CN113214371B - 枇杷抗旱相关的EjWRKY17基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷抗旱相关的转录因子EjWRKY17基因及其应用。EjWRKY17基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。EjWRKY17基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，具有典型的WRKY转录因子的亚细胞定位特性。将EjWRKY17基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达，显著增强了转基因植株对ABA胁迫和甘露醇诱导的干旱胁迫的抗性，减轻了转基因植株在干旱胁迫下的活性氧和丙二醛积累，促进了脱落酸介导的气孔关闭，同时，与胁迫相关基因的在干旱胁迫后显著上调表达，转基因植株比野生型具有更强的抗旱能力。因此，本发明的枇杷EjWRKY17可用于植物抗旱品种的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

枇杷抗旱相关的EjWRKY17基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷 EjWRKY17蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷原产于我国，是一种重要的热带和亚热带常绿经济果树。我国枇杷种质资源丰富，已有2100多年的栽培历史；目前枇杷广泛分布于中国、日本、西班牙、美国、澳大利亚和南非等国家和地区。枇杷根系分布浅，须根稀少，须根数量占总根量的比例较一般果树低，因此对水分要求较高，枇杷在生长过程中易发生花期、幼果期和果实成熟期旱害，而且枇杷一般种植在山坡地带，保水能力弱，灌溉条件差，导致枇杷的坐果率和产量严重降低，因此季节性干旱是制约枇杷产量和果实品质的主要因素，而且长期的干旱会对枇杷树体和果实造成不可逆的影响。

WRKY家族参与了广泛的生物学过程，包括种子萌发、植物发育和植物激素信号。棉花GhWRKY17在本氏烟草中的过表达显著降低了烟草对干旱和盐胁迫的耐受性。菊花CmWRKY17作为转录抑制因子，其过表达增加了菊花和拟南芥对盐胁迫的敏感性。在玉米中，ZmWRKY17可能是盐胁迫的负调节因子，ZmWRKY17在拟南芥中的过表达显著降低了植物对盐胁迫的耐受性。但是，WRKY17同源基因在多年生果树中的调控功能尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjWRKY17蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjWRKY17蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjWRKY17蛋白的基因。

所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控植物耐旱中的用途。

本发明从枇杷叶中分离了一个枇杷干旱胁迫调控密切相关的 EjWRKY17基因，该基因编码的蛋白序列与苹果等近源物种的 WRKY17同源基因相比，具有特异性。EjWRKY17基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的 WRKY转录因子基因的亚细胞定位特性。实时荧光定量PCR证实了 EjWRKY17基因在抗旱能力强的枇杷叶片中的表达量较高，表明 EjWRKY17基因的表达量具有提高响应干旱胁迫能力的作用。利用基因工程手段构建了EjWRKY17基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能显著增强了转基因植株对ABA胁迫和甘露醇诱导的干旱胁迫的耐受能力；能显著减轻转基因植株在干旱胁迫下的活性氧和丙二醛积累，促进了脱落酸介导的气孔关闭；同时增强了拟南芥在干旱胁迫下的保水能力；显著提高了转基因拟南芥植株响应干旱胁迫的能力。本发明为提高被子植物的抗旱能力提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1枇杷EjWRKY17基因的3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，左为3'RACE的电泳照片， M为DL2000 DNA marker，3R为3'RACE的PCR产物；中为5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R为5'RACE的 PCR产物；右为EjWRKY17基因ORF验证的PCR电泳照片，M为 DL2000 DNA marker，FL为EjWRKY17基因ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。

图2是枇杷EjWRKY17与其他被子植物WRKY17同源蛋白的氨基酸序列比对图。枇杷EjWRKY17、密罗木MfWRKY17、葡萄 VvWRKY17和茶树CsWRKY17蛋白质序列的整体对比，其中，·代表氨基酸序列相同，-代表氨基酸序列缺失。C-region：C区；HARF： HARF基序；NLS：核定位信号；WRKY：WRKY基序；C2H2 zinc-finger：C2H2锌指结构域；WRKY domain：WRKY结构域。

图3是实施例2枇杷EjWRKY17基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP， DAPI和BF的合并后的图像。

