CN104059920B - 桑树二氢黄酮醇还原酶启动子及其重组表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了桑树二氢黄酮醇还原酶启动子及其重组表达载体和应用，桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示，长度为1812bp，包括二氢黄酮醇还原酶基因起始密码子ATG开始的12bp编码序列和上游的1800bp序列，该启动子能够介导外源蛋白在根部特异表达，为植物基因工程的研究和应用提供了具有重要价值的启动子。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，还涉及含有桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体和应用。
背景技术
桑树是一种多年生木本植物，长期以来，桑树作为家蚕的主要食物来源，对蚕丝产业的发展起到至关重要的作用。桑树含有丰富的类黄酮化合物，二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)基因是植物类黄酮生物合成途径中的一个关键基因，该基因的编码产物能够催化二氢黄酮醇的还原反应而生成无色花青素，属于还原型辅酶II依赖性的还原酶家族。目前该基因已在多种植物中被克隆，序列分析表明其在功能区域的序列高度保守，并且该基因结构保守，一般由6个外显子和5个内含子组成。桑树DFR基因(MnDFR)的CDS序列长度为1008bp，编码336个氨基酸残基，由6个外显子组成。序列分析表明MnDFR的N端具有预测的NADP结合结构域，其决定底物特异性的关键氨基酸残基为天冬氨酸，表明MnDFR属于天冬氨酸类型DFR，该类型DFR不能有效的催化二氢山萘酚还原生成天竺葵素类花青素。MnDFR的表达模式及调控活性由MnDFR启动子序列决定，而现有技术中尚未见关于MnDFR启动子的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，本发明的目的之二在于提供含有桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2、含有所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体。
优选的，所述重组表达载体由SEQIDNO.3所示序列替换pCAMBIA1303载体上35S启动子而得。
3、所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子在植物根部特异表达外源蛋白中的应用。
优选的，所述植物为拟南芥。
优选的，所述外源蛋白可以为生物活性物质或抗性蛋白，更优选的，所述外源蛋白为β-葡萄糖苷酸酶。
本发明的有益效果在于：本发明首次提供了桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，该启动子可特异性地在转基因植物的根部实现外源基因的高效表达；本发明还提供了含有桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体，该重组表达载体能够用于制备转基因植物，获得在根部特异二氢黄酮醇还原酶启动子下游基因的转基因植株，为特异在植物根部表达外源蛋白提供了有利的工具。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为桑树MnDFR启动子的PCR结果(M表示DL2000PlusDNAMarker，泳道1为桑树MnDFR启动子的PCR扩增，箭头所示为扩增得到的目的条带)。
图2为植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR的重组质粒与酶切验证(M表示DL2000PlusDNAMarker，泳道1表示pCAMBIA1303载体，泳道2、3表示pCAMBIA1303-MnDFR重组质粒，泳道4、5表示pCAMBIA1303-MnDFR的双酶切验证)。
图3为拟南芥的GUS染色结果(WT表示野生型拟南芥，Dfrp-3、Dfrp-11和Dfrp-12表示不同的转基因阳性植株)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、桑树MnDFR基因启动子的获得
设计扩增MnDFR启动子的引物，上游引物为5’-cgtctgaacccggtcctaa-3’(SEQIDNO.1)，下游引物为：5’-cttcgatcccatattgctgc-3’(SEQIDNO.2)。然后以川桑基因组DNA为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10×Ex-taqbuffer2.5μL，25mMMgCl22μL，2.5mMdNTP2μL，川桑基因组DNA30ng，10μM上、下游引物各1μL，5U/μlEx-taq聚合酶0.2μL，灭菌水补足至25μL；PCR扩增条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待溴酚蓝跑至2/3时停止电泳，溴化乙锭(EB)染色后用清水冲洗，置于紫外灯观察，结果如图1所示。然后切下含有目的条带的胶块，并使用Takara公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit对产物进行回收，回收产物与pMD19-Tsimple载体连接，得pMD19-Tsimple-MnDFR载体。将pMD19-Tsimple-MnDFR载体送测序公司测序。测序结果表明，MnDFR启动子序列如SEQIDNO.3所示，长度为1812bp，包括MnDFR基因起始密码子ATG开始的12bp编码序列和上游的1800bp序列。
