CN108823220A

CN108823220A - 一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用

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Publication number: CN108823220A
Application number: CN201810823230.6A
Authority: CN
Inventors: 李媛媛; 郝玉金; 齐晨辉
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN108823220B

Abstract

本发明涉及一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用，所述MdCER1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将MdCER1基因的超量表达载体转入拟南芥中，获得转基因拟南芥。本发明首次通过植物基因工程技术改善植物表皮蜡质含量和抗旱性等性状，获得了从苹果中分离克隆出的蜡质相关基因MdCER1完整编码区段的DNA片段，并发现在MdCER1基因超量表达的转基因材料蜡质含量明显增高，表皮的通透性降低，对ABA更敏感，抗干旱能力明显提高。

Description

一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

我国苹果的栽培面积、总产量和出口量均居世界首位，是世界最大的苹果生产、出口和消费国。近年来，随着生活水平的提高，人们对果品的消费需求也发生了从数量到质量的转变，提高果实外观品质已成为当前国内果品生产上迫切需要解决的重要问题之一。

果实表皮蜡质作为其与外界的第一道屏障，具有保护果实免受外界生物以及非生物侵害、阻止组织内水分的非气孔性散失、维持植物表面清洁、减少污染物滞留沉积以及使其表面具有防水等作用。同时，蜡质决定了苹果的光泽品质。

大部分蜡质位于外角质层，多呈现出绿灰色或灰白色。角质层蜡质的物理化学性质决定了其功能对植物生命活动的重要性。它限制了非气孔性的水分散失，降低紫外线辐射损伤，还通过降低植物表皮的水分含量减少了灰尘、花粉和大气污染物的沉积。此外，表皮蜡质还被认为在抵抗细菌和真菌病原体的侵害方面起到重要作用，并且还参与了植物与昆虫的相互作用。鉴于角质层蜡质在植物抗逆境方面的重要作用，越来越多的研究开始关注这一领域。

植物外层蜡质主要由特长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)及其衍生物组成,主要包括醛、烷烃、酮、初级醇、次级醇、酯等,还含有一些三萜类和小分子次级代谢物。研究发现，CER基因与植物角质层蜡质形成密切相关。例如，水稻中wax crystal-sparse leaf4(WSL4)基因，是拟南芥CER6的同源基因，能够影响蜡的组分。在wsl4-1和wsl4-2突变体中，超过30C的蜡组分含量是显著减少的。OsCER2是WSL4的辅因子，也是拟南芥CER2的同系物。研究表明WSL4参与超过C22的VLCFA延伸并且超过C24的延伸需要OsCER2的参与，这些结果表明，WSL4和OsCER2的功能组合式延伸C24-C30脂肪酸所必需的。AtCER17编码ACYL COENZYME A DESATURASE LIKE4(ADS4)，能够参与不饱和蜡质组分不饱和脂肪醇的合成，并且能够参与拟南芥花序茎表皮角质cutin单体的合成以及角质结构的合成，尤其是花序茎顶端。

随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重要任务，因此苹果育种在世界各国果树研究工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。本发明为果树育种提供了一种新的、快速的途径，尤其是在转基因苹果砧木和品质改良中，MdCER1基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程和品质改良提供新的候选基因，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克隆出一种苹果中调控蜡质合成相关基因MdCER1，并验证其功能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，公开了一种苹果中调控蜡质合成的MdCER1基因及其应用，其完整编码区段的DNA片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明公开了一种苹果MdCER1基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取‘Gala’苹果组培叶片中的RNA及反转录；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的拟南芥中CER1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物MdCER1-F,MdCER1-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdCER1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdCER1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行回收、载体连接、转化、测序，得到MdCER1基因的开放阅读框(openreading frame,ORF)为1,872bp，编码624个氨基酸。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdCER1基因在转基因拟南芥中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdCER1基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达MdCER1基因的转基因拟南芥蜡质含量显著升高，表皮晶体明显增多，通透性明显降低，对ABA敏感性增加，在干旱胁迫下，死亡率相比于野生型明显降低，说明MdCER1基因在植株抗性中发挥重要作用。

