CN104480124A - 用于trv介导的基因沉默体系中的指示基因及其载体的构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明病毒诱导基因沉默是一种用反向遗传学研究植物基因功能的优良工具，本发明为烟草脆裂病毒诱导的基因沉默技术提供了一个非常优良的指示基因载体，本发明的指示基因载体构建简易，沉默表型显著，性状表现持久，为快速的基因功能研究起到良好的指示作用。

Description

用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因及其载体的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种指示基因载体、构建方法和用途。

背景技术

病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是研究植物基因功能的一种重要方法，具有简便、快速高效、不需要对植物进行复杂遗传转化和可以对致死基因进行功能研究等特点。近年来，多种VIGS载体相继得到开发并在多种植物中得到广泛的应用。其中，烟草脆裂病毒（TRV）是目前应用最广泛的VIGS载体，它是由TRV1与TRV2两条RNA病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV作为病毒载体有诸多优点，比如病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等，因而被广泛应用。尤其是Liu等人改进后的烟草脆裂病毒载体TRV2（pYL156和pYL279），在载体中插入了双倍CaMV35S启动子，在C端插入了1个核酶，可导致更有效的病毒RNA产生；而且也拓展了应用范围，除了应用在本氏烟和茄属的2个种外，还适用于番茄、烟草、辣椒等作物。

类胡萝卜素是一类由异戊二烯组成的萜类化合物，在动植物中都有重要的生理功能和生物活性。类胡萝卜素在植物光合作用中担负着光吸收的辅助色素的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用。通常的，在TRV-VIGS实验中，TRV1-TRV2（TRV）菌液混合注射作为阴性对照，TRV1-TRV2-PDS（TRV-PDS）菌液混合注射作为阳性对照。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是类胡萝卜素合成通路上一个关键基因，具有保护叶绿素免受光漂白的作用。PDS基因发生沉默后, mRNA转录水平显著降低，导致类胡萝卜素合成途径被阻断，从而使被侵染植物新生叶片表现出白化效应，可以直观的用肉眼观察，常被作为各种病毒VIGS体系的指示基因，来验证VIGS体系在植物中沉默成功。

ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）基因是类胡萝卜素生物合成途径中又一重要基因，紧邻PDS基因下游，主要参与线状类胡萝卜素的生物合成，催化ζ-胡萝卜素向番茄红素的转化，促进分支途径其他类胡萝卜素的合成。ZDS基因作为TRV介导的VIGS体系的指示基因在国际上还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种可用于TRV病毒介导基因沉默体系中的指示基因载体及其应用，并公开了该指示基因载体的构建方法。

本发明的技术方案是：用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，它的步骤如下：

（1）以普通烟草红花大金元旺长期幼叶cDNA为模板进行PCR扩增，测序得到普通烟草ZDS编码区全长序列1785 bp，共编码594个氨基酸；

（2）分别以ZDS-F和ZDS-R为引物，以红花大金元旺长期幼叶片cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶上纯化目标ZDS DNA 片段，纯化的ZDS DNA片段与pMD19-T载体连接，在42 ℃的条件下热激转化90s入大肠杆菌DH5α，从得到的克隆转化子中用菌落 PCR鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒ZDS-T；

（3）以ZDS基因5′端782-1414的633 bp的基因片段作为VIGS体系特异性核酸沉默片段，选取KpnI和XhoI限制性酶切位点设计引物，以ZDS-T质粒为模板进行PCR扩增，回收纯化 PCR 产物，使用KpnI和XhoI酶切 PCR 回收片段和 TRV2病毒载体，回收目的片段并连接，连接液转化细菌，构建TRV2-ZDS VIGS载体。

3. 根据权利要求2所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中ZDS-F和ZDS-R引物序列如下：

ZDS-F：5′-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3′

ZDS-R：5′-TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3′。

所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，所述步骤（3）中KpnI和XhoI限制性酶切位点引物序列如下：

KpnI限制性酶切位点：5′-ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3′；

XhoI限制性酶切位点：5′-CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3′。

用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因在本氏烟中的应用。

本发明的有益效果是：本发明病毒诱导基因沉默是一种用反向遗传学研究植物基因功能的优良工具，本发明为烟草脆裂病毒诱导的基因沉默技术提供了一个非常优良的指示基因载体，本发明的指示基因载体构建简易，沉默表型显著，性状表现持久，为快速的基因功能研究起到良好的指示作用。