图4是实施例3枇杷EjWRKY17基因分别在干旱不同时间下的枇杷幼苗的抗旱能力弱(未褪黑素处理，CK)和抗旱能力强(褪黑素处理，MT)的枇杷叶片中的表达量。Relativeexpression levels： EjWRKY17基因相对表达水平；Stress time：干旱胁迫时间。

图5实施例7枇杷EjWRKY17基因的转基因植株筛选和检测。 M:DL2000 DNAmarker；Col:Col野生型拟南芥。

图6是实施例8EjWRKY17基因的过表达提高了拟南芥幼苗对 ABA和渗透胁迫的耐受性。ABA:脱落酸；mannitol：甘露醇。

图7是实施例8EjWRKY17过表达拟南芥在缺水条件和复水后的表型。Drought：干旱缺水；rewater：复水。

图8是实施例8EjWRKY17的过表达减轻转基因植株的干旱胁迫下活性氧和丙二醛的积累。A.过氧化氢(H₂O₂)的组织化学检测，使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色后的脱色观察，颜色越深，代表H₂O₂积累越多。B.超氧化物(O^2-)的组织化学检测，使用硝基蓝四唑(NBT)染色的脱色观察，颜色越深，代表O^2-积累越多。C.丙二醛的含量。MDA：丙二醛。

图9是实施例8EjWRKY17转基因拟南芥促进了ABA介导的气孔关闭。

图10是实施例8转EjWRKY17基因的拟南芥植株中，与胁迫相关基因的表达模式。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjWRKY17基因cDNA序列的克隆

以枇杷叶片总RNA为模板，使用Oligo DT18引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA，以逆转录产物为模板，使用高保真酶EX-taq。选择NCBI网站公布的枇杷近缘物种苹果MdWRKY17基因 (HM122720.1)和WRKY转录因子保守结构域特征，设计引物克隆枇杷EjWRKY17基因的保守序列：PEjWRKY17F: 5′-CACCGACTTCACCGTGACAA-3′，PEjWRKY17R: 5′-GCTCTCTCCACGTGTTTCCTTGC-3′；反应条件为94℃5min； 94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃10min。反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将回收的PCR 产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序，获得枇杷EjWRKY17基因的部分序列。

枇杷EjWRKY17基因的3'RACE实验

根据核心片段的序列，设计3′RACE实验的特异性引物3REjWRKY17F1和3REjWRKY17F2，其中3REjWRKY17F1： 5′-CCGGCTTTCTCCGCTGGAAAACC-3′，3REjWRKY17F2：5′-GGTCAAAAGCCGATCAAGG-3′。根据3'RACE实验操作步骤：采用枇杷叶片总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。以第一链 3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjWRKY17F1和下游引物3'RACE Outer Primer： 5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第一链PCR反应。以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游内侧特异性引物3REjWRKY17F2和3'RACE Inner Primer： 5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链 PCR反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。

枇杷EjWRKY17基因的5'RACE实验

采用

RACE 5'/3'Kit试剂盒进行5'RACE逆转录获得 cDNA。枇杷花芽总RNA为5'RACE实验模板，以5'-CDS Primer A 为接头引物进行逆转录反应，合成5'RACE实验的第一链cDNA。

根据获得EjWRKY17基因的核心序列片段，设计5′RACE实验的下游特异性引物5REjWRKY17-1和5REjWRKY17-2， 5REjWRKY17-1：5′-GCTTGAACTTGGTGACGGTGAA-3′和5REjWRKY17-2：5′-AGGGTGCGGATGAGGTGGTG-3′。以5'RACE 逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，特异性引物 5REjWRKY17-1和5'RACE Long primer(试剂盒自备)，进行第一链PCR反应。接着，以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq 酶，特异性引物5REjWRKY17-2和5'RACE Short primer(试剂盒自备)，进行第二链巢式PCR反应。第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到 pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

在枇杷EjWRKY17基因序列全长两端设计引物EjWRKY17F: 5'-ATGGCTGTAGATCTAGTTGGCTTCTC-3'和EjWRKY17R: 5'-TCATTCTTTAGAAGATTGGAAAACAAGGC-3'，反应条件为 94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行35个循环； 72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjWRKY17基因的编码区序列进行验证。

