CN114149996B - GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途，本发明发现棉花GhAIL6这个基因过表达具有明显的棉花促进胚性愈伤组织形成的作用，并通过遗传转化得到了转GhAIL6基因的材料，其具有较高的胚性愈伤组织发生率及体细胞胚胎发生效率。

Description

GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途

技术领域

本发明涉及一种GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途，属于基因工程领域。

背景技术

棉花是重要的经济作物，转基因技术作为棉花遗传改良快速有效的方法，为棉花遗传育种带来了巨大的发展空间。通过基因工程技术培育的抗虫棉己经成为我国推广最为成功的转基因作物，其有效提高了棉花对鳞翅目害虫特别是棉铃虫的抵抗能力，挽回了重大的经济损失，极大程度降低了农药的使用，在保护环境，降低人畜中毒风险，提高植棉效益等方面发挥着重大作用。棉花的体细胞胚胎发生困难严重制约了转基因棉花研究及育种。棉花的体细胞胚胎发生主要分为外植体脱分化为愈伤组织形成，胚性愈伤组织形成，胚状体发生，胚成熟这几个阶段。其中胚性愈伤组织形成过程是限制体细胞胚胎发生的关键步骤。有研究发现WUS等基因有促进棉花体细胞胚胎发生的作用，只是未发现 AIL6基因具有促进棉花体细胞胚胎发生的作用。

发明内容

本发明提供了一种GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途， GhAIL6基因过表达具有明显的棉花促进胚性愈伤组织形成的作用。

本发明采用的技术方案为：

GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途，所述的GhAIL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，本发明也提供了GhAIL6基因在促进棉花体细胞胚胎发生的用途，所述的GhAIL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成通过GhAIL6基因过表达实现。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的GhAIL6基因在促进植物体细胞胚胎发生通过GhAIL6基因过表达实现。

本发明的有益效果：

本发明发现棉花GhAIL6这个基因过表达具有明显的棉花促进胚性愈伤组织形成的作用，并通过遗传转化得到了转GhAIL6基因的材料，其具有较高的胚性愈伤组织发生率及体细胞胚胎发生效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为载体示意图；

图2为组培培养基上培养的棉花下胚轴在45天时胚性愈伤组织图；

图3为三个株系统计的胚性愈伤组织形成率统计图；

图4为三个GhAIL6过表达株系进行Southern检测图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

植物材料：陆地棉品种冀合713棉种的胚性愈伤组织：山西省农科院棉花研究所提供。pCAMBIA2300GR载体：中国国农业科学院棉花研究所提供。农杆菌LBA4404，市场购买。陆地棉品种冀合713棉种：山西省农科院棉花研究所提供。

1.总RNA提取

取陆地棉品种冀合713的胚性愈伤组织为材料，用TRIZOL法提取总RNA。

1)取样品100mg在液氮中迅速研磨，将粉末加到装有1.5ml TRIZOL的2.0ml 离心管中，室温放置5min；

2)加入0.4ml氯仿，颠倒混匀，室温放置5min；

3)12000rpm离心15min，移上层水相到新管中；

4)加入等体积预冷异丙醇，混匀，室温放置10min；

5)12000rpm离心15min，弃上清；

6)加入1ml75％乙醇，7500rpm离心5min；

7)超静台自然干燥(切忌完全干燥，否则不易溶解)；

8)加50微升RNase水，溶解RNA，保存备用。

2.GhAIL6基因克隆

使用诺唯赞反转录试剂盒HISCRIPT III ALL-IN-ONE RT SUPERMIX PERFECT FORPCR将RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板，设计特异性引物：

上游引物：GGGGTACCCCATGGCATCAGCGAGTAACTGG(SEQ ID NO.1)

下游引物：CGGGATCCCGAAGCTTATCGATTTATAGGATGGGTGAGGC(SEQ ID NO.2)

使用诺唯赞高保真酶2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)，用PCR法扩增得到GhAIL6基因，PCR反应体系：

PCR反应参数：

将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶(2％浓度)电泳。

使用诺唯赞FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒对GhAIL6基因目的片段的回收：

1)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

2)加入等倍体积Buffer GDP。50～55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把小于700μl溶胶液转移至吸附柱中，12000 rpm(13400×g)离心30-60s。若溶胶体积大于700μl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12000rpm(13400×g)离心30-60s。

4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12000rpm(13400×g)离心30-60s。

5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000rpm(13400×g)离心30-60s。

6)重复步骤5。

7)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12000rpm(13400×g)离心2min。

8)将吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μl Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12000rpm(13400×g)离心1min。弃去吸附柱，把DNA 保存于-20℃。

