CN110913877A - 靶向基因破坏方法及免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

对专性细胞内细菌中特定基因的靶向干扰及其随后的恢复仍然是极其挑战性的，因为专性细胞内细菌为了复制绝对需要驻留在宿主细胞内。此处，构建了靶向等位基因交换突变以使立克次氏体病原体，查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的两个基因失活并然后恢复这两个基因中的一个。然后这些方法也在犬埃立克体(Ehrlichia canis)和嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocyophilum)中被成功地利用。所得的突变的病原体被用于免疫原性组合物中以便降低立克次氏体属病原体感染的发生或严重性。

Description

靶向基因破坏方法及免疫原性组合物

本发明是在NIH拨款号AI070908下在政府支持下进行的。政府在本发明中拥有某些权利。

发明背景

破坏专性细胞内细菌中的特定基因功能并随后恢复其活性仍然极具挑战性，因为专性细胞内细菌为了复制绝对需要驻留在宿主细胞内。此处，我们通过对立克次氏体病原体查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的两个基因的等位基因交换创建了靶向突变，并基因互补了一个基因。原则上，该方法可以应用于其他专性细胞内细菌，并且将能够在细胞内细菌中常规地进行结构功能分析。该方法还适用于产生专性细胞内细菌的减毒株，这在用作活的疫苗候选物时将是有价值的。

专性细胞内细菌(以下简称“专性菌”)造成了全球数百万人的多种疾病。它们包括立克次氏体目(Rickettsiales)和衣原体目(Chlamydiales)的许多致病性革兰氏阴性菌。缺乏有效的对埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、立克次氏体属(Rickettsia)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)的立克次氏体(Rickettsiale)和衣原体(Chlamydiale)进行靶向诱变的系统仍然是理解微生物致病机理和确定许多细菌基因的功能重要性的主要障碍。衣原体目和立克次氏体目已经经历了最大程度的(extreme)基因组减少，其中大多数基因对于每种病原体的细胞内生长可能至关重要。因此，专性细胞内细菌依赖它们的宿主来填补由于基因组减少而引起的缺陷。与该假设相一致，先前的研究表明，埃立克体属、无形体属、立克次氏体属、新立克次氏体属、东方体属和衣原体属中74-92％的预测的基因于细菌在脊椎动物的宿主细胞和载体中复制期间是有转录活性的。产生靶向突变的挑战可能归因于被选择用于诱变的基因的基本性质、细胞内复制依赖性以及缺乏支持细胞外生长的方法。尽管使用转座子诱变成功地产生了随机突变，但是对于专性菌，在感兴趣的特定基因中产生靶向突变并随后进行互补是有问题的，并且也是专心追求的目标。

发明简述

本公开通过提供立克次氏体目和衣原体目的等位基因交换产生至少一种稳定的靶向的突变的方法填补了该主要空白。有利地，本公开还提供了破坏或失活多个基因并随后通过另一等位基因交换突变恢复至少一个完整基因的能力，导致失活基因从其自身的启动子的转录恢复。在优选的形式中，被破坏或失活的基因阻止或至少降低细菌在其专性宿主中复制的能力，同时仍诱导对该细菌特异的免疫应答。因此，本公开提供了细菌的减毒形式，其可用于诱导免疫反应的免疫原性组合物中，所述免疫原性组合物在预防性施用时降低与立克次氏体目和衣原体目相关的或由其引起的至少一种临床症状的发生率或严重性，并在感染已经发生后施用时，减少与立克次氏体目和衣原体目相关或由其引起的至少一种临床症状的持续时间或严重性。

如本领域已知的“序列同一性”是指两个或更多个多肽(聚氨基酸)序列或两个或更多个多核苷酸序列，即参考序列和待与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。通过将给定序列与参考序列进行比较，在对这些序列进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性(如通过这些序列串之间的匹配确定的)后确定序列同一性。在这样的比对后，基于逐个位置确定序列同一性，例如，如果在特定位置上核苷酸或氨基酸残基是相同的，则在该位置上的序列是“相同”的。然后将这种位置相同的总数除以参考序列中核苷酸或氨基酸残基的总数以得出％序列同一性。序列同一性可以容易地通过已知方法计算，包括但不限于在Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,ed.,Oxford University Press,NewYork(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；

Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,ed.,Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,ed.,M.Stockton Press,New York(1991)；和Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些，其教导通过引用并入本文。确定序列同一性的优选方法被设计为给出测试的序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法被编码到公众可获得的计算机程序中，该程序确定给定序列之间的序列同一性。此类程序的实例包括但不限于，GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序是公众可从NCBI和其他来源获得的(BLAST手册，Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教导通过引用并入本文)。这些程序使用默认空位权重来最佳比对序列，以在给定序列和参考序列之间产生最高的序列同一性水平。以与参考核苷酸序列具有例如至少85％、优选90％、甚至更优选95％“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸作为例证，意图除了每个给定参考核苷酸序列包含至多15个点突变、优选至多10个、甚至更优选至多5个点突变/参考核苷酸序列的每100个核苷酸之外，给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，在相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，其参考序列中至多15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可被缺失或被另一个核苷酸取代，或者可以将参考序列中总核苷酸的至多15％、优选地10％、甚至更优选地5％数量的核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些突变可能发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或单独地散布在参考序列的核苷酸之中或以一个或更多个连续的组散布在参考序列内。类似地，具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％的序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，意指除了该多肽的给定多肽序列可包括至多15个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的每100个氨基酸之外，该给定氨基酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％的序列同一性的给定多肽序列，参考序列中至多15％、优选地至多10％、甚至更优选地至多5％的氨基酸残基可以被缺失或被另一种氨基酸取代，或可将参考序列中氨基酸残基总数量至多15％、优选至多10％、甚至更优选最多5％数量的氨基酸残基插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何地方，或者单独地散布在参考序列的残基之中或以一个或更多个连续的组散布在参考序列内。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。但是，当确定序列同一性时，不将保守取代包括作为匹配。

如本文所用的“序列同源性”是指确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，两个或更多个序列被最佳比对，并且如果需要的话引入缺口。但是，与“序列同一性”相对比，在确定序列同源性时，保守氨基酸取代被作为匹配计数。换句话说，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含用另一个氨基酸或核苷酸的保守取代，或者参考序列中总氨基酸残基或核苷酸(不包括保守取代)的至多15％，优选地至多10％，甚至更优选地至多5％数量的氨基酸或核苷酸可被插入到参考序列中。优选地，同源序列包含至少50个核苷酸、甚至更优选地至少100个、甚至更优选地至少250个、且甚至更优选地至少500个核苷酸的片段。

“保守取代”是指氨基酸残基或核苷酸被具有相似特征或性质(包括尺寸、疏水性等)的另一氨基酸残基或核苷酸取代，使得整体功能没有明显改变。

本领域技术人员将理解，本文中使用的免疫原性组合物可掺入已知的可注射的、生理学可接受的无菌溶液，以制备用于肠胃外注射或输注的即用型溶液、等渗水溶液(例如盐水或相应的血浆蛋白溶液)是容易获得的。另外，本公开的免疫原性组合物和疫苗组合物可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。

一方面，所述免疫原性组合物还可包含其他成分、抗原、药学可接受的载体、兽医学可接受的载体、佐剂、防腐剂、稳定剂或其组合。

如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷、Quil A、环状GMP-AMP、montanide凝胶、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。该乳液可以特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油例如从烯特别是异丁烯或癸烯的低聚得到的角鲨烷或角鲨烯油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别地是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。该油与乳化剂结合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇的酯、二缩甘露醇的酯(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘醇的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯和油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯(所述酯任选地被乙氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application ofAdjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.).JohnWiley和Sons,NY,第51-94页(1995)和Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。例如，可以使用由M.Powell和M.Newman编辑的“VaccineDesign,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press，1995的第147页上描述的SPT乳液，以及该同一本书第183页所描述的乳液MF59。佐剂的另一个实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物被称为术语卡波姆(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基的多羟基化合物(至少三个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团取代)交联的此类丙烯酸类聚合物。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其他烯属不饱和基团。不饱和基团本身可以含有其他取代基，例如甲基。其他合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，亚特兰大GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定肠毒素(重组或其他形式)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽等。

优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约500μg至约5mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约750μg至约2.5mg添加。最优选地，佐剂以每剂量约1mg的量添加。

另外，该组合物可以包含一种或多种药学可接受的或兽医学可接受的载体。如本文所用，“药学可接受的载体”或“兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。

药学可接受的媒介物应理解为是指进入药物组合物或疫苗中的化合物或化合物的组合，其不会引起次级反应并且促进例如活性化合物的施用，增加其寿命持续时间和/或其在体内的功效，增加其在溶液中的溶解度或可选地改善其保存。这些药学可接受的载体是众所周知的，并且本领域技术人员将随所选择的活性化合物的性质和施用方式的变化对其进行调整。

例如，根据本公开的免疫原性组合物或疫苗可以以每千克动物或人类约0.1至1000μg的量施用一次或随时间分散的数次，其中值和范围例如但不限于，每千克动物或人类体重0.5至800μg、每千克动物或人类体重1至1000μg、每千克动物或人类体重1至500μg、每千克动物或人类体重1至300μg、每千克动物或人类体重1至200μg、每千克动物或人类体重1至150μg、每千克动物或人类体重1至125μg、每千克动物或人类体重1至100μg、每千克动物或人类体重5μg、每千克动物或人类体重10μg、每千克动物或人类体重15μg、每千克动物或人类体重20μg、每千克动物或人类体重25μg、每千克动物或人类体重30μg、每千克动物或人类体重35μg、每千克动物或人类体重40μg、每千克动物或人类体重45μg、每千克动物或人类体重50μg、每千克动物或人类体重55μg、每千克动物或人类体重60μg、每千克动物或人类体重65μg、每千克动物或人类体重70μg、每千克动物或人类体重75μg、每千克动物或人类体重80μg、每千克动物或人类体重85μg、每千克动物或人类体重90μg、每千克动物或人类体重95μg、每千克动物或人类体重100μg、每千克动物或人类体重125μg、每千克动物或人类体重150μg、每千克动物或动物体重200μg、每千克动物或人类体重250μg、每千克动物或人类体重300μg、每千克动物或人类体重400μg、每千克动物或人类体重500μg、每千克动物或人类体重600μg、每千克动物或人类体重700μg、每千克动物或人类体重800μg、每千克动物或人类体重900μg以及每千克动物或人类体重1000μg。在其他优选形式中，也提供了上述量，但未参考动物或人类体重。

根据本公开，免疫原性组合物或疫苗可包含除查菲埃立克体(E.chaffeensis)以外的至少一种其他病原体，使其成为组合疫苗或免疫原性组合物。在这样的实施方案中，施用的有效量的疫苗或免疫原性组合物提供有效的保护，所述保护包括降低感染的临床症状的严重性或发生率，直至并包括针对由立克次氏体目细菌或衣原体目细菌和至少一种其他引起疾病的生物体引起的感染的免疫力。其他病原体优选地选自由以下组成的组：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；腺病毒；甲病毒例如东部马脑脊髓炎病毒；支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)；短螺旋体属(Brachyspira spp.)，优选猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)；大肠柔毛短螺旋体(B.piosicoli)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)，优选生物变种1、2和3；经典猪瘟病毒；梭菌属(Clostridium spp.)，优选艰难梭菌(Cl.difficile)、产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)类型A、B和C，诺维氏梭菌(Cl.novyi)、败毒梭菌(Cl.septicum)、破伤风梭菌(Cl.tetani)；冠状病毒，优选猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体病(Eperythrozoonosis suis)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)；大肠杆菌(Escherichia coli)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选亚型1、7和14：血凝性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒；细胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)，优选澳大利亚钩端螺旋体(Leptospira australis)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)；感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)；Leptospira icterohaemorrhagicae和问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)优选鸟分枝杆菌(M.avium)；细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)和牛分枝杆菌(M.bovis)；猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(M hyo)；多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)病毒；猪圆环病毒，伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属(Salmonella spp)，优选鼠伤寒沙门氏菌(S.thyhimurium)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)、葡萄球菌属(Streptococcusspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)，优选猪链球菌(Strep.suis)；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水泡性口炎病毒；猪水疱性皮疹病毒；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)；猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；甲型肝炎病毒；口蹄疫病毒(FMDV)；猪水泡病(SVDV)及其组合。

