CN104039967A - 筛选植物的在植物中诱导孤雌生殖的遗传元件的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于产生缺少由有性方式获得的胚的植物群体的组合物和方法。组合物包括编码多核苷酸的抑制盒和导致孤雌生殖的启动子。本发明还提供了用于抑制自繁殖植物中的有性繁殖的孤雌生殖遗传元件。方法包括利用母本胚缺陷隐性突变，所述突变随后作为不育自交保持系统得以保持，从而允许产生对于所述隐性突变等位基因而言是纯合的、但在转基因上是互补的群体。方法还包括利用通过卵细胞特异性启动子表达的毒素基因，从而产生不能通过所述雌配子传递的显性无胚表型。然后将用驱动用于鉴定转基因种子的所述解毒剂、花粉消融PTU以及种子颜色标记的卵细胞启动子转化所得的半合子植物。本发明涉及产生50％雌性可育的植物，所述植物的种子在下一代生长时将产生具有50％可存活且为转基因的种子，和50％不能存活且为无胚种子的植物。

Description

筛选植物的在植物中诱导孤雌生殖的遗传元件的方法

技术领域

本公开涉及植物分子生物学领域，更具体地讲涉及植物雌性繁殖生物学、改变植物雌性繁殖生物学以及筛选改变的生殖机制性能的方法。

背景技术

单性生殖是指无性繁殖，其在不受精的情况下导致种子的产生、得到在遗传上与母株相同的后代(Koltunow，et al.，(1995)Plant Physiol.108：1345-1352(Koltunow等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第1345-1352页)；Ravi，et al.，(2008)Nature451：1121-4(Ravi等人，2008年，《自然》，第451卷，第1121-1124页))。它是一个绕开雌性减数分裂和有性生殖来产生与母本相同的胚的繁殖过程。单性生殖增大了开发优良基因组合的可能性，并有利于所需性状的快速掺入。单性生殖不仅提供繁殖保证，而且避免了后代的杂合性丢失，因为卵细胞保持了亲代的基因型。因此，单性生殖避免了由于近亲交配造成的活力丧失效应，并由于杂种优势的影响可能另外赋予一些优点。

在物种水平上，单性生殖的发生率不足物种的1％。单性生殖出现在多个野生物种和少数农艺上重要的物种(例如柑桔属和芒果)中，但未出现在任何主要的谷类作物中(Eckhardt，(2003)The Plant Cell15：1449-01(Eckhardt，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1449-01页))。单性生殖的一种形式是不定胚生殖，其中胚由胚珠内位于胚囊外部的体细胞组织直接形成。不定胚生殖通常与正常的有性繁殖平行出现。单性生殖的第二种形式是二倍体孢子生殖，其取代了有性繁殖。在二倍体孢子生殖中，形成了未减数分裂的卵细胞，其随后经历称为孤雌生殖(不经过受精的胚发生过程)的过程而形成胚。单性生殖的第三种形式是无孢子生殖，其与不定胚生殖类似地在有性胚囊外部的组织中发生。无孢子生殖涉及形成无性的未减数分裂的胚囊，其与二倍体孢子生殖类似地经历孤雌生殖而形成单性生殖胚。单性生殖的所有三种形式都依赖于不经过受精而生成胚(孤雌生殖)。因为其提供了对所需基因型的固定和无限增殖的保证，所以工程化该能力以将无性系种子培育成作物(尤其是谷物)引起了极大关注(Spillane，et al.，(2001)Nat.Biotechnol.22：687-91(Spillane等人，2001年，《自然生物技术》，第22卷，第687-691页))。

在商业化植物品系中将单性生殖工程化的分子方法是非常可取的。对基因转录的调控在种子特异性发育程序的表达中具有至关重要的作用。因此，早期胚珠发育期间在有性繁殖途径和单性生殖过程之间的趋异点处分子开关的调控，是在其处可对类单性生殖性状加以控制的点。

本公开描述了一种维持缺乏由有性方式获得的胚的植物/种子大群体的方式。这可以用于生成针对诱导孤雌生殖的遗传元件的筛选群体。此外，一旦鉴定出孤雌生殖遗传元件，便可使用该相同方法来预防自繁殖植物中的有性繁殖。

发明内容

存在两种不同但类似的方法。第一种方法利用母本胚缺陷(胚致死)隐性突变，该突变随后在与不育自交保持系统(Sterile Inbred MaintenanceSystem，SIMS)，也称为制种技术(Seed Production Technology)中所用方法类似的方法中得以保持(参见，美国专利No.7,696,405、No.7,915,398和No.7,790,951)。该系统包括引入转基因盒，该转基因盒具有三个部分：1)与胚致死突变互补的野生型等位基因；2)花粉消融植物转录单元(PTU)，其用于防止通过花粉的转基因传递，以及3)种子颜色标记PTU，其用于允许将转基因群体从所产生的种子移除。这将允许生成对于隐性突变等位基因而言是纯合的、但在转基因上是互补的群体。这些植物将根据这些变化在下一代中分离成1∶1的存活的转基因种子和不能存活的非转基因无胚纯合突变种子。

第二种方法能够以类似的方式使用毒素基因和解毒剂基因实现。在该系统中，毒素基因将通过产生显性的无胚表型的卵细胞特异性启动子(构建体A)表达，所述无胚表型不能通过雌配子传递。构建体A将转化进预先转化了转基因盒的植物中，所述转基因盒具有三个部分(构建体B)：1)表达驱动同源解毒剂的启动子的卵细胞；2)花粉消融PTU，其用于防止通过花粉的转基因传递，以及3)种子颜色标记，其用于允许将保持系群体从所产生的种子移除。这将有利于生成对于构建体A而言是纯合的群体，但由于半合子状态的构建体B，所以50％的雌性可育。这些植物在下一代中应当分离成1∶1的存活的转基因(AA/B-)种子和不能存活的无胚AA/--种子。

这些系统被设计成用于筛选诱导种子中的孤雌生殖的遗传元件。此外，所述系统可用于促进添加了孤雌生殖PTU并移除了互补或解毒剂构建体的自繁殖杂交体(不丧失杂交体活力的植物)的生成。组分的不完全列表可能包括：隐性胚致死突变/卵细胞消融品系、野生型互补转基因/卵细胞解毒剂品系、花粉消融转基因、种子颜色标记和(自繁殖植物的)孤雌生殖PTU。

前述筛选体细胞胚发生的方案包括使用雄性不育品系鉴定不依赖受精的种子形成(未成功地鉴定孤雌生殖基因)以及筛选用于胚发生的带激活标签的体细胞组织(根)(Zuo，et al.，(2002)Plant J30：349-359(Zuo等人，2002年，《植物杂志》，第30卷，第349-359页)；Wang，et al.，(2009)Cell Res19：224-235(Wang等人，2009年，《细胞研究》，第19卷，第224-235页))。然而，参考方法不能鉴定产生种子中的体细胞胚发生的基因。尚不存在用于保持自繁殖植物作物的类似成功方法。这些方法描述了产生大量无胚种子的系统，所述系统可在种子的背景下筛选孤雌生殖。这些方法的一个优点是将不阻止胚乳受精(不同于雄性不育筛选)。本公开提供了较优的方法，因为有营养的胚乳对于正常的种子/胚发育是必需的。

附图说明

图1是受精的拟南芥(Arabidopsis)胚囊的荧光图像，其中仅有卵/接合子(红色)和助细胞(绿色)的残迹。绿色和红色的解体残迹可能显示黄色。中央细胞显示为健全的，其具有3-4个胚乳核，指示受精未发生。

图2至8描述了来自相同转化构建体的若干事件。

图2是具有处于解体过程中的接合子(红色)的受精的拟南芥胚囊的荧光图像，该接合子正在丧失完整性并看起来正在“起泡”。宿存助细胞(绿色)看起来正在凝聚和解体。中央细胞显示为健全的，其具有若干胚乳核，指示受精未发生。

图3是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，显示出位于正常发育的中央细胞中的7-8个胚乳核。没有存在接合子或胚(红色)的迹象，也没有存在任何助细胞(绿色)的迹象。可将胚乳描述为在不存在胚的情况下发育。

图4是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有接合子(红色)和宿存助细胞(绿色)的残迹，其中接合子和宿存助细胞均显示出正在凝聚和解体。中央细胞显示为不健全的并处于解体的早期阶段(如通过中央细胞的空泡形成增多所指示)。

图5是在受精将要开始前2个未受精的拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有2个胚乳核和2个助细胞(黄色)，但缺少卵(红色)。右边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有单个初生胚乳核，但缺少助细胞(黄色)和卵(红色)。

图6是受精的拟南芥胚囊的荧光图像和微分干涉相差(DIC)荧光重叠图像。中央细胞(青色)具有单个胚乳核和1个助细胞(黄色)，但缺少卵(箭头)。

图7是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有位于正常发育的中央细胞中的4个胚乳核。仅存在非常弱的红色荧光信号(箭头)，其指示胚或接合子的残迹的存在。宿存助细胞(绿色)正在解体。胚乳正在不存在胚的情况下发育。

图8是具有良好发育的胚乳的2个拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊在其中央细胞(青色)中具有多个胚乳核，并且在其珠孔端处(箭头)是胚或接合子(红色)的残迹。在正常条件下，该胚在心形阶段应当发育地完全得多。右边的较小胚囊具有多个胚乳核(青色)，但缺少胚(箭头)。到该最后阶段为止，助细胞自然地降解。

图9至11示出了来自种子的保持无胚群体的种子。

图9是对无胚条件进行分离的拟南芥种子的宽场显微图。在该取样中，较亮的种子是饱满的，并且包含胚。较暗的种子是皱缩的，并且缺少胚。无胚种子已明显发育，与在不存在胚的情况下的明显胚乳发育一致。

