTAGAGTCACTCTACAATAGCGGGATGAGGACACCGAACGCCCAGCAGATCGAGAAGATAACTGCTGAGCTGATCAAACATGGAAGAATTGAAGGAAAGAATGTCTTCTACTGGTTCCAGAACCATAAGGCAAGGGAAAGGCAGAAGCAGAAGCGCAACGGTCTCCTCAGCCCCTCCTTGCCACCAGACTCAAACTTCTCTGAAACAAAGGGAGCTGAAGAGAAGAAGGAGAGTAGAGATGGGAGAAGCAAGAGGAGAAGCAGGAGTTGGGGAGTTGAGCTTGATCAGATTATTGAGTGCGGCGGTGATGACAGAGTAACACTCGAGCTCTTCCCTTTGCACCCGGAGAACATTAATGGAAATAACTACTTTTAA；

使用Primer Primer 5.0软件设计引物，正反向引物两端分别加上酶切位点BamHI和SalI，正向引物：5’-g|gatccATGAAGTTTCAGCAGTTGGAAT-3，

反向引物：5’-g|tcgacAAAGTAGTTATTTCCATTAATGTTC-3’，克隆所需序列。

2.4PCR扩增反应

以铁皮石斛cDNA为模板扩增，反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min。30个循环后，68℃延伸10min。PCR反应完成后16℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。

2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收

将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1x TAE(40mM Tris-HCl(pH8.3)，1mM EDTA，20mM冰乙酸)，核酸染料为Gel Red(Biotium)。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用TRANSGEN品牌的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：

(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入2mL离心管中。每个离心管先称量，其重量作为一个凝胶体积，每个胶块尽量不要超过600mg，否则可能将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露时间来降低对DNA的损伤。

(2)根据胶块的质量和浓度，加入3倍凝胶体积的Buffer GSB。

(3)置于40℃水浴10min，期间混匀3～5次直至胶块完全溶化为止。

(4)等待融化的凝胶块溶液恢复室温。

(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，静置5min，10,000g离心1min。倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)加入500μL Buffer WB，10,000g离心1min。再次倒掉收集管中的液体。

(7)重复一次步骤6。

(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，10,000g空离1min。扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mL EP管中。

(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果。

(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O。室温静置5min，10,000g离心1min。1.5mLEP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。

2.6 DNA回收片段与pEASY-Blunt Cloning Vector(TRANSGEN品牌)载体连接

根据pEASY-Blunt Cloning Vector载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片段进行连接，反应体系如下：

PCR克隆回收产物 4μL

pEASY-Blunt Vector 1μL

轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化Trans1-T1Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell感受态(TRANSGEN品牌)。

2.7连接产物转化感受态大肠杆菌

转化感受态具体操作步骤如下：取出适量Trans1-T1Phage ResistantChemically Competent Cell感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的50μL感受态细胞中加入上述连接混合液，并轻轻敲打混匀。置于冰上20-30min。快速平稳放入42℃水浴中30s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗性的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h，200rpm，使细胞复苏。室温下4000rpm离心5min，弃掉大部分上清(保留少许培养基，约100-150μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于卡那霉素(Kan)或氨苄(Amp)抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温育14h。

2.8重组子的筛选和鉴定

用高压蒸汽灭菌的竹签挑取平板上8个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有3mL LB培养基(含相应抗生素)的10mL离心管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊或者过夜培养，并对所有培养基浑浊的菌样进行菌检PCR以及1％琼脂糖凝胶电泳检测，菌检可以初步验证载体构建成功的菌液(可以先取1mL送上海生工测序)。

2.9提取重组质粒

使用TRANSGEN品牌的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取质粒。

(1)取过夜培养的菌液，10,000g离心1分钟，去上清(尽量吸尽)。如菌液量过大，可分多次离心收集。

(2)根据产品说明书，加入250μL无色溶液RB(含RNaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

(3)根据产品说明书，加入250μL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使尚体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透光变为透完蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

(4)根据产品说明书，加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

(5)12,000g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12,000g离心1分钟，弃洗脱液。如果溶液体积过大，可以多次加入柱中，重复操作。

(6)加入650μL溶液WB，12,000g离心1分钟，弃洗脱液。

(7)12,000g离心1-2分钟，彻底去除残留的WB。

(8)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(pH>7.0)(EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)。室温静置1分钟。

(9)10,000g离心1分钟，洗脱DNA，置于-20℃保存。

2.10双酶切鉴定

(1)将提取的重组质粒后用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，鉴定是否有目的条带。使用TAKARA的快切酶进行实验。

(2)酶切体系：30μL，具体如下：

(3)37℃恒温孵育30min。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测

将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1x TAE(40mM Tris-HClpH8.3，1mM EDTA，20mM冰乙酸)，核酸染料为Gel Red(Biotium)。紫外光检测电泳结果并拍照记录。如果实际条带位置与目的条带的预期位置相同，条带单一，则取10μL重组质粒送生工测序。