所述免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种其他免疫调节剂例如诸如白介素、干扰素或其他细胞因子。

免疫原性组合物还可包含庆大霉素和硫柳汞。

尽管本领域技术人员可以容易地确定在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度，但是本发明考虑了包含约50μg至约2000μg佐剂的组合物。因此，本文所用的免疫原性组合物也指包含约1ug/ml至约60μg/ml抗生素或免疫调节剂，且更优选小于约30μg/ml抗生素或免疫调节剂的组合物。

根据另一方面，对需要其的受试者给予至少一个剂量的上文描述的免疫原性组合物的至少一次另外的施用，其中所述第二次或任何另外的施用在初次或任何之前的施用至少7天后给予。优选地，将免疫原性组合物与免疫刺激剂一起施用。优选地，给予所述免疫刺激剂至少两次。优选地，在免疫刺激剂的第一次和第二次或任何进一步的施用之间至少3天、更优选至少5天、甚至更优选至少7天。优选地，在初次施用本文提供的免疫原性组合物后至少10天、优选15天、甚至更优选20天，甚至更优选至少22天给予免疫刺激剂。优选的免疫刺激剂是例如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂(KLH/ICFA)乳化。但是，据此可以理解，也可以使用本领域技术人员已知的任何其他免疫刺激剂。如本文所用，术语“免疫刺激剂”是指可以触发免疫应答，优选地不引发或增加特异性免疫应答，例如针对特定病原体的免疫应答的任何剂或组合物。进一步指示以适当剂量施用免疫刺激剂。

在另一方面，本公开提供了通过对埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、立克次氏体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)进行等位基因交换产生至少一个稳定的靶向突变的方法。

在本公开的又一方面，使用所公开的方法突变的立克次氏体目和衣原体目可用在抵抗立克次氏体病原体和衣原体病原体的免疫原性组合物中。在优选的形式中，这种免疫原性组合物在减少由立克次氏体病原体和衣原体病原体的感染引起或与之相关的至少一种临床感染症状的发生率或严重性方面是有效的。在一些优选的形式中，预防性地给予此类组合物，从而降低临床症状的发生率和/或严重性。在特别优选的形式中，在用立克次氏体和/或衣原体病原体感染或攻击之前，可预防接受这种组合物的动物的临床症状。在其他形式中，在已经发生立克次氏体和/或衣原体病原体的感染后施用此类组合物。在此类情况中，降低了与感染相关或由感染引起的临床症状的发生率、严重性和/或持续时间(longevity)。

另一方面，稳定的靶向突变破坏了至少一个基因的功能。

还在另一方面，已被破坏的基因的功能可被恢复。

在本公开的一方面，在查菲埃立克体中进行了稳定的靶向突变，其中两个基因被破坏并且随后来自一个基因的功能被恢复。这些相同的方法也成功地用于包括犬埃立克体(E.canis)的埃立克体属物种和包括嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocyophilum)(A.phagocyophilum)的无形体属物种。

另一方面，本发明提供了在埃立克体属、无形体属、立克次氏体属、新立克次氏体属、东方体属和/或衣原体属物种中靶向破坏或突变基因以产生细菌的减毒生物体的方法，这在诱导有效宿主免疫应答以提高针对由那些相同的物种导致的恶性疾病的保护方面是有价值的。

还在另一方面，提供了在人或动物中引发免疫应答的方法，其中步骤包括向需要其的动物或人施用本文公开的免疫原性组合物或疫苗。另外，提供了用于减少至少一种或更多种与来自埃立克体属、无形体属、新立克次氏体属、立克次氏体属、东方体属和衣原体属的病原体感染相关或由其引起的临床症状的发生率和/或严重性的方法。在某些形式中，感染是由查菲埃立克体、犬埃立克体、边缘无形体、A.platys和/或嗜吞噬细胞无形体引起的或与之相关并且免疫原性组合物或疫苗包含那些物种中的至少一种，其中对此类物种进行靶向基因破坏或突变。这样的方法通常包括这一步骤，将免疫原性组合物给予需要其的动物以引发针对感染的免疫应答以及针对在动物被埃立克体属、无形体属、新立克次氏体属、立克次氏体属、东方属和衣原体属的物种感染或刺激后显示的临床症状的免疫应答。在某些形式中，免疫原性组合物包括修饰的埃立克体属、无形体属、新立克次氏体属、立克次氏体属、东方体属和衣原体属的活物种。

一方面，所述免疫原性组合物包括已经经历了本文所描述的靶向诱变的查菲埃立克体、犬埃立克体、嗜吞噬细胞无形体或边缘无形体。当查菲埃立克体是突变的物种时，免疫原性组合物优选包括减毒的查菲埃立克体细菌，该减毒的查菲埃立克体细菌包括使该细菌失活并干扰其复制能力的突变。在一些优选的形式中，突变是插入或缺失。在某些形式中，插入或缺失在基因内的任何地方，所述基因选自由Ech_0379或Ech_0660组成的组，导致基因功能失活。在一些形式中，查菲埃立克体的基因组包括与Ech_0660(SEQ ID No.35)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性的序列。优选地，序列比较是与查菲埃立克体基因组的未突变的相同区域比较。当犬埃立克体是突变的物种时，免疫原性组合物优选包括减毒的犬埃立克体细菌，该减毒的犬埃立克体细菌包括使该细菌的基因失活并干扰其复制能力的突变。在一些优选的形式中，突变是插入或缺失。在某些形式中，插入或缺失在Ecaj_0381基因内，在该基因的任何位置，导致该基因功能失活。在一些形式中，犬埃立克体的基因组包括与SEQ IDNo.54具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性的序列。优选地，序列比较是与犬埃立克体基因组的非突变形式的相同区域比较。当嗜吞噬细胞无形体是突变的物种时，免疫原性组合物优选包括减毒的嗜吞噬细胞无形体细菌，该减毒的嗜吞噬细胞无形体细菌包括使该细菌失活并干扰其复制能力的突变。在一些优选的形式中，突变是插入或缺失。在某些形式中，插入或缺失在APH_0634基因中，在该基因内的任何位置，导致该基因功能失活。在某些形式中，嗜吞噬细胞无形体基因组的APH_0634基因包括与SEQ ID No.55具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性的序列。优选地，该序列比较是与嗜吞噬细胞无形体基因组的非突变形式的相同区域比较。

本公开中提供的免疫原性组合物或疫苗和方法不限于查菲埃立克体、犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体，而是还可以包括立克次氏体目或衣原体目的任何成员，包括但不限于以下科：Pelagibacterales，Pelagibacteraceae(包括Ib、II、IIIa、IIIb、IV和V亚组)，远洋杆菌属(Pelagibacter)，Proro-mitochondira、无形小体科(Anaplasmataceae)，以下属的物种：埃立克体属、无形体属、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、新立克次氏体属；Midichloriaceae、Midichloria、立克次氏体属和立克次氏体属的种(Rickettsiaspecies)。此外，免疫原性组合物或疫苗还可以包括但不限于反刍埃立克体(E.ruminantium)、犬埃立克体、边缘无形体、A.platys、鼠埃立克体(E.muris)及其组合。

在本公开的另一方面，所述免疫原性组合物包含已经使用本文提供的方法突变的查菲埃立克体ECH_0660基因的同源物。在优选的形式中，同源物选自由以下组成的组：埃立克体属、无形体属、立克次氏体属、新立克次氏体属、东方体属和衣原体属。在其他优选形式中，基因同源物是犬埃立克体的Ecaj_0381，优选与GenBank#CP000107.1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、并且更优选至少92％、还更优选至少94％、甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同源性。在其他优选形式中，基因同源物是反刍埃立克体的Erum_3930，优选与GenBank#CR767821.1具有至少70％、75％、80％、85％、90％，并且更优选至少92％，还更优选至少94％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同源性。在其他优选的形式中，基因同源物是嗜吞噬细胞无形体的APH_0634，优选与GenBank#CP000235.1具有具有至少70％、75％、80％、85％、90％，并且更优选至少92％，还更优选至少94％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同源性。在其他优选的形式中，基因同源物是边缘无形体的AMH_581，优选具有与GenBank#CP000030.1具有至少70％、75％、80％、85％、90％，并且更优选至少92％，还更优选至少94％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同源性。在其他优选形式中，基因同源物是鼠埃立克体(Ehrlichia muris)AS145的EMUR_02070，优选与GenBank#CP006917.1具有至少70％、75％、80％、85％、90％，并且更优选至少92％，还更优选至少94％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同源性。

根据本公开的免疫原性组合物可以静脉内、肌内、鼻内、皮内、气管内、阴道内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、口服、鞘内或通过直接注射到任何靶组织中施用。取决于所需的治疗持续时间和有效性，根据本公开的免疫原性组合物也可以间歇性地以不同的剂量，例如每天施用一次或数次，持续数天、数周或数月。

另一方面，本公开的免疫原性组合物被施用于至少两周龄的需要其的动物。更优选地，动物年龄在2周至1周岁之间，还更优选地在3周至6个月之间。当然，可以考虑其他年龄和范围，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19和20周或更大。可选择地，在暴露于立克次氏体细菌或衣原体细菌之前至少2周施用所述免疫原性组合物。

在某些形式中，免疫原性组合物在被立克次氏体细菌或衣原体细菌感染后施用。在此类情况下，施用减少了与感染有关或由感染引起的临床症状的持续时间或严重程度。

另一方面，本公开提供了免疫原性组合物，其包含其中具有靶向等位基因交换突变的立克次氏体细菌或衣原体细菌和选自由以下组成的组的组分：兽医学可接受的载体、药学可接受的载体、佐剂、防腐剂、缓冲液、抗生素、细胞培养上清液、免疫调节剂及其任意组合的组分。在一些形式中，免疫原性组合物中的立克次氏体细菌或衣原体细菌选自由以下组成的组的物种：埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、立克次氏体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)。在一些形式中，埃立克体属细菌的种选自由以下组成的组：查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、犬埃立克体(Ehrlichia canis)、反刍埃立克体(Ehrlichiaruminatium)、鼠埃立克体(Ehrlichia muris)和鼠埃立克体样剂。在某些形式中，无形体属细菌的种选自由以下组成的组：嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、血小板无形体(Anaplasma platys)和边缘无形体(Anaplasma marginale)。在某些形式中，靶向等位基因交换突变使基因失活。在某些形式中，失活是由插入或缺失引起的。在某些形式中，失活导致细菌复制的能力降低。在某些形式中，靶向等位基因交换突变位于查菲埃立克体的Ech_0230、Ech_0379或Ech_0660中。在某些形式中，靶向等位基因交换突变在犬埃立克体的Ecaj_0381中。在某些形式中，靶向等位基因交换突变在嗜吞噬细胞无形体的APH_0634中。

