CN108192919B - 一种培育抗旱转基因棉花的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗旱转基因棉花的方法。本发明提供了HUB2蛋白或其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。所述HUB2蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抗旱性越强；所述HUB2蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越低，所述植物的抗旱性越弱。实验证明，抗旱指标显示转AtHUB2基因阳性植株较未转化的对照植株更为抗旱。另外，AtHUB2基因突变降低了植物的抗旱性，而将该基因转回到突变体中可使突变体的抗旱性恢复到野生型水平。本发明对于培育抗旱棉花新品种具有重要意义。

Description

一种培育抗旱转基因棉花的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培育抗旱转基因棉花的方法。

背景技术

随着全球温度的升高，降雨量的减少，土地沙漠化严重，干旱已经成为危害农作物产量的最严重的灾害之一，干旱胁迫所导致的减产可超过其他因素所造成减产的总和。在我国，国土总面积的52.5％为干旱和半干旱地区，年降雨量仅在250-500mm以下，土壤水分严重不足，极大程度的限制了农业的生产与发展。

棉花是我国的第一大经济作物，在国民经济中占有很重要的地位，棉纤维是一种重要的纺织原料，棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油料和蛋白质资源。随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，对棉花的需求日益增加。而棉花在我国主要分布在新疆等典型的干旱灌溉农区，水资源极为有限，而干旱胁迫是造成棉花减产，纤维品质下降的重要原因。干旱胁迫下棉花的株高，果枝延展以及叶面积扩张速度都显著减少；落蕾落铃率显著增加；光合能力减弱直接造成作物产量的降低。因此培育抗旱的棉花新品种对于提高棉花的产量具有重要意义，而传统的远缘杂交具有自交不亲和等缺点，运用基因工程技术提高植物的抗旱性已成为棉花抗旱育种的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗旱转基因棉花的方法。

第一方面，本发明要求保护HUB2蛋白或其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。

在所述应用中，所述HUB2蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越高，所述植物的抗旱性越强；所述HUB2蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性越低，所述植物的抗旱性越弱。

第二方面，本发明要求保护一种培育抗旱性增强的植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱性增强的植物的方法，具体可包括使受体植物中HUB2蛋白的表达量和/或活性升高的步骤。

第三方面，本发明要求保护一种培育抗旱性减弱的植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱性减弱的植物的方法，具体可包括使受体植物中HUB2蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。

在第二方面所述的方法中，所述使受体植物中HUB2蛋白的表达量和/或活性升高可通过向所述受体植物中导入所述HUB2蛋白的编码基因来实现。

进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如所述HUB2蛋白的编码基因可通过重组载体的形式导入所述受体植物中。

所述重组载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1305.1、pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

更进一步地，在本发明的一个实施例中，所述重组载体为将SEQ ID No.2所示DNA片段插入到pCAMBIA1305.1载体的酶切位点Nco I和Spe I之间后得到的重组质粒。

在第三方面所述的方法中，所述使受体植物中HUB2蛋白的表达量和/或活性降低可通过对所述受体植物中所述HUB2蛋白的编码基因进行敲除或抑制表达来实现。

进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述编码基因进行特异性编辑，从而敲除其在所述受体植株中的表达，或者通过RNAi手段对所述编码基因进行抑制表达。

在第二方面所述的方法和第三方面所述的方法中，将携带有所述HUB2蛋白的编码基因的所述重组载体或者用于对所述受体植物中所述HUB2蛋白的编码基因进行敲除或抑制表达时采用的基因编辑工具导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在第一方面所述的应用、第二方面所述的方法和第三方面所述的方法中，所述HUB2蛋白可为拟南芥来源的HUB2蛋白。更加具体的，可为如下(A1)-(A4)任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第13-395位的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第13-395位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在第一方面所述的应用、第二方面所述的方法和第三方面所述的方法中，所述HUB2蛋白的编码基因具体可为如下(B1)-(B4)任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2的第41-1192位或SEQ ID No.2的第5-1192位或SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.3的第10-5174位或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述HUB2蛋白的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述HUB2蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在第一方面所述的应用、第二方面所述的方法和第三方面所述的方法中，所述植物可为双子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为锦葵科植物或者十字花科植物。

更进一步地，所述锦葵科植物可为棉属植物或者拟南芥属植物。

更加具体地，所述棉属植物可为棉花，如棉花品种中棉所24。所述拟南芥属植物可为拟南芥。

实验证明：未转化的棉花单株(中棉所24)在干旱条件下叶片萎蔫，失绿倒伏严重，而转AtHUB2基因的阳性植株叶片萎蔫程度低，失绿倒伏情况较弱。在持续干旱的条件下，转AtHUB2基因的阳性植株株高以及果枝数都显著高于未转化的棉花植株(中棉所24)，结铃率显著增加。抗旱指标显示转AtHUB2基因阳性植株较未转化的对照植株更为抗旱。另外，AtHUB2基因突变降低了植物的抗旱性，而将该基因转回到突变体中可使突变体的抗旱性恢复到野生型水平。本发明对于培育抗旱植物特别是棉花新品种具有重要意义。

