CN107574169A - 一种苹果MdNRT2,4‑1基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苹果中一种促进硝酸盐吸收的MdNRT2,4‑1基因及其应用，所述MdNRT2,4‑1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将MdNRT2,4‑1基因的超量表达载体转入苹果王林愈伤组织和拟南芥中，获得转基因苹果王林愈伤组织和拟南芥。本发明首次通过植物基因工程技术提高硝酸盐吸收的生产性状，获得了一种从苹果中分离克隆出的促进硝酸盐吸收的基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用MdNRT2,4‑1基因在苹果王林愈伤组织和拟南芥中超量表达之后的转基因材料硝酸盐的吸收明显提高。

Description

一种苹果MdNRT2,4-1基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明一种促进硝酸盐吸收的基因及其应用，具体涉及一种苹果促进硝酸盐吸收的基因MdNRT2,4-1及其应用。

背景技术

氮素是植物生长发育所必需的重要的大量元素，它是构成核酸、蛋白质和磷脂等生物大分子的主要成分。对于高等植物特别是陆生植物来说，硝酸盐是主要的氮源。为了适应外界环境中不同的硝酸盐浓度，植物进化出两种硝酸盐吸收系统，分别是高亲和转运系统(high-affinity transport systems,HATS)和低亲和转运系统(low-affinitytransport systems,LATS)。

根系对土壤中硝酸盐吸收及硝酸盐的在植株体内的转运是由质膜定位的硝酸盐转运蛋白介导的，高等植物中已发现的硝酸盐转运蛋白主要有NRT1/PTR，NRT2，CLC和SLAC1/SLAH。在拟南芥中，NRT1/PTR转运蛋白家族大部分成员是低亲和力硝酸盐转运蛋白，即在硝酸盐浓度比较高的条件下负责硝酸盐的吸收和转运。而NRT2转运蛋白家族分成员是高亲和力硝酸盐转运蛋白，即在硝酸盐浓度比较低的条件下负责硝酸盐的吸收和转运。

我国是世界上苹果种植面积最大和总产量最高的国家，同时，苹果产业也是我国产量最大的果树产业，苹果产业的发展对于提高农民收入、解决剩余劳动力以及带动下游附加产业的发展起到了关键作用。但是，我国苹果产业与苹果生产先进国家相比，生产水平还存在着较大差距。例如，肥料利用率低，氮肥利用率国外发达国家高达50％～60％，我国仅为33％，特别是氮肥通过挥发、淋溶和径流等途径损失数量巨大。同时，由于片面追求产量与效益，果园内大量施用氮肥，因此导致了土壤肥力下降、果实品质降低和环境污染严重等后果，这严重制约了苹果产业的可持续发展。

因此，为了减少化肥的施用特别是氮肥的施用，促进氮素的吸收，研究和了解苹果中硝酸盐的吸收和转运相关的基因功能对苹果产业的发展具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种苹果促进硝酸盐吸收的MdNRT2,4-1基因及其制备方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果促进硝酸盐吸收的基因是从苹果中分离克隆出的硝酸盐吸收相关的基因完整编码区段的DNA片段，并命名为MdNRT2,4-1，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdNRT2,4-1基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取皇家嘎啦苹果组培叶片中的RNA及反转录；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的拟南芥中AtNTR2.4基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdNRT2,4-1基因的核苷酸序列，设计引物MdNRT2,4-1-F,MdNRT2,4-1-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdNRT2,4-1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdNRT2,4-1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到MdNRT2,4-1基因，MdNRT2,4-1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1593bp，编码531个氨基酸。进一步，步骤(3)中，所述PCR扩增反应体系为：

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdNRT2,4-1基因在转基因苹果愈伤组织和拟南芥中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdNRT2,4-1基因的超量表达载体转入苹果愈伤组织和拟南芥中，从而获得转基因材料。实验证明，超量表达MdNRT2,4-1基因的转基因苹果愈伤组织和拟南芥在低浓度的硝酸盐的处理条件下，硝酸盐的吸收相比于对照明显提高，说明MdNRT2,4-1基因在低浓度的硝酸盐的条件下植株硝酸盐的吸收过程中起着重要作用。

综上，本发明首次通过植物基因工程技术提高植物硝酸盐吸收的生产性状，从皇家嘎啦苹果组培苗中分离克隆出的硝酸盐吸收相关基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因材料硝酸盐的吸收能力明显提高。

