CN111893133A - 一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法 - Google Patents

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CN111893133A CN202010710182.7A CN202010710182A CN111893133A CN 111893133 A CN111893133 A CN 111893133A CN 202010710182 A CN202010710182 A CN 202010710182A CN 111893133 A CN111893133 A CN 111893133A
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Abstract

本发明涉及植物基因工程应用领域，具体涉及一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。本发明将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养，然后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，进行预培养、侵染、共培养、恢复培养和继代培养；将继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗，组培苗今后一步开瓶炼苗，后正常管理，得到转基因植物。本发明以菜心为材料，构建了菜心遗传转化体系，获得转基因植株，操作简单高效，污染率低，综合性能高，为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。

Description

一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程应用领域，具体涉及一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。
背景技术
菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是华南地区栽培面积和产量最大的蔬菜。菜心以菜薹为主要食用器官，品质柔嫩，风味独特，营养丰富，受到广大消费者的喜爱；其适应性广，生长周期短，可供周年生产，在蔬菜供应中占有重要地位。
20世纪80年代之后，大白菜组织培养与植株的高频再生系统逐步建立，在此基础上进行的转基因研究也取得了一定的进展，但主要集中在白菜遗传转化上，菜心遗传转化成功的报道很少。预培养时间、侵染时间、侵染浓度、共培养时间及选择压等都会对菜心的遗传转化产生影响。
携带AA基因型的白菜类作物属于芸薹属再生率比较低的品种，其不定芽再生困难，农杆菌不易感染，影响了基因工程在白菜品种改良上的应用。随着白菜全基因组测序计划的完成，白菜开始成为十字花科植物功能基因组研究的模式植物。关于芸薹属植物基因和功能的研究越来越多，遗传转化体系的建立将为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法，包含如下步骤：
(1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养；
(2)选取步骤(1)培养后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，转移至预培养培养基中，黑暗倒置预培养3d；
(3)采用农杆菌介导法侵染步骤(2)预培养后的外植体；
(4)将步骤(3)侵染后的外植体转移至共培养培养基中，黑暗正置共培养2d；
(5)将步骤(4)共培养后的外植体转移至恢复培养基中，黑暗倒置培养2d，然后恢复正常光照并倒置培养直至长出不定芽；
(6)将步骤(5)中获得的不定芽转至筛选培养基中，继代培养2～3次；
(7)将步骤(6)继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；
(8)将步骤(7)得到的组培苗开瓶炼苗，后正常管理；
步骤(1)中所述的表面消毒的具体操作优选为：
选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，首先用无菌水冲洗2遍，然后用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍，最后用质量分数为7.5％的NaClO(活性氯含量为4％)浸泡10min、无菌水冲洗3次并吸干水分；
步骤(3)中所述的侵染的时间优选为10min；
步骤(3)中所述的侵染的具体操作优选为：
将农杆菌扩摇后，4000rpm离心15min，弃上清液；用侵染培养基重悬农杆菌，将其光密度值OD600调至为0.5～0.6，然后28℃、200rpm震荡培养4h，得到农杆菌侵染液；将外植体转移至农杆菌侵染液中，28℃、150rpm震荡侵染10min；
步骤(4)中所述的共培养的具体操作优选为：
