CN108410888A

CN108410888A - 一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用

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Publication number: CN108410888A
Application number: CN201810215172.9A
Authority: CN
Inventors: 王小非; 郝玉金; 李睿
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-03-15
Also published as: CN108410888B

Abstract

本发明涉及一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用，所述MdCEPR1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将MdCEPR1基因的超量表达载体转入苹果王林愈伤组织和拟南芥中，获得转基因苹果王林愈伤组织和拟南芥。本发明首次通过植物基因工程技术提高硝酸盐吸收的生产性状，获得了一种从苹果中分离克隆出的促进硝酸盐吸收的基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，最终发现，MdCEPR1基因在苹果王林愈伤组织和拟南芥中超量表达之后的转基因材料，硝酸盐的吸收明显提高。

Description

一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明一种促进硝酸盐吸收的基因及其应用，具体涉及一种苹果促进硝酸盐吸收的基因MdCEPR1及其应用。

背景技术

氮素是植物生长发育所必需的重要的大量元素，它是构成核酸、蛋白质和磷脂等生物大分子的主要成分。对于高等植物特别是陆生植物来说，硝酸盐是主要的氮源。植物对硝酸盐的吸收主要受两个方面调控，一方面是硝酸盐引发的细胞自主局部信号，另一方面是内部氮素和外部氮素转换过程中的系统性长距离信号。在长距离信号转导过程中，多肽信号分子发挥了重要作用。C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1(CEP1)基因编码一个小肽肽前体，由N-端分泌信号肽、可变域、一个或多个CEP结构域和一个短的C-末端延伸组成。研究表明，CEPs参与了植物根形态的构建，根瘤形成以及长距离氮信号转导过程。而CEPs需要通过结合下游肽受体起作用。在拟南芥中CEP RECEPTOR 1(CEPR1)是一类富含亮氨酸重复受体激酶，已被证明是CEPs的受体，并且参与了硝酸盐的吸收与信号转导过程。

我国是世界上苹果种植面积最大和总产量最高的国家，同时，苹果产业也是我国产量最大的果树产业，苹果产业的发展对于提高农民收入、解决剩余劳动力以及带动下游附加产业的发展起到了关键作用。但是，我国苹果产业与苹果生产先进国家相比，生产水平还存在着较大差距。例如，肥料利用率低，氮肥利用率国外发达国家高达50％～60％，我国仅为33％，特别是氮肥通过挥发、淋溶和径流等途径损失数量巨大。同时，由于片面追求产量与效益，果园内大量施用氮肥，因此导致了土壤肥力下降、果实品质降低和环境污染严重等后果，这严重制约了苹果产业的可持续发展。

因此，为了减少化肥的施用特别是氮肥的施用，促进氮素的吸收，研究和了解苹果中硝酸盐的吸收和转运相关的基因功能对苹果产业的发展具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种苹果促进硝酸盐吸收的MdCEPR1基因及其制备方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果中促进硝酸盐吸收的基因，是从苹果中分离克隆出的硝酸盐吸收相关的基因完整编码区段的DNA片段，并命名为MdCEPR1，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdCEPR1基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取皇家嘎啦苹果组培叶片中的RNA及反转录；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的拟南芥中AtCEPR1基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdCEPR1基因的核苷酸序列，设计引物MdCEPR1-F,MdCEPR1-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdCEPR1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdCEPR1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到MdCEPR1基因，MdCEPR1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为2892bp，编码963个氨基酸。进一步，步骤(2)中，所述PCR扩增反应体系为：

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdCEPR1基因在转基因苹果愈伤组织和拟南芥中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdCEPR1基因的超量表达和沉默表达载体转入苹果愈伤组织和拟南芥中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达MdCEPR1基因的转基因苹果愈伤组织和拟南芥在低浓度的硝酸盐的处理条件下，硝酸盐的吸收相比于对照明显提高；沉默表达MdCEPR1基因的苹果愈伤组织氮吸收明显受到抑制，说明MdCEPR1基因在低浓度的硝酸盐的条件下植株硝酸盐的吸收过程中起着重要作用。

