CN108456690B - 一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法 - Google Patents

一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，其中甘蓝型油菜遗传转化方法包括以下步骤：(1)无菌外植体的培养；(2)目的载体的制备；(3)农杆菌转化液的制备；(4)农杆菌与下胚轴共培养；(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织；(6)诱导愈伤组织再分化形成芽；(7)转基因阳性筛选；(8)生根培养；(9)小苗炼苗移栽。本发明通过对遗传转化方法的整体流程设置、关键步骤的参数条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比利用有效的筛选手段能够高效、快速获取甘蓝型油菜转基因苗，本发明将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选。

Description

一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，该方法通过植物组织培养技术能够快速繁殖并高效获取转基因油菜。
背景技术
甘蓝型油菜(Brassica napus，AACC，2n＝38)，是一种适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物之一。我国是世界油菜生产大国，占世界油菜播种面积的26％左右，油菜籽总产量占世界油菜籽总产量的28％左右。长江流域冬油菜区是我国油菜主产区，占全国油菜面积的85％左右。近几年油菜的产量与质量已达到国际领先水平。尽管如此，优化和改良油菜的品质，一直以来都作为农业生物技术的一个重要目标。
甘蓝型油菜属于十字花科芸薹属，是一种越年生或一年生草本植物。根据禹氏三角关系，由白菜(Brassica rapa,AA,n＝10)和甘蓝(Brassica oleracea,CC,n＝9)进化而来，与埃塞比俄亚芥(Brassica carinata,BBCC,n＝17)和芥菜型油菜(Brassica juncea,AABB,n＝18)具有同源关系，故是一种典型的异源四倍体品种。由于单个基因拷贝数较多，在甘蓝型油菜中利用传统的杂交育种方法不能够满足科学家们对甘蓝型油菜生理、生化机制的探索。所以，基因工程为培育优良品种提供了新的方法，遗传转化法能突破物种间的界限，为创造更适合人类生活需要的新品种开辟了广阔的前景。转基因技术在油菜育种上已经被广泛应用，一些具有很高实用价值的基因已被转入油菜中，并得到表达，使油菜品质改良进入了一个新的阶段。
快速、高效获得转基因再生株系是有效基因功能验证的前提。目前，子叶、下胚轴、小孢子等都可以作为甘蓝型油菜遗传转化再生体系的载体，其转化效率与再生效率主要受其基因型、品种的限制。另外，褐化以及玻璃化也在一定程度上影响其再生效率。CN201611152235专利提出了一种利用甘露醇，作为油菜小孢子培养的渗透调节剂的方法；CN201310172910专利解决了甘蓝型油菜再生过程中去除玻璃化的难题；CN201610714886专利为一种芥菜型油菜提供了快速培育再生苗的组织培养方法。这些方法均无法解决高效、快速获取转基因苗。而甘蓝型油菜的遗传转化再生体系对于基因功能分析、遗传育种等方面都具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，其中通过对遗传转化方法的整体流程设置、关键步骤的参数条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比利用有效的筛选手段能够高效、快速获取甘蓝型油菜转基因苗，本发明将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选；本发明中甘蓝型油菜的组织培养快速、高效进行遗传转化的方法，简化筛选并获得转基因阳性植株的周期，进而获得大量性状优良的植株，为深入研究油菜的遗传转化和性状改良提供良好的基础；并且，利用本发明所述方法，外植体的脱分化率在80％以上，愈伤组织的再分化率在80％以上，平均转基因效率在83.27％以上，获得的组培苗均可用于种植，移栽成活率高达100％。
为实现上述目的，按照本发明，提供了一种甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌外植体的培养：将甘蓝型油菜种子灭菌后，播种到种子萌发培养基，暗培养6～7天；
(2)目的载体的制备：将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株中，-80℃保存；
(3)农杆菌转化液的制备：在无菌条件下，将所述步骤(2)得到的农杆菌菌株接种到含有相应抗性的LB中，28℃、180～220rpm的条件下培养12～13h；待其OD600达到0.4～2.1，吸取菌液至无菌的离心管中，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；接着，加入浸染液悬浮，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；再次加入浸染液悬浮，使最终得到的菌液其OD600满足0.4～0.6，4℃保存以备用；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：向灭过菌的平皿中加入侵染液，然后向其中加入所述步骤(1)中萌发出的下胚轴，接着再向其中加入所述步骤(3)所得到的菌液使该菌液稀释至10倍体积，进行浸染，然后将所述外植体表面的水分去除后将该外植体转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：将所述步骤(4)得到的所述外植体转移到愈伤诱导培养基中，进行培养，诱导外植体脱分化形成愈伤组织；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：在无菌的条件下，将所述步骤(5)所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，进行培养，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织或芽形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，为转基因阳性；若无红光，则反之，为转基因阴性；
