CN117660525B - 一种水稻单倍体诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和植物育种领域，涉及利用孤雌生殖基因诱导单倍体的方法，尤其涉及一种水稻单倍体诱导方法。本发明提供的水稻单倍体诱导方法，包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因AtEC1.2的启动子诱导山柳菊（Pilosellapiloselloides）孤雌生殖基因PpPAR在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体。本发明方法通过将自然界存在的山柳菊孤雌生殖基因PpPAR导入水稻中，通过让其在卵细胞异位表达，成功让水稻也可以进行孤雌生殖，在不影响植株生长发育的前提下，而能够诱导单倍体产生，为水稻单倍体育种提供了新的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物育种领域，具体涉及利用孤雌生殖基因诱导单倍体的方法。
背景技术
水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，选育优良品种有利于保障水稻稳产增产。水稻育种过程一般需要5-10年时间，而通过双单倍体育种技术可以实现1-2代内完成品系纯化，可极大地缩短育种周期。双单倍体育种技术的第一步是获取单倍体。目前水稻中最常用的技术是花药离体培养，但是该技术对实验条件要求较高，并且受遗传背景的影响，很多品种无法培养出单倍体植株。体内单倍体诱导技术可以很好地避免以上缺陷。孤雌生殖是体内单倍体诱导技术的一个非常重要的途径。
水稻中目前已经报道的可以诱发卵细胞自主发育的孤雌生殖基因只有BBM1和BBM4， 其中BBM1的克隆种子诱导率较高，但是其结实率较低，且不同遗传背景之间差异巨大；另外，BBM4结实率在不同株系中差异巨大，且其诱导率也仅为3.2%。这两个基因在育种上应用均存在一定局限，急需新的孤雌生殖基因。
发明内容
本发明提供了一种水稻单倍体诱导方法，其包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因AtEC1.2的启动子诱导山柳菊（Pilosella piloselloides）孤雌生殖基因PpPAR在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体，所述AtEC1.2的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述PpPAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法包括以下步骤：
（1）载体构建:首先设计引物，用引物分别从拟南芥和山柳菊中克隆基因AtEC1.2的启动子和基因PpPAR；接着将骨架载体pUB09进行酶切；最后利用多片段同源重组试剂盒，构建完整复合载体即得到重组产物；所述的重组产物核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
（2）将上述得到的重组产物进行克隆；
（3）遗传转化：用农杆菌进行转化实验，获得转基因植株；
（4）单倍体鉴定。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其载体构建步骤所设计引物为：AtEC1.2pro-F：AAATGTTCCTCGCTGACGT；
AtEC1.2pro-R：ACTTGTGTTAGAAGCCATTATTCT；
PpPAR-F：ATGGTAGATGATGGCACCGC；
PpPAR-R：GGCACCGTCGTCCTCCT；分别为SEQ ID NO.1-4所示。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其载体构建步骤还包括：为两对所设计引物序列加上同源重组的接头，其中，在PpPAR序列之后加上3xgggs序列，引物如下：
AtEC1.2pro-fusion-F：tctagccaatacgcgagctcaagctAAATGTTCCTCGCTGACGTA；
AtEC1.2pro-fusion -R：CATCTACCATACTTGTGTTAGAAGC；PpPAR-fusion -F：TAACACAAGTATGGTAGATGATGGC；
