CN113141965B

CN113141965B - 一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化

Info

Publication number: CN113141965B
Application number: CN202110596339.2A
Authority: CN
Inventors: 王晓飞; 谢晓婷; 黄巧宇; 温广超; 郑炳松; 黄坚钦; 袁虎威; 何漪; 闫道良
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2021-05-30
Filing date: 2021-05-30
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-05-30
Also published as: CN113141965A

Abstract

本发明公开一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。将发根农杆菌在TY固体培养基上划线培养，获得单菌落，挑取单菌落于TY液体培养基进行培养，得到活化后的发根农杆菌溶液；发根农杆菌侵染薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部；其中薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部位置为距幼苗根部的胚轴或茎1～5cm处；共培养、生根培养，待胚轴或茎部侵染处生长出薄壳山核桃的转基因毛状根。以幼苗作为繁殖材料进行侵染，无需无菌环境培育无菌苗进行继代操作等一系列组培技术。

Description

一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化

技术领域

本发明属于薄壳山核桃转基因体系技术领域，涉及一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。

背景技术

目前，转基因植物转化的方法主要有农杆菌转化法、花粉管通道法、核显微注射法、基因枪法等，农杆菌介导的遗传转化体系是在植物基因工程中相对完整、成熟的方法之一。发根农杆菌是一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，在侵染植物后，能够诱导植物产生大量高度分支的不定根，通常称为发根。其在植物基因工程中具有广泛的应用，携带的Ri质粒能有效侵染众多植物，Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成转基因毛状根(hairy root)。基因工程中发根农杆菌侵染形成转基因毛状根是一种快速高效的转基因方法。发根农杆菌侵染植物所产生的发根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，可应用范围广。

目前发根农杆菌介导的植物转基因基本均是利用植株的无菌苗及无菌苗的叶片或茎段作为外植体，与一定OD值的菌液共培养以获得转基因根。按照农杆菌侵染操作的不同，现有的农杆菌介导的植株转基因方法可分为菌液侵染法和注射器针头刺入法，转化率普遍较低，对于木本植物来说，茎的硬度和木质化也进一步限制了注射法的应用空间。

常规的农杆菌介导转基因主要是利用根癌农杆菌，但是这种转基因植物的构建方法仍需要大量的时间进行愈伤组织诱导和分化、继代，获得转基因植物的周期较长，操作繁琐，效率不高。

目前，薄壳山核桃转基因体系还鲜有报道，根癌农杆菌介导的转化体系周期长，效率低。因此，对于薄壳山核桃的遗传改良和基因挖掘与功能分析，需要建立一套农杆菌介导的、高效稳定的转基因体系。本发明通过发根农杆菌介导，利用薄壳山核桃幼苗，获得稳定的薄壳山核桃转基因根系，从而提供一种经济高效的转基因方法。

发明内容

本发明的目的是针对以下所要解决的技术问题，提出一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。

所述所要解决的技术问题如下：

(1)扩大农杆菌可转化的受体植物范围，检测其对薄壳山核桃的转化效果；

(2)筛选影响发根农杆菌转化效率的最关键因素；

(3)明确发根农杆菌应用于薄壳山核桃的最适转化条件，从而减少成本；

(4)提供一种基于发根农杆菌介导、稳定且高效的转基因方法。

本发明的技术方案具体如下：

本发明提供了一种发根农杆菌介导幼苗获得转基因根系的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)、准备薄壳山核桃幼苗；

步骤(2)、制备携带35S::GFP的发根农杆菌；

所述发根农杆菌的种类包括但不限于MSU440、C58C1或K599；如本发明实施例所示，不同的发根农杆菌种类对于毛状根的诱导率有影响，根据不同植物可选择其适宜的发根农杆菌类型。

所述的目的基因和其适宜的表达载体无特殊限定。本发明对表达载体转化发根农杆菌的方法无特殊限定，采用本领域已知的方法即可，比如热激法、电击法等等。

步骤(3)、发根农杆菌活化：

将发根农杆菌在TY固体培养基上划线培养，获得单菌落，挑取单菌落于TY液体培养基进行培养，得到活化后的发根农杆菌溶液；

步骤(4)、发根农杆菌侵染薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部；作为优选，薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部位置为距幼苗根部的胚轴或茎1～5cm处；