(8)生根培养：在无菌条件下，将所述步骤(6)获得的带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养；
(9)小苗炼苗移栽：将所述步骤(8)中获得的已生根的小苗进行炼苗，然后进行移栽。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述种子萌发培养基包括1/2MS培养基、蔗糖、以及琼脂粉；其中，1/2MS的浓度为2.2g/L，蔗糖的浓度为30.0g/L，琼脂粉的浓度为7.0g/L，该种子萌发培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(3)中，所述浸染液包括MS培养基、蔗糖、以及AS；其中，MS培养基的浓度为4.4g/L，蔗糖的浓度为30g/L，AS的浓度为200mM，该浸染液的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(4)中，所述共培养培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，AS 200mM，Manitol 18g/L，2,4-D 1mg/L，0.3mg/L KT，以及Agar 8g/L；该共培养培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(5)中，所述愈伤诱导培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，Manitol 18g/L，2,4-D 1mg/L，0.3mg/L KT，STS，特美汀300mg/L，潮霉素25mg/L，以及Agar 8g/L；其中，所述STS同时包括Na2S2O3和AgNO3，Na2S2O3的浓度为0.1M，AgNO3的浓度为0.1M；该愈伤诱导培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(6)中，所述芽诱导培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，葡萄糖10g/L，木糖0.25g/L，MES 0.6g/L，ZT 2.0mg/L，IAA 0.1mg/L，特美汀300mg/L，潮霉素25mg/L，硝酸银3mg/L，以及Agar 8g/L；该芽诱导培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(8)中，所述生根培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖10g/L，IBA0.5mg/L，特美汀300mg/L，琼脂粉8g/L；该生根培养基的pH值为5.84～5.88。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)中的所述浸染为计时浸染，该步骤(4)具体是在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成5mm的小段外植体，放入18mL浸染液的无菌平皿中，加入2mL的菌液，浸染10min，期间不定时的摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液，再将下胚轴转移到滤纸上，将其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述甘蓝型油菜种子灭菌，具体是先用无菌水清洗种子1～2次，再用75％(v/v)酒精灭菌处理1min后，然后迅速转入50％(v/v)84消毒液中灭菌处理3min后，期间不间断摇晃种子，接着再用无菌水冲洗3-5次。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)、(4)-(6)、(8)的培养温度均为20～25℃；所述步骤(4)-(6)、(8)中的培养所处的光照度为2000-2500lx，光照18小时/天。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，所述培养具体是培养至OD600达到0.4～0.6，然后吸取2mL菌液至无菌的离心管中，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；接着，加入2mL浸染液悬浮，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮从而最终得到OD600满足0.4～0.6的菌液，4℃保存以备用。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得以下
有益效果：
(1)本发明适用于春性和半冬性甘蓝型油菜品系不同基因的转入，提高了转基因体系适用的广泛性。本发明中菌浓度的控制十分关键，OD600过高会使下胚轴死亡，过低则会降低目的基因嵌入下胚轴的概率，故而合适的菌浓度对转基因效率具有决定性作用。合适的菌浓度不仅有利于目的基因嵌入植物基因组，而且只有达到合适的浓度的菌活性有利于侵染活性。本发明在农杆菌转化液的制备步骤中，通过控制直接培养得到的菌液的OD600值使其达到0.4～2.1(优选为0.4～1.8，更优选为0.4～0.6)，再通过离心、弃上清、加入浸染液悬浮后再次离心，如此重复操作后，使最终得到的菌液其OD600满足0.4～0.6，既确保了目的基因嵌入下胚轴的概率、保证侵染活性，又能避免OD600过高对下胚轴的不利影响；若直接培养后得到的菌液的OD600值大于0.6时(OD600值仍不能超过1.8)，则在后续处理时，可以适当减少直接培养后得到的菌液(即初始菌液)的添加量，从而确保最终的菌液其OD600满足0.4～0.6的要求。
