CN112175955A - 一种在植物花粉中特异表达的强启动子cp09及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、含有CP09的基因表达盒、重组表达载体、重组菌和转基因植物细胞系，所述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、基因表达盒、重组表达载体、重组菌和转基因植物细胞系可高效驱动外源基因在植物花粉中特异性表达，表达水平精确，可避免目的基因在植物其他组织持续表达带来的不利影响，可用于创制植物雄性不育系，在植物基因工程和杂种优势的利用中具有很好的应用前景。并且，本发明公开的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的核苷酸序列较短，其全长仅409bp，易于克隆，可有效降低启动子的克隆难度和成本，有助于提高重组表达载体的构建和转化效率，有助于快速获得其转基因植物。

Description

一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程与分子生物学领域，具体涉及一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09及其应用。

背景技术

植物基因表达调控主要是转录水平的调控，由多种顺式作用元件和反式作用因子协调控制。启动子是重要的顺式作用元件，在转录调控中起关键作用。按表达方式不同可将启动子分为三类，即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子，其中，组织特异性启动子只在某些特定组织或器官(包括叶片、根、块茎、维管束、花、花粉和种子等)中驱动基因表达，实现在植物体内对外源基因表达进行定时定量的精确调控，可有效降低组成型启动子在不同部位持续表达造成的能量损失或外源蛋白过量积累对植物生长发育的不利影响，在植物基因工程领域具有广泛的应用价值。尽管目前已公开了多种植物启动子，但对于组织特异性启动子的开发仍相对缓慢，还不能满足转基因产业化不断扩大的需求。

花粉是植物有性生殖过程中的重要组成部分，花粉发育是一个由许多基因相互协调完成的复杂过程，通常将花粉特异性启动子用于创制雄性不育系和研究花粉发育过程中的某些代谢过程或基因调控途径等。一方面，将植物花粉特异性启动子与某个外源基因嵌合构建表达载体，进一步通过转化植株来阻断花粉发育的过程，从而创造植物雄性不育系；亦可通过驱动花粉育性基因在花粉中特异性表达来恢复育性。另一方面，在研究花粉中某些代谢过程或基因调控途径时，可通过某个花粉特异性启动子驱动基因过表达或基因沉默，有针对性的研究基因在花粉发育过程中的作用；有时为了提高转基因效率和研究速度，也会将同源性较低的不同花粉特异启动子与不同基因嵌合用于同一表达载体，亦可防止高同源性启动子序列可能导致的基因沉默。然而，目前已公开的具有强驱动活性并且特异性好的花粉特异性启动子非常少，难以满足上述需求。

此外，已公开的植物花粉特异性启动子核苷酸序列普遍较长，多为1500-3000bp，例如CN104946648A一种植物花粉特异性启动子PCHF32及其应用公开了一个2038bp的水稻花粉特异性启动子；CN105695464A一种水稻花粉特异表达启动子OsPoll2及其应用公开了一个2050bp的水稻花粉特异性启动子；CN105602956A一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4及其应用公开了一个1864bp的水稻花粉特异性启动子；CN109762816A一种在水稻花粉中特异表达的启动子PCHF10及其应用公开了一个2095bp的水稻花粉特异性启动子；CN102010864A玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体公开了一个2222bp的玉米花粉特异性启动子；CN106957843A一种植物花粉特异表达的启动子P-PPP1及其应用公开了一个2194bp的拟南芥花粉特异性启动子，这些启动子虽然表现出良好的花粉特异性，但其启动子核苷酸序列较长，增加了启动子的克隆难度和成本，降低了表达载体构建及转化效率，不利于快速克隆和获得转基因植物。因此，迫切需要开发一种核苷酸序列较短且具有强驱动活性的植物花粉特异性启动子，以达到在提高启动子驱动活性的前提下，提高启动子克隆效率和降低成本的目的。

综上所述，开发一种核苷酸序列较短且具有强驱动活性的植物花粉特异性启动子，不仅有助于植物花粉发育相关基因的功能分析和鉴定，也有助于创制植物雄性不育系，在植物基因工程和杂种优势的利用中具有很好的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核苷酸序列较短且具有强驱动活性的植物花粉特异性启动子及其应用，以克服现有花粉特异表达启动子的不足，促进植物花粉发育相关基因的功能分析和鉴定，从而为植物雄性不育系的创制和杂种优势的利用提供有力的工具。

