CN104878039A - 基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，是将含目的基因重组载体的农杆菌工程菌转化液直接微量注射至桑树将要萌发的冬芽中，通过农杆菌侵染冬芽顶端分生组织分生细胞和冬芽腋芽分生细胞获得成功转化的芽分生细胞，所得芽分生细胞分化生长获得转基因的桑枝条和芽，再通过桑树的嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖技术获得转基因嫁接桑苗或获得转基因桑种，进而大量获得桑树转基因苗木和种子。该方法免去了诸如组织培养的繁琐步骤以及无菌的操作环境等要求，直接在植株上进行，在自然环境下即可完成，成本低廉，操作简单，技术要领掌握容易、可重复性好，转化效率较高，能够快速获得适宜当地野外自然条件的转基因植株、苗木及种子，并且适用于多种桑树品种，是一种新型、高效、实用的桑树转基因方法。

Description

基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种农杆菌介导的桑树转基因方法。

背景技术

木本植物大多为多年生植物，相对于农作物等一、二年生草本植物而言，一般具有生命周期长、成熟开花晚、遗传背景复杂等特点，其遗传转化方面的研究一直相对滞后。近年来，随着农杆菌介导的植物遗传转化的快速发展，研究者们已经相继在杨树（Populus L.）、刺槐（Robinia pseudoacacia Linn. ）、苹果（Malus pumila）、桃（Amygdalus persica L.）、柑橘（Citrus reticulata Blanco.）等木本植物中成功建立了遗传转化体系。这些木本植物的遗传转化都是利用其叶、茎等组织易于培养和再生的特点，通过与农杆菌共培养，诱导再生出丛生芽后，筛选获得阳性丛生芽，再进一步培养成转基因株系。

桑树是一种多年生木本植物，具有很强的环境适应能力、耐修剪和种苗易繁育等优良林木树种特点，具有改善空气质量、保水固土防沙等优良生态功能，不仅其叶是家蚕唯一食料来源，其果、叶、枝、皮还皆为良药，所含的氨基酸和抗氧化物质十分丰富。因此，桑树生物资源的多用途开发价值和潜力巨大，其多元化开发研究对推动以获取桑叶养蚕为唯一目的的传统蚕桑产业的升级转型具有重要意义。桑树多元化利用的关键是筛选和创造具有不同用途的专用品种和育种素材，如专用药用桑、生态用桑和食用桑等，为桑树多元化产业开发奠定基础。随着桑树基因组测序的完成，桑树研究正式步入功能基因组时代。转基因技术是目前创造新素材和功能基因研究的最重要平台之一。但到目前为止，高效实用的桑树转基因技术体系尚未建立起来。虽然部分学者通过农杆菌介导的叶盘转化法和基因枪外源基因导入法开展了桑树转基因研究并取得了很大进展，但利用叶、子叶等组织的叶盘转化法受到组织培养严格繁琐操作和桑树再生体系难以建立的限制，目前还只能在个别桑树品种（如再生能力强的印度桑和新一之濑）中获得成功，而且这些技术可重复性较差，目前只在极少几个研究小组取得了突破，还难以有效的应用于桑树功能基因组研究和多元化开发研究中。因此，现在迫切需要发展一套高效实用的桑树转基因技术体系，有效的创造新的研究材料和育种素材，来支撑桑树的功能基因组研究和传统蚕桑产业的升级转型。

发明内容

鉴于现有桑树转基因技术存在桑树再生系统建立困难、转化成功率低、技术可重复性差以及仅限于个别桑树品种的缺点，本发明的目的在于提供一种新型高效实用的桑树转基因方法，摆脱实验室及组织培养繁琐步骤的束缚，无需探索建立组织再生系统，能够在自然环境下实施，转化效率高，可以快速获得转基因植株及其后代，技术可重复性好，而且普遍适用于不同桑树品种和资源。