附图说明

图1为棉花表达载体p1305.1-AtHUB2的构建流程图。

图2为T₂代转基因棉花的PCR鉴定。1-9为9个转基因棉花株系，10为p1305.1-AtHUB2质粒(阳性对照)，11-12为未转化棉花和ddH₂O(阴性对照)，M为DNA标准分子量。

图3为T₂代转基因棉花的RT-PCR检测。WT为未转化棉花(阴性对照)，“+”p1305.1-AtHUB2(上)，pMD18-T-GhUBI1(下)质粒(阳性对照)，1，2，3为转基因植株3个株系，250bp为DNA标准分子量，AtHUB2为目的基因，GhUBI为内参基因。

图4为免疫印迹检测T₂代转基因棉花叶片中的AtHUB2蛋白。WT为未转化棉花(阴性对照)，1，2，3为转基因植株3个株系，M为蛋白分子量标准，由下到上分别为55kDa，43kDa，箭头所示为AtHUB2目的蛋白。

图5为旱棚生长的未转化的棉花单株以及T₂代转基因棉花。a为旱棚生长的未转化的棉花单株；b为旱棚生长的T₂代转基因棉花。

图6为拟南芥表达载体p1200-AtHUB2的构建流程图。

图7为AtHUB2基因的Sal I和BamH I双酶切鉴定结果。

图8为AtHUB2基因回复突变体植株的潮霉素筛选和T2代回补材料与WT的表型观察。a为AtHUB2基因回复突变体植株的潮霉素筛选；b为T2代回补材料与WT的表型观察。

图9为拟南芥WT、Athub2突变体，突变体回复材料AtHUB2/Athub2干旱条件下表型。a为干旱前拍照，b为干旱14天拍照，c为复水三天拍照。

图10为拟南芥WT、Athub2突变体，突变体回复材料AtHUB2/Athub2干旱14天，复水3天后存活率的统计。

图11为拟南芥WT、Athub2突变体，突变体回复材料AtHUB2/Athub2植株叶片在不同干旱时间点的含水量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、培育抗旱转基因棉花及其抗旱性检测

一、抗旱转基因棉花的获得

1、AtHUB2基因的克隆

由Invitrogen公司合成SEQ ID No.2所示的核苷酸，其中第3-8是Nco I酶切位点，第11-40是MYC标签序列，第41-1192是AtHUB2基因的序列，第1194-1199是Spe I的酶切位点。

将SEQ ID No.2所示的片段插入pMD18-T载体(Promage公司)，得到载体pMD18-T-AtHUB2，经过测序验证，克隆得到的片段AtHUB2具有SEQ ID No.2的自5’端第41-1192位所示的核苷酸。

2、重组载体的构建

构建过程如图1所示。

载体p1305.1-AtHUB2的构建

将步骤1得到的载体pMD18-AtHUB2经过Nco I和Spe I双酶切，回收小片段，然后将该片段与经同样酶切过的载体pCAMBIA1305.1(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriclture,www.cambia.org)连接，得到载体p1305.1-AtHUB2(如图1所示)。

p1305.1-AtHUB2的结构描述为：在pCAMBIA1305.1载体的酶切位点Nco I和Spe I之间插入含有SEQ ID No.2的第41-1192位所示DNA片段后得到的重组质粒。

3、抗旱转基因棉花的获得

1)转化农杆菌

a.农杆菌感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl于液氮中速冻1min，冻存于-80℃。

b.植物表达载体转化农杆菌EHA105

取1μg的表达载体p1305.1-AtHUB2加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml Kan和125μg/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h。挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含50μg/mL Kan和125μg/mL利福平)中，28℃，220rpm振荡过夜培养；取2μL菌液做模板进行菌液PCR，以鉴定农杆菌的阳性克隆。长出单菌落用PCR鉴定，鉴定用的引物是以CaMV35S启动子的5′引物：5′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′和AtHUB2基因的3′引物：5′-GTTACATTTTGACAAGCCGGAC-3′进行扩增，结果显示载体p1305.1-AtHUB2已经成功转入农杆菌中。

