CN113150094B - 枇杷花发育相关的EjAP2L基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷开花时间和花器官发育的转录因子EjAP2L基因及其应用。EjAP2L基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID NO.1所示。本发明的EjAP2L基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，具有典型的AP2转录因子基因的亚细胞定位特性。将EjAP2L基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达，能显著促进拟南芥开花时间，并在部分转基因植株中改变拟南芥的花瓣结构和数目。因此，本发明的枇杷EjAP2L可用于植物早花早熟、多瓣品种的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

枇杷花发育相关的EjAP2L基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjAP2L蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷是起源于我国的重要亚热带常绿果树，目前已广泛分布在日本、印度、巴基斯坦、西班牙、意大利、美国、巴西、南非等30多个国家，成为一种世界范围的重要果树。由于枇杷鲜美多汁、营养价值极高，同时价格较高，在推动我国农村产业结构调整中起着重要作用。在枇杷生产过程中，花果发育是一个连续的过程，早花品种通常也是果实早熟品种，特别是早花早熟品种往往可以在销售市场上抢占先机，因此选育早花早果新品种对枇杷产业发展具有重要作用：一方面可以提前上市时间，有效拓宽枇杷货架期；另一方面可以提高枇杷的生产效益，达到增收的效果。

在拟南芥中，APETALA2(AP2)基因编码AP2/EREBP转录因子，在调控花发育网络调控过程中扮演重要角色，包括营养生长向花分生组织生长的转变、花器官发育等方面。在花发育基因调控网络中，AP2不仅可以促进WUSCHEL(WUS)基因的表达，调控花芽分化，而且AP2还与AG基因相互拮抗，进而调控萼片和花瓣的发育。但是，AP2基因的功能研究仅限于模式植物拟南芥，主要农作物水稻、大麦，重要观赏花卉植物。但是多年生木本植物AP2-like基因的功能鉴定及作用机制一直未见报道，其是否参与调控功能尚不清楚。因此，开展多年生木本植物，特别是果树中的AP2-like基因序列、表达和功能进行分析，对拓宽AP2-like基因的认知具有重要作用。

本发明对枇杷AP2-like基因EjAP2L的分子调控机制和应用进行研究，有助于综合了解多年生蔷薇科植物的花发育过程，并为枇杷早花早熟品种的定向选育提供有价值且可利用的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjAP2L蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjAP2L蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjAP2L蛋白的基因。

所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控被子植物开花时间和花器官中的用途。

本发明从枇杷花芽中分离了一个枇杷花发育调控密切相关的AP2-like基因EjAP2L，发现其定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的AP2转录因子基因的亚细胞定位特性。通过半定量PCR证实了EjAP2L基因在枇杷不同器官中均有表达，但在成花转变、花器官和幼果中的表达量较高。实时荧光定量PCR证实了EjAP2L基因在花芽生理分化期和花序支轴分化期的表达量较高，表明EjAP2L基因的表达量具有促进枇杷花芽分化时间的作用。利用基因工程手段构建了EjAP2L基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能显著促进拟南芥开花时间，并在部分转基因植株中改变拟南芥的花瓣结构和数目。本发明为被子植物开花时间和花器官的改造提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1枇杷EjAP2L基因的核心序列、3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是核心序列克隆的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，EjAP2L1为EjAP2L基因的核心序列PCR产物；B是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R为5'RACE的PCR产物；C是3'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，3R为3'RACE的PCR产物；D为EjAP2L基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，FEjAP2L为EjAP2L基因ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。

图2是枇杷花发育相关的EjAP2L蛋白氨基酸序列比对图。A是枇杷(EjAP2L)、拟南芥(AtAP2)、月季(RcAP2)、毛白杨(PtAP2)和大豆(GsAP2)的AP2同源蛋白质序列对比率；B是EjAP2L、AtAP2、RcAP2、PtAP2和GsAP2的AP2同源蛋白质序列的整体对比，·代表氨基酸序列相同，-代表氨基酸序列缺失。

图3是实施例2枇杷EjAP2L基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。

图4是实施例3枇杷EjAP2L基因在枇杷不同器官的半定量PCR分析。a：茎；b：叶；c：叶芽；d：萼片；e：花瓣；f：花药；g：花丝；h：花柱；i：子房；j：幼果。