(2)本发明利用利用油菜下胚轴作为外植体，提高了脱分化、再分化及其成活率的能力。其愈伤组织分化率平均达到94.92％，芽分化率平均达到85.26％以上，移栽成活率高达100％。同时，基因转化率也平均可达93.32％；
(3)本发明为转基因再生苗的筛选提供了便利的方法，通过DsRed基因地嵌入与表达，从早期脱分化形成的愈伤组织以及分化形成的芽组织进行检测且不妨碍组织的正常生长，以直观地观察基因的转入与否，能够更快的对转基因阳性苗进行筛选，简化了常规转基因验证的繁琐程序。本发明通过DsRed基因作为能够快速筛选的荧光标记，相较于传统的鉴定方法必须要等到愈伤组织形成幼苗了之后才能进行鉴定，本发明运用红色荧光这一方法可以在早期就达到筛选的目的，快速高效。
附图说明
图1是本发明甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法的流程示意图。
图2是本发明甘蓝型油菜介导的再生体系各个阶段的照片，其中A为下胚轴外植体的获取，B为愈伤组织的形成，C为再生芽组织的分化，D、E为芽分化生根。
图3是本发明甘蓝型油菜介导的快速筛选体系的照片，其中A、C为带有红荧光的愈伤组织及再生芽组织(图中的阴影即红色荧光)，B、D为未带有红荧光的愈伤组织及再生芽组织。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中甘蓝型油菜再生的高效鉴定及快繁方法，总体来说主要包括以下几个步骤：(1)无菌外植体的培养；(2)目的载体的制备；(3)农杆菌转化液的制备；(4)农杆菌与下胚轴共培养；(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织；(6)诱导愈伤组织再分化形成芽；(7)转基因阳性筛选；(8)生根培养；(9)小苗炼苗移栽。
以下为具体实施例：
实施例1：
甘蓝型油菜半冬性品系J2016的组织培养快速育苗方法：
(1)载体构建：将DsRed基因插入到含有目的基因LPAT2的载体pLH-1390-RNAi中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株GV3101中，-80℃保存。
(2)无菌外植体的培养：第一天，选择20颗左右的饱满甘蓝型油菜种子，装在2mL离心管中，在超净工作台上先加入1mL无菌水清洗种子1～2次，弃掉悬浮液；再加入1mL 75％酒精灭菌处理1min，弃掉悬浮液；然后迅速加入1mL 50％84消毒液中灭菌处理3min，期间不间断摇晃种子，弃掉悬浮液；无菌水冲洗3-5次，将种子转移至滤纸上待其表面水分风干后，播种到种子萌发培养基，暗培养7天。
所述的种子萌发培养基可以包括：1/2MS培养基+蔗糖30.0g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值为5.84～5.88；
(3)农杆菌转化液的制备：第六天，在无菌条件下，将目的基因的农杆菌菌株GV3101接种到含有Rif，Gen，Kan的LB中，28℃，180～220rpm，培养约12h。其OD600达到2.088左右，吸取0.5mL菌液至无菌的离心管中，6000rpm 3min离心后，弃上清；加入2mL浸染液悬浮，6000rpm 3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮，此时悬浮液中菌体OD600达到0.544左右。4℃保存以备用。
浸染液配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM，pH值为5.84～5.88；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：第七天，在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成大约5mm的小段，放入加入18mL浸染液的无菌平皿后，加入2mL制备好的菌液，浸染10min，期间不定时地摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液，再将下胚轴转移到滤纸上，将其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
共培养培养基配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM+Manitol 18g/L+2,4-D 1mg/L+0.3mg/L KT+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：第九天，将(4)中的外植体转入愈伤诱导培养基中诱导其形成愈伤组织，培养20天；
愈伤诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+Manitol 18g/L+2,4-D1mg/L+0.3mg/L KT+STS(Na2S2O3+AgNO3)+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：第二十九天，在无菌的条件下，将步骤(5)中所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次。大概经过一次继代后，96.30％的下胚轴会形成愈伤组织；经过两次继代以后，93％愈伤组织会分化形成芽；
芽诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES0.6g/L+ZT 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+硝酸银3mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，用记号笔在培养皿的反面做上标记并转移到新的培养皿中；若无红光，则反之。
