CN109385446B - 一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法 - Google Patents

一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，包括如下步骤：1)获得携带目的基因的发根农杆菌菌苔，利用液体共培养培养基悬浮菌苔，调节OD600值在0.6～1.0；2)将在萌发培养基中萌发的大豆种子沿种脐剖开获得半种子，将半种子放入步骤1)制备的含有悬浮菌苔的液体共培养培养基中，侵染15～30min；3)步骤2)侵染后的半种子布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天；4)步骤3)共培养后的半种子切去根部，布于培养基中，23～25℃黑暗培养，长出根后，选取长度为4～6cm的阳性根切下单独培养。本发明所述方法操作时间短，简单高效，发根率高，阳性率高；且外植体不容易被农杆菌和其他杂菌污染。

Description

一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法。
背景技术
发根农杆菌(Agrobacteriam rhizogenes)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够感染大多数双子叶植物。植物被发根农杆菌侵染后会产生许多生长迅速的不定根，称为毛状根或发状根[4]。发根农杆菌在植物转基因研究中具有重要的应用价值,其通过植物伤口感染，其T-DNA随机插入宿主细胞染色体中，与宿主细胞的基因共同表达，诱导植物产生毛状根[1]。
早在1907年Smith和Townsend发现发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)能诱导植物形成毛状根(hairyroot),1934年Hildebrand在对苹果树的研究中再次阐述了该现象[2]。对发根农杆菌真正意义上的深入研究应追溯到1982年Chilton报道在发根农杆菌侵染植物的过程中，在感染部位上或附近能产生大量副产物——发状根[3]。这种发状根又称毛状根,毛状根是由发根农杆菌含有的Ri(root inducing)质粒引起的[5]。自从Ri质粒被人们发现并认识以来,它已广泛应用于植物基因工程、植物品种改良、植物次生代谢产物生产和植物栽培等领域,显示出了极其广阔的应用前景。
野生型发根农杆菌K599是由澳大利亚学者Allen Kerr从土壤中分离而得[5]，Savka M A等和Cho H J等用9个起源于美国的大豆基因型和1个起源于我国的野生大豆基因型(Peking)作为材料,研究发现K599能有效地诱导大豆离体子叶生根[6]。
目前，发根农杆菌侵染大豆的的方法分为针刺注射法和子叶侵染法。但上述方法操作繁琐，容易被农杆菌及其他杂菌污染，而且假阳性率高。其中，针刺注射法是利用注射器将侵染菌液注射入生长一周左右大豆子叶、茎等部位。该方法发根数量较少，假阳性较高，环境条件影响较大。子叶侵染法是将生长一周左右的无菌苗子叶切下，并在子叶背部做物理切伤，并与菌液共培养。该方法操作繁琐，容易被农杆菌及其他杂菌污染。
因此，寻找一种利用组织培养的方法，在实验室条件下规模化进行转化大豆工作，且操作要求低、转化效率高的转化方法尤为重要。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种简单的农杆菌介导大豆根毛转化方法。本发明所述方法操作时间短、简单、高效，相比于针刺注射法，发根率较高，且阳性率较高；相比于子叶侵染法，操作简单，外植体不容易被农杆菌和其他杂菌污染。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，具体包括如下步骤：
1)获得携带目的基因的发根农杆菌菌苔，利用液体共培养培养基悬浮菌苔，调节OD600值在0.6～1.0；
2)将在萌发培养基中萌发的大豆种子沿种脐剖开获得半种子，将半种子放入步骤1)制备的含有悬浮菌苔的液体共培养培养基中，侵染15～30min；
3)步骤2)侵染后的半种子布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天；
4)步骤3)共培养后的半种子切去根部，布于培养基中，23～25℃黑暗培养，长出根后，选取长度为4～6cm的阳性根切下单独培养。
本发明步骤1)中OD600值在0.6～1.0这个区间，农杆菌的侵染效率高，若低于这个区间，侵染效率会明显下降，若超过这个区间，对大豆会产生毒害作用。
本发明步骤1)所述液体共培养培养基可以为现有技术中常用的侵染体系，为了提高侵染活性，增加侵染效率，本发明提供一种具体的液体共培养培养基配比：CCM基本培养基中加入0.03～0.05g/L乙酰丁香酮(AS)、0.2～0.3mg/L赤霉素(GA3)、0.15～0.16g/L二硫苏糖醇(DTT)、55～60mg/L的L-半胱氨酸和120～122g/L的NaOH，优选的更为具体的配比为：CCM基本培养基中加入0.04g/L乙酰丁香酮(AS)、0.25mg/L赤霉素(GA3)、0.154g/L二硫苏糖醇(DTT)、58mg/L的L-半胱氨酸和120g/L的NaOH。
本发明步骤1)中所用的农杆菌菌苔可以为接到根毛转化常用的农杆菌菌株，如K599菌株。
本发明步骤2)中侵染15～30min，可以获得最高的侵染效率，当低于此区间，侵染效率明显下降，超过此区间不但会造成对大豆的毒害作用，且转移到空培养容器中后，农杆菌也难以抑制；侵染优选的条件为70～90rpm摇床中侵染15～30min。
本发明步骤2)中萌发培养基可以选用常规的用于种子萌发的培养基，如GM固体培养基，本发明选用萌发培养基萌发的大豆种子，在后续剖开的过程中，不容易切烂，且若大豆种子有污染，在培养基中会长出菌落，可容易被发现，及时剔除；为了获得有利于农杆菌侵染的萌发状态，本发明提供一种大豆种子萌发的方法：灭菌的大豆种子种脐向下插入萌发培养基至种子2/3处，23～25℃黑暗培养15～17h，按照这种方法萌发的大豆种子处于吸涨并萌动的状态，有利于农杆菌的侵染。
本发明步骤2)中半种子侵染之前，优选将胚芽去除，申请人发现，胚芽去除有利于根毛的生长。