附图说明

图1：TRV2-ZDS载体构建示意图；

图 2：指示基因ZDS沉默表型图，WT，未注射烟草对照植株；TRV，注射TRV空载体对照植株；TRV-ZDS，注射指示基因片段ZDS菌液植株；

图 3：指示基因PDS沉默表型图，TRV-PDS，注射指示基因片段PDS菌液植株；

图 4：指示基因ZDS在本氏烟TRV介导的病毒诱导基因沉默体系中基因表达量。WT，未注射烟草对照植株；TRV，注射TRV空载体对照植株；TRV-ZDS，注射指示基因片段ZDS菌液植株。

具体实施方式

1. ZDS基因的同源克隆及ZDS-TRV VIGS载体构建

通过 NCBI搜索ZDS基因序列，在ATG和TGA处设计保守引物。以普通烟草红花大金元cDNA为模板进行PCR扩增，回收目的片段，T-A连接，转化大肠杆菌（DH5α）感受态，37 ℃过夜培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后测序得到普通烟草ZDS编码区全长序列。获得ZDS编码区（CDS）全长序列1785 bp，共编码594个氨基酸。ZDS编码区碱基序列如SEQ ID NO：1所示。将测序正确的ZDS基因序列与其他植物ZDS基因序列进行比对，找到保守区域，本发明选取ZDS基因5′端782-1414的633 bp的基因片段作为VIGS体系特异性核酸沉默片段，VIGS体系特异性核酸沉默片段的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，考虑TRV病毒载体PYL156酶切位点和ZDS基因序列分析结果，选取KpnI和XhoI限制性酶切位点设计引物，进行PCR扩增，通过酶切，连接反应，构建TRV2-ZDS VIGS载体，其构建示意图见图1。

具体方法如下所述：

分别以ZDS-F和ZDS-R（5’-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3’和5’-TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3’）为引物，以红花大金元旺长期幼叶片cDNA (RNA提取按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒说明书进行，并按照TaKaRa公司Reverse transcription system 试剂盒说明书，以Oligo(dT)18为引物合成cDNA第一链)为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min 45 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4 ℃，pause。反应体系50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各2.5 μL（10 μM），dNTPs 4 μL（10 μM），10×Buffer 5 μL，HiFi酶（北京全式金生物技术有限公司） 0.5 μL，无菌水33.5 μL。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒（Gel Extraction KIT ，购自QIAGENE) 从琼脂糖凝胶上纯化目标ZDS DNA 片段（方法参照试剂盒说明书），用Eppendorf 公司 BioPhotometer 测定浓度后用于连接或存-20 °C备用。纯化的ZDS DNA片段与pMD19-T载体（TaKaRa 公司，氨苄霉素抗性）连接（Solution I，TaKaRa 公司，按照试剂盒说明书操作），热激转化（42 ℃ 90s）入大肠杆菌DH5α（TaKaRa 公司）。从得到的克隆转化子中用菌落 PCR （引物为上述扩增引物）鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒ZDS-T（小提质粒试剂盒，QIAGENE，方法参照试剂盒说明书进行）。

构建TRV2-ZDS载体：所用引物为5′-ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3′（包含KpnI酶切位点）和 5′-CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3′（包含XhoI酶切位点）；以上述测序正确的ZDS-T质粒为模板进行扩增，PCR反应条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，35 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4 ℃，pause。反应体系50 μL：ZDS-T质粒2 μL，上下游引物（10 μM）各2.5 μL，dNTPs（10 μM）4 μL，10×Buffer 5 μL，HiFi酶（北京全式金生物技术有限公司） 0.5 μL，无菌水33.5 μL。回收纯化 PCR 产物。使用KpnI和XhoI酶切 PCR 回收片段和 TRV2（pYL156）病毒载体，酶切体系（50 μL体系）为：ZDS-VIGS回收片段（或TRV2载体，约100 ng/μL）25 μL；KpnI （10 U/μL，TaKaRa 公司）2.5 μL；XhoI（10 U/μL，TaKaRa 公司）2.5 μL；M Buffer 5 μL；ddH₂O 15 μL。酶切条件：37 ℃酶切4 h。回收目的片段并连接，连接体系（10 μL体系）为：ZDS-VIGS酶切回收片段 4 μL；TRV2酶切回收片段1 μL；Solution I连接试剂（TaKaRa） 5 μL。连接条件：16 ℃连接4 h。连接液转化细菌（DH5α，TaKaRa 公司），菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到目的载体，酶切验证并测序，得到测序正确的TRV2-ZDS载体。

