CN113846107B - PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用，属于基因工程技术领域。所述PpyABF3基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。本发明提供了梨中PpyABF3基因在抗盐性能中的作用，通过对秋子梨PpyABF3基因的克隆并结合同源遗传转化过表达技术对该基因进行功能验证，PpyABF3基因过表达植株的耐盐胁迫性能显著增强，可用于抗盐胁迫梨品种的选育。

Description

PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用。
背景技术
土壤盐渍化是限制植物生长的主要非生物环境胁迫因素之一，土壤中高浓度盐分会对植物细胞造成渗透胁迫和离子毒害(主要是Na+)以及氧化胁迫等次级胁迫。盐胁迫不仅会引起多种生理变化，如植物失水、黄化和萎蔫，还会引起植物体内的生化变化，一些大分子物质如蛋白质和脂类被破坏和水解，导致代谢紊乱，甚至引起植物死亡(胡涛等，2018)。
植物AREB(ABA responsive element binding protein)/ABF(ABRE bindingfactors)转录因子是特异识别ABA响应元件(ABA-responsive element，ABRE)的一类碱性亮氨酸拉链蛋白，参与调控ABA响应基因的表达，属于bZIP家族中的A亚族，在植物响应非生物胁迫的过程中具有重要作用(Choi H等，2000；Drogelaser W等，2018；Joo H等，2019)。在盐、干旱、低温等非生物胁迫下，植物体内的ABA被显著诱导合成，并启动一系列信号途径激活植物抗逆机制。
近年来AREB/ABFs转录因子在不同物种中的功能被广泛报道。例如拟南芥中ABF1受低温胁迫显著诱导，AREB1/ABF2，AREB2/ABF4和ABF3受ABA、脱水和高盐等渗透胁迫诱导(Fujita Y等，2013)。在盐胁迫条件下，转AtABF4基因马铃薯的相对含水量得到提升，并导致气孔导度和蒸腾速率低于野生型，表现出更强的耐盐性(
Figure BDA0003313947980000011
García M N等，2018)。在拟南芥中甘薯(Ipomoea batatas)IbABF4基因的过表达表现出抗盐的表型，并且进一步的生理实验表明转IbABF4基因拟南芥具有较高的光合效率、较低的丙二醛以及过氧化氢含量(Wang W B等，2019)。玉米ABF类转录因子ZmbZIP4，ZmbZIP72基因都会受到盐胁迫诱导表达。ZmbZIP4的过表达株系在萌发期和幼苗期遭受高盐胁迫后均表现出更高的存活率，而突变体则对盐胁迫更敏感。ZmbZIP4可以正调控NHX3(Na+/H+antiporter)基因的表达，增强转基因植株在盐胁迫下的离子区域化作用(Ma H Z等，2018)，对ZmbZIP72基因在拟南芥中的过表达发现，在盐胁迫后的覆水期表现出更强的恢复能力(Ying S等，2012)。苦荞麦中ABF同源基因FtbZIP5基因受到盐胁迫的诱导，在拟南芥中的过表达降低了转基因植物在盐胁迫条件下所受到的氧化损伤，并使AtRD26(responsive to dehydration 26)和AtCOR15(coldregulated 15)等ABA依赖的胁迫响应基因的表达水平显著增加(Li Q等，2020)。油菜BnaABF2基因在拟南芥中的过表达也影响了RAB18(responsive to ABA 18)和KIN2等胁迫响应基因表达的变化，从而使转基因植株气孔孔径减小并抑制了盐胁迫条件下的失水过程，从而提升了植株的抗盐能力(Zhao B等，2016)。
梨产业发展在一定程度上受土壤盐碱化问题的影响。盐胁迫威胁着梨植株的正常生长发育及代谢生理活动，生产中常选用抗盐性较强的砧木以缓和盐碱胁迫，但因为其未改变梨组抗盐性能，其效果不尽人意；且由于嫁接手段的局限性，此方法不易于推广。研究并探索梨中的抗盐相关基因，并将其应用于梨抗盐性的选育中，得到一种更简洁、更高效增加梨抗盐性的方法，是本领域人员待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于挖掘梨中的具有耐盐胁迫作用的抗性基因，并将其应用到提高梨树抗盐性的选育当中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从秋子梨组培苗中鉴定克隆得到具有耐盐胁迫作用的抗性基因PpyABF3，利用基因工程技术手段获得PpyABF3基因过表达的梨转基因株系，该株系表现出对盐胁迫的抗性显著提高，表明PpyABF3基因对改良梨树对盐胁迫抗性方面具有潜在的应用价值。
具体的，本发明提供了PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用，所述PpyABF3基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。
PpyABF3基因的编码序列全长1296bp。该基因编码的蛋白质由431个的氨基酸残基组成，其序列如SEQ ID NO.2所示。
通过对蛋白序列功能域分析显示，梨PpyABF3转录因子含有bZIP结构域以及保守的N端结构域(C1，C2，C3)，保守的丝氨酸(S)和苏氨酸(T)则是其潜在的磷酸化位点。
进一步的，所述PpyABF3基因正调控梨树对盐胁迫的抗性。
进一步的，所述应用包括：利用生物学技术手段使得梨树中PpyABF3基因上调表达，提高其对盐胁迫的抗性。
研究结果显示，在盐胁迫条件下PpyABF3基因超表达的梨愈伤组织中的丙二醛含量、脯氨酸含量以及过氧化氢含量显著低于野生型。
进一步的机理研究表明，在盐胁迫条件下，通过PpyABF3基因上调表达增强梨树中的超氧化物歧化酶活力或过氧化物酶活力，或增加总谷胱甘肽含量来提高梨树对盐胁迫的抗性。
本发明还提供了一种提高梨树盐胁迫抗性的育种方法，包括以下步骤：
