CN114606246A - 一种trv载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法 - Google Patents

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杨暹
康云艳
柴喜荣
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，该方法包括S1、扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段，将扩增菜心PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV2‑BcPDS；S2、农杆菌转化及培养，得到含pTRV1与pTRV2‑BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；S4、将S3获得的含pTRV1与pTRV2‑BcPDS的转化菌液分别侵染发芽的菜心种子，培养侵染后的菜心种子，得到沉默菜心，该基因沉默的方法能够快速高效地在整个菜心植株中沉默目的基因，为验证菜心基因功能提供技术支持，并且该基因沉默的方法能够高效地、长时间地沉默目的基因。

Description

一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法。
背景技术
菜心(学名：Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen etLee)，亦称菜薹，十字花科芸薹属种白菜亚种的一个变种。原产于我国，主要分布在长江流域和华南地区，是华南地区种植面积最大的蔬菜，近些年来，菜心因其营养价值较高而成为国人餐桌上的新宠，影响及市场需求越来越大。现阶段，菜心的遗传转化体系尚不完善，菜心植株的突变体材料很难获得。对菜心遗传机制的分析技术上仍然不足。
RNA沉默是通过小的RNA来介导基因沉默机制，其能在大多数真核生物中起作用，是天然的抗病毒防御机制。由于基因沉默相对容易获得，病毒诱导的基因沉默(VIGS)不仅针对靶点病毒入侵的同时，也能抑制植物基因的表达，因此，许多病毒被开发成VIGS工具进行研究植物基因功能。
目前，有一系列改造过的RNA或DNA病毒载体被用于VIGS。烟草脆裂病毒(TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够很好的介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，也可以鉴定宿主植物生长点的基因，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。然而，基于TRV的VIGS在菜心中应用较少，并且效率尚未得到优化。
因此，受基因型限制等对菜心基因功能的研究带来了诸多不便，导致对菜心基因功能研究及开发相对滞后，亟需开发研究菜心基因的技术。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，该基因沉默的方法能够快速高效地在整个菜心植株中沉默目的基因，为验证菜心基因功能提供技术支持，并且该基因沉默的方法能够高效地、长时间地沉默目的基因。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
提供一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，包括以下步骤，
S1、扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段，扩增后的所述菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段记为扩增菜心PDS基因片段，将扩增菜心PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；
S2、农杆菌转化及培养，包括以下步骤：
S21、将S1获得的pTRV2-BcPDS质粒、pTRV2质粒以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经PCR鉴定正确后，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
S22、将S21获得的pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS放在含有抗生素的LB平板培养基上培养，使其分别长出单克隆；
S23、挑取S22获得的pTRV1单克隆、pTRV2单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆，将其分别放于含抗生素的LB液体培养基上培养，实现单克隆增殖；
S24、挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2单克隆以1:1混合，将其按1:100转接到含抗生素的LB液体培养基上后，在瓶体中继续培养直到菌液的OD600为0.4～1.5；挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基后，在瓶体中继续培养到菌液的OD600为0.4～1.5，调整两个瓶体中的菌液的OD值，使两个瓶体中的菌液的OD值相同；
S3、向S24中的瓶体加入乙酰丁香酮，混匀后，分别得到含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S4、将S3获得的含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液分别侵染发芽的菜心种子，培养侵染后的菜心种子，得到沉默菜心，观察沉默菜心的表型，提取沉默菜心RNA并反转录为cDNA，然后使用荧光定量方法检测沉默菜心中PDS基因的表达；其中，发芽的菜心种子通过以下方式获得：取菜心种子，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养。
在一些实施方式中，所述S1中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
S11、cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，备用；
S12、扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用。
在一些实施方式中，通过以下方式将菜心PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2：将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
在一些实施方式中，所述S1中，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％。