另一方面，本公开提供了降低由立克次氏体细菌或衣原体细菌引起的至少一种临床症状的发生率或严重性的方法，该方法包括施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含其中具有靶向等位基因交换突变的立克次氏体细菌或衣原体细菌和选自由兽医学可接受的载体、药学可接受的载体、佐剂、防腐剂、缓冲剂、抗生素、细胞培养上清液、免疫调节剂组成的组的组分。在某些形式中，施用步骤选自由以下组成的组：肌内、鼻内、皮内、气管内、阴道内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、口服、鞘内或通过直接注射到靶组织中。在某些形式中，免疫原性组合物的施用可以被称为第一次施用，并且该第一次施用之后是第二次施用。在某些形式中，第二次施用是在第一次施用后至少7天。在优选的形式中，发病率在已经接受了免疫原性组合物的施用的一组动物中降低，并且是与未接受该免疫原性组合物的施用的一组动物相比至少10％。在优选的形式中，严重性降低在接受了免疫原性组合物施用的单只动物中评估，并且是与没有接受免疫原性组合物的动物比较。在优选的形式中，当将已接受该组合物的动物与未接受该免疫原性组合物并随后被立克次氏体细菌或衣原体细菌感染或攻击的动物进行比较时，这种严重性降低至少为10％。在一些形式中，与未接受免疫原性组合物施用的一组动物相比，已接受该免疫原性组合物的一组动物的严重性降低了至少10％。在某些形式中，立克次氏体细菌或衣原体细菌选自由以下组成的组：埃立克体属、无形体属、立克次氏体属、新立克次氏体属、东方体属和衣原体属。在一些形式中，埃立克体属细菌选自由查菲埃立克体、反刍埃立克体、鼠埃立克体和犬埃立克体组成的组。在某些形式中，无形体属细菌选自由以下组成的组：嗜吞噬细胞无形体、血小板无形体和边缘无形体。在某些形式中，靶向等位基因交换突变使基因失活。在某些形式中，失活是由插入或缺失引起的。在某些形式中，失活导致细菌复制的能力降低。在某些形式中，靶向等位基因交换突变位于查菲埃立克体的Ech_0230、Ech_0379或Ech_0660中。在某些形式中，靶向的等位基因交换突变在犬埃立克体中的Ecaj_0381中。在某些形式中，靶向的等位基因交换突变在嗜吞噬细胞无形体的APH_0634中。在某些形式中，该组分是选自由以下组成的组的佐剂：皂苷、环状GMP-AMP，montanide凝胶或其任何组合。

附图简述

图1是概述用于在查菲埃立克体中产生靶向等位基因交换突变以使基因Ech_0230和Ech_0379失活并恢复失活的Ech_0379的基因功能的策略的示意图的图示，其中A和A'是指5'和3'同源臂。

图2A是具有同源臂鉴定的pHR-Ech_0230-tuf-aadA的质粒图谱的示意图。该构建体的质粒序列数据已保存在GenBank(登录号MF068805)中。

图2B是具有同源臂鉴定的pHR-Ech_0379-tuf-aadA的质粒图谱的示意图。所有构建体的质粒序列数据都保存在GenBank(登录号MF068806)。

图2C是具有同源臂鉴定的质粒图谱的示意图。该构建体的质粒序列数据保存在GenBank(登录号MF068807)中。

图3A图示了破坏Ech_0230基因的靶向等位基因交换诱变，图3A描绘了跨越被选择的用于制备等位基因交换构建体的区域的基因组片段，包括用于映射插入的限制性酶位点(EcoRI(E)和ClaI(C))。包括限制性酶切位点的基因组座标和插入片段(tuf-aadA)的大小以允许在PCR和DNA印迹分析中确定预期的DNA大小。

图3B是显示在使用靶向等位基因插入(标示为1和4的引物)和插入的DNA(引物2和3)上游和下游的基因组区域的引物的三种不同PCR后分辨的扩增子的照片。(L，1kb+DNA分子量标志物；野生型(W)，PCR以野生型基因组DNA为模板；突变体(M)，PCR以突变型基因组DNA为模板)。

图3C是显示靶向的突变体中插入位点的PCR DNA序列验证的图示。在上分图中，在黑色箭头上方和左侧所示的从扩增子产生的DNA序列代表来自查菲埃立克体基因组的序列，而黑色箭头上方和右侧的序列代表基因破坏突变体中的插入序列。在下分图中，在黑色箭头上方和右侧所示的从扩增子产生的DNA序列代表来自查菲埃立克体基因组的序列，而黑色箭头上方和左侧的序列代表基因破坏突变体中的插入序列。在5'和3'插入连接处的序列边界用小的黑色线箭头标示。另外，在上分图中，上方序列是SEQ ID NO.42，而下方序列是SEQ ID NO.48。在下分图中，上方序列是SEQ ID NO.43，而下方序列是SEQ ID NO.49。

图3D是用ClaI(C)或EcoRI(E)消化的基因组DNA(W和M)的DNA印迹分析的照片。印迹分析以aadA基因片段为探针进行。

图4图示了破坏Ech_0379基因的靶向等位基因交换诱变，图4A描绘了跨越被选择用于制备等位基因交换构建体的区域的基因组片段，包括用于映射插入的限制酶位点(ClaI(C)和HindIII(H))。包括限制性酶切位点的基因组座标和插入片段(tuf-aadA)的大小以允许在PCR和DNA印迹分析中确定预期的DNA大小。

图4B显示在使用靶向等位基因插入(标示为1和4的引物)和插入的DNA(引物2和3)上游和下游的基因组区域的引物的三种不同PCR后分辨的扩增子的照片。(L，1kb+DNA分子量标志物；野生型(W)，PCR以野生型基因组DNA为模板；突变体(M)，PCR以突变型基因组DNA为模板)。

图4C是显示靶向的突变体中插入位点的PCR DNA序列验证的图示。在上分图中，在黑色箭头上方和左侧所示的从扩增子产生的DNA序列代表来自查菲埃立克体基因组的序列，而黑色箭头上方和右侧的序列代表基因破坏突变体中的插入序列。在下分图中，在黑色箭头上方和右侧所示的从扩增子产生的DNA序列代表来自查菲埃立克体基因组的序列，而黑色箭头上方和左侧的序列代表基因破坏突变体中的插入序列。在5'和3'插入连接处的序列边界用小的黑色线箭头标示。另外，在上分图中，上方序列是SEQ ID NO.44，而下方序列是SEQ ID NO.50。在下分图中，上方序列是SEQ ID NO.45，而下方序列是SEQ ID NO.51。

图4D是用ClaI(C)和HindIII(H)消化的基因组DNA(W和M)的DNA印迹分析的图片。印迹分析以aadA基因片段为探针进行。

图5A类似于图3图示了恢复Ech_0379基因的靶向等位基因交换诱变，不同之处在于该图示描绘了，在该分图的上部分的基因组片段代表来自Ech_0379突变体的基因组。

图5B图示了表达mCherry的Ech_0379基因恢复突变体培养物。使用40X放大透镜通过共聚焦显微镜评估在ISE6细胞中培养的恢复的突变生物体的mCherry表达，其中mCherry表达显示在箭头处。

图5C是显示在使用靶向等位基因插入(标示为1和4的引物)和插入的DNA(引物2和3)上游和下游的基因组区域的引物的三种不同PCR后分辨的扩增子的照片。(L，1kb+DNA分子量标志物；野生型(W)，PCR以野生型基因组DNA为模板；突变体(M)，PCR以突变型基因组DNA为模板)。

图5D是显示恢复Ech_0379基因的靶向等位基因交换诱变的图片。该图与图3C相似，不同之处在于用于DNA印迹实验的限制酶和探针(图5E中所示)分别是Cla I和代表Ech_0379基因的DNA片段。另外，在图5D的上分图中，上方序列是SEQ ID NO.46，而下方序列是SEQ ID NO.52。在下分图中，上方序列是SEQ ID NO.47，而下方序列是SEQ ID NO.53。

图5E是用ClaI(C)或EcoRI(E)消化的基因组DNA(W和M)的DNA印迹分析的图片。印迹分析以aadA基因片段为探针进行。泳道M₁和M₂分别代表从DH82和ISE6培养物中回收的查菲埃立克体Ech_0379突变体培养物回收的基因组DNA的数据。类似地，R₁和R₂分别代表分别从DH82和ISE6培养物中回收的查菲埃立克体Ech_0379回复突变体培养物中回收的基因组DNA的数据。

图6A示出了对从野生型和等位基因交换突变体查菲埃立克体生物体中回收的RNA通过RT-PCR评估的转录分析。分辨了来自野生型(W)和Ech_0230突变(M)生物体的RT-PCR产物(L，1kb+DNA分子量标志物；+，来自野生型查菲埃立克体的基因组DNA被用作模板；-，阴性对照反应，不添加模板)。

图6B类似于图6A，不同之处是使用从Ech_0379破坏(M)和恢复(R)突变生物体中回收的RNA进行分析。该实验的阳性对照包括来自W、M和R的基因组DNA作为模板。(对W和R的PCR的DNA模板预期了0.38kb的扩增子，而对M DNA作为模板预期了1.6kb的产物。)

图6C图示了对从野生型和等位基因交换突变体查菲埃立克体生物体中回收的RNA通过RT-PCR评估的转录分析。使Ech_0379基因失活并恢复其基因活性的突变并未改变其邻近基因的基因表达。对野生型、基因失活和基因挽救突变生物体的Ech_0378、Ech_0379和Ech_0380进行了30、35和40个PCR循环的半定量RT-PCR分析并展示了35个循环的数据。W、M和R具有相似量的Ech_0378和Ech_0380扩增子；W和R的Ech_0379扩增子也相似，而M则不存在。

图7说明了在抗转运蛋白缺陷的大肠杆菌菌株EP432中对Ech_0379基因的表型表征。进行了针对抗转运蛋白缺陷的大肠杆菌菌株EP432中的Ech_0379转录物的RT-PCR分析，在EP432中对Ech_0379基因进行表型表征。

发明详述

本公开提供了提供能够在宿主中产生免疫原性应答的稳定的免疫原性细菌的方法。该方法优选地包括以下步骤：靶向地破坏细菌菌株的基因组，并然后进行等位基因交换。

本公开提供了免疫原性组合物或疫苗，包括施用本文公开的免疫原性细菌。用于在免疫原性组合物或疫苗中使用的免疫原性细菌可以是杀死性的、修饰为杀死性的、修饰为活的、重组蛋白、蛋白及其组合。在优选的形式中，修饰的活免疫原性细菌是减毒的。

提供了预防或治疗立克次氏体病、埃立克体病、落基山斑疹热、人单核细胞埃立克体病、粒细胞性无形体病和/或无形体病中的至少一种的方法。该方法的步骤通常包括将本文公开的免疫原性组合物或疫苗施用至需要其的人或动物。

提供了降低与立克次氏体病、埃立克体病、落基山斑疹热、人单核细胞埃立克体病、粒细胞性无形体病和/或无形体病中至少之一相关的临床症状的发生率或严重性的方法，其中步骤通常包括将本文公开的免疫原性组合物或疫苗施用至需要其的人或动物。临床症状通常包括但不限于发烧、头痛、发冷、不适、肌肉疼痛、腹痛、恶心、呕吐、腹泻、意识错乱、结膜充血(红眼睛)、皮疹及其组合。优选地，与埃立克体病、落基山斑疹热、人单核细胞埃立克体病、粒细胞性无形体病和/或无形体病中至少之一相关的临床症状在频率和/或严重性方面被降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或降低100％。这是与未接受本公开的免疫原性组合物或疫苗的动物或人相比的。本文还考虑了与多组动物或人的比较。

本公开的产品和方法的接受者可以是人或动物。该动物优选地选自但不限于猪、家猪、母牛、山羊、马、狗、鹿、土狼、猫、家禽和其他相关的野生和家养动物。在一个优选的实施方案中，接受者是人、狗、母牛或家牛、马或猪。

修饰或修饰的活核苷酸序列应理解为是指根据本领域技术人员众所周知的技术通过诱变获得的任何核苷酸序列，并且包含相对于根据本发明的正常序列的修饰，例如在多肽表达的调控序列和/或启动子序列中突变，尤其是导致所述多肽表达率改变或复制周期调节的突变。

根据本公开，应将核苷酸、多核苷酸或核酸序列理解为表示单体和二聚体(所谓的串联)形式的双链或单链DNA以及所述DNA的转录产物。

必须理解，本公开不涉及在其天然环境中，即在天然状态下获得的基因组核苷酸序列。本发明涉及的序列是可能分离、纯化或部分纯化的，所述分离、纯化或部分纯化从例如诸如离子交换色谱的分离方法，通过基于分子大小的排阻或通过亲和力，或基于在不同溶剂中的溶解度的分级分离技术开始，或从诸如扩增、克隆和亚克隆的基因工程方法(本公开的序列可能由载体携带)开始。此外，该序列已从存在于自然界的形式被改变为包括通过定点诱变或其他减毒技术(例如连续传代)诱导的突变，进一步证明该序列是人工制造的，而不是自然界中存在的。