用漏勺过滤步骤(3)中侵染后的外植体，然后置于干净的滤纸上，将多余菌液吸干净；另取一张干净的滤纸平铺于共培养培养基上，用侵染培养基打湿滤纸，将吸干净菌液的外植体至于其上，保证子叶柄切口接触滤纸；然后黑暗正置培养；
步骤(5)中所述的外植体优选用无菌水清洗3～4遍，吸干多余水分，迅速转移至恢复培养基中，前2d黑暗倒置培养，之后倒置正常光照培养；
步骤(6)中所述的不定芽的长度优选为1.0～2.0cm；
步骤(6)中所述的筛选培养基中优选添加终浓度为55.6μL/L的PPT；
步骤(7)中所述的生根培养中选择压的加入会影响菜心生根，生根培养基中不添加选择压；
步骤(8)中所述的炼苗的方式为：选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培养基，转移至含有泥炭和蛭石的混合基质中，保鲜袋套袋5～10天，后续常规管理；
所述的泥炭和蛭石的质量比优选为1:1；
所述的保鲜袋优选具有若干孔洞，以利于植物呼吸；
步骤(1)、(5)、(6)、(7)中，组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmol/m2s的白色LED灯；
步骤(1)～(7)中所述的培养基的组成如下所示：
Figure BDA0002596255540000031
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以菜心为材料，研究预培养时间、侵染时间、侵染浓度、共培养时间及选择压等对不定芽再生率及转化率的影响，建立菜心遗传转化体系，为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。
(2)本发明构建的方法，可建立菜心遗传转化体系，优化影响菜心遗传转化的多种因素，获得转基因植株；提供每一步所需培养基配方；操作简单高效，污染率低，综合性能高；为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。
附图说明
图1是本发明获得的转基因菜心植株的展示图；其中，1.播种，2.3d苗龄的无菌苗，3.预培养，4.共培养，5.恢复培养，6.筛选培养，7.生根培养，8.炼苗，9.转基因植株正常管理，10.开花的转基因菜心。
图2是转化体植株的Bar基因PCR检测结果图；其中，M：Marker，图左边数字为marker条带大小，1～4：不同转化株系，5：质粒，6：野生型，7：水。
图3是转化体植株Bar基因测序结果比对图。
图4是转化体植株GUS染色结果图；其中，1：野生型，2：转基因菜心。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.材料
1.1植物材料
试验于2018年7月～2019年6月在华南农业大学园艺学院蔬菜栽培与生理实验室、分子实验室和组培室内进行。供试菜心品种为“油绿501”，由广州市农业科学研究院育成，本实验室多代自交留种。
1.2培养基
表1培养基配方
Figure BDA0002596255540000041
1.3农杆菌
大肠杆菌菌株为DH5α(Vazyme)、农杆菌GV3101(维地)、植物超表达载体为pCAMBIA3301(鼎国)。
1.4检测引物
用于菜心阳性苗检测引物Bar基因的序列为：
Bar-F：ATGAGCCCAGAACGACGCC；
Bar-R：TCAAATCTCGGTGACGGGCA；
2.试验方法
2.1菜心遗传转化步骤
(1)外植体的获得
选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，首先用无菌水冲洗2遍，然后用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍，最后用质量分数为7.5％的NaClO(活性氯含量为4％)浸泡10min、无菌水冲洗3次后置于滤纸上，吸干多余水分，将种子均匀地接种于播种培养基上，每瓶50～80粒；组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmolm-2s-1的白色LED灯；
(2)预培养
自播种开始计算，选取3d苗龄的菜心无菌幼苗的带子叶柄的子叶(简称带柄子叶，子叶柄的长度为0.5cm左右)为外植体，分别进行2d、3d、4d预培养，预培养需黑暗、倒置，在25℃的组培室中培养；
(3)侵染
①pCAMBIA3301载体通过常规方法转入大肠杆菌DH5α中，然后抽质粒并通过常规方法转入农杆菌GV3101中；将含有pCAMBIA3301载体的农杆菌采用LB液体培养基扩摇后，4000rpm离心15min，弃上清液；用侵染培养基重悬使其光密度值OD600调至为0.5～0.6，然后28℃、200rpm震荡培养4h，得到农杆菌侵染液；
②将步骤(2)预培养后的外植体转移至农杆菌侵染液中，28℃、150rpm振荡侵染10min；
(4)共培养
侵染后用漏勺过滤菌液，将侵染后的外植体置于干净的滤纸上，吸干多余菌液；另取一张适宜大小、干净的滤纸平铺于共培养培养基上，用1～2ml侵染培养基打湿滤纸，将浸染好的外植体至于其上，保证子叶柄切口接触滤纸；黑暗正置共培养2d；