2)转化棉花

a.外植体的获得

将受体材料中棉所24(中国农业科学院棉花研究所科技贸易公司)的去壳种子利用。0.1％升汞消毒5min，无菌水冲洗3-5次，接种于无菌MS培养基上，光照培养5-7d；用刀片将其下胚轴切成长0.5cm左右的切段，以此5-7d的棉花无菌苗下胚轴切段作为外植体进行农杆菌感染转化。

b.农杆菌介导转化与培养

挑取上述经过验证过的含有p1305.1-AtHUB2表达载体的农杆菌单菌落接种于YEB(50μg/ml Kan和125μg/ml利福平)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.7，5000rpm离心5min，用MSB液体培养基重新悬浮，与5-7d的棉花无菌苗下胚轴切段共培养10min，用无菌滤纸吸干外植体表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的共培养培养基(MSB+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.1mg/L IAA+30g/L葡萄糖+2g/L Gelrite，pH 5.8)中，21℃黑暗条件下共培养48h，接着转移到抗性愈伤诱导培养基(MSB+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/LKT+0.1mg/L IAA+500mg/L头孢霉素+50mg/L潮霉素+30g/L葡萄糖+2g/L Gelrite，pH 5.8)培养3周，将诱导的生长良好的抗性愈伤转入分化培养基(MSB+0.02mg/LKT+0.005mg/L IAA+30g/L葡萄糖+2g/L Gelrite，pH 5.8)中诱导分化成胚状体，将胚状体转入成苗培养基(MSB+0.1mg/L IBA+30g/L葡萄糖+2g/L Gelrite，pH 5.8)形成再生植株，用劈接法将获得的转基因再生植株嫁接到砧木苗上；将在营养钵中种植长出4-5片真叶的棉苗作为砧木，左手扶苗，右手用锋利的手术刀去掉顶端部分，只保留下部1-2片真叶，之后从上向下轻轻将顶部劈开1cm左右，将再生苗插入劈开部分，用线缠好结合处，用塑料袋将浇灌后的营养钵连同刚嫁接好的再生植株密封，放置于30-36℃遮荫见光的条件下生长；7-10d后，去除塑料袋，解开塑料绳，遮荫培养7-10d后，将营养钵放入花盆定植。

3)转基因棉花的检测

a.潮霉素检测

在转化单株幼苗长出2-3片真叶时，对其进行了潮霉素叶片涂抹初筛实验。取浓度为80mg/L的潮霉素涂抹转化单株，涂抹7-10d后观察涂抹部位的颜色，淘汰叶片涂抹点变黄的单株，然后进行第二轮筛选，如此连续涂抹3次，选出涂抹叶片依然为绿色的单株。根据最后一次筛选结果将潮霉素抗性单株进行标记，取样进行室内分子生物学检测。

b.DNA水平检测

PCR检测：以转基因棉花基因组DNA为模板，质粒p1305.1-AtHUB2为阳性对照，未转化棉花的基因组DNA和ddH₂O为阴性对照，PCR扩增鉴定转基因植株，以p35S启动子的5′引物：5′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′和AtHUB2基因的3′引物：5′-GTTACATTTTGACAAGCCGGAC-3′进行扩增，反应体系如下：

PCR反应程序为：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性50sec，60℃退火50sec，72℃延伸1min30s，35个循环；第三轮：72℃延伸10min。反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

选出能扩增出特异的35S启动子加基因长度的基因片段(1458bp)的植株为PCR阳性植株(如图2所示)。

c.RNA水平检测

RT-PCR检测：为了检测步骤b中的PCR阳性植株中AtHUB2基因是否得到转录，进一步进行RT-PCR检测。用SDS法提取步骤b中的PCR阳性植株的总RNA，以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(TaKaRa生物工程公司)反转录RNA为cDNA，反转录反应体系：

混匀后轻离心使溶液回到离心管底部，70℃水浴10min，冰上冷却5min，轻离心后，加入下列试剂：

总体积达到25.0μL，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃保温1h，70℃水浴10min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

选用棉花基因GhUBI的RT-PCR扩增产物作为总RNA模板定量的内标，所用引物是GhUBI正向引物：5′-CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC-3′和GhUBI反向引物：5′-GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC-3′。RT-PCR的反应体系同b，反应条件为：先预变性94℃5min，然后是94℃50sec，50℃50sec，72℃30sec，28个循环，最后72℃延伸5min。扩增AtHUB2基因的引物是AtHUB2正向引物：5′-GAAGCTGCAATTGTGAGGCTC-3′和AtHUB2反向引物：5′-ATTTCCGGTGTCGGATCTCT-3′，反应条件为：先预变性94℃5min，然后是94℃50sec，52℃50sec，72℃30sec，28个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上做电泳分析，用凝胶成像分析仪检测条带亮度，对反转录产物进行半定量RT-PCR分析。选出经RT-PCR能扩增出特异的AtHUB2基因片段(如图3所示)的植株，为RT-PCR阳性植株。

d.蛋白水平检测

免疫印迹实验：为了检测步骤c中得到的RT-PCR阳性植株中AtHUB2基因是否得到表达，进一步进行免疫印迹检测。提取转基因植株的总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，应用电转装置将蛋白转移至醋酸纤维膜上进行免疫印迹杂交，封闭后加入特异性抗体Myc-TagMouse mAb(稀释比例1：1000，货号是#2276，Cell Signaling Technology公司)，二抗反应加入用封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG(稀释比例1：1000，货号是ZB-2310，北京伯翱森生物公司)，杂交膜洗涤3次后，避光条件下，将硝酸纤维素膜置于含有NBT/BCIP的缓冲液中显色至条带清晰，用蒸馏水冲洗终止反应。