综上，本发明从苹果中分离到了一个苹果蜡质合成相关基因MdCER1，通过在拟南芥中转基因功能验证表明，MdCER1基因能够提高植株蜡质含量，降低表皮的通透性，提高对ABA的敏感性，提高植株的抗干旱能力；通过转基因苹果愈伤组织发现MdCER1基因能够提高愈伤的抗旱性；VIGS瞬时转化苹果果实结果表明MdCER1能够促进苹果果实蜡质的积累。

附图说明

附图1为PCR扩增产物电泳图谱。

附图2为qRT-PCR分析MdCER1在拟南芥中的异位表达。其中Control为对照，MdCER1-OE-1、MdCER1-OE-2、MdCER1-OE-3分别为转基因拟南芥。

附图3为qRT-PCR分析MdCER1在拟南芥中不同组织中的异位表达。

附图4为qRT-PCR分析MdCER1在苹果愈伤组织中的表达，其中WT为对照，MdCER-1、MdCER-2、MdCER-3为苹果愈伤组织。

附图5为异位表达MdCER1的3个拟南芥株系和对照拟南芥Emptyvector(EV)莲座叶总蜡量的测定。

附图6为SEM观察对照和异位表达MdCER1的3个拟南芥株系莲座叶表皮蜡。放大倍数为40000倍，scalebar＝1μm。

附图7为EV和异位表达MdCER1拟南芥在MS、MS+10μmol·L-1ABA、MS+30μmol·L-1ABA培养基上的生长情况。

附图8为EV与异位表达MdCER1的3个拟南芥株系在MS、MS+10μmol·L-1ABA、MS+30μmol·L-1ABA培养基上生长的根长统计。

附图9为对照和异位表达MdCER1的3个拟南芥株系莲座叶叶片的失水实验。

附图10为对照和异位表达MdCER1的3个拟南芥株系莲座叶叶片的0.05％TB染色实验。

附图11为EV与异位表达MdCER1拟南芥在土壤中进行的干旱实验。

附图12为EV与异位表达MdCER1的3个拟南芥株系在MS、MS+4％PEG、MS+6％PEG培养基上的生长情况，scalebar＝1cm。

附图13为EV与异位表达MdCER1拟南芥在MS、MS+4％PEG、MS+6％PEG培养基上拟南芥根长统计。

附图14为检测正常浇水和缺水处理的EV与异位表达MdCER1拟南芥叶绿素含量。

附图15为PEG模拟干旱条件下的苹果愈伤组织丙二醛含量分析。

附图16为MdCER1转入苹果果实的瞬时表达量分析，其中pIR为瞬时表达空载体，MdCER1-pIR为MdCER1瞬时过量表达的转基因苹果果实，TRV为瞬时沉默空载体，MdCER1-TRV为MdCER1瞬时沉默表达的转基因苹果果实。

附图17为MdCER1转入苹果果实的总蜡含量分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：苹果MdCER1基因的克隆

(一)嘎啦组培叶片RNA提取及反转录

1、利用CTAB法提取总RNA

(1)取1.5g经200mmol l^-1NaCl盐处理24h的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；

(2)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(其中PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5h，其中提取缓冲液组成见表1:

表1-提取缓冲液组成

(3)加入与上述步骤(2)离心管中液体等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5h，4℃，12,000rpm离心20min，将上清液转移到新的50ml离心管中；

(4)加入1/3上清液体积的10mol·L-1预冷LiCl，-20℃放置3h，12,000rpm离心30min，弃上清液；

(5)加入500μl SSTE缓冲液充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中，其中SSTE缓冲液组成见表2：

表2-SSTE缓冲液

(6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2h；

(9)于4℃、12,000rpm离心20min，70％乙醇洗2次；

(10)于4℃、14,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；加入20μl DEPC水溶解RNA。