(1)以秋子梨cDNA为模板，克隆得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpyABF3基因编码片段，再将PpyABF3基因编码片段插入过表达载体中构建重组质粒；
(2)利用农杆菌介导技术将PpyABF3基因编码片段导入受体梨材料中，培育获得功能性获得且稳定遗传的转基因植株。
优选的，步骤(1)中，所述过表达载体为pCAMBIA1301。利用35s强启动子对PpyABF3进行超表达。
步骤(2)中，将重组质粒转入农杆菌中，利用农杆菌介导技术将目标片段导入梨愈伤组织中使其在受体植株中过表达。优选的，农杆菌采用EHA105。
优选的，受体梨为茄梨。
本发明具备的有益效果：
本发明首次公开了梨中PpyABF3基因在抗盐性能中的作用，通过对秋子梨PpyABF3基因的克隆并结合同源遗传转化过表达技术对该基因进行功能验证，PpyABF3基因过表达植株的耐盐胁迫性能显著增强，可用于抗盐胁迫梨品种的选育。
附图说明
图1为PCR扩增产物电泳图谱，其中泳道1为DM2000 Marker，2-8分别为退火温度58、59、60、61、62、63、64℃下PpyABF3的条带。
图2为qRT-PCR检测转基因愈伤组织中PpyABF3的相对表达量，其中WT为空白对照，#2、#3为两个过表达PpyABF3的转基因愈伤细胞系。
图3为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在不同NaCl浓度处理下生长21天的状态。
图4为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天时愈伤组织的生长量。t-test
图5为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中MDA含量变化。
图6为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中PRO含量变化。
图7为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中H2O2含量变化。
图8为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中SOD含量变化。
图9为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中POD含量变化。
图10为转入空载体的愈伤(Empty vector)、PpyABF3-OE转基因愈伤组织细胞系在NaCl处理下生长21天，愈伤组织中T-GSH含量变化。
注：图2运用t-test处理数据，与WT相比，“*”的数量表示数据显著性差异大小，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。图3-10中数据为平均值±标准差(图3，去掉极值后n＝9，9个生物学重复；图4-10，取混样，n＝3，3个技术重复)，运用t-test处理数据，与Empty vector相比，“*”的数量表示数据显著性差异大小，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：梨PpyABF3基因的克隆
一、秋子梨组培苗叶片RNA提取
植物组织总RNA采用CTAB法提取，步骤包括：
1、试剂准备：
(1)CTAB RNA提取液(1L，121℃，45min灭菌)：20g CTAB，20g PVP，7.3g EDTA，1g亚精胺，12.1g Tris，117g NaCl，定容至1L。
(2)SSTE(500mL，pH＝8.0，121℃，4min灭菌)：29.25g NaCl，2.5g SDS，0.6g Tris，0.15g EDTA，定容至500mL。
(3)12M LiCl(100mL，121℃，40min灭菌)：50.87g LiCl定容至100mL。
(4)氯仿:异戊醇(24:1)：500ml氯仿(三氯甲烷)中加入21mL异戊醇。
2、耗材准备：
1.5mL和10mL的离心管，10μL、200μL、1mL和5mL的枪头，150μL的排管。121℃，45min灭菌准备待用。
3、RNA提取(在通风橱中操作)：
(1)打开水浴锅调至65℃，取12支10mL离心管，在通风橱中每管加入4mL的CTAB和80μL的β-巯基乙醇(2％)；每个样品4管提取液(四个重复)。
(2)将加好溶液的离心管放入65℃水浴锅中预热，同时研磨样品。
(3)在每管中加入0.1-1g磨好的秋子梨叶片样品，迅速在漩涡仪上混匀，放入水浴锅中水浴10min左右(<30min)，期间拿出再涡旋混匀2-3次。
(4)加入4mL氯仿/异戊醇，充分涡旋混匀，15℃，10000rpm，离心10min，取上清(800μL吸4次)，加入到新的10mL离心管中，再加4mL的氯仿/异戊醇，在涡旋仪上混匀。
(5)15℃，10000rpm，离心15min，取上清(600μL吸4次)，加入到新的10mL离心管中。
(6)加入1/5体积的12M LiCl(约480μL)，4℃冰箱放置过夜(16-18小时最佳)。
(7)离心机4℃预冷，65℃预热SSTE，无水乙醇放-20℃冰箱预冷。
(8)将(6)中的提取液从冰箱拿出，4℃，10000rpm，离心25min，倒掉上清液，用200μL的枪轻轻吸出残余液体。
(9)加入500μL预热的SSTE，吸打使其将RNA充分溶解，再加入等体积(500μl)的氯仿/异戊醇，反复吸打混匀。
(10)将混匀后约1000μL的溶液移入1.5mL的离心管中，15℃，10000rpm，离心30min。
(11)将上清吸出(200μL吸取两次)至新的1.5mL离心管中，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇。
(12)上下颠倒混匀，于-70℃冰箱放置30min。
(13)小离心机4℃预冷，并去电泳房准备1％的琼脂糖胶。
(14)取出-70℃放置的样品，4℃，12000rpm，离心30min；取出倒掉上清，短暂离心(Short)5秒左右，用枪头吸出残余液体。
(15)将沉淀在通风橱中晾干(5min左右，不宜太久或太干)，加入15-40μL的0.1％DEPC水，轻轻吸打溶解。