(8)生根培养：待芽长出完整的生长点时，在无菌条件下，将步骤(6)中带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养，大概一周左右会长出新根；
生根培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖10g/L+IBA 0.5mg/L+特美汀300mg/L+琼脂粉8g/L，pH值为5.84～5.88；
以上所述方法，步骤(2)、(4)、(5)、(6)、(8)的培养温度为20～24℃，光照度2000-2500lx，光照18小时/天。
(9)小苗炼苗移栽：待生根的组培苗长到5-6叶片时，将步骤(8)中获得的已生根的小苗转移至冷库(0～4℃，光照)进行春化1个月，再转移至温室进行炼苗，然后按常规技术移栽到大田里。
共获得23株转基因株系，其中21株为转基因阳性，转基因效率为91.30％。
实施例2
甘蓝型油菜半冬性品系J2016的组织培养快速育苗方法：
(1)载体构建：将DsRed基因插入到含有目的基因LPAT5的载体pCRISPR-Cas9中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株GV3101中，-80℃保存。
(2)无菌外植体的培养：第一天，选择20颗左右的饱满甘蓝型油菜种子，装在2mL离心管中，在超净工作台上先加入1mL无菌水清洗种子1～2次，弃掉悬浮液；再加入1mL 75％酒精灭菌处理1min，弃掉悬浮液；然后迅速加入1mL 50％84消毒液中灭菌处理3min，期间不间断摇晃种子，弃掉悬浮液；无菌水冲洗3-5次，将种子转移至滤纸上待其表面水分风干后，播种到种子萌发培养基，暗培养7天。
所述的种子萌发培养基包括：1/2MS培养基+蔗糖30.0g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值为5.84～5.88；
(3)农杆菌转化液的制备：第六天，在无菌条件下，将目的基因的农杆菌菌株GV3101接种到含有Rif，Gen，Kan的LB中，28℃，180～220rpm，培养约12h。其OD600达到1.648左右，吸取520μL菌液至无菌的离心管中，6000rpm 3min离心后，弃上清；加入2mL浸染液悬浮，6000rpm 3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮，此时悬浮液中菌液OD600在0.42左右。4℃保存以备用。
浸染液配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM，pH值为5.84～5.88；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：第七天，在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成大约5mm的小段，放入加入18mL浸染液的无菌平皿后，加入2mL制备好的菌液，浸染10min，期间不定时地摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液，再将下胚轴转移到滤纸上，将其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
共培养培养基配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM+Manitol 18g/L+2,4-D 1mg/L+0.3mg/L KT+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：第九天，将(4)中的外植体转入愈伤诱导培养基中诱导其形成愈伤组织，培养20天；
愈伤诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+Manitol 18g/L+2,4-D1mg/L+0.3mg/L KT+STS(Na2S2O3+AgNO3)+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：第二十九天，在无菌的条件下，将步骤(5)中所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次。大概经过一次继代后，90.98％的下胚轴会形成愈伤组织；经过两次继代以后，83.47％愈伤组织会分化形成芽；
芽诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES0.6g/L+ZT 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+硝酸银3mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，用记号笔在培养皿的反面做上标记并转移到新的培养皿中；若无红光，则反之。
(8)生根培养：待芽长出完整的生长点时，在无菌条件下，将步骤(6)中带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养，大概一周左右会长出新根；
生根培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖10g/L+IBA 0.5mg/L+特美汀300mg/L+琼脂粉8g/L，pH值为5.84～5.88；
以上所述方法，步骤(2)、(4)、(5)、(6)、(8)的培养温度为20～24℃，光照度2000-2500lx，光照18小时/天。
(9)小苗炼苗移栽：待生根的组培苗长到5-6叶片时，将步骤(8)中获得的已生根的小苗转移至冷库(0～4℃，光照)进行春化1个月，再转移至温室进行炼苗，然后按常规技术移栽到大田里。
