CN106755066A - 一种小麦整株trv载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用 - Google Patents

一种小麦整株trv载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）：取小麦种子50粒，用有效氯为1%次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；（2）：用基因工程的方法将扩增后的番茄PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV‑SlPDS；（3）农杆菌转化及培养；（4）配制转化菌液；（5）小麦种子侵染。本发明利用番茄PDS基因来沉默小麦PDS基因，能够快速高效的实现小麦PDS基因沉默，叶片呈现出光漂白现象。本发明方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且本发明为全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各个组织中功能。

Description

一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法。
背景介绍
植物突变体很难获得，有些基因的突变对植物可能是致死的，基因沉默相对容易获得，病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后基因沉默技术，作为一种有效的反向遗传学技术已经广泛应用于植物基因工程的研究中，其作用原理是植物在抵御病毒侵染时会启动RNA沉默(RNA silencing)机制。植物体内的Dicer-like protein4可以识别病毒复制过程中产生dsRNA，并将其切割成21-24nt的siRNAs(small interferingRNAs)，siRNAs中的一条链与Agronatue(AGO)等蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，并特异的与同源的靶标mRNA结合最终导致靶标mRNA的降解，这一过程即病毒诱导的基因沉默。同样的，如果将寄主植物基因的片段克隆岛病毒VIGS载体中，当寄主植物通过RNA沉默引起防御反应时，相应的寄主基因也会被沉默。
一系列改造过的RNA或DNA病毒载体被用于VIGS(Becker and Lange,2010)。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，也可以鉴定宿主植物生长点的基因，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。
小麦是我国重要的粮食作物，小麦基因组测序的初步完成为小麦功能基因组学的研究提供了重要的参考(Brenchley et al.,2012,Jia et al.,2013,Ling et al.,2013)。但是小麦是六倍体作物，多拷贝基因普遍存在；小麦基因组复杂，突变体不易获得；小麦遗传转化困难，受基因型限制等特点对小麦基因功能的研究带来了诸多不便。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种快速方便的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用，能够快速高效的在整个小麦植株中沉默目的基因。
一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，具体步骤如下：
步骤(1)：取小麦种子50粒，用有效氯为1％次氯酸钠消毒液进行种子消毒，将消毒过的小麦种子放在垫有湿润无菌滤纸片的培养皿内，并透气性密封，置于室温下黑暗处萌发30h 后获得无菌小麦芽，备用；
步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；
具体步骤如下：
cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄叶片的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；
PDS基因扩增：设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’，PCR产物为409-bp番茄PDS基因片段；以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系进行扩增；扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
pTRV-SlPDS基因沉默载体的构建：
纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后备用；
步骤(3)农杆菌转化及培养：
3.1)将pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；
3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；
3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；
3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04-1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；
步骤(4)配制转化菌液：
向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮(AS)终浓度为19.62mg·L-1、半胱氨酸(Cys) 终浓度为400mg·L-1和吐温20(Tween 20)终浓度为5ml·L-1，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
步骤(5)小麦芽侵染：将等量的处理过的小麦芽分别放入带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，记为玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1与TRV2的转化菌液，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器对玻璃瓶抽真空，每次保持15s，操作1～2次；最后，分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦种子和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转每分钟下过夜培养0-25h；