图10是与图A相同的样品视场的宽场荧光显微图。从饱满的含胚种子观察到亮红色荧光。从皱缩的无胚种子观察到极少的荧光或未观察到荧光。

图11示出了被设计用于筛选孤雌生殖的库构建体的一个预想实施例的组分。在TDNA骨架内，启动子例如AT DD1PRO(反足细胞启动子)将驱动来自边界在3’端处(此处为终止子)的单性生殖遗传来源的cDNA或gDNA片段。独特于保持系构建体的种子颜色标记的种子颜色标记也在TDNA边界内。

图12和13示出了筛选孤雌生殖cDNA群体，以及在筛选群体中对孤雌生殖胚进行预测性鉴定的方法。

图12示出了由反足细胞发育的发绿色荧光的孤雌生殖胚。生成了预测性无红色荧光的发绿色荧光的种子，随后在高通量筛选系统例如得自UnionBiometrica公司的复杂对象参数分析仪和分选机(Complex Object ParameterAnalyzer and Sorter，COPAS)中进行鉴定。

图13示出了在COPAS上分析的约15,000个无胚/保持系群体种子。数据在对数标度上朝向红色荧光偏移。绿色多边形和单个数据点预测性地展示了在限定的挑选标准内对发绿色荧光的包含孤雌生殖胚的种子的鉴定。

图14图示了用于PHP47029/PHP50940(无胚品系)植物的超转化的载体PHP57122。在农杆菌(Agrobacterium)转化之前，用来自异源来源的cDNA取代ATTR1//CAM/CCDB/ATTR2。所得的TDNA在反足细胞中驱动来自AT-DD1PRO的cDNA表达，并在胚中驱动来自KTI3PRO的AC-GFP1表达。

图15示出了在使用旨在筛选反足细胞孤雌生殖的cDNA表达库进行转化之后，在Union Biometrica的复杂对象参数分析仪和分选机(COPAS)上分选的PHP47029/PHP50940(无胚品系)成熟种子。X轴＝绿色荧光；Y轴＝红色荧光；蓝色＝单个数据点，红色＝两个数据点，绿色＝多于两个数据点。可以看到数据点尾部朝向右方偏移，其中数据点尾部代表由于使用cDNA表达库进行了转化而具有红色和绿色荧光的种子。多边形是选择用于分选命中点的区域；在COPAS上进行筛选期间，在该屏幕截图中选择了六个推定的命中点。

图16示出了在使用旨在筛选反足细胞孤雌生殖的cDNA表达库进行转化之后，在Union Biometrica的复杂对象参数分析仪和分选机(COPAS)上分选的PHP47029/PHP50940(无胚品系)成熟种子的六个推定命中点的PCR结果。使用在反足细胞孤雌生殖筛选载体PHP57122中cDNA插入位点旁侧的引物对粗略的种子分离物执行巢式PCR。将PCR产物置于1％琼脂糖凝胶上于TAE中运行，并用溴化乙锭染色。从7个推定命中点中的3个点观察到了常见的1.7-1.9kb条带。

发明详述

下文将参照附图更完整地描述本发明，其中附图示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

I. 概述

提供了防止在植物胚珠中形成有性胚并使用该状态以鉴定和促进无性胚形成(孤雌生殖)的方法和组合物。

可使用各种方法来测定向胚细胞样状态的这种转化。例如，卵细胞优选启动子可以可操作地连接到标记。此类报道基因构建体在大多数胚珠植物细胞中将是无活性的，但报道基因构建体在胚细胞样状态形成时将变得有活性。胚细胞优选启动子可用于检测胚细胞样转录状态，所述胚细胞优选启动子包括例如dif1(决定性不育基因1)45下调的拟南芥(Arabidopsisthaliana)启动子(AT-DD45PRO；SEQ ID NO：10)和EASE启动子(卵器优选增强子启动子；SEQ ID NO：19)、KTI3启动子(Perez-Grau andGoldberg，(1989)Plant Cell1：1095-1109(Perez-Grau和Goldberg，1989年，《植物细胞》，第1卷，第1095-1109页))。另参见Yang，et al.，(2005)Plant Physiology139：1421-1432(Yang等人，2005年，《植物生理学》，第139卷，第1421-1432页)。另参见与本文同时提交且其全文以引用方式并入本文的名称为“Ovule Specific Promoters and Methods of Their Use”(胚珠特异性启动子及其应用方法)的美国临时专利申请序列号________。当利用此类可操作地连接到适当标记的胚细胞优选启动子时，可通过测定标记在胚珠细胞中的表达来测定胚样转录状态。以该方式，可测定在植物胚珠的组织(包括适合于孤雌生殖的任何组织和子结构)中的胚细胞样状态。

可监测另外的雌配子体特异性标记基因，以测定卵/胚细胞样状态，所述基因包括任何雌配子体优选表达基因，例如AT1G18770(MYB98)、AT1G26795(与自交不亲和性蛋白相关)、AT2G20070、at4g25530(同源盒蛋白，fwa)和at5g40260(结瘤素mtN3家族蛋白)。参见例如Koszegi，et al.，(2011)Plant Journal67：280-291(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，第67卷，第280-291页)，该文献以引用方式并入本文。

在另一个实施例中，卵细胞样状态可通过类似于接合子细胞形态的细胞形态发育指示，值得注意的是致密细胞质的极性分布占据了细胞容积的一大部分，且细胞核位于细胞的与大液泡相对的致密细胞质顶端处，而大液泡占据细胞内的中间至基部位置。一个实施例将包括与尺寸为大约26μm高×15μm宽的天然接合子细胞类似的拟南芥细胞。此类形态学实施例是分子决定因素的补充，并且不是独立于其他决定因素的胚细胞样状态的诊断因素。

在另外的其他实施例中，可表征胚细胞样状态并测定其在胚囊外部的组织和子结构中的胚样结构的发育，包括在适合于孤雌生殖的任何组织和子结构中此类结构的形成。胚样状态可通过显示出胚的形态学发育状态的细胞的邻接分群来表征。胚样状态的形态学特征可包括通常有液泡的细胞变为细胞质稠密的细胞，或等径细胞变为伸长的以及卵形或接合子形的。暗示胚/接合子样状态的其他细胞学特征可包括细胞极性的变化，“顶点”变宽，而“基部”变细且逐渐变小。其他特征可包括大部分的细胞质占据顶端位置，而大液泡占据细胞内的中间至基部位置。该接合子样细胞的细胞核将占据细胞内的顶端位置。在拟南芥的例子中，形态学状态将是卵、接合子、原胚、球形或心形胚、鱼雷胚、手杖胚和卷曲子叶。胚柄或子叶(一个或多个)的发育将是另一个形态学实施例。此类结构也可以表达分子标记，诸如AT-DD45直到早期球形阶段的表达。晚期球形阶段直到成熟，胚样结构可表达KTI3报道基因或其他胚特异性标记表达。

在具体的实施例中，“卵/接合子/胚细胞样状态”可发展为产生孤雌生殖或引发胚生殖。此类方法和组合物在本文的其他地方进一步详细讨论。在不定胚生殖(孢子体单性生殖)中，胚由胚珠内位于胚囊外部的体细胞组织直接形成。换句话讲，胚不由配子体，而是例如由珠心和/或珠被组织形成。在不完全胚生殖中，胚发育是不完全的。在一些实施例中，这可能表明缺少胚柄。在其他实施例中，这可能表明停留在成熟前的胚发育阶段。在另外的其他实施例中，这可能表明缺少球状头部、子叶或其他胚器官。

表1

II. 编码细胞毒性多肽的序列

提供了防止在植物胚珠中形成有性胚并使用该状态以鉴定和促进无性胚形成(孤雌生殖)的方法和组合物。胚细胞样状态通过增加在缺少保持系转基因盒的胚珠植物细胞中至少一种多肽或调控RNA的表达而在胚珠植物细胞中生成。多肽或调控RNA将通过孤雌生殖筛选的方式进行鉴定。

如本文所用，孤雌生殖筛选是指一类遗传消融卵细胞的蛋白质的受控表达以及用于保持无胚群体的整合系统。DAM甲基化酶蛋白与DNA甲基转移酶的功能类似。各种DNA甲基转移酶多肽的结构是已知的，并且DNA甲基转移酶基因已在多种原核生物、低等真核生物和高等植物(包括大肠杆菌(Escherichia coli)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、拟南芥、玉米和水稻(Oryza sativa))中鉴定出来。可使用各种方法保持具有细胞毒素的无胚群体，包括反义RNA、RNAi、人工微RNA、同源抑制剂、适配子和同源抗体表达。BARNASE蛋白与核糖核酸酶的功能类似。各种核糖核酸酶多肽的结构是已知的，并且核糖核酸酶基因已在多种原核生物和真核生物(包括细菌和植物)中鉴定出来。提供了利用具有核糖核酸酶活性的多核苷酸和多肽的多种方法和组合物。此类核糖核酸酶多核苷酸包括SEQ IDNO：23、24、25和28中任何一者示出的那些、它们编码的多肽及其生物活性变体和片段。还提供了其活性变体和片段。

