CN115838404B - 调控枇杷花期的EjMYB44基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个延迟枇杷开花时间的EjMYB44基因及其应用。EjMYB44基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。本发明的EjMYB44基因在烟草叶片中瞬时表达，定位于细胞核，具有典型的转录因子亚细胞定位特性；EjMYB44基因在枇杷花发育的各阶段均有表达，在盛花期的表达量最高。将EjMYB44基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达。结果显示，野生型拟南芥中过量表达EjMYB44基因，能显著延迟拟南芥开花时间。利用EjMYB44基因过表达载体获得的转基因植物材料，能显著延迟植物的开花时间，进而导致植物的结果时间延迟，可用于被子植物晚花晚熟品种的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

调控枇杷花期的EjMYB44基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjMYB44蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷原产于我国，在热带和亚热带地区广泛种植。枇杷果肉多汁、酸甜可口，还具有止咳润肺、滋润内脏和解渴的作用，受到消费者的广泛赞赏。枇杷作为特色经济水果，其主产区花期和产期较为集中，对枇杷产业的可持续发展产生了较为不利的影响，严重影响产业经济效益的发挥。因此，选育早熟优质的枇杷新品种具有重要的生产价值。

MYB类转录因子在调控植物发育过程中扮演重要角色，主要参与植物的初生和次生合成代谢，以及干旱、高温、高盐等多种非生物胁迫的响应调控。目前，有关MYB类转录因子的研究主要集中在模式植物和草本农作物中。据统计，MYB类转录因子在玉米中有157个，拟南芥中约有126个，大豆中有244个，水稻中有102个；例如，拟南芥的AtMYB90和AtMYB144基因在拟南芥中起到了合成花色苷的作用。但是，多年生木本植物MYB基因大多仅是进行了序列组装预测，并未对这些基因序列的准确性进行克隆验证和功能分析。因此，开展木本植物，特别是对木本果树的MYB基因家族的表达和功能进行分析，有利于更全面认识和利用MYB基因家族的功能。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供调控枇杷花期的EjMYB44基因及其编码蛋白与应用。

首先，本发明提供枇杷EjMYB44蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjMYB44蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在延迟被子植物开花中的用途。

在本发明一个具体的实施方案中，将所述基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，显著延迟植物的开花时间，进而延迟植物的结果时间。

本发明从枇杷花芽中克隆了1个MYB基因家族成员EjMYB44基因，该基因的亚细胞定位于细胞核，具有典型的转录因子亚细胞定位特性。通过实时荧光定量PCR证实了EjMYB44基因在枇杷花发育的各阶段均有表达，在盛花期的表达量最高，表明EjMYB44基因的表达与枇杷花发育调控密切相关。利用基因工程手段构建了EjMYB44基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能显著延迟拟南芥开花时间，进而导致结果时间延迟。本发明为被子植物花期的定向改造提供了很好的应用前景。

本发明对枇杷花期调控EjMYB44基因的功能进行研究，表明EjMYB44基因过表达能使显著延迟植物的开花时间，进而导致植物的结果时间延迟。本发明有助于全面了解蔷薇科植物的花期调控网络，并为枇杷晚花晚熟品种的定向选育提供了基础。

附图说明

图1所示是枇杷EjMYB44基因的编码区序列验证的电泳照片。其中，M为DL2000 DNAmarker，EjMYB44为基因编码区的PCR产物。

图2所示是枇杷EjMYB44编码蛋白质的氨基酸序列与预测的苹果、毛果杨和芒果的MYB44同源序列对比。该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的蛋白相比，序列差异明显，特别是211位到270位氨基酸区域的序列差异最大，见方框标注，表明了EjMYB44蛋白序列具有特异性。

图3所示是实施例2枇杷EjMYB44基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，结果显示EjMYB44基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF合并后的图像。

图4所示是实施例3枇杷花发育的各阶段均有表达，在盛花期的表达量最高。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。S1:花芽的生理分化期；S2:花芽形态分化期；S3:花序主轴分化期；S4:花序支轴分化期；S5:花序侧生支轴快速伸长期；S6:小花分化期；S7:花蕾露白期；S8:盛花期。

图5所示是实施例6转基因拟南芥EjMYB44阳性植株的PCR鉴定。其中，M为DNA分子质量标准(DL2000)，1^#—17^#为转基因株系，W为野生型拟南芥阴性对照，P为pFGC5941-EjMYB44质粒。

图6是实施例7转基因前后的野生型拟南芥的开花时间照片和EjMYB44基因表达分析。其中，A和B是与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjMYB44基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟7天左右；C是转基因拟南芥内源的MYB44基因表达量；D是转基因拟南芥EjMYB44基因表达量。W1、W2和W3为野生型拟南芥；1^#、8^#和13^#为EjMYB44转基因拟南芥株系；**表示基因表达差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjMYB44基因cDNA序列的克隆

枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜长度约0.5cm的枇杷分化期的花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻4h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA快速提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1.5mL RLT裂解液和150μL PLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至2.0mL的eppendorf离心管中，12000rpm离心12min后，吸取600μL上清液，转移至新的1.5mL离心管；向上清液中加入300μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，然后将吸附柱放入收集管；12000rpm离心1min；向吸附柱中加入500μL去蛋白液，12000rpm离心1min后；加入500μL漂洗液，12000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液，再次重复一次加入漂洗液并12000rpm离心1min；将吸附柱重新放回空收集管中，12000rpm空离心2min，去除残留的漂洗液，将吸附柱在超净工作台中放置2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的RNase-free H₂O₂，室温放置2min，接着12000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液再次加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。

基于本团队前期的枇杷花芽不同发育时期的转录组测序数据，在枇杷EjMYB44基因编码区序列全长两端设计特异引物EjMYB44F:5'-ATGGCGTCCACTAAGAAGGTG-3'和EjMYB44R:5'-CTACTCGATTTTGCTAATCCCGA-3'，反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，使用DNAMAN软件对编码区序列进行序列分析和验证，得到枇杷EjMYB44基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。

使用primer 5软件，对枇杷EjMYB44基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjMYB44基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的苹果、毛果杨和芒果的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性(图2)。

实施例2枇杷EjMYB44基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjMYB44基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，LEjMYB44-BamHI：5'-ggggatccATGGCGTCCACTAAGAAGGTG-3'；LEjMYB44-XbaI：5'-gctctagaCTCGATTTTGCTAATCCCGA-3'。以测序正确的pMD19-EjMYB44质粒为模板进行扩增，得到含有BamHI和XbaI酶切位点的EjMYB44基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶BamHI和XbaI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjMYB44和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV1301感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图3)。

实施例3枇杷EjMYB44基因的实时荧光定量PCR分析

分别提取枇杷8个不同发育时期的花芽的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 7.0软件设计实时荧光定量PCR引物qEjMYB44F:5'-TTAGCCTCTCGCTTCCCGGAT-3'和qEjMYB44R:5'-ACATCCAGGAACTCCGAGCTGA-3'。以枇杷Ejactin基因为内参基因，引物为qEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：在枇杷花发育过程中，EjMYB44基因在枇杷不同器官中的表达具有显著性差异，在盛花期的表达量最高(图4)，表明EjMYB44基因的表达主要在枇杷花发育后期发挥调控作用。

实施例4枇杷EjMYB44基因的植物转基因载体pFGC5941-EjMYB44构建

通过PCR扩增手段，在枇杷EjMYB44基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjMYB44F：5′-ggcgcgccATGGCGTCCACTAAGAAGGTG-3′(引入AscI酶切位点)和TEjMYB44R：5′-gctctagaCTACTCGATTTTGCTAATCCCGA-3′(引入XbaI酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用AscI和XbaI限制性内切酶分别双酶切pMD19-EjMYB44重组质粒和pFGC5941载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjMYB44基因与pFGC5941连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pFGC5941-EjMYB44。经PCR扩增后，通过阳性筛选，验证EjMYB44基因与pFGC5941载体连接成功。

实施例5将转基因表达载体pFGC5941-EjMYB44转入拟南芥

取1μg的pFGC5941-EjMYB44质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pFGC5941-EjMYB44阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入pFGC5941-EjMYB44农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例6枇杷EjMYB44基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjMYB44转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将拟南芥种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动6min；离心5000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取EjMYB44转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行EjMYB44基因进行确证。利用枇杷EjMYB44基因序列的载体构建引物TEjMYB44F和TEjMYB44R，用2×Mix Taq，1μLDNA，对抗草铵膦的拟南芥植株进行PCR鉴定，共获得17株阳性的EjMYB44转基因野生型拟南芥植株(图5)。

实施例7枇杷EjMYB44基因的转基因拟南芥的表型鉴定

以未转基因野生型拟南芥的cDNA作为对照，使用实时荧光定量引物qEjMYB44F和qEjMYB44F，以及拟南芥MYB44基因和内参基因Tubulin作为对照，拟南芥TUB-F：5′-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3′；TUB-R：5′-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3′；qRT-MYB44-F1：5′-GGTTACGACCATCGGGGTTACGAT-3′；qRT-MYB44-R1：5′-GAAAAGCTCAACGGAAGGTAATAT-3′。对转基因拟南芥的阳性植株进行EjMYB44基因和内源MYB44基因的表达量进行分析。

在这些转基因株系中，随机挑选了1、8和13号株系进行开花时间的表型鉴定，对这些拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照。表型结果显示：与野生型拟南芥相比，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjMYB44基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟7天左右(图6A和B)；转基因拟南芥的EjMYB44基因表达分析发现，这些拟南芥自身的内源MYB44基因表达量并未显著变化(图6C)；但是，与未转基因野生型拟南芥中相比，延迟开花的转基因拟南芥的EjMYB44基因显著高表达(图6D)。因此，结果表明：EjMYB44基因表达导致拟南芥开花时间的延迟，EjMYB44基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，使植物延迟开花，进而有效延迟植物的果实成熟时间，有利于晚熟品种的定向选育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.枇杷EjMYB44蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的枇杷EjMYB44蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在延迟被子植物开花中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，将所述基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，显著延迟植物的开花时间，进而导致植物的结果时间延迟。

8.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其开花时间明显延迟，进而导致结果时间延迟。