CN108374012B - 橡胶树白粉菌内源启动子wy51及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途，所述启动子WY51具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的变体。本发明还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、转基因植物、外植体和愈伤组织。所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。

Description

橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途。

背景技术

启动子是起始基因转录的一段能够被RNA聚合酶所识别、结合并有效起始下游序列转录的DNA序列，是基因表达调控的关键点。根据启动子调控模式特点大致可分为组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子这三类。在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。

组成型启动子的表达不受外界环境的调控且无组织特异性，几乎在所有器官和组织中都有表达，且表达一般具有持续性，不表现时空特异性。目前转基因工程中使用的启动子多数都是组成型的，在双子叶植物的转基因工程中被广泛应用的是烟草花叶病毒的CaMV35S启动子。Ca MV35S启动子具有多个顺式作用元件，其转录起始位点上游343-46bp处是转录增强区，上游343-208bp处和208-90bp处是转录激活区，90-46bp处是转录活性进一步增强区。在了解Ca MV35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人们就可以利用它的核心序列构建人工启动子使之转录活性进一步增强或进一步寻找表达强度更强的启动子来替代Ca MV35S启动子。另外，玉米泛素基因Ubi-1启动子和水稻肌动蛋白基因Actin1启动子也属于组成型启动子，有研究表明这些启动子在单子叶植物大麦和玉米中的表达效率是CaMV35S的几十甚至上百倍，而在双子叶植物中仅有微弱的表达。由于组成型启动子具有持续性、稳定性和高效性等优点，可通过过表达来研究目的基因功能或者获取某一表达的产物，最大限度地实现人们的研究目的。组成型启动子可使目的基因高效而持续地表达，但外源基因的有效表达常常导致大量的植物能量和营养成分的消耗，并且不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，影响植物的生长和发育。此外，如果重复采用同一类型启动子驱动两个或以上外源基因则有可能引发基因沉默。因此，为了控制植物中外源基因表达的时间和精度，并减少对植物生长、发育和代谢途径的影响，采用诱导型或组织特异型启动子代替组成型启动子可以更灵活的调控目的基因的表达。

现有的研究结果表明，真菌内源启动子在表达内源基因时通常表达量惊人，而在表达外源基因时往往表达量大大降低。橡胶树白粉菌是一种专性寄生真菌，其遗传转化体系尚未建立，找到一种强效内源启动子，加强后期工作中其在橡胶树白粉菌中调控内源基因表达的相关研究，对于建立橡胶树白粉菌遗传转化体系也是不无裨益的。

发明内容

针对以上现有技术的不足之处，本发明提供一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51。

本发明采取的技术方案如下：

一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选的，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。

进一步的，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。

进一步的，本发明还涉及一种重组载体，所述载体为本发明的启动子与pGEM-Teasy或PBI 121质粒经重组所得。

进一步的，本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。

优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。

进一步的，本发明还涉及一组引物对，所述引物对的两条引物分别含有SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的序列；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。

进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及所述启动子WY51或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子WY51，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。

附图说明

图1为重组载体PBI121-WY51的质粒图谱。

图2为启动子WY51重组载体PBI121-WY51的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的GUS染色结果。

图中，WY51为PBI121-WY51转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK⁺(CaMV35S)为由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK^-(无菌苗)为未转化的三生烟无菌苗叶盘的GUS染色结果。

图3为WY51转基因三生烟各生长时期图；

图中，由左至右依次为共培养期、愈伤期、侧芽期、生根期、成株期。

图4为WY51调控GUS基因转基因三生烟的PCR扩增检测结果。

图中，M:Marker2000；WY51：WY51调控GUS基因转基因三生烟叶片DNA；CK⁺：转PBI121空载体的转基因三生烟；CK^-:野生型三生烟。

图5为启动子WY51重组载体PBI121-WY51的重组根癌农杆菌介导转化的水稻(日本晴)愈伤的GUS染色结果；

图中，WY51为PBI121-WY51转化水稻愈伤叶盘的GUS染色结果；CK⁺(CaMV35S)为由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化水稻愈伤的GUS染色结果；CK^-为未转化的日本晴水稻愈伤的GUS染色结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一、WY51启动子片段的PCR扩增