图5是实施例4枇杷EjAP2L基因在枇杷花芽不同发育时期的表达量变化。其中横坐标代表花发育时期：S1.花芽的生理分化期；S2.花芽形态分化期；S3.花序主轴分化期；S4.花序支轴分化期；S5.花序侧生支轴快速伸长期；S6.小花分化期；S7.花蕾露白期；S8.盛花期。

图6是实施例7枇杷EjAP2L拟南芥阳性苗的PCR产物鉴定。M为DL2000 DNA marker，1-23是转EjAP2L基因拟南芥植株，n1是模板为ddH₂O的PCR产物阴性对照，n2是模板为未转基因拟南芥DNA的PCR产物阴性对照，P1是模板为pFGC5941-EjAP2L质粒的PCR产物阳性对照。

图7是实施例7转EjAP2L基因前后的野生型拟南芥的开花时间分析。其中，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjAP2L基因能导致转基因拟南芥开花时间提前15天左右。

图8是实施例7转基因拟南芥的花器官对比分析。其中，A是未转基因拟南芥的花器官；B是转EjAP2L基因拟南芥的花器官。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjAP2L基因cDNA序列的克隆

枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜长度约0.5cm的枇杷花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1mL RLT裂解液和100μLPLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至2.0mL的离心管中，12000rpm离心15min后，吸取600μL上清液，转移至新的2.0mL离心管；向上清液中加入300μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，然后将吸附柱放入收集管，13000rpm离心，1min后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入600μL去蛋白液，13000rpm离心1min后；加入600μL漂洗液，13000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液，再次重复一次加入漂洗液并13000rpm离心2min；将吸附柱重新放回空收集管中，13000rpm空离心2min，去除残留的漂洗液，将吸附柱在超净工作台中放置2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的RNase-free H₂O₂，室温放置2min，接着13000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液重新加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。

枇杷EjAP2L基因的核心保守序列克隆

以枇杷花芽总RNA为模板，使用Oligo DT18引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA，以逆转录产物为模板，使用高保真酶EX-taq。选择NCBI网站公布的预测的枇杷近缘物种AP2基因同源序列：梨AP2-like基因(XM_018644219.1)，苹果AP2-like基因(XM_008371483.2)和拟南芥AP2-like基因(U12546.1)的cDNA序列保守区域(比对区域的序列高度一致)，设计引物克隆枇杷EjAP2L基因的保守序列：PEjAP2F:AGCTCGCAGTATCGGGGCGTTA，PEjAP2R:GAGAACCCGGTACTCTGGCG；反应条件为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃10min。反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

枇杷EjAP2L基因的5'RACE实验

采用

RACE 5'/3'Kit试剂盒进行5'RACE逆转录获得cDNA。枇杷花芽总RNA为5'RACE实验模板，以5'-CDS Primer A为接头引物进行逆转录反应，合成5'RACE实验的第一链cDNA。

根据获得EjAP2L基因的核心序列片段，设计5′RACE实验的下游特异性引物5REjAP2L1和5REjAP2L2，5REjAP2L1：5′-CAGGATATGCACAAATTCTTCCTTTGT-3′和5REjAP2L2：5′-CAAGTACACTTGTTTCCGGCAATCCC-3′。以5'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，特异性引物5REjAP2L1和5'RACE Long primer(试剂盒自备)，进行第一链PCR反应。接着，以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，特异性引物5REjAP2L2和5'RACE Shortprimer(试剂盒自备)，进行第二链巢式PCR反应。第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1B)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

枇杷EjAP2L基因的3'RACE实验

根据核心片段序列和5'RACE实验所得到的序列，设计3′RACE实验的特异性引物3REjAP2L1和3REjAP2L2，其中3REjAP2L1：5′-TGGTCACTACGACGGTCGGAGGAC-3′，3REjAP2L2：5′-AGTGTACTTGGGAGGATTTGACA-3′。根据3'RACE实验操作步骤：采用枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。以第一链3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjAP2L1和下游引物3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第一链PCR反应。以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游内侧特异性引物3REjAP2L2和3'RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链PCR反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1C)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。

在枇杷EjAP2L基因序列全长两端设计引物EjAP2LF:5'-ATGCTAGATCTCAACCTCAGGTTC-3'和EjAP2LR:5'-CTATCCGATCGTGAACTGCTTCTGG-3'，反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行35个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1C)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjAP2L基因的编码区序列进行验证。