能够显色有特异的大约55kDa的条带(如图4所示)的转化株为免疫印迹阳性植株。

二、抗旱功能检测

将经上述步骤d验证过的T₂代阳性植株(图5)在当年进行抗旱性检测，检测方法如下：

T₂代阳性植株、野生型对照(未转化的棉花植株中棉所24)播种于中国农业科学院棉花研究所旱棚，极端干旱处理，旱棚播种前一周灌溉水量约6吨，相当于30吨/亩。播种前0d对旱棚六个区18个点20cm深土层进行土壤水分检测(铝盒烘干法)，各区水分含量在16-20％之间，经统计分析发现各区土壤水分含量差异不显著。每30天检测一次土壤水分含量，对干旱两个半月的转基因阳性植株以及野生型对照(未转化的棉花植株中棉所24)进行干旱指标的测定。萎蔫、倒伏情况以及失绿程度的测定按照单株划分级别，分为1、2、3、4、5等5级。对干旱条件下的株高、果枝数、脱落率以及成铃率进行测定，筛选出抗旱的转基因棉花植株。

棉花长势分级标准：

1级：生长缓慢停滞；

2级：与对照相比长势不显著；

3级：长势较快；

4级：长势快，植株较高；

5级：长势快，植株高，粗状旺盛。

棉花叶片萎蔫分级标准：

1级：部分叶片轻度萎蔫；

2级：叶片全部轻度萎蔫；

3级：叶片全部轻度萎蔫，部分叶片重度萎蔫；

4级：大部分叶片严重失水，叶片萎蔫；

5级：叶片全部萎蔫、萎缩。

棉花失绿程度分级标准：

1级：部分叶片轻度失绿；

2级：部分叶片1/3以上面积失绿；

3级：部分叶片全片发黄，上部绝大部分叶片发黄；

4级：下部叶片脱落；

5级：叶片枯死。

棉花倒伏情况分级标准：

1级：植株倾斜，但与竖直成角<30度；

2级：部分植株倾斜角度>45度；

3级：半数以上植株倾斜角度>45度；

4级：部分植株倒伏贴地；

5级：植株倒伏贴地。

根据测定统计结果如下：

以一个株系为一个样本，对每个株系中的T₂代阳性植株进行抗旱指标测定，每个株系得到相应的抗旱指标，对照检测了大于15个单株。如表1所示，未转化的棉花单株(中棉所24)在干旱条件下叶片萎蔫，失绿倒伏严重，而转基因的阳性植株叶片萎蔫程度低，失绿倒伏情况较弱。在持续干旱的条件下，转基因的阳性植株株高以及果枝数都显著高于未转化的棉花植株(中棉所24)，结铃率显著增加，1号转化体结铃率极显著增加，脱落率显著降低。抗旱指标显示转基因阳性植株较未转化的对照植株更为抗旱。

表1 T₂代转基因棉花及对照干旱相关指标

实施例2、HUB2功能缺失降低植物的抗旱性

一、Athub2功能回复植株的获得

1、AtHUB2基因全长(包括外显子及内含子区)的获得

由Invitrogen公司合成SEQ ID No.3所示的核苷酸，其中第4-9是BamH I酶切位点，第10-5174是AtHUB2全基因的序列，第5175-5180是Sal I的酶切位点。

将SEQ ID No.3所示的片段插入pMD18-T载体(Promage公司)，得到载体pMD18-T-AtHUB2，经过测序验证，克隆得到的片段AtHUB2具有SEQ ID No.3的自5’端第10-5174位所示的核苷酸。

2、重组载体的构建

构建过程如图6所示。

载体pCAMBIA1200-AtHUB2的构建

将步骤1得到的载体pMD18-T-AtHUB2经过BamH I和Sal I双酶切，回收目的片段，然后将该片段与经同样酶切过的载体pCAMBIA1200(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriclture,www.cambia.org)连接，得到载体p1200-AtHUB2(如图6所示)，并用BamH I和Sal I双酶切鉴定，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果(图7)。

p1200-AtHUB2的结构描述为：在pCAMBIA1200载体的酶切位点BamH I和Sal I之间插入含有SEQ ID No.3的第10-5174位所示DNA片段后得到的重组质粒。

3、Athub2功能回复植株的获得

1)转化农杆菌

a.农杆菌感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl于液氮中速冻1min，冻存于-80℃。

b.植物表达载体转化农杆菌EHA105

取1μg的表达载体p1200-AtHUB2加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml Kan和125μg/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h。挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含50μg/mL Kan和125μg/mL利福平)中，28℃，220rpm振荡过夜培养；取2μL菌液做模板进行菌液PCR，以鉴定农杆菌的阳性克隆。