为了实现上述目的，本发明提供了一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的基因表达盒，所述基因表达盒由在植物花粉中特异表达的强启动子CP09序列与外源目的基因以及转录终止序列按特定方向连接组成；所述外源目的基因包括但不限于结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA基因、长链非编码RNA(lncRNA)基因、环状RNA(circRNA)基因；在本发明的一个实施例中，所述外源目的基因具体为β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)。

本发明还提供了含有上述基因表达盒的重组表达载体，所述重组表达载体为现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，包括但不限于pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI101、pBI121、pRI201、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301植物表达载体；所述重组表达载体中还可含有选择标记基因，通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等；在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为pBI101。

本发明还提供了含有上述基因表达盒的重组菌和转基因植物细胞系。

本发明还提供了上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、上述含有在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的基因表达盒、重组表达载体、转基因植物细胞系和重组菌在驱动外源目的基因在植物花粉中特异性表达的应用。

本发明还提供了上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、上述含有在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的基因表达盒、重组表达载体、转基因植物细胞系和重组菌在制备转基因植物中的应用。

本发明所述转基因植物可通过已知的能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种转基因技术获得；在本发明的一个实施例中，所述转基因技术为农杆菌介导的转化法。

本发明所述转基因植物为外源目的基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉或受精能力增强或削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

本发明所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，优选的为十字花科植物，更优选的为白菜、甘蓝、油菜或拟南芥；在本发明的一个实施例中，所述植物为拟南芥。

本发明还提供了PCR扩增上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种分离或鉴定上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的方法，包括使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3引物对从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中经PCR扩增得到所述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的核苷酸序列。

与上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09互补的DNA分子也属于本发明的内容，利用该DNA分子也能实现与上述在植物花粉中特异表达的强启动子CP09相同的目的。

本发明的有益效果为：

1)本发明提供的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09具有强驱动活性和组织特异性，CP09能高效驱动外源基因在植物花粉中特异性表达，表达水平精确，可避免目的基因在植物其他组织持续表达带来的不利影响，在植物基因工程领域具有广泛的应用价值。

2)本发明提供的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的核苷酸序列较短，其全长仅为409bp，易于克隆，可有效降低启动子的克隆难度和成本，有助于提高重组表达载体的构建和转化效率，有助于快速获得其转基因植物。

3)本发明提供的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09可用于植物花粉发育相关基因的功能分析和鉴定，有助于了解植物花粉发育调控的分子机理。

4)本发明提供的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09可用于创制植物雄性不育系，在植物基因工程和杂种优势的利用中具有很好的应用前景。

5)本发明提供了一种高效驱动外源基因在植物花粉中特异性表达的新方法。

附图说明

图1是在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的重组表达载体pCP09-GUS的构建示意图；

图2是对本发明重组表达载体pCP09-GUS进行双酶切的鉴定图，其中泳道1为Marker；泳道2为经HindIII和BamHI双酶切得到的13891bp的pBI101线性载体片段和409bp的CP09启动子片段；泳道3为CP09启动子片段；

图3是pCP09-GUS转基因幼苗及各组织GUS染色图，A：幼苗；B：茎和成熟叶片；C：雌蕊；D：不同时期的果荚及种子；E：花序；F：雄蕊；G：花粉。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如未特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂和仪器等，如未特别说明，均可从市面购买；下述实施例中，如未特别说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

本发明实施例中使用的主要试剂：EasyTaq DNA聚合酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、无缝连接重组酶(

-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)购自北京TransGen生物技术有限公司；BM5000 DNA Marker和农杆菌GV3101感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；pBI101购自武汉淼灵生物科技有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、利福平和Silwet L-77购自北京酷来搏科技有限公司；引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；其它化学试剂购自重庆骏伟广生物科技有限公司。

实施例1：在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的获得

1)哥伦比亚型拟南芥基因组DNA的制备

取约100mg的拟南芥幼嫩叶片置于带有1颗钢珠的2mL无菌离心管内；于液氮中速冻约5min，经研磨仪35Hz 20s快速研磨成粉末；加入400μL经65℃预热的CTAB提取液，充分振荡后置于65℃加热30min(每隔10min振荡1次)；取出样品于室温冷却，加入与CTAB等体积的氯仿(400μL)，上下轻柔颠倒几次，室温静置5min使其充分乳化；12000rpm离心1min；取200-400μL上清于1.5mL无菌离心管中，加入1mL预冷的无水乙醇，上下颠倒几次；12000rpm离心1min，去除上清，晾干得到DNA沉淀；加入50μL的无菌水，于55℃温浴约15-20min使DNA充分溶解；于-20℃保存备用。