所述侵染发根农杆菌的方法之一是对薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部进行伤口切割；然后将幼苗置于活化后的发根农杆菌菌液中浸泡20-30min，期间轻轻摇晃，使伤口和发根农杆菌充分接触，最后取出幼苗将多余菌液吸干。

所述对薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部进行伤口切割方法包括但不限于环割，或单面刀片横向切割。

所述侵染发根农杆菌的方法之二是用注射器注射活化后的发根农杆菌菌液至待转化幼苗的胚轴或茎。

如本发明的具体实施例所示，侵染的菌液浓度对于毛状根诱导率有一定影响，选择OD₆₀₀＝0.8的菌液，毛状根的诱导率更高。

步骤(5)、共培养；

作为优选，共培养的条件是避光，温度24-28℃，湿度80％-90％；

步骤(6)、生根培养，待胚轴或茎部侵染处生长出薄壳山核桃的转基因毛状根。

作为优选，生根培养的条件是温度21-24℃，湿度60％-70％。

一种发根农杆菌介导幼苗获得转基因植物，通过上述的方法构建而成。

本发明的有益效果是：

1.本发明以幼苗作为繁殖材料进行侵染，无需无菌环境培育无菌苗进行继代操作等一系列组培技术。该方法操作方便快捷，所需设备简单，周期短、效率高，易于生产实践的推广，具有广阔的开发应用前景。

2.在农林业上，许多经济林如重要造林树种和优质果树栽培品系扦插繁殖时生根率很低，严重制约了利用无性繁殖方法对它们进行大面积推广。而采用发根农杆菌处理木本植物的茎干等繁殖材料，将能够改善生根能力，明显地提高生根率，这可为解决生产上林木繁殖难生根的问题提供一条新的途径。

3.用于获得转基因植物和培育作物新品种：构建具有目的基因和标记基因的双元表达载体，用含双元表达载体的发根农杆菌感染植物，可将目的基因导入植物组织，并可再生出转基因植物。

4、本发明已知的产品薄壳山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)及潜在产品山核桃(Carya cathayensis Sarg.)、湖南山核桃(Carya hunanensis Cheng etR.H.Chang ex Chang et Lu)，果实采摘困难，且结果迟，一般树龄需要15年左右进入结实期，可利用转基因技术进行深入研究，如缩短童期、矮化植株解决其采摘难题等等，故需要建立稳定的遗传转化体系，为后续的转基因植株的获得奠定基础。而发根农杆菌即可用于获得转基因植物和培育作物新品种。获得转基因根系之后，利用山核桃属植物易根繁的特性，通过根繁获得完整的转基因植株，为薄壳山核桃及其他品种的遗传改良和基因挖掘与功能分析奠定基础。

附图说明

图1侵染方式，其中a.环割；b.注射；

图2生根情况，其中a.种子；b.对照；c.环割后30d的生根情况；d.环割后60d的生根情况；e.30d的生根情况局部详图；f.60d的生根情况局部详图；比例尺5cm；

图3结果验证图，其中a.体式显微镜荧光检测：A、B：愈伤；C、D：根；b.手持式荧光检测器检测根的转化情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。

实施例1：不同时期的薄壳山核桃幼苗

(1)种子的收集，收获薄壳山核桃的成熟种子；

(2)种子的发芽

将种子种在含基质(70-80％草炭土、5-10％珍珠岩、2-5％蛭石、5-10％沙壤土，添加适量水并混合，并选用有机腐熟微生物菌剂进行10天的腐熟处理)的盆中并在催芽室(26±2℃)中进行两个月的发芽过程，获得不同时期的薄壳山核桃幼苗。