4、RNA质量及浓度检测：
(1)电泳检测：4μL DEPC水+1μL的RNA原液+1μL的6×Loading Buffer。28S:18S的亮度约为2:1。
(2)浓度检测：NanoDrop检测RNA浓度。
(3)置于-80℃冰箱保存。
二、反转录
使用宝日医生物技术有限公司(北京，Takara中国)的PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser反转录试剂盒进行，反应体系如下：
1、去除基因组DNA反应
(1)按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。体系如表1所示。
表1
试剂 使用(μL)
5×gDNA Eraser Buffer 2
dNTP Mixture(10mM each) 1
模板RNA n
<![CDATA[RNase Free dH<sub>2</sub>O]]> up to 10
(2)轻轻混匀，42℃孵育2min之后迅速置于冰上；
2、反转录反应
(1)反应液配制(TB Green qPCR法)
冰上配制，反应体系如表2所示。
表2
试剂 使用(μL)
步骤1的反应液 10
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1
RT Primer Mix 1
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4
<![CDATA[RNase Free dH<sub>2</sub>O]]> 4
(2)轻轻混匀，PCR反应37℃15min，85℃5s，4℃+∞
三、cDNA全长序列获得
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶，以稀释10倍的反转录产物为模板进行PCR扩增，引物序列如下：
PpyABF3-F：5’-CACCATGGGGTCTAATTTCAACTTC-3’(SEQ ID NO.3)；
PpyABF3-R：5’-TTACCAAGGGCCTGTCAATGT-3’(SEQ ID NO.4)；
反应体系及步骤如下：
(1)反应液的配制(25μl体系，冰浴)，反应体系如表3所示：
表3
试剂 使用量(μL)
Phanta 10
dNTPs 4
PpyABF3-F 1
PpyABF3-R 1
模板cDNA 1
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 8.5
DNA Polymerase 0.5
(2)PCR反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性10s；58-64℃温度梯度退火30s；72℃延伸85s；变性、退火及延伸共进行34个循环；72℃终延伸10min；
(3)1％琼脂糖凝胶用于PCR结果的凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。
(4)琼脂糖凝胶电泳产物回收：采用浙江易思得生物科技有限公司的Easy GelExtraction&Clean-up Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行琼脂糖凝胶电泳产物的回收，操作步骤按说明书进行。
(5)连接反应：将PCR产物连接到pClone007 Blunt Simple Vector载体(北京擎科生物科技有限公司)，反应体系如表4所示：
表4
试剂 使用量(μL)
pClone007Blunt Simple Vector 1
胶回收产物 4
轻柔混匀后，于25℃反应20min。
(6)转化大肠杆菌：
使用热激法进行大肠杆菌感受态细胞转化：将-80℃冰箱冻存的DH5α感受态细胞置于冰上融化，将5μL连接产物与25μL感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min。加入无抗生素液体LB培养基500μL，置于37℃摇床200rpm振荡培养1h。
(7)抗性培养：12000rpm，离心1min，弃掉多余LB培养基，留100μL上清重悬菌体，含有相应抗生素的LB固体培养基用于涂布菌液，倒置在37℃培养箱过夜培养。
(8)菌液检测：用无菌牙签在超净工作台内挑取单菌落，进行菌落PCR，PCR反应条件为：98℃预变性30sec，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸90s，34个循环，72℃终延伸10min。
应用康宁生命科学(吴江)有限公司的质粒提取试剂盒提取pClone007BluntSimple Vector的质粒(操作步骤按照康宁质粒小提试剂盒说明书进行)，浙江尚亚生物技术有限公司将提取的质粒进行测序，剩余质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。
测序结果表明，PpyABF3基因的开放阅读框有1296bp(如SEQ ID NO.1所示)，编码431个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)。
实施例2：PpyABF3基因过表达载体的构建与遗传转化
为研究PpyABF3基因的功能，将包含有PpyABF3基因编码区在内的共1296bp片段正确插入pCAMBIA1301表达载体上。
根据用于扩增基因PpyABF3的上下游引物，设计上下游引物分别加上酶切位点SpeⅠ和BstEⅡ后，以pCAMBIA1301质粒为模板进行扩增，回收目的条带后使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒连接pCAMBIA1301，转化大肠杆菌DH5α，筛菌后于浙江尚亚生物技术有限公司进行测序。测序正确后，将6×Myc标签接于pCAMBIA1301载体上，构建成新的表达载体，使目的蛋白与Myc标签位于同一编码框，将该载体命名为Myc-1301。