(5)恢复培养
共培养后的外植体用无菌水冲洗4遍，吸干多余水分，迅速转移至恢复培养基中，前2d黑暗倒置培养，之后倒置正常光照培养(组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmolm-2s-1的白色LED灯)，直至长出不定芽；
(6)筛选培养
将步骤(5)中长出不定芽(不定芽的长度为1.5cm左右)的外植体转移至筛选培养基，每20d继代一次，继代2～3次；组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmolm- 2s-1的白色LED灯；
(7)生根培养
对筛选后正常生长的不定芽进行生根培养，一般25d左右；组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmolm-2s-1的白色LED灯；
(8)开瓶炼苗，后正常管理
待不定根生长健壮时开瓶炼苗，转移至含有泥炭和蛭石(质量比1:1)的塑料盆中，用镊子将保鲜袋扎几个孔，保鲜袋套袋一周，后续正常管理。
2.2转基因植株检测
使用TIANGEN的DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒提取炼苗成功的菜心植株DNA，以DNA为模板，对转化植株进行Bar基因PCR扩增，PCR反应结束后，用1％(质量体积百分比)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将检测条带正确的对应PCR产物进行测序分析。使用美国生物技术信息中心(NCBI)数据库中BLAST网络服务工具(网址为：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列检索和比对。
GUS染色：将准备好的新鲜待测样品用纯水冲洗干净，吸干水分，加入GUS染液中，浸没染色材料。抽真空三次，用锡纸包裹37℃保温过夜。先用0.1M磷酸缓冲液冲洗植株，然后用FAA固定1h，接着依次用25％(体积百分比)、50％(体积百分比)、70％(体积百分比)、95％(体积百分比)的乙醇进行梯度脱色，最后保存于70％(体积百分比)乙醇中。
3.结果与分析
预培养是菜心遗传转化过程中不可缺少的步骤，预培养时间的长短决定着遗传转化效率。从表2中可以得到预培养3d，外植体再生率最高，最终得到2株转基因菜心；预培养2d、4d，外植体再生率最低且没有获得转基因植株。因此，在菜心的遗传转化中预培养3d最适宜。
表2预培养时间对再生率及转化率的影响
Figure BDA0002596255540000071
实施例2侵染浓度
1.材料
1.1植物材料：同实施例1；
1.2培养基：同实施例1；
1.3农杆菌：同实施例1；
1.4检测引物：同实施例1；
2.试验方法
2.1菜心遗传转化步骤
取3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d；将含有pCAMBIA3301载体的农杆菌采用LB液体培养基扩摇后，4000rpm离心15min，弃上清液；用侵染培养基重悬菌体，使其光密度值OD600调至不同浓度(OD600为0.3～0.4、0.4～0.5、0.5～0.6、0.6～0.7、0.7～0.8)，然后28℃、200rpm震荡培养4h，得到农杆菌侵染液并进行侵染，其余步骤同实施例1保持一致；
2.2转基因植株检测：同实施例1；
3.结果与分析
侵染浓度直接影响到后续不定芽的再生和筛选。从表3中可以看出，当侵染菌液光密度值OD600小于0.5时，外植体的再生率低，且未得到转基因植株；当OD600大于0.6时，虽然再生率得到了提高，但后期污染严重，在筛选培养阶段最为明显，不易抑制农杆菌的滋生，最终未得到转基因植株。OD600在0.5～0.6之间时，不定芽的再生率最高，得到2株转基因菜心。因此，用侵染培养基重悬菌体时，农杆菌OD600在0.5～0.6为宜。
表3侵染浓度对再生率及转化率的影响
Figure BDA0002596255540000072
Figure BDA0002596255540000081
实施例3侵染时间
1.材料
1.1植物材料：同实施例1；
1.2培养基：同实施例1；
1.3农杆菌：同实施例1；
1.4检测引物：同实施例1；
2.试验方法
2.1菜心遗传转化步骤
取3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d，用制备好的农杆菌侵染液分别振荡侵染5min、10min、15min。其余步骤同实施例1保持一致；
2.2转基因植株检测：同实施例1；
3.结果与分析
侵染时间对菜心转基因转化效果影响很大。侵染时间过短，转化率较低，但丛生芽较多，后期假阳性率高，工作量大，本处理得到2株转基因菜心；侵染时间过长，后期抑制农杆菌困难，降低了转化率，得到1株转基因菜心；侵染10min，外植体再生率最高(表4)，最终得到2株转基因菜心，是最适宜的侵染时间。
表4侵染时间对再生率及转化率的影响
Figure BDA0002596255540000082