培养结束，超净台用无菌水清洗干净，将经TRV1与TRV2转化菌液侵染过的小麦芽和经TRV1与TRV-SlPDS转化菌液侵染过的小麦芽清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养两天，移栽至土壤中继续生长，两周后观察表型，提取RNA鉴定。
进一步，步骤(2)中，番茄PDS经PCR扩增后所得的番茄PDS基因片段与小麦PDS基因TaPDS的相似度为76.53％。
进一步，步骤(3)中，所述的液氮冻融法具体方法为：取农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，加入200纳克待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入到800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L Kna和50mg/L Rif抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定正确后，得到含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS农杆菌GV3101阳性菌株。
进一步，步骤(3)中，100ml三角瓶中培养的菌液的OD600＝0.3。
进一步，步骤(5)中，带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，同时加入转化菌液5ml，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器抽真空，每次保持15s，操作2次。
进一步，步骤(5)中，所述的分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦芽和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转每分钟下过夜培养15h。
本发明还公开了一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法在研究同时沉默小麦MLO同源基因中的应用。
与现有技术相比较，本发明具有如下主要创新点：
(1)本发明针对小麦研究现存的问题，发明一种基于TRV的VIGS新技术，能够快速高效的在整个小麦植株中沉默目的基因，对于多拷贝基因的同时沉默更为有效。八氢番茄红素 脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)沉默后植株会有光漂白现象(Liu et al.,2002a,Dinesh-Kumaret al.,2003)，本发明利用番茄PDS基因来沉默小麦PDS基因，能够快速高效的实现小麦PDS基因沉默，叶片呈现出光漂白现象。本发明方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且本发明为全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各个组织中功能。
(2)这种基于TRV的VIGS法实现小麦基因沉默的方法也可用于研究其他小麦的基因功能。小麦MLO是一个负调小麦对白粉菌抗性的基因，小麦基因组有三个拷贝分别位于A、B、D基因组上，将三个拷贝同时突变会使小麦对白粉病感病变为抗病，本发明同时对MLO的三个拷贝进行沉默，并检测对多拷贝基因同时沉默的效果，结果表明，本发明的方法方便快捷、基因沉默效果一目了然。
附图说明
图1小麦PDS基因TaPDS和番茄PDS基因SlPDS片段相似度比对结果；
图2TRV介导的番茄PDS基因沉默的小麦培养16天的表型；
图3半定量检测沉默小麦植株中PDS基因表达水平；
图4不同参数下TRV诱导玉米基因沉默效果；
图5TaMLO-A1,TaMLO-B1和TaMLO-D1三个基因片段序列相似度比对结果；
图6同时沉默小麦MLO的三个拷贝后的小麦表型与未沉默的小麦的表型对比图。
具体实施方式
下面通过实例对本发明作进一步阐述，其目的在于更好理解本发明内容而非限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例均按照常规试验条件，若Sambrook等分子克隆实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例
实施例1沉默小麦PDS基因
一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法：
原料来源：小麦品种为小堰22；(试验采用萌发的小麦种子的培养条件为：19-21℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养至芽长3mm。)；
所用载体：VIGS实验所用沉默载体为烟草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体，分别为TRV1和TRV2，由剑桥大学David Baulcombe教授和清华大学刘 玉乐教授馈赠。pTRV1载体包括编码RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和16kD蛋白的基因，是VIGS体系的辅助病毒载体。pTRV2载体包括衣壳蛋白(Cp)基因、多克隆位点(MCS)等，用于目的基因的构建。
具体步骤如下：
步骤(1)：取小麦种子50粒(用发芽的小麦种子，后续小麦PDS基因的沉默效率最好，详见图4a)，用有效氯为1％次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；
步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；
具体步骤如下：
cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；
PDS基因扩增：设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’，PCR产物为409-bp。以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系进行扩增；扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；番茄PDS经PCR扩增后所得的番茄PDS基因片段与小麦PDS基因TaPDS的相似度为76.53％，详见图1；
