CN102499075A - 一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备大豆复合型外植体的方法及用该复合型外植体制备快速转基因大豆植株的方法。本发明的方法是将成熟大豆种子消毒，无菌条件下在萌发培养基中光照培养催芽，催芽24h后去掉种皮、一片子叶和第一片真叶，保留下胚轴、胚尖及一片子叶，即为大豆复合型外植体。本发明方法制备的大豆复合型外植体可以用于制备快速转基因大豆植株，外植体再生率高，达90%以上，转化效率高，而且明显缩短转化周期。

Description

一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法。

背景技术

大豆是高蛋白和高脂肪含量的作物，营养价值和经济价值都很高。大豆在农作物中是粮食兼油料作物，又是家畜和轻工业的重要原料作物，在国内外市场占有重要的地位。然而，普通栽培大豆由于遗传基础相对狭窄，育种周期相对较长，仅靠常规育种手段难以满足国内外市场对大豆日益增长的需求。随着基因工程的发展，通过转基因技术有目的地将外源基因转入大豆，进而获得综合性状优良的转基因大豆品种，不但可以丰富栽培大豆的基因资源，拓宽栽培大豆相对狭窄的遗传背景，而且还可使大豆在产量、品质等性状上得到明显改善。

大豆是全球公认的难转化作物之一。1988年Hinchee等首次用农杆菌介导法以子叶为外植体，经不定芽获得大豆转基因植株，但是转化效率极其低下。后来发展了以大豆胚尖、下胚轴为外植体，但仍然传转效率不高，且操作繁琐、工作量大、周期长、成本高。因此，寻求高高转化效率的大豆外植体作为外源基因的转化受体显得尤其重要。本发明在前人研究的基础上经过多次的尝试创新了传统的大豆外植体，获得了具有高转化效率的大豆复合型外植体，为转基因大豆的发展提供了很好的转化平台。

中国发明专利申请201010554668.2（公开日2011年2月16日）公开了一种农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其中外植体制备方法是将大豆种子经乙醇和升汞消毒后浸泡在无菌水中，培养萌发得无菌苗，然后取子叶还未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3~5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽，即得含子叶节的外植体。

中国发明专利申请03816844.8（公开日2005年9月14日）公开了一种转化大豆的方法，其中制备外植体的方法是将用氯气释放处理消毒两次，每次8~18小时，培养种子过夜，然后去除种皮，去除部分下胚轴，保留大约0.5cm的下胚轴，去除一个子叶及其邻近的腋芽，保留附于剩下子叶上的初生叶，再将保留的初生叶除去一部分，保留初生叶基部，得到外植体。

上述第1种方法由于子叶节是经过器官发生再生植株，因此转化体容易形成嵌合体，后代筛选难度大，获得转化植物效率低下；上述第2种方法中由于去掉了大部分下胚轴营养供给受到影响，因此外植体的再生效果差及转化率较低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中用于作为转基因大豆植株的外植体转化效率低、操作繁琐等问题，提供一种新的制备大豆复合型外植体的方法。

本发明的另一目的是利用上述大豆复合型外植体制备快速转基因大豆植株的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备大豆复合型外植体的方法，是将成熟大豆种子消毒（优选在含有氯气的密闭容器内熏蒸消毒4~6h），无菌条件下在萌发培养基中光照培养催芽，催芽24h后，从种子眼处去掉种皮，去掉胚尖两侧的第一片真叶，去掉一片子叶，保留包括胚根的完整下胚轴、胚尖及另一片子叶，即为所述大豆复合型外植体；