(11)置于-80℃储藏，备用,或立即进行以下反转录实验。

2、反转录cDNA第一链的合成

(1)在0.2ml的微量离心管中配制表3混合液(其中表3中RNA为步骤1提取获得的；如果用的是-80℃储藏RNA，必须让其在冰上缓慢融解)：

表3-混合液

(2)用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在PCR仪上(65℃，5min)进行变性、退火反应，然后冰上急冷；

(3)在上述微量离心管中继续配制表4反转录反应液。

表4-反转录反应液

(4)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃保存。合成的反转录产物cDNA，用于进行后面的相关实验。

3、cDNA末端加尾

利用TdT末端转移酶，步骤2中反转录合成的cDNA 3’末端加上Poly(C)尾巴，以此为模板进行5’RACE扩增。具体步骤如下：

在1.5ml离心管中依次加入表5的PCR反应试剂，终体积为50μl。

表5-PCR反应试剂

(1)37℃反应30min；

(2)加入50μl(等体积)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(3)加入50μl(等体积)的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(4)加入5μl(1/10体积)3M NaAC(pH 5.2)，再加入125μl(2.5倍体积)预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60min；

(5)4℃、12,000rpm离心15min，70％乙醇洗2次；

(6)4℃、12,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；用20μl无菌水溶解DNA，4℃保存。获得的加尾cDNA作为模板用于后面的5′RACE扩增。

(二)cDNA全长序列的获得

根据NCBI查到的拟南芥中CER1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物MdCER1-F，MdCER1-R，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdCER1-F：5’-ATGGCTACTACTCCCGGAATTCTC-3’，其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

MdCER1-R：5’-ATTTTTGGTGTGAGAGGTACTGAT-3’，其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

其中，PCR扩增体系见表6。

表6-PCR扩增体系

PCR反应程序：94℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，35次循环；72℃延伸7min。

PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图谱如附图1所示，回收目的条带(回收根据Takara公司“Agarose Gel DNAPurification Kit”操作)，连接到pMD18-T克隆载体进行测序(操作步骤按pMD18-T Vector说明书进行)，转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在表面涂有IPTG/X-Gal的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20h；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌液取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到MdCER1基因序列，开放阅读框(open reading frame,ORF)为1,872bp，编码624个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，应用天根质粒提取试剂盒提取pMD18-T-MdCER1的质粒DNA(操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明书进行)，提取的质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2：MdCER1基因表达载体的构建

为研究MdCER1基因的功能，将包含有MdCER1基因编码区在内的共1,872bp片段正确插入表达载体pCXSN-HA上。

1、根据分离出的MdCER1基因的核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，设计带A的上游引物EMdCER1-F，便于连接表达载体，下游引物应用cDNA扩增全长下游引物MdCER1-R(序列如SEQ.ID.NO.4所示)，以保存的pMD18-T-MdCER1的质粒DNA为模板，进行PCR反应。

EMdCER1-F：5’-AATGGCTGTTTCACAAAACAATC-3’，其序列如SEQ.ID.NO.5所示。

2、PCR反应结束后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物回收。将pCXSN-HA载体用Xcm I进行单酶切，酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收。

3、将回收的PCR产物和酶切产物用T4连接酶进行连接(操作步骤按照T4连接酶说明书)、转化、测序。筛选阳性克隆进行测序，从中选择正确的重组子MdCER1-pCXSN-HA。

4、用构建好的重组子MdCER1-pCXSN-HA转化农杆菌GV3101感受态细胞。进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子MdCER1-pCXSN-HA单克隆用于后续的遗传转化。

实施例3：转基因拟南芥的获得

1、将野生型拟南芥种子，分别用70％酒精消毒3min，4％次氯酸钠消毒8～10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干水；播种于种子萌发培养基上(直接铺于表面)，光培养(25～28℃，16h长日照或8h短日照10d)，至小苗长出，移栽到基质培养到开花。

