CN115044606B - 一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法，属于植物基因工程技术领域。该方法包括以下步骤，培养得到待侵染外植体；制备农杆菌侵染液；切根侵染；鉴定筛选得到枣遗传转化苗。本发明采用发根农杆菌作为介导，以枣幼苗作为繁殖材料进行侵染，可获得在枣根部特异表达的转基因材料，解决了在枣树遗传改良和基因功能分析方面的问题。该方法操作简便，低成本，转化率高，重复性好且周期短，加速了枣功能基因的研究进程。这对在枣本体相关功能基因的表达体系研究上具有重大意义。

Description

一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法。
背景技术
枣(Ziziphusjujuba Mill.)属于鼠李科枣属植物，为药食同源的典型代表，枣果营养价值高，药理作用众多，多年来被用作食品和传统中药。枣在长期的驯化过程中，产生了大量的遗传变异，目前已记载的枣品种有700多种。而在枣树育种过程中，因其胚败育率高，枣花小且去雄困难，大大限制了传统育种在枣树上的应用；同时枣树为多年生的木本植物，世代周期长，杂合度较高，使得对杂交育种工作造成极大困难。并且长期以来，育种工作者只注重从现有品种产生的芽变材料中挖掘优良性状，尚缺少实生选育品种及利用转基因等技术手段创制的新品种，致使优良性状和基因难以快速整合。目前，遗传转化技术在果树育种中逐渐处于主导地位，也为果树育种提供了新的方向。
关于枣树转基因的报道极少，这与其他果树相比，如苹果、梨和柑橘等，枣树在遗传转化方面的研究仍然处于起步阶段，面临不少问题。目前现有技术中大部分均采用枣茎尖以及叶片作为外植体获得转基因株系，而这种方法都存在如枣转化效率偏低，嵌合体现象严重，受体系统不容易建立，且功能基因的遗传转化未得到实践验证等问题。
毛状根作为一种在植物次生代谢产物方面的研究工具被广泛应用，具有独特的优势和前景。同时，毛状根也可以作为基因功能研究的载体，通过发根农杆菌的介导，使得其成为一种快速高效的转基因方法。而常规的农杆菌构建方法需要进行无菌苗的培养、愈伤组织的诱导分化以及继代和生根培养，获得转基因植物周期长且操作繁杂，效率不高。目前借助发根农杆菌已成功实现烟草、大豆、水稻、苹果和梨等植物的遗传转化，并获得了高抗性、高产量的转基因植株。然而在枣上还没有发根农杆菌遗传转化的报道，缺乏高效快速的遗传转化体系和方法。因此有必要建立一套枣毛状根遗传转化体系的方法，要求操作简便，低成本，转化率高，重复性好且周期短，解决在枣树遗传改良和基因功能分析方面的问题，从而加速枣功能基因的研究进程。这对在枣本体相关功能基因的表达体系研究意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过发根农杆菌作为介导，以枣幼苗作为繁殖材料进行侵染，可获得在枣根部特异表达的转基因材料，解决了在枣树遗传改良和基因功能分析方面的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法，包括以下步骤：
S1、枣种子播种，培养后获得待侵染外植体；
S2、含有外源基因的重组质粒转入发根农杆菌感受态细胞中，培养得到农杆菌侵染液；
S3、将所述待侵染外植体的根部放置于所述农杆菌侵染液中，抽真空侵染；
S4、浸染后的外植体培养后，得到含有所述外源基因枣遗传转化苗。
进一步的，步骤S1的具体操作包括：枣种子经消毒处理后播种，培养两周后切除须根，并对主根和下端茎部进行划伤处理。
进一步的，播种后的培养条件为24℃，16h光照/8h黑暗。
进一步的，所述消毒处理为用次氯酸钠溶液进行消毒处理。
进一步的，在步骤S2中，所述含有外源基因的重组质粒为pcambia2300-35S-EGFP，所述发根农杆菌感受态细胞为发根农杆菌K599感受态细胞。
进一步的，在步骤S2中，所述重组质粒转化进入所述发根农杆菌感受态细胞采用的方法为冻融法。
进一步的，在步骤S4中，所述培养包括共培养和生根培养。
进一步的，在步骤S4中，所述共培养为将浸染后的枣苗扦插到浇透水的育苗基质中，黑暗培养2天。