本发明的减毒的修饰的活疫苗或免疫原性组合物不包含自然界中存在的核苷酸或氨基酸序列，因为所述核苷酸或氨基酸序列已经过人工构建。因此，本发明的免疫原性组合物或疫苗与自然界发现的明显不同。与美国专利局于2014年根据U.S.C.101颁布的对于符合要求的基于自然界的产品实例的实例5相似，本发明的免疫原性组合物或疫苗与该实例的权利要求2相似，因为该免疫原性组合物或疫苗基因具有其他要素，例如病毒序列内的突变或病毒的灭活，所述突变或灭活为该免疫原性组合物或疫苗提供了在功能上与例如天然存在的查菲埃立克体不同的特征。

通过PCR获得了先前定义的Ech_0230和Ech_0379基因的随机插入突变位点上游和下游大约1kb的查菲埃立克体基因组DNA片段，并将其克隆到质粒载体中。类似地将查菲埃立克体延长因子Tu基因Tuf-2(Ech_0407)的启动子片段克隆到一个不同的质粒的aadA基因编码序列的前面(aadA基因赋予了对壮观霉素和链霉素的抗性)。选择Tuf-2基因启动子(tuf)来表达aadA蛋白，因为它驱动了高度保守且组成性表达的蛋白Tu的表达，在蛋白翻译机制中Tu是多肽延伸过程所必需的。此外，我们通过引物延伸实验进行的生物信息学分析和转录映射表明，它是负责转录基因的强启动子，这些基因中的大多数编码30S和50S核糖体蛋白，并具有多个转录起始位点(未示出)。选择aadA基因是因为它在对查菲埃立克体和无形体属的种赋予抗生素抗性方面发挥了良好的作用。将tuf-aadA片段工程化到Ech_0230和Ech_0379的同源重组构建体(分别为pHR-Ech_0230-tuf-aadA和pHR-Ech_0379-tuf-aadA)中。通过PCR从包含被tuf-aadA片段隔开的基因的5'和3'同源臂的构建体生成线性DNA片段，以用于产生靶向突变。为了创建撤消Ech_0379基因内的靶向基因突变的挽救诱变模板，通过PCR从查菲埃立克体基因组获得该基因的突变位点下游的0.5kb片段，并将其工程化到pHR-Ech_0379-tuf-aadA构建体中以生成修饰的构建体：pHR-res-Ech_0379-Amtr-mCh-Gent，其在5'端包含完整的Ech_0379基因ORF，接着存在Amtr启动子、mCherry的ORF和庆大霉素抗性盒(Gent)(Amtr-mCh-Gent)以及一个1kb的包含Ech_0379基因的3'部分的基因组片段。Gent经过密码子优化以在查菲埃立克体中有效翻译。然后制备来自挽救构建体的线性片段，其包含以Ech_0379基因开始的5'同源臂，接着是Amtr-mCh-Gent片段和在Ech_0379插入下游的3'末端基因组片段以用作3'同源臂。将破坏Ech_0230或Ech_0379基因的线性DNA片段电穿孔到从ISE6蜱细胞(tick cell)中回收的无宿主细胞的野生型查菲埃立克体生物体中，然后允许重新感染ISE6蜱细胞。针对突变体持续数周在包含壮观霉素和链霉素的培养基中生长的能力对其选择，然后允许其感染巨噬细胞系DH82，以继续持续生长数月。对于挽救突变实验，将Ech_0379基因恢复模板的线性DNA片段类似地电穿孔到在Ech_0379基因中含有突变的查菲埃立克体生物体中。然后通过其在包含庆大霉素的培养基中生长的能力来选择恢复了Ech_0379基因的查菲埃立克体培养物。在回收在含有抗生素的培养基中生长的查菲埃立克体培养物后，通过两个插入特异性PCR分析来确认Ech_0230或Ech_0379中的靶向基因失活，该两个插入特异性PCT分析针对1)等位基因交换位点和插入特异性DNA5'的基因组区域和2)插入DNA和基因组上等位基因交换位点的3'部分。然后，通过针对等位基因交换插入位点上游和下游的基因组区域的另一种PCR测定确认克隆纯度。通过PCR-DNA序列分析确认PCR产物的完整性。对于Ech_0379基因恢复突变体产生，还通过荧光显微镜评估了mCherry蛋白表达(图5B)。对于基因破坏突变和基因恢复突变，还通过DNA印迹分析验证了查菲埃立克体基因组中突变的存在。RT-PCR分析表明，Ech_0230和Ech_0379转录物存在于野生型查菲埃立克体中，而在基因破坏突变生物中却不存在。与野生型查菲埃立克体相似，经互补的突变株被测试为Ech_0379转录物阳性。进一步地，我们测试了失活和恢复Ech_0379基因活性的等位基因交换突变是否会引起改变其邻近基因的基因表达的极性效应。通过半定量RT-PCR测定进行了分析，其中使用了三套PCR循环：30、35和40个循环。与执行的PCR循环数目无关，野生型、基因失活突变体和基因拯救突变体的Ech_0378和Ech_0380的RT-PCR产物相似，且Ech_0379RT-PCR产物仅在基因失活的突变体中不存在，而在野生型和基因挽救突变体中相似地出现(图6C)。没有证据支持在全部三个突变实验中存在脱靶插入。在其自身的启动子前面的Ech_0379基因的开放阅读框由于互补等位基因交换突变实验的结果而被完全恢复，且因此其基因结构与野生型查菲埃立克体相似，不同之处在于它还表达mCherry和庆大霉素抗性蛋白。在具有完整基因组方面与野生型相似的该修饰的查菲埃立克体对于通过体外和体内荧光成像实时监测病原体的新研究(与对于伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)描述的先前研究类似)将是有用的。

该书面描述使用实施例(包括最佳模式)是为了公开本发明，并且还为了使本领域技术人员能够实施本发明，包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何整合的方法。本发明的专利范围由权利要求书限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其他实例。如果此类其他实例具有与权利要求书的字面语言并无不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求书的字面语言没有实质性差异的等效结构元件，则意图将这些其他实例包括在该权利要求书的范围内。

实施例

实施例1

材料和方法

查菲埃立克体的体外培养。如先前描述的(Elwell,C.,Mirrashidi,K.,andEngel,J.,Nat.Rev.Microbiol.；14,385-400(2016))，在ISE6蜱细胞系，一种肩板硬蜱(I.scapularis)胚胎细胞系中连续培养查菲埃立克体阿肯色洲分离株。还遵循先前报道的方案(Walker,D.H.,Paddocl,C.D.and Dumler,J.S.,Med Clin North Am；92,1345-1361(2008))使用犬巨噬细胞系(DH82)培养查菲埃立克体。

同源重组质粒和片段的构建。表1中描述了用于制备为了靶向诱变实验而开发的重组质粒构建体的所有引物。表2列出了本研究中使用和制备的质粒。

表1：本研究中使用的寡核苷酸列表。

大写字体序列是基因特异性的。小写字体序列是Gibson组装的重叠部分。

*如果一条引物被多次列出，则这些引物的序列只提供一次。

表2：本研究中使用的质粒和大肠杆菌菌株

在图1中描绘了在制备用于等位基因交换诱变实验的构建体时遵循的详细分子步骤。在制备构建体时，所有PCR实验均使用

高保真Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。按照我们之前报道的，使用查菲埃立克体的Ech_0230和Ech_0379基因创建等位基因交换突变，这些基因中的随机突变通过Himar1随机诱变方法并且突变体生物体正常地生长于体外培养物中。从查菲埃立克体基因组(GenBank#CP000236.1；Ech_0230和EcH_0379的Himar1突变插入位点分别为219,097和374,461)扩增约2.0kb基因组DNA片段，这些片段自之前鉴定的这些基因的突变插入位点的两侧各跨越1kb。Ech_0230和Ech_0379基因的扩增片段的基因组坐标分别为218,060至220,133和373,265至375,810。先按照制造商的说明书将扩增子克隆到质粒pCR^TM2.1-TOPO TA载体(Life Technologies，Rockville，MD)中。还从查菲埃立克体基因组中扩增了跨Tuf-2基因(Ech_0407)启动子(tuf)的0.37kb DNA(此片段的基因组坐标为396,385至396,751)，用于组成性表达aadA基因产物以赋予对壮观霉素和链霉素的抗性。通过PCR从pCis mCherry-SS Himar A7质粒(Sahni，SK，Narra，HP..，Sahni，A.，和Walker，DH；Future Microbiol；8，1265-1288(2013))获得aadA基因开放阅读框。还将tuf启动子和aadA ORF克隆到单独的pCR^TM2.1-TOPO TA载体中，并然后使用该质粒生成tuf-aadA片段的线性片段(片段1)以掺入最终的靶向基因破坏诱变构建体中。然后，从包含基因片段的完整质粒(分别为pHR-Ech_0230和pHR-Ech_0379)使用Ech_0230或Ech_0379基因特异性引物生成线性片段，所述引物被设计为将这些基因片段分成位于线性片段的每一端并保持中间的质粒骨架(片段2)的两个相等的两半。通过遵循Gibson组装法(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA)的操作说明，将线性片段1和2连接起来，以创建最终的同源重组质粒构建体，其中基因片段因插入tuf-aadA片段而被破坏。最终的构建体分别命名为pHR-Ech_0230-tuf-aadA和pHR-Ech_0379-tuf-aadA(分别为图2A和2B)。(GenBank提交号2012015和2012023；尚待收到登录号。)随后，通过PCR由这些构建体产生包含每个基因破坏片段的5'和3'同源臂以及tuf-aadA盒的线性片段(图3A)。然后在1％琼脂糖凝胶上分辨扩增子(图3B)。凝胶分离DNA，并在无核酸酶的水中浓缩至1μg/μl，以用于等位基因交换诱变实验产生靶向基因破坏。

为了构建Ech_0379基因功能挽救模板，使用查菲埃立克体基因组DNA作为模板，通过PCR产生了突变位点的下游3'端0.5kb片段(基因座标为374,462至374,837)。以pCismCherry-SS Himar A7质粒为模板，扩增了构成Amtr-mCherry(Amtr-mCh)DNA片段的边缘无形体转录调节因子(Tr)基因启动子和mCherry ORF。按照查菲埃立克体基因组中最常见的密码子对庆大霉素抗性基因编码序列(Gent)进行商业密码子优化(GenScript，Piscataway，NJ)(GenBank#KY977452)。然后，使用Gent片段克隆到Amtr-mCh片段的下游，以生成Amtr-mCh-Gent融合片段。然后通过进行重叠PCR将3'端0.5kb Ech_0379片段连接到Amtr-mCh-Gent片段的5'端，并随后通过进行Gibson组装克隆策略将最终的扩增子克隆到Ech_0379-tuf-aadA-HR 1构建体中，以用包含3'末端0.5kb Ech_0379ORF片段的Amtr-mCh-Gent片段取代tuf-aadA片段。最终的Ech_0379挽救质粒构建体pHR-res-Ech_0379-Amtr-mCh-Gent包括在其自身启动子之前的被恢复的全长Ech_0379ORF，接着是Amtr-mCh-Gent和Ech_0379基因的3'末端1kb基因组片段(图2C)(GenBank提交号为2012033；尚未收到登录号)。然后将该构建体用作模板，通过PCR产生线性片段，该片段在5'端包含包括其自身的启动子和完整的ORF的完整Ech_0379基因，接着是Amtr-mCh-Gent片段和另外的Ech_0379基因突变位点下游的3'端1kb片段(图5A)。通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)纯化PCR产物，并如上概述的在无核酸酶水中浓缩至1μg/μl，用于等位基因交换诱变实验来恢复具有Ech_0379基因破坏的查菲埃立克体生物体中该基因的完整性。