PpPAR-fusion-R：ccttgctcaccatactagtggatcTtgagccacctcccgagccaccgccggaaccgccaccGGCACCGTCGTCCTCCTCCG；分别为SEQ ID NO.5-8所示。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其重组产物进行克隆时，将所述重组产物转入感受态细胞DH5α中进行克隆。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其遗传转化时，利用农杆菌EHA105菌株介导的遗传转化方法 。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其转化的水稻品种为籼粳杂交稻品种春优84。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其单倍体鉴定步骤为：先利用Indel标记进行初步鉴定，再将鉴定得到的单倍体用流式细胞术进一步鉴定。
进一步地，本发明所述的水稻单倍体诱导方法，其单倍体鉴定步骤，依据CY84亲本籼稻C84和粳稻春江16A设计的12对Indel分子标记，区分CY84杂合子和纯合子，如果是单倍体Indel条带应为单条带。
本发明还提供所述的水稻单倍体诱导方法在水稻育种中的应用。
技术效果：水稻自身不能进行孤雌生殖，也无法产生单倍体，但是单倍体诱导技术可以极大的缩短水稻育种进程，是一个非常重要的技术途径。本发明方法通过将自然界存在的山柳菊孤雌生殖基因PpPAR导入水稻中，通过让其在卵细胞异位表达，成功让水稻也可以进行孤雌生殖，在不影响植株生长发育的前提下，而能够诱导单倍体产生，为水稻单倍体育种提供了新的解决方案。
附图说明
图1是载体图谱；
图2 是Indel标记筛选单倍体胶图；
图3是流式细胞术筛选单倍体图；
图4是AtEC1.2启动子序列图；
图5是山柳菊孤雌生殖基因PpPAR序列图；
图6是各株系的结实率及单倍体诱导效率图；
图7是具有单倍体诱导效率的株系的表型图；
图8是Indel分子标记检测单倍体图；
图9是流式细胞术检测单倍体图；
图10是单倍体植株表型图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式，具体阐述本发明，本发明具体实施方式的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明具体实施方式所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明具体实施方式中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明的具体实施方式为将本方法应用于籼粳杂交稻春优84中，获得了结实率较高且稳定的转基因株系，在后代植株的倍性鉴定中，成功鉴定到了单倍体植株。本方法的主要步骤分为：载体构建、克隆重组产物、遗传转化、单倍体鉴定和检测结果。
1.载体构建：
（1）分别在拟南芥和山柳菊中克隆相关序列，引物如下：
AtEC1.2pro-F：AAATGTTCCTCGCTGACGT
AtEC1.2pro-R：ACTTGTGTTAGAAGCCATTATTCT
PpPAR-F：ATGGTAGATGATGGCACCGC
PpPAR-R：GGCACCGTCGTCCTCCT
利用回收试剂盒纯化产物。
（2）给两个序列加上同源重组的接头，其中，在PpPAR序列之后加上3xgggs序列，引物如下：
AtEC1.2pro-fusion-F：tctagccaatacgcgagctcaagctAAATGTTCCTCGCTGACGTA
AtEC1.2pro-fusion -R：CATCTACCATACTTGTGTTAGAAGC
PpPAR-fusion -F：TAACACAAGTATGGTAGATGATGGC
PpPAR-fusion -R：ccttgctcaccatactagtggatcTtgagccacctcccgagccaccgccggaaccgccaccGGCACCGTCGTCCTCCTCCG
利用回收试剂盒纯化产物。
（3）将骨架载体pUB09进行酶切：
COMPONENT 50 µl REACTION
pUB09 1 µg
10X rCutSmart Buffer 5 µl (1X)
HindIII-HF 20 units
BamHI-HF 20 units
Nuclease-free Water to 50 µl
37°C酶切5h，利用回收试剂盒纯化产物。
（4）利用多片段同源重组试剂盒（诺唯赞C113），构建完整复合载体即得到重组产物：
COMPONENT 20 µl REACTION
pUB09酶切 100ng
AtEC1.2pro-fusion片段 20ng
PpPAR-fusion片段 10ng
5 × CE MultiS Buffer 4 µl
Exnase MultiS 2 µl
Nuclease-free Water to 20 µl
37℃反应30 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
2. 克隆将上述重组产物
将上述重组产物转入感受态细胞DH5α进行克隆：
a)在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞；
