BR112019022325A2

BR112019022325A2 - Métodos de interrupção gênica alvejada e composições imunogênicas

Info

Publication number: BR112019022325A2
Application number: BR112019022325-8A
Authority: BR
Inventors: R. Ganta Roman; Wang Ying
Original assignee: Kansas State University Research Foundation
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2018-04-30
Publication date: 2020-05-26
Also published as: MX2019012667A; AU2018256922A1; US20200188498A1; KR20200003039A; JP2020517722A; US11541108B2; CA3060320A1; CN110913877A; EP3615049A4; EP3615049A1; WO2018201153A1

Abstract

interrupção alvejada de um gene específico e sua restauração subsequente em bactérias intracelulares obrigatórias permanece extremamente desafiadora devido à sua necessidade absoluta de residência dentro de uma célula hospedeira para se replicar. aqui, mutações de troca alélica alvejadas foram criadas para inativar dois genes e depois para restaurar um dos dois genes de um patógeno riquetsiano, ehrli-chia chaffeensis. estes métodos depois também foram utilizados com êxito em ehrlichia canis e anaplasma phagocyophilum. os patógenos mutados resultantes são úteis em composições imunogênicas para reduzir a incidência ou severidade de infecção com patógenos riquetsianos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE INTERRUPÇÃO GÊNICA ALVEJADA E COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS.

[0001] A invenção foi feita com suporte governamental sob a concessão N² AI070908, outorgada pelo NIH. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A interrupção da função genética específica e restauração subsequente de sua atividade em bactérias intracelulares obrigatórias permanece extremamente desafiadora devido à sua necessidade absoluta de residência dentro de uma célula hospedeira para se replicar. Aqui, criam-se mutações alvejadas por troca alélica em dois genes e complementam-se geneticamente um gene do patógeno riquetsiano Ehrlichia chaffeensis. Em princípio, esta abordagem pode ser aplicada a outras bactérias intracelulares obrigatórias e permitirá análises da função estrutural rotineiramente feitas em bactérias intracelulares. O método também é aplicável em gerar cepas atenuadas de bactérias intracelulares obrigatórias, que serão valiosas em servir como candidatos de vacina viva.

[0003] Bactérias intracelulares obrigatórias (daqui em diante obrigatórias) são responsáveis por causar doenças em milhões de pessoas portodo o mundo. Elas incluem muitos Gram-negativos patogênicos das ordens Rickettsiales e Chlamydiales. A carência de um sistema eficiente para mutagênese alvejada em Rickettsiales e Chlamydiales dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia, Neorickettssia, Orientia e Chlamydia permanece um principal impedimento em compreender a patogênese microbiana e em definir a significância funcional de muitos genes bacterianos. Chlamydiales e Rickettsiales passaram por reduções extremas de genoma onde a maioria dos genes para cada patógeno pode

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2/86 ser crítica para seu crescimento intracelular. Assim, bactérias intracelulares obrigatórias dependem de seus hospedeiros para preencher as deficiências resultantes das reduções de genoma. Compatíveis com esta hipótese, estudos anteriores demonstram que quase 74 a 92 % dos genes prognosticados em espécies de Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia, Neorickettsia e Chlamydia são transcricionalmente ativos durante a replicação bacteriana nas células hospedeiras de vertebrados e vetores. Desafios em criar mutações alvejadas podem ser atribuídos à natureza essencial de um gene selecionado para mutagênese, dependência de replicação intracelular e à carência de métodos para sustentar o crescimento extracelular. Apesar do sucesso em gerar mutações aleatórias usando mutagênese de transposon, gerar mutações alvejadas em genes específicos de interesse seguido por complementação é problemático e também é uma meta altamente procurada para obrigatórias. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] A presente descrição preenche esta principal lacuna fornecendo-se métodos para gerar pelo menos uma mutação alvejada estável por troca alélica em Rickettsiales e Chlamydiales. Vantajosamente, a descrição fornece ainda a capacidade de interromper ou inativar genes múltiplos e posteriormente, restaurar pelo menos um gene intacto por uma outra mutação de troca alélica, resultando na transcrição restaurada do gene inativado de seu próprio promotor. Em formas preferidas, os genes interrompidos ou inativados impedem ou pelo menos diminuem a capacidade das bactérias de se replicarem em seu hospedeiro obrigatório enquanto ainda induzindo uma resposta imune específica para as bactérias. Assim, a presente descrição fornece formas atenuadas das bactérias que serão úteis em composições imunogênicas que induzem respostas imunes que diminuem a incidência ou severidade de pelo menos um sinal clínico associado com ou causado por Rickettsiales e Chlamydiales quando administradas profilaticamente e

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3/86 diminuem a duração ou severidade de pelo menos um sinal clínico associado com ou causado por Rickettsiales e Chlamydiales quando administradas depois que a infecção já ocorreu.