具体操作过程可以如下：

将无创伤饱满的成熟大豆种子消毒后在无菌条件下置于萌发培养基中光照培养催芽，培养温度优选25~28℃，催芽24h后从种子眼处去掉种皮，用锋利的解剖刀轻轻拨掉1片子叶，留下一片子叶，接着小心去掉胚尖两侧的第一片真叶，留下刚刚萌动的胚尖，保留完整的下胚轴（包括胚根），所得到的具有完整的下胚轴、胚尖及一片子叶，即为所述大豆复合型外植体，简称CEP外植体（见图1）。本发明制备的复合型外植体能够克服现有外植体操作繁琐、转化体筛选困难、再生率和转化率低的缺点，具有操作简便、再生率及转化率高、转化体筛选简便的特点。

所述萌发培养基成分为30g/L蔗糖和质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8。

上述制备大豆复合型外植体的方法中大豆种子可以选用任何品种，如华春3号、华春6号或马祖1号等。

一种制备快速转基因大豆植株的方法，步骤如下：

（1）制备大豆CEP外植体：按上述方法制备大豆外植体，将该外植体胚尖朝上垂直播种预培养基中，预培养24~28h；

（2）携带目的基因的农杆菌转化外植体：将携带外源目的基因的农杆菌在YEB液体培养基中扩大培养，扩大培养后的培养液离心，收集沉淀，用共培养基稀释成OD₆₀₀=1.5的菌液，将步骤（1）中预培养后的大豆复合型外植体转移到菌液中，28℃黑暗环境侵染19~23h；

（3）大豆复合型外植体芽诱导：取出侵染后的大豆复合型外植体，置于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，28℃黑暗培养3~7天，再取出，灭菌水洗去附着在其表面的农杆菌，无菌滤纸吸干表面附着的液体，转到芽诱导培养基培养2~3周（进行筛选并诱导出芽），每周转接一次（即每周更换一次培养基），培养至外植体长出不定芽；

（5）生根培养及炼苗：将芽诱导培养基上的外植体不定芽转到生根培养基生根培养，根健壮时敞开瓶口炼苗2~3天，移入培养土中，待幼苗长出两片新叶后，再移栽到温室中；

上述步骤中使用的培养基成分如下：

所述预培养基成分：MSB5，1.0 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤），30g/L蔗糖，质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8；

所述YEB液体培养基成分：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，pH 5.8；

所述共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤），0.5 g/L MES（2-吗啉乙磺酸），200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH5.8；

所述固体共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200μmol/L 乙酰丁香酮，0.4%琼脂，pH 5.8；

所述芽诱导培养基成分：1/2MSB5，0.2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L IBA（吲哚丁酸），300 mg/L头孢霉素，1.25mg/L PPT（草铵膦, 4-[羟基（甲基）膦酰基]-DL-高丙氨酸），0.8％琼脂，pH5.6；

所述生根培养基：1/2MSB5，20g/L蔗糖，1.0mg/L IBA，250mg/L 头孢霉素，0.25mg/L  PPT，0.7％琼脂，pH5.6。

 上述MSB5指MS大量元素、微量元素，B5维生素和B5铁盐。主要成分为：大量元素KNO₃ 1.9 g/L，NH₄NO₃ 16.5 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.44 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.37 g/L, KH₂PO₄·2H₂O 0.17 g/L; 微量元素：KI 0.83mg/L, H₃BO₃ 6.2 mg/L, MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L, ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L, CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L, CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L；B5维生素：烟酸VB₅ 0.1 g/L，肌醇10.0 g/L，盐酸硫胺素VB₁ 1.0 g/L，盐酸吡哆醇（VB₆）0.1 g/L；B5铁盐：FeSO₄·7H₂O 5.56g/L，NaEDTA·7H₂O 7.46 g/L。

上述制备快速转基因大豆植株的方法可以用于制备一般的外源基因转化品种，如外源基因为抗冷冻蛋白基因afp，将其导入农杆菌（优选EHA105菌株），还可以同时导入抗除草剂基因bar作为筛选标记，使后续的筛选工作简便快速。

当外源目的基因为抗冷冻蛋白基因afp，农杆菌菌株为EHA105菌株，且该农杆菌还包括抗除草剂基因bar作为筛选标记时，上述制备方法步骤（2）中携带外源目的基因的农杆菌菌株由以下方法制备：