pTRV-SlPDS基因沉默载体的构建：
纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后备用；
步骤(3)农杆菌转化及培养：
将验证正确的pTRV-SlPDS、pTRV2(空载，起对照作用)以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，所述的液氮冻融法具体方法为：取农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，加入200纳克待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入到800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L Kna和50mg/L Rif抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的液体 LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定正确后，得到含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；
将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，分别在含有相应抗生素的LB平板培养基上划线，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆放于5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，用50ml离心管在28℃、200转每分钟条件下，震荡培养24小时；将TRV1与TRV2以1：1混合(空载，起对照作用)，TRV1与TRV-SlPDS以1:1混合，分别按1:100转接到20ml相同的LB培养基中，在100ml三角瓶中继续培养到菌液的OD600＝0.04-1.5(OD600最优值是0.3，参见图4d)，并调整两个三角瓶中的菌液的OD600值相同；
步骤(4)配制转化菌液：
向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮(AS)终浓度为19.62mg·L-1、半胱氨酸(Cys)终浓度为400mg·L-1和吐温20(Tween 20)终浓度为5ml·L-1，(采用乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20的混合液培养效果最佳，图4表示不同参数下，TRV诱导小麦基因沉默效果，图4b表示：不同组分侵染液对基因沉默效率的影响，结果显示：采用乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20的混合液培养效果最佳，混合液中，乙酰丁香酮，终浓度为19.62mg·L-1；半胱氨酸，终浓度为400mg·L-1；吐温20，终浓度为5ml·L-1)，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
步骤(5)小麦种子侵染：
将等量的处理过的小麦种子分别放入带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，记为玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1与TRV2的转化菌液(起对照作用)，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器对玻璃瓶抽真空，每次保持15秒，操作1～2次(利用注射器抽真空能非常有效的辅助侵染，真空处理每次15s，两次即总时间30秒沉默效率最高(参见图4C))；最后，分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦种子和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转每分钟下过夜培养0-25小时(侵染效果最好的是和农杆菌共培养15h，参见图4e)；
培养结束，超净台用无菌水清洗干净，将经TRV1与TRV2转化菌液侵染过的小麦和经TRV1与TRV-SlPDS转化菌液侵染过的小麦清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养两天，移栽至土壤中继续生长，两周后观察表型，提取RNA，进一步鉴定。
结果分析：
1.对经TRV1与TRV2 1：1混合侵染过的小麦种子(起对照作用)和经TRV1与TRV-SlPDS1：1混合侵染过的小麦种子清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养至长出叶片，移栽至土壤中继续生长两周后观察表型，结果如图2所示(A、本实验使用的萌发的小麦种子；B、真空辅助携带病毒质粒的农杆菌侵染小麦种子；C-E、对照处理小麦种子萌发16天后的表型(经TRV1与TRV2 1：1混合侵染过的小麦种子)；F-H、经含有PDS基因片段TRV载体(TRV1,TRV-SlPDS)的农杆菌侵染后的小麦种子萌发两周后的表型；I、本实验使用的小麦种子；J-L、经含有PDS基因片段TRV载体(TRV1,TRV-SlPDS)的农杆菌侵染后的小麦种子萌发20天后的表型。标尺A图和I图为6.25mm，B图为14.41mm，D、G和L图为4.96mm，E、H和K图为3.94mm，C、F和J图为1.49cm)，如图中所示，经TRV1与TRV2 1：1混合侵染过的小麦种子，萌发16天后长势良好，叶子呈绿色或黄绿色，表示控制其叶绿素合成的基因未沉默；经TRV1与TRV-SlPDS 1：1混合侵染过的小麦种子，萌发两周后，叶子呈白色，产生光漂白现象，表示控制其叶绿素合成的PDS基因沉默；由此可知，小麦种子经TRV载体介导番茄PDS病毒基因侵染后，控制其叶绿素合成的PDS基因沉默。