[0005] Identidade de sequência como é conhecido na técnica refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo (poliaminoácido) ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, isto é, uma sequência de referência e uma sequência dada a ser comparada com a sequência de referência. Identidade de sequência é determinada comparando-se a sequência dada à sequência de referência depois que as sequências foram idealmente alinhadas para produzir o grau mais alto de similaridade de sequência, como determinado pela combinação entre as séries de tais sequências. Durante tal alinhamento, a identidade de sequência é apurada em uma base de posiçâo-por-posição, por exemplo, as sequências são idênticas em uma posição particular se nesta posição, os nucleotídeos ou resíduos de aminoácido são idênticos. O número total de tais identidades de posição é depois dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido na sequência de referência para fornecer % de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados, àqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genoma Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), os ensinamentos dos qual são incorporados aqui por referência. Métodos preferidos para determinar a identidade de sequência são designados para fornecer a

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4/86 maior combinação entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade de sequência são codificados em programas de computador publicamente disponíveis, que determinam a identidade de sequência entre as sequências dadas. Exemplos de tais programas incluem, mas não são limitados, ao pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403 - 410 (1990). O programa BLASTX está publicamente disponível da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403 - 410 (1990), os ensinamentos do qual são incorporado aqui por referência). Estes programas idealmente alinham as sequências usando pesos de intervalo padrão de modo a produzir o nível mais alto de identidade de sequência entre as sequências dadas e de referência. Como uma ilustração, por um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos, por exemplo, 85 %, preferivelmente 90 %, ainda mais preferivelmente 95 % de identidade de sequência a uma sequência de nucleotídeo de referência, é intencionado que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo dado seja idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotídeo dada pode incluir até 15, preferivelmente até 10, ainda mais preferivelmente até 5 mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 85 %, preferivelmente 90 %, ainda mais preferivelmente 95 % de identidade em relação à sequência de nucleotídeo de referência, até 15 %, preferivelmente 10 %, ainda mais preferivelmente 5 % dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser suprimidos ou substituídos com um outro nucleotídeo ou vários nucleotídeos até 15 %, preferivelmente 10 %, ainda mais preferivelmente 5 % dos nucleotí

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5/86 deos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intersperses individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Analogamente, por um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido dada tendo pelo menos, por exemplo, 85 %, preferivelmente 90 %, ainda mais preferivelmente 95 % de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido de referência, é intencionado que a sequência de aminoácido dada do polipeptídeo seja idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polipeptídeo dada pode incluir até 15, preferivelmente até 10, ainda mais preferivelmente até 5 alterações de aminoácido por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de referência. Em outras palavras, para obter uma sequência de polipeptídeo dada tendo pelo menos 85 %, preferivelmente 90 %, ainda mais preferivelmente 95 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de referência, até 15 %, preferivelmente até 10 %, ainda mais preferivelmente até 5 % dos resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser suprimidos ou substituídos com um outro aminoácido ou vários aminoácidos até 15 %, preferivelmente até 10 %, ainda mais preferivelmente até 5 % do número total de resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino ou carbóxi da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intersperses individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em o um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Preferivelmente, posições de resíduos que não são

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6/86 idênticas diferem por substituições de aminoácido conservativas. Entretanto, substituições conservativas não são incluídas como uma combinação quando da determinação da identidade de sequência.

[0006] Homologia de sequência, como usado aqui, refere-se a um método de determinar a relação de duas sequências. Para determinar a homologia de sequência, duas ou mais sequências são idealmente alinhadas e intervalos sâo introduzidos se necessário. Entretanto, ao contrário da identidade de sequência, substituições de aminoácido conservativas são contadas como uma combinação quando da determinação da homologia de sequência. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo ou polinucleotídeo tendo 95 % de homologia de sequência com uma sequência de referência, 85 %, preferivelmente 90 %, ainda mais preferivelmente 95 % dos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos na sequência de referência devem combinar ou compreender uma substituição conservativa com um outro aminoácido ou nucleotídeo ou vários aminoácidos ou nucleotídeos até 15 %, preferivelmente até 10 %, ainda mais preferivelmente até 5 % dos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos totais, não incluindo substituições conservativas, na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Preferivelmente a sequência homóloga compreende pelo menos um estiramento de 50, ainda mais preferivelmente pelo menos 100, ainda mais preferivelmente pelo menos 250 e ainda mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos.