使用DNAMAN软件对核心保守序列、3'RACE、5'RACE和编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列分析和拼接，得到枇杷 EjWRKY17基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。使用Primer 5 软件，对枇杷EjWRKY17基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQID No.2)。进一步，将枇杷EjWRKY17基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的密罗木MfWRKY17、葡萄VvWRKY17和茶树CsWRKY17蛋白质序列的整体对比，该蛋白质序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显(图2)，表明了 EjWRKY17蛋白序列的特异性。

实施例2枇杷EjWRKY17基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjWRKY17基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，TEjWRKY17F：5'- cgcggatccATGGCTGTAGATCTAGTTGGCTTCTC-3'； TEjWRKY17R：5'-gctctagaTTCTTTAGAAGATTGGAAAACAAGGC -3'。以测序正确的pMD18-EjWRKY17质粒为模板进行扩增，得到含有BamHI和XbaI酶切位点的EjWRKY17基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶BamHI 和XbaI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用 T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjWRKY17和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌 GV3101-90感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10 mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液(10mM MgCl2、10mM MES-KOH，pH＝5.6，150μM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养 16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图3)。结果表明，该基因的表达产物定位于细胞核。

实施例3枇杷EjWRKY17基因的实时荧光定量PCR分析

分别提取在干旱不同时间下的枇杷幼苗的抗旱能力弱(未褪黑素处理)和抗旱能力强(褪黑素处理，处理方法：用150μM褪黑素对枇杷幼苗进行根部浇灌处理，每次浇灌300mL，每隔2天浇灌一次，预处理2周，显著提高了枇杷幼苗的抗旱能力，该处理方法和效果参见Wang et al.Physiological and transcription analyses reveal the regulatorymechanism of melatonin in inducing drought resistance in loquat(Eriobotryajaponica Lindl.)seedlings,Environmental and Experimental Botany,2021,181:104291)，去除总RNA中微量的 DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 7.0软件设计实时荧光定量PCR引物 qEjWRKY17F:5'-AAAAGCCGATCAAGGGCTCA-3'和qEjWRKY17R: 5'-TGGAAAACAAGGCCCACCAC-3'。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和 qEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。

PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s， 72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：干旱胁迫的7天到13天，EjWRKY17基因在抗旱能力强 (褪黑素处理)的枇杷叶片显著高于抗旱能力弱(未褪黑素处理)的幼苗叶片(图4)，表明EjWRKY17基因的表达具有正向调控抗干旱胁迫的作用。

实施例4EjWRKY17基因的植物转基因载体pFGC5941-EjWRKY17 构建

采用PCR扩增手段，在枇杷EjWRKY17基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷叶片总RNA逆转录的cDNA为模板，以 TAEjWRKY17F： 5′-aggcgcgccATGGCTGTAGATCTAGTTGGCTTCTC-3′(引入AscI酶切位点)和TAEjWRKY17R： 5′-gctctagaTCATTCTTTAGAAGATTGGAAAACAAGGC-3′(引入 XbaI酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30 个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用 AscI和XbaI限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjWRKY17重组质粒和pFGC5941载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjWRKY17 基因与pFGC5941连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，通过测序验证序列正确后，获得植物转基因表达载体pFGC5941-EjWRKY17。

实施例6将转基因表达载体pFGC5941-EjWRKY17转入拟南芥

取1μg的pFGC5941-EjWRKY17质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、 250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pFGC5941-EjWRKY17阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10 μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48 h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其 OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度 70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入pFGC5941-EjWRKY17农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d 后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例7枇杷EjWRKY17基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjWRKY17转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将春化的种子均匀播撒在培养土上，喷洒水后用保鲜膜覆盖保湿，发芽后揭去保鲜膜，按照常规的水肥管理。待苗子长至十天左右喷洒20mg/L的草铵膦，每三天喷洒一次，一共喷洒三次。将存活的的拟南芥植株培养20天左右，每一植株取一定量的叶片，提取EjWRKY17转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于2.0mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的 eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10 min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱) 漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL 无菌水。