附图说明

图1为MdNRT2,4-1基因的组织化学定位。A-K为在低浓度的硝酸盐的条件下转基因拟南芥植株中的MdNRT2,4-1基因的GUS活性组织化学定位，其中A是幼苗，B-C是幼叶，D-E是幼根，F-G是侧根的发育过程，J-K是花序；L为在不同浓度的硝酸盐的条件下转基因拟南芥主根和侧根中的MdNRT2,4-1基因的GUS活性组织化学定位；M为在不同浓度的硝酸盐的条件下转基因拟南芥中老叶到新叶的MdNRT2,4-1基因的GUS活性组织化学定位。

图2为MdNRT2,4-1转基因苹果王林愈伤组织中MdNRT2,4-1基因的表达分析图。

图3为MdNRT2,4-1转基因苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下N15标记的硝酸盐的吸收速率。

图4为MdNRT2,4-1转基因苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸盐的含量。

图5为MdNRT2,4-1转基因苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸还原酶的活性(NRA)。

图6为MdNRT2,4-1转基因苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下总氮含量。

图7为MdNRT2,4-1转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)中MdNRT2,4-1基因的表达分析。

图8为MdNRT2,4-1转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)在不同浓度的硝酸盐的条件下N15标记的硝酸盐的吸收速率。

图9为MdNRT2,4-1转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸盐的含量。

图10为MdNRT2,4-1转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸还原酶的活性(NRA)。

图11为MdNRT2,4-1转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)在不同浓度的硝酸盐的条件下总氮含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：苹果MdNRT2,4-1基因的克隆

一、嘎啦组培叶片RNA提取及反转录

1、嘎啦组培叶片RNA提取和含量检测

利用RNAplant Plus植物总RNA提取试剂小规模提取嘎啦组培叶片的总RNA，操作步骤按提取试剂说明书进行。吸取1μl总RNA溶液用Nanodrop进行测定，以无RNase的水为空白对照，测定溶液中RNA浓度(μg/ml)。

2、cDNA模板的合成

利用宝生物cDNA反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser)操作步骤的第一步去除基因组DNA反应去除DNA。然后利用宝生物试剂盒(PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)操作步骤合成cDNA模板。操作步骤按试剂盒说明书进行。

二、cDNA全长序列的获得

根据NCBI查到的拟南芥中AtNTR2.4基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdNRT2,4-1基因的核苷酸序列，设计引物MdNRT2,4-1-F,MdNRT2,4-1-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增。

SEQ.ID.NO.3MdoNRT2.4-1-F：5’-AATGGCAGATTCAGAAGGTG-3’；

SEQ.ID.NO.4MdoNRT2.4-1-R：5’-CTAAACATGGGAAGGTGTGGT-3’；

其中，PCR扩增体如下：

PCR反应结束后，进行2.0％琼脂糖凝胶电泳以检测是否有适当大小的条带，并将PCR产物回收(回收操作步骤根据Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒的说明书进行)、载体连接(取3.0μl PCR回收产物与pMD18-T载体连接，操作步骤按pMD18-TVector说明书进行)、大肠杆菌转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，操作步骤按全式金生物科技公司的Trans5αChemically Competent Cell感受态的说明书进行，在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆，在LB液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定)。

测序后得到MdNRT2,4-1基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

实施例2：转基因愈伤组织的获得

1、准备苹果王林的愈伤组织用于侵染，每隔2-3周在王林愈伤组织的固体培养基(MS基本培养基加入1.5mg/L 2.4-D和0.4mg/L 6-BA)上进行继代一次，在23℃-25℃的暗室培养。

2、挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素以及50mg/L利福平)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(约48h)；取其中l mL菌液加入20mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平以及100μmol/L乙酰丁香酮)内，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(约5h)；然后离心收集菌体，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)悬浮菌体，备用。

3、将侵染用的农杆菌的菌体悬浮在无菌水中，使其终浓度OD₆₀₀为0.5-0.6；将苹果王林的愈伤组织移入上述侵染液中，在摇床上慢慢摇15min左右，用无菌的滤纸吸除表面的侵染液，转移到不含抗性的王林愈伤组织的固体培养基玻璃平板上，室温暗处培养2天左右。然后将共培养的王林愈伤组织加入头孢的灭菌水洗3-5次，洗去农杆菌。最后将上述获得的王林愈伤组织均匀的铺到的固体筛选培养基(含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的潮霉素)玻璃平板上；大约培养30天左右，将新长出的王林愈伤组织移到新的筛选培养基(含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的潮霉素)上。