2、挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mLYEP液体培养基(含50mg·L^-1潮霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为0.6～0.8(约48h)；取其中l mL菌液加入20mLYEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为0.6～0.8(约5h)；然后离心收集菌体，用侵染液(含0.05g·mL^-1蔗糖、0.03-0.05％Silweet)悬浮稀释20倍，备用。

3、将拟南芥花序浸到侵染液中15～20s，收集果荚，50mg·L^-1卡那霉素抗性筛选后，PCR检测得到阳性转基因植株，通过qRT-PCR，分析MdCER1在拟南芥中的异位表达量，如附图2所示。并分别对转基因植株不同的组织，根、茎、叶、花、果实中的表达量进行分析，如附图3所示。阳性转基因植株经过连续3代筛选得到T3代纯合体，收取种子，进行表型分析。

实施例4：MdCER1过量表达苹果愈伤组织的获得

将准备侵染的野生型‘王林’苹果愈伤组织，隔7-9天周期继代，为乳白色或蛋黄色小颗粒为宜。农杆菌准备和活化方法同实施例3步骤2。取生长状态良好的苹果愈伤组织，置于农杆菌中浸泡10min，用灭菌的滤纸吸净农杆菌菌液，接种到无抗生素的培养基(MS+6-BA0.4mg l^-1+2,4-D 1.5mg l^-1)上，暗培养2天后用灭菌水洗3-5次，洗去多余的农杆菌。用灭菌的滤纸将水吸干后，转移至加Cb(300mg l^-1),Kana(30mg l^-1)的继代培养基上，铺成薄薄的一层。继代筛选3-5次后，取抗性愈伤，提取DNA和RNA进行检测。

提取野生型和MdCER1转基因苹果愈伤组织总RNA，设计定量检测引物MdCER1-Q-F和MdCER1-Q-R，应用qRT-PCR检测MdCER1基因在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量。如附图4所示，与对照相比，MdCER1的转录水平在三个转基因株系中显著升高，表明成功获得了MdCER1过量表达的转基因苹果愈伤。MdCER1-Q-F序列如SEQ.ID.NO.6所示，MdCER1-Q-R序列如SEQ.ID.NO.7所示。

实施例5：拟南芥表皮蜡质的提取和扫描电镜(SEM)观察

选取生长5周的拟南芥材料，用剪刀将拟南芥莲座叶从底端剪下，注意不要碰触表面蜡质层，放入30ml的玻璃样品瓶中，加入10ml色谱纯正己烷温柔震荡提取表皮蜡质，提取液转移到新的样品瓶中，剩余组织再次用10ml色谱纯正己烷进行蜡质提取。合并两次提取液，50℃加热条件下，氮气吹干溶剂正己烷。称重，增加的重量即为蜡质重量。蜡质提取结束后，将叶片置于通风橱中晾干，随后平铺于叶面积仪上扫描出拟南芥莲座叶的表面积。如附图5所示，异位表达MdCER1的3个拟南芥株系总蜡量明显升高。

应用SEM观测表皮蜡晶体结构。选择生长5周的健壮的拟南芥莲座叶进行固定、漂洗、脱水、干燥、镀膜，然后进行扫描电镜SEM观测，结果如附图6所示，相比于对照拟南芥，异位表达MdCER1的3个拟南芥株系表皮蜡晶体数量显著增多，表明MdCER1基因能够促进拟南芥的蜡质合成。

实施例6：MdCER1转基因拟南芥对ABA敏感性分析

为了研究MdCER1与ABA的关系，将转空载体的拟南芥Empty vector(EV，以下称为对照拟南芥)及MdCER1转基因株系(L1，L2，L3)的种子播种到MS培养基上，4d后将幼苗分别转接至MS、MS+10μmol l^-1ABA、MS+30μmol l^-1ABA的培养基上，放置于25℃光照培养箱中培养，7d后测量拟南芥幼苗的根系发育情况，统计主根长度，如附图7-8所示，发现相比于EV，10μmol l^-1和30μmol l^-1的ABA处理使得MdCER1转基因拟南芥主根生长明显受到抑制。