共获得93株转基因株系，其中87株为转基因阳性，转基因效率为96.67％。
实施例3：
甘蓝型油菜春性品系J9707(Yang et al,Plant Biotechnology Journal(2018),pp.1–14)的组织培养快速育苗方法：
(1)载体构建：将DsRed基因插入到含有目的基因SOD7的载体pcambia1303中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株GV3101中，-80℃保存。
(2)无菌外植体的培养：第一天，选择20颗左右的饱满甘蓝型油菜种子，装在2mL离心管中，在超净工作台上先加入1mL无菌水清洗种子1～2次，弃掉悬浮液；再加入1mL 75％酒精灭菌处理1min，弃掉悬浮液；然后迅速加入1mL 50％84消毒液中灭菌处理3min，期间不间断摇晃种子，弃掉悬浮液；无菌水冲洗3-5次，将种子转移至滤纸上待其表面水分风干后，播种到种子萌发培养基，暗培养7天。
所述的种子萌发培养基包括：1/2MS培养基+蔗糖30.0g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值为5.84～5.88；
(3)农杆菌转化液的制备：第六天，在无菌条件下，将SOD7的农杆菌菌株GV3101以25％的比例接种到含有Rif，Gen，Kan的LB中，28℃，180～220rpm，过夜培养大约12h。其OD600为0.668左右，吸取1.5mL菌液至无菌的离心管中，6000rpm 3min离心后，弃上清；加入2mL浸染液悬浮，6000rpm 3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮，此时悬浮液中菌液的OD600为0.501。4℃保存以备用。
浸染液配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM，pH值为5.84～5.88；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：第七天，在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成大约5mm的小段，放入加入18mL浸染液的无菌平皿后，加入2mL制备好的菌液，浸染10min，期间不定时地摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液直至计时结束，再将下胚轴转移到滤纸上，待其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
共培养培养基配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM+Manitol 18g/L+2,4-D 1mg/L+0.3mg/L KT+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：第九天，将(4)中的外植体转入愈伤诱导培养基中诱导其形成愈伤组织，培养20天；
愈伤诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+Manitol 18g/L+2,4-D1mg/L+0.3mg/L KT+STS(Na2S2O3+AgNO3)+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：第二十九天，在无菌的条件下，将步骤(5)中所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次。大概经过一次继代后，96.6％的下胚轴会脱分化形成愈伤组织；经过两次继代以后，82.1％愈伤组织会分化形成芽；
芽诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES0.6g/L+ZT 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+硝酸银3mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，用记号笔在培养皿的反面做上标记并转移到新的培养皿中；若无红光，则反之。
(8)生根培养：待芽长出完整的生长点时，在无菌条件下，将步骤(6)中带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养，大概一周左右会长出新根；
生根培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖10g/L+IBA 0.5mg/L+特美汀300mg/L+琼脂粉8g/L，pH值为5.84～5.88；
以上所述方法，步骤(2)-(6)的培养温度为20～24℃，光照度2000-2500lx，光照18小时/天。
(9)小苗炼苗移栽：待生根的组培苗长到5-6叶片时，将步骤(8)中获得的已生根的小苗转移至温室进行炼苗，然后按常规技术移栽到大田里。
实施例4：
甘蓝型油菜春性品系J9707(Yang et al,Plant Biotechnology Journal(2018),pp.1–14)的组织培养快速育苗方法：
(1)载体构建：将DsRed基因插入到含有目的基因GS3的载体pcambia1303中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株GV3101中，-80℃保存。
(2)无菌外植体的培养：第一天，选择20颗左右的饱满甘蓝型油菜种子，装在2mL离心管中，在超净工作台上先加入1mL无菌水清洗种子1～2次，弃掉悬浮液；再加入1mL 75％酒精灭菌处理1min，弃掉悬浮液；然后迅速加入1mL 50％84消毒液中灭菌处理3min，期间不间断摇晃种子，弃掉悬浮液；无菌水冲洗3-5次，将种子转移至滤纸上待其表面水分风干后，播种到种子萌发培养基，暗培养7天。
所述的种子萌发培养基包括：1/2MS培养基+蔗糖30.0g/L+琼脂粉7.0g/L，pH值为5.84～5.88；