在一些实施方式中，所述S24中，瓶体中培养的菌液的OD600为0.6。
在一些实施方式中，所述S3中，所述乙酰丁香酮的浓度为10mg/L-25mg/L。
在一些实施方式中，所述S4中，通过以下方式侵染发芽的菜心种子：采用1号蓝口瓶和2号蓝口瓶，所述1号蓝口瓶和所述2号蓝口瓶分别放入等量的发芽的菜心种子，向所述1号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；向所述2号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵分别对所述1号蓝口瓶和所述所述2号蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。
在一些实施方式中，所述S4中，通过以下方式培养侵染后的菜心种子和观察沉默菜心表型：将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养18小时～25小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型。
在一些实施方式中，所述S4中，用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液和75％的乙醇对菜心种子进行消毒；当发芽培养时，待芽长至1.5cm～2cm时，备用。
本发明一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法的有益效果：
(1)本发明首创利用TRV、扩增菜心PDS基因片段对菜心种子进行病毒载体侵染，进而实现菜心PDS基因沉默，其中，pTRV1是烟草脆裂病毒(TRV)的RNA1表达载体，pTRV2是烟草脆裂病毒(TRV)的RNA2cDNA表达载体，pTRV1载体包括编码RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和16kD蛋白的基因，是VIGS体系的辅助病毒载体。pTRV2载体包括衣壳蛋白(Cp)基因、多克隆位点(MCS)、绿色荧光蛋白(GFP)等，用于目的基因的构建，使得扩增菜心PDS基因片段能稳定地连接到TRV中。
(2)本发明基因沉默的方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且能实现菜心整株沉默，效率高，方便研究菜心目的基因在各个组织中功能，有助于进行菜心基因功能研究，具有广泛的应用前景。
其他实施方式中，本发明首创采用真空负压辅助来侵染菜心种子，使得侵染快捷以及侵染效果好。
附图说明
图1是菜心PDS基因和番茄PDS基因片段相似度比对结果。
图2是TRV介导的菜心PDS基因沉默菜心植株萌发21，28，35天的表型。
图3是不同参数下TRV诱导菜心基因沉默效果。
图4是荧光定量检测沉默菜心植株中PDS基因表达水平。
图5是含GFP蛋白重组载体侵染菜心植株的荧光观察图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“该”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
应当理解，尽管在本发明可能采用术语“1号”、“2号”等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。由此，限定有“1号”、“2号”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为便于说明本发明的沉默方法，统一选用以下原料：
菜心种子：油青49；
KpnI-BamHI双切酶：购自NEB公司；
T4-DNA连接酶：购自赛默飞公司。
VIGS实验所用沉默载体：烟草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体。
实施例1
本实施例公开的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，包括以下步骤，
S1、取菜心种子50粒，用有效氯为1％的次氯酸啦消毒液进行种子消毒后，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养，待芽长至1.5-2cm时，放于带有干净滤纸的培养皿中，备用；
S2、用PCR方法将扩增后的菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段(扩增菜心PDS基因片段)连接到TRV病毒诱导沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；其中，图1所示，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％，图1所示，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％，菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度较高，表明成功克隆到菜心BcPDS基因，后续能够将其连接到TRV病毒诱导沉默载体pTRV2中，用于沉默BcPDS基因。其中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后备用；
扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用；
pTRV-PDS基因沉默载体的构建：
将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
S3、农杆菌转化及培养
将经PCR和测序验证正确的pTRV2-BcPDS、pTRV1和pTRV 2载体转入农杆菌GV3101，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
具体方法为：取农杆菌GV3103感受态细胞，冰上融化，加入100ng待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定合格后，得到含质粒子pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS；挑取增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2单克隆以1:1混合，将其按1:100转接到含抗生素的LB液体培养基上后，在三角瓶中继续培养直到菌液的OD600为1.5；挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基后，在三角瓶中继续培养到菌液的OD600为0.8；调整两个三角瓶中的菌液的OD值，使两个瓶体中的菌液的OD值相同；
S4、配制转化菌液
向步S3中所得的两个三角瓶分别加入20mg/L的乙酰丁香酮，混匀后，分别得到含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S5、菜心种子侵染