如本文所用，“孤雌生殖活性”包括调节胚发生的多肽。如本文所用，具有“孤雌生殖活性”的多肽包含保持充分的孤雌生殖活性的调节多肽或其活性变体或片段，所述充分的孤雌生殖活性使得(i)所述多肽具有调节活性；(ii)当所述多肽以足够水平在胚珠植物细胞中表达时，所述多肽将转录状态改变为胚细胞样状态，和/或(iii)当所述多肽在宿主植物细胞中表达时，所述多肽增加了可操作地连接到胚细胞启动子的基因的表达，所述胚细胞启动子包括例如胚细胞优选启动子，包括At1g60530、At3g63320、At1g66610或AT1g53930，或本文其他地方公开的其他胚细胞优选启动子。测定此类活性的方法是已知的。参见例如Koszegi.et al.，(2011)PlantJournal Accelerated article，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，在线提前出版文章，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x)，该文献以引用方式并入本文。以卵细胞样转录状态表达的雌配子体特异性标记基因的非限制性例子包括(但不限于)雌配子体特异性表达基因AT1G18770(MYB98)、AT1G26795(与自交不亲和性蛋白相关)、AT2G20070(未知)、at4g25530(同源盒蛋白，fwa)和at5g40260(结瘤素mtN3家族蛋白)。参见Koszegi，et al.，(2011)PlantJournal Accelerated article，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，在线提前出版文章，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x)。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性部分，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或多肽的天然存在环境中存在的、与该多核苷酸或多肽相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最优的是，“分离的”多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在各个实施方案中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在得到该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质的多肽的制备物。当本公开的多肽或其生物活性部分用重组法生产时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白的化学品。

如本文所用，当多核苷酸或多肽为人工的或工程化改造的，或衍生自人工的或工程化改造的蛋白质或核酸时，该多核苷酸或多肽是“重组的”。例如，插入载体或任何其他异源位置(如，重组生物体的基因组)中，使得其不按照天然存在的那样与通常在多核苷酸旁侧的核苷酸序列相关联的多核苷酸是重组多核苷酸。由重组多核苷酸在体外或体内表达得到的多肽是重组多肽的例子。同样，未出现在自然界中的多核苷酸序列(例如，天然存在的基因的变体)是重组的。

“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点，并且可以是任何合适的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型或天然的植物或细胞，即具有与用于进行导致受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)遗传上与受试植物或植物细胞相同但未暴露于与受试植物或植物细胞相同的处理(如，除草剂处理)的植物或植物细胞；或者(e)处于其中目的基因不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。

A. 细胞毒素序列的活性片段和变体

如上文所讨论，提供了利用具有细胞毒素活性的多核苷酸和多肽的方法和组合物。还涵盖了细胞毒素多核苷酸和多肽的片段和变体。所谓“片段”，是指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列以及因此的蛋白的一部分。多核苷酸的片段可编码保持细胞毒素活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码细胞毒素多肽的全长多核苷酸的范围内。

编码细胞毒素蛋白质的生物活性部分的细胞毒素多核苷酸的片段将编码至少50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、410、415、420、425、430、435或440个连续氨基酸或直至存在于全长细胞毒素多肽中的氨基酸总数。

因此，细胞毒素多核苷酸的片段可以编码细胞毒素多肽的生物活性部分。细胞毒素多肽的生物活性部分可通过分离细胞毒素多核苷酸中的一者的一部分、表达细胞毒素多肽的编码部分(如，通过在体外重组表达)以及评估细胞毒素蛋白质的细胞毒素部分的活性来制备。作为细胞毒素核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续核苷酸或直至本文所公开的全长细胞毒素多核苷酸中存在的核苷酸数目。

“变体”蛋白旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失(即，在5′和/或3′末端截短)和/或缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该蛋白质衍生的蛋白质。所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即具有细胞毒素活性。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。

“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括具有5′和/或3′末端处的缺失(即，截短)和/或天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换的多核苷酸。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码细胞毒素多肽中的一者的氨基酸序列。诸如这些的天然存在的变体可用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变或基因合成产生但仍编码细胞毒素多肽的多核苷酸。

细胞毒素多肽(以及编码其的多核苷酸)的生物活性变体将与任何细胞毒素多肽(包括由SEQ ID NO：23、24、25和28中的任何一者编码的多肽)具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性，这通过用本文别处描述的序列比对程序和参数测定。

细胞毒素多核苷酸的生物活性变体将与编码细胞毒素多肽的任何多核苷酸(包括SEQ ID NO：23、24、25和28中的任何一者的多核苷酸)具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，这通过用本文别处描述的序列比对程序和参数测定。

细胞毒素多肽及其活性变体和片段可以各种方式改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，细胞毒素蛋白的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米兰出版公司，纽约)以及其中所引用的参考文献。有关不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可见于Dayhoff，et al.，(1978)Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.Washington，D.C.)(Dayhoff等人，1978年，《蛋白质序列和结构图谱集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿)的模型中，这些专利和文献均以引用方式并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。

显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且优选将不会生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开No.75,444。

变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组工程程序(如DNA改组)得到的序列和蛋白质。用这种程序，可操纵一个或多个不同的RDK编码序列以产生具有所需性质的新的细胞毒素多肽。以此方式，从一组相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区。例如，使用该方法，可将编码目的结构域的序列基序在本文公开的细胞毒素序列和其他已知细胞毒素基因之间进行改组，以获得编码具有改进的目标性质(诸如在酶的情况中为降低的K_m)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer，(1994)Nature370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri，et al.，(1997)NatureBiotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri，etal.，(1998)Nature391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)和美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。

III. 胚囊细胞、胚、种子和花粉特异性组织优选启动子

在种子植物中，胚珠是产生并且包含雌性生殖细胞的结构。在发育早期，其由三个部分组成：形成其外层的珠被、珠心(或大孢子囊)以及珠柄。珠心产生大孢子母细胞，其将在大孢子发生期间经历减数分裂形成大孢子。在蓼(Polygonum)型胚囊发育中，三个大孢子降解，一个变成功能大孢子。在大配子发生期间，功能大孢子(在蓼型胚囊中)经历三轮合胞有丝分裂变为八核细胞。细胞化在进一步发育期间出现，从而产生成熟胚囊，所述成熟胚囊包括卵、助细胞、反足细胞和中央细胞，在典型的蓼型胚囊发育中所述中央细胞具有两个极核。在一些物种(玉米属(Zea spp.))中，反足细胞还可分裂并成为多个细胞。因此，如本文所用，胚珠最初由产生单倍体雌配子体组织的未减数分裂的组织构成。雌配子体进一步发育为由四种独特细胞类型构成的“成熟卵囊”，所述细胞类型包括：一个卵细胞、中央细胞、两个助细胞以及三个或更多个反足细胞。

在本文提供的方法和组合物中可以采用各种类型的启动子。启动子能够以细胞类型优选的、细胞类型特异性的、组织优选的或组织特异性的方式驱动表达。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(诸如叶、根、种子或胚珠)中起始转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”优选的启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根、叶或胚珠中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“抑制型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性的、细胞类型优选的以及诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。

如本文所用，“胚珠组织优选启动子”包括当与其未可操作地连接到胚珠组织优选启动子时的表达水平相比较，在植物的至少一种或所有胚珠组织(包括例如珠被和珠心)有优势活性的启动子。因此，虽然在其他植物组织类型中可出现可操作地连接的异源核苷酸序列的一定水平的表达，但在胚珠组织中出现的表达最为丰富。

在具体实施例中，利用了胚珠组织优选启动子，该启动子为“在植物胚珠的至少一种非配子体组织中有活性的”。此类启动子在植物胚珠位于胚囊外部的未减数分裂的体细胞中将是有活性的。此类启动子可以仅在胚珠的非配子体组织中具有活性，或者作为另外一种选择，启动子可以在除至少一种其他胚珠组织/结构之外的配子体组织中显示出活性。能够以该方式引导表达的启动子的非限制性例子包括如SEQ ID NO：1或2中示出的拟南芥NUC1启动子区；如SEQ ID NO：3或4中示出的拟南芥CYP86C1启动子区；如SEQ ID NO：5中示出的拟南芥PPM1启动子区；如SEQ ID NO：6中示出的拟南芥EXT启动子区；如SEQ ID NO：7中示出的拟南芥GILT1启动子区；如SEQ ID NO：8中示出的拟南芥TT2启动子区；如SEQ ID NO：9中示出的拟南芥SLV3启动子区，以及如SEQ ID NO：33中示出的拟南芥启动子AT1G24540(AT-CP450-1-PRO)，或它们的活性变体和片段。在具体实施例中，所采用的启动子是胚珠特异性启动子。

启动子AT NUC1(AT4G21620；GenBank：CP002687.1(bps.11496827-11495501)，GENE ID：828249；也称为F17L22.80；F17L22_80；SEQ IDNO：1和2)显示出在受精前于内珠被的珠孔端中的表达模式。表达进一步沿合点(chalazally)扩散穿过内珠被，以围绕胚囊的珠孔一半。在发育晚期，表达从珠孔内珠被过渡到合点珠被。表达的出现从授粉前数天持续到授粉后数天。在心形胚阶段，表达仅在与合点端相对的珠被处观察到。图1提供了AT NUC1启动子的表达模式。另参见美国专利申请公开No.2011/0107458A1，其以引用方式并入本文。

启动子AT CYP86C1(AT1G24540；GenBank：CP002684.1(bps8697732-8699750；其他名称：F21J9.20；SEQ ID NO：3或4)显示出在受精前于内珠被的珠孔端中的表达模式。表达沿合点扩散穿过内种皮(内珠被的最内层)以围绕胚囊的珠孔基部，然后表达沿合点扩散穿过整个内种皮层。表达的出现从授粉前数天持续到授粉后数天。图2至10提供了CYP86C1启动子的表达模式。

启动子AT PPM1(AT5G49180；GenBank：CP002688.1(bps19943368-19942879；其他名称：K21P3.5，K21P3_5；SEQ ID NO：5)显示出两种类型的表达模式。第一种AT PPM1启动子显示出在珠孔的内珠被和外珠被中(除外珠被的表皮层之外)的表达模式。第二种类型的表达模式是在珠孔的内珠被和外珠被中，如上所述，但表达沿合点延伸穿过内珠被和外珠被(非表皮层)以围绕整个胚囊(除合点珠心之外)。在胚囊内未观察到表达。后一种表达模式最常见于胚珠发育的早期阶段。图11提供了AT PPM1启动子的表达模式。另参见美国专利No.7,179,904、美国专利No.7,402,667、WO2006/005023、WO2006/066134、WO2006/076099、WO2007/075172、WO2007/078286和WO2006/08102，以及Louvet，et al.，(2006)Planta224：782(Louvet等人，2006年，《植物学》，第224卷，第782页)，它们中的每一个均以引用方式并入本文。