9)扩增产物经测序与参考基因组序列一致。

GhAIL6基因的CDS序列如下(SEQ ID NO.3)：

ATGGCATCAG CGAGTAACTG GCTTTGGTTT TCACTGTCTC CAATGGAGAT GTTGAGGTCATCATCTGAGC CTCAGTTCGT GTCATATGAA GGATCTCCTG CTGCTTCTTC TCATCATCTC ATCGATAACTTCTATGCTAA TGGGTGGACA AATCCAAAAC ATCAAGCGTT TGTTCAAGGA GAGAAGAACC AAAGCGAAGAAGCTCAAACG GAAGCATCAA TGGCGGATG A ATCTCCCATT TTTACCAGCT TCCATTACCA AGCACCAAAGCTTGAAGACT TCCTTGGCGA TTCTTCATCG ATGGTTCGAT ATTCAGATAG CCAAGCTGAA ACCCAAGAAGACTCATCTTT GACCCAAATC TACGATCCCA GTGTCTCCAC TTACTTCGAT CACCACCAAG ATCTCAACCAAATAACTGGG TTTCAAACGT TCTCGACGAA CTCGGGATCG GAAGTTGACG AGTCGTCATC AAGGGGTCGAACTCAGTTGA CTGGCGTTGA GTTACCTGGT CACTCGATTG AATCATCTGG TAACAATACT ACTAATAATAACAAAGCCAT TGTTTCGGTT GACTCGGATA ACTCAAAGAA GATAGCTGAT ACATTTGGTC AAAGAACTTCGATTTACAGA GGTGTCACCA GACACAGATG GACGGGTAGA TATGAAGCTC ATCTATGGGA TAACAGCTGCAGGAGAGAGG GTCAAGCCAG AAAAGGCCGT CAAGTATACT TAGGTGGTTA TGATAAGGAA GAAAAGGCTGCTCGGGCTTA CGATCTGGCC GCTTTAAAAT ACTGGGGTCC TACAGCAACC ACCAACTTCC CGATTTCGGATTATTCAAAA GAGTTGGAAG AGATGAAGCA TGCGACCAAG CAAGAGTTTA TTGCATCCTT GAGGAGGAAAAGTAGCGGAT TTTCAAGGGG TGCATCGATT TACAGAGGTG TCACAAGGCA TCATCAACAG GGCCGATGGCAAGCAAGGAT AGGTCGGGTT GCTGGAAACA AGGACTTGTA CCTTGGGACA TTCGCTACTG AAGAGGAGGCAGCAGAGGCA TATGATATTG CAGCCATCAA GTTCCGAGGT GTCAATGCGG TGACTAACTT CGAGATGAGTCGGTATGATG TCAAAGCCAT TGCCCAGAGT TCTCTTCCCA TTGGTGGGGC AGCCAAGCGC TTAAAGCTTTCACTTGAATC AGAGCCAAAA CCGATAGTGA ACCAGAAGCA ACAACCACCA CCACCCCGGT GCAGCTCCAACAGCAATCTT ATAAGTTTTG CTCCCATGAA GCAGCCGGTT TCCACTATTC CTTGTGGAAT CCCTTTCGATGCTGCAGCAG CAACGGCTGC ATTTTATCAA CAGAATCTCT ACCAGCACCT TCAGACTGCC AACACCAGCGTCACTGAACC CCCAGGTTCT TCCTCGACAA CGGTGATGCC GCAGCCAGCG GCTGAGTTCT TTTTATGGCCTCACCCATCC TATTAA

3.pCAMBIA2300GRGhAIL6载体构建

将GhAIL6基因CDS序列通过酶切酶连的方式连接至实验室 pCAMBIA2300GR载体，使用Kpn I和BamH I两个酶切位点对载体进行酶切线性化，使用上下游引物将胶回收的基因连接到pCAMBIA2300GR载体上，构建成pCAMBIA2300GRGhAIL6载体，载体示意图如图1所示。

将测序正确的目的基因片段以及pCAMBIA2300GR载体进行双酶切，则采用以下酶切体系：

37℃酶切4h，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳以及胶回收。

按照目的片段浓度是载体浓度3～10倍的原则添加(根据琼脂糖凝胶电泳结果，如果点样体积相同，亮度一致，两个片段浓度比是片段大小的反比)，做 10μL体系，体系如下(以下体系按照目的片段浓度是载体浓度的3倍配制)：