纯化无细胞查菲埃立克体生物体。使用来自约80-90％感染的汇合的ISE6细胞培养瓶中的5ml查菲埃立克体细胞培养物产生无宿主细胞的查菲埃立克体生物体。简而言之，通过在4℃于15,000g离心10分钟回收感染的细胞悬浮物，并在弃去上清液之后，向细胞沉淀物添加1.5ml冰冷的0.3M蔗糖溶液和100μl体积的高压灭菌的滚石砂粒(rock tumblergrit)#1(60/90碳化硅砂粒，Lortone,WA)，并使用台式涡旋仪以最大速度涡旋震荡30秒以使细菌从感染的宿主细胞释放。然后将细胞悬液在4℃以200g离心10分钟以沉淀宿主细胞碎片。将上清液小心地回收到3ml注射器中，并通过1.6μm过滤器(Whatman Ltd.，Piscataway，NJ)；通过在4℃以15,000g离心10分钟使含有查菲埃立克体生物体的滤液沉淀。用重悬在45μl的0.3M冰冷蔗糖溶液洗涤细胞沉淀物两次，并立即用于电穿孔实验。

查菲埃立克体的转化和突变体的克隆分离。将来自等位基因交换诱变质粒构建体(上文概述的)的3-10μg纯化的线性DNA片段加入45μl体积的无宿主细胞的查菲埃立克体生物体中，轻柔混合并将内容物转移至1mm间隙的电穿孔比色杯(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。将比色杯在冰上孵育15分钟，并然后在2,000伏、25μF和400Ω设置下进行电穿孔(Gene Pulser Xcell^TM，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。将电穿孔的细胞转移到含有0.5ml FBS和1ml未感染的ISE6细胞悬浮液(在蜱细胞培养感染培养基中包含约1x10⁶ ISE6细胞)的微型离心管中。将混合后的样品在5,000g离心5分钟，在室温孵育15分钟，然后将细胞重悬在5ml培养基中，并将全部内容物转移到包含汇合的ISE6细胞的T25烧瓶中，并在加湿的34℃孵箱中孵育24h，并然后将各100μg/ml的壮观霉素和链霉素添加到培养基中；继续在34℃孵育数周以选择突变体。通常，在两到三周后通过PCR分析检测到突变体，但是在该时间点之后继续评估数周。进行类似的实验以获得Ech_0379基因恢复突变体，不同之处在于电穿孔24小时后使用含有80μg/ml庆大霉素的培养基。还通过使用NikonDiaphot倒置显微镜(Nikon，Melville，NY)检查培养物，通过检测mCherry的表达评估了Ech_0379基因恢复突变体培养物。一旦鉴定，将抗生素抗性培养物转移至DH82细胞培养物中以进一步培养和维持。还制备了液氮储备液，并在突变株建立后的前两周内进行了储存。

确认查菲埃立克体突变体的存在。随后通过插入特异性PCR通过基因组DNA分析，筛选在抗生素存在下生长良好的查菲埃立克体培养物以获得等位基因交换突变阳性株。按照制造商的说明书(Promega，Madison，WI)，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒从培养物中回收总基因组DNA。使用纯化的基因组DNA进行了三种不同的PCR测定(图4B)。第一和第二PCR测定针对1)等位基因交换位点5'的基因组区域和插入的特定DNA(图4B第一分图)，插入DNA和基因组上的等位基因交换位点的3'部分(图4B的第二分图)。设计了第三PCR测定(图4B的第三分图)以另外测试突变体的克隆纯度；该测定中使用的引物靶向等位基因交换插入位点上游和下游的基因组区域(图4C)。在0.9％琼脂糖凝胶上分辨PCR产物以鉴定特定的预测长度的扩增子，并然后进行测序分析以通过映射从扩增子两端的插入的基因组连接点来进一步确认完整性。随后通过DNA印迹分析确认突变和克隆纯度(图4D)。使用ClaI、EcoRI或HindIII限制酶对来自突变生物体和野生型生物体的基因组DNA进行限制酶消化；在1％琼脂糖凝胶上分辨消化的DNA，并转移到尼龙膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)上。插入特异性aadA基因片段探针用于DNA印迹杂交实验以将插入的DNA放置在Ech_0230和Ech_0379的靶向破坏突变体中，同时使用Ech_0379基因片段探针以按照DNA印迹分析的标准程序对Ech_0379的靶向基因插入和恢复突变体克隆中的基因组插入定位。

通过RT-PCR进行RNA分析，以验证转录物的丢失和恢复。按照以下三试剂总RNA分离方法按照制造商的说明书(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，从生长在ISE6或DH82细胞培养物中的野生型和突变体查菲埃立克体生物体分离总RNA。然后将用RQ1 DNA酶(Promega，Madison，WI)在37℃处理RNA样品60分钟，以去除任何残留的基因组DNA。在RT-PCR分析中使用针对Ech_0230或Ech_0379ORF的引物，并通过0.9％琼脂糖凝胶分析和通过对产物进行DNA序列分析，评估了特定扩增子的存在。按我们先前描述的进行半定量RT-PCR分析，以使用从野生型、Ech_0379基因破坏突变体和Ech_0379基因恢复突变体中回收的等量查菲埃立克体RNA来评估基因Ech_0378、Ech_0379和Ech_0380的mRNA表达(图5B、5C、6A和6B)。该测定进行30、35和40个循环(图6C)。使用DNA印迹确认(图5E)。

实施例2

材料和方法。犬埃立克体和嗜吞噬细胞无形体的体外培养。按先前所述(Munderloh,U.G.等人J.Clin.Microbiol.37,2518-2524(1999)和Cheng,C.&Ganta,R.R.Curr.Protoc.Microbiol.Chapter 3,Unit 3A1(2008))，在ISA6蜱细胞系(一种肩板硬蜱(I.scapularis)胚胎细胞系)中连续培养犬埃立克体和嗜吞噬细胞无形体。

同源重组质粒和片段的构建。用于制备重组质粒构建体的所有引物均按照与我们对于查菲埃立克体描述的相似的方案开发用于靶向诱变实验，不同之处在于使用该病原体的基因靶向特异性引物。相似地，制备用于等位基因交换诱变实验的构建体所遵循的详细分子步骤与针对查菲埃立克体通过遵循标准分子方法(Sambrook,J.&Russell,D.W.Molecular cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,New York.(2001))描述的步骤相似。简言之，从与查菲埃立克体基因Ech_0660相似的犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体的基因同源物扩增约2.0kb基因组DNA片段，这些片段自这些基因的先前鉴定的突变插入位点两侧各跨越约1kb。本文分别以SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55提供了犬埃立克体和嗜吞噬细胞无形体的Ech_0660同源序列。首先将扩增子克隆到质粒载体中，并将驱动抗生素选择标记基因的埃立克体或无形体基因启动子与荧光报告基因一起插入最终的靶向基因破坏诱变构建体中以将细菌的序列分成大致相等的两半。然后通过PCR从包含犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体特定破坏基因片段的整个重组质粒中产生线性片段。然后纯化扩增子，并在无核酸酶的水中浓缩至1μg/μl，以用于等位基因交换诱变实验产生靶向基因破坏。

纯化无细胞犬埃立克体和嗜吞噬细胞无形体生物体。回收犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体的无宿主生物体的纯化方法与以上在实施例1中描述的查菲埃立克体的基本相同，不同之处在于分别使用了包含犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体的感染的80-90％感染的汇合的ISE6细胞培养瓶，通过遵循如Felsheim,R.F.等人BMC Biotechnol.6,42(2006)中的方案分别产生特定的无宿主细胞生物体。

查菲埃立克体的转化和突变体的克隆分离。将来自等位基因交换诱变质粒构建体(上文概述的)的3μg纯化的线性DNA片段加入45μl体积的无宿主细胞的查菲埃立克体生物体中，轻柔混合并将内容物转移至1mm间隙的电穿孔比色杯(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。将比色皿在冰上孵育15分钟，然后在2,000伏、25μF和400Ω设置下进行电穿孔(Gene Pulser Xcell^TM，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。将电穿孔的细胞转移至到含有0.5ml FBS和1ml未感染的ISE6细胞悬浮液(在蜱细胞培养感染培养基中包含约1x10⁶ ISE6细胞)的微型离心管中。将混合后的样品在5,000g离心5分钟，在室温孵育15分钟，然后将细胞重悬在5ml培养基中，并将全部内容物转移到包含汇合的ISE6细胞的T25烧瓶中，并在加湿的34℃孵箱中孵育24h，并然后将各100μg/ml的壮观霉素和链霉素添加到培养基中；继续在34℃孵育数周以选择突变体。通常，在两到三周后通过PCR分析检测到突变体，但是在该时间点之后继续评估数周。进行类似的实验以获得Ech_0379基因恢复突变体，不同之处在于电穿孔24小时后使用含有80μg/ml庆大霉素的培养基。还通过使用NikonDiaphot倒置显微镜(Nikon，Melville，NY)检查培养物通过检测mCherry的表达评估了Ech_0379基因恢复突变体培养物。一旦鉴定，将抗生素抗性培养物转移至DH82细胞培养物中以进一步培养和维持。还制备了液氮储备液，并在突变株建立后的前两周内进行了储存。

确认犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体突变体的存在。通过插入特异性PCR通过基因组DNA分析，筛选在抗生素存在下生长良好的犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体以获得等位基因交换突变阳性株。操作方案与我们针对查菲埃立克体描述的相同。

通过RT-PCR进行RNA分析，以验证转录物的丢失和恢复。在ISE6细胞培养物中生长的野生型和突变体犬埃立克体或嗜吞噬细胞无形体生物体的总RNA通过遵循三试剂总RNA分离方法分离并用RQ1 DNA酶处理。在RT-PCR分析中使用病原体基因特异性引物，并通过琼脂糖凝胶分析和通过对产物进行DNA序列分析来评估特异性扩增子的存在(Sambrook,J.&Russell,D.W.Molecular cloning:a laboratory manual.Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York.(2001))。

实施例3

材料与方法

体外培养和无细胞查菲埃立克体回收

使查菲埃立克体阿肯色州野生型分离株和突变体在犬巨噬细胞DH82中生长。按下文进行无细胞查菲埃立克体野生型及其突变体的分离和纯化。简言之，用Diff-Quik染色评估细菌在DH82细胞中的感染率。感染72h后，当感染达到80-90％左右时，从四个T-150汇合烧瓶中收集培养物，并以500×g离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于含有蛋白酶抑制剂(Roche,Indianapolis,IN)的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在冰上对细胞进行匀浆，通过用23g针头使其在10mL注射器中经过15-20次抽打(stroke)。在光学显微镜下检查匀浆效率(80-90％裂解)。将全细胞裂解液在4℃以500×g离心5分钟。所得的含有无细胞埃立克体生物体的上清液通过2μm的无菌膜滤器(Millipore，Billerica，MA)过滤。通过在15,000×g离心15分钟使滤液中的无细胞埃立克体沉淀，并将沉淀物悬浮在PBS中，并然后在30％的泛影葡胺和钠溶液(Renografin)MD-76R(Mallinckrodt Inc，St.Louis，MO)上分层。将悬浮液在S50-ST旋斗式转子(贝克曼，印第安纳波利斯，印第安纳州)中在4℃以100,000×g离心1h。将无细胞埃立克体沉淀物在15,000×g洗涤15分钟，并用于实验。

细菌mRNA富集和测序

细菌mRNA富集和cDNA文库制备以及RNA测序如下进行：简言之，使用TRIzol试剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)从纯化的无细胞埃立克体中分离野生型和突变体的RNA。然后用DNA酶I(Invitrogen，Carlsbad，CA)处理RNA样品，并使用MICROBEnrich试剂盒(Ambion，Foster City，CA)去除宿主18S rRNA、28S rRNA和多聚腺苷酸mRNA来富集细菌RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，Waltham，MA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)评估富集前后细菌RNA的数量和完整性。使用Ribo-Zero磁性试剂盒从总RNA样品中分离mRNA，并然后按照制造商的操作说明(Epicentre，Madison，WI)片段化成短片段。随后，使用mRNA片段为模板合成cDNA。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina，Ingolstadt，Germany)制备野生型和突变体cDNA文库。在使用Illumina HiSeqTM 4000(Beijing Genomics Institute(BGI),Philadelphia,PA)对样品进行测序之前，使用Agilent 2100生物分析仪对样品文库进行定量，并通过实时PCR(ABI StepOnePlus)评估文库质量。