4、提取筛选出来的抗性王林愈伤组织的DNA和RNA，PCR和RT-PCR鉴定是否为转基因的王林愈伤组织。将确定为转基因的王林愈伤组织每隔2-3周进行继代一次，进行表型分析。

实施例3：转基因愈伤组织的相关生理指标检测

选择继代2周、长势良好并且基本一致的对照(WT)和转基因苹果王林愈伤组织(MdNRT2,4-1)，在不含硝酸盐的王林愈伤组织培养基(氮饥饿处理)上暗培养1周左右，然后用不同浓度的氮15标记的硝酸盐(0.5mM的K¹⁵NO₃和5mM的K¹⁵NO₃)进行处理30min，检测氮15标记的硝酸盐的吸收速率；同时将氮饥饿处理的王林愈伤组织转移到不同浓度的硝酸盐(0.5mM的KNO₃和5mM的KNO₃)的王林愈伤组织培养基上暗培养10天左右，检测其硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)和总氮含量。结果表明，在低浓度的硝酸盐(0.5mM的KNO₃)的条件下，MdNRT2,4-1过表达转基因愈伤组织与对照相比具有较高的N15标记的硝酸盐的吸收速率和硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)以及总氮含量，而在正常浓度的硝酸盐(5mM的KNO₃)条件下则没有明显差异，证明MdNRT2,4-1在低浓度硝酸盐(0.5mM的KNO₃)而不是高浓度硝酸盐(5mM的KNO₃)的条件下在调控硝酸盐的吸收。

实施例4：转基因拟南芥的获得

1、将获得的拟南芥种子，分别用70％酒精消毒2min，4％次氯酸钠消毒0min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，将种子均匀播种到MS培养基上。首先在4℃层积培养2-4天，然后在长日照的条件下进行培养2周(19-25℃，16h/8h长日照)，至成长为小苗，移栽到基质培养到开花。

2、农杆菌的活化按照实施例2中的步骤2的方法进行操作。

3、将拟南芥花序浸到侵染液中15～20s，收集果荚，播种到MS筛选培养基(50mg/L的潮霉素)上筛选，PCR和RT-PCR检测得到阳性转基因植株，经过连续3代筛选得到T3代纯合体，收取种子，进行表型分析。

实施例5：转基因拟南芥的相关生理指标检测

选取萌发2周左右、长势良好并且一致的野生型拟南芥(col)和转基因拟南芥(MdNRT2,4-1-7/9/10)，在不含硝酸盐的MS培养基(氮饥饿处理)上竖直培养5天左右，然后用不同浓度的氮15标记的硝酸盐(0.1mM的K¹⁵NO₃和5mM的K¹⁵NO₃)进行处理30min，检测氮15标记的硝酸盐的吸收速率；同时将氮饥饿处理的拟南芥转移到不同浓度的硝酸盐(0.1mM的KNO₃和5mM的KNO₃)的MS培养基上长日照培养1周左右，检测其硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)和总氮含量。结果表明，在低浓度的硝酸盐(0.5mM的KNO₃)的条件下，MdNRT2,4-1过表达转基因拟南芥与对照相比具有较高的N15标记的硝酸盐的吸收速率和硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)以及总氮含量，而在正常浓度的硝酸盐(5mM的KNO₃)条件下则没有明显差异，同样证明MdNRT2,4-1在低浓度硝酸盐(0.5mM的KNO₃)而不是高浓度硝酸盐(5mM的KNO₃)的条件下在调控硝酸盐的吸收。上述检测硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)、总氮含量和氮15标记的硝酸盐的吸收速率的方法均为实验室常规检测方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种苹果MdNRT2,4-1基因及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1593