2)拟南芥Athub2突变体的转化及阳性植株的筛选

a.拟南芥Athub2突变体的培养

将受体材料Athub2突变体(来自于ABRC：Arabidopsis Biological ResourceCenter，编号为Salk_071289)种子，用0.5％NaClO(v/v)(含0.01％(v/v)TritonX-100)进行表面消毒8-10min，灭菌蒸馏水漂洗4-6次，每次漂洗3-5min，再点播到MS固体培养基上，4℃暗处理3天，然后放入光照培养箱中培养(光强80μmol.m^-2.s^-1，12L/8D光周期，温度：22±1℃)。将在光照培养箱中生长7-10天的幼苗移至土中，至温室(光强80μmol.m^-2.s^-1，12L/8D光周期，温度：22±1℃)中生长15-20天后分单株取叶片提取基因组DNA进行PCR鉴定，选出纯合突变体温室中培养至花蕾期。

b.农杆菌介导转化与培养

将鉴定正确的含有目的基因的双元载体的农杆菌EHA105接种于10ml含相应抗生素YEB液体培养基中28℃，230rpm震荡培养，转化前一天以1:50比例浓度接种于200ml含相应抗生素的的YEP培养基中扩大培养至OD600为1.25-1.6，5000rpm，15min离心集菌，重悬于渗入缓冲液，使OD600为0.8；采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期拟南芥。具体方法是在拟南芥抽苔4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透且将大的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml菌液的容器中浸泡2-3min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于花盆中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的关照培养，收获T1代种子。

c.阳性植株的筛选

将收获的T1代种子播种于含有50mg/L Kan⁺及80mg/L Hyg⁺的MS固体平板上，4℃春化3天，置22℃光照培养箱中培养7-10天，转化体表现为真叶呈深绿色，根生长至培养基中(如图8中a所示)，将转化体转至不含抗生素的MS培养基中，6-8天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种(如图8中b所示)，收获的种子为转基因T2代种子。

二、抗旱功能检测

将经上述T₂代阳性植株进行抗旱性检测，检测方法如下：

T₂代回复材料的阳性植株和对照(哥伦比亚野生型以及Athub2突变体)种子，用0.5％NaClO(v/v)(含0.01％(v/v)TritonX-100)进行表面消毒8-10min，灭菌蒸馏水漂洗4-6次，每次漂洗3-5min，再点播到MS固体培养基上，4℃暗处理3天，然后放入光照培养箱中培养(光强80μmol.m^-2.s^-1，12L/8D光周期，温度：22±1℃)。将在光照培养箱中生长7-10天的幼苗移至土中，至温室(光强80μmol.m^-2.s^-1，12L/8D光周期，温度：22±1℃)中生长14天后进行，干旱处理14天，复水3天后如图9所示对植株的存活率进行统计，野生型的存活率为91.94％，突变体的存活率为64.15％，而回复材料的存活率为85.17％，接近野生型的存活率(图10)。对生长3周大的植株进行叶片含水量的测定，以三种材料的叶片作为实验材料，分别统计干旱0.0hr、0.5hr、1.0hr、1.5hr、2.0hr、2.5hr、3.0hr、3.5hr时叶片重量，以各时间点叶片重量占叶片鲜重的百分比作为数据绘制图表如图11所示，随着干旱时间的延长，三种材料的叶片含水量都逐渐降低，突变体的叶片含水量要显著低于野生型，而回补材料的叶片含水量与野生型相似。实验结果显示，AtHUB2基因突变降低了植物的抗旱性而将该基因转回到突变体中可使突变体的抗旱性恢复到野生型水平。

<110> 中国农业大学

<120> 一种培育抗旱转基因棉花的方法

<130> GNCLN180273

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 395

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

Met Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Met Leu Thr Lys

1 5 10 15

Ala Asp Glu Gln Lys Gly Leu Glu Asp Lys Cys Ala Lys Gln Met Ala

20 25 30

Glu Ile Lys Ser Leu Lys Ala Leu Ile Glu Lys Leu Leu Lys Glu Lys

35 40 45

Leu Gln Leu Gln Asn Leu Ala Ser Ile Cys Thr Arg Glu Cys Asn Asp

50 55 60

Asp Arg Gly Leu Ala Glu Ile Lys Asp Ser Gln Arg Lys Ala Gln Ala

65 70 75 80

Gln Ala Glu Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Glu His Phe Leu Glu Leu

