CN107868796A - 一种新型植物转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种新型植物转基因方法，将配置好的转化液作用于植物分生组织区进行转化侵染，保持温度20‑28摄氏度，保持分生组织表面有液体存在，转化侵染2‑3天后进行正常培养，对植物干细胞群进行转化进一步发育成转基因苗，长出新的丛生苗待PCR分子鉴定后，在体生长进一步结种子或者切下生根成新的幼苗长成一个完整的转基因植株。本发明方法适合与任何一种有分生组织的植物包括单子叶和双子叶植物，且都有较高的转化效率(>50％)，无需采用筛选技术，获得转化苗后只需要用PCR技术进行分子鉴定即可，可以进行无标签转化。

Description

一种新型植物转基因方法
技术领域
本发明涉及一种新型植物转基因方法。
背景技术
转基因是研究基因功能和基因应用的必须工具，自从发明了农杆菌介导的遗传转化技术以来得到了快速发展，但是现在转基因技术都是以组织培养为基础，对条件要求高，且必须建立该物种的组织培养体系，组织培养体系的建立对于许多物种的遗传转化都是瓶颈，造成新物种转基因体系建立困难，并且在物种内还受到品种的限制。
发明内容
本发明提出一种新型植物转基因方法，建立了一种完全在室外进行的转基因技术，无需组织培养条件，并且能够快速高效的获得转基因植株，转化效率在不经过筛选的情况下达到了90％以上，试验周期可以压缩到20天以内，不受物种限制，彻底打开了植物转基因应用在转化技术上的瓶颈，可以做到无标签转基因技术。
本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
一种新型植物转基因方法，将配置好的转化液作用于植物分生组织区进行转化侵染，保持温度20-28摄氏度，保持分生组织表面有液体存在，转化侵染2-3天后进行正常培养，对植物干细胞群进行转化进一步发育成转基因苗，长出新的丛生苗待PCR分子鉴定后，在体生长进一步结种子或者切下生根成新的幼苗长成一个完整的转基因植株。
优选地，转化侵染采用农杆菌侵染方式，转化液是将构建好的转基因载体转入农杆菌中，将鉴定好的农杆菌菌液重新用侵染液悬浮，控制OD值0.1-1.5。
优选地，转化侵染采用DNA直接渗透的方式，转化液是将DNA直接溶解在侵染液中控制DNA浓度200ng/ul以上。
优选地，转化液是能促进DNA或者T-DNA进入植物分生组织细胞内并且有利于外源DNA整合进植物基因组的培养液体，所述转化液至少包含表面活性剂、细胞分裂素、生长素、基础培养基、碳源和氮源，pH值为5.0-6.0。
优选地，所述细胞分裂素含量为0.1-25mg/L，可以是6-ba、kt、zt、tdz中的至少一种。
优选地，所述表面活性剂重量含量0.1-0.5％，可以是NP40、tween20、PEG、tritonX-100、silwet 77、甜菜碱中的至少一种。
优选地，所述生长素含量为0-20mg/L，可以是IAA、NAA、2,4-D中的至少一种。
优选地，所述基础培养基是包含铵态氮和硝态氮的培养基。
优选地，所述碳源中除了其他糖类须包含葡萄糖5-20g/L。
优选地，所述氮源可以是酸水解酪蛋白、脯氨酸以及谷氨酰胺的至少一种。
本发明产生的有益效果为：本发明是对植物自体干细胞群(主要是顶端分生组织，侧芽分生组织，形成层组织，侧芽原基)进行转化，优选侧芽原基，不需要进行离体组培，可以通过农杆菌介导也可以直接导入DNA片段，转化效率高，周期短，无须抗性筛选，得到的转基因再生苗可以在体生长也可以离体移栽。本发明方法适合与任何一种有分生组织的植物包括单子叶和双子叶植物，且都有较高的转化效率(>50％)，无需采用筛选技术，获得转化苗后只需要用PCR技术进行分子鉴定即可，可以进行无标签转化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本实施例中大豆转化后丛生苗再生的图示。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：玉米高效原位转化
S1，受体材料准备：将玉米种子正常发芽，5-20天左右将主芽去除。
S2，转化液配制：将构建好的常规的转基因载体转入农杆菌中，将鉴定好的农杆菌菌液重新用转化液悬浮，控制OD值0.5-1.5；如果使用DNA直接转化则将DNA直接溶解在侵染液中控制DNA浓度200ng/ul以上。