实施例7：拟南芥失水检测和甲苯胺蓝染色(toluidine blue staning)

选取健康生长5周的对照拟南芥和异位表达MdCER1基因的拟南芥，剪下莲座叶，立即在黑暗条件下，置于去离子水中浸润1h，随后用吸水纸将材料表面残留水分去除。在黑暗中每隔40min对材料称重一次，直至160min，计算拟南芥莲座的叶失水速率。结果发现，超量表达MdCER1的转基因拟南芥失水率显著低于对照拟南芥，如附图9所示。

同时，剪下健康生长5周的拟南芥莲座叶，完全浸入0.05％的甲苯胺蓝溶液中染色15min。随后将材料取出，用去离子水漂洗2-3次。如附图10所示，观察染色情况，发现相比于对照拟南芥，异位表达MdCER1的3个拟南芥叶片不易被染色。以上结果表明MdCER1基因使得拟南芥莲座叶表皮通透性明显降低。

实施例8：拟南芥干旱实验及干旱条件下叶绿素含量测定

如附图11所示，将对照拟南芥和异位表达MdCER1拟南芥置于正常条件下生长20天，20天后不再浇水，直到对照拟南芥叶片开始萎蔫，观测拟南芥的表型，发现在适度缺水的条件下，对照拟南芥明显表现出萎蔫时，MdCER1转基因拟南芥仍然能够正常生长。

如附图12-13所示，在MS培养基中加入不同浓度PEG，模拟干旱胁迫。将转空载体的拟南芥Empty vector(EV，以下称为对照拟南芥)及MdCER1-OE转基因株系(L1，L2，L3)的种子播种到MS培养基上，4d后将幼苗分别转接至MS、MS+4％PEG、MS+6％PEG的培养基上，放置于25℃光照培养箱中培养，7d后测量拟南芥幼苗的根系发育情况，统计主根长度,发现经过PEG处理的转基因拟南芥根系长度明显长于对照，说明转基因拟南芥对于干旱的抗性更强。

同时检测适度缺水情况下拟南芥叶绿素的含量，将拟南芥叶片浸入到95％乙醇，浸泡24h后，将提取液分别吸出到新管中，将提取液分别在649nm和665nm处测吸光度，并根据叶绿素含量＝(13.95×D₆₆₅-6.88×D₆₄₉)+(24.96×D₆₄₉-7.32×D₆₆₅)公式计算叶绿体含量。如附图14所示，结果发现，在适度缺水条件下，异位表达MdCER1的拟南芥叶绿素含量明显高于对照拟南芥。这表明，MdCER1能够增强植物抗旱性。

实施例9 PEG模拟干旱条件下的苹果愈伤组织丙二醛含量分析

用正常愈伤继代培养基(control)和添加6％PEG的培养基分别处理野生型和转基因苹果愈伤组织，于25℃暗室培养，每个板重复3次。三周后分别称量鲜样质量，然后将愈伤组织置于加有0.5％硫代巴比妥酸的磷酸缓冲液中，于沸水中煮10min，待试管冷却后，4,000g离心10min，以0.5％硫代巴比妥酸为空白对照，测定450nm、532nm、600nm下的吸光值，根据公式MDA＝(6.45×(D532-D600)-0.56×D450)×提取液体积/愈伤组织鲜重计算丙二醛含量。如附图15所示，发现在正常愈伤培养基上，野生型愈伤以及3个转基因愈伤组织的丙二醛含量相差不大，PEG处理后，发现与正常培养基相比，野生型和转基因苹果愈伤的丙二醛含量均明显上升，表明MdCER1能够响应干旱信号；同时发现PEG处理后转基因愈伤中丙二醛的含量显著低于野生型对照，这表明在苹果愈伤组织中过量表达MdCER1基因能显著提高苹果愈伤对干旱的抗性。