具体技术方案如下：

基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，包括以下步骤：

（1）将含有目的基因的农杆菌工程菌接种到含有筛选压的液体培养基中进行扩大培养，当菌液OD600值达到0.8～1.2时分离菌体，用悬浮培养基重悬浮，再加入乙酰丁香酮，获得农杆菌工程菌转化液；所述悬浮培养基为含有渗透剂和表面活性剂的1/2MS（Murashige-Skoog）培养基；

（2）选取待转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，将冬芽生长点刺伤后注入农杆菌工程菌转化液至溢出为止，用脱脂棉包裹注射后的冬芽；重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次；

（3）对注射后冬芽长出的叶片进行转基因鉴定，筛选出阳性枝条；

（4）筛选出的阳性枝条通过嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖获得转基因嫁接桑苗或转基因桑树种子。

进一步，步骤（1）中所述农杆菌为根瘤农杆菌LBA4404。

进一步，步骤（1）中所述悬浮培养基为含有5wt% D-葡萄糖、0.05wt% Silwet L-77和0.05wt% MES（2-吗啉乙磺酸）的1/2MS培养基（本文中的符号“wt%”均表示质量百分浓度）。

进一步，步骤（1）中所述菌体用悬浮培养基按体积比1:1重悬浮。

进一步，步骤（1）中所述农杆菌工程菌转化液中乙酰丁香酮的终浓度为100～200 μmol/L。

进一步，所述桑树品种为红果1号和珍珠白。

本发明的有益效果在于：本发明方法是直接微量注射含目的基因重组载体的农杆菌工程菌转化液于桑树将要萌发的冬芽中，通过农杆菌侵染冬芽顶端分生组织分生细胞和冬芽腋芽分生细胞获得成功转化的芽分生细胞，所得芽分生细胞分化生长获得转基因的桑枝条和芽，再通过桑树的嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖技术获得转基因嫁接桑苗或获得转基因桑种，进而大量获得桑树转基因苗木和种子。该方法免去了诸如组织培养的繁琐步骤以及无菌的操作环境等要求，直接在植株上进行，在自然环境下即可完成，成本低廉，操作简单，技术要领掌握容易、可重复性好，转化效率较高，能够快速获得适宜当地野外自然条件的转基因植株、苗木及种子，并且适用于多种桑树品种，是一种新型、高效、实用的桑树转基因方法，大大加速了转基因桑品系和素材的实用化进程。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为植物超表达重组载体PLGNL-MAPK 6的结构示意图。

图2为注射所选冬芽。

图3为注射后冬芽长出叶片的GUS染色鉴定结果。

图4为T2代阳性植株的叶片GUS染色鉴定结果，其中：a和b为野生型；c和d为红果1号转基因株系；e和f为珍珠白转基因株系。

图5为阳性叶片的基因组PCR鉴定结果，其中：M为trans 2K Marker；+为PLGNL-MAPK6载体；CK为野生型；9为红果1号转基因株系；23和18为珍珠白转基因株系。

图6为阳性叶片的qRT-PCR鉴定结果，其中：CK为野生型；9为红果1号转基因株系；23和18为珍珠白转基因株系。

图7为阳性叶片的Southern blotting鉴定结果，其中：CK为野生型；9为红果1号转基因株系；23和18为珍珠白转基因株系。

图8为T2代阳性植株叶片的基因组PCR鉴定结果，其中：M为trans 2K Marker；9为PLGNL-Mapk6载体；1为野生型；2为珍珠白2-1-2；3为珍珠白2-12；4为红果1号5-8；5为红果1号5-9-1；6为红果1号5-9-2；7为珍珠白6-13；8为红果1号7-19。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J. 萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

实验桑树品种为红果1号，转化目的基因为MAPK6基因。

根据PLGNL载体上的MCS酶切位点，构建植物超表达重组载体PLGNL-MAPK6（图1），其具有卡那霉素（Kan）抗性。将重组载体PLGNL-MAPK6转化农杆菌LBA4404感受态细胞获得PLGNL-MAPK6 工程菌。