综上，本发明首次通过植物基因工程技术提高植物硝酸盐吸收的生产性状，从皇家嘎啦苹果组培苗中分离克隆出的硝酸盐吸收相关基因的完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后，转基因材料硝酸盐的吸收能力明显提高。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图谱

图2为MdCEPR1转基因苹果王林愈伤组织中MdCEPR1基因的表达分析图。其中，WT为野生型，MdCEPR1-OX为MdCEPR1过表达苹果愈伤组织，MdCEPR1-anti为MdCEPR1沉默苹果愈伤组织。

图3为MdCEPR1转基因(MdCEPR1-OX)和MdCEPR1沉默(MdCEPR1-anti)苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下的鲜重。

图4为MdCEPR1转基因(MdCEPR1-OX)和MdCEPR1沉默(MdCEPR1-anti)苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸盐的含量。

图5为MdCEPR1转基因(MdCEPR1-OX)和MdCEPR1沉默(MdCEPR1-anti)苹果王林愈伤组织在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸还原酶的活性(NRA)。

图6为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)中MdCEPR1基因的表达分析。

图7为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)在不同浓度的硝酸盐的条件下N¹⁵标记的硝酸盐的吸收速率。

图8为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)在不同浓度的硝酸盐的条件下的生长状态。

图9为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)在不同浓度的硝酸盐的条件下的鲜重。

图10为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸盐的含量。

图11为MdCEPR1转基因拟南芥(L1，L2和L3)在不同浓度的硝酸盐的条件下硝酸还原酶的活性(NRA)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：苹果MdCEPR1基因的克隆

一、嘎啦组培叶片RNA提取及反转录

1、嘎啦组培叶片RNA提取和含量检测

利用RNAplant Plus植物总RNA提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司)小规模提取嘎啦组培叶片的总RNA，操作步骤按提取试剂说明书进行。吸取1μl总RNA溶液用Nanodrop超微量分光光度计进行测定，以无RNase的水为空白对照，测定溶液中RNA浓度(μg/ml)。

2、cDNA模板的合成

利用宝生物cDNA反转录试剂盒(PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser)操作步骤的第一步去除基因组DNA反应去除DNA。然后利用宝生物试剂盒(PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)操作步骤合成cDNA模板。操作步骤按试剂盒说明书进行。

二、cDNA全长序列的获得

根据NCBI查到的拟南芥中AtCEPR1基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdCEPR1基因的核苷酸序列，设计引物MdCEPR1-F,MdCEPR1-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增。

SEQ.ID.NO.3MdCEPR1-F：5’-GTCGACATGGCTTCTTATAATCATACC-3’；

SEQ.ID.NO.4MdCEPR1-R：5’-GAATTCTAACTCATAAGGGTTCTTGACC-3’；

其中，PCR扩增体如下：

PCR反应结束后，进行2.0％琼脂糖凝胶电泳以检测是否有适当大小的条带，并将PCR产物回收(回收操作步骤根据Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒的说明书进行)、载体连接(取3.0μl PCR回收产物与pMD18-T载体连接，操作步骤按pMD18-TVector说明书进行)、大肠杆菌转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，操作步骤按全式金生物科技公司的Trans5αChemically Competent Cell感受态的说明书进行，在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆，在LB液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定)。

测序后得到MdCEPR1基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

实施例2：转基因愈伤组织的获得

1、准备苹果王林的愈伤组织用于侵染，每隔2-3周在王林愈伤组织的固体培养基(MS基本培养基加入1.5mg/L 2.4-D和0.4mg/L 6-BA)上进行继代一次，在23℃-25℃的暗室培养。