以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行EjWRKY17基因进行确证。根据pFGC5941载体上35s 启动子序列里设计一对特异性引物(CaMV 35s-F： 5′-TGAGACTTTTCAACAAAGGATAATT-3′,CaMV 35s-R： 5′-TGTCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3′)，用2×Mix taq，1μL DNA，对抗草铵膦的拟南芥植株进行PCR鉴定，共获得8株阳性的 EjWRKY17转基因野生型拟南芥植株(图5)。

实施例8枇杷EjWRKY17基因的转基因拟南芥的抗旱表型鉴定在这些转基因株系中，随机挑选了3和4号转基因株系，并筛选了3代后的植株进行抗旱表型的鉴定，对这些拟南芥的抗干旱胁迫的表型进行观察、统计和拍照。转基因株系和野生型株系的灭菌种子在MS培养基上生长3天，然后将幼苗移植到补充有甘露醇(0、150 和300mM)和ABA(0、1和5μM)的新鲜培养基中生长8天，测定根长结果显示：与未转基因野生型拟南芥中相比，ABA胁迫抑制了拟南芥的根长，特别是对过量表达EjWRKY17基因的转基因拟南芥根长抑制显著较弱(图6A和B)；随着甘露醇处理浓度的增加，拟南芥的根长也受到抑制作用，同时EjWRKY17转基因拟南芥根长抑制较未转基因植株弱(图6C和D)。因此，结果表明：EjWRKY17基因的过表达提高了拟南芥植株对ABA和渗透胁迫的耐受性。

在连续缺水的情况下，这些拟南芥的抗干旱胁迫的表型进行观察。未转基因野生型植株表现出比L3和L4转基因株系更严重的萎蔫表型。恢复浇水后，L3和L4转基因株系的生长势显著强于野生型株系，且转基因植株的存活率显著高于野生型植株(图7)。此外，离体叶片的失水率结果表明L3和L4转基因株系比野生型具有更强的保水能力(图7)。结果表明：过表达EjWRKY17增强了转基因拟南芥植株的干旱耐受性。

剪取完整的拟南芥莲座叶片于培养板内，加入2mL的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)和硝基蓝四唑(NBT)反应液，用锡箔纸包好，置于黑暗条件下培养12个小时，染好色后倒掉染色液，加入酒精在沸水浴中煮10-15分钟，脱色完成后用清水冲洗，检测积累的过氧化氢(H₂O₂)和超氧化物(O^2-)。将野生型和第三代转基因超表达系的拟南芥种子在土壤中培养5周。对于干旱处理，持续不浇水直至叶片出现萎蔫，取样测定丙二醛含量。结果显示：在正常条件下，野生型 (WT)和转基因株系(L3和L4)中的活性氧水平没有明显差异。当植物处于干旱胁迫下，野生型的活性氧的积累显著高于L3和L4 转基因株系。在干旱条件下，野生型比转基因株系始终积累更多的丙二醛(图8)，表明：EjWRKY17在拟南芥中的过表达减轻了转基因植株的干旱胁迫下活性氧和丙二醛的积累。

将大小一致的野生型和过表达株系拟南芥莲座叶光照3h后置于含有25mM MES，pH7.0,10mM KCl和1mM CaCl2且含有不同浓度的ABA(0,0.5和1.0μM)的缓冲液中2小时，用扫描电镜观察并测定气孔的孔径。结果表明，在0μM ABA处理下时，过表达 EjWRKY17的L3和L4株系的气孔孔径比野生型的气孔孔径大。然而，在1μM脱落酸处理后，转基因品系的气孔孔径均显著小于野生型株系(图9)，这表明拟南芥中EjWRKY17的过表达促进脱落酸介导的气孔关闭。

提取转基因植株的RNA，并进行逆转录，进一步检测EjWRKY17 过表达在干旱胁迫的响应过程中，一些与胁迫相关基因的表达水平，包括NCED3，RD22,RD29A,RAB18等12个基因作为标记监控干旱胁迫反应通路在拟南芥中的变化(荧光定量检测方法同实施例3)，基因的引物如下：