实施例10 MdCER1瞬时表达转基因苹果的获得及蜡质含量分析

构建pIR正义瞬时表达载体，提取质粒后，与辅助质粒IL60-1一起，分别用10mMMgCl₂溶液稀释至10ngμl^-1；将pIR正义瞬时表达载体质粒与辅助质粒IL60-1按9：1比例充分混匀，注射苹果果皮，pIR空载体注射作为对照。置于常温下7天取注射点周围果皮，提取RNA，检测MdCER1基因表达。

构建TRV瞬时沉默载体，与辅助载体TRV1分别转入农杆菌LBA4404感受态；按转基因拟南芥的方法，活化农杆菌，用TRV侵染液稀释菌体至OD600＝0.6，将TRV瞬时沉默载体菌液与TRV1辅助载体菌液按1：1比例混匀，注射苹果果皮，TRV空载体注射作为对照。4℃黑暗处理3天后，转移至常温7天取注射点周围果皮，提取RNA，检测MdCER1基因表达。

如附图16所示，对于VIGS载体注射的苹果果实进行RT-PCR检测，发现成功获得了MdCER1瞬时过量和沉默表达的转基因苹果果实。如附图17所示，应用拟南芥的蜡质提取方法提取MdCER1过量表达和对照pIR，以及MdCER1沉默表达和对照TRV的总蜡，结果表明，MdCER1能够显著提高苹果总蜡的含量，而沉默MdCER1基因导致苹果果实总蜡含量降低。

综上，从苹果中分离到了MdCER1基因，通过在拟南芥及苹果愈伤组织中转基因功能验证分析发现，MdCER1在促进蜡质积累和抵抗外界干旱中具有显著作用。可将该基因转化小麦、玉米、棉花等一年生农作物，或梨、桃、杏等多年生木本植物，提高其抗逆境能力，改善果实光泽品质，具有重要的经济效益和社会效益。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用

<141> 2018-07-24

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1872

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggctacta ctcccggaat tctcactgaa tggccatgga ctcctcttgg aagctttaag 60