启动子AT EXT(AT3G48580；Genbank CP002686.1，bps18004981-18007235；也称为T8P19.90、XTH11、木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶11；SEQ ID NO：6)显示出在围绕胚囊的珠孔端的内珠被和外珠被的最内层中的表达模式。此外，在一个例子中，单个细胞(外珠被的最内层)显示出强表达。AT EXT的表达模式在图13中示出。

启动子AT SVL3(AT3G20520；GenBank登录号NM_112944；也称为K10D20.6、SHV3-LIKE3、SVL3；SEQ ID NO：9)显示出在大配子发生早期开始的表达模式。在四核大配子体阶段，表达最初在珠孔的内珠被和外珠被中是强的，随后扩散遍及整个胚珠的珠被。在发育晚期的接合子阶段，胚乳和胚也显示出表达。因此，表达可见于除珠柄之外的整个胚珠。图12提供了AT-SVL3启动子的表达模式。先前的表达数据限于6周龄长角果中的表达。参见Hayashi，et al.，(2008)Plant Cell Physiol.49：1522-1535(Hayashi等人，2008年，《植物细胞生理学》，第49卷，第1522-1535页)，其以引用方式并入本文。

在植物胚珠的至少一种非配子体组织中有活性的另外的胚珠组织优选启动子包括启动子AT GILT1(SEQ ID NO：7；AT4G12890；GenbankCP002686.1(bps7545227-7546409)；其他名称：T20K18.240、T20K18-240)。另参见美国专利No.7,179,904、美国专利No.7,402,667、美国专利No.7,169,915、WO2006/005023、WO2006/066134、WO2006/076099、WO2007/075172、WO2007/078286、WO2006/081029和WO2002/016655，以及Lovet，et al.，(2006)Planta224：782-791(Louvet等人，2006年，《植物学》，第224卷，第782-791页)。另外的启动子包括ATTT2(SEQ ID NO：8；AT5G35550；GenBank登录号AJ299452；也称为透明种皮2、ATMYB123、AT TT2、MOK9.18、MOK9_18、MYB域蛋白123、MYB123、TT2)。另参见WO2006/031779；美国专利No.6,972,197；WO2000/055325以及Gonzalez，et al.，(2009)Developmental Bio.352(2)：412-421(Gonzalez等人，2009年，《发育生物学》，第352卷，第2期，第412-421页)。另外的启动子包括如SEQ ID NO：33中示出的拟南芥启动子AT1G24540，或其活性变体和片段。

因此，所述方法和组合物包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含上文公开的胚珠组织优选启动子以及在植物胚珠的至少一种非配子体组织中有活性的任何胚珠组织优选启动子。此类序列包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的启动子核苷酸序列。所谓“启动子”，是指这样的DNA调控区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点处起始RNA合成的TATA框。启动子可以另外包含通常位于TATA框的上游或5′的其他识别序列，称为上游启动子元件，它们影响转录起始速率。本文所公开的启动子序列调节(即，活化)从启动子区的转录。

已经认识到，可将另外的域添加到本文所公开的启动子序列，从而调节表达水平、表达的发育计时、或表达在其中发生的组织类型。具体参见澳大利亚专利No.AU-A-77751/94以及美国专利No.5,466,785和No.5,635,618。

还提供了胚珠组织优选启动子多核苷酸中的每一者的片段和变体。启动子多核苷酸的片段可保持生物活性，从而保持转录调节活性。因此，启动子核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至本公开的全长多核苷酸的范围内。因此，胚珠组织优选启动子多核苷酸的片段可编码胚珠组织优选启动子的生物活性部分。胚珠组织优选启动子多核苷酸的生物活性部分可通过分离胚珠组织优选启动子多核苷酸中一者的一部分，以及评估胚珠组织优选启动子的所述部分的活性来制备。作为胚珠组织优选多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2000个核苷酸或直到本文所公开的全长胚珠组织优选启动子多核苷酸中存在的核苷酸数目。

对于启动子多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。通常，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定，特定胚珠组织优选启动子的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

可以修饰本文利用的任何启动子序列以提供所述异源核苷酸序列的一系列表达水平。因此，可以利用小于完整的启动子区，并且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可以按不同方式缺失启动子序列的部分，改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调节元件，则因启动子缺失，可以降低mRNA表达水平，或者可以增加表达。通常，分离的启动子序列的至少约20个核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。

变体多核苷酸还涵盖从诱变和诱重组方法(诸如DNA改组)得到的序列。通过这种方法，可操纵一个或多个不同的启动子序列以生成具有所需性质的新的胚珠组织优选启动子。这种DNA改组的策略在本文别处有描述。

在本领域中还可获得用于确定启动子序列是否保持以所需的时间和空间模式调节转录的能力的方法。此类活性可通过RNA印迹分析测量。参见例如Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，美国纽约州普莱恩维尤)，其以引用方式并入本文。或者，启动子的生物活性可使用特别设计用于测量由启动子表达的多肽的活性和/或水平的测定法测量。此类测定法是本领域已知的。

IV. 表达构建体

提供了增加植物胚珠细胞中孤雌生殖多肽的活性/水平的方法和组合物。在具体实施例中，此类孤雌生殖多肽的活性/水平调节促进了胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类方法和组合物可利用表达构建体，其包含可操作地连接到胚珠组织优选启动子(尤其是在植物胚珠的至少一种组织中有活性的胚珠组织优选启动子)的孤雌生殖多肽或其活性变体或片段。

表达盒可包括可操作地连接到孤雌生殖编码多核苷酸或其活性变体或片段的5′和3′调节序列。“可操作地连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注的多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作地连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓可操作地连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因(一个或多个)。这种表达盒提供有多个限制性位点和/或重组位点，以使孤雌生殖编码多核苷酸的插入处于胚珠组织优选启动子的转录调节之下。表达盒可另外含有选择性标记基因。

在5′-3′方向的转录中，表达盒将包括胚珠组织优选启动子或其活性变体或片段、孤雌生殖编码多核苷酸或其活性变体或片段，以及在宿主细胞(即，植物)中具有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或孤雌生殖编码多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是天然的/同功的。或者，调控区和/或孤雌生殖编码多核苷酸或其活性片段和变体对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是异源的。

如本文所用，指涉序列的“异源的”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与衍生这种多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/相似的物种，则一者或者两者从它们的原始形式和/或基因座经实质修饰而获得，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。

终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对可操作地连接的孤雌生殖编码多核苷酸或对胚珠组织优选启动子序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、孤雌生殖编码多核苷酸、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot，(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon，etal.，(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，et al.，(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。

因此，提供了表达构建体，其包含可操作地连接到编码孤雌生殖多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子，其中胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一种组织中是有活性的。在又一个实施例中，在表达构建体中编码孤雌生殖多肽的多核苷酸编码如SEQ ID NO：12、14、16或18中示出的多肽；或其编码与SEQ ID NO：12、14、16或18中示出的多肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保持孤雌生殖活性。

此外，具有RDK编码多核苷酸或其活性变体或片段的构建体能够可操作地连接到胚珠组织优选启动子，所述启动子包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸；或者与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保持引导可操作地连接的多核苷酸以胚珠组织优选的方式直接表达的能力。

在另外的实施例中，表达构建体包含：(i)SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸，其可操作地连接到编码SEQ ID NO：14中示出的多肽的多核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：1或3中示出的序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保持引导可操作地连接的多核苷酸以胚珠组织优选的方式直接表达的能力，并且所述多核苷酸可操作地连接到与SEQ ID NO：14中示出的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保持孤雌生殖活性。

如适当的话，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主优选的密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，其均以引用的方式并入本文。

已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie，et al.，(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)(Johnson，et al.，(1986)Virology154：9-20(Johnson等人，1986年，《病毒学》，第154卷，第9-20页))和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列(Jobling，et al.，(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病病毒前导序列(TMV)(Gallie，et al.，(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，Liss，纽约，第237-256页))以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Virology81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。另参见Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。也可利用其他已知的用于增强翻译的方法，例如内含子等等。

在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(例如转换和颠换)。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su，et al.，(2004)Biotechnol Bioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter，et al.，(2004)Plant Cell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato，et al.，(2002)Plant Physiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao，et al.，(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley，et al.，(1980)TheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》，第177-220页)；Hu，et al.，(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown，et al.，(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge，et al.，(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle，et al.，(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，博士论文，海德堡大学)；Reines，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic AcidsRes.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob Agents Chemother35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，博士论文，海德堡大学)；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob Agents Chemother36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill，et al.，(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容均以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。可以使用任何选择性标记基因。

还认识到，除孤雌生殖表达构建体之外的各种表达构建体在本文中均有描述。例如，具有编码标记序列、细胞毒性多肽和胚诱导多肽的序列的表达构建体在本文也有描述。技术人员将会知道如何将上述讨论的语言施用于任何表达构建体。

V. 编码胚诱导多肽的序列

提供了增加植物胚珠细胞中细胞毒素多肽的活性/水平的方法和组合物。在具体实施例中，此类细胞毒素多肽的活性/水平调节促进了胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。如上文所讨论，此类方法和组合物利用包含可操作地连接到胚珠组织优选启动子的细胞毒素编码多核苷酸的表达构建体。此类方法和组合物还可与编码胚诱导多肽的其他序列结合使用。