2)在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的克隆

从http://www.gramene.org/microsat数据库获得拟南芥参考基因组DNA序列，进一步利用Vector NTI Advance 10设计在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的特异性PCR扩增引物对，其正向引物和反向引物序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，以上述所获拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增，将其产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对序列长度约409bp的DNA片段进行胶回收，连接至pMD19-T载体获得并转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选单克隆进行测序，测得启动子CP09序列如SEQ ID No.1所示。将上述测序正确的载体命名为pMD19-CP09，进一步活化提取质粒，用于构建启动子CP09的各类重组表达载体的PCR扩增模板。所用PCR反应体系及PCR反应程序具体为：

a)PCR反应体系(50μL)：

b)PCR反应程序：

实施例2：构建启动子CP09的重组表达载体pCP09-GUS

1)同实施例1引物设计方法，得到启动子CP09的PCR扩增引物对，先分别在正向引物和反向引物5′末端加上HindIII和BamHI酶切位点，进一步分别在正反向引物5′末端添加15bp与pBI101载体相应连接位置重叠的序列，得到用于连接至pBI101载体的启动子CP09的PCR扩增引物对，其正向引物和反向引物序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

2)利用上述获得的启动子CP09扩增引物对(序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示)，以pMD19-CP09质粒为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行胶回收，获得目的片段，PCR反应体系及程序同实施例1。

3)用HindIII和BamHI双酶切pBI101载体，胶回收获得酶切后的线性载体。

4)用无缝连接重组酶将2)所述的目的片段与3)所述的线性载体进行高效连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选单克隆测序验证，测序引物序列如SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示，将测序正确的载体命名为pCP09-GUS，如图1所示。进一步提取质粒，用HindIII和BamHI对其双酶切进行双重验证，如图2所示，pCP09-GUS质粒经HindIII和BamHI双酶切后获得长度约为409bp的目的片段和长度约为13891bp的线性载体片段，说明该质粒即为pCP09-GUS。

实施例3：将重组表达载体pCP09-GUS转化拟南芥

1)将重组表达载体pCP09-GUS转入农杆菌

取1μg-2μg实施例2获得的重组表达载体pCP09-GUS质粒，采用冻融法将其转化农杆菌GV3101感受态细胞，在含有利福平(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的无菌YEB固体平板上培养筛选单克隆，用特异性引物SEQ ID No.6和SEQ ID No.7对pCP09-GUS重组菌进行PCR验证，确定阳性克隆，PCR反应体系及程序同实施例1。

2)农杆菌介导的拟南芥遗传转化

28℃活化pCP09-GUS农杆菌菌液，采用花序浸染法转化野生型拟南芥，具体为：取出-80℃保存的鉴定正确的pCP09-GUS农杆菌的甘油菌，吸取少量菌液接种于50-100mL含有利福平(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的无菌YEB液体培养基中，28℃恒温下200-220rpm振摇过夜培养使农杆菌OD₆₀₀值处于0.8-1.2之间，然后5000rpm离心15min，弃上清液后用无菌超纯水配制的浸染液(仅含5g/100mL蔗糖和50μL/100mL Silwet L-77)按比例重悬农杆菌，获得OD₆₀₀值约0.8的农杆菌悬浮液。将修剪过的野生型拟南芥花序完全浸于上述农杆菌悬浮液中，15s后取出花序并平放于23-25℃黑暗环境下处理24h，于正常培养环境下培养约1周，去除未结果荚的花序，继续培养并收获转基因种子于1.5mL离心管中，加入3-8颗变色硅胶干燥剂，用封口膜密封后置于4℃长期保存。