使用真菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，D3390-01)提取橡胶树白粉菌(海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供)的基因组DNA，根据WY51启动子的序列，设计一对特异性扩增引物(上游引物WY51F，加限制性酶切位点HindⅢ和保护碱基，下游引物WY51R，加限制性酶切位点BamHⅠ和保护碱基)。以上述提取的橡胶树白粉菌的基因组DNA为模板，使用高保真Ex Taq聚合酶(TRANSGEN，AP122)进行PCR扩增。如表1所示。

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸5min。

上游引物WY51F：CCCAAGCTTATTGGTATTCGAGTACATGG，其中下划线代表HindⅢ酶切位点。下游引物WY51R：CGGGATCCTGTTTCTGACTCACTTGCAAA，其中下划线代表BamHⅠ酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为260bp左右的条带，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：D2500-01)进行纯化回收。

实施例二、pGEM-T easy-WY51重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pGEM-T easy质粒，PROMEGA，A1360)转化大肠杆菌(TRANSGEN,CD201)，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：10ul

pGEM-T Easy Vector(PROMEGA，A137A):1ul

2×Rapid ligation Buffer:5ul

PCR扩增产物(回收插入片段)：2ul

T4DNA ligase:1ul

ddH₂O:1ul

先置于室温1小时，然后于4℃连接过夜，得到pGEM-T easy-WY51重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgene,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pGEM-T easy-WY51重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(氨苄青霉素,IPTG,X-gal)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养12h～16h。获得含有pGEM-T easy-WY51克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-WY51。深圳华大基因科技有限公司对pGEM-T easy-WY51克隆载体中的WY51进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

测序结果表明，获得的pGEM-T easy-WY51克隆载体中WY51启动子序列正确。

实施例三、PBI121-WY51重组载体的构建

将上述构建获得的DH5α-WY51菌株挑取单菌落进行摇菌，37℃220rpm摇菌过夜，用OMEGA质粒小提试剂盒(D6943-01)提取质粒，然后用HindⅢ(NEB,R0104S)和BamHⅠ(NEB,R0136V)限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用OMEGA回收试剂盒(D2500-01)进行回收WY51启动子片段。

将上述得到的回收产物与PBI121质粒(TIANNZ，60908-750y)进行连接，然后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：10ul

PBI121Vector:1ul

10×T4DNA Ligase Buffer:1ul

回收产物(WY51启动子片段)：6ul

T4DNA Ligase(Ta Ka Ra，D2011A)：0.5ul

ddH₂O:1.5ul

16℃连接过夜，得到PBI121-WY51重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgen,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即PBI121-WY51重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl 4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃200rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有PBI121-WY51克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-PWY51。深圳华大基因科技有限公司对PBI121-WY51克隆载体中的WY51进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

测序结果表明，获得的PBI121-WY51克隆载体中WY51启动子序列正确。

实施例四、重组根癌农杆菌LBA4404-WY51细胞的制备

将重组大肠杆菌DH5α-PWY51挑取单菌落在含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中摇菌，37℃200rpm，生长到OD₆₀₀为0.5左右，与含有协助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101和受体农杆菌LBA4404的感受态细胞等体积混匀，用涂抹棒涂布于不含有任何抗生素固体的LB培养基平板上，28℃培养过夜。用接种针将长出的菌落转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，28℃培养3-4天。将长出的单菌落再次转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，挑取单菌落用含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基摇菌，37℃200rpm，以引物对WY51F、WY51R进行菌落PCR验证，同时提取质粒用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切验证。条带为260bp左右的即为重组根癌农杆菌LBA4404-WY51细胞。

