CN103525864A

CN103525864A - 转化大豆的方法

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Publication number: CN103525864A
Application number: CN201310546099.0A
Authority: CN
Inventors: 贾志伟; 刘雁华
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN103525864B

Abstract

本发明涉及一种转化大豆的方法，包括：大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。本发明转化大豆的方法首次公开了将预处理后的大豆分生组织块作为外植体材料；在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，易于外源基因的插入，同时通过分生组织的增值变大，使得侵染过程更加便于操作；在农杆菌侵染过程中，加入了超声波处理，使外源基因插入植物基因组的效率大大增加，大豆的转化效率可达10%；同时转化周期短、嵌合体少、转化成本低。

Description

转化大豆的方法

技术领域

本发明涉及一种植物转化的方法，特别是涉及一种转化大豆组织的方法。

背景技术

大豆（Glycine max）起源于中国，是植物蛋白质的主要来源，也是中国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，种植面积仅次于水稻、玉米和小麦，居第四位。为了提高大豆耐除草剂、抗病虫害及生理逆境的能力、改善大豆品质、增加大豆产量，除了采用传统的育种方法外，可通过基因工程手段实现有目的的遗传工程改良。

大豆的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法、电击法、PEG法、显微注射法、超声波辅助法和花粉管导入法等，其中农杆菌介导法为大豆常用的转基因方法。而农杆菌介导法不仅受到植物基因型依赖和菌株特异性的限制，不同的大豆受体系统也是大豆遗传转化的重要环节，目前常用的大豆受体系统主要有：

（1）子叶节受体系统：大豆转化过程中运用最早最普遍的就是子叶节受体系统（Hinchee et al.,1988）。该系统是将发芽5天左右的大豆在下胚轴离子叶3-5mm处横切，然后将两片子叶纵切开，去掉上胚轴部分。这种受体系统的特点是：没有经过愈伤组织阶段直接分化成不定芽；得到再生苗时间短，一般3个月就可得到生根的植株；再生频率高等。由于这些特点，它受到很多大豆分子育种工作者的青睐，但运用这种方法在切子叶节时需要进行精心人工操作，且不定芽常起源于多细胞，所形成的再生植株有较多的嵌合体，加大了后代的筛选难度，子叶节受体系统的转化效率较低。

（2）大豆胚尖受体系统：大豆胚尖受体系统是将发芽1天的大豆剥去种皮，将两片子叶从胚轴上剥掉，去掉真叶，再用农杆菌侵染胚尖。大豆胚尖再生系统既可以用幼胚胚尖，也可以用成熟胚的胚尖。它的特点是得到再生苗时间短，1-2个月就可以得到再生植株，且再生植株嵌合体少。基于上述特点，越来越多的研究者采用这种方法。但这种方法在农杆菌侵染阶段的技术难度较高，筛选时较困难，且得到的转化子较少。

（3）体细胞胚受体系统：这种方法是经体细胞发生形成的在形态和功能上类似于有性胚的结构，然后以其为转化受体。现在主要以未成熟胚的子叶为外植体，经过诱导后形成体细胞胚。这种受体系统的特点是：体细胞胚的形成与大豆基因型有很大关系，一旦形成体细胞胚后可以大量扩繁，受体数量多，易于转化，但起源于多细胞，增加了筛选的难度。

（4）半子叶受体系统：用子叶作为受体系统是Paz等于2005年首先提出来的，这种方法是将用水浸泡过夜的大豆种子，剥去种皮后，将胚轴部分去掉，留下子叶，然后将子叶与农杆菌共培养。这种方法避免了由于子叶节划伤时需要精心操作的人为因素影响，使操作更简单；但这种转化方法出苗困难，转化效率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化大豆的方法，有效克服现有技术技术难度高、筛选难度大、嵌合体较多、转化效率偏低等技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种转化大豆的方法，包括：

大豆种子萌发后去除子叶和第一片真叶，获得裸露的分生组织；

所述裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基上进行预处理；

农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块。

优选地，所述细胞分裂素为1mg/L6-苄基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一种或任意组合。

进一步地，所述预处理培养基还包括乙酰丁香酮。

更进一步地，所述转化大豆的方法还包括所述预处理后的分生组织块创伤后进行超声波处理2-4分钟。

在上述技术方案的基础上，所述转化大豆的方法还包括超声波处理后的分生组织块在含有选择剂的培养基上培养，所述选择剂是草丁膦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种生产稳定转化的大豆植物的方法，包括：