采用1号蓝口瓶和2号蓝口瓶，其中1号蓝口瓶为对照组，2号蓝口瓶为实验组。
所述1号蓝口瓶和所述2号蓝口瓶分别放入等量的发芽的菜心种子，向所述1号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；向所述2号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵分别对所述1号蓝口瓶和所述所述2号蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养18小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型，提取RNA使用荧光定量方法检测沉默菜心中BcPDS基因的表达情况。
实施例2
S1、取菜心种子50粒，用有效氯为1％的次氯酸啦消毒液进行种子消毒后，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养，待芽长至1.5-2cm时，放于带有干净滤纸的培养皿中，备用；
S2、用PCR方法将扩增后的菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段(扩增菜心PDS基因片段)连接到TRV病毒诱导沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；其中，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％。其中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后备用；
扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用；
pTRV-PDS基因沉默载体的构建
将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
S3、农杆菌转化及培养
将经PCR和测序验证正确的pTRV2-BcPDS、pTRV1和pTRV 2载体转入农杆菌GV3101，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
具体方法为：取农杆菌GV3103感受态细胞，冰上融化，加入100ng待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定合格后，得到含质粒子pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS；挑取增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2单克隆以1:1混合，将其按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基上后，在三角瓶中继续培养直到菌液的OD600为0.6；挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，将其按1:100转接到含抗生素的LB液体培养基上后，在三角瓶中继续培养到菌液的OD600为0.6；调整两个三角瓶中的菌液的OD值，使两个瓶体中的菌液的OD值相同；
S4、配制转化菌液
向步S3中所得的两个三角瓶分别加入10mg/L的乙酰丁香酮，混匀后，分别得到含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S5、菜心种子侵染
采用1号蓝口瓶和2号蓝口瓶，其中1号蓝口瓶为对照组，2号蓝口瓶为实验组。
所述1号蓝口瓶和所述2号蓝口瓶分别放入等量的发芽的菜心种子，向所述1号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；向所述2号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵分别对所述1号蓝口瓶和所述所述2号蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养25小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型，提取RNA使用荧光定量方法检测沉默菜心中BcPDS基因的表达情况。
实施例3
S1、取菜心种子50粒，用有效氯为1％的次氯酸啦消毒液进行种子消毒后，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养，待芽长至1.5-2cm时，放于带有干净滤纸的培养皿中，备用；
S2、用PCR方法将扩增后的菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段(扩增菜心PDS基因片段)连接到TRV病毒诱导沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；其中，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％。其中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后备用；
扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增，得到扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用；
pTRV-PDS基因沉默载体的构建
将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
S3、农杆菌转化及培养
将经PCR和测序验证正确的pTRV2-BcPDS、pTRV1和pTRV 2载体转入农杆菌GV3101，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
具体方法为：取农杆菌GV3103感受态细胞，冰上融化，加入100ng待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定合格后，得到含质粒子pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS；挑取增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2单克隆以1:1混合，按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基后，在三角瓶中继续培养直到菌液的OD600为1.2，；挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，将其按1:100转接到含抗生素的LB液体培养基上后，在三角瓶中继续培养到菌液的OD600为0.4；调整两个三角瓶中的菌液的OD值，使两个瓶体中的菌液的OD值相同；
S4、配制转化菌液