2、将扩增获得的MdCEPR1基因和基因沉默用的反向MdCEPR1基因序列分别连接中间载体pMD18-T，获得MdCEPR1-OX-pMD18和MdCEPR1-anti-pMD18载体，然后通过限制性内切酶对这两个中间载体进行酶切反应，将含有目的基因片段的酶切产物进行回收。对pBI121表达载体用相同的限制性内切酶进行酶切反应，同样将酶切的载体产物进行回收，然后将回收的目的基因片段和pBI121混合，在16℃进行连接反应，连接过夜后转化大肠杆菌感受态细胞。筛选阳性克隆，获得MdCEPR1-OX-pBI121和MdCEPR1-anti-pBI121植物表达载体。将构建的表达载体转化农杆菌LBA4404，挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素以及50mg/L利福平)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(约48h)；取其中l mL菌液加入20mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平以及100μmol/L乙酰丁香酮)内，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(约5h)；然后离心收集菌体，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)悬浮菌体，备用。

3、将侵染用的农杆菌的菌体悬浮在无菌水中，使其终浓度OD₆₀₀为0.5-0.6，将苹果王林的愈伤组织移入上述侵染液中，在摇床上慢慢摇15min左右，用无菌的滤纸吸除表面的侵染液，转移到不含抗性的王林愈伤组织的固体培养基玻璃平板上，室温暗处培养2天左右。然后将共培养的王林愈伤组织加入头孢的灭菌水洗3-5次，洗去农杆菌。最后将上述获得的王林愈伤组织均匀的铺到的固体筛选培养基(含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的潮霉素)玻璃平板上；大约培养30天左右，将新长出的王林愈伤组织移到新的筛选培养基(含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的潮霉素)上。

4、提取筛选出来的抗性王林愈伤组织的DNA和RNA，PCR和RT-PCR鉴定是否为转基因的王林愈伤组织。将确定为转基因的王林愈伤组织每隔2-3周进行继代一次，进行表型分析。

实施例3：转基因愈伤组织的相关生理指标检测

选择继代2周、长势良好并且基本一致的对照(WT)和转基因苹果王林愈伤组织(MdCEPR1-OX和MdCEPR1-anti)，在不同硝酸盐浓度的王林愈伤组织培养基(氮饥饿处理)上暗培养1周左右，然后转移到不同浓度的硝酸盐(0.1mM的KNO₃和10mM的KNO₃)的王林愈伤组织培养基上暗培养15天左右，检测其鲜重、硝酸盐的含量和硝酸还原酶的活性(NRA)。结果表明，在低浓度的硝酸盐(0.1mM的KNO₃)的条件下，MdCEPR1过表达转基因愈伤组织与野生型和MdCEPR1沉默愈伤组织相比具有较高的鲜重、硝酸盐的含量以及硝酸还原酶的活性(NRA)，MdCEPR1沉默愈伤组织中鲜重、硝酸盐的含量以及硝酸还原酶的活性(NRA)显著低于野生型，而在正常浓度的硝酸盐(10mM的KNO₃)条件下则没有明显差异，证明MdCEPR1在低浓度硝酸盐(0.1mM的KNO₃)而不是高浓度硝酸盐(10mM的KNO₃)的条件下在调控硝酸盐的吸收。

实施例4：转基因拟南芥的获得

1、将获得的拟南芥种子，分别用70％酒精消毒2min，4％次氯酸钠消毒10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，将种子均匀播种到MS培养基上。首先在4℃层积培养2-4天，然后在长日照的条件下进行培养2周(19-25℃，16h/8h长日照)，至成长为小苗，移栽到基质培养到开花。

2、农杆菌的活化按照实施例2中的步骤2的方法进行操作。

3、将拟南芥花序浸到侵染液中15～20s，收集果荚，播种到MS筛选培养基(30mg/L的潮霉素)上筛选，PCR和RT-PCR检测得到阳性转基因植株，经过连续3代筛选得到T3代纯合体，收取种子，进行表型分析。