将克隆的PpyABF3基因片段用SpeⅠ和BstEⅡ酶切，连接到Myc-1301载体上，构成PpyABF3-OE表达载体。
将eGFP克隆至该载体，命名为Myc-GFP作为空载使用。
将PpyABF3-OE表达载体及Myc-GFP空载体分别转入到农杆菌EHA105，-80℃冰箱保存备用。
实施例3：PpyABF3过量表达梨愈伤组织的获得
一、取野生型茄梨愈伤组织于MS固体培养基(添加6-BA：0.5mg·L-1+2,4-D：1mg·L-1)培养15-20d。活化含有Myc-PpyABF3质粒的农杆菌菌株，将菌液离心，吸取MS液体培养基吸打菌体沉淀至悬浮，置于转速200rpm的摇床40min-1h，使终浓度为OD600＝0.4。挑取生长至乳白色清透状态的愈伤与上述菌液混合，室温震荡转化10min，无菌滤布过滤菌液，再用无菌滤纸吸除多余菌液，然后将愈伤转移至无抗的MS固体培养基(添加6-BA：0.5mg·L-1+2,4-D：1mg·L-1)中。25℃黑暗条件下无菌共培养3天左右，将愈伤取成黄豆大小铺于筛选培养基(TMT：200mg·L-1；Hyg：10mg·L-1)上，培养至新愈伤长出。将新长出的愈伤移到新的筛选培养基(TMT：200mg·L-1；Hyg：10mg·L-1)，继代筛选一次后，取抗性愈伤，提取DNA和RNA进行检测。
二、CTAB法提取野生型和PpyABF3过表达茄梨愈伤组织总RNA，利用ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix染料，由浙江尚亚生物技术有限公司合成引物(如表5)，检测PpyABF3基因在野生型和两个转基因茄梨愈伤组织中的表达量。
表5
引物名称 序列(5’-3’)
Q-PpyABF3-F CCGGTTCGAATTTGCCACAG
Q-PpyABF3-R CGGTTGTTGAAAGCCGGAAG
反应体系及实验步骤如下：
在冰上配制PCR反应液，反应体系如表6所示：
表6
试剂 使用量(μL)
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5
Q-PpyABF3-F 0.5
Q-PpyABF3-R 0.5
cDNA 1
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 5.5
Total 15
使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，两步法进行PCR反应，反应条件为：预变性95℃30s，然后变性95℃5s，退火65℃30s，共40个循环，最后绘制溶解曲线。采用2-ΔΔCT方法(Livak and Schmittgen,2001)进行基因表达量的计算。
结果如附图2所示，与对照相比，PpyABF3的转录水平在两个转基因细胞系#2、#3中显著升高，表明成功获得了过量表达PpyABF3的转基因茄梨愈伤组织。
三、PpyABF3过表达愈伤组织对NaCl敏感性分析
检测了盐胁迫与PpyABF3的关系，愈伤组织细胞系在不同NaCl浓度下生长21天的状态如附图3所示，在对照MS培养基上(MS基本培养基含0.5mg·L-1 6-BA+1mg·L-1 2,4-D)，转入空载体的愈伤(Vector)长势与2个转基因愈伤组织细胞系相似，而在含0.4％NaCl的MS培养基上处理后，发现转基因愈伤组织长势优于control。
培养21天后，PpyABF3基因过表达愈伤组织的生长量明显高于对照组(图4)。
采用南京建成生物工程研究所有限公司的试剂盒对愈伤进行丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢含量、总谷胱甘肽含量、过氧化物酶活力、超氧化物歧化酶活力以及抗超氧阴离子自由基活力等指标测定。按照试剂盒操作步骤进行操作，结果显示在盐处理下PpyABF3过表达的愈伤中，丙二醛含量、脯氨酸含量以及过氧化氢含量显著低于对照组(图5、6、7)；超氧化物歧化酶活力、过氧化物酶活力以及总谷胱甘肽含量显著高于对照组(图8、9、10)。表明PpyABF3基因在梨盐胁迫过程中起到正调控的作用。
综上，从梨中分离到了PpyABF3基因，通过茄梨愈伤组织转基因功能验证分析发现，PpyABF3在提高植株的抗性方面具有显著效果，提高了转基因植株的抗盐能力，对于梨新品种的选育具有重要意义。
序列表
<110> 浙江大学
<120> PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1296
<212> DNA
<213> 梨(pyrus ussuriensis maxim)
<400> 1
atggggtcta atttcaactt caagagcttt ggtgaagcag caccagtgga aggcaatggt 60
gggagggcag gaggaagttt tggattggtg cggcagtctt cggtgtactc attgacgttt 120
gatgagttcc agaacacgat aggtggactt gggaaggatt atggatcaat gaacatggat 180
gaactgttga aaaatatatg gaccgctgag gagactcaag gcatgacggc tacttctggg 240
gtcggagggg aagtaaatgc cccggggggt aatttgcaga gacaaggttc gttaacgttg 300
ccgcgaacgc ttagtcagaa aacggttgat gaggtttgga aaaatttgat tagagagact 360
actgattata agtataataa tgttgccgcc ggttcgaatt tgccacagag acaacaaact 420
ttgggagaga tgaccttgga ggactttctg ttgaaagcag gggtcgtgag agaagatata 480
cagccaccag ttgtaaggcc taataatggt ggattctatg gtgaattata ccgtcctaaa 540