农杆菌侵染所述预处理后的分生组织块；

侵染后的分生组织块与所述农杆菌共培养；

在含有选择剂的培养基上培养并选择转化的抗性组织；

转化的抗性组织再生为大豆植物。

进一步地，所述预处理培养基还包括乙酰丁香酮。

更进一步地，所述选择剂是草丁膦。

在上述技术方案的基础上，所述生产稳定转化的大豆植物的方法还包括所述预处理后的分生组织块创伤后进行超声波处理2-4分钟。

本发明中的克隆基因、表达盒、载体（例如质粒）、蛋白和蛋白片段、以及转化的细胞核植物均可使用标准方法生产。

本发明可用于在大豆植物中表达任何目的基因。目的基因可以是耐除草剂基因、抗病基因或抗虫基因，或者是选择或评价标记，并含有植物可操作的启动子、编码区和终止子区。耐除草剂基因包括对咪唑啉酮或磺酰脲除草剂耐受的AHAS基因、对草丁膦除草剂耐受的pat或bar基因、对草甘膦除草剂耐受的EPSPS基因等。抗病基因包括抗生素合成酶基因，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物来源的抗性基因等。抗虫基因包括苏云金芽孢杆菌杀虫基因。目的基因也可以编码与生物化学途径有关的酶，该酶的表达可改变食物、饲料、营养药和/或药物生产中重要的性状。目的基因可以位于质粒上。适合本发明使用的质粒可以含有一个以上目的基因和/或农杆菌可含有带有不同目的基因的不同质粒。

本发明中所述“大豆”是指Glycine max，所述方法是以农杆菌介导的目的基因传输到大豆细胞，之后再生为转化的大豆植物为基础的。本发明的方法独立于栽培品种。

在选择剂存在的情况下培养转化的大豆细胞。优选地，用草丁膦乙酰转移酶（PAT）基因转化，并且转化的基因在草丁膦存在的情况下培养。在含有草丁膦为选择剂的培养基中，PAT基因转化的大豆细胞选择性生长。

含有异源核酸（即含有按照本发明的方法转化的细胞或组织）的转基因植物以及通过该转基因植物产生的种子和后代是本发明所涉及的。将转化的细胞培养成有用栽培品种的方法是本领域技术人员公知的。植物组织体外培养技术和整个植株再生技术也是公知的。相应的，所述“种子”包括这些转化植物的种子以及转化植物后代产生的种子。所述“植物”不仅包括转化和再生的植物，还包括通过本发明的方法产生的转化和再生植物的后代。

可以从本发明的方法产生的植物中筛选成功的转化植物。为了开发改良的植物和种子品系，可以持续地筛选和选择本发明再生植物的种子和子代植物以使转基因和整合的核酸序列持续存在。因此，可以将所需要的转基因核酸序列移入（即渐渗或交配）其它的遗传品系如某些原种或商业上有用的品系或品种中。渐渗目的基因进入遗传植物品系的方法可通过本领域公知的多种技术来实现，包括通过传统的育种、原生质体融合、细胞核转移以及染色体转移。育种方法和技术也是本领域公知的。根据本发明获得的转基因植物和自交系可用于生产商业上有价值的杂交植物和农作物。

本发明提供了一种转化大豆的方法，具有以下优点：

1、新颖的外植体材料。本发明转化大豆的方法首次公开了将成熟的大豆种子在萌发培养基中萌发1天后进行预处理，将预处理后的大豆分生组织块作为外植体材料。

2、农杆菌侵染过程简单便利。本发明转化大豆的方法在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，同时通过分生组织的增值变大，使得侵染过程更加便于操作。

3、转化效率高、转化周期短、嵌合体少。本发明转化大豆的方法在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，易于外源基因的插入；同时在农杆菌侵染过程中，加入了超声波处理，使外源基因插入植物基因组的效率大大增加，大豆的转化效率可达10%。

4、转化成本低。本发明转化大豆的方法通过简便侵染过程，提高转化效率，实现了遗传转化过程中各环节转化成本的降低。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明转化大豆的方法的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图2为本发明转化大豆的方法的重组表达载体DBN100024构建流程图；

图3为本发明转化大豆的方法的转化大豆组织的效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明转化大豆的方法的技术方案。

第一实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有目的基因的重组克隆载体

将PAT核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；PAT为草丁膦乙酰转移酶基因核苷酸序列（SEQ ID NO:1）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体DBN01Ab-T），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100mg/L）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入150μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（4M醋酸钾，2M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经ApaI和EcoRV酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的PAT基因序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2、构建含有目的基因的重组表达载体

用限制性内切酶HindIII和KasI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的PAT基因序列插到表达载体DBNBC-01的HindIII和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100024，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:2）；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因核苷酸序列（SEQ ID NO:1）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ IDNO:3）；LB：左边界）。