本发明步骤3)中侵染后的半种子布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天，优选5天，在这个时间内，不但可以使农杆菌侵染入大豆细胞并整合入染色体，而且可以保证根毛高效率转化。
优选的，本发明步骤3)中侵染后的半种子去除种皮后布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天，发明人发现，去掉种皮不但可以降低污染率，且可以避免后续步骤4)中种皮影响子叶对培养基营养的吸收，提高根诱导率。更优选的，本发明步骤3)中侵染后的半种子去除种皮后，曲面向下布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天，曲面向下一方面容易夹取便于操作，另一方面可以减少与培养容器的接触面积，有利于抑制农杆菌的生长。
本发明步骤4)中，半种子切去根部的方法优选为，切去根部只保留距胚轴0.8～1.2cm的下胚轴，采用这种方法可以抑制大豆根部侧根的形成，消除大豆本身形成的侧根对发根农杆菌诱导形成的根毛造成的干扰，提高发根率，提高阳性根毛的数量，可以为后续实验处理提供大量的阳性根毛。
本发明步骤4)中所用的培养基可以为常用的培养根毛的培养基，如white培养基。
本发明步骤4)中23～25℃黑暗培养，可以2个星期继代一次，通常7天长出愈伤组织，10天长出根，选取长度为4～6cm的阳性根毛切下单独培养。
本发明相对于现有技术的优势：
1)本发明利用大豆下胚轴作为发根的外植体，提高了发根率，而且提高了阳性根毛的数量，为后续实验处理提供了大量的阳性根毛。
2)利用组培技术，可以在可控的环境下为根毛生长提供适宜的生长环境，排除了外界环境对根毛生长的影响，为后续实验处理消除了环境的因素。
3)并且本发明操作时间短、简单、高效，相比于针刺注射法，发根率较高，且阳性率较高；相比于子叶侵染法，操作简单，外植体不容易被农杆菌和其他杂菌污染。
附图说明
图1根毛转化所使用载体图；
图2为本发明所述的农杆菌介导大豆根毛转化方法流程图；
图3为根毛转化后荧光体视镜观察图；
图4为单个阳性根毛荧光体视镜观察图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
本发明实施例所用的基础培养基配方(1L)：
(1)GM培养基
Figure BDA0001378130400000041
Figure BDA0001378130400000051
(2)CCM基本培养基
Figure BDA0001378130400000052
(3)White培养基
Figure BDA0001378130400000053
实施例1
如图2所示的农杆菌介导大豆根毛转化方法，包括如下步骤：
1.大豆萌发
将灭好菌的豆子种于GM固体培养基中，豆子种脐向下插入培养基至种子2/3处。一皿20粒左右，用封口膜封培养皿，至于培养箱中23℃黑暗培养16h。
2.农杆菌制备
将阳性K599菌株菌液吸取400～500μl涂布在含有25mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的平板中，28℃培养36～48h长出菌苔。
3.侵染液制备
将液体CCM基本培养基(以200ml为例)在使用前加入AS(称取0.008g用20μl二甲基亚砜溶解后加入)、GA3(母液0.5mg/ml加入100μl)、DTT(母液154.2mg/ml加入200μl))、L-半胱氨酸(母液580mg/ml加入200μl)、NaOH(母液1M加入600μl)，摇匀后向灭菌的锥形瓶中倒出50ml备用。用药匙刮取培养好的菌苔，放入CCM液体培养基中，磁力搅拌将菌苔打匀。用分光光度计测量OD600，调节OD600使其在0.6～1.0。将制备好的侵染液倒入灭菌的培养皿中。
4.侵染豆瓣
用手术刀将豆子纵切，将豆子切开后用刀将胚芽去除，并放入CCM液体培养基中(培养基没过豆子)，用封口膜封培养皿于80rpm摇床中共培养20min左右(15～30min)。将侵染过的豆瓣去掉种皮转入空培养皿中，封口膜封好(曲面朝下，每皿10个豆瓣)，入培养箱中23℃黑暗培养5天。
5.根诱导
把共培养5天后的豆瓣取出，切去根部只保留距胚轴1cm左右的下胚轴，而且用刀切除未去净的幼芽。将切好的豆瓣平铺在White培养基中。用医用胶带封好放入培养箱中23℃黑暗培养，2个星期继代一次。7天长出愈伤组织，10天长出根，选取长度为5cm左右的阳性根毛切下单独培养。
实验结果：
1)实施例1所述方法诱导的阳性根毛的荧光体视镜观察图
实施例1根毛转化所使用载体图如图1所示，这个载体名称是pBinGFP4，质粒带有35S启动子、Nos终止子和GFP绿色荧光蛋白，阳性根毛在荧光体视镜下可以观察到绿色荧光。
使用实施例1所述方法转入white培养基培养两周，使用荧光体视镜观察根毛荧光观察结果如图3所示，左侧为绿色荧光下观察结果，右侧为明场下观察结果。使用实施例1所述方法侵染后阳性根毛切下单独培养在荧光体视镜下观察结果如图4所示，左侧为绿色荧光下观察结果，右侧为明场下观察结果。
2)实施例1所述方法与子叶侵染法的对比
对比所用的子叶侵染法实验方法，所述对比结果如表1所示：
1.外植体处理
1)将灭菌大豆用无菌水浸泡过夜；
2)剥去大豆种皮，种植于固体琼脂水中，一周；
3)切下大豆子叶，并在大豆子叶凸面用手术刀做物理切伤；
4)将处理好的大豆子叶平铺于white培养基中。
2.菌液处理
1)将含有目的质粒的发根农杆菌K599菌株接种于含有相应抗生素的YEP培养基中，28℃、180rpm培养至OD600＝0.6；
2)5500rpm离心2min,弃上清，用10Mm MgCl2悬浮，调整OD600在0.6-1.0之间。
3.侵染
将处理好的菌液滴到平铺于white培养基上大豆子叶的伤口处，待菌液被伤口吸收后用封口膜封好培养皿，置于23～25℃黑暗培养，2周换一次培养基。
表1实施例1所述方法与子叶侵染法所用方法的数据对比
实施例1 子叶侵染法
发根数(1个外植体) 10 4
阳性根毛数(1个外植体) 8 2
发根数(20皿，每皿10个外植体) 1632 786
阳性根毛数(20皿，每皿10个外植体) 1487 421
阳性率(20皿，每皿10个外植体) 91％ 54％
污染皿数(120皿，每皿10个外植体) 4 50
污染率(120皿，每皿10个外植体) 3.3％ 41.6％
综上可见，实施例1所述方法操作时间短、简单、高效，发根率高，阳性率高且外植体不容易被农杆菌和其他杂菌污染。