向步S3中所得的两个三角瓶分别加入20mg/L的乙酰丁香酮，混匀后，分别得到含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S4、菜心种子侵染
采用1号蓝口瓶和2号蓝口瓶，其中1号蓝口瓶为对照组，2号蓝口瓶为实验组。
所述1号蓝口瓶和所述2号蓝口瓶分别放入等量的发芽的菜心种子，向所述1号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；向所述2号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵分别对所述1号蓝口瓶和所述所述2号蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养18小时～25小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型，提取RNA使用荧光定量方法检测沉默菜心中BcPDS基因的表达情况。
实施例4
S1、取菜心种子50粒，用有效氯为1％的次氯酸啦消毒液进行种子消毒后，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养，待芽长至1.5-2cm时，放于带有干净滤纸的培养皿中，备用；
S2、用PCR方法将扩增后的菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段(扩增菜心PDS基因片段)连接到TRV病毒诱导沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；其中，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％。其中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后备用；
扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增，得到扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用；
pTRV-PDS基因沉默载体的构建
将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
S3、农杆菌转化及培养
将经PCR和测序验证正确的pTRV2-BcPDS、pTRV1和pTRV 2载体转入农杆菌GV3101，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
具体方法为：取农杆菌GV3103感受态细胞，冰上融化，加入100ng待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定合格后，得到含质粒子pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株、含pTRV2的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1、pTRV2和pTRV2-BcPDS；挑取增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2单克隆以1:1混合，按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基后，在三角瓶中继续培养直到菌液的OD600为1.5；挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆并将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，将其按1:100转接到含抗生素的LB液体培养基上后，在三角瓶中继续培养到菌液的OD600为0.4；调整两个三角瓶中的菌液的OD值，使两个瓶体中的菌液的OD值相同；
S4、配制转化菌液
向步S3中所得的两个三角瓶分别加入20mg/L的乙酰丁香酮，混匀后，分别得到含pTRV1与pTRV2的转化菌液和含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S4、菜心种子侵染
采用1号蓝口瓶和2号蓝口瓶，其中1号蓝口瓶为对照组，2号蓝口瓶为实验组。
所述1号蓝口瓶和所述2号蓝口瓶分别放入等量的发芽的菜心种子，向所述1号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；向所述2号蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵分别对所述1号蓝口瓶和所述所述2号蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养18小时～25小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型，提取RNA使用荧光定量方法检测沉默菜心中BcPDS基因的表达情况。
沉默效果验证：
1.菜心出白化
图3可见，OD在0.4 0.8，抽真空时间在5分钟，共培养15-25小时时，菜心出白化的概率高。
2.表型观察
将实施例1的侵染后的菜心种子移栽至土壤中继续培养其生长，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养至长出叶片，于第移栽培养的第21天、第28天和第35天，观察沉默菜心的表型，得到图2所述的表型结果。
在图2中，
A表示本实验使用的菜心种子和侵染装置；
B、C表示经pTRV1与pTRV2-BcPDS以1:1侵染的菜心种子萌发21天后的表型；
D、E表示经pTRV1与pTRV2-BcPDS以1:1侵染的菜心种子萌发28天后的表型；
F、G表示经pTRV1与pTRV2-BcPDS以1:1侵染的菜心种子萌发35天后的表型；
图中，标尺＝2cm；
经含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液侵染过的菜心种子，萌发21天后，叶子逐渐呈白色，35天后产生光漂白现象，表示控制其叶绿素合成的PDS基因沉默，由此可知，菜心种子经TRV载体介导菜心PDS病毒基因侵染后，能实现控制菜心叶绿素合成的PDS基因沉默。
3.PDS基因的表达水平
按照天根提取试剂盒提取经pTRV1与pTRV2 1:1混合侵染过的菜心萌发0,7,14,21,28,35天的植株和经pTRV1与pTRV2-BcPDS 1:1混合侵染过的菜心萌发的植株的总RNA。以1μg提的总RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(TaKaRa)操作说明合成第一链cDNA，然后稀释10倍备用。采用荧光定量方法检测沉默植株中PDS基因的表达水平。菜心GAPDH基因(登录号AF536826)为内参基因，菜心PDS基因(登录号Bra032770)。