实施例4共培养时间
1.材料
1.1植物材料：同实施例1；
1.2培养基：同实施例1；
1.3农杆菌：同实施例1；
1.4检测引物：同实施例1；
2.试验方法
2.1菜心遗传转化步骤
取3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d，用侵染培养基重悬后OD600为0.5～0.6、然后28℃、200rpm震荡培养4h的农杆菌侵染液振荡侵染10min，共培养0d、1d、2d、3d、4d。其余步骤同实施例1保持一致。共培养需黑暗、正置，在25℃的组培室中培养。确定最适宜的共培养时间。
2.2转基因植株检测：同实施例1；
3.结果与分析
进行共培养可以提高菜心的再生率，但共培养时间过长会抑制不定芽的分化，降低再生率。本试验分别将侵染后的外植体分别共培养0、1、2、3、4d，从表5中可以发现，共培养2d，外植体再生率和每个外植体平均分化不定芽数均最高，得到2株转基因菜心，为最适宜的共培养时间。其与4个处理均未得到转基因植株。
表5共培养时间对再生率及转化率的影响
Figure BDA0002596255540000091
实施例5选择压
1.材料
1.1植物材料：同实施例1；
1.2培养基：同实施例1；
1.3农杆菌：同实施例1；
1.4检测引物：同实施例1；
2.试验方法
2.1菜心遗传转化步骤
①先取3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，接种于含有不同PPT浓度(200、166.7、142.9、125、111.1、100、83.3、71.4、62.5、55.6、50μL/L)的分化培养基(MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/L AgNO3，pH＝5.8)中。观察外植体生长情况和不定芽分化情况，根据观察结果，初步确定PPT的筛选浓度；
②对经过恢复培养后的不定芽进行筛选培养，结合上一步结果进一步优化选择压，其余步骤同实施例1保持一致；
2.2转基因植株检测：同实施例1；
3.结果与分析
将3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，分别接种于选择压为200、166.7、142.9、125、111.1、100、83.3、71.4、62.5、55.6、50μL/L PPT的分化培养基中。在加入选择压的培养基中，外植体均出现变黄、萎蔫、死亡的现象；随着培养基中PPT浓度的增加，黄化出现的时间越早，死亡时间越快。添加100～200μL/L的PPT时，3d后外植体出现变黄现象，5d后全部死亡。添加83.3、71.4、62.5μL/L的PPT时，4d后外植体开始变黄，7d全部死亡。添加62.5、55.6、50μL/L的PPT时，外植体10d全部死亡。选择压为55.6μL/L的PPT时已经低于正常使用浓度，因此初步选择加入PPT 62.5μL/L、55.6μL/L、50μL/L作为选择压，进行菜心遗传转化的筛选。
结果表明，添加62.5μL/L的PPT对经过恢复培养后的不定芽进行筛选培养时，由于选择压太高不定芽全部死亡；添加50μL/L的PPT进行筛选时，假阳性率太高；添加55.6μL/L的PPT进行筛选时，既可以筛除大部分假阳性植株，又可以保证转基因植株的正常生长。因此，加入55.6μL/L的PPT做为选择压最为适宜。
实施例6
根据实施例1～5，建立菜心遗传转化体系：用3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d，用侵染培养基重悬后OD600为0.5～0.6、然后28℃、200rpm震荡培养4h的农杆菌侵染液侵染10min，共培养2d，无菌水冲洗4遍进行恢复培养，待不定芽长至1.5cm左右进行筛选培养，选择压为55.6μL/L的PPT，继代2～3次，进行生根培养，不定根生长健壮时进行开瓶炼苗，后续正常管理，其他实验细节同实施例1(图1)。
以携带目的基因Bar基因的质粒(pCAMBIA3301)做阳性对照，野生型菜心做阴性对照，无菌水做空白对照。由图2可以看出，有四个株系扩出目标条带，野生型和水没有扩增出任何条带。
测序结果用NCBI数据库中BLAST网络服务工具进行对核苷酸序列检索和比对，如下图3所示，有4个样品与Bar基因高度相似，相似度高达99％，共得到4株转基因菜心。
GUS结果如图4所示，进行GUS染色并用酒精脱色以后，发现所检测的2株叶片染为蓝色，证明该2株再生植株成功转化。
本发明建立菜心遗传转化体系：用3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d，用侵染培养基重悬后OD600为0.5～0.6、然后28℃、200rpm震荡培养4h的农杆菌侵染液侵染10min，共培养2d，无菌水冲洗4遍进行恢复培养，待不定芽长至1.5cm左右进行筛选培养，选择压为55.6μL/L的PPT，继代2～3次，进行生根培养，不定根生长健壮时进行开瓶炼苗，后续正常管理。90个外植体共得到2株转基因菜心苗，转化率为2.22％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养；