使用DNAMAN软件对核心保守序列、3'RACE、5'RACE和编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列分析和拼接，得到枇杷EjAP2L基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。使用Primer 5软件，对枇杷EjAP2L基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ IDNo.2)。进一步，将枇杷EjAP2L基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的拟南芥、月季、毛白杨和大豆的AP2同源蛋白质序列对比，该蛋白质序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，比对率仅有59.65％，序列差异明显(图2)，表明了EjAP2L蛋白序列的特异性。

实施例2枇杷EjAP2L基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjAP2L基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，LEjAP2L-KpnI：5'-ggggtaccATGCTAGATCTCAACCTCAGGTTC-3'；LEjAP2L-BamHI：5'-cgggatccTCCGATCGTGAACTGCTTCTGG-3'。以测序正确的pMD18-EjAP2L质粒为模板进行扩增，得到含有KpnI和BamHI酶切位点的EjAP2L基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶KpnI和BamHI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjAP2L和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101-90感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液(10mM MgCl2、10mMMES-KOH，pH＝5.6，150μM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图3)。

实施例3枇杷EjAP2L基因的半定量PCR分析

分别提取枇杷茎、叶、叶芽、萼片、花瓣、花药、花丝、花柱、子房、幼果的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 7.0软件设计半定量PCR引物RTEjAP2LF:5'-GGCCTATTTGATAGCGAGATTG-3'和RTEjAP2LR:5'-GGAGCAATTCCCAAGTTCAG-3'。以枇杷actin基因为内参基因，引物为RTEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和RTEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，PCR反应程序为:94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图4)，表明EjAP2L基因的表达与成花转变、花器官和幼果发育密切相关。

实施例4枇杷EjAP2L基因的实时荧光定量PCR分析

分别提取枇杷花芽生理分化期(S1)、花芽形态分化期(S2)、花序主轴分化期(S3)、花序支轴分化期(S4)、花序侧生支轴快速伸长期(S5)、小花分化期(S6)、花蕾露白期(S7)、盛花期(S8)的材料总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用引物RTEjAP2LF和RTEjAP2LR(与实施例3中的引物序列相同)。以枇杷actin基因为内参基因，引物为RTEjactinF：和RTEjactinR(与实施例3中的引物序列相同)，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：在枇杷花发育过程中，EjAP2L基因在枇杷花芽发育不同时期的表达具有显著性差异，在花芽生理分化期和花序支轴分化期的表达量较高(图5)，表明EjAP2L基因的表达具有促进枇杷花芽分化和花器官发育的作用。

实施例5 EjAP2L基因的植物转基因载体pFGC5941-EjAP2L构建

采用PCR扩增手段，在枇杷EjAP2L基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjAP2LF：5′-ggcgcgccATGCTAGATCTCAACCTCAGG-3′(引入AscI酶切位点)和TEjAP2LR：5′-tcccccgggCTATCCGATCGTGAACTGCTTCTGG-3′(引入SmaI酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用AscI和SmaI限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjAP2L重组质粒和pFGC5941载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjAP2L基因与pFGC5941连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，通过测序验证序列正确后，获得植物转基因表达载体pFGC5941-EjAP2L。

实施例6将转基因表达载体pFGC5941-EjAP2L转入拟南芥

取1μg的pFGC5941-EjAP2L质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pFGC5941-EjAP2L阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mLKan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入pFGC5941-EjAP2L农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例7枇杷EjAP2L基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjAP2L转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将春化的种子均匀播撒在培养土上，喷洒水后用保鲜膜覆盖保湿，发芽后揭去保鲜膜，按照常规的水肥管理。待苗子长至十天左右喷洒20mg/L的草铵膦，每三天喷洒一次，一共喷洒三次。将存活的的拟南芥植株培养20天左右，每一植株取一定量的叶片，提取EjAP2L转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于2.0mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行EjAP2L基因进行确证。根据pFGC5941载体上35s启动子序列和EjAP2L的保守序列里设计一对特异性引物(CaMV35s-F：TGAGACTTTTCAACAAAGGATAATT,EjAP2LR：CGATAAAACGTAACGCCCCGAT)，用2×Mix taq，1μL DNA，对抗草铵膦的拟南芥植株进行PCR鉴定，共获得23株阳性的EjAP2L转基因野生型拟南芥植株(图6)。