实施例五、重组根癌农杆菌介导转化三生烟

1)烟草无菌苗的获得

烟草种子浸泡：将三生烟种子装入1.5ml离心管(＜50粒/管)，加入1ml ddH₂O，用移液枪反复吸打，更换ddH₂O，放入4℃冰箱，浸泡2到3天进行春化。

烟草种子消毒：春化好的三生烟种子用移液枪吸出ddH₂O，加入1ml 75％的无水乙醇浸泡2min，用移液枪吸出无水乙醇，用ddH₂O反复洗3至5次，洗净种子，每次用ddH₂O 1ml。然后再用移液枪加入3％的次氯酸钠溶液浸泡种子3min，再用ddH₂O洗3至5次，最后用移液枪吸出ddH₂O。

接种：用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再用吸头将三生烟种子接种于MS固体培养基平板上进行萌发，每皿10—20粒，置于26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养一周，光照强度为2000lx(本发明的所有的光照培养均在此光照强度下进行)。

转接：三生烟长出幼苗后，转入装有新鲜MS固体培养基的组培瓶，每瓶(Φ6cm，H11cm，50ml培养基/瓶)1株烟草小苗，26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养3—5周，获得三生烟无菌苗。

2)烟草无菌苗的继代和扩繁

剪除三生烟无菌苗的叶片和根，将茎杆剪为带有腋芽的小段，每段长约2—3cm，用枪镊夹住将其形态学下端垂直插入含有新鲜MS固体培养基的组培瓶内。每瓶接种一个带有腋芽的茎段，26℃光照培养3—5周，此即待转化材料。

3)侵染菌液的制备

将重组根癌农杆菌LBA4404-WY51挑取单菌落转入含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基，28℃200rpm摇菌过夜。吸取少量菌液转入30倍体积的含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基，相同条件进行复摇。培养至OD₆₀₀为0.6—0.8，即为侵染菌液。

4)侵染

从培养3—5周的无菌三生烟苗上剪取较大的叶片，盛入装有少许ddH₂O的无菌培养皿中。用直径约1cm的打孔器将烟草叶片打成叶圆盘，或者用无菌手术刀将烟草叶片切为边长约1cm的近似正方形的叶盘，放入另一个装有少许ddH₂O的无菌培养皿中。

用枪镊将烟草叶盘夹出，放入装有适量侵染菌液的无菌50ml离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10—25min，期间不断摇晃几次。捞出烟草叶盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4—10块叶盘，26℃暗培养2天。

5)筛选

暗培养结束的烟草叶盘转接到含有5—10ug/ml卡那霉素和1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA和100ug/ml特美汀的MS固体培养基平板中，26℃光照培养。培养2—4天后，取没有变白的叶盘进行GUS染色。37℃染色过夜后以75％乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。

结果如图4所示，含有启动子WY51的重组载体PBI121-WY51的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘经GUS染色后变蓝。结果显示本发明的WY51启动子在双子叶模式植物三生烟中对GUS基因具有调控作用。

GUS染色液配方：

0.25mM K₃Fe(CN)₆,0.25mM K₄Fe(CN)₆,64mM Na₂HPO₄·12H₂O,36mM KH₂PO₄,10mMNa₂EDTA,0.1％Trition X-100,10％CH₃OH,2.5mg/ml X-Gluc.

实施例六：转基因烟草中GUS基因的表达

取部分上述转化过的三生烟叶盘继续光照培养，约两周后继代，约四周后出现丛生芽。当丛生芽生长到1—2cm时，用灭菌过的手术刀切下，接种到含有5—10ug/ml卡那霉素和100ug/ml特美汀的1/2MS培养基中，每瓶1株。26℃光照培养约2周。取生根状况良好的烟草小苗，在培养箱里打开组培瓶的盖子，炼苗2—3天。

剪除转基因烟草小苗的大部分叶片，小心洗掉根部大部分培养基，移栽到灭过菌的土壤里，进行盆栽。生长约2—3周，取长出的新叶提取DNA进行PCR扩增验证。扩增引物为WY51F、WY51R。