如本文所用，“胚诱导多肽”包含当与可操作地连接到胚珠组织优选启动子的细胞毒素编码多肽组合表达时，进一步促进卵细胞样状态的发育(包括进一步促进卵细胞样转录状态)，从而促进卵细胞样结构的发育、促进孤雌生殖和/或促进部分孤雌生殖的任何序列。此类胚诱导多肽可通过触发发育程序来促进生长。

此类胚诱导序列包括(但不限于)：体细胞胚发生受体样激酶(SERK)(Schmidt，et al.，(1997)Development124：2049-62(Schmidt等人，1997年，《发育》，第124卷，第2049-2062页))、Wushel(WUS)(Zuo，et al.，(2001)The Plant Journal30：349-359(Zuo等人，2001年，《植物杂志》，第30卷，第349-359页))、LEC多肽家族包括Leafy Cotyledon1(LEC1)(Lotan，at al.，(1998)Cell93：1195-1205(Lotan等人，1998年，《细胞》，第93卷，第1195-1205页))和Leafy Cotyledon2(LEC2)(Stone，et al.，(2001)PNAS98：11806-11811(Stone等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第11806-11811页))、Baby Boom(BBM)(Boutilier，etal.I，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页))和agamous-like15(Harding，et al.，(2003)Plant Physiol.133：653-663(Harding等人，2003年，《植物生理学》，第133卷，第653-663页))、EMBRYOMAKER(EMK)(Tsuwamoto，et al.，(2010)Plant Molecular Biology73：481-492(Tsuwamoto等人，2010年，《植物分子生物学》，第73卷，第481-492页))。

在特定实施例中，胚诱导序列在器官发育、顶端分生组织的起始和/或发育中涉及。此类序列包括例如Wuschel(WUS)或其活性变体和片段。参见美国专利No.7,348,468和No.7,256,322，以及美国专利申请公开No.2007/0271628；Laux，et al.，(1996)Development122：87-96(Laux等人，1996年，《发育》，第122卷，第87-96页)和Mayer，et al.，(1998)Cell95：805-815(Mayer等人，1998年，《细胞》，第95卷，第805-815页)，它们中的每一者均以引用方式并入本文。对WUS的调节预期能调节植物和/或植物组织表型，包括细胞生长刺激、器官发生和体细胞胚发生。WUS还可用来通过体细胞胚发生来改进转化。拟南芥WUS的表达可诱导营养组织中的干细胞，其可分化成体细胞胚(Zuo，et al.，(2002)Plant J30：349-359(Zuo等人，2002年，《植物杂志》，第30卷，第349-359页))。

在又一个实施例中，MYB118基因(参见美国专利No.7,148,402)、MYB115基因(参见Wang，et al.，(2008)Cell Research224-235(Wang等人，2008年，《细胞研究》，第224-235页))、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier，et al.，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页))、LEC和/或CLAVATA基因(参见例如美国专利No.7,179,963)与包含至少一个细胞毒素家族成员多肽的至少一个表达盒共表达。

在具体实施例中，胚诱导序列编码Leafy Cotyledon多肽(LEC)或其活性变体或片段。LEC家族转录因子在胚成熟过程中涉及，并在发育的早期阶段发挥功能以维持胚细胞命运，并且已显示出促进胚样结构的形成。参见例如Lotan，at al.，(1998)Cell93：1195-1205(Lotan等人，1998年，《细胞》，第93卷，第1195-1205页)；Braybrook，et al.，(2008)Trends in PlantScience13：624-630(Braybrook等人，2008年，《植物科学趋势》，第13卷，第624-630页)；Stone，(2001)PNAS98：11806-11811(Stone，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第11806-11811页)；Gazzarrini，et al.，(2004)Dev Cell7：373-385(Gazzarrini等人，2004年，《发育细胞》，第7卷，第373-385页)；Gaj，et al.，(2005)Planta222：977-988(Gaj等人，2005年，《植物》，第222卷，第977-988页)；Wang，et al.，(2007)Planta226：773-783(Wang等人，2007年，《植物》，第226卷，第773-783页)。

BABY BOOM(BBM或BNM3)或其活性变体和片段显示出与AP2/ERF家族转录因子的相似性，并且优选地在发育的胚和种子中表达。BBM在植物中的异位表达导致籽苗上体细胞胚和子叶样结构的自发形成。BBM的异位表达诱导另外的多效表型，包括赘生物生长、外植体的无激素再生以及叶和花的形态改变。BBM在胚发生期间起到促进细胞增殖和形态发生的作用。参见Boutilier，et al.，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页)和EP1057891(A1)，这两者均以引用方式并入本文。

其他胚诱导多肽包括环指蛋白的ARIADNE亚类成员。参见例如Jackson，et al.，(2000)Trends Cell Biol.10：429-439(Jackson等人，2000年，《细胞生物学趋势》，第10卷，第429-439页)和Mladek，et al.，(2003)Plant Physiol.131：27-40(Mladek等人，2003年，《植物生理学》，第131卷，第27-40页)，这两者均以引用方式并入本文。ARIADNE蛋白属于酵母、植物和动物中存在的E3连接酶家族，并且被认为在泛素依赖性蛋白降解的控制中涉及(在Vierstra，(2003)Trends Plant Sci.8：135-142(Vierstra，2003年，《植物科学趋势》，第8卷，第135-142页)中有所综述)。ARIADNE基因家族的一个成员是ARIADNE7(ARI7)。参见例如Schallan，et al.，(2010)The Plant Journal62：773-784(Schallan等人，2010年，《植物杂志》，第62卷，第773-784页)，该文献以引用方式并入本文。

胚诱导多肽(以及编码其的多核苷酸)的生物活性变体将与任何胚诱导多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，所述任何胚诱导多肽包括但不限于SERK、Wushel(WUS)、LEC多肽家族、Baby Boom(BBM)和agamous-like15中任一者的多肽，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数进行测定。

因此，可操作地连接到胚珠组织优选启动子的细胞毒素编码多核苷酸还可与目的多核苷酸序列(尤其是编码胚诱导多肽的序列)的任何组合进行堆叠。此类堆叠可发生在同一个表达盒内，或可将两条不同的序列独立地引入植物中。所需的堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或TopCross方法或者遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则目的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO1999/25821、WO1999/25854、WO1999/25840、WO1999/25855和WO1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。

技术人员将认识到，可将编码胚诱导多肽的序列置于表达盒内。表达盒在本文别处进行讨论。任何目的启动子均能够可操作地连接到编码胚诱导多肽的序列，包括例如组成型启动子、组织优选启动子、组织特异性启动子、胚珠组织优选启动子、在植物胚珠的至少一种非配子体组织中有活性的胚珠组织优选启动子、种子优选启动子、胚优选启动子和/或胚乳优选启动子。多个此类启动子已在本文别处有描述。

组成型启动子的非限制性例子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子以及WO1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142和No.6,177,611。

“种子优选”启动子包括“种子特异性”启动子(那些在种子发育期间活跃的启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些在种子萌发期间活跃的启动子)。参见Thompson，et al.，(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物测定法》，第10卷，第108页)，该文献以引用方式并入本文。这类种子优选启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO2000/11177和美国专利No.6,225,529，这些专利均以引用方式并入本文)。HV-NUC1是大麦珠心特异性启动子。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括(但不限于)菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括(但不限于)玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。另参见WO2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子，该专利以引用方式并入本文。

VI. 编码细胞毒性多肽的序列

如上文所讨论，提供了增加植物胚珠细胞中细胞毒素多肽的活性/水平的方法和组合物。在具体实施例中，此类细胞毒素多肽的活性/水平调节促进了胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类状态的发育(即，转录卵细胞样状态或卵细胞外部的组织和子结构中胚样结构的发育，包括此类结构在适合于孤雌生殖的任何组织和子结构中的形成)可通过进一步利用以允许靶细胞死亡或胚囊的特定细胞类型消融的方式表达的细胞毒性多肽来改善。在具体实施例中，至少卵细胞被消融。

在具体实施例中，植物胚珠中的卵细胞被特异性地消融，从而防止形成接合子胚。由于仅有卵细胞被消融，所以中央细胞的受精连同某种程度的胚乳发育应当是可能的。防止形成合子胚允许使用合成的无孢子生殖方法产生自繁殖植物或克隆繁殖植物。即，不形成接合子胚，但不定胚通过如本文所公开的RDK多肽的表达由胚珠中的未减数细胞形成。

因此，此类消融卵细胞的方法可与包含可操作地连接到编码细胞毒素多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体结合使用，其中胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一种组织中是有活性的，并且胚珠组织优选启动子在植物的胚珠细胞中是有活性的。

多种细胞毒性多肽可用于使靶细胞死亡或将胚囊的特定细胞类型消融。除了如下所述的细胞毒素序列之外，其他可能的细胞毒素包括：α淀粉酶、其他核酸酶；已知的是任何沉默靶向卵细胞发育和/或任何蛋白质或核酸表达所需基因的基因方法可导致细胞死亡。也可以使用消融卵细胞的另外的方法和组合物，包括例如杂交进入植物的胚致死突变。