aacaacgttg gtttagcttc cggctttcaa caaccgaata taagcaacgg tattttgggg 600
aatcgagttg cggacaacaa aaattcagtt ccaaatcagt ctcctacttt agcacttaat 660
gttggtggag tgagaacttc tcagcaacaa acgctgcagt tgcccccaca acagcagcca 720
ctcttcccca agccttcaac catggcgttt gccccatcta tgcatttggt aaacaatgct 780
cagctaagta gcccaagaac taggggacca atggctgggg ttgtggaacc ttctatgaac 840
accgctttct ctcaagctgg agggtttccg ggtgcaggaa ttggcacggt tggtttgggc 900
actgggggcg gtgcagttgc aacaagatct cctgcaaatc agatatcacc ggatgtaatt 960
gctaagagca gtggggatac atcttcattg tcgccggtac cttacatgtt taaccgggga 1020
aggaagtgca gtggagctgt ggagaaagta gttgagagaa ggcaaaggag aatgataaaa 1080
aacagagaat ctgctgcaag gtctcgtgct cgtaaacagg cctatacctt agaactagag 1140
gcagaagttg caaaacttaa agaaatgaac gaagaattac agaaaaaaca ggaggaaatt 1200
atggaagtgc agaaagatca gatgttggag acaatgaagc ggcaatgggg aggcaaaagg 1260
caatgcttac gacgaacatt gacaggccct tggtaa 1296
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> 梨(pyrus ussuriensis maxim)
<400> 2
Met Gly Ser Asn Phe Asn Phe Lys Ser Phe Gly Glu Ala Ala Pro Val
1               5                   10                  15
Glu Gly Asn Gly Gly Arg Ala Gly Gly Ser Phe Gly Leu Val Arg Gln
            20                  25                  30
Ser Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Asn Thr Ile Gly
        35                  40                  45
Gly Leu Gly Lys Asp Tyr Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Ile Trp Thr Ala Glu Glu Thr Gln Gly Met Thr Ala Thr Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Gly Gly Glu Val Asn Ala Pro Gly Gly Asn Leu Gln Arg Gln Gly
                85                  90                  95
Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val
            100                 105                 110
Trp Lys Asn Leu Ile Arg Glu Thr Thr Asp Tyr Lys Tyr Asn Asn Val
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Ser Asn Leu Pro Gln Arg Gln Gln Thr Leu Gly Glu Met
    130                 135                 140
Thr Leu Glu Asp Phe Leu Leu Lys Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Ile
145                 150                 155                 160
Gln Pro Pro Val Val Arg Pro Asn Asn Gly Gly Phe Tyr Gly Glu Leu
                165                 170                 175
Tyr Arg Pro Lys Asn Asn Val Gly Leu Ala Ser Gly Phe Gln Gln Pro
            180                 185                 190
Asn Ile Ser Asn Gly Ile Leu Gly Asn Arg Val Ala Asp Asn Lys Asn
        195                 200                 205
Ser Val Pro Asn Gln Ser Pro Thr Leu Ala Leu Asn Val Gly Gly Val
    210                 215                 220
Arg Thr Ser Gln Gln Gln Thr Leu Gln Leu Pro Pro Gln Gln Gln Pro