<212> DNA

<213> 苹果

<400> 1

atggcagatt cagaaggtga acccggaagc tccatgcatg gagtgacagg cagagagcaa 60

acctttgcat tttcagtagc atcaccaatt gtcccaacag acacgacagc caaattcgac 120

ttgccagtcg attcagagca caaggccaaa gttttcaaac tattctctct ggccaaccct 180

cacatgagga cgttccactt gtcttggatc tccttcttca cttgctttat ctcaacattt 240

gcagctgctc ctctcgtccc tatcatccga gacaacataa acctcacgaa gcaagacatc 300

ggaaatgccg gagttgcctc cgtctcaggc agcatattct caaggcttgt gatgggtgcg 360

gtgtgtgatt tgatagggcc acgctacggc tgtgcgttcc taattatgct cagcgcaccc 420

actgtgtttt gcatgtcgtt tgtggctgac gctgggggtt acatagcagt taggtttatg 480

attggttttt cccttgcaac atttgtgtcg tgccaatatt ggatgagcac aatgtttaat 540

ggtaagatta ttggactggt taatgggact gcagccgggt ggggaaacat gggcggtggg 600

gcaacccaac tcttgatgcc attgatgttc gacatcatcg gtagatgtgg agcaactcct 660

tttactgcct ggagaattgc attcttcatt ccagggtggt ttcatatcat tactggaatc 720

atggtgttga cccttggcca agacttgccc gatgggaatc ttggtgcctt gcagaagaag 780

ggtgaagttg ccaaagatca attctccaag gtattgtggt atgctgtcac aaactataga 840

acgtggatct ttgtccttct ctatggctac tccatgggtg ttgagttgtc cattgataat 900

gtcattgctg aatacttcta tgaccgattt gatctaaaac ttcacttagc cggcatcatt 960

gctgcatcat tcggcatggc caactttgcg gctcgtccct ttggtgggtg ggcatctgat 1020

gtagcaggca ggtactttgg aatgagaggc aggttgtgga ctctctggat tctccaaacc 1080

ctaggaggag tcttctgtat atgtctcggc cgagccaatt cactccccct tgcagtcctt 1140

gccatgatcc tcttctctat aggagcccag gctgcatgtg gagctacctt tggcgtcatc 1200

cccttcatct cccgacgttc cctcggcatc atatctggcc tcaccggagc aggtgggaac 1260

tttgggtctg ggttgaccca actagtgttc ttctcgacct cagcgttctc aactgcctca 1320

gggttgtctt ggatgggggt aatgattgtg tgctgtactc ttcctgtgac tttggtgcac 1380

ttcccacaat ggggaggcat gttccttcca gcgtccaaag atgtcgagaa gtcgacggaa 1440

gagttttact atgcagctga gtggagtgag gcggagaagc agaaggggct gcaccaaggg 1500

agtttaaagt tcgcagagaa tagtaggtct gagcgtggta ggcgggttgc ctctgttcca 1560

actccaccaa acaccacacc ttcccatgtt tag 1593

<210> 2

<211> 530

<212> PRT

<213> 苹果

<400> 2

Met Ala Asp Ser Glu Gly Glu Pro Gly Ser Ser Met His Gly Val Thr

1 5 10 15

Gly Arg Glu Gln Thr Phe Ala Phe Ser Val Ala Ser Pro Ile Val Pro

20 25 30

Thr Asp Thr Thr Ala Lys Phe Asp Leu Pro Val Asp Ser Glu His Lys

35 40 45

Ala Lys Val Phe Lys Leu Phe Ser Leu Ala Asn Pro His Met Arg Thr

50 55 60

Phe His Leu Ser Trp Ile Ser Phe Phe Thr Cys Phe Ile Ser Thr Phe

65 70 75 80

Ala Ala Ala Pro Leu Val Pro Ile Ile Arg Asp Asn Ile Asn Leu Thr

85 90 95

Lys Gln Asp Ile Gly Asn Ala Gly Val Ala Ser Val Ser Gly Ser Ile

100 105 110

Phe Ser Arg Leu Val Met Gly Ala Val Cys Asp Leu Ile Gly Pro Arg

115 120 125

Tyr Gly Cys Ala Phe Leu Ile Met Leu Ser Ala Pro Thr Val Phe Cys

130 135 140

Met Ser Phe Val Ala Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Ala Val Arg Phe Met