生物信息学分析

原始图像数据通过碱基调用转换为原始序列数据。对原始读段进行质量评估，以确定原始读段是否符合映射要求。将低质量(<20)的碱基从分析中排除。然后将原始读段过滤以去除衔接子序列和低质量读段，然后使用SOAPaligner/SOAP2按照第一个带注释的GenBank#CP000236.1将清理的读段与查菲埃立克体阿肯色州菌株的完整基因组进行比对。之所以选择并使用该登录号，是因为我们先前的出版物以及其他研究者类似地广泛使用它来指代其中列出的基因名称和编号。比对时允许不超过五个错配，这是用于比对分析的标准截止值。使用比对数据计算参考基因的读段分布并确定基因覆盖率。评估比对结果以进行质量检查，并然后进行DGE分析。使用针对总读段长度和测序读段数目进行归一化的RPKM方法计算基因表达水平。我们使用p值<0.05，错误发现率(FDR)≤0.001，Log2比率绝对值≥1作为阈值来判断基因表达的显著性差异。FDR使用准确的p值作为RNA seq数据的多样品比较中的控制措施。使用Benjamini和Yekutieli描述的方法对假阳性和假阴性错误进行了校正。

实时定量逆转录PCR

基于SYBR green检测的实时定量逆转录PCR(进行qRT-PCR测定以验证在RNA seq数据分析中观察到的基因表达变化)。还使用用于产生RNA seq数据的野生型、ECH_0379、ECH_0490和ECH_0660突变体的RNA通过使用

III Platinum SYBR GreenOne-Step qRT-PCR试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)通过进行定量RT-PCR通过SYBRGreen测定来确定转录水平。使用SuperScript III从所有重复样品中逆转录RNA，然后在含有正向和反向引物各0.5μM的25μL的反应中进行定量PCR。热循环仪条件为：94℃持续15秒，60℃持续30秒，74℃持续15秒，持续40个循环。在验证实验中使用StepOnePlus^TMReal-TimePCR仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)使用了13个随机选择的差异化转录的基因，并通过StepOne Software v2.3分析了数据。在进行验证实验之前，通过实时RT-PCR对查菲埃立克体16S rRNA进行定量，并将不同RNA批次之间的RNA浓度针对其归一化。对于qRT-PCR数据，采用delta-delta Ct(ΔΔCt)计算来计算表达的相对变化，并通过基因表达的重复值的平均和标准差获得倍数变化。按照先前的研究(PloS One；10，e0132657(2015))中描述的使用基因特异性引物进行针对查菲埃立克体基因ECH_0490和ECH_0492(在ECH_0490基因下游、接近转座子突变)的半定量一步RT-PCR(Life Technologies,Carlsbad,CA)，进行30个扩增循环。简言之，来自野生型和ECH_0490突变体的RNA被用作RT-PCR的模板。将没有逆转录酶或模板RNA的一个管用作阴性对照。具有DNA为模板的一个管用作阳性对照。热循环仪的条件如下：对于逆转录步骤，50℃持续1h，然后进行35个循环的94℃持续30秒，55℃持续30秒和72℃持续30秒；最后，2分钟的72℃延伸步骤是反应的一部分。

立克次氏体病原体查菲埃立克体引起蜱媒病、人单核细胞埃立克体病。病原体某些基因组位置内的突变有助于理解致病机理和开发减毒疫苗。我们以前的研究表明，查菲埃立克体中不同基因组位点的突变对其在脊椎动物和蜱宿主中的生长和减毒产生了不同的影响。此处，我们使用RNA深度测序技术评估了三个突变对转录变化的影响。RNA测序有助于检测野生型和突变体查菲埃立克体66-80％的转录物。反向转运蛋白基因(ECH_0379)的突变导致在脊椎动物宿主中的生长减慢，导致许多转录的基因的下调。相似地，ECH_0490编码序列下游的突变对该病原体的体内生长产生最小的影响，但引起其转录组的重大变化。该突变引起几种宿主应激反应基因的表达增强。即使ECH_0660基因突变导致该病原体在脊椎动物宿主中被快速清除并有助于产生保护性应答，但对转录组的影响最小。转录组数据提供了有关突变对整体基因表达的影响以及它们如何促进病原体耐性和/或宿主清除的新见解。

查菲埃立克体是蜱传播的细胞内细菌病原体，引起人单核细胞埃立克体病(HME)，并且它还感染狗、鹿、山羊和土狼。某些基因组位置的突变导致基因表达变化，影响该病原体在宿主中引起感染并持久存在的能力。查菲埃立克体的基因组可能已在宿主细胞环境中进化，导致破坏宿主免疫应答的机制的发展。与致病机理相关的查菲埃立克体基因在宿主微环境中可能是高度活跃的，并且与该假设一致，已知响应于宿主细胞防御发生了差异化基因表达。关于鉴定对查菲埃立克体在宿主细胞环境中存活至关重要的基因，已取得进展。然而，迄今为止，仅鉴定出少数几个大量表达的基因与致病有关。明确与致病和毒力有关的基因并记录它们的差异化表达可能有助于发现有价值的作为HME的治疗干预的靶的新蛋白以及针对HME的疫苗开发。

基因突变的细胞内病原体是研究微生物致病机理的重要资源，并且也有助于疫苗开发的努力。我们之前的研究证明了基于转座子的突变在查菲埃立克体中的可行性。我们还发现，导致膜蛋白基因转录失活的一些插入突变会导致该病原体在脊椎动物宿主中的生长减弱。在ECH_0379和ECH_0660基因的编码区域内的插入提供了不同水平的防止脊椎动物宿主感染的保护。在这项研究中，我们假设突变的特定基因组位置可能会影响整体基因表达，并导致该病原体在宿主细胞环境中的存活、感染进程和复制被改变。为了验证这一假设，我们评估了Cheng等人较早前报道的三个突变对整体基因转录的影响。我们选择了两个突变体，它们在编码噬菌体样蛋白(ECH_0660)的ECH_0660基因和编码反向转运蛋白(ECH_0379)的ECH_0379基因的编码区域内具有突变。ECH_0660基因中的插入突变位于555个碱基的长开放阅读框的核苷酸位置213。类似地，ECH_0379基因中的突变位于1056个碱基的长开放阅读框的核苷酸位置682。第三插入突变株ECH_0490，在ECH_0490基因的终止密码子下游具有166个核苷酸的插入突变。

高通量RNA测序(RNA seq)技术已被证明是确定专性细胞内细菌的整体转录组活性的可靠且稳健的工具。比较基因组学研究鉴定到数类毒力因子，它们参与分泌和病原体与宿主细胞之间的分子运输以及宿主免疫应答的调节。但是，专注于埃立克体基因表达的研究主要局限于外膜蛋白基因、IV型分泌系统(T4SS)基因、串联重复蛋白(TRP)基因和锚蛋白重复基因(Ank)。在它们之中，已发现编码T4SS蛋白和p28-OMP蛋白的基因对于致病性至关重要。

查菲埃立克体的专性细胞内性质对从宿主细胞中获得无细胞埃立克体提出了挑战。从高度丰富的宿主RNA中分离埃立克体RNA的技术限制仍然是表征病原体转录物的障碍。为了克服此限制，我们使用了有效的细胞裂解策略，然后进行密度梯度离心。进一步地，我们通过有效去除宿主和细菌RNA混合物中的多聚腺苷酸化RNA(多聚(A)RNA)和真核和原核生物核糖体RNA富集了埃立克体RNA。根据带注释的基因组：GenBank#CP000236.1，对富集的RNA进行测序有助于检测66–80％的查菲埃立克体被注释的基因的转录物。对野生型和突变株的转录水平的比较揭示，免疫原性和分泌性蛋白基因的调节程度最高，尤其是在ECH_0490和ECH_0379的突变株中，而在ECH_0660突变株中观察到的变化最小。

结果

从宿主细胞中分离和纯化无细胞查菲埃立克体

对细胞内病原体进行转录组研究的主要挑战是难以分离无宿主细胞的细菌并随后回收高质量的细菌RNA。立克次氏体生物体，包括查菲埃立克体，仅占分离的总RNA的很小一部分。由于高度丰富的宿主细胞RNA的存在，回收细菌RNA成为执行RNA序列分析实验的挑战。在这项研究中，我们首先通过采用与密度梯度离心方案结合的有效的细胞裂解方法从感染的宿主细胞(犬巨噬细胞系，DH82)中纯化出不含宿主细胞的细菌。进行宿主细胞裂解以有效地破裂宿主细胞而不对细菌造成重大损害。查菲埃立克体的直径约为0.5至1μm。因此，将感染的宿主细胞裂解物通过2μm的膜过滤，以去除大部分宿主细胞碎片。对所得的查菲埃立克体细胞悬浮液的高速泛影葡胺(Renografin)密度梯度离心有助于使细菌沉淀，而宿主细胞碎片仍保留在溶液的顶层。经过总RNA分离和DNA酶处理后，生物分析仪分析揭示，尽管先前对无宿主细胞的细菌进行了分级分离，但在回收的RNA中仍保留高浓度的宿主28S和18S RNA。细菌mRNA富集是通过使用细菌RNA富集方案耗尽宿主的多聚(A)RNA和真核生物核糖体RNA来进行的，导致宿主28S和18S RNA的水平几乎检测不到。通过使用查菲埃立克体16S rRNA基因引物的实时定量PCR证实，纯化的RNA样品中不存在污染的查菲埃立克体基因组DNA。我们还通过比对20个随机选择的查菲埃立克体基因间非编码DNA序列，确认了RNAseq原始数据中不存在DNA序列(数据未示出)。

查菲埃立克体突变体中基因的遍在性(ubiquitous)转录

对查菲埃立克体野生型和突变体的Illumina HiSeq.4000RNA seq产生7500万-1.3亿个读段。转录组数据保存在NCBI Bio-Project ID：PRJNA428837和SRA登录号：SRP128532(可在ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP128532网站上找到)。尽管有效地去除了宿主核糖体RNA，但仅小部分(少于19％)的读段被映射到查菲埃立克体基因组。根据带注释的基因组(GenBank#CP000236.1)，读段(最少10个读段/基因)的映射鉴定到从查菲埃立克体基因组表达的基因的约66–80％；野生型生物体(n＝3)的转录组包含针对总共1158个基因中的约920个基因的转录物，并且相似地在突变体ECH_0660、ECH_0379和ECH_0490中也分别鉴定到888、895和768个基因转录物(n＝3)(表3)。野生型(R²＝0.9)和突变体ECH_0379(R²＝0.93)、ECH_0490(R²＝0.68)和ECH_0660(R²＝0.89)的重复RNA seq数据显示出高度的表达相关性。野生型对ECH_0379(R²＝0.18)和野生型对ECH_0490(R²＝0.38)的表达数据散点图显示负相关性。值得注意的是，野生型对ECH_0660的表达图显示出正相关(R²＝0.96)。对于差异化表达分析，仅考虑具有读段/千碱基转录组/百万映射的读段(RPKM)≥1的转录物。

表3

查菲埃立克体的全转录组

野生型查菲埃立克体中的转录物分布包括由少于5个转录物代表的481个转录物，接着是代表了转录组19％的假设的蛋白转录物(178个)，以及127个核糖体蛋白基因转录物(14％)。主要外膜蛋白的转录物(22个转录物)代表了下一个最丰富的组。由14个基因编码的保守域蛋白转录物与NADH脱氢酶I复合物相关。其他高表达的基因包括分子伴侣、ATP合酶、推定的膜蛋白、细胞色素c氧化酶、GTP结合蛋白、推定的脂蛋白、翻译延伸因子、ABC转运蛋白和DNA聚合酶；其全部占转录组的0.5–1.7％。