85 90 95

Arg Val Lys Ala Ala His Glu Thr Glu Ser Ala Cys Gln Glu Arg Leu

100 105 110

Ala Thr Ala Lys Ala Glu Ile Ala Glu Leu Arg Thr Gln Leu Asp Leu

115 120 125

Ser Glu Arg Glu Val Leu Glu Leu Lys Glu Gly Ile Lys Val Lys Glu

130 135 140

Gln Glu Ala Glu Ala Ser Ile Ala Glu Met Glu Thr Ile Gly Gln Ala

145 150 155 160

Tyr Glu Asp Met Gln Thr Gln Asn Gln His Leu Leu Gln Gln Val Ala

165 170 175

Glu Arg Asp Asp Tyr Asn Ile Lys Leu Val Ser Glu Ser Val Lys Thr

180 185 190

Lys His Ala Tyr Asn Thr His Leu Ser Glu Lys Gln Val Met Glu Lys

195 200 205

Gln Leu His Gln Val Asn Ala Ser Val Glu Asn Phe Lys Ala Arg Ile

210 215 220

Ala His Asn Glu Glu Gln Met Lys Gly Cys Phe Ser Glu Ala Tyr Lys

225 230 235 240

Leu Ile Gln Glu Asp Arg His Leu Val Ile Ser Leu Glu Thr Thr Lys

245 250 255

Trp Glu Val Ala Asp Ala Asp Lys Glu Phe Arg Trp Leu Lys Ser Ala

260 265 270

Val Ser Ser Ser Glu Lys Glu Tyr Glu Gln Ile Ser Arg Arg Thr Asp

275 280 285

Asp Ile Lys Leu Glu Leu Asp Asp Glu Arg Arg Glu Lys Lys Lys Leu

290 295 300

Glu Glu Glu Leu Met Glu Leu Asn Lys Glu Leu Glu Glu Leu Gly Ser

305 310 315 320

Glu Ser Val Glu Ala Ala Ile Val Arg Leu Gln Glu Glu Val Lys Asn

325 330 335

Cys Lys Asn Ile Leu Lys Cys Gly Val Cys Phe Asp Arg Pro Lys Glu

340 345 350

Val Val Ile Val Lys Cys Tyr His Leu Phe Cys Gln Gln Cys Ile Gln

355 360 365

Arg Ser Leu Glu Ile Arg His Arg Lys Cys Pro Gly Cys Gly Thr Ala

370 375 380

Phe Gly Gln Asn Asp Val Arg Leu Val Lys Met

385 390 395

<210> 2

<211> 1201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atccatggta gaacagaagt tgatttccga agaagacctc atgctaacaa aggcagacga 60