[0007] Uma substituição conservativa refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido ou nucleotídeo com um outro resíduo de aminoácido ou nucleotídeo tendo características ou propriedades similares incluindo tamanho, hidrofobicidade, etc., tal que a funcionalidade global não muda significativamente.

[0008] Aqueles de habilidade na técnica compreenderão que a composição imunogênica usada aqui pode incorporar conhecidas soluções

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7/86 estéreis injetáveis, fisiologicamente aceitáveis para preparar uma solução pronta para o uso para injeção ou infusão parenteral, soluções isotônicas aquosas, tais como por exemplo, solução salina ou soluções de proteína plasmática correspondentes, estão prontamente disponíveis. Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da presente descrição podem incluir diluentes, agentes isotônicos, estabilizadores ou adjuvantes. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Estabilizadores incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilendiamintetracético, entre outros.

[0009] Em um aspecto, a composição imunogênica também pode compreender elementos adicionais, antígenos, veículos farmaceuticamente aceitáveis, veículos veterinariamente aceitáveis, adjuvantes, conservantes, estabilizadores ou combinações destes.

[0010] Adjuvantes como usado aqui, podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, Quil A, GMP-AMP cíclico, gel de montanide, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão águaem-óleo, emulsão óleo-em-água, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser fundamentada em particular em óleo de parafina líquida leve (do tipo Farmacopeia Européia); óleo de isoprenoide tal como óleo de esqualano ou esqualeno resultante da oligomerização de alcenos, em particular de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente óleos vegetais, oleato de etila, di-(caprilato/caprato) de propileno glicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos ou álcoois graxos ramificados, em particular ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsionantes para formar a emulsão. Os emulsionantes sâo preferivelmente tensoativos

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8/86 não iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, que são opcionalmente etoxilados e blocos de copolímero de polioxipropilenopolioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter etal., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51 - 94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564 - 570 (1997). Por exemplo, é possível usar a emulsão de SPT descrita na página 147 of Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach editado por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995 e a emulsão MF59 descrita na página 183 deste mesmo bloco. Um outro exemplo de um adjuvante é um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metracrílico e dos copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os polímeros de ácido acrílico ou metracrílico que são reticulados, especialmente com éteres polialquenílicos de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, N^Q 2, junho de 1996). Pessoas habilitadas na técnica também podem referir-se à Patente dos EUA N² 2.909.462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outro grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem, por si só, conter outros substituintes, tais como metila. Outros adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados, ao sistema adjuvante de RIBI (Ribi Inc.), copolímero de bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), lipídeo A de monofosforila, adjuvante de Avridina lipídeo

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9/86 amina, enterotoxina termicamente lábil de E. coli (recombinante ou diferente), toxina da cólera, IMS 1314 ou dipeptideo de muramila entre muitos outros.

[0011] Preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. Ainda mais preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. O mais preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.

[0012] Adicionalmente, a composição pode incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis ou veterinariamente aceitáveis. Como usado aqui, um veículo farmaceuticamente aceitável ou um veículo veterinariamente aceitável inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retardadores de adsorção e semelhantes.

[0013] O veículo farmaceuticamente aceitável é entendido como designando um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica ou vacina que não provoca reações secundárias e que permite, por exemplo, a facilitação da administração do composto ativo, um aumento em sua duração e/ou sua eficácia no corpo, um aumento em sua solubilidade em solução ou alternativamente uma melhoria em sua conservação. Estes veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pela pessoa habilitada na técnica como uma função da natureza e do modo de administração do composto ativo escolhido.