2. ZDS-TRV-VIGS指示体系在本氏烟中的应用

病毒诱导的基因沉默具有简便、快速、高效的优点，是研究植物基因功能的一种重要的方法。本发明利用烟草脆裂病毒介导的基因沉默，在本氏烟中下调了ZDS基因的表达，在ZDS基因部分沉默的情况下，本氏烟草表型发生了显著变化。

烟草脆裂病毒载体感染能力较强，病毒症状轻，空载体（TRV1-TRV2）侵染与对照植株生长发育无明显差异（图1）。TRV-zds（TRV1-TRV2-ZDS）混合阳性菌株接种本氏烟草后，烟株中ZDS基因表达被抑制，新生叶片都显现出严重白化现象，株高明显变矮，长势不强，但不致死，与PDS基因沉默后表型极其相似（图2）。注射的20棵烟株中，侵染发病率100%，表型一致，定量PCR检测ZDS转录表达水平仅有对照植株的10%（甚至更低）（图3），ZDS基因作为TRV VIGS沉默体系指示基因效果非常显著，为TRV介导的病毒诱导基因沉默体系提供了一个良好的可选指示基因，说明本发明所开发的ZDS-TRV-VIGS体系的指示作用与国际通用的PDS-TRV-VIGS指示体系达到同等效果。

具体方法如下所述：

（1）载体质粒转化农杆菌：取TRV1、TRV2、TRV-ZDS、TRV-PDS质粒1 μL，加入含0.1 mL的GV3101农杆菌感受态的EP管中，冰上放置30min；将含有该质粒的农杆菌感受态放入液氮速冻1min，然后37℃温育5min；加入1 mL LB液体培养基，28℃震荡培养3 h；5,000 rpm离心1min，弃去上清，加入200 μL LB液体培养基，重悬沉淀；取200 μL重悬液（即转化产物）均匀地涂于含25 mg / mL利福平（Rif, Sigma）和50 mg / mL卡那霉素（kana, Sigma）的LB平板上，28℃培养2-3天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌注射本氏烟烟苗。

（2）烟草准备：本氏烟草于温室中栽培。培养条件为（23 ±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，（60±2）%的相对湿度；长到5-6片展开叶时用于农杆菌注射。

（3）烟草注射：挑取转化成功的克隆，划线28℃培养过夜(LB培养基，50 mg / mL Rif, 50 mg / mL Kana；挑取上述过夜菌接种到5 mL LB (25 mg / mL Rif, 50 mg / mL Kana) 中28℃培养过夜；将上述过夜的菌液吸取200 mL转接到20 mL LB (10 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES） + 20 μM 乙酰丁香酮（Sigma） + 25mg / mL Rif +50 mg / mL Kana)中，28℃培养过夜；离心收集上述菌液，然后重悬在LB (10 mM MgCl₂ +10 mM MES + 200 μM乙酰丁香酮)中，调OD600 ＝1.0，在室温下静置3小时；按TRV1 ：TRV2 （或TRV-ZDS或TRV-PDS）＝ 1 ：1注射烟草，注射时要注射近轴端的嫩叶；注射后观察表型，进行检测。

ZDS沉默后定量PCR检测引物序列为：ZDS-Q-R：5′-TGAAATAGGGGAGCTTGATTTCCGC-3′；ZDS-Q-F：5′-GAGCATATGCGACAGGATCCCAC-3′。

<110> 郑州大学

<120> 用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因及其载体的构建方法与应用

<160> 1

 

<210> 1

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<221> misc_difference

<222> (782)...( 1414)