在这些转基因株系中，随机挑选了1、2、3、10、11、12、13、17、18和19号株系进行开花时间的表型鉴定，对这些拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照。表型结果显示：与野生型拟南芥相比，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjAP2L基因能导致转基因拟南芥开花时间提前15天左右(图7)；这些转基因植株中，有1株转基因拟南芥的出现了花瓣数目增多和花瓣宽度变窄和长度变短(图8)。因此，结果表明：EjAP2L基因表达导致拟南芥开花时间的提前，EjAP2L基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物促进开花；同时，EjAP2L基因的转基因拟南芥材料可用于花瓣数目和花器官结构的改造。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 枇杷花发育相关的EjAP2L基因及其编码蛋白与应用

<130>

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 1

atgctagatc tcaacctcag gttcgtctcc cacgacgtcg ttcccgattc ccaccacaag 60

cttctctcca cctccccgat cgaaagctcc ggaagcctca actcctcctc caaccacacc 120

cttgccggcg acgacgacga cgtctccgct actctcaact tccttgctcc aaacgacgac 180

gtatccgctg gtcactacga cggtcggagg accatccagc tcttcccgct cgcccaatcc 240

gtacgctctt cttcgtcgtc gtcatcggct tctaagaagc aatggccggg actgtcgtcc 300

agttccagat tggagctgga gccgatttac aatgctcctg cggagcagag gattgcgcca 360

ccgcagcaag tgaagaaaag caggagaggg ccccggtcac ggagctcgca gtatcggggc 420

gttacgtttt atcgaagaac cgggagatgg gaatcccata tttgggattg ccggaaacaa 480

gtgtacttgg gaggatttga cactgcccat tctgctgcta gggcatatga tcgagctgcg 540

atcaaattcc gtggaactga ggctgatatt aacttcagtg ttagtgatta tgaggatgat 600

attgagcaga tgagtaattt tacaaaggaa gaatttgtgc atatcctgcg ccgccagagt 660

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agcgagattg aagctgcaag ggcatatgac caggctgcca ttgagtgcaa tggaagagaa 840

gcagtcacca acttcaattc aagctcatat gatggggagt taatgtctga ggccaataac 900

aaaggtatta ttgttggtag agaacatcac ttcaaaagat accaaatcgc caataacaaa 960

ggtagccacc aaaatcttga tctgaacttg ggaattgctc cccctttcgt ttctgaaatc 1020

caaaaggaga acatcaattt gagcagcttt ccttttcagc taggctgtga cagcattcct 1080

attcacacaa gagcaaggaa tgagaactct gttccagcac ctatgaggtc tcaactttct 1140

catggctcaa tggtcgcgcc tgaggtgcct cctataatga gcaacatgaa ttccagtttc 1200

tttcccattc atatgaaaag agctatggag aagagtatgg atgttaattc atttcccagt 1260

tcggcttggc aactccaaga cctgaatggc gggccaactt ccatgccact cttctctgct 1320

gcagcatcat caggattccc ttcttcagca gccacttcat cgtcatcagc tgtcactcaa 1380

cttcatttcc ctaacaaggc gattctccgc caccattttt caccgtattc accaacaaca 1440

tcccccattt ttattgctga ggctgaaaac cagaagcagt tcacgatcgg atag 1494

<210> 2

<211> 497

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 2

Met Leu Asp Leu Asn Leu Arg Phe Val Ser His Asp Val Val Pro Asp

1 5 10 15

Ser His His Lys Leu Leu Ser Thr Ser Pro Ile Glu Ser Ser Gly Ser

20 25 30

Leu Asn Ser Ser Ser Asn His Thr Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Val