此类细胞毒性多肽包括Barnase(“细菌”“核糖核酸酶”的混成词)，它是细菌蛋白，由110个氨基酸组成并具有核糖核酸酶活性。Barnase多肽的非限制性例子在SEQ ID NO：23中示出。注意到，INT是指添加ST-LS1INTRON2。还可以使用其活性片段和变体，其中所述活性片段和变体保持在它们在其中表达的细胞中的细胞毒活性。Barnase由细菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens合成和分泌，但当其在不存在其抑制剂barstar的情况下表达时对于细胞是致命的。抑制剂结合并关闭核糖核酸酶活性位点，防止barnase在合成后但分泌之前破坏细胞的RNA。参见例如Buckle，et al.，(1994)Biochemistry33(30)：8878-8889(Buckle等人，1994年，《生物化学》，第33卷，第30期，第8878-8889页)；Serrano，at al.，(1992)J.Mol.Biol.224(3)：783-804(Serrano等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第783-804页)；Serrano，et al.，(1992).J.Mol.Biol.224(3)：805-818(Serrano等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第805-818页)；Matouschek，et al.，(1992)J.Mol.Biol.224(3)：819-835(Matouschek等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第819-835页)；Mossakowska，et al.，(1989)Biochemistry28(9)：3843-3850(Mossakowska等人，1989年，《生物化学》，第28卷，第9期，第3843-3850页)；Gils，et al.，(2008)Plant Biotechnology Journal6：226-235(Gils等人，2008年，《植物生物技术杂志》，第6卷，第226-235页)和Kempe，et al.，(2009)Plant Biotechnology Journal7：283-297(Kempe等人，2009年，《植物生物技术杂志》，第7卷，第283-297页)。

可以利用的另外的细胞毒素包括(但不限于)如SEQ ID NO：24中示出的Dam甲基化酶或其活性变体或片段或Dam甲基化酶内含子断裂蛋白质(Intein Split)：DMETH N-端(SEQ ID NO：25)；INTE-N(SEQ ID NO：26)；INTE-C(SEQ ID NO：27)；DMETH C-端(SEQ ID NO：28)或其活性变体或片段，或ADP核糖酶多肽(SEQ ID NO：29)或其活性变体或片段。

操纵受精和/或种子发育的细胞消融可包括例如使用本文所公开的一种或多种细胞类型特异性启动子。因此，技术人员将认识到，可将编码细胞毒性多肽的序列置于表达盒内。表达盒在本文别处进行讨论。任何目的启动子均可以可操作地连接到编码细胞毒性多肽的序列，只要启动子引导细胞毒性多肽在期望消融的细胞类型中表达即可。单个启动子将尤其适用于细胞消融，以防止花粉管吸引受精(助细胞消融，DD31或DD2)；防止有性胚形成(卵细胞消融，DD45)和/或防止胚乳形成(中央细胞消融，DD65)。此类启动子包括例如胚囊优选启动子或胚囊特异性启动子，包括卵细胞优选启动子。此类卵优选启动子在中央细胞或胚乳中将是无活性的，因此这些组织在卵细胞优选启动子可操作地连接到编码细胞毒性多肽的序列时得以保存。此类卵细胞优选启动子包括拟南芥启动子(AT-DD45PRO；dif1(决定性不育基因1；SEQ ID NO：10；At2g21740启动子)下调的拟南芥)，及其活性变体和片段。分析显示，该启动子是特异于卵细胞和接合子/早期胚的，并且在任何其他细胞类型中不表达。当采用AT-DD45PRO来表达细胞毒性多肽时，植物胚珠中的卵细胞将被特异性地消融。参见Steffen，et al.，(2007)Plant J51(2)：281-292(Steffen等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第2期，第281-292页)。使用DD45启动子表达毒素(如，BARNASE)将导致卵细胞消融，并防止接合子胚形成。由于将仅有卵细胞被消融，所以中央细胞的受精连同某种程度的胚乳发育应当是可能的。因此，当与本文所公开的各种方法结合时，此类构建体可用于使合成的无孢子生殖发育。

可用于表达细胞毒性多肽的另外的胚囊优选启动子包括反足细胞优选启动子AT-DD1PRO(SEQ ID NO：40；dif1(决定性不育基因1)1下调；At1g36340)；助细胞优选启动子(AT-DD31PRO；SEQ ID NO：42；dif1(决定性不育基因1)131下调；At1g47470)和/或中央细胞优选启动子(ATDD65PRO；SEQ ID NO：43；dif1(决定性不育基因1)165下调；At3g10890)；Fem2(SEQ ID NO：30；中央细胞优选/极核优选)，以及它们的活性变体和片段。另参见与本文同时提交且其全文以引用方式并入本文的名称为“Ovule Specific Promoters and Methods of Their Use”(胚珠特异性启动子及其应用方法)的美国临时专利申请序列号_________，以及Steffen，et al.，(2007)The Plant Journal51：281-292(Steffen等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第281-292页)(以引用方式并入本文)。

VII. 启动子的变体和片段

如本文所讨论，可在本文提供的方法和组合物中采用多种启动子，包括：用于表达编码胚诱导多肽的序列和编码细胞毒性多肽的序列的启动子。可以使用这些启动子多核苷酸的片段和变体。启动子多核苷酸的片段可保持生物活性，因此以未修饰的形式在所需的组织中保持转录调节活性。因此，启动子核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至全长启动子序列的范围内。因此，启动子多核苷酸的片段可编码启动子的生物活性部分。启动子多核苷酸的生物活性部分可通过分离启动子多核苷酸中一者的一部分，以及评估启动子的所述部分的活性来制备。作为多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2000个核苷酸或直至本文所公开的全长启动子多核苷酸中存在的核苷酸数目。

对于启动子多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。通常，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定，本公开的特定启动子多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在本文别处描述了确定启动子序列是否保持以所需时间和空间模式调节转录的能力的方法。

应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本文所公开的启动子结合使用。增强子是起到增加启动子区的表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域知道的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。一些增强子还已知用来改变正常的启动子表达模式，例如通过造成启动子被组成型表达而改变正常的启动子表达模式，若没有该增强子，则该启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中被表达。

本文所公开的启动子的修饰可以提供异源核苷酸序列的一系列表达。因此，可以将它们修饰成弱启动子或者强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意在指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。

IIX. 植物以及制备方法

本文所公开的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。本文所公开的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。

“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。

转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据转化靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))以及弹道粒子加速法(参见例如美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes，et al.，(1995)in Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips，(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑(斯普林格出版社，柏林)；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))以及Lec1转化(WO2000/28058)。另参见Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(Sanford等人，1987年，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen，(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，(朗文出版社，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals ofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)，全部上述专利和文献均以引用方式并入本文。

在具体实施例中，可使用多种瞬时转化方法将在本文所公开的方法和组合物中使用的各种序列(如，细胞毒素多肽、胚诱导序列、细胞毒性多肽等)提供给植物。此类瞬时转化方法包括(但不限于)：将在本文所公开的方法和组合物中使用的各种序列(如，细胞毒素多肽、胚诱导序列、细胞毒性多肽等，或它们的变体和片段)直接引入植物或将转录物引入植物。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)；Nomura，et al.，(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush，et al.，(1994)The Journal of Cell Science107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用方式并入本文。

或者，可使用本领域已知的技术将在本文所公开的方法和组合物中使用的各种序列(如，细胞毒素多肽、胚诱导序列、细胞毒性多肽等)瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用涂覆有聚乙烯亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。

在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本公开的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本公开的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。已经认识到，在本文所公开的方法和组合物中使用的各种序列(如，细胞毒素多肽、胚诱导序列、细胞毒性多肽等)最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。此外，应认识到，本文所公开的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931以及Porta，et al.，(1996)MolecularBiotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)，它们均以引用方式并入本文。

用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见，例如，WO1999/25821、WO1999/25854、WO1999/25840、WO1999/25855和WO1999/25853，上述专利以引用方式并入本文。简单而言，可将本公开的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧带有两个非重组产生的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的非重组产生的重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。

进行体内定向诱变的另外方法是已知的。例如，具有所需序列改变的DNA序列可侧接有与基因组靶标同源的序列。然后可选择或筛选成功的同源重组事件。参见美国专利No.5,527,695。通常，此类载体构建体被设计为具有两个处于具有所需序列的多核苷酸旁侧的与基因组靶标同源的区域。将载体引入植物细胞将允许同源重组发生，并在靶标位点处产生同源区之间的序列交换。

此类同源重组方法还可与诱导植物细胞中的位点特异性基因组双链断裂的试剂结合。此类双链断裂试剂可经工程改造以在靶标位点处产生断裂，从而增强同源重组事件。参见例如Puchta，et al.，(1996)Proc Natl AcadSci USA93：5055-5060(Puchta等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第5055-5060页)；美国专利申请公开No.2005/0172365A1；美国专利申请公开No.2006/0282914、WO2005/028942；2004年8月12日公开的WO2004/067736；美国专利No.5,792,632；美国专利No.6,610,545；Chevalier et al.，(2002)Mol Cell10：895-905(Chevalier等人，2002年，《分子细胞》，第10卷，第895-905页)；Chevalier et al.，(2001)Nucleic AcidsRes29：3757-3774(Chevalier等人，2001年，《核酸研究》，第29卷，第3757-3774页)；Seligman et al.，(2002)Nucleic Acids Res30：3870-3879(Seligman等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第3870-3879页)；美国专利申请公开No.2009/0133152和WO2005/049842，上述中的每一者均全文以引用方式并入本文。

转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化株系或不同的株系进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本公开提供在其基因组中稳定掺入了本公开的多核苷酸(例如本公开的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。

本文所公开的方法和组合物可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物物种的例子包括(但不限于)：玉米(玉米(Zea mays))、芸苔属物种(Brassica sp.)(如，欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实施本公开的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树，例如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)，以及雪松，例如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施例中，本公开的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属物种、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。

其他的目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属物种、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括荚果类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。

IX. 各种应用方法

提供了促进胚珠植物细胞中的卵细胞样状态的方法。此类方法包括使表达构建体表达，所述表达构建体包含可操作地连接到编码细胞毒素多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子，其中胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一种组织中是有活性的。此类方法促进植物的至少一个胚珠细胞中在胚囊外部的卵细胞样状态。在具体实施例中，本文所公开的方法提供“卵细胞样状态”，用于进展为产生孤雌生殖或起始胚生殖。