(3)农杆菌转化液的制备：第六天，在无菌条件下，将GW8的农杆菌菌株GV3101以25％的比例接种到含有Rif，Gen，Kan的LB中，28℃，180～220rpm，过夜培养大约12h。其OD600为0.515左右，吸取2mL菌液至无菌的离心管中，6000rpm 3min离心后，弃上清；加入浸染液悬浮，6000rpm 3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮，4℃保存以备用。
浸染液配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM，pH值为5.84～5.88；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：第七天，在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成大约5mm的小段，放入加入18mL浸染液的无菌平皿后，加入2mL制备好的菌液，浸染10min，期间不定时地摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液直至计时结束，再将下胚轴转移到滤纸上，待其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
共培养培养基配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+AS 200mM+Manitol 18g/L+2,4-D 1mg/L+0.3mg/L KT+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：第九天，将(4)中的外植体转入愈伤诱导培养基中诱导其形成愈伤组织，培养20天；
愈伤诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖30g/L+Manitol 18g/L+2,4-D1mg/L+0.3mg/L KT+STS(Na2S2O3+AgNO3)+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：第二十九天，在无菌的条件下，将步骤(5)中所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次。大概经过一次继代后，95％的下胚轴会脱分化形成愈伤组织；经过两次继代以后，93％愈伤组织会分化形成芽；
芽诱导培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES0.6g/L+ZT 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素25mg/L+硝酸银3mg/L+Agar 8g/L，pH值为5.84～5.88；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，用记号笔在培养皿的反面做上标记并转移到新的培养皿中；若无红光，则反之。
(8)生根培养：待芽长出完整的生长点时，在无菌条件下，将步骤(6)中带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养，大概一周左右会长出新根；
生根培养基的配方包括：MS培养基4.4g/L+蔗糖10g/L+IBA 0.5mg/L+特美汀300mg/L+琼脂粉8g/L，pH值为5.84～5.88；
以上所述方法，步骤(2)-(6)的培养温度为20～24℃，光照度2000-2500lx，光照18小时/天。
(9)小苗炼苗移栽：待生根的组培苗长到5-6叶片时，将步骤(8)中获得的已生根的小苗转移至温室进行炼苗，然后按常规技术移栽到大田里。
下表表1为实施例1-4的统计表。
表1
Figure BDA0001624106760000151
本发明中的目的基因为待研究的对象基因(如研究人员所要研究的任何感兴趣的基因)，可根据实际需求灵活调整。在农杆菌转化液的制备步骤中，将农杆菌菌株接种到的含有相应抗性的LB，该LB所含的抗性可根据农杆菌的类型和载体的类型来确定。
本发明所使用的各个试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。上述实施例中的农杆菌菌株GV3101，甘蓝型油菜半冬性品系J2016和甘蓝型油菜春性品系J9707均由华中农业大学张椿雨教授友情赠送。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌外植体的培养：将甘蓝型油菜种子灭菌后，播种到种子萌发培养基，暗培养6～7天；
(2)目的载体的制备：将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株中，-80℃保存；
(3)农杆菌转化液的制备：在无菌条件下，将所述步骤(2)得到的农杆菌菌株接种到含有相应抗性的LB中，28℃、180～220rpm的条件下培养12～13h；待其OD600达到0.4～2.1，吸取菌液至无菌的离心管中，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；接着，加入浸染液悬浮，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；再次加入浸染液悬浮，使最终得到的菌液其OD600满足0.4～0.6，4℃保存以备用；
(4)农杆菌与下胚轴共培养：向灭过菌的平皿中加入侵染液，然后向其中加入所述步骤(1)中萌发出的下胚轴，接着再向其中加入所述步骤(3)所得到的菌液使该菌液稀释至10倍体积，进行浸染，然后将所述外植体表面的水分去除后将该外植体转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时；
(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：将所述步骤(4)得到的所述外植体转移到愈伤诱导培养基中，培养20天，诱导外植体脱分化形成愈伤组织；