acagaagggt ttggaggata aatgtgctaa acagatggcg gaaattaaat ctctcaaggc 120

tctaattgag aaactactca aagaaaaact acagctgcaa aatctagcaa gcatctgtac 180

gcgtgaatgt aatgatgaca ggggactggc agaaatcaag gattcacaac ggaaagccca 240

agctcaggct gaagagctga aaaacgtttt ggatgaacac tttcttgaat tgagagtgaa 300

agcggctcat gagactgaga gtgcttgcca agaaaggctt gctaccgcca aggctgaaat 360

tgctgaattg aggactcagt tagatctttc tgagagggag gttttggaac ttaaggaggg 420

tattaaagtt aaagagcagg aggcagaggc atccattgct gaaatggaga ctataggtca 480

agcctatgaa gacatgcaga cacagaacca acatttgttg cagcaggtgg ctgagcggga 540

cgattataat atcaagcttg tttccgaaag tgtcaagaca aagcatgctt acaacactca 600

cttatctgag aagcaagtaa tggaaaagca gctccatcag gttaatgcat ccgtagagaa 660

ttttaaagca aggattgcac ataatgagga acagatgaaa ggctgttttt ctgaggctta 720

taaattgatt caagaagatc gtcacctcgt tatcagcctc gaaaccacca aatgggaagt 780

agctgatgct gacaaggaat tcagatggct caagtcggcc gtgtcttcat ccgaaaagga 840

atatgaacag atcagtagga ggacagacga catcaaactg gaactggatg atgaaaggag 900

ggagaagaag aagcttgagg aagagcttat ggagttgaac aaagagcttg aagagttggg 960

ttctgagagt gtagaagctg caattgtgag gctccaggaa gaagttaaga attgcaaaaa 1020

catcctcaaa tgtggtgtat gttttgatcg gcctaaagag gtggtaattg tgaaatgtta 1080

tcatctgttc tgccagcaat gcatccaacg tagcttagag atccgacacc ggaaatgtcc 1140

aggctgcggt accgcctttg gccagaatga cgtccggctt gtcaaaatgt aacactagtt 1200

t 1201

<210> 3

<211> 5184

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

cggggatcca tggagaatca ggaatcggac gagccgatgc agaagaagcc tcatctttta 60

gactccgttt ctccgaattc catggctcgt aactcttcac cttctcaccc tatagctaaa 120

agtgtaagct ttttcgactg tgacttctcg cttctctgtt taaggctcgt tgattatgaa 180

attgatgttt ttggaatctg tgaatgagtt gtctctgtct ggcgtttgta atatagtgtg 240

caatgtctca gaatgataca aataaggaac tatgcaagag tgagtttttt tggtacatgt 300

ggtttacttt ggagttcctt ttttcaggtt gatgccactg ttctacagtt acagaatcag 360

aaactggttc agcaattaga cctgcagaag aaacagctgt acgatgttga aagcaagatc 420

caagagttgc agctcaacca aacgtcttat gatgatgaac ttatatcagt gaaccagctt 480

tggaatcagg tcagcagtta ctttctgtct ttatagaacg actaattgca tcgtttaatg 540

tttaactcag agggtctgtt gtttaatttg tgcattatga cggtttagtt ggtagatgac 600

ctgattttgc ttggtgttcg tgccggggct aatcaagagg ctctaaacta cttggacatt 660

gtagataaaa agcgaggtat taaataagag ttctctctca gttctttaag tataatagct 720

gcttagattt gcgtaacagt ttatctatct tcatgcactt taggttcagt tccaccatgc 780

gctgctgatg aaacgtttct atgtagactt ctgcaagtag attccttaga tactagtaag 840

agtgatgagg tagtaagaaa ggttgaagaa gctcttgctt tgcgtcattc ctctacaatg 900

gagttgatgg gactctttga gaacaccatt gatacacaga agacgaaagc tgaaagcatt 960

tcacaaagtt tacatgctgt aaaatcgaca gaaggttggt tggtgtgcca attatcgatt 1020

cattttaatt taacggctat tgaaaattca cattctttta tttttagatg ccaccatcca 1080

gttatctagc attaatgatt tgatgaaaga ggagtccaaa aacttgcgtg agatgattga 1140

tgctttacat gtgaggcaca aagaacattc cgagcagatt caggcgtaca taagcagcca 1200

ttcaacagat caatccgagc ttaaacacct taaaggttat atatttcatg attctagaca 1260

atatggaaaa atcagctgtt tgtttctata agcgtagcac cttttccatt atgcacgctg 1320

gaaccaggat gtgagaattt aagtattagc atgatgccat ttcataattg ctcctgagta 1380

ttgagtatat ttggttatta aaggtcaatt ggaagagatc aaggctgagc ttgaagaaaa 1440

tagaagaaaa ttgataactc tgaaaatgca gaaggatgct gcatgtgaag gtcatgtaac 1500

atcaccggca atagcaaatg gaagtctttc tcctgagaag cctgtagata aaacgaagtt 1560

gcgtgaattg aaggactcca ttgatgagat aaaggtaact acatcgttaa tagtgtggtt 1620

catcttttaa tttttggttt ttcttccaaa cttgtaagct tagcatgtgt attgaataat 1680

tattctagat aatggcagaa ggtcgtctgt ctgagcttca agcttcacaa gagtataatc 1740

tttccttgtc aagacaatgt caagatattg aggtatggat atataattta gggatttttt 1800

tccttttctt agagcagtag ttgcagttga cagtgatatg ttttgcttaa tggatgtaga 1860

atgaactaaa ggatgaccag tatatatact cgtctagact gtatagtttg atcaatgatc 1920

gaattcatca ctggaatgct gaactggacc ggtacaaaat tctgactgag gccattcagg 1980

tcagcttctt attcaatttg ccagtgtttc tctcccacat atgtgagtaa gtttttcgtc 2040

tatccatatc taacctctgc ttcaggctga aaggtccttt gtaatgagac gggataagga 2100

actaaatctg agggcagaat ctctagaggc agccaaccat aagactacca ctgttggttc 2160

tagaattgaa gtgctggaaa agaagctgca gagttgtata attgaaaaga atggattaga 2220

gcttgaaacg gaagaagcta ttcaagattc tggtgatgtt caatccattt tagtactcat 2280

ttctttttca acgctttcta tgtgctctta aaatatatct tccatgttcc agaacggcaa 2340

gatattaaaa gcgagtttat tgcaatggca tcaaccttat ctaaagagat ggaaatgatg 2400