ECH_0379突变引起许多涉及反向转运蛋白活性、噬菌体蛋白的基因以及涉及转运和转录功能有关的基因的转录下调。

通过比较突变体和野生型的RPKM表达值确定差异化基因表达(DGE)。倍数变化被认为是显著的，p值≤0.05，错误发现率(FDR)≤0.001，且重复之间的表达值一致。野生型和突变体之间对于管家基因的基因表达的变化并不显著。基于这些标准，与野生型相比，在ECH_0379基因突变体中鉴定出41个基因被显著下调，而2个基因被上调(表4)。在转录水平上表现出显著下降的最突出的基因是编码反向转运蛋白、ABC转运蛋白和ATP依赖性Clp蛋白酶(ECH_0367)的基因。四个反向转运蛋白基因：单价阳离子/质子反向转运蛋白(ECH_0466)、Na(+)/H(+)反向转运蛋白亚基C(mrpC)(ECH_0469)、钾吸收蛋白TrkH(ECH_1093)和氮调节蛋白NtrY(ECH_0299)表现出转录水平上的显著下降。此外，两种膜转运蛋白的转录物：基因ECH_0517的阳离子ABC转运蛋白透性酶蛋白转录物和基因ECH_0972的另一种ABC转运蛋白透性酶蛋白转录物被下调。编码噬菌体样蛋白{噬菌体前头蛋白酶(ECH_0032)、噬菌体门蛋白(ECH_0033)和噬菌体主要衣壳蛋白(ECH_0830)}的三个基因在突变体株中也被下调。6个参与转录的基因：DNA复制和修复蛋白RecF(ECH_0076)、甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶(ECH_0602)、二甲基腺苷转移酶(ECH_0648)、GTP结合蛋白EngA(ECH_0504)、亮氨酰tRNA合成酶(ECH_0794)和核酸内切酶III(ECH_0857)的转录物在该突变菌株中也被下调。代谢过程的酶例如谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)(ECH_0125)、DNA/泛酸代谢黄素蛋白(PMF)(ECH_0374)、ATP酶、AGF1(ECH_0392)、尿卟啉原III合酶(UPGS)(ECH_0480)、二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC)(ECH_0485)、生物素-乙酰-CoA-羧化酶连接酶(BACL)(ECH_0848)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)(ECH_0937)也被下调。8个假设的蛋白基因：ECH_0021、ECH_0161、ECH_0264、ECH_0289、ECH_0725、ECH_0879、ECH_0913和ECH_1053的转录物在该突变体中也被下调。

表4

突变体ECH_0490中T4SS和p-28OMP基因簇基因的差异化转录调控在ECH_0490突变株中，37个基因被显著下调，而17个基因被上调(表5)。被下调的基因中属于T4SS的四个是ECH_0494(VirB3)、ECH_0496(VirB6)、ECH_0498(VirB6)和ECH_0499(VirB6)；和I型分泌膜融合蛋白(T1SS_HlyD)(ECH_0970)。分子伴侣基因，例如冷休克蛋白(CSP)(ECH_0298)和ATP依赖性Clp蛋白酶以及ATP结合亚基ClpA(ClpA)也被下调。包括蛋白输出膜蛋白(SecF)(ECH_0095)、前蛋白转位酶(SecY)(ECH_0428)、钾吸收蛋白(TrkH)(ECH_1093)和氮调节蛋白(NtrY)(ECH_0299)在内的转运蛋白也在被下调的基因之中。参与生物合成过程的代谢酶，{四氢吡啶-2-羧酸N-琥珀酰转移酶(dapD)(ECH_0058)、醌氧化还原酶(ECH_0385)、金属内肽酶(MEP)(ECH_0644)、肽去甲酰基酶(PDF)(ECH_0939)、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PSP)(ECH_0964)、焦磷酸酶(PPi)(ECH_1014)和乳清酸酯磷酸核糖基转移酶(OPRTase)(ECH_1108)}也被下调。转录和翻译相关基因，例如延伸因子(EF-Tu)(ECH_0515)、氨酰基-tRNA合成酶(IARS)(ECH_0538)、DNA结合蛋白(HU)(ECH_0804)、3'-5'核酸外切酶结构域(ECH_1011)和DNA结合反应调节剂(ECH_1012)也被下调。

表5

该突变体中的被上调的蛋白基因包括属于跨膜蛋白类别的7种蛋白。在这些中，4个属于p-28OMP基因簇{ECH_1143(OMP-p28)、ECH_1146(OMP-p28-2)、ECH_1136(OMP-1B)和ECH_1121(OMP-1N)}。此外，两个推定的膜蛋白基因(ECH_0009、ECH_0230)和免疫主导性表面蛋白基因(ECH_0039)被上调。热休克蛋白ATP依赖性Clp蛋白酶ClpA(ECH_0567)和ATP结合伴侣ClpB(ECH_0367)以及与应激反应相关的RNA聚合酶σ因子(RpoH)(ECH_0655)的转录物也被上调。2个编码铁硫蛋白{BolA家族蛋白(ECH_0303)和FeS簇组装支架(IscU)(ECH_0630)}的基因的转录物被相似地上调。我们观察到六个假设的蛋白基因的差异化表达，其包括ECH_0166、ECH_0251、ECH_0450、ECH_0531、ECH_0753和ECH_0878。

ECH_0660基因中的突变导致最小的转录改变。

尽管我们观察到ECH_0379和ECH_0490突变体中的剧烈基因表达变化，但ECH_0660突变体的转录组显示出与野生型相比最小的改变；我们仅观察到在该突变体中显著差异性地表达的5个基因(表6)。这些基因包括作为下调基因的氮调节蛋白(NtrY)(ECH_0299)和ABC转运蛋白透性酶蛋白(ECH_0972)，而血红素输出蛋白CcmA(ECH_0295)和伴侣蛋白(ECH_0364)被上调。我们还鉴定了ECH_0379和ECH_0490中的几个通常差异化表达的基因(表7)。核糖核酸酶D(ECH_0300)和钾吸收蛋白(ECH_1093)在ECH_0379和ECH_0490中通常被下调。T4SS蛋白VirB4基因在ECH_0490突变体中被下调，而该基因在ECH_0379突变体中被上调。与此相反，ClpB在ECH_0379突变体中被下调而在ECH_0490突变体中被上调。

表6

表7

通过实时定量逆转录PCR验证RNA seq数据

根据RNA seq数据，对13个随机选择的被鉴定为差异化转录的基因进行定量的实时定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)分析。为了生成qRT-PCR数据，我们首先如先前在Cheng等人所描述的，将RNA样品针对组成型表达的编码16S RNA的查菲埃立克体基因归一化。验证了ECH_379突变体中7个下调基因的转录物丰度，包括ECH_0466和mrpC、ClpB、ECH_0033、NtrY、TrkH和ECH_0972。类似地，通过qRT验证了来自ECH_0490突变株的6个上调基因，包括属于OMP基因簇的四个转录物(OMP-p28、OMP-1B、OMP-1N、OMP-p28-2)以及来自ClpB和RpoH基因中的各一个转录物。同样，通过qRT-PCR在ECH_0660突变体中确认了ECH_0299和ECH_0972基因的转录物的下调。

讨论

从极其丰富的宿主RNA中分离无细胞细菌RNA是对细胞内病原体进行转录谱分析的第一个挑战。立克次氏体需要在宿主细胞中培养，并然后需要在提取RNA用于转录组评估实验之前纯化。为了记录三个转座子突变对查菲埃立克体转录的影响，我们首先开发了一种分离和纯化无宿主细胞的查菲埃立克体生物体的方法，从中我们分离了RNA并然后进行了下一代测序(NGS)分析。为了分离无细胞的查菲埃立克体，我们从有效的宿主细胞裂解方案开始，并然后过滤全细胞裂解液，接着进行泛影葡胺密度梯度离心。第二个挑战是获得用于转录组分析的不含宿主细胞的RNA。先前的研究报道了，细菌RNA富集方法产生的对细菌RNA读段的富集仅为3–10％。我们的研究中实施的无宿主细胞的细菌的分离和细菌RNA纯化步骤允许对查菲埃立克体RNA的更多的富集。在我们目前的研究中，我们能够富集细菌RNA，这有助于产生高达19％的高映射RNA读段。值得注意的是，深度RNA测序分析有助于映射感染的巨噬细胞宿主细胞中表达的查菲埃立克体基因的80％。

在高表达的基因中，p28-OMP多基因簇在转录组中占主导地位。查菲埃立克体p28-OMP多基因位点包含22个串联排列的编码细菌免疫主导性蛋白的基因。RNA seq数据中所有22个转录物的存在表明该基因簇在表达最丰富的基因之中。这些观察结果与我们先前的蛋白组学研究一致，在该研究中我们报告了p28-OMP基因的表达丰度。NADH脱氢酶I复合体基因也在查菲埃立克体中高表达。NADH脱氢酶对抗吞噬体NOX2反应，从而抑制宿主细胞凋亡34。一些病原菌中的T4SS效应蛋白被认为在操纵宿主基因表达以破坏宿主免疫反应方面是重要的。对于立克次氏体，包括边缘无形体、嗜吞噬细胞无形体、犬埃立克体和查菲埃立克体，已经报道了T4SS效应物在致病性中的作用。RNAseq分析鉴定到编码T4SS蛋白的几种转录物，该T4SS蛋白包括VirB3、B4、B6、B8、B9、B10和B11。伴侣蛋白基因DnaK、DnaJ、GroE和ClpB在野生型和突变株中也都高表达。在其他立克次氏体中也报道了这种参与细胞稳态和氧化应激反应的蛋白的存在，表明病原体蛋白组如果按照本研究中报道的转录组发生类似的改变，它们的基因产物对于查菲埃立克体的应激反应也至关重要。确实，我们最近的研究表明，应激反应蛋白对于查菲埃立克体是重要的。其他高表达的蛋白基因包括编码参与蛋白合成的管家核糖体蛋白、推定的膜蛋白、ABC转运蛋白和脂蛋白的那些蛋白基因；所有这些蛋白基因对于病原体的蛋白合成、转运、运输和效应子向宿主细胞中的分泌可能都是重要的。参与能量代谢，细胞分裂和转录调控的ATP合酶亚基、细胞色素C氧化酶、DNA聚合酶、GTP结合蛋白和翻译延伸因子也在野生型和突变型生物体中高表达的基因之中。转录组覆盖的程度高于先前针对在ISE6和AAE2蜱细胞8中的查菲埃立克体报道的。这对于增强细胞内病原体转录物和观察到的基因表达的丰度的检测是重要的。与微阵列分析相比，下一代测序对RNA的深度测序可能导致更高的转录组覆盖率。这整套高表达的基因可能代表参与查菲埃立克体在宿主细胞环境中的致病性、复制和存活的产物。在转录组中还鉴定到编码锚蛋白重复蛋白的四个转录物，其显示出调节蛋白-蛋白相互作用。值得注意的是，来自野生型和突变生物体的转录组包含216个编码功能未知的假设蛋白的转录物。由于这些位于核心转录组中，因此我们预期它们代表了查菲埃立克体复制的一套重要的被转录的基因。