catgtggtcg tggctccttg gatcattcac ggtacatact cgtattttgc taacgatgag 120

gaagataaag atctatctta tttcctcata tttccactta ttctgtggag gtttgtccac 180

aaccagttat ggatctctct ttctcgatat cggacggcca agggcaacgg ccggattgtt 240

gacaagagcc tcgaattcga acaagtcgac agagaaagaa actgggatga tcaaatattg 300

ttcaactcaa ttctattcta cctagggagc aggcacttgc caggggcttc aaacctgcca 360

atgtggagga cagatggagt tattctaaca attctgcttc atgctggtcc ggtggagttt 420

ctctactact ggttccacag agcacttcac caccatttcc tatactctcg ctaccactct 480

catcaccatt cctccattgt cactgagcca atcacttctg tgattcaccc atttgcggag 540

cacatcgcat atttcatact ctttgctata ccaatgttga caactctatt caccggaaca 600

acttctgtcg cagtctatgc tggttattta acttatattg acttcatgaa caacatggga 660

cattgcaatt ttgagctcat tccaaattgg ctcttcacca ttttcccccc tctcaagtat 720

ttcatgtaca ctccatcgta ccattctttg caccacacac aatttaggac caattactct 780

ctcttcatgc caatctacga ctacatgtat ggcaccatgg acaaatcaaa cgattccctc 840

tatgatactt cactcaagcg aggggaggaa ttgccagatg tcctccayct aacccatcta 900

acaacgcccg agtccatata ttatctaccg ctaggatttg tttccttggc ctctaggccc 960

cacacaagga cgtggtactt gtggttgatg tggcctctca cattgtggtc catgatgata 1020

acttggatct atggccgtac ttttgtcgtt gaaaggcacc gctttcacga gttcagatta 1080

cagacttggg ctattccaaa gtacactttg caatacttta tgaaatggca aagtgaagct 1140

atcaatggct tgattgagga agccatactt gatgcagagg aaaaaggtgt caaagttttg 1200

agcctaggtc ttttaaatca gggtgaagag ttgaataggt atggcggtct ctatgttcaa 1260

aggcatccac atctcaaaat caaggtggtg gatggaagta gtttagttgt ggctgtaatc 1320

ctaaacagca ttccaaaagg gacaactcaa gtcgttctta gaggcaatct cacaaaggtt 1380

gcttatgcca ttgcccatgc tttgagccag aagggtatcc agatagctac attacaccag 1440

gctgaacatt tgaaactcac caaatcatta aatggcactg aaagtaacct aattgttgca 1500

aaaagctatg cacaaaagat atggttggtg ggtgatggat tgaccgaaaa agaacagatg 1560

cgtgcaccaa aaggaacact atttgttccc ttctcacaat tcccacccaa aaaattgcgc 1620

aaggactgct tctatcacta cactccagca atgaagactc ccgcatctct tgagaatgtt 1680

cactcttgcg agaactggtt gccaagaagg gtgatgagtg catggcgagt tgcgggcata 1740

gtgcatgcct tggaaggttg gaaggagcat gagtgtggtt acaccatgtc taacagcgac 1800

aaagtttggc aagcaagtct tgtgcatggg tttcagcctc tgacgatcag tacctctcac 1860

accaaaaatt ag 1872

<210> 2

<211> 623

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Thr Thr Pro Gly Ile Leu Thr Glu Trp Pro Trp Thr Pro Leu