145 150 155 160

Ile Gly Phe Ser Leu Ala Thr Phe Val Ser Cys Gln Tyr Trp Met Ser

165 170 175

Thr Met Phe Asn Gly Lys Ile Ile Gly Leu Val Asn Gly Thr Ala Ala

180 185 190

Gly Trp Gly Asn Met Gly Gly Gly Ala Thr Gln Leu Leu Met Pro Leu

195 200 205

Met Phe Asp Ile Ile Gly Arg Cys Gly Ala Thr Pro Phe Thr Ala Trp

210 215 220

Arg Ile Ala Phe Phe Ile Pro Gly Trp Phe His Ile Ile Thr Gly Ile

225 230 235 240

Met Val Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Pro Asp Gly Asn Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Gln Lys Lys Gly Glu Val Ala Lys Asp Gln Phe Ser Lys Val Leu

260 265 270

Trp Tyr Ala Val Thr Asn Tyr Arg Thr Trp Ile Phe Val Leu Leu Tyr

275 280 285

Gly Tyr Ser Met Gly Val Glu Leu Ser Ile Asp Asn Val Ile Ala Glu

290 295 300

Tyr Phe Tyr Asp Arg Phe Asp Leu Lys Leu His Leu Ala Gly Ile Ile

305 310 315 320

Ala Ala Ser Phe Gly Met Ala Asn Phe Ala Ala Arg Pro Phe Gly Gly

325 330 335

Trp Ala Ser Asp Val Ala Gly Arg Tyr Phe Gly Met Arg Gly Arg Leu

340 345 350

Trp Thr Leu Trp Ile Leu Gln Thr Leu Gly Gly Val Phe Cys Ile Cys

355 360 365

Leu Gly Arg Ala Asn Ser Leu Pro Leu Ala Val Leu Ala Met Ile Leu

370 375 380

Phe Ser Ile Gly Ala Gln Ala Ala Cys Gly Ala Thr Phe Gly Val Ile

385 390 395 400

Pro Phe Ile Ser Arg Arg Ser Leu Gly Ile Ile Ser Gly Leu Thr Gly

405 410 415

Ala Gly Gly Asn Phe Gly Ser Gly Leu Thr Gln Leu Val Phe Phe Ser

420 425 430

Thr Ser Ala Phe Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ser Trp Met Gly Val Met

435 440 445

Ile Val Cys Cys Thr Leu Pro Val Thr Leu Val His Phe Pro Gln Trp

450 455 460

Gly Gly Met Phe Leu Pro Ala Ser Lys Asp Val Glu Lys Ser Thr Glu

465 470 475 480

Glu Phe Tyr Tyr Ala Ala Glu Trp Ser Glu Ala Glu Lys Gln Lys Gly

485 490 495

Leu His Gln Gly Ser Leu Lys Phe Ala Glu Asn Ser Arg Ser Glu Arg

500 505 510

Gly Arg Arg Val Ala Ser Val Pro Thr Pro Pro Asn Thr Thr Pro Ser

515 520 525

His Val

530

Claims (6)

1.一种苹果MdNRT2,4-1基因，其特征在于，所述苹果MdNRT2,4-1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种利用权利要求1所述苹果MdNRT2,4-1基因编码出的多肽，其特征在于，所述苹果MdNRT2,4-1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述苹果MdNRT2,4-1基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取皇家嘎啦苹果组培叶片中的RNA并对其进行反转录得到嘎啦基因组cDNA；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的拟南芥中AtNTR2.4基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdNRT2,4-1基因的核苷酸序列，以MdNRT2,4-1-F和MdNRT2,4-1-R为引物，以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdNRT2,4-1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdNRT2,4-1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到苹果MdNRT2,4-1基因。

4.根据权利要求3所述的苹果MdNRT2,4-1基因的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR扩增反应体系为：10×TransTaq HiFi buffer Ⅱ：5μl,浓度为2.5mM的dNTPs：4μl,浓度为10μM的MdNRT2,4-1-F：10μl；浓度为10μM的MdNRT2,4-1-R(10μM)：10μl；TransTaq HiFiDNA Polymerase:0.5μl；cDNA模板:1μl；ddH₂O：加至50μl。

5.根据权利要求3所述的苹果MdNRT2,4-1基因的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的反应条件：在95℃温度下运行5min，之后以95℃温度下运行30sec、58℃温度下运行30sec以及72℃温度下运行1min为循环单元，运行35个循环，再在72℃温度下运行10min。

6.一种苹果MdNRT2,4-1基因在转基因在制备苹果王林愈伤组织和拟南芥中的应用。