进一步的，在步骤S4中，所述生根培养为将侵染枣苗转移至光照培养箱中正常培养，每隔3天浇透水。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用含35S::EGFP报告基因的发根农杆菌K599菌液浸染枣实生小苗，获得根部转化的嵌合体转基因植株，不仅可以大大缩短转化周期，且能够长期稳定表达；获得的毛状根可应用于枣基因功能的鉴定(包括被转化基因表达量的检测以及枣物质含量的检测等)，同时可以为在枣根部特异表达的功能物质的积累研究提供一条新的途径。并且，本发明所建立的枣毛状根遗传转化体系，获得了适宜枣毛状根体系诱导的实生苗苗龄、农杆菌菌株、侵染体系及毛状根培养条件等，加速了枣功能基因的研究进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为枣实生苗在基质中生长状态示意图；
图2为枣外植体准备、切除根系图；
图3为含有35S::EGFP的载体pcambia2300质粒的质粒图谱；
图4为枣实生小苗侵染后培养30天获得毛状根的生长状态示意图；
图5为PCR扩增检测结果验证图。其中，1-10均为检测阳性的毛状根；+为质粒阳性对照；-为未侵染的实生苗根(阴性对照)；M，DNA标准分子量2000；
图6为转化的枣毛状根中在488nm激发光下可以观察到EGFP的绿色荧光信号，其中CK为对照组(未侵染的实生苗根)，35S::EGFP为实验组(发根农杆菌注射侵染后的枣实生苗)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，含有35S::EGFP的载体pcambia2300质粒由本实验室保存；发根农杆菌K599感受态细胞购自于上海唯地生物技术有限公司。
实施例1一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法
S1、外植体准备：首先挑选已成熟且生长饱满、正常的枣种子，用次氯酸钠溶液进行消毒处理，然后用无菌水冲洗3遍(3-5可达相同效果)，播种在经高温高压灭菌后的营养基质(蛭石和草炭按照3：1的质量比例混合)中并浇透水，放置光照培养箱中培养(24℃，16h光照/8h黑暗)。待生长两周后，切除已经长出的须根，并对主根和下端茎部进行划伤，获得待侵染外植体(见图1，图2)。
S2、农杆菌侵染液的制备：含有35S::EGFP的载体pcambia2300质粒(即图3中的pcambia2300-GFP)，质粒图谱详见图3。将测序验证准确的报告基因35S::EGFP采用冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞，涂布在含卡那霉素(50mg/mL)和链霉素(50mg/mL)的TY平板上，28℃培养2天，挑取单菌落，转入2mL含卡那霉素和链霉素的TY液体培养基中，于28℃恒温培养箱中以220rpm的转速培养12h后进行菌液PCR检测，对检测结果为阳性的菌液进行扩大培养，吸取200μL菌液到20mL含卡那霉素和链霉素的TY液体培养基中，在28℃恒温培养箱中以220rpm的转速培养24h左右，此时菌液OD600为1.2。然后6000rpm室温离心2分钟收集菌液，弃上清，使用重悬液(10mM MES，pH＝5.6，10mM MgCl2，150mMAs)清洗两次，最后加入10mL重悬液重悬菌体，调至菌液浓度OD600＝0.75即可，获得农杆菌侵染液备用。
S3、外植体侵染：将之前准备好并已经切除根系的枣苗根部用无菌水清洗干净，放入已灭菌的小烧杯中，根部向下竖直摆放，倒入农杆菌侵染液中，1.0MPa抽真空20min。
S4、共培养：抽真空结束后，将枣实生苗捞出，吸干菌液，扦插于浇透水的育苗基质中后暗培养2d。
S5、生根培养：将侵染枣苗转移至培养条件为24℃-28℃温度环境中光照16小时、暗培养8h正常培养，每隔3天浇透水，保证水分充足，培养30天后观察。结果发现有大量毛状根的形成，见图4。