2.按照TaKaRa提取试剂盒提取经TRV1与TRV2 1：1混合侵染过的小麦萌发两周后的植株和经TRV1与TRV-SlPDS 1：1混合侵染过的小麦萌发两周的植株的总RNA。以1μg提的总RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(TaKaRa)操作说明合成第一链cDNA，然后稀释10倍备用。采用半定量RT-PCR方法检测沉默植株中PDS基因转录本的沉默效果。小麦Actin基因(GenBank登录号AB181991.1或者KC775780.1)为内参基因，半定量RT-PCR检测小麦PDS基因(登录号FJ517553.1)的表达水平，引物序列(TaActin：5’-GATACACGCTTCCTCATGCTATCC-3’和5’-AGAGCCACCGATCCAGACACTG-3’TaPDS:5’-TATTTGAGTCCCATCAGTAA-3’和5’-ACAGCCGTTTTGATTTCC-3’)。PCR所用试剂为Taq酶预混液(2×Taq PCR StarMix withLoading Dye，购于北京康润科技有限公司)，20μl体系，按照说明书配制，PCR反应条件：95℃预变性3min；28-36个循环的95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min，4℃保存，阳性克隆菌液提质粒备用；为了避免PCR产物量到达平台期对实验结果的影响，按照上述条件进行28、30、32、34和36个不同循环数的扩增，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。结果如图3所示：与内参基因相比较，经TRV1与TRV-SlPDS 1：1混合侵染过的小麦萌发两周的植株的根部和茎部， 小麦PDS基因的表达量显著降低。
不同条件对TRV诱导小麦基因沉默效率影响，如图4所示：
A表示：侵染小麦种子和萌发的小麦种子对沉默效率的影响，侵染萌发的小麦种子沉默效率显著高于直接侵染小麦种子；
B表示：侵染液不同组分对基因沉默效率的影响，所用几种组分均为必需组分；
C表示：真空处理时间对基因沉默效率的影响，30s达到最高沉默效率；
D表示：侵染所用农杆菌O.D600.值对基因沉默效率的影响，O.D.600＝0.3时效果最好；
E表示：和农杆菌共培养时间对基因沉默效率的影响，共培养15h最佳。
结果表明：受体为萌发的小麦种子，用含有组分2所有试剂配制的侵染液，在农杆菌O.D.600＝0.3时，抽真空侵染30s，侵染后共培养15h得到的沉默效率最高。
实施例2同时沉默小麦MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1
MLO是小麦对白粉病抗性的负调基因，小麦MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1分别位于小麦的A、B和D基因组上，序列高度相似，功能冗余，沉默或敲出任何一个或两个基因均不能显著影响小麦对白粉病的抗病性，只有同时沉默MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1才能显著增强小麦对白粉病的抗病性。本实施例利用小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，同时沉默小麦MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1，并通过观察小麦抗病表型来证实MLO同源基因MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1被同时沉默。
植物和白粉菌材料：
沉默MLO的植物材料同实施例1。
利用本发明所述的利用小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，沉默小麦MLO基因的具体做法是：
步骤(1)：小麦白粉菌小种E18(Blumeria graminis f.sp.Tritici，Bgt isolateE18)生长在小麦品种京411上，培养箱中培养，19-21℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度70％，每周转接一次到新的小麦的幼苗上。
步骤(2)TRV-MLO重组载体的构建、农杆菌转化及培养和配制转化菌液：
以转接有白粉菌的小麦cDNA为模板扩增小麦基因组MLO-B1CDS序列210-668bp的459bp片段(引物序列5’-CCGGAATTCCATCTCGCTGCTGCTCGCCG-3’和5’-CGCGGATCCGTGAGGTAGTCCACCTTGGT-3’)，这段序列在三个MLO之间高度保守，MLO序列参考(Wang Y,Cheng X,Shan Q,Zhang Y,Liu J,Gao C,Qiu JL(2014)Simultaneous editingof three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistanceto powdery mildew.Nat Biotechnol32:947-51)，这段序列三个基因的相似度超过98％(参见图5)。PCR产物经EcoRI-BamHI双酶切后构建到TRV2载体中，验证正确后用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，记为TRV-MLO(该过程采用的扩增、构建重组载体、液氮冻融法以及对照组试验的设计和实施例1相同)。
农杆菌转化及培养和配制转化菌液，采用的方法同实施例1，此处不再详述。
步骤(3)小麦白粉菌侵染实验
该实验共设计三组：
第一组：(WT)对未侵染小麦接种白粉菌BgtE18处理；
第二组：(TRV)用TRV1-TRV2(空载)转化菌液侵染小麦接种白粉菌BgtE18；
第三组：(TRV-MLO)用TRV-MLO转化菌液侵染小麦接种白粉菌BgtE18。
取沉默MLO和对照的小麦植株叶片，平铺到1％Agar(含有85μmol苯并咪唑)平板上，放置4h以上，低密度接种生长一周的小麦白粉菌。接种后放置于白粉菌培养箱中3天后进行微观表型分析，接菌后培养7天进行宏观表型观察。步骤如下：
固定：取接菌的小麦叶片放置于固定液(乙醇：醋酸的体积比为1:1)中室温浸泡24h；
脱色，取出固定后的叶片，清水冲洗，放入脱色液(乳酸：甘油：水的体积比为1:1:1)中，室温脱色48h；
染色，取出脱色后的叶片，清水冲洗，用0.6％(w/v)考马斯亮蓝R250染色5-10s，立即用清水冲洗；
显微镜观察，叶片放于载玻片上加一滴50％甘油盖上盖玻片，光学显微镜观察白粉菌菌丝和孢子的发育情况；结果如图6A所示。接种60小时后小麦白粉菌BgtE18植株上白粉菌孢子萌发和菌丝生长显微观察，可以看出沉默MLO的叶片和对照组相比，白粉菌孢子萌发正常，但是不能正常侵染；(形成菌丝的孢子占总萌发孢子的比例作为衡量植物抗病的一个指标，数值越低植株越抗病结果表明沉默MLO的小麦叶片白粉菌生长显著受到抑制而抗病性增强)。