b)取10µl重组产物加入到500µl感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30 min；
c)42℃水浴热激45 sec后，立即置于冰上冷却2 min；
d)加入900µl LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1 h(转速200 rpm)；
e)5,000 rpm离心1 min，留100µl重悬，涂布在对应抗性的平板上；
f)37℃培养箱中倒置培养12 - 16 h。
菌落PCR检测出阳性克隆，送公司测序，测序引物NOS-R：agtaacatagatgacaccgc。
3.遗传转化：
克隆载体测序正确，进行下一步农杆菌转化实验，利用农杆菌EHA105菌株介导的遗传转化方法转化籼粳杂交稻品种春优84（CY84）以获得转基因材料。将种子去壳，用75%乙醇消毒1 min，倒掉乙醇，加入2%次氯酸钠溶液消毒20 min，期间放置于摇床上；在超净工作台内倒掉次氯酸钠溶液，利用无菌水漂洗4-5次，将种子放在灭过菌的滤纸上，将水分吸干；随后将种子接到N6成熟胚愈伤诱导培养基上，28℃暗培养约1个月时间，挑状态良好的胚性愈伤继代培养2-3次，挑选第二次继代培养3-5 d的胚性愈伤做转化。
将胚性愈伤浸泡在活化好的带有目的质粒农杆菌EHA105菌液（含有乙酰丁香酮）中30 min，无菌水清洗愈伤组织数次，超净工作台中吹干残留液体后19℃共培养2-3 d，转移至加有筛选标记抗生素的筛选培养基上进行筛选，每次筛选过程持续2周时间，经过2-3轮筛选，以获得新长出的愈伤组织。然后再将新长出的愈伤组织转移到预分化培养基上培养7 d，再转移至分化培养基上，25℃ 16 h/d的光照时间培养10 d左右，会有绿色点出现，然后获得再生植株。分化出的转基因苗剪掉根后放入生根培养基2-3周，然后掀开封口膜，加水炼苗1周，移栽。
4.单倍体检测：
(1)先利用Indel标记鉴定单倍体
依据CY84亲本籼稻C84和粳稻春江16A设计的12对Indel分子标记，区分CY84杂合子和纯合子，如果是单倍体Indel条带应为单条带，引物序列如下：
引物名称 正向引物 (5’-3’) 反向引物 (5’ -3’)
Indel Chr1 ATTACAGGGATGCACTGCTGAC GAAGCCACTCTGAAATCGGCA
Indel Chr2 CGTGGCCATCTTGTAGTG GCTGCAGTAGACAGAGAT
Indel Chr3 CTTGCCCATCAGCCTATCAC ACACGTACACAGCCATGAGA
Indel Chr4 TGCCTCTTTCGAACGTATCC TAAGCTACGAGCAGTGGACA
Indel Chr5 ACAGCGATAATAACACGCACAA TCAAGTGCTATACTTGACACGG
Indel Chr6 ACGCCGCTAGGATATTGGAAGAC TCCGACGCGGCACGAACCAACG
Indel Chr7 ATATGCACAAAGGTAGCGTG TGCTATTATCGACAAGAAGG
Indel Chr8 AGGTCTTCTGTCCAAGTTCA AACCATATAAACTCATCTGC
Indel Chr9 ATTCTTGTGAGGACGGGAGG GAGAGGCGGTTACCATCTGC
Indel Chr10 GCGCATCCATGCATATCCAA GACAAGGTGTTGCCCAAGAA
Indel Chr11 GGCATCATTAAGGCTTGT CTGGCGATCTCTGTGAGG
Indel Chr12 GAGCAGATCACCCCTAAATTATG GATTCATTCATCTTTCGAAGAG
(2)再利用流式细胞术进一步鉴定单倍体
裂解缓冲液LB01：Tris 363.4 mg，Na2EDTA 148.9 mg，Sperminetetrahydrochloride 34.8 mg，KCl 1.193 g，NaCl 233.8 mg，Triton X-100 200 µl ，定容至200 mL，用1M HCl调pH至7.5，在通风厨中加入220 µl β-mercaptoethanol。在超净工作台中用0.22 µm的滤头抽滤除菌和分装，在-20℃保存。
碘化丙啶(Propidium iodide, PI)母液(1 mg/ml)：称取50 mg粉末溶于50 mLddH2O中；在超净工作台中用0.22 μm的滤头抽滤除菌和分装，-20℃保存。
RNase母液(1 mg/ml)：称取25 mg RNase (IIA Sigma)溶于25 ml ddH2O；在超净工作台中用0.22 µm的滤头抽滤除菌和分装；90℃加热15 min使其中DNase失活；-20℃保存。
实验操作如下：