S3，转化操作：将配置好的侵染液施加在侧芽原基上，并保持湿度。侵染时间2-3天25摄氏度左右。
S4，转化在体再生：将侵染好的植株移到此种植物最适合的生长环境下，进行正常培养，一般10天左右会长出新的被转基因的丛生芽。
S5，转化苗分子鉴定：用pcr报告基因的方式对新生的丛生芽进行分子或者生化的鉴定。
S6，转化苗移栽或者在体收获：将转化的幼苗进行扦插生根获得完整的转基因植株或者不进行生根，直接获得转基因种子。
实施例2：大豆高效原位转化
S1，受体材料准备：将大豆种子正常发芽，5-20天左右将主芽去除，并且将腋芽破坏，然后对腋芽的侧芽原基进行转化。
S2，转化液配制：将构建好的常规的转基因载体转入农杆菌中，将鉴定好的农杆菌菌液重新用侵染液悬浮，控制OD值0.5-1.5。如果使用DNA直接转化则将DNA直接溶解在侵染液中控制DNA浓度200ng/ul以上的浓度。
S3，转化操作：将配置好的侵染液施加在侧芽原基上，并保持湿度。侵染时间2-3天25摄氏度左右
S4，转化在体再生：将侵染好的植株移到此种植物最适合的生长环境下，进行正常培养，一般10天左右会长出新的被转基因的丛生芽。
S5，转化苗分子鉴定：用pcr报告基因的方式对新生的丛生芽进行分子或者生化的鉴定。
S6，转化苗移栽或者在体收获：将转化的幼苗进行扦插生根获得完整的转基因植株或者不进行生根，直接获得转基因种子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型植物转基因方法，其特征在于，将配置好的转化液作用于植物分生组织区进行转化侵染，保持温度20-28摄氏度，保持分生组织表面有液体存在，转化侵染2-3天后进行正常培养，对植物干细胞群进行转化进一步发育成转基因苗，长出新的丛生苗待PCR分子鉴定后，在体生长进一步结种子或者切下生根成新的幼苗长成一个完整的转基因植株。
2.如权利要求1所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，转化侵染采用农杆菌侵染方式，转化液是将构建好的转基因载体转入农杆菌中，将鉴定好的农杆菌菌液重新用侵染液悬浮，控制OD值0.1-1.5。
3.如权利要求1所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，转化侵染采用DNA直接渗透的方式，转化液是将DNA直接溶解在侵染液中控制DNA浓度200ng/ul以上。
4.如权利要求1所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，转化液是能促进DNA或者T-DNA进入植物分生组织细胞内的并且有利于外源DNA整合进植物基因组的培养液体，所述转化液至少包含表面活性剂、细胞分裂素、生长素、基础培养基、碳源和氮源,pH值为5.0-6.0。
5.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述细胞分裂素含量为0.1-25mg/L，可以是6-ba、kt、zt、tdz中的至少一种。
6.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述表面活性剂重量含量0.1-0.5%，可以是NP40、tween20、PEG、triton X-100、silwet 77、甜菜碱中的至少一种。
7.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述生长素含量为0-20mg/L，可以是IAA、NAA、2,4-D中的至少一种。
8.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述基础培养基是包含铵态氮和硝态氮的培养基。
9.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述碳源中除了其他糖类须包含葡萄糖5-20g/L。
10.如权利要求4所述的一种新型植物转基因方法，其特征在于，所述氮源可以是酸水解酪蛋白、脯氨酸以及谷氨酰胺的至少一种。
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