配制农杆菌工程菌转化液：将农杆菌工程菌100μL接种至含有50mg/L Kan 的YEB液体培养基100mL中，于28℃、220 r/min恒温摇床培养约12h，吸取10mL菌液，加至含有50mg/L Kan 的新鲜YEB液体培养基300mL中，于28℃、220 r/min恒温摇床培养至OD600值达0.8（OD600值在0.8～1.2的农杆菌都处于生长对数期，活力较高。因此，OD600值在0.8～1.2均能满足实验要求），5000rpm离心15min，收集菌体，用悬浮培养基（为含有5wt% D-葡萄糖、0.05wt% Silwet L-77和0.05wt% MES的1/2MS培养基）按体积比1:1重悬浮，最后加入终浓度为200 μmol/L的乙酰丁香酮（乙酰丁香酮能促进提高转化效率，终浓度为100～200 μmol/L的乙酰丁香酮均能满足实验要求），即得。

选取需要转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，用1ml一次性注射器吸取适量农杆菌工程菌转化液，用针头刺伤冬芽生长点后注入，至农杆菌工程菌转化液溢出为止，然后立即用无菌脱脂棉包裹注射后的冬芽以延长农杆菌侵染时间并防止叶芽脱水而导致死亡。重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次。

对注射后冬芽长出的叶片进行GUS染色鉴定，之后对染色阳性叶片同一枝条的其余叶片进行GUS染色鉴定，初步确定候选阳性枝条，然后通过基因组PCR、qRT-PCR、Southern blotting等分子鉴定手段最终确定阳性枝条。

GUS染色鉴定方法如下：待注射过的冬芽长出2～3片叶片时，剪取1cm×1cm大小的叶片，放入含有GUS染色液的1.5mL离心管中染色，37℃过夜，之后用体积百分浓度分别为30%、75%和95%的乙醇梯度脱色漂洗3次，每次3～4小时以消除叶绿素的干扰，然后在显微镜下观察组织染色情况，叶片有染出蓝色为GUS检测呈阳性的转基因叶片，反之为阴性。结果见图2。

基因组PCR鉴定方法如下：（1）对GUS染色阳性叶片用CTAB法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以一对nptII扩增引物（上游引物：5'-ATGGATTGCACGCA- GGTTCTCC-3'（SEQ ID No.1）；下游引物：5'-TCAGAAG-AACTCGTCAAGAAGGCG-3'（SEQ ID No.2））进行PCR鉴定。PCR体系为总体积为25μL的标注TaqPCR体系。PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃ 40s，54℃ 35s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取PCR产物10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。（2）对GUS染色阳性叶片用CTAB法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以一对35S-MAPK6扩增引物（上游引物：5'-ACATGGTGGAGCACGACACA-3'（SEQ ID No.3）；下游引物：5'-TTAAGAAC-ACACCTCGCCGTTAGTA-3'（SEQ ID No.4））进行PCR鉴定。PCR体系为总体积为25μL的标注TaqPCR体系。PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃ 40s，56℃ 35s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取PCR产物10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3。

qRT-PCR鉴定方法如下：将GUS染色阳性叶片及阴性对照用TaKaRa公司RNAiso Plus提取试剂提取叶片总RNA，用TaKaRa公司反转录试剂盒 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反转成cDNA后，利用MAPK6基因定量引物结合TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II试剂完成对Mapk6基因表达量的qRT-PCR检测。结果见图4。

Southern blotting鉴定方法如下：取GUS染色阳性叶片提取的基因组DNA 15～30μg，用Hind III酶切过夜，酶切产物用乙醇沉淀法纯化，然后按照转膜、预杂交、杂交、洗膜、荧光检测步骤完成southern检测。结果见图5。

根据上述鉴定结果，注射阳性率统计如下：红果1号共注射冬芽10个，获得阳性枝条3枝，阳性率为30%。 另外，qRT-PCR结果表明，阳性植株中MAPK6基因表达量显著高于野生型。