扩增产物经1％琼脂糖电泳，结果如图5显示，得到了一条约250bp的条带，与WY51大小一致，转PBI121空载体的阳性对照和三生烟野生型无菌苗则无条带。

实施例七：水稻愈伤组织的诱导和转化

诱导水稻愈伤组织，用重组根癌农杆菌LBA4404-WY51转化所述愈伤组织。

1)水稻种子灭菌

将成熟的日本晴水稻种子手工去壳，加70％乙醇处理1—2min，倒净乙醇，用无菌水冲洗三次。加0.1％HgCl₂浸泡15min，用无菌水冲洗三次，晾干，备用。

2)水稻愈伤组织的诱导和继代

将消毒后的含胚米粒接种到N6D培养基上，29℃生化培养箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生。将长出的水稻愈伤组织从种子上剥离，转接到新的N6D培养基上，继代培养。大约每两周继代一次。

3)农杆菌LBA4404-WY51的活化及转化菌液制备

挑选黄白色，干燥的活跃愈伤组织，接种到新的N6D培养基上培养三天。

挑取重组根癌农杆菌LBA44O4-WY51的单菌落，在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的液体YM/YEP/LB培养基上中，28℃，250rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.8—1.0。吸取1ml培养好的菌液加入50ml含50ug/ml的卡那霉素的YM/YEP/LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀＝0.8—1.0。4℃，4000rpm离心，沉淀菌体，然后用含适量MS重悬菌液培养至OD₆₀₀＝0.5左右，备用。

4)转化

将继代培养的水稻愈伤组织放入灭菌培养皿中，将LBA4404-WY51重悬液倒入培养皿，浸泡水稻愈伤组织15—30min。将水稻愈伤组织移出放在灭菌滤纸上，滤掉多余液体。N6共培养基上放一张灭菌滤纸。将水稻愈伤组织放到滤纸上，密封培养，28℃暗培养48—60小时。

5)筛选

将受感染的水稻愈伤组织用1％的甘露醇溶液清洗3—4次，然后用无菌水振荡清洗3—4次，直到上清液变澄清。最后用300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的无菌水溶液清洗3—4次。将愈伤组织放在无菌滤纸上，除去多余水分。最后将愈伤组织接种到含有5—10ug/ml的卡那霉素和300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的N6培养基上，密封，29℃暗培养，约两周继代一次。

实施例八：日本晴水稻愈伤组织中的GUS基因的表达

将用LBA4404-WY51转化的水稻愈伤组织进行GUS染色。

GUS染色液的配方(1ml)：

0.25mM K₃Fe(CN)₆,0.25mM K₄Fe(CN)₆,64mM Na₂HPO₄·12H₂O,36mM KH₂PO₄,10mMNa₂EDTA,0.1％Trition X-100,10％CH₃OH,2.5mg/ml X-Gluc。

用LBA4404-WY51转化的水稻愈伤组织于37℃浸泡在GUS染色液中，过夜。拍照，结果如图5所示，含有重组载体PBI121-WY51的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织GUS染色后变蓝色。不含重组载体PBI121-WY51的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织GUS染色后颜色不变。结果表明，本发明的WY51启动子对GUS基因的表达具有调控作用。

表2MS培养基配方

pH调至5.8，121℃灭菌20min。

表3 N6培养基配方

pH调至5.2，121℃灭菌20min。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 海南大学

<120> 橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attggtattc gagtacatgg aacatagttt gacccaatgt caaatctcca ggaaaagtgt 60

tgtcgggcgt cacaccaata gacacggtta ttgtagtaga ccaattgcta tccaatttgg 120

ttgctgaata gaattgtact ttaataattg aatcgtgtgt gactcgtggg ccacgtccac 180

caatacctgc catggtcaaa gaaaattcag aaatataagg agcgagtttt tttgcaagtg 240

agtcagaaac a 251

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attggtattc gagtacatgg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtttctgac tcacttgcaa a 21

Claims (7)

1.橡胶树白粉菌内源启动子WY51，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。

3.一种核酸构建体，其特征在于，其包含权利要求1所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子与pGEM-T easy或PBI121质粒经重组所得。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体；所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。

6.一组引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。

7.权利要求1所述的启动子WY51或权利要求3所述的核酸构建体或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，所述植物为三生烟或水稻。

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