S6、毛状根鉴定1：取诱导后长出新根的枣苗，切取毛状根，在液氮中速冻后并研磨成粉末，使用CTAB法提取组织DNA进行PCR扩增检测。EGFP检测引物F(35s):GACGCACAATCCCACTATCC,R(M13F):TGTAAAACGACGGCCAGT，PCR产物约1520bp。反应体系为2xRapid Taq Master Mix(诺唯赞)12.5μL，F/R 1μL，DNA 1μL，ddH2O补足至25μL；反应程序为，95℃预变性3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，35cycles，最后72℃延伸5min。检测结果如图5所示，12个毛状根材料中10个转化成功，检测均有条带，说明绝大部分毛状根都转化成功。
毛状根鉴定2：在多光谱动态荧光显微镜下进行EGFP荧光成像观察，结果如图6所示，大部分毛状根系均有绿色荧光发出，表明外源EGFP基因整合到枣树诱导根的基因组中，说明用该体系将目的基因转入枣树根系中是快速可行的。
实验例1
将实施例1中的实生苗苗龄分别设置为培养1周、2周、4周和6周，其余操作同实施例1，得到遗传转化植株。按照实施例1中毛状根鉴定1的方法，统计转化成功率，结果见表1，从表1可以看出，实生苗苗龄为2周时毛状根的转化成功率最高。
表1
实生苗苗龄 转化成功率，％
1周 20.8％
2周 50.3％
4周 45.5％
6周 32.3％
实验例2
将实施例1中外植体抽真空浸染的时间分别设置为10min、15min、20min、25min，其余操作同实施例1，得到遗传转化植株。按照实施例1中毛状根鉴定1的方法，统计转化成功率，结果见表2，从表1可以看出，外植体抽真空浸染的时间为20min时毛状根的转化成功率最高。
表2
Figure BDA0003717971360000061
对比例1
将实施例1中的农杆菌菌株替换为C58C1或ATCC15834，酶的添加量不变，其余操作同实施例1，得到遗传转化植株。按照实施例1中毛状根鉴定1的方法，统计转化成功率，结果见表3，从表3可以看出，农杆菌菌株为含有报告基因35S::EGFP的发根农杆菌K599时毛状根的转化成功率最高。
表3
所用菌株 转化成功率，％
C58C1 48.9％
K599 63.4％
ATCC15834 50.1％
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种发根农杆菌介导的枣遗传转化体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、枣种子播种，培养后获得待侵染外植体；
S2、含有外源基因的重组质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞中，调整菌液浓度OD600=0.75，得到农杆菌侵染液；
S3、将所述待侵染外植体的根部放置于所述农杆菌侵染液中，抽真空侵染，所述抽真空侵染的真空时间为20min；
S4、浸染后的外植体培养后，得到含有所述外源基因的枣遗传转化苗；
所述步骤S1的具体操作包括：枣种子经消毒处理后播种，培养两周后切除须根，并对主根和下端茎部进行划伤处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，播种后的培养条件为24℃，16h光照/8h黑暗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理为用次氯酸钠溶液进行消毒处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述含有外源基因的重组质粒为pcambia2300-GFP。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述重组质粒转化进入所述发根农杆菌感受态细胞采用的方法为冻融法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述培养包括共培养和生根培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共培养为将浸染后的枣苗扦插到浇透水的育苗基质中，黑暗培养2天。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生根培养为将侵染枣苗转移至光照培养箱中正常培养，每隔3天浇透水。
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