实施例5：转基因拟南芥的相关生理指标检测

选取萌发2周左右、长势良好并且一致的野生型拟南芥(col)和转基因拟南芥(MdCEPR1-L1/L2/L3)，在不含硝酸盐的MS培养基(氮饥饿处理)上竖直培养5天左右，然后用不同浓度的氮15标记的硝酸盐(0.1mM的K¹⁵NO₃和10mM的K¹⁵NO₃)进行处理30min，检测氮15标记的硝酸盐的吸收速率；同时将氮饥饿处理的拟南芥转移到不同浓度的硝酸盐(0.1mM的KNO₃和10mM的KNO₃)的MS培养基上长日照培养1周左右，检测其鲜重、硝酸盐的含量以及硝酸还原酶的活性(NRA)。结果表明，在低浓度的硝酸盐(0.1mM的KNO₃)的条件下，MdCEPR1过表达转基因拟南芥与对照相比具有较高的N15标记的硝酸盐的吸收速率和鲜重、硝酸盐的含量以及硝酸还原酶的活性(NRA)，而在正常浓度的硝酸盐(10mM的KNO₃)条件下则没有明显差异，同样证明MdCEPR1在低浓度硝酸盐(0.1mM的KNO₃)而不是高浓度硝酸盐(10mM的KNO₃)的条件下在调控硝酸盐的吸收。上述检测硝酸盐的含量、硝酸还原酶的活性(NRA)、总氮含量和氮15标记的硝酸盐的吸收速率的方法均为实验室常规检测方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用

<141> 2018-03-15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 2892

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atggcttctt ataatcatac caccttcgtc ctttctatct tccttataat ttactcgctt 60