(5)利用BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。

2.11表达载体的构建

(1)将测序获得完全正确的序列，使用提取的质粒再次用TAKARA的快切酶BamHI和SalI双酶切中间载体和表达载体pCAMBIA1300-GFP。

(2)将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤与“2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收”相同，分别割胶回收，获得相应的条带，并且使用紫外分光光度计(ThermoNANODROP2000)测定回收产物的OD值浓度(ng/μL)，并且记录相应的体积(μL)。

(3)再用T4连接酶连接经过双酶切的pCAMBIA1300-GFP载体和DcWOX4基因片段，具体如下：

连接体系：5μL

10x T4DNA Ligase Buffer 0.5μL

基因片段：载体 5:1摩尔比(ng/bp)

T4DNA Ligase 0.5μL

16℃恒温孵育30-60min，也可以连接过夜。

(4)转化到大肠杆菌中，菌液PCR(PCR使用2x Taq Master Mix DNA聚合酶)检测后，挑选阳性菌落，继续过夜摇菌3-5mL，收获质粒。具体的操作步骤与“2.7连接产物转化感受态大肠杆菌”、“2.8重组子的筛选和鉴定”、“2.9提取重组质粒”相同。

(5)提取质粒重新酶切验证，具体的操作步骤与“2.9提取重组质粒”“3.0双酶切鉴定”相同，但是由于之前的酶切位点可能不存在了，因此具体的限制酶可能需要改变，不过此基因和pCAMBIA1300-GFP都有BamHI和SalI位点，因此限制内切酶不变。

2.12转化农杆菌

2.12.1转化农杆菌感受态

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态(GV3101Chemically Competent Cell，上海唯地生物技术有限公司)于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)每100μL感受态加入0.01-1μg质粒DNA(转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手轻弹管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

(3)加入700μL无抗生素的LB(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)或YEP(1％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化钠)液体培养基，于28℃避光振荡(220rpm)培养2～3h。

(4)6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

(当平板只含有50μg/mL Kan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50μg/mL Kan，20μg/mL Rif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/mL Rif则需要28℃培养72-90h)。

2.12.2阳性菌的筛选与增殖(摇菌)

(1)小摇：在超净工作台内挑选LB或YEB平板上的单菌落2-3个，添加入4mL的含有50μg/mL Kan，25μg/mL Rif的LB或YEB液体培养基中，离心管用10mL的，28℃振荡避光培养24h。

(2)大摇：在超净工作台内挑选LB或YEB液体培养基的菌液1个，先吸取600μL的菌液进行菌种保存(添加400μL的50％甘油，混匀后，液氮速冻，保存于-80℃)，剩下的转入到50mL含有50μg/mL Kan，25μg/mL Rif的LB或YEB液体培养基中，继续摇菌，28℃振荡避光培养48h左右，等到菌液比较浑浊时停止培养。

2.12.3转化农杆菌的浓度测定及其侵染拟南芥前的准备

(1)28℃振荡避光培养了48小时左右时候，观察LB或YEB液体培养基由比较澄清变为橙色浑浊时候，测其OD值，若达到1.2左右时，则停止摇菌培养。

(2)配制100mL高渗溶液(1/2MS，5％蔗糖，0.1％6-BA，2％Silwet)用于侵染拟南芥。

2.13拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选

2.13.1拟南芥的种植

(1)在计划侵染拟南芥转基因实验时，提前1个月左右种植野生型拟南芥。将消毒(75％酒精中震荡浸泡消毒5-10min，然后在95％的酒精中震荡浸泡消毒5-10min)过的野生型拟南芥种子，在超净工作台内均匀撒在1/2MS(0.22％MS培养基(Solarbio,Cat#M8521,固体粉末)，3％蔗糖，0.9％琼脂粉)固体培养基中。

(2)4℃冰箱避光春化处理2天。

(3)2天后，移至拟南芥培养室或者比较干净的光照培养箱中光照培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lax，光照16小时，黑暗8小时。

(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后(一般两周左右)，将其移植到含基质(营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1)的盆中，继续培养。

2.13.2拟南芥的遗传转化

(1)农杆菌菌液的准备：此步骤农杆菌菌液的培养与准备需要配合拟南芥的生长情况(生长健壮植株的盛花期)。

(2)将准备好的农杆菌菌液，4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用配好且高压蒸灭菌过的高渗溶液悬浮菌体，再使用比色皿和分光光度计调整侵染用的菌液OD值，使其介于0.6-1.0之间，终体积为50-100mL(一般一个基因50mL左右)。

(3)喷洒花朵法转化拟南芥

a.选取开花前期花苞密集的拟南芥植株(若有已经有很多果荚，则可以剪去这部分果荚)，将侵染用的菌液倒入喷壶内，均匀喷洒于9-18株的野生型拟南芥花序上。

b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养12小时，期间保持湿度。

c.12小时后开盖通风，10min，再盖盖密封光照培养12小时，之后移出容器让其恢复正常生长。

d.期间合理管理施肥和浇水，等待种子成熟，收获拟南芥种子，37℃干燥2-3天，4℃保存。

2.13.3拟南芥转基因种子的筛选及种植

(1)在超净工作台内，将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为25mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照。