（1）构建外源基因表达载体：将含有抗冷冻蛋白基因afp的pTHP5质粒和含有bar除草剂抗性基因的pCAMBIA3301质粒进行双酶切，回收含有afp基因的片段和含有bar除草剂抗性基因的目的片段，用DNA连接酶把两片段连接，构建表达载体pCAAFP66，该表达载体含有35S启动子、afp抗冷冻蛋白基因和bar除草剂抗性筛选标记基因，用热激法把载体pCAAFP66转到农杆菌EHA105菌株中，置-80℃保存备用，见文献报道（赵印华，陈颖珊，郭丽琼，覃凤云，林俊芳. pCAAFP66 表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究. 大豆科学，2011,30（4）：541-545）；

（2）筛选：取保存的菌株，在加入筛选抗生素的YEP固体培养基上划平板，培养48h，挑取单菌落接种到含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃、220 r/min培养24 h，即得携带目的基因的农杆菌菌株；

所述抗生素为壮观霉素（浓度优选为100 μg / mL）、链霉素（浓度优选为50 μg / mL）和卡那霉素（浓度优选为50 μg / mL）中的一种或几种；

所述YEP固体培养基成分为：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，质量百分浓度为6%的琼脂，pH 5.8。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）明显缩短转化周期，从农杆菌感染到移土栽培50-60d，比其他方法的转化周期时间缩短10d以上；

（2）制备复合型外植体技术方法简单，步骤明了易于掌握和操作；

（3）复合型外植体再生率高达90%以上；

（4）复合型外植体的转化效率为8%，明显高于已报道的子叶节3%的转化率及胚尖的5%转化率。

附图说明

图1. CEP外植体照片。

图2. 复合型外植体（CEP）种植在预培养培养基上预培养24h。

图3. 质粒pCAAFP66结构示意图，该表达载体含有35S启动子、afp抗冷冻蛋白基因和bar除草剂筛选标记基因。

图4. CEP外植体与农杆菌共培养后转到诱导培养基上培养，图示诱导2周的不定芽。

图5. 不定芽在生根培养基中筛选并生根，图中为筛选获得的大豆转基因植株移栽前的炼苗。

图6. 大豆转基因植株盆栽，生长发育正常，图示植株已开花。

图7. 转基因植株PCR鉴定结果，图中泳道1-10显示有目的基因afp的扩增条带（400bp左右）。

具体实施方式

    以下结合具体实施方式进一步解释本发明，但不对本发明作任何形式的限制。实施例中除作特殊说明外，均为本领域常规实验试剂和实验方法。

实施例1

表1 培养基配方

萌发培养基	30g/L蔗糖和质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8
		预培养基	MSB5，1.0 mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8
YEP固体培养基	10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，质量百分浓度为0.6%的琼脂，pH 5.8
		YEB液体培养基	10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，pH 5.8
共培养基	1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH5.8
		固体共培养	1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L 6- BA，0.5 g/L MES，200μmol/L 乙酰丁香酮，质量百分浓度为0.4%的琼脂，pH 5.8
芽诱导培养基	1/2MSB5，0.2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L IBA（吲哚丁酸），300 mg/L头孢霉素，1.25mg/L PPT，质量百分浓度为0.8％的琼脂，pH5.6
		生根培养基	1/2MSB5，20g/L蔗糖，1.0mg/L IBA，250mg/L 头孢霉素，0.25mg/L  PPT，质量百分浓度为0.7％的琼脂，pH5.6

1. 无菌苗的制备

挑选饱满健康成熟的华春3号大豆种子（购自广州新富农生物科技有限公司），放入含有氯气（由50mL NaClO和2 mL浓HC1反应生成）的密闭容器内，消毒4~6h。在超净工作台上消毒后的大豆种子播种于萌发培养基中，于25~28℃环境下光照培养催芽24h。