tttaatccgt ctcaagccgt catccgtaca aatactagcc agtctgagtt ttttttgctc 120

ataataaagt ctgtttcagc aaacgccggg aactccctgt cagattggga tgtcaaagga 180

gggaaacctt actgcaactt ctccggtgtc acctgcaaca acgaagggta tgttgtcgag 240

cttgatatat ccagtaggtc actctccggt aactttcctg caggcatctg ctcttacctg 300

cctcagttgc gtgttctccg tcttggacgt aacaatctcc ggggtgactt tgtggacagc 360

atcaccaact gctcattctt ggaagagctc aacatggaac atttgtacct cagtcagacg 420

cttccggatt tttcacccat gaaatctctg aaggttcttg acatgtcgta caatttgttc 480

atcggcaagt tccccatgtc agtgttcaac ctcaccaatc ttgaggtact caacttcaat 540

gaaaacgaag gtttcaactt gtggcagctt ccggaggaca tcactcggck gacaaatctc 600

aaatctatga tcttgacaac gtgcatgatt gaagggaaga tcccggcatc aattggaaaa 660

atgacttctc ttgttgatct cgaattgagc ggcaatttcc tgggcggtga aattccggcc 720

gagattggtt tgctcaagaa tttgaaacag ttrgagctct actacaacca acttgttgga 780

actatacctg aggagcttgg aaatctcact ggcctggtag amttagacat gtcagtcaat 840

aagctgactg gaaggattcc ggaatctatt tgtcgycttc ccaagctcca agtcctgcag 900

ctttacaaca acagtctttc aggtgaaatc ccaagcgcca tsgcagactc gaaaacactg 960

agcatgctgt cgctttatga caacttcctg acaggagaaa ttcctcgaaa tctggggcac 1020

tcatcaccaa tgattgtcyt agacttgtcc gagaaccatt tttccggtcc attgccaacg 1080

gaggtttgca agggaggtaa gttgctctac tttcttatgc tggacaataa gttatctgga 1140

gagataccag agagctactc agaatgccag tctcttcttc gatttcgact tagctataat 1200

catctggagg gctcaatacc tgcaggactt cttagtcttc cccatgtttc gatctttgat 1260

ttgggttaca ataatttgag tggtcagatt gcagatacaa ttggaagagc tagaaacttg 1320

tcagaattgt ttatacaaag caacaagatt tcaggtgttc taccacctgc agtctctgga 1380

gcaatcagcc tagtaaagat tgacctcagt aataatcttc tttctggtcc aattccttct 1440

gcaattggaa acttaaagaa gcttaattta ctgatgttac aaggcaacaa gctcaactct 1500

wccattcccg attctctttc ttcactaaaa tctctcaatg ttcttgatct ctccaacaac 1560

ctcttgaccg gaaacatccc agagagtctc gttgaattat taccaaactc catcaacttc 1620

tcaaacaata agctttctgg tccaattcct ctctcattga taaaaggcgg gttggtggaa 1680

agcttttccg gcaacccagg cctctgtgtt aaagtttcat cagatcaaaa taattttccc 1740

atatgttcac aatctcttaa caaaaaaaag ttaaattmtt tctgggtagt tacagtttca 1800

gtagtcttcc tcctcattgg agctctgctg ttcctaaagc gccggtttgg aagaagagca 1860

gaggtggaac atgatgagag cctgtcctca tcattcttct catatgatgt aaagagcttc 1920

catcgaataa gcttcgacca ccgcraggtc attgaaggca tggttgataa gaacatagta 1980

ggccatggag gatcagggac agtgtacaag attgagctga gcagcgggga tgtgattgca 2040

gtgaagaggc tgtggagtag aaaagcaaaa gattctggag aagatcagct gttcacacac 2100

aaggagttga aaactgaggt cgagacgctg ggaagtataa ggcacaaaaa cattgtcaaa 2160

ttgtactgct acttctcaag ctcggactgc aatcttttgg tttatgagta tatgccaaat 2220

ggtaaccttt gggatgctct tcacaaaggt tggrtccatc tagattggcc tactcgtcac 2280

cagattgccc tcgggattgc gcagggtttg gcatacctcc accatgatct gatgcctcca 2340

attattcaca gagatatcaa gtctaccaac atcctgctcg atgtcaataa ccaacccaag 2400

gttgcagatt ttggcatagc caaggtttta caagcaagag saggaaaaga ttccaccacc 2460

actgttattg ctgggactta tggttactta gccccrgaat atgcatattc atccaaagca 2520

acaaccaagt gtgacgtcta cagttttggg gtagttttga tggagctgat aactgggaag 2580

aagccggtgg aggcagagtt tggagacaac aagaacatca tatactgggt ttcaaacaaa 2640

gtggacacca aagaaggagc tacggaggtg ctggacaagc gatcatcgga ctcattcaag 2700

gaggagatga tccaggttct tcgcattgcc gttcgatgca cctacaaggc gccttcgctg 2760

cgcccgagca tgaaggagrt cgttcagctg ctgattgaag ctgacccttg cagatttgat 2820

tcatgcaagt catcaactaa gaccaaagaa gcaccaaatg tgacaaaggt caagaaccct 2880

tatgagttat ga 2892

<210> 2

<211> 963

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Ser Tyr Asn His Thr Thr Phe Val Leu Ser Ile Phe Leu Ile

1 5 10 15

Ile Tyr Ser Leu Phe Asn Pro Ser Gln Ala Val Ile Arg Thr Asn Thr

20 25 30

Ser Gln Ser Glu Phe Phe Leu Leu Ile Ile Lys Ser Val Ser Ala Asn

35 40 45

Ala Gly Asn Ser Leu Ser Asp Trp Asp Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr

50 55 60

Cys Asn Phe Ser Gly Val Thr Cys Asn Asn Glu Gly Tyr Val Val Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Ser Ser Arg Ser Leu Ser Gly Asn Phe Pro Ala Gly Ile