[0014] Por exemplo, a composição imunogênica ou vacina de

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10/86 acordo com a presente descrição pode ser administrada uma vez ou várias vezes, difundida com o passar do tempo em uma quantidade de cerca de 0,1 a 1000 pg por quilograma de peso do animai ou ser humano, onde valores e faixas tais como, mas não limitados a, 0,5 a 800 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 1000 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 500 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 300 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 200 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 150 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 125 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 1 a 100 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 5 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 10 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 15 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 20 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 25 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 30 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 35 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 40 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 45 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 50 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 55 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 60 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 65 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 70 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 75 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 80 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 85 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 90 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 95 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 100 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 125 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 150 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 200 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 250 pg por quilograma de

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11/86 peso do animal ou ser humano, 300 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 400 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 500 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 600 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 700 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 800 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano, 900 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano e 1000 pg por quilograma de peso do animal ou ser humano são previstos. Em outras formas preferidas, as quantidades acima também são fornecidas sem referência ao peso do animal ou ser humano.

[0015] De acordo com a presente descrição, a composição imunogênica ou vacina pode incluir pelo menos um outro patógeno exceto E. chaffeensis, tornando-a uma vacina de combinação ou composição imunogênica. Em uma tal modalidade, uma quantidade eficaz de uma vacina ou composição imunogênica administrada fornece proteção eficaz incluindo uma redução na severidade ou incidência de sinais clínicos de infecção até e incluindo imunidade contra infecções causadas por bactérias Rickettsiale ou Chlamydiale e pelo menos um outro organismo causador de doença. O outro patógeno é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em: Actinobacillus pleuropneumonia; Adenovirus; Alfavírus tal como vírus da encefaiomielite equina oriental; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferivelmente B. hyodyentheríae; B. piosicoli, Brucella suis, preferivelmente biovars 1, 2 e 3; Vírus da febre suína clássico; Clostridium spp., preferivelmente Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl. novyi, Cl.septicum, Cl. tetani; Coronavirus, preferivelmente Coronavirus respiratório porcino; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coll; Haemophilus parasuis, preferivelmente os subtipos 1, 7 e 14: Vírus da encefaiomielite hemaglutinante; Vírus da encefalite japonesa; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp.; preferivelmente Leptospira australis; Leptospira canicola;

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Leptospira grippotyphosa] Leptospira icterohaemorrhagicae] e Leptospira interrogans] Leptospira pomona] Leptospira tarassovi] Mycobacterium spp. preferivelmente M. avium] M. intracellulare] e M.bovis] Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo); Pasteurella multocida] Citomegalovirus porcino; Parvovirus porcino; Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS); Circovirus porcino, Virus Pseudorabies; Rotavirus; Salmonella spp.; preferivelmente S. thyhimuriurrr, e S. choleraesuis] Staph, hyicus] Staphylococcus spp., Streptococcus spp., preferivelmente Strep, suis] Virus da herpes suína; Virus da gripe suína; Virus da varíola suína; Virus da estomatite vesicular; Virus do exantema vesicular de suino; Leptospira Hardjo] Mycoplasma hyosynoviae] Poliovirus; Rinovirus; virus da hepatite A; vírus da febre aftosa (FMDV); doença vesicular suína (SVDV) e combinações destes.

[0016] As composições imunogênicas podem incluir ainda um ou mais agentes imunomoduladores adicionais tais como, por exemplo, interleucinas, interferons ou outras citocinas.

[0017] As composições imunogênicas também podem incluir Gentamicina e Mertiolate.

[0018] Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção possam ser facilmente determinados pelo técnico habilitado, a presente invenção considera composições compreendendo de cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante. Assim, a composição imunogênica como usada aqui também refere-se a uma composição que compreende de cerca de 1 ug/ml a cerca de 60 pg/ml de antibióticos ou agentes imunomoduladores e mais preferivelmente menos do que cerca de 30 pg/ml de antibióticos ou agentes imunomoduladores.

[0019] De acordo com um outro aspecto, pelo menos uma outra administração de pelo menos uma dose da composição imunogênica como descrito acima é dada a um sujeito em necessidade desta, em