gaagcacagt tgaaacggtg gaaggacact gcacaagatg ctctttacct gcgtgaacaa 2460

gctcaatcgt tgagagtttc gttaagtaac aaggtttgaa cgcaaccaca gctttaaaga 2520

ttatattcgg tacaatatta ctctgttttt cctaaatgcc atctaatttg ttttattttg 2580

ttgttgtttt gatggacttt ttggtcactg catgaattac tagtaaggag caggttactc 2640

aattaatagt gtgacagagg ctgctatttt ctaggataag atgaggagaa gtgataagat 2700

tttgttgagt ttcagctatt ctatgttgac cgttttgtgc ttttcttgtc agtgcaaaga 2760

ctttgagtaa tttacaatct tgtcagtgca aagactttga gtaatttaca acttttatat 2820

gcaacattaa ccggcataac tttgaatttc taatgtggaa tctctctcct ttgtatatac 2880

aactgctttg cttctactat catttttttc ctttgtattg gactaattta gtagactgct 2940

ccctgaaata ttgattttct catgctaaca aaggcagacg aacagaaggg tttggaggat 3000

aaatgtgcta aacagatggc ggaaattaaa tctctcaagg ctctagtaag ttttctttat 3060

gtccctaaaa ccatctactc caaaaaaatt tgtgtggtaa ttacaatgtt cttttgctct 3120

atttacatgc ctctctccaa ccgtttccta ggcactttaa ctcatccacg tacttagttg 3180

tttttttgcc atcttttagg aattcatgga tactgaaact ccagaaaatt tagcagtaag 3240

agtctgaatt taaattgtaa tattgcagat tgagaaacta ctcaaagaaa aactacagct 3300

gcaaaatcta gcaagcatct gtacgcgtga atgtaatgat gacaggtatg tgaccatttg 3360

agtgtgttta agctcttcaa attttgctga aaacatgaga tttgagcttt acaatttcag 3420

gggactggca gaaatcaagg attcacaacg gaaagcccaa gctcaggctg aagagctgaa 3480

aaacgttttg gatgaacact ttcttgaatt gagagtgaaa gcggctcatg agactgagag 3540

tgcttgccaa gaaaggcttg ctaccgccaa ggctgaaatt gctgaattga ggactcagtt 3600

agatctttct gagaggtatg ctctctcatg gtaccacatc caaggtcatt cattatattc 3660

ttttcaccgt tttgggggca ttaatcagta ttatattgct ttctcatttg cagggaggtt 3720

ttggaactta aggagggtat taaagttaaa gagcaggagg cagaggcatc cattgctgaa 3780

atggaggtac aatcatcctt ctgctcgttt ttcctatttt aatgttctta aggagtttat 3840

tagaaatctg aaagtcgaaa tgctcgtttc tcatcaatac tttacttctc tagactatag 3900

gtcaagccta tgaagacatg cagacacaga accaacattt gttgcagcag gtggctgagc 3960

gggacgatta taatatcaag gtaaatttta gtgttaatag gacactttga tactgagatt 4020

tgttttttgt tttttttttc atcttttctc aattccaatc tttgacttta actatatcta 4080

gcctttgaac acatcttttg tagatttctg atttgatcta tgatttcagc ttgtttccga 4140

aagtgtcaag acaaagcatg cttacaacac tcacttatct gagaagcaag taatggaaaa 4200

gcagctccat caggttaatg catccgtaga gaattttaaa gcaaggattg cacataatga 4260

ggaacaggtt agaggagagt tcttgtgtaa tttttgtaac tctctaaaac ttctctcatc 4320

agtgtctttt actaatgttc ttatgttcgc agatgaaagg ctgtttttct gaggcttata 4380

aattgattca agaagatcgt cacctcgtta tcagcctcga aaccaccaaa tgggaagtag 4440

ctgatgctga caaggaattc agatggctca agtcggccgt gtcttcatcc gaaaaggaat 4500

atgaacagat cagtaggagg acagacgaca tcaaactgga actggatgat gaaaggtgac 4560

ctaaaaacag atctcttgtt tgaacccaat tactatatta tgacagtgat ataaattcta 4620

tctatggaac aggagggaga agaagaagct tgaggaagag cttatggagt tgaacaaaga 4680

gcttgaagag ttgggttctg agagtgtaga agctgcaatt gtgaggctcc aggaagaagt 4740

taagaattgc aaaaacatcc tcaaatgtgg tgtatgtttt gatcggccta aagaggtaac 4800

aatgctcata acaatcctat atctcactgt caaggcagac ataatgattc gataatcctt 4860

tctcatcact gtcataatca tcatcaatag tcatatatca tgcatcagaa aatatcattt 4920

tcagcgcata tcaacaaccg ctttttgttt caaacattat ttgcaggtgg taattgtgaa 4980

atgttatcat ctgttctgcc agcaatgcat ccaacgtagc ttagagatcc gacaccggaa 5040

atgtccaggc tgcggtaccg cctttggcca gaatgacgtc cggcttgtca aaatgtaact 5100

caaaacattc acacaaatgc actatgtgtt ggtacataac aaacttaatt aaggtccaca 5160

cagtctcatc ttccgtcgac catg 5184

Claims (6)

1.HUB2蛋白或其编码基因在提高棉花抗旱性中的应用；

所述HUB2蛋白为如下（A1）或（A2）所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第13-395位的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HUB2蛋白的编码基因是如下任一DNA分子：

（B1）SEQ ID No.2的第41-1192位或SEQ ID No.2的第5-1192位或SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（B2）SEQ ID No.3的第10-5174位或SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.一种培育抗旱性增强的棉花的方法，包括使受体棉花中HUB2蛋白的表达量和/或活性升高的步骤；

所述HUB2蛋白为如下（A1）或（A2）所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第13-395位的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：使所述受体棉花中所述HUB2蛋白的表达量和/或活性升高是通过向所述受体棉花中导入所述HUB2蛋白的编码基因来实现的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述HUB2蛋白的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体棉花中的。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述HUB2蛋白的编码基因是如下任一DNA分子：

（B1）SEQ ID No.2的第41-1192位或SEQ ID No.2的第5-1192位或SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（B2）SEQ ID No.3的第10-5174位或SEQ ID No.3所示的DNA分子。

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