刺激器官发生和/或体细胞胚发生的能力可用来产生单性生殖的植物。单性生殖具有经济潜力，因为它能造成任何基因型(无论有多杂合)纯育。它是一个绕开雌性减数分裂和有性生殖来产生遗传上与母本相同的胚的繁殖过程。在单性生殖情况下，特别适应的或杂种的基因型的后代将在反复的生命周期中保持它们的遗传保真度。除了固定杂种活力之外，单性生殖还可使得有可能在没有有效的雄性不育或能育性恢复系统以供产生杂种的作物中进行商业性杂种生产。单性生殖可使杂种发育更有效。它还能在具有良好雄性不育的植物物种中简化杂种生产和提高遗传多样性。此外，在可能会危及授粉的胁迫(干旱、寒冷、高盐等)条件下，单性生殖可能是有利的。

在具体实施例中，本文所公开方法中采用的编码细胞毒素多肽包含如SEQ ID NO：12、14、16或18中示出的多肽，或其活性变体或片段。此外，胚珠组织优选启动子可包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸，或其活性变体或片段。在又一个实施例中，表达构建体包含SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸或其活性变体，所述多核苷酸或其活性变体可操作地连接到编码SEQ ID NO：14中示出的多肽或其活性变体或片段的多核苷酸序列。

在促进卵样状态形成的方法中可以使用另外的序列。例如，来自胚珠组织优选启动子的RDK多肽的表达可以与胚诱导多肽的表达相结合。此类胚诱导多肽在本文别处有讨论，并且包含BBM、WUS、LEC、MYB115、MYB118和/或ARI7多肽或它们的活性变体。编码此类胚诱导多肽的序列可以可操作地连接到任何启动子，包括例如胚珠组织优选启动子。

在另外的实施例中，细胞毒素多肽与第二多核苷酸结合表达，该第二多核苷酸在表达时将消融胚囊内的至少一种细胞。在非限制性例子中，第二表达构建体包含可操作地连接到多核苷酸的胚囊特异性启动子，所述多核苷酸在表达时将消融胚囊内的至少一种细胞。胚囊优选启动子可以是反足细胞优选启动子、助细胞优选启动子、卵细胞优选启动子或中央细胞优选启动子。然而在其他实施例中，胚囊优选启动子是卵细胞优选启动子，并包含SEQ ID NO：10中示出的多核苷酸或其活性变体或片段。

可用于检测卵细胞样状态、卵细胞样转录状态、卵细胞样结构的发育、孤雌生殖和胚生殖的起始的各种方法和组合物在本文别处有讨论。按此方式，可测定在植物胚珠的组织(包括适合于孤雌生殖的任何组织和子结构)中的卵细胞样状态。

还提供了调节植物胚珠的至少一种组织中细胞毒素多肽或其活性变体的浓度和/或活性的方法。在其他实施例中，对细胞毒素多肽的浓度和/或活性的调节发生在胚珠细胞中。通常，相对于天然对照植物、植物部分或细胞，浓度和/或活性增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本共开中的调节可在植物生长至所需的发育阶段过程中和/或在其后发生。

在具体实施例中，调节(即，增加)细胞毒素多肽或其活性变体或片段的浓度和/或活性的方法包括将编码所采用的细胞毒素多肽的多核苷酸引入植物或植物细胞中，所述细胞毒素多肽包括如SEQ12、14、16或18中示出的多肽或其活性变体或片段。在其他实施例中，编码细胞毒素多肽的序列可操作地连接到胚珠组织优选启动子，该序列可以包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸或其活性变体或片段。在又一个实施例中，用于调节细胞毒素多肽的水平的表达构建体包含SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸或其活性变体，所述多核苷酸或其活性变体可操作地连接到编码SEQ ID NO：14中示出的多肽或其活性变体或片段的多核苷酸序列。

IX. 胚珠组织优选启动子序列的另外应用方法

当与DNA构建体装配使得启动子序列可操作地连接到编码目的异源蛋白或RNA的异源多核苷酸时，本文所公开的各种胚珠组织优选启动子序列及其变体和片段可用于任何植物的遗传操纵。以此方式，胚珠组织优选启动子序列的核苷酸序列便连同用于在目的植物中表达的异源多核苷酸一起在表达盒中提供。

合成的杂合启动子区是本领域已知的。这种区域包含可操作地连接至另一个核苷酸序列的启动子元件的一个核苷酸序列的上游启动子元件。在本公开的一个实施例中，通过合成的杂合启动子控制异源基因表达，该合成的杂合启动子包含可操作地连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本文所公开的胚珠组织优选启动子序列或其变体或片段。

本文所公开的胚珠组织优选启动子序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。

目的基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些。

X. 序列同一性

如下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较序列”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质上相同”。

本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。

本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的片段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller，(1988)CABIOS4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith，et al.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的算法；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法；Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的算法；Karlin and Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872：264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872卷，第264页)的算法，其在Karlin andAltschul，(1993)Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(Karli和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了改进，这些文献均以引用方式全文并入本文。

这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可获自美国加利福尼亚州山景城智生公司(Intelligenetics，Mountain View，Calif.))中的CLUSTAL；GCGWisconsin Genetics Software 版本10(可获自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(Accelrys Inc.，9685ScrantonRoad，San Diego，Calif.，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。CLUSTAL程序如下文献详细说明：Higgins，et al.，(1988)Gene73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higgins，et al.，(1989)CABIOS5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，et al.，(1992)CABIOS8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)以及Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)，这些文献均以引用方式全文并入本文。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)(以引用方式全文并入本文)的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可如Altschul，et al.，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所述利用GappedBLAST(在BLAST2.0中)，该文献以引用方式全文并入本文。或者，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)(出处同上)。当采用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的互联网网站www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。本文所用的“等同程序”是任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

GAP程序利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两条完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0至200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)，其以引用方式全文并入本文)。

在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时该两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是(例如)如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城智生公司(Intelligenetics，MountainView，Calif.))中所执行那样进行计算。

本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”是指多核苷酸与参考序列相比包含具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％序列同一性的序列，所述百分比是用比对程序采用标准参数得到。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常是指至少60％、70％、80％、90％和至少95％的序列同一性。

以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。

实例

以下实例进一步说明各实施例，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本发明的各实施例，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可确定各实施例的必要特征，且在不背离各实施例的实质和范围的情况下，可对各实施例作出各种变化和修改以适应各种用法和条件。因此，除了本文显示和描述的那些实施例之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道各实施例的各种修改。这类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。

本文给出的每个参考文献的公开内容均以引用方式全文并入本文。

实例1： 单性生殖库的生成

胚囊特异性启动子(AT DD2启动子、AT DD31启动子、AT DD1启动子)、AT DD65启动子、EASE启动子或上文以引用方式并入的任何其他胚囊启动子)

单性生殖遗传来源-例如：来自Boechera holboellii或其他单性生殖Boechera sp.、单性生殖兰花、单性生殖苹果、观赏海棠(Malus sp.)、单性生殖悬钩子属物种(Rubus sp.)、单性生殖柑桔属物种(Citrus sp.)、山柳菊属物种(Hieracium sp.)、金丝桃属物种(Hypericum sp.)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)或其他单性生殖或非单性生殖植物物种的发育期胚珠。

早期球形胚-KTI3PRO：AC-GFP1

从母体组织中转化和分离出表达GFP信号的不定胚，以便使用以下设备进行选种：Union Biometrica COPAS(复杂对象参数分析仪和分选机)种子分选机(可在万维网上的www.unionbio.com/copas/找到)，美国专利No.6,657,713(2003年12月2日)和美国专利No.6,400,453(2002年6月4日)，“Large Object Sorter：Fluid Controlled Machinefor Selecting andDepositing Multicellular Organisms”(大型对象分选机：用于选择和沉淀多细胞生物的流体控制机)；美国专利No.7,116,407(2006年10月3日)，“System For Axial Pattern Analysis of Multicellular Organisms(Profiler)”(用于多细胞生物的轴向模式分析的系统(断面仪))；加拿大专利No.2,341,231(2003年10月21日)，“Large Object Sorter：Fluid ControlledMachine for Selecting and Depositing Multicellular Organisms”(大型对象分选机：用于选择和沉淀多细胞生物的流体控制机)。

其他种子分离方式可通过包括(但不限于)如下的方法实现：非荧光种子标记(颜色、形状、尺寸、表面性质)。可利用其他选择性质，例如阳性选择或反选择。例如，阳性选择PTU可在筛选构建体的过程中使用，用于(例如)在移除包含保持系盒的种子之后选择除草剂抗性。

实例2： EGS系统突变方案

该方法利用母本胚缺陷(胚致死)隐性突变，该突变随后在与不育自交保持系统(SIMS)或制种技术中所用方法类似的方法中得以保持(参见美国专利No.7,696,405、No.7,915,398和No.7,790,951)。所引入的转基因盒具有三个部分：与胚致死突变互补的野生型等位基因，用于防止通过花粉的转基因传递的花粉消融PTU，以及用于允许将转基因群体从所产生的种子移除的种子颜色标记。另一个实施例使用在保持系构建体中的阴性反选择，其中阴性选择通过可诱导的表达系统、代谢反选择化学应用或其他方式而激活。所得的群体对于隐性突变等位基因而言将是纯合的，但在转基因上是互补的。这些植物应当在后代中分离成1∶1的存活的转基因种子和不能存活的非转基因无胚纯合突变体。

图解：

2种植物：

母本胚缺陷(胚致死)突变：ee

在半合子状态下互补的野生型等位基因：E-

植物为ee+E/花粉-消融PTU/种子颜色标记(E仅通过卵传递)

在自交时：雌配子为50％e(胚致死)和50％eE(胚存活)

雄配子为100％e(所有携带E的花粉均被消融)

