CN111893116A - 杨树miR167a的前体基因及其在提前植物开花中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杨树miR167a的前体基因，所述前体基因的序列如下:(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或(b)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成杨树miR167a的核苷酸序列。应用杨树miR167a前体基因序列，有望人为地控制植物开花。具体地，应用杨树miR167a的前体基因，有望调控杨树的花期，进一步地缩短甚至阻止杨树开花，以便阻止杨树花期飘絮的产生。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杨树miR167a的前体基因及其在提前植物开花中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类长度为21～24nt的非编码小分子RNA，它们动植物中广泛存在。miRNA能够在基因表达中起负调控其靶基因作用，通过在转录水平或者转录后水平上对基因组相关靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达。miRNA普遍存在于各种动植物中，其功能涉及到生物生长发育、信号转导以及抵抗生物和非生物胁迫等各个生命进程的方面。miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达，其作用方式主要有两个：导致靶mRNA的降解或翻译抑制。miRNA与其靶基因的互补程度决定了它以何种机制沉默靶基因。在植物中，大部分的miRNA介导其靶mRNA的降解，由于植物中的miRNA与相应的靶mRNA完全或近似完全配对时便引起靶mRNA的降解；然而，并不是所有的miRNA都介导靶mRNA的降解。迄今，杨树miR167a的前体基因的功能鲜有研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杨树miR167a的前体基因，所述前体基因的序列如下:
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成杨树miR167a的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述杨树miR167a的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
本发明还提供了含有上述前体基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
在一个实施方案中，上述重组菌为将上述前体基因插入表达载体得到的重组菌。
进一步，本发明还提供了杨树miR167a的前体基因在提前植物开花中的应用，所述前体基因的序列如下:
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成杨树miR167a的核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述杨树miR167a的成熟序列为SEQ ID NO：2。
在一个实施方案中，上述植物为拟南芥或烟草；优选地，所述植物是拟南芥。
在一个实施方案中，由于杨树miR167a本身序列很短，只有21个bp，而前体序列相对较长，通过将其前体序列连接到载体上，有利于转化实现，因此上述应用包括：将所述杨树miR167a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。
本发明提供了杨树miR167a前体在提前植物开花中的应用。应用杨树miR167a前体基因序列，有望人为地控制植物开花；具体地，应用杨树miR167a的前体基因，有望调控杨树的花期，进一步地缩短甚至阻止杨树开花，以便阻止杨树花期飘絮的产生。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.材料
1.1实验材料
实验材料取自中国河北平泉县杨树育种基地，6年的杨树叶片，时间2019年4月份，样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。拟南芥野生型种子使用哥伦比亚生态型(Columbia-0)。
1.2实验试剂与仪器
DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自北京天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700 PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
1.3引物合成及测序
引物合成及测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。
2.方法
2.1杨树花芽总RNA的提取(改良后的CTAB法)
(1)在2ml离心管中加入800ml CTAB和30ml的β巯基乙醇，放入65℃水浴锅中预热；
(2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，将磨好的样品分装于预热好的离心管中，每管大概300mg，涡旋仪上涡旋混匀。然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀，加热20-30min；
(3)在加热好的混合物中加入等体积的酸性饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混合均匀后12000转10min，常温离心；
(4)将离心后的上清液转入新的2ml离心管中，然后再加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，上下颠倒混匀后12000转10min，常温离心；
(5)重复第4步一次；
(6)第5步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，然后加入0.6ml的异丙醇，此时能看到一些白色的沉淀。上下颠倒混匀后放入-20℃冰箱中冷冻过夜；
(7)第二天将冷冻过夜的离心管在4℃条件下12000转15min，离心完成后将液体倒掉，再加入65℃预热好的SSTE 0.5ml，待沉淀溶解完全后再加入0.5ml的酸性饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后12000转10min，常温离心；
(8)将离心后的上清液转移至新的离心管中，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)。混匀后12000转10min，常温离心；
(9)重复第8步一次；
(10)将上清液分装到1.5ml的离心管中，然后加入3倍体积的无水乙醇和1/3体积的10mol/L的醋酸钠(NaAc)，混匀后放入-70℃冰箱中冷冻3h以上；
(11)冷冻完成后-4℃12000转20min离心收集沉淀；
(12)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75％乙醇0.5ml；将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子；
(13)12000转10min常温离心后，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据沉淀的量加入100ul DEPC水将沉淀溶解。
2.2cDNA合成
使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：
(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:
(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)
(3)再次配置反应体系如下：
(4)缓慢摇匀。
(5)42℃反应30-60min。
(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。
2.3前体序列的引物设计
依据杨树miR167a的前体序列：
AGGGAAAAAGTGAAGCTGCCAGCATGATCTATCTTTGGTTAGAGAAAGAAAGGACTAACCCTAGCTAGGTCATGCTGTGACAGCCTCACTCCTTCCTA，使用Primer Primer 4.0设计引物，
表1miR167a前体特异性引物
2.4PCR扩增反应
以杨树cDNA为模板扩增，反应体系如下：
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性25s，56℃退火30s，72℃延伸1min。30个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。
2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)，核酸染料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露时间来降低对DNA的损伤；
(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例加入Buffer B2；
(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为止；
(4)当目的片段＜500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若≥500bp，则此步骤可以省略；
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg离心30sec，倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中；
(6)加入500μL Wash Solution，9000xg离心30sec，再次倒掉收集管中的液体；
(7)重复一次步骤6；
(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离1min，扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mL EP管中；
(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min，为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果；