接菌后培养7天进行菌落指数统计：结果如图6B所示：接种白粉菌BgtE18小麦分别进行WT、TRV、TRV-MLO处理后，对小麦叶片的微菌落指数进行统计，每种处理至少统计2,000个萌发的孢子，得出形成菌落的孢子占总萌发孢子的百分比，四次独立实验统计结果间**P<0.01(t-test)；显示：沉默MLO的叶片上白粉菌生长受到严重抑制。
接菌后培养7天进行宏观表型观察，结果如图6C所示，沉默MLO的叶片和对照组相比，沉默MLO的植株菌的生长显著受到抑制，白粉菌孢子不能形成菌落，未经病毒侵染和空载体 (TRV)侵染的植株白粉菌生长正常，可见白色菌落(图6C)。结果表明MLO的MLO-A，MLO-B和MLO-D被同时沉默。

Claims (8)

1.一种小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤(1)：取小麦种子50粒，用有效氯为1％次氯酸钠消毒液进行种子消毒，将消毒过的小麦种子放在垫有湿润无菌滤纸片的培养皿内，并透气性密封，置于室温下黑暗处萌发30h后获得无菌小麦芽，备用；
步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；
步骤(3)农杆菌转化及培养：
3.1)将pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；
3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；
3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；
3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04-1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；
步骤(4)配制转化菌液：
向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
步骤(5)小麦芽侵染：
将等量的处理过的小麦芽分别放入带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，记为玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1与TRV2的转化菌液，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器对玻璃瓶抽真空，每次保持15s，操作1～2次；最后，分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦芽和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转/min下过夜培养0-25小时；
培养结束，在超净台中，分别将经TRV1与TRV2转化菌液侵染过的小麦芽和经TRV1与TRV-SlPDS转化菌液侵染过的小麦芽用无菌水清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养两天，移栽至土壤中继续生长，两周后观察表型，提取RNA使用半定量RT-PCR方法检测被沉默小麦中PDS基因转录本的沉默效果。
2.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(2)的详细操作步骤如下：
cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；
PDS基因扩增：以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系进行扩增；设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
pTRV-SlPDS基因沉默载体的构建：纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV-SlPDS基因沉默载体。
3.根据权利要求2所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，
番茄PDS经PCR扩增后所得的番茄PDS基因片段与小麦PDS基因TaPDS的相似度为76.53％。
4.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的液氮冻融法具体方法为：取农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，加入200纳克待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入到800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L Kna和50mg/L Rif抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定正确后，得到含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS农杆菌GV3101阳性菌株。
5.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中，三角瓶中培养的菌液的O.D.600＝0.3；步骤(4)中乙酰丁香酮的终浓度为19.62mg·L-1、半胱氨酸的终浓度为400mg·L-1和吐温20的终浓度为5ml·L-1。
6.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(5)中，带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，同时加入转化菌液5ml，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器抽真空，每次保持15s，操作2次。
7.根据权利要求1所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麦芽和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转每分钟下过夜培养15h。
8.根据权利要求1-7中任一所述的小麦整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法在研究沉默小麦MLO基因中的应用。
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