(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：在无菌的条件下，将所述步骤(5)所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，进行培养，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次；
(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织或芽形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，为转基因阳性；若无红光，则反之，为转基因阴性；
(8)生根培养：在无菌条件下，将所述步骤(7)获得的带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养；
(9)小苗炼苗移栽：将所述步骤(8)中获得的已生根的小苗进行炼苗，然后进行移栽；
该方法将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体并转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选，进而在甘蓝型油菜的组织培养过程中实现快速、高效的遗传转化，简化筛选并缩短获得转基因阳性植株的周期。
2.如权利要求1所述甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述种子萌发培养基包括1/2MS培养基、蔗糖、以及琼脂粉；其中，1/2MS的浓度为2.2g/L，蔗糖的浓度为30.0g/L，琼脂粉的浓度为7.0g/L，该种子萌发培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(3)中，所述浸染液包括MS培养基、蔗糖、以及AS；其中，MS培养基的浓度为4.4g/L，蔗糖的浓度为30g/L，AS的浓度为200mM，该浸染液的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(4)中，所述共培养培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，AS 200mM，Manitol 18g/L，2,4-D 1mg/L，0.3mg/L KT，以及Agar 8g/L；该共培养培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(5)中，所述愈伤诱导培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，Manitol 18g/L，2,4-D 1mg/L，0.3mg/L KT，STS，特美汀300mg/L，潮霉素25mg/L，以及Agar 8g/L；其中，所述STS同时包括Na2S2O3和AgNO3，Na2S2O3的浓度为0.1M，AgNO3的浓度为0.1M；该愈伤诱导培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(6)中，所述芽诱导培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，葡萄糖10g/L，木糖0.25g/L，MES 0.6g/L，ZT 2.0mg/L，IAA 0.1mg/L，特美汀300mg/L，潮霉素25mg/L，硝酸银3mg/L，以及Agar 8g/L；该芽诱导培养基的pH值为5.84～5.88；
所述步骤(8)中，所述生根培养基包括的主要成分及它们的浓度如下：MS培养基4.4g/L，蔗糖10g/L，IBA 0.5mg/L，特美汀300mg/L，琼脂粉8g/L；该生根培养基的pH值为5.84～5.88。
3.如权利要求1所述甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(4)中的所述浸染为计时浸染，该步骤(4)具体是在无菌的条件下，将萌发出的下胚轴在无菌的条件下切成5mm的小段外植体，放入18mL浸染液的无菌平皿中，加入2mL的菌液，浸染10min，期间不定时的摇晃平皿，待剩余2min时慢慢吸走浸染液，再将下胚轴转移到滤纸上，将其表面的水分风干后转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时。
4.如权利要求1所述甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述甘蓝型油菜种子灭菌，具体是先用无菌水清洗种子1～2次，再用75％(v/v)酒精灭菌处理1min后，然后迅速转入50％(v/v)84消毒液中灭菌处理3min后，期间不间断摇晃种子，接着再用无菌水冲洗3-5次。
5.如权利要求1－4任意一项所述甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)、(4)-(6)、(8)的培养温度均为20～25℃；所述步骤(4)-(6)、(8)中的培养所处的光照度为2000-2500lx，光照18小时/天。
6.如权利要求1－4任意一项所述甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述培养具体是培养至OD600达到0.4～0.6，然后吸取2mL菌液至无菌的离心管中，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；接着，加入2mL浸染液悬浮，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；再加入2mL浸染液悬浮从而最终得到OD600满足0.4～0.6的菌液，4℃保存以备用。
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