(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O，室温静置5min，9000xg离心1min。1.5mLEP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。
2.6DNA回收片段与PMD-19T载体连接
根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片段进行T-A克隆连接，反应体系如下：
轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化DH5α感受态。
2.7连接产物转化DH5α感受态
转化感受态具体操作步骤如下：取出适量DH5α感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混合液，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰上20min。快速平稳放入42℃水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min，弃掉上清(保留少许培养基，约50μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于氨苄抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温育14h。
2.8重组子的筛选和鉴定
用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有800μL LB培养基(含相应抗生素)的1.5mL EP管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊，并对培养基浑浊的菌样进行菌检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取1mL送上海生工测序。利用BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。
2.9超表达载体的构建
(1)用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ同时对miR167a前体基因进行双酶切，酶切反应体系如下(50μl)：
37℃条件下酶切3-4h,反应结束后电泳检测并回收片段、测定浓度。
(2)将回收的目的片段和载体片段进行连接，体系如下：
进行转化和菌检，得到正确的阳性克隆，提取测序结果正确的菌株质粒，待用。
2.10转化农杆菌
2.10.1电击杯的处理
(1)用移液枪吸取ddH2O反复冲洗电击杯3-5次；
(2)用75％的乙醇反复冲洗电击杯3-5次；
(3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工作台中让残余酒精挥发；
(4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室温保存备用。
2.10.2电转化
采用仪器为伯乐公司GenePμLser Xcell电穿孔仪进行感受态细胞的转化。主要参数为：电脉冲2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω。操作步骤如下：
(1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化；
(2)取1μL质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀；
(3)将混合液加到电击杯中(-20℃预冷)，在电脉冲为2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω的参数条件下电击；
(4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基，悬浮细胞后，转移到1.5mL的离心管中；
(5)28℃，220rpm震荡培养2h左右；
(6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相应抗生素YEP平板上，倒置放入28℃培养箱培养2-3天。
2.10.3电转化农杆菌及其检测
将酶切验证正确的pC1301-miRNA167a质粒转化到农杆菌GV3101中，再从农杆菌中提取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒，酶切验证。验证正确的含有pC1301-miRNA167a质粒的农杆菌，-80℃保存菌种。
2.11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选
2.11.1拟南芥的种植
(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中；
(2)4℃冰箱避光春化处理2天；
(3)4天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lx，光照12小时，黑暗8小时；
(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。
2.11.2拟南芥的遗传转化
(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板，划线以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为橙色，测其OD值达到1.2时停止培养；
(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体；
(3)浸花法转化拟南芥。
a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约10-20秒；
b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时；
c.第二天，放置正常条件下继续培养；
d.收获拟南芥种子，干燥。
2.11.3拟南芥转基因种子的筛选及种植
(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照；
(2)4℃避光春化处理2天；
(3)4天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则避光培养；
(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长；
(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养；
(6)观察对照拟南芥(野生型拟南芥)和转杨树miR167a前体基因的拟南芥的生长开花情况。
3.实验结果
3.1杨树花芽的总RNA提取分析
从杨树叶片提取的总RNA经过DNase处理后1％琼脂糖电泳，28SrRNA明显比18SrRNA亮度强很多，而且比例大约2：1，表明提取的总RNA很完整，基本没有降解。5.8S rRNA的亮度也很强，暗示小分子RNA富集，提取RNA的量是大约400ng/ul,每个样总量大约40ug。
3.2杨树miR167a的功能验证
依据杨树miR167a前体序列，进行表达载体的构建，将杨树miRNA167a前体序列连接到pC1301表达载体上，转化到DH5α感受态细胞中，同时对其进行菌液PCR检测，菌液PCR检测的条带单一；将连接成功的单克隆提取质粒，转化到土壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对杨树miR167a转基因拟南芥植株进行抗性筛选，将筛选出的转基因拟南芥体取DNA，进行PCR检测，PCR扩增获得杨树miR167a前体基因。
观察野生型拟南芥和转杨树miR167a前体基因的拟南芥在2020年4月20日-2020年4月30日期间开花情况发现，转杨树miR167a前体基因的拟南芥相比同时期的野生型拟南芥，花期延迟3天。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 廊坊师范学院
<120> 杨树miR167a的前体基因及其在提前植物开花中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggaaaaag tgaagctgcc agcatgatct atctttggtt agagaaagaa aggactaacc 60
ctagctaggt catgctgtga cagcctcact ccttccta 98
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaagctgcc agcatgatct a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggaaaaag tgaagctgcc ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgacagcctc actccttcct a 21
Claims (9)
1.一种杨树miR167a的前体基因，其特征在于,所述前体基因的序列如下:
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成杨树miR167a的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的前体基因，其特征在于，所述杨树miR167a的核苷酸序列为SEQID NO：2。
3.含有权利要求1所述前体基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为将权利要求1所述前体基因插入表达载体得到的重组菌。
5.杨树miR167a的前体基因在提前植物开花中的应用，其特征在于,所述前体基因的序列如下:
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成杨树miR167a的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杨树miR167a的核苷酸序列为SEQ IDNO：2。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述杨树miR167a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。
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