 

atggctactt cttcagctta tctttgttgt cctgcaactt ctgctactgg aaagaaacat     60

attttgccca atggggcagc tggattcttg gttttccctg tattcttggt tttccgtggt     120

ccccgtttgt ccaaccggtt tgtgacccgg aagtcagtta ttcgtgctga tttggactcc     180

atggtctctg atatgagtac taatgctcca aaagggctat ttccacctga acctgaacat      240

tatcgggggc caaagctgaa agtagctatt attggagctg ggcttgcagg catgtcaact      300

gctgtggagc tcttggatca aggacatgag gtggatatat atgaatcaag gccttttatt      360

ggtgggaaag tgggatcttt tgttgataga cgtggaaacc acattgaaat gggactgcat      420

gtgttctttg gttgctataa taatttgttc cgtttgttaa aaaaggtggg tgctgaaaaa      480

aatctgctag tgaaggacca tactcacaca tttgtaaata aagggggtga aataggggag      540

cttgatttcc gctttccagt tggagcaccc ctacacggaa ttaatgcatt tttgtctacc      600

aatcagctaa agatttatga taaggctaga aatgctgtag ctcttgccct tagtccagtg      660

gtgcgggctt tagttgatcc agatggcgcg ttgcagcaga tacgtgatct agatagtgta      720

agcttttcag agtggtttat gtctaaaggt gggacgcgtg ctagcatcca gaggatgtgg      780

gatcctgtcg catatgctct tggattcatt gactgtgaca atatcagtgc tcggtgtatg      840

ctcactatat ttgcattatt tgccactaaa acggaggctt ccctattacg catgcttaaa      900

ggttctccgg acgtttattt gagtggtcca attaagaagt acatcttgga taagggggga      960

aggtttcaca tgaggtgggg gtgcagacag gtactctatg agacatcctc tgatggcagt      1020

atgtatgtca gcgggcttgc catgtcaaag gccactcaga agaaagttgt aaaagctgat      1080

gcctatgtcg ctgcatgtga tgtccctgga attaaacgat tggtacctca gaagtggagg      1140

gaattggaat tctttgacaa catttacaaa ttggttggag tgcctgttgt tacggtacaa      1200

ctacgataca atggctgggt tacagagttg caggacttgg agcgttcgag gcaattgaag      1260

cgcgctacag gtttggacaa tctcctgtat acaccagatg cagatttctc ttgctttgcg      1320

gaccttgcat tggcatctcc tgaagattat tacattgagg gccaaggctc attgcttcaa      1380

tgtgtcctta cacctggtga cccttacatg cctctactaa atgatgaaat cataaaaaga      1440

gtgtcaaagc aggttttggc actatttcct tcttcccaag gtcttgaggt tacctggtca      1500

tcagttgtga aaattgggca atccctatat cgtgaaggac ctggtaaaga cccattcaga      1560

cctgatcaga agactccagt ggaaaatttc tttcttgctg gctcatatac aaaacaggac      1620

tacatagata gcatggaagg ggcaactctt tcaggtaggc aagcatctgc atacgtatgt      1680

gatgctggcg agaagctggt ggtgttgcgg aaaaagattg ctgctgctga gtcaaacgag      1740

atctctgaag gtgtatcagt atctgatgag ttgagtcttg tctga                      1785

Claims (5)

1.用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）以普通烟草红花大金元旺长期幼叶cDNA为模板进行PCR扩增，测序得到普通烟草ZDS编码区全长序列1785 bp，共编码594个氨基酸；

（2）分别以ZDS-F和ZDS-R为引物，以红花大金元旺长期幼叶片cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶上纯化目标ZDS DNA 片段，纯化的ZDS DNA片段与pMD19-T载体连接，在42 ℃的条件下热激转化90s入大肠杆菌DH5α，从得到的克隆转化子中用菌落 PCR鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒ZDS-T；

（3）以ZDS基因5′端782-1414的633 bp的基因片段作为VIGS体系特异性核酸沉默片段，选取KpnI和XhoI限制性酶切位点设计引物，以ZDS-T质粒为模板进行PCR扩增，回收纯化 PCR 产物，使用KpnI和XhoI酶切 PCR 回收片段和 TRV2病毒载体，回收目的片段并连接，连接液转化细菌，构建TRV2-ZDS VIGS载体。

3.根据权利要求2所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中ZDS-F和ZDS-R引物序列如下：

ZDS-F：5′-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3′

ZDS-R：5′-TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3′。

4.根据权利要求2所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中KpnI和XhoI限制性酶切位点引物序列如下：

KpnI限制性酶切位点：5′-ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3′；

XhoI限制性酶切位点：5′-CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3′。

5.用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因在本氏烟中的应用。