ATACTINF：5′-TTACCCGATGGGCAAGTC；

ATACTINR：5′-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3′；

ATABF1F：5′-GAGACTAGCGCAGATGGTCC-3′；

ATABF1R：5′-CTAGCAGCGGATTCCCGATT-3′；

ATRD29AF：5′-AGGAGGAATGGTTGGGAGGA-3′；

ATRD29AR：5′-TTCTGCACCGGAACAACAGT-3′；

ATRD29BF：5′-ACGTCGTTGCCTCAAAGCTA-3′；

ATRD29BR：5′-TTGCGTCTCCTTCACTCCAC-3′；

ATRD22F：5′-GGTTCGGAAGAAGCGGAG-3′；

ATRD22R：5′-GAAACAGCCCTGACGTGATAT-3′；

ATCOR15AF：5′-GGCCACAAAGAAAGCTTCAG-3′；

ATCOR15AR:5′-CTTGTTTGCGGCTTCTTTTC-3′；

ATRAB18F：5′-TCGGTCGTTGTATTGTGCTTTTT-3′；

ATRAB18R：5′-CCAGATGCTCATTACACACTCATG-3′；

ATLEA14F：5′-GTCATTCGATTCCGATCTGTGAGATC-3′；

ATLEA14R:5′-GTCATTCGATTCCGATCTGTGAGATC-3′；

ATLEA76F：5′-GGTGAAGCACACTTTAGGGC-3′；

ATLEA76R:5′-TTCCTCTGTGTCTCACGAGTAGT-3′；

ATKIN1F:5′-AACAAGAATGCCTTCCAAGC-3′；

ATKIN1R：5′-CGCATCCGATACACTCTTTCC-3′。

在干旱胁迫后，这些基因中的11个基因在EjWRKY17过表达株系中的表达量几乎都高于野生型(图10)。这些结果表明，EjWRKY17 可能通过调控非生物胁迫响应途径中的与胁迫相关基因的表达来参与干旱胁迫的响应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 枇杷抗旱相关的EjWRKY17基因及其编码蛋白与应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 837

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 1

atggctgtag atctagttgg cttctccaag atggacgatc ggactgccgt gcaagaagct 60

gcctccgccg gcctgcaaag catgcaccac ctcatccgca ccctgtccaa tcaaaccccg 120

tcccacactc cgctcgattg cctggaaatc accgacttca ccgtcaccaa gttcaagcac 180

ctaatctccg tcttgaaccg gaccggtcac gcccggttcc gccgcggacc agccaaacca 240

gcttcagatt cggtccatcc gaaacctcag acgactttga ctgcttttca aaccccaaaa 300

tcggacaagg ataactccac tacgtcgttg tttttttcct caaacacaat cggagacggc 360

agtgtttcca acggtaaacc cttctcatcg atttctgtgc ctacgcctcc ggctttctcc 420

gctggaaaac cgccccttcc acaatctcac cggaaacggt gtcacgaggg cgaactcgct 480

aatacgtcgt cgtcgtcggg ccactgccat tgttctaaaa gaaggaagtg taaggttaag 540

agggcgatta gagtgccggc gattagctcg aaaaccgccg atatacctgc ggacgagttc 600

gcgtggagaa agtatggtca aaagccgatc aagggctcac cttacccgag agggtattat 660

aggtgcagta cagtgagagg gtgtccagca aggaaacacg tggagagagc acaggacgac 720

cccaagatgc tcgtcgtaac ctacgaagct gagcaccgtc acccgcaccc ttacccttcc 780

ctcacagtcg cagccgcgaa tgtggtgggc cttgttttcc aatcttctaa agaatga 837

<210> 2

<211> 278

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 2

Met Ala Val Asp Leu Val Gly Phe Ser Lys Met Asp Asp Arg Thr Ala

1 5 10 15

Val Gln Glu Ala Ala Ser Ala Gly Leu Gln Ser Met His His Leu Ile

20 25 30

Arg Thr Leu Ser Asn Gln Thr Pro Ser His Thr Pro Leu Asp Cys Leu

35 40 45

Glu Ile Thr Asp Phe Thr Val Thr Lys Phe Lys His Leu Ile Ser Val

50 55 60

Leu Asn Arg Thr Gly His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Pro Ala Lys Pro