1 5 10 15

Gly Ser Phe Lys His Val Val Val Ala Pro Trp Ile Ile His Gly Thr

20 25 30

Tyr Ser Tyr Phe Ala Asn Asp Glu Glu Asp Lys Asp Leu Ser Tyr Phe

35 40 45

Leu Ile Phe Pro Leu Ile Leu Trp Arg Phe Val His Asn Gln Leu Trp

50 55 60

Ile Ser Leu Ser Arg Tyr Arg Thr Ala Lys Gly Asn Gly Arg Ile Val

65 70 75 80

Asp Lys Ser Leu Glu Phe Glu Gln Val Asp Arg Glu Arg Asn Trp Asp

85 90 95

Asp Gln Ile Leu Phe Asn Ser Ile Leu Phe Tyr Leu Gly Ser Arg His

100 105 110

Leu Pro Gly Ala Ser Asn Leu Pro Met Trp Arg Thr Asp Gly Val Ile

115 120 125

Leu Thr Ile Leu Leu His Ala Gly Pro Val Glu Phe Leu Tyr Tyr Trp

130 135 140

Phe His Arg Ala Leu His His His Phe Leu Tyr Ser Arg Tyr His Ser

145 150 155 160

His His His Ser Ser Ile Val Thr Glu Pro Ile Thr Ser Val Ile His

165 170 175

Pro Phe Ala Glu His Ile Ala Tyr Phe Ile Leu Phe Ala Ile Pro Met

180 185 190

Leu Thr Thr Leu Phe Thr Gly Thr Thr Ser Val Ala Val Tyr Ala Gly

195 200 205

Tyr Leu Thr Tyr Ile Asp Phe Met Asn Asn Met Gly His Cys Asn Phe

210 215 220

Glu Leu Ile Pro Asn Trp Leu Phe Thr Ile Phe Pro Pro Leu Lys Tyr

225 230 235 240

Phe Met Tyr Thr Pro Ser Tyr His Ser Leu His His Thr Gln Phe Arg

245 250 255

Thr Asn Tyr Ser Leu Phe Met Pro Ile Tyr Asp Tyr Met Tyr Gly Thr

260 265 270

Met Asp Lys Ser Asn Asp Ser Leu Tyr Asp Thr Ser Leu Lys Arg Gly

275 280 285

Glu Glu Leu Pro Asp Val Leu His Leu Thr His Leu Thr Thr Pro Glu

290 295 300

Ser Ile Tyr Tyr Leu Pro Leu Gly Phe Val Ser Leu Ala Ser Arg Pro

305 310 315 320

His Thr Arg Thr Trp Tyr Leu Trp Leu Met Trp Pro Leu Thr Leu Trp

325 330 335

Ser Met Met Ile Thr Trp Ile Tyr Gly Arg Thr Phe Val Val Glu Arg

340 345 350

His Arg Phe His Glu Phe Arg Leu Gln Thr Trp Ala Ile Pro Lys Tyr

355 360 365

Thr Leu Gln Tyr Phe Met Lys Trp Gln Ser Glu Ala Ile Asn Gly Leu

370 375 380

Ile Glu Glu Ala Ile Leu Asp Ala Glu Glu Lys Gly Val Lys Val Leu

385 390 395 400

Ser Leu Gly Leu Leu Asn Gln Gly Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Gly Gly

405 410 415

Leu Tyr Val Gln Arg His Pro His Leu Lys Ile Lys Val Val Asp Gly

420 425 430

Ser Ser Leu Val Val Ala Val Ile Leu Asn Ser Ile Pro Lys Gly Thr

435 440 445

Thr Gln Val Val Leu Arg Gly Asn Leu Thr Lys Val Ala Tyr Ala Ile

450 455 460

Ala His Ala Leu Ser Gln Lys Gly Ile Gln Ile Ala Thr Leu His Gln

465 470 475 480

Ala Glu His Leu Lys Leu Thr Lys Ser Leu Asn Gly Thr Glu Ser Asn

485 490 495

Leu Ile Val Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Lys Ile Trp Leu Val Gly Asp

500 505 510

Gly Leu Thr Glu Lys Glu Gln Met Arg Ala Pro Lys Gly Thr Leu Phe

515 520 525

Val Pro Phe Ser Gln Phe Pro Pro Lys Lys Leu Arg Lys Asp Cys Phe

530 535 540

Tyr His Tyr Thr Pro Ala Met Lys Thr Pro Ala Ser Leu Glu Asn Val

545 550 555 560

His Ser Cys Glu Asn Trp Leu Pro Arg Arg Val Met Ser Ala Trp Arg

565 570 575

Val Ala Gly Ile Val His Ala Leu Glu Gly Trp Lys Glu His Glu Cys

580 585 590

Gly Tyr Thr Met Ser Asn Ser Asp Lys Val Trp Gln Ala Ser Leu Val

595 600 605

His Gly Phe Gln Pro Leu Thr Ile Ser Thr Ser His Thr Lys Asn

610 615 620

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atttttggtg tgagaggtac tgat 24

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aatggctgtt tcacaaaaca atc 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atttttggtg tgagaggtac tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aaggactgct tctatcacta 20

Claims

1.一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1，其特征在于，所述苹果MdCER1基因的编码区序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因还包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列。

3.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因还包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。

4.一种利用权利要求1所述苹果MdCER1基因编码出的氨基酸，其特征在于，所述苹果MdCER1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

5.一种扩增MdCER1基因的引物对序列，其特征在于，所述引物序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示。

6.一种苹果MdCER1基因在转基因拟南芥中的应用，其特征在于，能够增加转基因拟南芥和苹果果实蜡质含量，提高转基因拟南芥和苹果愈伤组织抵抗干旱的能力。

7.一种苹果MdCER1基因的应用，其特征在于，能够增加木本植物和草本植物的蜡质含量，提高植物抗逆性。

8.如权利要求7所述的基因的应用，其特征在于，所述木本植物包括苹果、桃、梨、杏、杨树，所述草本植物包括小麦、玉米、水稻。