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Met Ala Phe Ala Pro Ser Met His Leu
                245                 250                 255
Val Asn Asn Ala Gln Leu Ser Ser Pro Arg Thr Arg Gly Pro Met Ala
            260                 265                 270
Gly Val Val Glu Pro Ser Met Asn Thr Ala Phe Ser Gln Ala Gly Gly
        275                 280                 285
Phe Pro Gly Ala Gly Ile Gly Thr Val Gly Leu Gly Thr Gly Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Ala Asn Gln Ile Ser Pro Asp Val Ile
305                 310                 315                 320
Ala Lys Ser Ser Gly Asp Thr Ser Ser Leu Ser Pro Val Pro Tyr Met
                325                 330                 335
Phe Asn Arg Gly Arg Lys Cys Ser Gly Ala Val Glu Lys Val Val Glu
            340                 345                 350
Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser
        355                 360                 365
Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala
    370                 375                 380
Lys Leu Lys Glu Met Asn Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln Glu Glu Ile
385                 390                 395                 400
Met Glu Val Gln Lys Asp Gln Met Leu Glu Thr Met Lys Arg Gln Trp
                405                 410                 415
Gly Gly Lys Arg Gln Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp
            420                 425                 430
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccatgggg tctaatttca acttc 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaccaaggg cctgtcaatg t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggttcgaa tttgccacag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggttgttga aagccggaag 20

Claims (7)

1.PpyABF3基因在调控梨树耐盐胁迫中的应用，其特征在于，所述应用包括：利用同源遗传转化过表达技术使得梨树中PpyABF3基因上调表达，提高其对盐胁迫的抗性，所述PpyABF3基因的编码序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PpyABF3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在盐胁迫条件下，通过PpyABF3基因上调表达增强梨树中的超氧化物歧化酶活力或过氧化物酶活力，或增加总谷胱甘肽含量来提高梨树对盐胁迫的抗性。
4.一种提高梨树盐胁迫抗性的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以秋子梨cDNA为模板，克隆得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpyABF3基因编码片段，再将PpyABF3基因编码片段插入过表达载体中构建重组质粒；
(2)利用农杆菌介导技术将PpyABF3基因编码片段导入受体梨材料中，培育获得功能性获得且稳定遗传的转基因植株。
5.如权利要求4所述的提高梨树盐胁迫抗性的育种方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过表达载体为pCAMBIA1301。
6.如权利要求4所述的提高梨树盐胁迫抗性的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，农杆菌采用EHA105。
7.如权利要求4所述的提高梨树盐胁迫抗性的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，受体梨为茄梨。
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