在第二年春天对上述鉴定得到的阳性枝条上的桑树雌花提前进行套袋处理，采用人工授粉的方式获得桑树种子。对桑树种子萌发而获得的桑苗进行GUS染色，统计T2代种子阳性率。结果显示，350颗红果1号杂交种子萌发的桑苗叶片中有122棵植株GUS染色呈阳性，阳性率为34.86%。GUS染色呈阳性的植株，其进一步的基因组PCR鉴定结果也显示为阳性。上述结果表明，已获得转基因桑树植株，且阳性率较高。

实施例2

实验桑树品种为珍珠白，转化目的基因为MAPK6基因。

根据PLGNL载体上的MCS酶切位点，构建植物超表达重组载体PLGNL-MAPK6（图1），其具有卡那霉素（Kan）抗性。将重组载体PLGNL-MAPK6转化农杆菌LBA4404感受态细胞获得PLGNL-MAPK6 工程菌。

配制农杆菌工程菌转化液：将农杆菌工程菌100μL接种至含有50mg/L Kan 的YEB液体培养基100mL中，于28℃、220 r/min恒温摇床培养约12h，吸取10mL菌液，加至含有50mg/L Kan 的新鲜YEB液体培养基300mL中，于28℃、220 r/min恒温摇床培养至OD600值达1.0（OD600值在0.8～1.2的农杆菌都处于生长对数期，活力较高。因此，OD600值在0.8～1.2均能满足实验要求），5000rpm离心15min，收集菌体，用悬浮培养基（为含有5wt% D-葡萄糖、0.05wt% Silwet L-77和0.05wt% MES的1/2MS培养基）按体积比1:1重悬浮，最后加入终浓度为200 μmol/L的乙酰丁香酮（乙酰丁香酮能促进提高转化效率，终浓度为100～200 μmol/L的乙酰丁香酮均能满足实验要求），即得。

选取需要转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，用1ml一次性注射器吸取适量农杆菌工程菌转化液，用针头刺伤冬芽生长点后注入，至农杆菌工程菌转化液溢出为止，然后立即用无菌脱脂棉包裹注射后的冬芽以延长农杆菌侵染时间并防止叶芽脱水而导致死亡。重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次。

对注射后冬芽长出的叶片进行GUS染色鉴定，之后对染色阳性叶片同一枝条的其余叶片进行GUS染色鉴定，初步确定候选阳性枝条，然后通过基因组PCR、qRT-PCR、Southern blotting等分子鉴定手段最终确定阳性枝条。

GUS染色鉴定方法如下：待注射过的冬芽长出2～3片叶片时，剪取1cm×1cm大小的叶片，放入含有GUS染色液的1.5mL离心管中染色，37℃过夜，之后用体积百分浓度分别为30%、75%和95%的乙醇梯度脱色漂洗3次，每次3～4小时以消除叶绿素的干扰，然后在显微镜下观察组织染色情况，叶片有染出蓝色为GUS检测呈阳性的转基因叶片，反之为阴性。结果见图2。

基因组PCR鉴定方法如下：（1）对GUS染色阳性叶片用CTAB法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以一对nptII扩增引物（上游引物：5'-ATGGATTGCACGCA- GGTTCTCC-3'（SEQ ID No.1）；下游引物：5'-TCAGAAG-AACTCGTCAAGAAGGCG-3'（SEQ ID No.2））进行PCR鉴定。PCR体系为总体积为25μL的标注TaqPCR体系。PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃ 40s，54℃ 35s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取PCR产物10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。（2）对GUS染色阳性叶片用CTAB法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以一对35S-MAPK6扩增引物（上游引物：5'-ACATGGTGGAGCACGACACA-3'（SEQ ID No.3）；下游引物：5'-TTAAGAAC-ACACCTCGCCGTTAGTA-3'（SEQ ID No.4））进行PCR鉴定。PCR体系为总体积为25μL的标注TaqPCR体系。PCR反应条件为：95℃ 4min；95℃ 40s，56℃ 35s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取PCR产物10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3。

qRT-PCR鉴定方法如下：将GUS染色阳性叶片及阴性对照用TaKaRa公司RNAiso Plus提取试剂提取叶片总RNA，用TaKaRa公司反转录试剂盒 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反转成cDNA后，利用MAPK6基因定量引物结合TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II试剂完成对Mapk6基因表达量的qRT-PCR检测。结果见图4。