85 90 95

Cys Ser Tyr Leu Pro Gln Leu Arg Val Leu Arg Leu Gly Arg Asn Asn

100 105 110

Leu Arg Gly Asp Phe Val Asp Ser Ile Thr Asn Cys Ser Phe Leu Glu

115 120 125

Glu Leu Asn Met Glu His Leu Tyr Leu Ser Gln Thr Leu Pro Asp Phe

130 135 140

Ser Pro Met Lys Ser Leu Lys Val Leu Asp Met Ser Tyr Asn Leu Phe

145 150 155 160

Ile Gly Lys Phe Pro Met Ser Val Phe Asn Leu Thr Asn Leu Glu Val

165 170 175

Leu Asn Phe Asn Glu Asn Glu Gly Phe Asn Leu Trp Gln Leu Pro Glu

180 185 190

Asp Ile Thr Arg Xaa Thr Asn Leu Lys Ser Met Ile Leu Thr Thr Cys

195 200 205

Met Ile Glu Gly Lys Ile Pro Ala Ser Ile Gly Lys Met Thr Ser Leu

210 215 220

Val Asp Leu Glu Leu Ser Gly Asn Phe Leu Gly Gly Glu Ile Pro Ala

225 230 235 240

Glu Ile Gly Leu Leu Lys Asn Leu Lys Gln Leu Glu Leu Tyr Tyr Asn

245 250 255

Gln Leu Val Gly Thr Ile Pro Glu Glu Leu Gly Asn Leu Thr Gly Leu

260 265 270

Val Xaa Leu Asp Met Ser Val Asn Lys Leu Thr Gly Arg Ile Pro Glu

275 280 285

Ser Ile Cys Arg Leu Pro Lys Leu Gln Val Leu Gln Leu Tyr Asn Asn

290 295 300

Ser Leu Ser Gly Glu Ile Pro Ser Ala Xaa Ala Asp Ser Lys Thr Leu

305 310 315 320

Ser Met Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Phe Leu Thr Gly Glu Ile Pro Arg

325 330 335

Asn Leu Gly His Ser Ser Pro Met Ile Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn

340 345 350

His Phe Ser Gly Pro Leu Pro Thr Glu Val Cys Lys Gly Gly Lys Leu

355 360 365

Leu Tyr Phe Leu Met Leu Asp Asn Lys Leu Ser Gly Glu Ile Pro Glu

370 375 380

Ser Tyr Ser Glu Cys Gln Ser Leu Leu Arg Phe Arg Leu Ser Tyr Asn

385 390 395 400

His Leu Glu Gly Ser Ile Pro Ala Gly Leu Leu Ser Leu Pro His Val

405 410 415

Ser Ile Phe Asp Leu Gly Tyr Asn Asn Leu Ser Gly Gln Ile Ala Asp

420 425 430

Thr Ile Gly Arg Ala Arg Asn Leu Ser Glu Leu Phe Ile Gln Ser Asn

435 440 445

Lys Ile Ser Gly Val Leu Pro Pro Ala Val Ser Gly Ala Ile Ser Leu

450 455 460

Val Lys Ile Asp Leu Ser Asn Asn Leu Leu Ser Gly Pro Ile Pro Ser

465 470 475 480

Ala Ile Gly Asn Leu Lys Lys Leu Asn Leu Leu Met Leu Gln Gly Asn

485 490 495

Lys Leu Asn Ser Xaa Ile Pro Asp Ser Leu Ser Ser Leu Lys Ser Leu

500 505 510

Asn Val Leu Asp Leu Ser Asn Asn Leu Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu

515 520 525

Ser Leu Val Glu Leu Leu Pro Asn Ser Ile Asn Phe Ser Asn Asn Lys

530 535 540

Leu Ser Gly Pro Ile Pro Leu Ser Leu Ile Lys Gly Gly Leu Val Glu

545 550 555 560

Ser Phe Ser Gly Asn Pro Gly Leu Cys Val Lys Val Ser Ser Asp Gln

565 570 575

Asn Asn Phe Pro Ile Cys Ser Gln Ser Leu Asn Lys Lys Lys Leu Asn

580 585 590

Xaa Phe Trp Val Val Thr Val Ser Val Val Phe Leu Leu Ile Gly Ala

595 600 605

Leu Leu Phe Leu Lys Arg Arg Phe Gly Arg Arg Ala Glu Val Glu His

610 615 620

Asp Glu Ser Leu Ser Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Asp Val Lys Ser Phe