2. 复合型外植体（CEP）的获得及再生效果

将无创伤饱满的成熟大豆种子消毒后，在无菌条件下置于萌发培养基中光照培养催芽24h。之后从种子眼处去掉种皮，用解剖刀轻轻掰掉1片子叶，留下一片子叶，接着小心去掉胚尖两侧的第一片真叶，留下刚刚萌动的胚尖，保留完整的下胚轴（包括胚根），所得到的具有完整的下胚轴、胚尖及一片子叶，即为大豆转基因复合型外植体，简称CEP外植体。之后，CEP外植体胚尖朝上垂直播种于预培养基中，进行预培养24~28h，培养结果见图2。不同大豆品种复合外植体的再生效果见表2，表2显示了不同大豆品种CEP外植体的再生率均在90%以上，其中华春3号最高为93.9%。

表2 不同大豆品种复合外植体再生率比较

3. 农杆菌菌液的制备

（1）表达载体pCAAFP66的构建及转化农杆菌EHA105获得工程菌株见文献报道（赵印华，陈颖珊，郭丽琼，覃凤云，林俊芳. pCAAFP66 表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究. 大豆科学，2011,30（4）：541-545.），pCAAFP66 质粒图见图3。

（2）EHA105工程菌株菌液的制备

1) 从新鲜平板上挑取农杆菌EHA105工程菌株的单菌落接种到5mL含有壮观霉素（100 μg / mL）、链霉素（50 μg / mL）和卡那霉素（50 μg / mL）的YEB液体培养基中，28℃、200r/min 振荡培养过夜。

2) 取过夜培养的菌液0.5mL，接种到50mL含与1）中相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min振荡培养，至OD₆₀₀为1.0时停止培养。

3) 取2）中的培养物，在4000 r/min，4℃下离心10min，弃上清，用液体共生培养基重悬菌体至OD600=1.5，即得农杆菌菌液，备用。

4. 转化及筛选

CEP外植体在预培养基上光照预培养24 h后转绿，将已转绿的CEP外植体从预培养基上转移到事先制备好的农杆菌工程菌液(OD₆₀₀=1.5)中，在28℃黑暗环境中轻微振荡侵染21 h。取出CEP外植体，置于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，28℃暗培养5 d。之后取出CEP外植体并用灭菌水反复清洗5~6次，彻底去除附着在CEP外植体表面的农杆菌，用无菌滤纸吸干附着在CEP外植体上的液体，转到芽诱导培养基培养2~3周，每周转接一次，图4为诱导2周的不定芽。待不定芽长到3 cm左右，切下不定芽并转到生根培养基（含0.25mg/L PPT除草剂）中进行筛选并生根培养，可在生根培养基中生根的不定芽视为初转化植株。

5. 移土栽培

待初转化植株根长到足够健壮时敞开瓶口炼苗2~3d（见图5），然后移入培养土中生长。5~8天后幼苗长出两片新叶后，再移栽到温室中生长结实（见图6）。

实施例2 检测抗冷冻蛋白基因的转化率

实施例1制备的转基因大豆植株和非转基因大豆对照植株的PCR检测：取非转基因大豆叶片和转基因大豆叶片1~2片，提取基因组DNA作为PCR模板。目的基因afp的PCR引物如下，扩增片段大小为306bp。:Primer afp F1：5’-AATCGGCACG AGGAAAGACA-3’(SEQ ID NO:1)；Primer afp R1：5’-TGCATCCAGG GCCTGAAATA-3’(SEQ ID NO:2)。反应体系如下：

按上述试剂混匀后，在95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环后在72℃继续延伸10min，4℃保存。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定：