65 70 75 80

Ala Ser Asp Ser Val His Pro Lys Pro Gln Thr Thr Leu Thr Ala Phe

85 90 95

Gln Thr Pro Lys Ser Asp Lys Asp Asn Ser Thr Thr Ser Leu Phe Phe

100 105 110

Ser Ser Asn Thr Ile Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Gly Lys Pro Phe

115 120 125

Ser Ser Ile Ser Val Pro Thr Pro Pro Ala Phe Ser Ala Gly Lys Pro

130 135 140

Pro Leu Pro Gln Ser His Arg Lys Arg Cys His Glu Gly Glu Leu Ala

145 150 155 160

Asn Thr Ser Ser Ser Ser Gly His Cys His Cys Ser Lys Arg Arg Lys

165 170 175

Cys Lys Val Lys Arg Ala Ile Arg Val Pro Ala Ile Ser Ser Lys Thr

180 185 190

Ala Asp Ile Pro Ala Asp Glu Phe Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys

195 200 205

Pro Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Pro Arg Gly Tyr Tyr Arg Cys Ser Thr

210 215 220

Val Arg Gly Cys Pro Ala Arg Lys His Val Glu Arg Ala Gln Asp Asp

225 230 235 240

Pro Lys Met Leu Val Val Thr Tyr Glu Ala Glu His Arg His Pro His

245 250 255

Pro Tyr Pro Ser Leu Thr Val Ala Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Val

260 265 270

Phe Gln Ser Ser Lys Glu

275

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 4

caccgacttc accgtgacaa 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 5

gctctctcca cgtgtttcct tgc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 6

ccggctttct ccgctggaaa acc 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 7

ggtcaaaagc cgatcaagg 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 8

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 9

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 10

gcttgaactt ggtgacggtg aa 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 11

agggtgcgga tgaggtggtg 20

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 12

atggctgtag atctagttgg cttctc 26

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 13

tcattcttta gaagattgga aaacaaggc 29

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 14

cgcggatcca tggctgtaga tctagttggc ttctc 35

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 15

gctctagatt ctttagaaga ttggaaaaca aggc 34

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 16

aaaagccgat caagggctca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 17

tggaaaacaa ggcccaccac 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 18

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 19

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 20

aggcgcgcca tggctgtaga tctagttggc ttctc 35

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 21

gctctagatc attctttaga agattggaaa acaaggc 37

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 22

tgagactttt caacaaagga taatt 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 23

tgtcctctcc aaatgaaatg aac 23

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 24

ttacccgatg ggcaagtc 18

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 25

gctcatacgg tcagcgatac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 26

gagactagcg cagatggtcc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 27

ctagcagcgg attcccgatt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 28

aggaggaatg gttgggagga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 29

ttctgcaccg gaacaacagt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 30

acgtcgttgc ctcaaagcta 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 31

ttgcgtctcc ttcactccac 20

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 32

ggttcggaag aagcggag 18

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 33

gaaacagccc tgacgtgata t 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 34

ggccacaaag aaagcttcag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 35

cttgtttgcg gcttcttttc 20

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 36

tcggtcgttg tattgtgctt ttt 23

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 37

ccagatgctc attacacact catg 24

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 38

gtcattcgat tccgatctgt gagatc 26

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 39

gtcattcgat tccgatctgt gagatc 26

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 40

ggtgaagcac actttagggc 20

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 41

ttcctctgtg tctcacgagt agt 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 42

aacaagaatg ccttccaagc 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 43

cgcatccgat acactctttc c 21

Claims (10)

1.枇杷EjWRKY17蛋白，其为：由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控植物耐旱中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，减轻转基因植株在干旱胁迫下的活性氧和丙二醛积累，促进了脱落酸介导的气孔关闭，同时转基因植株比野生型具有更强的保水能力。

9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，增强了对ABA胁迫和甘露醇诱导的干旱胁迫的耐受能力，同时增强了转基因植物的保水能力，与胁迫相关基因在干旱胁迫后显著上调表达，显著增强了植物的抗旱能力。

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