16℃连接过夜。

将连接液转化大肠杆菌Fast T1感受态：

1)将感受态细胞Fast T1置于冰上融化；

2)加入5μL的连接产物于感受态细胞中，轻轻吸打后混匀，置于冰上25min， 0.5μLpCAMBIA2300GR质粒做阳性对照；

3)将混合物在42℃水浴中热激90s，冰上放置2min；

4)加入800μL LB混匀，37℃，150r/min，培养1h；

5)4000r/min离心1min，弃上清600μL，用枪头将菌液吸打，将剩余的200μL 菌液铺匀至Kana抗性的LB固体培养基上，晾干；

6)用封口膜封口，置于37℃恒温箱培养过夜；

7)挑选多个单菌落进行PCR阳性鉴定，纯化鉴定后送去测序。

4.重组质粒转化农杆菌

将构建好的测序正确的pCAMBIA2300GRGhAIL6载体用热激法转入农杆菌 LBA4404中可用于棉花遗传转化。方法如下：

1)取一管农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上溶解，吸取10μL要转化的质粒加入到感受态细胞中，轻轻吸打，混匀后冰浴25min；

2)将装有混合液的离心管放入液氮中5min，然后放入37℃水浴锅中热激5min，然后置于冰上2min；

3)在超净工作台内，加入800μL LB培养液于离心管中，置于200r/min 28℃摇床内培养4h；

4)将已转化的大肠杆菌菌液接种到Kana和Rif双抗性的LB培养基上，吹干， 28℃培养箱中培养两日；

5)农杆菌阳性单菌落鉴定，获得农杆菌阳性单菌落；

6)将农杆菌阳性单菌落接种至装有10mL Kana和Rif双抗性的液体LB培养基的三角瓶中，至于28℃，200r/min培养2日。

5.农杆菌侵染棉花下胚轴

胚性愈伤组织获取：取若干个冀合713棉种(山西省农科院棉花所提供)，放入大烧杯中加少量浓硫酸立即用玻璃棒迅速搅拌均匀使烧杯中所有棉种变黑,然后立即用自来水冲洗,反复冲洗以使硫酸彻底洗净(至少冲洗25次).之后将棉种摊开放在报纸上晾干。已去绒的棉种约300粒放入250ml三角瓶中,加入 150ml3％H2O溶液,震荡培养(28℃120rpm)每隔8—12小时跟换新的3％H2O2溶液；发芽后即可进行播种。种子萌发后,在无菌条件下将其种皮捏去,播于无菌苗培养基(MS培养基)中,扎好口,做好标记(内容、日期).28℃黑暗培养4d.之后光照培养1d(16h光照+8h黑暗).5d后,种苗即可长至10cm以上,此时下胚轴可用于农杆菌侵染或愈伤诱导。

转化农杆菌将转化有pCAMBIA2300GR-GhAIL6质粒农杆菌接种于5mlK+, Rif+的LB培养基中28℃小摇摇至变成橙色进而变成土棕色后以1：100的比例取小摇菌液加入加有AS(酰丁香酮终浓度200uM)、K+、Rif+的LB培养基中,28℃摇1h,即可用于侵染。无菌条件下侵染下胚轴小段10min。纸吸干多余菌液后,铺于铺有5—6层无菌滤纸的共培养培养基(MS+lmg/L IAA/24—D/ KT)上,封口做好标记,28℃共培养48h；将共培养48h后的下胚轴外植体转入添加 DEX(30uM)的K+Cef+/特美汀抗性愈伤诱导培养基(B29 MS+1mg/LIAA/24 —D/KT)暗培养20—30天,随后见光培养20天,诱导出愈伤组织。

6.胚性愈伤组织诱导与统计

将诱导出的愈伤组织转入添加DEX(30uM)加有激素的愈伤继代培养基 (DB29,MS+0.1mg/L IAA/24—D/KT)中进行继代培养20天后,将鲜嫩的已分化的愈伤组织转入添加DEX(30uM)无激素的愈伤继代培养基(DB29)中进行再次继代,每20天继代一次,均挑选鲜嫩的已分化的愈伤组织转入添加DEX(30uM)无激素愈伤继代培养基(DB29)中进行继代大约继代2—3次后,会渐渐有胚性愈伤组织自发生出将胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基(MSC培养基)中以诱导生成胚状体