625 630 635 640

His Arg Ile Ser Phe Asp His Arg Xaa Val Ile Glu Gly Met Val Asp

645 650 655

Lys Asn Ile Val Gly His Gly Gly Ser Gly Thr Val Tyr Lys Ile Glu

660 665 670

Leu Ser Ser Gly Asp Val Ile Ala Val Lys Arg Leu Trp Ser Arg Lys

675 680 685

Ala Lys Asp Ser Gly Glu Asp Gln Leu Phe Thr His Lys Glu Leu Lys

690 695 700

Thr Glu Val Glu Thr Leu Gly Ser Ile Arg His Lys Asn Ile Val Lys

705 710 715 720

Leu Tyr Cys Tyr Phe Ser Ser Ser Asp Cys Asn Leu Leu Val Tyr Glu

725 730 735

Tyr Met Pro Asn Gly Asn Leu Trp Asp Ala Leu His Lys Gly Trp Xaa

740 745 750

His Leu Asp Trp Pro Thr Arg His Gln Ile Ala Leu Gly Ile Ala Gln

755 760 765

Gly Leu Ala Tyr Leu His His Asp Leu Met Pro Pro Ile Ile His Arg

770 775 780

Asp Ile Lys Ser Thr Asn Ile Leu Leu Asp Val Asn Asn Gln Pro Lys

785 790 795 800

Val Ala Asp Phe Gly Ile Ala Lys Val Leu Gln Ala Arg Xaa Gly Lys

805 810 815

Asp Ser Thr Thr Thr Val Ile Ala Gly Thr Tyr Gly Tyr Leu Ala Pro

820 825 830

Glu Tyr Ala Tyr Ser Ser Lys Ala Thr Thr Lys Cys Asp Val Tyr Ser

835 840 845

Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Ile Thr Gly Lys Lys Pro Val Glu

850 855 860

Ala Glu Phe Gly Asp Asn Lys Asn Ile Ile Tyr Trp Val Ser Asn Lys

865 870 875 880

Val Asp Thr Lys Glu Gly Ala Thr Glu Val Leu Asp Lys Arg Ser Ser

885 890 895

Asp Ser Phe Lys Glu Glu Met Ile Gln Val Leu Arg Ile Ala Val Arg

900 905 910

Cys Thr Tyr Lys Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ser Met Lys Glu Xaa Val

915 920 925

Gln Leu Leu Ile Glu Ala Asp Pro Cys Arg Phe Asp Ser Cys Lys Ser

930 935 940

Ser Thr Lys Thr Lys Glu Ala Pro Asn Val Thr Lys Val Lys Asn Pro

945 950 955 960

Tyr Glu Leu

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtcgacatgg cttcttataa tcatacc 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaattctaac tcataagggt tcttgacc 28

Claims

1.一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用，其特征在于，所述苹果MdCEPR1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种利用权利要求1所述苹果MdCEPR1基因编码出的多肽，其特征在于，所述苹果MdCEPR1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述苹果MdCEPR1基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取皇家嘎啦苹果组培叶片中的RNA并对其进行反转录得到嘎啦基因组cDNA；

(2)cDNA全长序列的获得：根据NCBI查到的拟南芥中AtCEPR1基因保守氨基酸序列并进行同源序列比对获得苹果中MdCEPR1基因的核苷酸序列，以MdCEPR1-F和MdCEPR1-R为引物，以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdCEPR1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdCEPR1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到苹果MdCEPR1基因。

4.根据权利要求3所述的苹果MdCEPR1基因的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应体系为：

5.根据权利要求3所述的苹果MdCEPR1基因的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的反应条件：在95℃预变性5min；循环参数为：95℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，运行35个循环；再在72℃延伸10min。

6.一种苹果MdCEPR1基因在转基因在制备苹果王林愈伤组织和拟南芥中的应用，所述应用为，促进硝酸盐吸收。