实施例4：pCP09-GUS转基因拟南芥的筛选及鉴定

取实施例3中获得的经低温干燥保存的转基因种子，于无菌环境下，将适量种子置于无菌1.5mL离心管中，加入适量体积的无菌水，将离心管颠倒几次后用低速离心机离心10s，小心倒掉上清，重复3次；加入75％酒精，将离心管颠倒几次后用低速离心机离心10s，小心倒掉上清；用无菌水清洗3次，低速离心10s后去除上清；加入适量体积的5％NaClO溶液，将离心管上下颠倒10-20次，低速离心10s后倒掉上清，重复2次；用无菌水清洗3次，低速离心10s后去除上清；加入无菌水，使种子完全浸泡在无菌水中，于4℃放置48h，播种于含卡那霉素(50μg/mL)的无菌1/2CS固体植物组织培养基(CN110754366A公开的一种广适性植物组织培养基及1/2培养基)中，于温度22-24℃、湿度50-70％、光照强度1500-2000Lux、光照和黑暗交替(光照时间16h、黑暗时间8h)条件下培养10-15天，此时可见深绿色的抗性幼苗，而黄色或白色幼苗为无抗性野生型幼苗，将抗性幼苗移栽至营养基质(蛭石：营养土＝1：2，V/V)中继续培养。取筛选的T1代阳性转基因植株幼嫩组织，提取基因组DNA进行PCR检测(引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示)，结果为阳性转基因植株中均含有目的条带，经重复筛选获得T2代植株和种子，将T2代种子继续筛选，其后代都为深绿色抗性幼苗的则为pCP09-GUS转基因纯合株系。

实施例5：转基因拟南芥植株各组织器官中GUS基因表达的组织化学检测

将pCP09-GUS转基因纯合株系幼苗和不同组织器官浸泡于底物X-Gluc染色反应液中，抽真空5min后于37℃恒温过夜，去除染液，再用70％的乙醇脱色2-3次，在体视镜及显微镜下观察拍照，结果如图3所示，在pCP09-GUS转基因拟南芥的幼苗(包括根、胚轴和幼叶等组织器官)、茎、成熟叶片、雌蕊、不同时期的果荚及种子中均未检测到蓝色，仅在不同时期雄蕊的花粉中以及致密分布于盛花期雌蕊柱头上的花粉中检测到深蓝色，表明启动子CP09可高效驱动GUS基因在拟南芥花粉中特异性表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当然，在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等花粉特异性启动功能的衍生核苷酸序列也在本申请的保护范围之内，特别是与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列具有75％以上同源性，且具有同等花粉特异性启动子功能的衍生核苷酸序列。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 409

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

tgtgaccaat acagttattt agacatcaaa gttatctgca aattcattag agacgaacgg 60

taatagtcac acatgacaat aagaatgaag atgtcactta gataaaaatt aaaccaactc 120

atgtatttgc ctaaataaat cactatttac caaatttagc aaacaaatcg taactaacca 180

atcaacatca cacaatctca accctttaat aatctcacat tctctcgctt cttcttctcg 240

gattcctaaa tattatcatt cattcatcat cctcccaact cattggctct cttctctcct 300

ctcctttgcc tattttctaa aatcttctcc ggccacccac cggccacctt atgatctttt 360

tggtggcggc gattacacca tcaatttgtt agtttattta tatattaat 409

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tgtgaccaat acagttattt agacatc 27

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

attaatatat aaataaacta acaaattgat g 31

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gaccatgatt acgccaagct ttgtgaccaa tacagttatt tagacatc 48

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggactgacca cccggggatc cattaatata taaataaact aacaaattga tg 52

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cactttatgc ttccggctcg ta 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gaaacgcagc acgatacgc 19

Claims (10)

1.一种在植物花粉中特异表达的强启动子CP09，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的基因表达盒。

3.含有权利要求2所述基因表达盒的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述基因表达盒的重组菌。

5.含有权利要求2所述基因表达盒的转基因植物细胞系。

6.权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、或权利要求2所述的基因表达盒、或权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求4所述的重组菌、或权利要求5所述的转基因植物细胞系在驱动外源目的基因在植物花粉中特异性表达的应用。

7.权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09、或权利要求2所述的基因表达盒、或权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求4所述的重组菌、或权利要求5所述的转基因植物细胞系在制备转基因植物中的应用。

8.PCR扩增权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

9.一种分离或鉴定权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的方法，其特征在于，所述方法包括使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3引物对从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中经PCR扩增得到权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09的核苷酸序列。

10.与权利要求1所述的在植物花粉中特异表达的强启动子CP09互补的DNA分子。

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