发现ECH_0379突变体中大量基因的转录与野生型相比减少。代表反向转运蛋白、ABC转运蛋白、分子伴侣、代谢酶和转录调节因子的基因在被下调的基因之中(表4)。我们预测，反向转运蛋白基因的突变引起代谢抑制。反向转运蛋白和转运蛋白在离子和溶质跨细菌细胞膜的转运中起重要作用。反向转运蛋白是完整的膜蛋白，其可以执行Na+和/或K+跨磷脂膜获取H+的二次转运。查菲埃立克体基因组包含几个与反向转运蛋白或其亚基具有同源性的基因，表明它们是病原体的噬菌体内复制和在宿主中的生存所必需的。特别地，反向转运蛋白帮助细菌维持pH、盐和温度条件。我们观察到转运蛋白基因诸如一价阳离子/H+反向转运蛋白亚基C(ECH_0469)和ECH_0466的显著转录下降。破坏转运蛋白功能或阻止其表达可能会影响病原体在体内的生长。确实，ECH_0379基因中的突变导致该生物体在偶然宿主(狗)和贮存宿主(白尾鹿)中的生长减弱。ABC转运蛋白还参与离子和氨基酸的吸收，并且可能在病原体感染并在宿主细胞环境中存活的能力方面发挥重要作用。ECH_0379突变体具有编码ABC转运蛋白的基因ECH_0517和ECH_0972的低水平转录活性，这些转运蛋白在感染致病的不同阶段起作用。这些蛋白促进病原体在宿主微环境中的存活。该突变可能干扰转运机制，从而影响其在宿主细胞中感染和存活的能力。该突变也可能导致参与生理性应答的基因的转录发生改变，例如调节病原体的代谢活动。我们还发现了编码代谢酶的几种转录物的下调：谷氨酸-半胱氨酸连接酶、DNA/泛酸代谢黄素蛋白家族蛋白、ATP酶、尿卟啉原-III合酶、二氨基庚二酸酯脱羧酶、生物素-乙酰-CoA-羧化酶连接酶和精氨酸琥珀酸裂解酶。通常，病原体在细胞内环境中的存活取决于其从宿主细胞中获取营养成分的能力。致病细菌利用破坏宿主免疫系统的代谢途径和毒力相关的因子，使得它们能够从宿主细胞中获取营养。可能的是，ECH_0379突变体中上述基因的转录物的下调可能会阻碍细菌的代谢反应及其从宿主中获取营养的能力。该突变还引起编码DNA复制和修复蛋白、甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶、二甲基腺苷转移酶和亮氨酰tRNA合成酶的基因表达降低。这也可能导致病原体在细胞内生长和存活的缺陷。我们先前的研究表明，尽管该突变体的生长减弱，但它未能提供针对野生型感染刺激的完全保护。如果转录组的变化与蛋白组的变化相关，则突变生物体的蛋白表达相对于野生型查菲埃立克体的变化可能会导致宿主反应改变，从而使宿主在暴露于突变生物体时启动宿主保护性应答的效率降低。

致病菌产生T4SS效应子，以减弱宿主细胞基因的表达并造成细菌的致病性。RNAseq数据表明ECH_0490突变体中各种T4SS组分蛋白基因转录物的表达下降。我们还观察到ECH_0490突变株中伴侣蛋白和参与转录和翻译机制的几个基因以及核酸外切酶和DNA结合调节基因转录物的转录降低。相反，ClpB(一种主要的应激反应热休克蛋白)和RpoH(应激反应RNA聚合酶转录亚基)在该突变体中显示出转录增加。

伴侣蛋白在蛋白分解和帮助病原体克服可能的宿主细胞诱导的应激中起关键作用。ClpB使在应激条件下积累的聚集蛋白重新活化，并且它在查菲埃立克体的复制阶段大量表达。在细菌在宿主细胞内生长期间预防或减少蛋白聚集以及相关的蛋白失活可能有益于增强病原体的存活。RNA聚合酶转录调节因子RpoH对于病原体的持续生长也很重要，因为它有助于促进应激反应蛋白的表达。与该预测一致，在当前对于ECH_0490突变体的研究中观察到ClpB和RpoH表达增强。如我们在先前的研究所报道的，这两个重要基因的增强表达可能使该突变体能够在脊椎动物和蜱宿主中类似于野生型查菲埃立克体那样生长。外膜蛋白执行多种功能，例如入侵、转运、免疫反应和粘附，这些功能对于埃立克体属的物种(包括查菲埃立克体和反刍埃立克体)的存活至关重要。与野生型生物体相比，ECH_0490突变体具有增加的OMP丰度。我们发现编码免疫主导性P28/OMP家族蛋白(OMP_p28、OMP_p28-2、OMP-1B和OMP-1N)和膜蛋白(ECH_0039、ECH_0009和ECH_0230)的七个跨膜基因被上调。外膜蛋白丰度的显著变化可能与膜结构的整体变化有关，从而改变了病原体对宿主防御的敏感性。ECH_0490突变体中注意到的转录变化可能对病原体没有任何不利影响，因为该突变体在白尾鹿(贮存宿主)和狗(偶然宿主)及其蜱宿主美洲蜱(Amblyomma americanum)中的生长与野生型病原体相似。对ECH_0490(硫辛酸合成酶)和ECH_0492(推定的磷酸ABC转运蛋白)基因的转录活性评估(均位于转座子插入突变的上游和下游)表明，该突变对这些基因的转录没有影响。突变体转录组的多样性变化虽然在突变位点附近没有影响，但却表明该突变影响了整体基因表达而尚未对该病原体在脊椎动物和蜱宿主中的存活产生不利影响。

最值得注意的观察结果是，ECH_0660突变体的转录组与野生型查菲埃立克体相比表面上最小变化。重要的是，ECH_0660基因内的突变导致在脊椎动物宿主体内严重的生长缺陷。此外，用该突变体感染还引发强烈的宿主反应并赋予针对野生型病原体感染刺激的保护。在当前研究中，我们仅观察到该突变体与野生型相比微小的基因表达变化。基因表达的微小变化包括编码推定的氮调节蛋白、ABC转运蛋白、血红素输出蛋白和GroES的基因，但是这些变化与前两个突变体中描述的众多变化相比显著更少。总之，这些数据表明ECH_0660基因中的突变导致较少的转录改变。假设查菲埃立克体的野生型和突变株的蛋白组与转录组类似地变化，那么ECH_0660突变体蛋白组可能与野生型细菌非常相似。该突变体与野生型之间更高程度的相似性可能使得脊椎动物宿主能够将该突变体识别为更接近野生型生物体，从而诱导出更强的模仿野生型感染的宿主反应。对于该突变体早前报道的复制缺陷可能是由于丧失了较少基因(例如ECH_0659和ECH_0660)的基因表达，同时保持大多数转录组与野生型相似而导致的。

结论

细胞内细菌的RNA深度测序研究仍然是一个重大挑战。此处报道的RNAseq数据提供了对查菲埃立克体的比较转录组学的第一个快照。对从野生型和突变株中富集的细菌RNA测序产生了高的基因覆盖率。ECH_0379基因的ORF中的突变引发基因急剧下调，导致代谢抑制，这可能促使突变体在脊椎动物宿主中减弱。虽然ECH_0490基因的蛋白编码序列下游的突变引起基因表达的整体变化，但应激反应调节基因的上调可能有助于该突变体在脊椎动物宿主和蜱宿主中存活。ECH_0660基因编码序列内的突变导致很少的转录变化，因此保持其转录组与野生型相似的完整性。虽然转录组数据提示蛋白表达差异，但必须进行对蛋白分析研究的其他实验验证来证实这些结果。总之，本研究提供了对查菲埃立克体转录组数据的首次详细描述，表明观察到的病原体在宿主中存活的能力以及宿主诱导对病原体的保护能力的差异可能是基因表达整体变化的结果，这进而可能影响病原体蛋白组的变化。

Claims (36)

1.一种免疫原性组合物，包含：

其中具有靶向等位基因交换突变的立克次氏体(Rickettsiale)细菌或衣原体(Chlamydiale)细菌；和

选自由以下组成的组的组分：兽医学可接受的载体、药学可接受的载体、佐剂、防腐剂、缓冲剂、抗生素、细胞培养上清液、免疫调节剂及其任意组合。

2.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述立克次氏体细菌或衣原体细菌选自由埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、立克次氏体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)的物种组成的组。

3.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述埃立克体属细菌物种选自由查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、反刍埃立克体(Ehrlichia ruminatium)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)组成的组。

4.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述无形体属细菌选自由嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocytophilum)、血小板无形体(Anaplasma platys)和边缘无形体(Anaplasma marginale)组成的组。

5.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因突变使所述细菌减毒。

6.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变使基因失活。

7.权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述基因的功能为辅助复制。

8.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在查菲埃立克体的Ech_0379或Ech_0660或来自同一物种的其他菌株的同源基因中。

9.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在犬埃立克体的Ecaj_0381中或在来自同一物种的其他菌株的同源基因中。

10.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在嗜吞噬细胞无形体的APH_0634中或在来自同一物种的其他菌株的同源基因中。

11.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在其他相关查菲埃立克体菌株或其他相关的埃立克体属物种及其菌株的Ech_0660或其同源物中。

12.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组分是选自由以下组成的组的佐剂：皂苷、环状GMP-AMP、montanide凝胶或其任何组合。

13.权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含来自另一种引起疾病的生物体的抗原。

14.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述细菌包括与SEQ ID NO.35、54或55具有至少70％序列同一性的序列。

15.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在来自其他埃立克体属物种的查菲埃立克体Ech_0379或Ech_0660基因的同源物中。

16.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述靶向等位基因交换突变在来自其他无形体属物种的嗜吞噬细胞无形体APH_0634基因的同源物中。

17.一种降低由立克次氏体细菌或衣原体细菌引起的至少一种临床症状的发生率或严重性的方法，所述方法包括以下步骤：

施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含其中具有靶向等位基因交换突变的立克次氏体细菌或衣原体细菌，以及选自由以下组成的组的组分：兽医学可接受的载体、药物学可接受的载体、佐剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂、抗生素、细胞培养上清液、免疫调节剂及其任何组合。

18.权利要求17所述的方法，其中所述免疫原性组合物使用选自由以下组成的组的施用方式施用：静脉内、肌内、鼻内、皮内、气管内、阴道内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、口服、鞘内、通过直接注射到任何靶组织或其任意组合。

19.权利要求17所述的方法，其中所述施用之后伴随第二次施用。

20.权利要求19所述的方法，其中所述第二次施用是在第一次施用后至少7天或第一次施用后的任何时间。

21.权利要求17所述的方法，其中所述发生率的降低是至少10％并且是与未接受所述免疫原性组合物施用的一组动物相比而言的。

22.权利要求17所述的方法，其中，所述严重性的降低是与未接受所述免疫原性组合物的动物相比而言的。

23.权利要求17所述的方法，其中所述严重性的降低是与未接受所述免疫原性组合物施用的一组动物相比至少10％。

24.权利要求17所述的方法，其中所述立克次氏体细菌或衣原体细菌选自由埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、立克次氏体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)的物种组成的组。

25.权利要求24所述的方法，其中所述埃立克体属细菌选自由查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、反刍埃立克体(Ehrlichia ruminatium)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)组成的组。

26.权利要求24所述的方法，其中所述无形体属细菌选自由嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocytophilum)、血小板无形体(Anaplasma platys)和边缘无形体(Anaplasma marginale)组成的组。

27.权利要求17所述的方法，其中所述靶向等位基因交换突变使基因失活。

28.权利要求27所述的方法，其中灭活的基因参与复制。

29.权利要求17所述的方法，其中所述靶向等位基因交换突变在查菲埃立克体的Ech_0379或Ech_0660中，或在与Ech_0379或Ech_0660具有70％或更高同源性并且属于同一生物体的不同地理分离株和菌株或其他相关的埃立克体属的物种的基因同源物中。

30.权利要求17所述的方法，其中所述靶向等位基因交换突变在犬埃立克体的Ecaj_0381中或在与Ecaj_0381具有70％或更高同源性并且属于同一生物体的不同地理分离株和菌株或其他相关埃立克体属物种的基因同源物中。

31.权利要求17所述的方法，其中所述靶向等位基因交换突变在嗜吞噬细胞无形体的APH_0634中或在与APH_0634具有70％或更高同源性并且属于同一生物体的不同地理分离株和菌株或其他相关无形体属物种的基因同源物中。

32.权利要求17所述的方法，其中所述组分是选自由以下组成的组的佐剂：皂苷、环状GMP-AMP、montanide凝胶或其任何组合。

33.权利要求17所述的方法，其中所述细菌包括与SEQ ID NO.35、54或55具有至少70％序列同一性的序列。

34.权利要求17所述的方法，其中所述动物选自由猪、家牛、山羊、马、狗、鹿、狼、猫和家禽组成的组。

35.权利要求17所述的方法，其中所述动物在接受所述施用时的年龄在3周至6个月之间。

36.权利要求17所述的方法，其中所述靶向等位基因突变使来自任何相关物种以及相关菌株和基因分离株的Ech_0660或其同源物失活。

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