用引物Primer afp F1和Primer afp R1 PCR扩增目的基因afp的结果（见图7）表明，52株大豆转化抗性再生植株中有32株能扩增出大小约为306bp左右的目的基因特异条带，而未转化的阴性对照植株则无这一特异条带。说明目的基因afp已整合在这32株大豆转化抗性再生植株的基因组中。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种制备大豆外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aatcggcacg aggaaagaca                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgcatccagg gcctgaaata                                                 20 

Claims (5)

1.一种制备大豆复合型外植体的方法，其特征在于是将成熟大豆种子消毒，无菌条件下在萌发培养基中光照培养催芽，催芽24h后，从种子眼处去掉种皮，去掉胚尖两侧的第一片真叶，去掉一片子叶，保留包括胚根的完整下胚轴、胚尖及另一片子叶，即为所述大豆复合型外植体；

所述萌发培养基成分为30g/L蔗糖和质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8。

2.根据权利要求1所述制备大豆复合型外植体的方法，其特征在于所述消毒是在含有氯气的密闭容器内熏蒸消毒4~6h。

3.一种制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤如下：

（1）制备大豆复合型外植体：用权利要求1或2所述方法制备大豆复合型外植体，将该外植体胚尖朝上垂直播种预培养基中，预培养24~28h；

（2）携带目的基因的农杆菌转化外植体：将携带外源目的基因的农杆菌在YEB液体培养基中扩大培养，培养液离心，收集沉淀，用共培养基稀释成OD₆₀₀=1.5的菌液，将步骤（1）中预培养后的大豆复合型外植体转移到菌液中，28℃黑暗环境侵染19~23h；

（3）大豆复合型外植体芽诱导：取出侵染后的大豆外植体，置于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，28℃黑暗培养3~7d，再取出，用无菌水洗去附着在其表面的农杆菌，无菌滤纸吸干表面附着的液体，转到芽诱导培养基培养2~3周，每周转接一次，培养至外植体长出不定芽；

（5）生根培养及炼苗：将芽诱导培养基上的外植体不定芽转到生根培养基生根培养，根健壮时敞开瓶口炼苗2~3d，移入培养土中，待幼苗长出两片新叶后，再移栽到温室中；

所述预培养基成分：MSB5，1.0 mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8；

所述YEB液体培养基成分：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，pH 5.8；

所述共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH5.8；

所述固体共培养基成分：1/2MSB5，30 g/L葡萄糖，6.0 mg/L BA，0.5 g/L MES，200μmol/L 乙酰丁香酮，0.4%琼脂，pH 5.8；

所述芽诱导培养基成分：1/2MSB5，0.2 mg/L 6-BA，0.2 mg/L IBA，300 mg/L头孢霉素，1.25mg/L PPT，0.8％琼脂，pH5.6；

所述生根培养基：1/2MSB5，20g/L蔗糖，1.0mg/L IBA，250mg/L 头孢霉素，0.25mg/L  PPT， 0.7％琼脂，pH5.6。

4.根据权利要求3所述制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤（2）中携带外源目的基因的农杆菌菌株是EHA105，外源目的基因为抗冷冻蛋白基因afp，该农杆菌还包括bar除草剂抗性基因作为筛选标记。

5.根据权利要求4所述制备快速转基因大豆植株的方法，其特征在于步骤（2）中携带外源目的基因的农杆菌菌株由以下方法制备：

（1）构建外源目的基因表达载体：构建表达载体pCAAFP66，该表达载体含有35S启动子、afp抗冷冻蛋白基因和bar除草剂抗性筛选标记基因；

（2）外源目的基因转化农杆菌：用热激法把载体pCAAFP66转到农杆菌EHA105菌株中，置-80℃保存备用；

（3）筛选：取保存的菌株，在加入抗生素的YEP固体培养基上划平板，培养48h，挑取单菌落接种到含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃、220 r/min培养24 h，即得携带目的基因的农杆菌菌株；

所述抗生素为壮观霉素、链霉素和卡那霉素中的一种或几种；

所述YEP固体培养基成分为：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，质量百分浓度为6%的琼脂，pH 5.8。

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