Southern blotting鉴定方法如下：取GUS染色阳性叶片提取的基因组DNA 15～30μg，用Hind III酶切过夜，酶切产物用乙醇沉淀法纯化，然后按照转膜、预杂交、杂交、洗膜、荧光检测步骤完成southern检测。结果见图5。

根据上述鉴定结果，注射阳性率统计如下：珍珠白品种共注射冬芽14个，获得阳性枝条5枝，阳性率为35.71%。另外，qRT-PCR结果表明，阳性植株中MAPK6基因表达量显著高于野生型。

在第二年春天对上述鉴定得到的阳性枝条上的桑树雌花提前进行套袋处理，采用人工授粉的方式获得桑树种子。对桑树种子萌发而获得的桑苗进行GUS染色，统计T2代种子阳性率。结果显示，珍珠白杂交种子共计360颗，其萌发桑苗叶片GUS染色阳性植株为60棵，阳性率为16.67%。GUS染色呈阳性的植株，其进一步的基因组PCR鉴定结果也显示为阳性。上述结果表明，已获得转基因桑树植株，且阳性率较高。

上述2个实施例的结果表明，通过直接注射工程农杆菌于桑树冬芽的方法能够有效获得转基因植株且操作简单，免去了诸如组织培养的繁琐步骤以及无菌的操作环境等要求，成本低廉，转化效率高且适用于多种桑树品种，获得转基因桑苗无需炼苗等过程，完全适宜当地野外天然的生长环境，大大加速了转基因桑品系和素材的实用化进程。

<110>  西南大学

<120>  基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法

<160>  4

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  nptII扩增上游引物

<400>  1

atggattgca cgcaggttct cc    22

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  nptII扩增下游引物

<400>  2

tcagaagaac tcgtcaagaa ggcg    24

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  35S-MAPK6扩增上游引物

<400>  3

acatggtgga gcacgacaca    20

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  35S-MAPK6扩增下游引物

<400>  4

ttaagaacac acctcgccgt tagta    25

 

Claims (6)

1.基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将含有目的基因的农杆菌工程菌接种到含有筛选压的液体培养基中进行扩大培养，当菌液OD600值达到0.8～1.2时分离菌体，用悬浮培养基重悬浮，再加入乙酰丁香酮，获得农杆菌工程菌转化液；所述悬浮培养基为含有渗透剂和表面活性剂的1/2MS培养基；

（2）选取待转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，将冬芽生长点刺伤后注入农杆菌工程菌转化液至溢出为止，用脱脂棉包裹注射后的冬芽；重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次；

（3）对注射后冬芽长出的叶片进行转基因鉴定，筛选出阳性枝条；

（4）筛选出的阳性枝条通过嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖获得转基因嫁接桑苗或转基因桑树种子。

2.根据权利要求1所述的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述农杆菌为根瘤农杆菌LBA4404。

3.根据权利要求1所述的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述悬浮培养基为含有5wt% D-葡萄糖、0.05wt% Silwet L-77和0.05wt% MES的1/2MS培养基。

4.根据权利要求1所述的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述菌体用悬浮培养基按体积比1:1重悬浮。

5.根据权利要求1所述的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述农杆菌工程菌转化液中乙酰丁香酮的终浓度为100～200 μmol/L。

6.根据权利要求1所述的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，所述桑树品种为红果1号和珍珠白。