实施例2植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR的构建
根据实施例1获得的桑树MnDFR基因启动子序列和pCAMBIA1303载体序列，选择合适的酶切位点，设计构建植物表达载体的引物，具体为：上游引物：5’-cgggatcccgtctgaacccggtcctaa-3’(SEQIDNO.4)，下划线表示BamHI酶切位点，下游引物：5’-gactagtcttcgatcccatattgctgc-3’(SEQIDNO.5)，下划线表示SpeI酶切位点。然后以实施例1所得pMD19-Tsimple-MnDFR载体为模板，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10×Ex-taqbuffer2.5μL，25mMMgCl22μL，2.5mMdNTP2μL，pMD19-Tsimple-MnDFR质粒50pg，10μM上、下游引物各1μL，5U/μLEx-taq聚合酶0.2μL，灭菌水补足至25μL；PCR扩增条件为94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待溴酚蓝跑至2/3时停止电泳，溴化乙锭(EB)染色后用清水冲洗，置于紫外灯下切下含有目的条带的胶块，使用Takara公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit对产物进行回收。
将回收的PCR产物经BamHI和SpeI双酶切，回收酶切产物(MnDFR启动子)，同时用BamHI和SpeI双酶切pCAMBIA1303载体，将该载体中的35S启动子切掉，回收pCAMBIA1303载体片段，然后将酶切后的MnDFR启动子与pCAMBIA1303载体片段进行连接，构建得到pCAMBIA1303-MnDFR重组载体。为了验证pCAMBIA1303-MnDFR重组载体，将pCAMBIA1303-MnDFR重组载体用BamHI和SpeI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，待溴酚蓝跑至2/3时停止电泳，溴化乙锭(EB)染色后用清水冲洗，置于紫外灯下切下含有目的条带的胶块，同时以未经酶切的pCAMBIA1303载体和pCAMBIA1303-MnDFR重组载体为对照，结果如图2所示。结果显示，pCAMBIA1303-MnDFR重组载体经BamHI和SpeI酶切后能够获得预期的片段，表明pCAMBIA1303-MnDFR重组载体构建成功。获得的pCAMBIA1303-MnDFR重组载体是以MnDFR启动子替换pCAMBIA1303载体上的35S启动子，替换后β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)基因由MnDFR启动子启动表达。
实施例3、桑树MnDFR基因启动子在拟南芥中表达外源蛋白
将植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR转化到农杆菌菌株LBA4404感受态细胞中，在YEB培养基中培养至OD600为0.6-0.8，离心收集菌体，用拟南芥转化渗透液(1/2MS培养基2.17g，蔗糖50g，MES0.5g，定容至1L，KOH调pH值至5.7后，加入1mg/mL6-BA10μL和Silwet200μL)重悬后制成转化菌液。通过农杆菌介导的浸花法，将植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR转化至拟南芥基因组中，然后培养并收获拟南芥种子。
筛选转基因植株，具体方法如下：将收获的拟南芥种子放置于4℃春化两天后，置于30℃烘箱烘干一天，然后将种子放在消毒液(立白消毒液500μL，Tween-205μL，灭菌水定容至10mL)中，震荡消毒10分钟，用灭菌水清洗种子5次，之后用0.05％的琼脂悬浮种子，用枪头将悬浮的拟南芥种子点在筛选培养基(1/2MS培养基2.17g，蔗糖30g，定容至1L，KOH调pH值至5.8，加入6.5g琼脂，高压灭菌后，加入卡那霉素至终浓度50ng/mL，混匀后倒平板)中，将平板用封口膜封紧后置于23℃培养。
对筛选得到的转基因阳性植株的种子继续进行筛选，获得T3代植株，并对其进行β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色观察，结果如图3所示。结果显示，在不同的转基因系中，GUS基因特异性的在根部表达，表明MnDFR启动子能够调控下游基因在根部特异表达。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.含有权利要求1所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQIDNO.3所示序列替换pCAMBIA1303载体上35S启动子而得。
4.权利要求1所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子在植物根部特异表达外源蛋白中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述外源蛋白为β-葡萄糖苷酸酶。
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