这些植物产生的种子为50％ee(胚致死)

50％eEe(正常胚，由于互补的E，有色种子)

1)构建体B，野生型互补转基因/卵细胞解毒剂品系

2)花粉消融转基因

a.证实了多个此类转基因

i.AT-LAT52LP1PRO：BA-BARNASE-INT

ii.AT-PPG1PRO：BA-BARNASE-INT

iii.AT-LAT52LP2PRO：ADP核糖酶(

iv.AT-LAT52LP1PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

v.AT-LAT52LP2PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

vi.AT-PPG1PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

3)种子颜色标记

a.已证实在拟南芥和玉蜀黍中存在多个此类标记

I.拟南芥：KTI3PRO：AC-GFP1；KTI3PRO：AM-CYAN；RD29A PRO：DS-RED EXPRESS；RD29A PRO：ZS-YELLOW。

4)(对于自繁殖植物的)孤雌生殖PTU

a.启动子已列出

b.AT-RKD2是CDS候选物

c.启动子驱动cDNA库连接到作为胚报道基因的KTI3：AC-GFP1。这构成了“孤雌生殖库”

d.使用Union Biometrica COPAS(复杂对象参数分析仪和分选机)鉴定GFP阳性种子

I.COPAS同时检测光密度、飞行时间、红色荧光、黄色荧光和绿色荧光。

II.筛选涉及搜遍种子找到DS-RED阴性、GFP阳性种子，表明形成了不定胚。

1.DS-RED阴性表明不存在EGS保持系，因此卵细胞已被消融，并阻止了有性接合子形成

2.GFP阳性表明存在孤雌生殖库。

实例3：胚发生功能获得筛选(EGS)

用构建体转化野生型拟南芥植株，该构建体包含：花粉消融、卵细胞+以及种子颜色标记。然后使植株自交，生成半合子转基因群体。

然后用包含卵消融的构建体转化拟南芥植株的半合子转基因群体。

使存活植株的种子生长，所得的转化拟南芥植株的卵消融构建体是半合子状态。用来自包含体细胞胚生殖和胚颜色标记的单性生殖库的构建体转化这些植株。

进一步更详细地描述了该步骤：

构建体A包含卵细胞特异性启动子：：毒素基因

构建体B包含卵细胞特异性启动子：毒素解毒剂/花粉消融PTU/种子颜色标记

当包含构建体A和构建体B二者的植株自交时：

雌配子为100％A+B(因为仅A-是不能存活的)

雄配子为100％A(因为A+B花粉被消融)

产生的所得种子为

100％(A+A)A(构建体A是纯合的，构建体B是半合子的)

使此代自交产生

50％AA/B-(可存活，转基因)

50％AA/--(不能存活，无胚)

通过COPAS将所得的种子分类，得到大约50％EGS卵+种子(可存活，转基因)，50％非荧光的败育种子(不能存活，无胚)。

所需的组分为：

1)构建体A，隐性胚致死突变/卵细胞消融品系

2)构建体B，野生型互补转基因/卵细胞解毒剂品系

3)花粉消融转基因

a.证实了多个此类转基因

i.AT-LAT52LP1PRO：BA-BARNASE-INT

ii.AT-PPG1PRO：BA-BARNASE-INT

iii.AT-LAT52LP2PRO：ADP核糖酶(

iv.AT-LAT52LP1PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

v.AT-LAT52LP2PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

vi.AT-PPG1PRO：DMETH(Dam甲基化酶)

4)种子颜色标记

a.已证实在拟南芥和玉蜀黍中存在多个此类标记

i.拟南芥：KTI3PRO：AC-GFP1；KTI3PRO：AM-CYAN；RD29A PRO：DS-RED EXPRESS；RD29A PRO：ZS-YELLOW。

5)(对于自繁殖植物的)孤雌生殖PTU

a.启动子已列出

b.AT-RKD2是CDS候选物

c.启动子驱动cDNA库连接到作为胚报道基因的KTI3：AC-GFP1。这构成了“孤雌生殖库”

d.使用Union Biometrica COPAS(复杂对象参数分析仪和分选机)鉴定GFP阳性种子

i.COPAS同时检测光密度、飞行时间、红色荧光、黄色荧光和绿色荧光。

ii筛选涉及搜遍种子找到DS-RED阴性、GFP阳性种子，表明形成了不定胚。

1.DS-RED阴性表明不存在EGS保持系，因此卵细胞已被消融，并阻止了有性接合子形成。

2.GFP阳性表明存在孤雌生殖库。

实例4：在EGS保持系中包含卵消融报道基因AT-RKD1：Barnase-三重 标签(AT-DD45：DsRed_AT-DD31：ZsYellow_AT-DD65：AmCyan)的表达盒的 活性。

图1是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其中仅有卵/接合子(红色)和助细胞(绿色)的残迹。绿色和红色的解体残迹可能显示黄色。中央细胞显示为健全的，其具有3-4个胚乳核，指示受精未发生。

实例5： 在EGS保持系中包含卵消融报道基因AT-RKD2：Barnase- 三重标签(AT-DD45：DsRed_AT-DD31：ZsYellow_AT-DD65：AmCyan)的表达 盒的活性。

图2至8描述了来自相同转化构建体的若干事件。

图2是具有处于解体过程中的接合子(红色)的受精的拟南芥胚囊的荧光图像，该接合子正在丧失完整性并看起来正在“起泡”。宿存助细胞(绿色)看起来正在凝聚和解体。中央细胞显示为健全的，其具有若干胚乳核，指示受精未发生。

图3是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，显示出位于正常发育的中央细胞中的7-8个胚乳核。没有存在接合子或胚(红色)的迹象，也没有存在任何助细胞(绿色)的迹象。可将胚乳描述为在不存在胚的情况下发育。

图4是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有接合子(红色)和宿存助细胞(绿色)的残迹，其中接合子和宿存助细胞均显示出正在凝聚和解体。中央细胞显示为不健全的并处于解体的早期阶段(如通过中央细胞的空泡形成增多所指示)。

图5是在受精将要开始前2个未受精的拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有2个胚乳核和2个助细胞(黄色)，但缺少卵(红色)。右边的胚囊具有中央细胞(青色)，该中央细胞具有单个初生胚乳核，但缺少助细胞(黄色)和卵(红色)。

图6是受精的拟南芥胚囊的荧光图像和微分干涉相差(DIC)荧光重叠图像。中央细胞(青色)具有单个胚乳核和1个助细胞(黄色)，但缺少卵(箭头)。

图7是受精的拟南芥胚囊的荧光图像，其具有位于正常发育的中央细胞中的4个胚乳核。仅存在非常弱的红色荧光信号(箭头)，其指示胚或接合子的残迹的存在。宿存助细胞(绿色)正在解体。胚乳正在不存在胚的情况下发育。

图8是具有良好发育的胚乳的2个拟南芥胚囊的荧光图像。左边的胚囊在其中央细胞(青色)中具有多个胚乳核，并且在其珠孔端处(箭头)是胚或接合子(红色)的残迹。在正常条件下，该胚在心形阶段应当发育地完全得多。右边的较小胚囊具有多个胚乳核(青色)，但缺少胚(箭头)。到该最后阶段为止，助细胞自然地降解。

说明书中提到的所有专利公布和专利申请均指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的专利公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。

虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。

Claims (17)

1.一种用于生成缺少由具有繁殖能力的有性方式获得的胚的大型种子群体的方法，包括：

a)用包含三个部分的第一转基因盒转化第一植物，所述三个部分为：

i)表达驱动同源解毒剂的启动子的卵细胞，

ii)花粉消融PTU

iii)种子选择标记；

b)用第二表达盒转化所述植物，其中所述第二表达盒包含编码通过卵细胞特异性启动子表达的毒素基因的核酸分子，生成显性半合子无胚表型，从而产生对于所述毒素而言是纯合的但对于能育性而言是半合子的植物群体；以及

c)使来自用所述第二盒转化的所述植物的所述种子生长，产生其种子的50％存活并且所述第一和第二表达盒为转基因的植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码同源解毒剂的核酸分子，其中所述解毒剂选自：SEQ ID NO：49或其活性变体或片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码含有荧光团的种子颜色标记的核酸分子，所述荧光团选自：DS-RED、ZS-GREEN、ZS-YELLOW、AC-GFP、AM-CYAN和AM-CYAN1、AC-GFP、eGFP、eCFP、eYFP、eBFP、“水果”荧光蛋白(UC系统)；tagRFP、tagBFP、mKate、mKate2、tagYFP、tagCFP、tagGFP、TurboGFP2、TurboYFP、TurboRFP、TurboFP602、TurboFP635、TurboFP650、NirFP或Cerulean。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一表达盒包含花粉消融植物转录单元(PTU)，其具有的启动子选自包含下列的组：SEQ ID NO：53、54、55和56。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一表达盒还包含可操作地连接到编码同源解毒剂多肽的所述核酸分子的组织特异性启动子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组织特异性启动子是卵细胞组织特异性启动子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述卵细胞组织特异性启动子选自包含下列的组：SEQ ID NO：1-9、11、13、15、17、19-21、31和33。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第二盒还包含可操作地连接到毒素基因的卵细胞组织特异性启动子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二盒启动子选自：SEQ IDNO：53、54、55和56。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述植物用孤雌生殖PTU转化，并且移除所述毒素和/或解毒剂互补构建体，以允许产生自繁殖植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述双子叶植物为芸苔属物种(Brassica sp.)、向日葵、棉花、低芥酸油菜(canola)、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis sp.)或苜蓿。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述自繁殖植物是大豆。

14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述自繁殖植物是单子叶植物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。

16.一种通过权利要求1-15中任一项所述的方法产生的自繁殖植物。

17.一种权利要求16所述的自繁殖植物的种子。