剪取生长10天大小4-5 cm长的新鲜水稻叶片放入玻璃皿中，加入1 ml植物裂解缓冲液LB01，用刀片垂直向下快速切碎组织。吸取培养皿内的裂解液，用50 µm尼龙网过滤至离心管中，在管盖上做好样品标记。台式冷冻离心机中，4℃下1,200 rpm离心5 min。轻轻取出离心管，缓慢吸去上清，加入450 µl 的LB01、25 µl 预冷的PI 和25 µl RNase A。4℃避光染色10 min。BD Accuri C6上机检测。如果是单倍体其峰值应该为二倍体的一半。
5.检测结果：
通过遗传转化总共获得了13个阳性株系。这个13个株系的生长发育与野生型一致，结实率较为稳定（47.08~60.88%）。待种子成熟，收获这13个株系的种子，萌发种子用于单倍体鉴定。通过Indel分子标记标记筛选及流式细胞术的鉴定，最终在两个株系（eePA-12和eePA-13）中分别筛选到了3株单倍体，其单倍体诱导效率分别为1.43%和1.48%。单倍体植株生长发育不正常，且不能结实。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种水稻单倍体诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：用拟南芥卵细胞特异表达基因AtEC1.2的启动子诱导山柳菊孤雌生殖基因PpPAR在水稻卵细胞中异位表达，诱导水稻进行孤雌生殖，得到水稻单倍体，所述AtEC1.2的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述PpPAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；具体包括以下步骤：
（1）载体构建:首先设计引物，用引物分别从拟南芥和山柳菊中克隆基因AtEC1.2的启动子和基因PpPAR；接着将骨架载体pUB09进行酶切；最后利用多片段同源重组试剂盒，构建完整复合载体即得到重组产物；所述的重组产物核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；
（2）将上述得到的重组产物进行克隆；
（3）遗传转化：用包含所述重组产物的农杆菌转化由水稻种子制备得到的胚性愈伤组织，经培养获得转基因植株；
（4）对所述转基因植株的种子进行单倍体鉴定。
2.根据权利要求1所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其载体构建步骤所设计引物为： AtEC1.2pro-F：AAATGTTCCTCGCTGACGT；
AtEC1.2pro-R：ACTTGTGTTAGAAGCCATTATTCT；
PpPAR-F：ATGGTAGATGATGGCACCGC；
PpPAR-R：GGCACCGTCGTCCTCCT。
3.根据权利要求2所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其载体构建步骤还包括：为两对所设计引物序列加上同源重组的接头，其中，在PpPAR序列之后加上3xgggs序列，引物如下：
AtEC1.2pro-fusion-F：tctagccaatacgcgagctcaagctAAATGTTCCTCGCTGACGTA；
AtEC1.2pro-fusion -R：CATCTACCATACTTGTGTTAGAAGC；
PpPAR-fusion -F：TAACACAAGTATGGTAGATGATGGC；
PpPAR-fusion-R：ccttgctcaccatactagtggatcTtgagccacctcccgagccaccgccggaaccgccaccGGCACCGTCGTCCTCCTCCG。
4.根据权利要求3所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其重组产物进行克隆时，将所述重组产物转入感受态细胞DH5α中进行克隆。
5.根据权利要求4所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其遗传转化时，利用农杆菌EHA105菌株介导的遗传转化方法 。
6.根据权利要求5所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其转化的水稻品种为籼粳杂交稻品种春优84。
7.根据权利要求6所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其单倍体鉴定步骤为：先利用Indel标记进行初步鉴定，再将鉴定得到的单倍体用流式细胞术进一步鉴定。
8.根据权利要求7所述的水稻单倍体诱导方法，其特征在于，其单倍体鉴定步骤，依据CY84亲本籼稻C84和粳稻春江16A设计的12对Indel分子标记，区分CY84杂合子和纯合子，如果是单倍体Indel条带应为单条带，所述的12对Indel分子标记分别为SEQ ID NO.9-32所示。
9.权利要求1-8任一所述的方法在制备单倍体水稻中的应用。
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