荧光定量PCR引物序列(BcGAPDH:5’-CCGCTAACTGCCTTGCTCCACTT-3’和5’-GCGGCTCTTCCACCTCTCCAGT-3’；BcPDS:5’-TGCAGGTAGTGTGTGTGGAT-3’和5’-CAGCACCAGCAATGACAACT-3’)。PCR所用试剂为Taq酶预混液(2×Taq PCR StarMix withLoading Dye，购于北京康润科技有限公司)，20μl体系，按照说明书配制，结果如图4所示：与内参基因相比较，经pTRV1与pTRV2-BcPDS 1：1混合侵染过的菜心萌发21天的植株的根部和叶片中，菜心PDS基因的表达量显著降低。
图5是含GFP蛋白重组载体侵染菜心植株的荧光观察图，图5所示，侵染菜心有较好的荧光效果，可见pTRV2-BcPDS载体已成功侵染，并且表达成功，其能在后续中正常表达。
由上述的植株表型和基因表达水平两个角度证明了本发明能够实现对菜心的特定基因进行基因沉默。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：包括以下步骤，
S1、扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段，扩增后的所述菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段记为扩增菜心PDS基因片段，将扩增菜心PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV2-BcPDS；
S2、农杆菌转化及培养，包括以下步骤：
S21、将S1获得的pTRV2-BcPDS质粒和pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经PCR鉴定正确后，得到含pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株和含pTRV2-BcPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，分别记为pTRV1和pTRV2-BcPDS，保菌备用；
S22、将S21获得的pTRV1和pTRV2-BcPDS放在含有抗生素的LB平板培养基上培养，使其分别长出单克隆；
S23、挑取S22获得的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆，将其分别放于含抗生素的LB液体培养基上培养，实现单克隆增殖；
S24、挑取S23增殖后的pTRV1单克隆和pTRV2-BcPDS单克隆，将pTRV1单克隆与pTRV2-BcPDS单克隆以1:1混合，按1ml菌液接种到100ml含抗生素的LB液体培养基后，在瓶体中继续培养到菌液的OD600为0.4～1.5；
S3、向S24中的瓶体加入乙酰丁香酮，混匀后，得到含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；
S4、将S3获得的含pTRV1与pTRV2-BcPDS的转化菌液分别侵染发芽的菜心种子，培养侵染后的菜心种子，得到沉默菜心；其中，发芽的菜心种子通过以下方式获得：取菜心种子，对菜心种子进行消毒后，放入1/2MS培养基中，进行发芽培养。
2.根据权利要求1所述的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：所述S1中，扩增菜心八氢番茄红素脱氢酶基因片段的步骤包括：
S11、cDNA合成：按天根提取试剂盒操作说明提取菜心的总RNA，以1μg的总RNA为模板，按照Vazyme cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，备用；
S12、扩增菜心PDS基因：以菜心的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits，50μL体系以特异性引物进行扩增菜心PDS基因片段，所述特异性引物的上游引物序列为：F：TCTACCAGCACCCTTAAACG，下游引物序列为：R：CCAAAGAAGTCCTCTCCGATAC；所述PCR基因片段经电泳检测为单一条带，得到纯化后的扩增菜心PDS基因片段，备用。
3.根据权利要求2所述的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：
通过以下方式将菜心PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2：将纯化后的扩增菜心PDS基因片段，经过KpnI-BamHI双酶切后，与同样经过KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，将所得的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV2-BcPDS基因沉默载体。
4.根据权利要求1所述的菜心整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征是：所述S1中，扩增菜心PDS基因片段与番茄PDS基因BcPDS的相似度为68.41％。
5.根据权利要求1所述的菜心整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征是：所述S24中，瓶体中培养的菌液的OD600为0.6。
6.根据权利要求1所述的菜心整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征是：所述S3中，所述乙酰丁香酮的浓度为10mg/L-25mg/L。
7.根据权利要求1所述的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：所述S4中，通过以下方式侵染发芽的菜心种子：采用蓝口瓶，所述蓝口瓶放入发芽的菜心种子，向所述蓝口瓶加入5ml含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使菜心种子完全浸泡在该转化菌液中；用真空泵对所述蓝口瓶抽真空，每次抽60秒，操作1～5次，实现对菜心种子侵染。
8.根据权利要求7所述的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：所述S4中，通过以下方式培养侵染后的菜心种子和观察沉默菜心表型：将侵染后的菜心种子于28℃下暗培养18小时～25小时，培养结束后，移栽至土壤中继续生长两周后观察沉默菜心的表型。
9.根据权利要求1所述的TRV载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法，其特征是：所述S4中，用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液和75％的乙醇对菜心种子进行消毒；当发芽培养时，待芽长至1.5cm～2cm时，备用。
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