将重组表达载体DBN100024用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体DBN100053），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶HindIII和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100024在HindIII和KasI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即PAT核苷酸序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100024用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶ApaLI和EcoRV酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100024结构完全正确。

第二实施例、转基因大豆植株的获得

大豆种子萌发：将成熟的大豆种子（中黄13）100粒接种在大豆萌发培养基（B5盐3.1g/L，B5维他命，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.6）上进行萌发，培养条件为：温度25±1℃，光周期为16/8h。

预处理：萌发1天后，去除子叶和第1片真叶，将该裸露的分生组织接种到含有细胞分裂素的预处理培养基（MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、琼脂8g/L、2-吗啉乙磺酸（MES）4g/L、玉米素（ZT）2mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BAP）1mg/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L，pH5.3），在此步骤中加入了细胞分裂素，使分生组织区的细胞处于活跃状态，同时在培养基还加入了AS，预处理3天，将预处理后的组织块用解剖刀的刀背进行创伤5刀，创伤后进行超声波处理3分钟。

农杆菌菌液的制备：挑取含有DBN100024的农杆菌单菌落，用枪头在加有卡那霉素（Kanamycin）的固体YP培养板（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g、卡那霉素100mg/L）上划线，在28℃黑暗条件下培养2-3天。刮取YP培养板上的菌斑，在新的YP培养板上再培养1天，刮取培养3-4天的菌落，悬浮在5ml的侵染液（即侵染培养基（MS盐2.15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2-吗啉乙磺酸（MES）4g/L、玉米素（ZT）2mg/L，pH5.3））中，将农杆菌菌液混匀，将其浓度调整为OD₆₆₀=0.5-0.8。

农杆菌侵染大豆分生组织块：将农杆菌菌液（10-15ml）与大豆分生组织块（100个）一起放置至少3小时；侵染结束后将农杆菌菌液吸出，并用滤纸将附着在大豆分生组织块上的农杆菌菌液彻底吸干。

农杆菌与大豆分生组织块共培养：将吸干农杆菌菌液的分生组织块转移到共培养培养基（MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-吗啉乙磺酸（MES）4g/L、玉米素（ZT）2mg/L、琼脂8g/L，pH5.6）上，分生组织块与农杆菌共培养3天。

大豆分生组织块的恢复：将共培养后的分生组织块转移到恢复培养基（B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸（MES）1g/L、蔗糖30g/L、玉米素（ZT）2mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5.6）上，恢复3天，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。

大豆分生组织块的筛选：恢复期结束后，将分生组织块转移到筛选培养基（B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸（MES）1g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤（6-BAP）1mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，草丁膦6mg/L，pH5.6）上，导致转化的细胞选择性生长，筛选3周后获得抗性组织块（100个）。

大豆抗性组织块再生成植物：将抗性组织块转移到B5分化培养基（B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸（MES）1g/L、蔗糖30g/L、玉米素（ZT）1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生长素1mg/L、草丁膦6mg/L，pH5.6）上，25℃下培养分化3周；分化出来的小苗转移到B5生根培养基（B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸（MES）1g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸（IBA）1mg/L）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养。在温室中，每天于26℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时，可以获得转基因植株。

第三实施例、用TaqMan验证转入PAT核苷酸序列的大豆植株

取转入PAT核苷酸序列的大豆植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PAT基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测PAT基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、取转入PAT核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop2000（Thermo Scientific）测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测PAT核苷酸序列：

引物1（PF1）：CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQ IDNO:4所示；

引物2（PR1）：TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQID NO:5所示；

探针1（PP1）：CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQ IDNO:6所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，PAT核苷酸序列整合到所检测的大豆植株的染色体组中的阳性植株为10株，转化效率可达10%，如表1和图3所示。

表1、大豆转化效率的实验结果

起始萌发大豆种子数量（个）	阳性植株数（株）	转化效率（%）
			100	10	10

综上所述，本发明转化大豆的方法首次公开了将成熟的大豆种子在萌发培养基中萌发1天后进行预处理，将预处理后的大豆分生组织块作为外植体材料；在农杆菌侵染之前通过对外植体材料进行高浓度的细胞分裂素处理，使得大豆的分生组织处于活跃状态，易于外源基因的插入，同时通过分生组织的增值变大，使得侵染过程更加便于操作；在农杆菌侵染过程中，加入了超声波处理，使外源基因插入植物基因组的效率大大增加，大豆的转化效率可达10%；同时转化周期短、嵌合体少、转化成本低。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。