35 40 45

Ser Ala Thr Leu Asn Phe Leu Ala Pro Asn Asp Asp Val Ser Ala Gly

50 55 60

His Tyr Asp Gly Arg Arg Thr Ile Gln Leu Phe Pro Leu Ala Gln Ser

65 70 75 80

Val Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Gln Trp Pro

85 90 95

Gly Leu Ser Ser Ser Ser Arg Leu Glu Leu Glu Pro Ile Tyr Asn Ala

100 105 110

Pro Ala Glu Gln Arg Ile Ala Pro Pro Gln Gln Val Lys Lys Ser Arg

115 120 125

Arg Gly Pro Arg Ser Arg Ser Ser Gln Tyr Arg Gly Val Thr Phe Tyr

130 135 140

Arg Arg Thr Gly Arg Trp Glu Ser His Ile Trp Asp Cys Arg Lys Gln

145 150 155 160

Val Tyr Leu Gly Gly Phe Asp Thr Ala His Ser Ala Ala Arg Ala Tyr

165 170 175

Asp Arg Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Thr Glu Ala Asp Ile Asn Phe

180 185 190

Ser Val Ser Asp Tyr Glu Asp Asp Ile Glu Gln Met Ser Asn Phe Thr

195 200 205

Lys Glu Glu Phe Val His Ile Leu Arg Arg Gln Ser Thr Gly Phe Ser

210 215 220

Arg Gly Ser Ser Lys Phe Arg Gly Val Thr Leu His Lys Cys Gly Arg

225 230 235 240

Trp Glu Ala Arg Met Gly Gln Phe Leu Gly Lys Lys Cys Ile Tyr Leu

245 250 255

Gly Leu Phe Asp Ser Glu Ile Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Gln Ala

260 265 270

Ala Ile Glu Cys Asn Gly Arg Glu Ala Val Thr Asn Phe Asn Ser Ser

275 280 285

Ser Tyr Asp Gly Glu Leu Met Ser Glu Ala Asn Asn Lys Gly Ile Ile

290 295 300

Val Gly Arg Glu His His Phe Lys Arg Tyr Gln Ile Ala Asn Asn Lys

305 310 315 320

Gly Ser His Gln Asn Leu Asp Leu Asn Leu Gly Ile Ala Pro Pro Phe

325 330 335

Val Ser Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ile Asn Leu Ser Ser Phe Pro Phe

340 345 350

Gln Leu Gly Cys Asp Ser Ile Pro Ile His Thr Arg Ala Arg Asn Glu

355 360 365

Asn Ser Val Pro Ala Pro Met Arg Ser Gln Leu Ser His Gly Ser Met

370 375 380

Val Ala Pro Glu Val Pro Pro Ile Met Ser Asn Met Asn Ser Ser Phe

385 390 395 400

Phe Pro Ile His Met Lys Arg Ala Met Glu Lys Ser Met Asp Val Asn

405 410 415

Ser Phe Pro Ser Ser Ala Trp Gln Leu Gln Asp Leu Asn Gly Gly Pro

420 425 430

Thr Ser Met Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ala Ser Ser Gly Phe Pro Ser

435 440 445

Ser Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ala Val Thr Gln Leu His Phe Pro

450 455 460

Asn Lys Ala Ile Leu Arg His His Phe Ser Pro Tyr Ser Pro Thr Thr

465 470 475 480

Ser Pro Ile Phe Ile Ala Glu Ala Glu Asn Gln Lys Gln Phe Thr Ile

485 490 495

Gly

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 3

agctcgcagt atcggggcgt ta 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 4

gagaacccgg tactctggcg 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 5

caggatatgc acaaattctt cctttgt 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 6

caagtacact tgtttccggc aatccc 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 7

tggtcactac gacggtcgga ggac 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 8

agtgtacttg ggaggatttg aca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 9

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 10

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 11

atgctagatc tcaacctcag gttc 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 12

ctatccgatc gtgaactgct tctgg 25

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 13

ggggtaccat gctagatctc aacctcaggt tc 32

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 14

cgggatcctc cgatcgtgaa ctgcttctgg 30

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 15

ggcctatttg atagcgagat tg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 16

ggagcaattc ccaagttcag 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 17

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 18

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 19

tgagactttt caacaaagga taatt 25

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 20

cgataaaacg taacgccccg at 22

Claims (8)

1.枇杷EjAP2L蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控被子植物开花时间以及改变花器官数目和结构中的用途，其特征在于，将所述基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提前植物的开花时间，进而提前植物的结果时间；同时，转基因植株中花瓣数目和花器官结构发生改变。

7.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其促进花芽分化和开花时间明显提前，结果时间显著提前；花瓣数目和花器官结构发生改变。

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