(2)4℃避光春化处理2天。

(3)2天后，将撒有野生型拟南芥种子的培养皿置于光照下，于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则继续避光培养。

(4)2天后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长。

(5)待拟南芥长出2片及以上真叶后，随机挑选两株正常生长状态的幼苗(还可以挑选长根的但生长不好或者死亡的幼苗)的根，去除固体的培养基，置于滴有1-3滴20％甘油的载玻片上，盖上盖玻片，再移到荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现，再次判断是否是转基因植株。剩下的成活幼苗移植到拟南芥种植土的盆中，继续培养生长。

(6)观察对照野生型Col拟南芥和铁皮石斛DcWOX4转基因拟南芥的生长情况，拍照记录、文字描述记录以及统计指标性状。

3.实验结果

3.1铁皮石斛幼苗总RNA提取分析

利用CTAB+RNA iso plus法提取铁皮石斛晶品一号无菌苗的总RNA(见图1)，首先通过紫外分光光度计(Thermo NANODROP 2000)测定3个RNA样品260nm及280nm的吸光度，从而可以计算RNA的A260nm/280nm；其次通过1％琼脂糖凝胶电泳(120V 15min)检测RNA的是否降解。提取的RNA吸光度A260nm/280nm比值均分布在2.0-2.2之间，说明总RNA中基本上没有糖类、EDTA、酚、胍盐及蛋白质等的污染；另外RNA的电泳图谱结果则显示RNA样品的18s和28s两条带比较清晰，5.8sRNA条带不明显，因此可推断RNA没有降解，符合进行后续反转录等分子实验的要求。

3.2铁皮石斛WOX4基因序列的克隆

利用设计的引物序列，使用PCR仪器扩增，获得单一条带(图2)，产物经连接到pEASY-Blunt Cloning Vector(TRANSGEN)，菌检PCR进行检测阳性克隆(图3)，以及提取重组质粒后用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切发现1％琼脂糖凝胶电泳图谱实际条带位置与目的条带的预期位置相同，条带单一(图4)，从而取10μL重组质粒送生工测序。然后送到上海生工测序，主要利用NCBI在线网站的BLAST功能对序列进行分析。最终验证了铁皮石斛WOX4基因序列的存在和正确。

3.3铁皮石斛DcWOX4基因的功能验证

对通过铁皮石斛DcWOX4基因的克隆而获得的序列，进行表达载体的构建，将DcWOX4基因序列连接到pCAMBIA1300-GFP表达载体上，转化Trans1-T1Phage ResistantChemically Competent Cell大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR(图5)和质粒酶切(图6)鉴定阳性克隆，目的载体质粒转化到土壤农杆菌GV3101中，从而进行铁皮石斛DcWOX4基因对拟南芥的转基因。对铁皮石斛DcWOX4转基因拟南芥植株单株收获的种子进行抗性筛选(图7)，并在T2代获得纯合转基因植株，随后对其表现型进行观察，可以发现DcWOX4转基因植株的分蘖数目在植株生长的第5周到第6周期间，明显多于野生型(图8和图9)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 649

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tagtggtaag tataccatga agtttcagca gttggaatta gcctttttga ataaaaattc 60

ctcaacgtct tcttcctctt cgtcttcctt gactcttgga tttaagcgtc ttcggccggt 120

cgtaccggct gcatccactg tcaagcctgt tacttctctg gaactcaaga gcttcagctt 180

ctctaaggct tcttccgcac ctctgcaaca tcaacatgtc actctgtcag gagggggaac 240

aagatggaac ccaactcaag aacagataag gaaactagag tcactctaca atagcgggat 300

gaggacaccg aacgcccagc agatcgagaa gataactgct gagctgatca aacatggaag 360

aattgaagga aagaatgtct tctactggtt ccagaaccat aaggcaaggg aaaggcagaa 420

gcagaagcgc aacggtctcc tcagcccctc cttgccacca gactcaaact tctctgaaac 480

aaagggagct gaagagaaga aggagagtag agatgggaga agcaagagga gaagcaggag 540

ttggggagtt gagcttgatc agattattga gtgcggcggt gatgacagag taacactcga 600

gctcttccct ttgcacccgg agaacattaa tggaaataac tacttttaa 649

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaagtttc agcagttgga at 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aaagtagtta tttccattaa tgttc 25

Claims (1)

1.铁皮石斛DcWOX4基因在提高植物茎分蘖中的应用，包括：将所述铁皮石斛DcWOX4基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系，其特征在于，所述铁皮石斛DcWOX4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述应用通过DcWOX4基因的过量表达实现。

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