(2)选取步骤(1)培养后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，转移至预培养培养基中，黑暗倒置预培养3d；
(3)采用农杆菌介导法侵染步骤(2)预培养后的外植体；
(4)将步骤(3)侵染后的外植体转移至共培养培养基中，黑暗正置共培养2d；
(5)将步骤(4)共培养后的外植体转移至恢复培养基中，黑暗倒置培养2d，然后恢复正常光照并倒置培养直至长出不定芽；
(6)将步骤(5)中获得的不定芽转至筛选培养基中，继代培养2～3次；
(7)将步骤(6)继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；
(8)将步骤(7)得到的组培苗开瓶炼苗，后正常管理；
步骤(1)～(7)中所述的培养基的组成如下所示：
播种培养基：1/2MS培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.9；
预/共培养培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/LAgNO3+100mM/L AS，pH 5.8；
侵染培养基：1/2MS培养基+20g/L蔗糖+100mM/L AS，pH5.7；
恢复培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/L AgNO3+100mM/L AS+200mg/L TM，pH5.8；
筛选培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/L AgNO3+100mM/L AS+200mg/L TM+55.5μL/LPPT，pH5.8；
生根培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+0.3mg/L NAA+2mg/LAgNO3+100mM/L AS+200mg/L TM，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的表面消毒的具体为：
选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，首先用无菌水冲洗2遍，然后用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍，最后用质量分数为7.5％的NaClO浸泡10min、无菌水冲洗3次并吸干水分。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的侵染的为10min。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的侵染的具体为：
将农杆菌扩摇后，4000rpm离心15min，弃上清液；用侵染培养基重悬农杆菌，将其光密度值OD600调至为0.5～0.6，然后28℃、200rpm震荡培养4h，得到农杆菌侵染液；将外植体转移至农杆菌侵染液中，28℃、150rpm震荡侵染10min。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的共培养的具体为：
用漏勺过滤步骤(3)中侵染后的外植体，然后置于干净的滤纸上，将多余菌液吸干净；另取一张干净的滤纸平铺于共培养培养基上，用1～2ml侵染培养基打湿滤纸，将吸干净菌液的外植体至于其上，保证子叶柄切口接触滤纸；然后黑暗正置培养。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的外植体用无菌水清洗3～4遍，吸干多余水分，迅速转移至恢复培养基中，前2d黑暗倒置培养，之后倒置正常光照培养。
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(6)中所述的不定芽的长度为1.0～2.0cm。
8.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(8)中所述的炼苗的方式为：选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培养基，转移至含有泥炭和蛭石的混合基质中，保鲜袋套袋5～10天，后续常规管理。
9.根据权利要求8所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
所述的泥炭和蛭石的质量比为1:1。
10.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：
步骤(1)、(5)、(6)、(7)中，组培室环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、使用110μmol/m2s的白色LED灯。
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