注：培养基添加DEX可以诱导GhAIL6-GR融合蛋白进入细胞核发挥转录因子的调控作用。整个再生实验以不添加DEX的培养基为对照组。

自交扩繁后，使用T3代种子进行再生能力鉴定，分别在组培45 55 65 85 天时统计胚性愈伤组织形成率EDR，结果见2和图3。图2中展示组培培养基上培养的棉花下胚轴在45天时，转GHALI6基因的转化株出现胚性愈伤组织(方框内)，而对照没有胚性愈伤组织形成。图3展示三个株系统计的胚性愈伤组织形成率显著高于对照。统计分析发现有3个株系的胚性愈伤组织形成率显著高于对照(pvalue<0.01)。

对这三个GhAIL6过表达株系进行southern检测，结果如图4所示，表明转基因均为单拷贝事件。

上述结果表明GhAIL6编码基因过表达具有明显的棉花促进胚性愈伤组织形成的作用，并通过遗传转化得到了转GhAIL6基因的材料，其具有较高的胚性愈伤组织发生率及体细胞胚胎发生效率。

虽然上文已经描述了本发明的实施例，但对于本领域的技术人员而言，在不偏离本发明的原理和精神的情况下所做的修改和替换，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> GhAIL6基因在促进植物胚性愈伤组织形成的用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggtacccc atggcatcag cgagtaactg g 31

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggatcccg aagcttatcg atttatagga tgggtgaggc 40

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcatcag cgagtaactg gctttggttt tcactgtctc caatggagat gttgaggtca 60

tcatctgagc ctcagttcgt gtcatatgaa ggatctcctg ctgcttcttc tcatcatctc 120

atcgataact tctatgctaa tgggtggaca aatccaaaac atcaagcgtt tgttcaagga 180

gagaagaacc aaagcgaaga agctcaaacg gaagcatcaa tggcggatga atctcccatt 240

tttaccagct tccattacca agcaccaaag cttgaagact tccttggcga ttcttcatcg 300

atggttcgat attcagatag ccaagctgaa acccaagaag actcatcttt gacccaaatc 360

tacgatccca gtgtctccac ttacttcgat caccaccaag atctcaacca aataactggg 420

tttcaaacgt tctcgacgaa ctcgggatcg gaagttgacg agtcgtcatc aaggggtcga 480

actcagttga ctggcgttga gttacctggt cactcgattg aatcatctgg taacaatact 540

actaataata acaaagccat tgtttcggtt gactcggata actcaaagaa gatagctgat 600

acatttggtc aaagaacttc gatttacaga ggtgtcacca gacacagatg gacgggtaga 660

tatgaagctc atctatggga taacagctgc aggagagagg gtcaagccag aaaaggccgt 720

caagtatact taggtggtta tgataaggaa gaaaaggctg ctcgggctta cgatctggcc 780

gctttaaaat actggggtcc tacagcaacc accaacttcc cgatttcgga ttattcaaaa 840

gagttggaag agatgaagca tgcgaccaag caagagttta ttgcatcctt gaggaggaaa 900

agtagcggat tttcaagggg tgcatcgatt tacagaggtg tcacaaggca tcatcaacag 960

ggccgatggc aagcaaggat aggtcgggtt gctggaaaca aggacttgta ccttgggaca 1020

ttcgctactg aagaggaggc agcagaggca tatgatattg cagccatcaa gttccgaggt 1080

gtcaatgcgg tgactaactt cgagatgagt cggtatgatg tcaaagccat tgcccagagt 1140

tctcttccca ttggtggggc agccaagcgc ttaaagcttt cacttgaatc agagccaaaa 1200

ccgatagtga accagaagca acaaccacca ccaccccggt gcagctccaa cagcaatctt 1260

ataagttttg ctcccatgaa gcagccggtt tccactattc cttgtggaat ccctttcgat 1320

gctgcagcag caacggctgc attttatcaa cagaatctct accagcacct tcagactgcc 1380

aacaccagcg tcactgaacc cccaggttct tcctcgacaa cggtgatgcc gcagccagcg 1440

gctgagttct ttttatggcc tcacccatcc tattaa 1476

Claims (4)

1.GhAIL6基因在促进棉花胚性愈伤组织形成的用途，其特征在于：所述的GhAIL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.GhAIL6基因在促进棉花体细胞胚胎发生的用途，其特征在于：所述的GhAIL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的GhAIL6基因在促进植物胚性愈伤组织形成通过GhAIL6基因过表达实现。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的GhAIL6基因在促进植物体细胞胚胎发生通过GhAIL6基因过表达实现。

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