Claims (8)

1.一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）获得携带目的基因的发根农杆菌菌苔，利用液体共培养培养基悬浮菌苔，调节OD600值在0.6～1.0；所述液体共培养培养基的配比为：CCM基本培养基中加入0.03～0.05g/L乙酰丁香酮、0.2～0.3mg/L赤霉素、0.15～0.16g/L二硫苏糖醇、55～60mg/L的L-半胱氨酸和120～122g/L的NaOH；其中每升的CCM基本培养基的配比为0.1×B5盐，0.1×B5有机，MES3.9g，蔗糖30g，pH5.4；
2）将在萌发培养基中萌发的大豆种子沿种脐剖开获得半种子，将胚芽去除后将半种子放入步骤1）制备的含有悬浮菌苔的液体共培养培养基中，侵染15～30min ；
3）步骤2）侵染后的半种子布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天；
4）步骤3）共培养后的半种子切去根部只保留距胚轴0.8～1.2cm的下胚轴，布于培养基中，23～25℃黑暗培养，长出根后，选取长度为4～6cm的阳性根切下单独培养。
2.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤1）所述液体共培养培养基的配比为：CCM基本培养基中加入0.04g/L乙酰丁香酮、0.25mg/L赤霉素、0.154g/L二硫苏糖醇、58mg/L的L-半胱氨酸和120g/L的NaOH。
3.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤2）中侵染条件为70～90rpm摇床中侵染15～30min。
4.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤2）中萌发培养基为GM固体培养基；每升的GM固体培养基的配比为1×B5盐，1×B5有机，1×铁盐，蔗糖20g，琼脂8g，pH5.8。
5.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤2）中大豆种子萌发的方法：灭菌的大豆种子种脐向下插入萌发培养基至种子2/3处，23～25°C黑暗培养15～17h。
6.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤3）中侵染后的半种子去除种皮后布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天。
7.根据权利要求6所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤3）中侵染后的半种子去除种皮后，曲面向下布于空培养容器中，23℃黑暗共培养5天。
8.根据权利要求1所述的高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，其特征在于，步骤4）中所用的培养基为white培养基。
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