实施例2：菌液制备

(1)首先将携带有35S::GFP的表达载体转入K599发根农杆菌菌株，于-80℃下采用含50％甘油保存菌液。

(2)将上述带有35S::GFP的发根农杆菌于TY固体培养基上划线，28℃倒置培养2-3天。

(3)当OD₆₀₀＝0.5时，将培养好的菌液在室温下离心，离心转速6500rpm，10min富集发根农杆菌。

所述离心的转速优选为4000-8000rpm，更优选为6500rpm。在本发明中，所述离心的时间优选为5-15min，更优选为10min。

(4)弃上清，将富集的菌重悬于MES-KOH(10mM MES-KOH，PH＝5.2，10mM MgCl₂，100μM As)。

(5)重悬后的菌液测定OD₆₀₀＝0.5即可。

实施例3：毛状根的诱导

如图1(a)将沾有发根农杆菌菌液的单面刀片在薄壳山核桃近种子的胚轴或茎部1-5cm处轻轻水平倾斜45°，横向环割三个刀口，每划一刀将单面刀于菌液中浸泡，以保证伤口处均被菌液侵染到。

图1(b)为用1ml注射器将发根农杆菌菌液注射到薄壳山核桃近种子的胚轴或茎部1-5cm处，每株苗横向注射3个部位。

实施例4：共培养

将侵染过的苗在催芽室(避光，温度26±2℃，湿度80％-90％)培养2-3天。

实施例5：生根培养

从催芽室移至温室大棚(温度23±2℃，湿度60％-70％)培养一个月，观察并统计其生根情况。

图2薄壳山核桃生根过程示意图。a.薄壳山核桃种子；b.薄壳山核桃幼苗；c和e.发根农杆菌侵染后30天的生根情况和生根部位细节图；d和f.发根农杆菌侵染后60天的生根情况和生根部位细节图；比例尺5cm。

实施例6：体系优化

采用正交设计四因素三水平进行试验设计，具体如表1、2所示。

表1四因素三水平表

表2四因素三水平正交试验设计表

(1)菌株采用K599、C58C1、MSU440三种发根农杆菌菌株。

(2)重悬后的菌液OD₆₀₀＝0.4/0.8/1.2时，进行处理。

(3)环割的位置距种子的0-1cm、1-3cm、3-5cm的胚轴或茎部处。

(4)重悬后的菌液测定OD₆₀₀＝0.4/0.8/1.2即可。

(5)统计并进行数据分析，得出优化结果：影响发根农杆菌侵染薄壳山核桃生根率的因素大小为苗龄>注射部位>菌液OD>菌种，及其最佳组合K599(菌种)，OD₆₀₀0.8，子叶期，距离种子3-5cm处。所有生根的苗中，具有阳性根植株为80％。所有长出的根中，阳性根的比例为78％。

实施例7：验证体系

(1)荧光检测；

(2)DNA水平验证。

图3薄壳山核桃转基因根验证，a.体式显微镜荧光检测(愈伤(A可见光，B荧光)；根(C可见光，D荧光))；b.转基因根GFP检测。

Claims

1.一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1) 、准备苗龄为子叶期的薄壳山核桃幼苗；

步骤(2) 、制备携带35S::GFP的发根农杆菌K599；

步骤(3) 、发根农杆菌活化：

将发根农杆菌K599在TY固体培养基上划线培养，获得单菌落，挑取单菌落于TY液体培养基进行培养，得到OD₆₀₀=0.8时活化后的发根农杆菌溶液；

步骤(4)、发根农杆菌侵染薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部；其中薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部位置为距幼苗根部的胚轴或茎3～5 cm处；

步骤(5)、共培养；

步骤(6) 、生根培养，待胚轴或茎部侵染处生长出薄壳山核桃的转基因毛状根。

2.根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于所述侵染发根农杆菌的方法是对薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部进行伤口切割；然后将幼苗置于重悬后的菌液中浸泡20-30 min，期间轻轻摇晃，使伤口和发根农杆菌充分接触，最后取出幼苗将多余菌液吸干。

3.根据权利要求2所述的一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于所述对薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部进行伤口切割方法包括但不限于环割，或单面刀片横向切割。

4.根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于所述侵染发根农杆菌的方法是用注射器注射活化后的发根农杆菌菌液至待转化幼苗的胚轴或茎。

5.根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于共培养的条件是避光，温度24-28℃，湿度80%-90%。

6.根据权利要求1所述的一种薄壳山核桃的转基因根系的构建方法，其特征在于生根培养的条件是温度21-24℃，湿度60%-70%。

7.一种发根农杆菌介导幼苗获得转基因植物，通过权利要求1-6任一所述的方法构建而成。