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13/86 que a segunda administração ou qualquer outra é dada pelo menos 7 dias além das administrações iniciais ou quaisquer administrações prévias. Preferivelmente, a composição imunogênica é administrada com um imunoestimulante. Preferivelmente, o dito imunoestimulante é dado pelo menos duas vezes. Preferivelmente, pelo menos 3 dias, mais preferivelmente pelo menos 5 dias, ainda mais preferivelmente pelo menos 7 dias estão entre a primeira e a segunda administração ou qualquer outra do imunoestimulante. Preferivelmente, o imunoestimulante é dado pelo menos 10 dias, preferivelmente 15 dias, ainda mais preferivelmente 20, ainda mais preferivelmente pelo menos 22 dias além da administração inicial da composição imunogênica fornecida aqui. Um imunoestimulante preferido é, por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), preferivelmente emulsionado com adjuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA). Entretanto, com isto, é entendido, que qualquer outro imunoestimulante conhecido a uma pessoa habilitada na técnica também possa ser usado. O termo imunoestimulante como usado aqui, significa qualquer agente ou composição que possa desencadear a resposta imune, preferivelmente sem iniciar ou aumentar uma resposta imune específica, por exemplo a resposta imune contra um patógeno específico. É instruído ainda administrar o imunoestimulante em uma dose adequada.

[0020] Em outro aspecto, a presente descrição fornece métodos para gerar pelo menos uma mutação alvejada estável por troca alélica para os gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Neoríckettsia, Rickettsia, Orientia e Chiamydia.

[0021] Ainda em um outro aspecto da presente descrição, Rickettsiales e Chlamydiales mutados usando os métodos divulgados são úteis em composições imunogênicas contra patógenos de Rickettsiale e Chlamydiale. Em formas preferidas, tais composições imunogênicas são eficazes em reduzir a incidência ou severidade de pelo menos um

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14/86 sinal clínico de infecção causado por ou associado com infecção por patógenos de Rickettsiale e Chlamydiale. Em algumas formas preferidas, tais composições são administradas profilaticamente tal que os sinais clínicos são reduzidos em incidência e/ou severidade. Em formas particularmente preferidas, os sinais clínicos são impedidos em animais que recebem tais composições antes de serem infectados ou inoculados com patógenos de Rickettsiale e/ou Chlamydiale. Em outras formas, tais composições são administradas depois que a infecção por patógenos de Rickettsiale e/ou Chlamydiale já ocorreu. Em tais situações, os sinais clínicos associados com ou causados pelas infecções são reduzidos em incidência, severidade e/ou longevidade.

[0022] Em um outro aspecto, a mutação alvejada estável interrompe a função de pelo menos um gene.

[0023] Ainda em um outro aspecto, a função de um gene que foi interrompido pode ser restaurada.

[0024] Em um aspecto da presente descrição, mutações alvejadas estáveis foram feitas em E. chaffeensis onde dois genes foram interrompidos e subsequentemente tiveram função restaurada de um gene. Estes mesmos métodos também foram usados com êxito em espécies de Ehrlichia incluindo Ehrlichia canis (E. canis) e espécies de Anaplasma incluindo Anaplasma phagocyophiium (A. phagocyophila).

[0025] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método de interrupção gênica alvejada ou mutação em espécies de Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia, Neorickettsia, Orientia e/ou Chlamydia para gerar organismos atenuados das bactérias, que serão valiosos em induzir respostas imunes do hospedeiro eficazes para conferir proteção contra as doenças virulentas causadas por estas mesmas espécies.

[0026] Ainda em um outro aspecto, um método para evocar uma resposta imune em um ser humano ou animal é fornecido, onde as etapas incluem administração de uma composição imunogênica ou vacina

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15/86 divulgada aqui a um animal ou ser humano em necessidade deste. Adicionalmente, um método para reduzir a incidência e/ou severidade de pelo menos um ou mais sinais clínicos associados com ou causados por infecção por um patógeno dos gêneros Ehrlichia, Anapiasma, Neorickettsia, Rickettsia, Orientia e/ou Chlamydia é fornecido. Em algumas formas, a infecção é causada por ou associada com E. chaffeensis, E. canis, A. marginale, A. platys e/ou A. phagocyophilum e a composição imunogêníca ou vacina compreende pelo menos uma destas espécies em que a interrupção gênica alvejada ou mutação é realizada em uma tal espécie. Um tal método geralmente compreende a etapa de administrar a composição imunogênica a um animal em necessidade deste para evocar uma resposta imune contra infecção e exibição subsequente de sinais clínicos em animais infectados ou inoculados por uma espécie dos gêneros Ehrlichia, Anapiasma, Neorickettsia, Rickettsia, Orientia e Chlamydia depois da administração da composição imunogênica. Em algumas formas, a composição imunogênica inclui uma espécie viva modificada de Ehrlichia, Anapiasma, Neorickettsia, Rickettsia, Orientia ou Chlamydia.

[0027] Em um aspecto, a composição imunogêníca inclui E. chaffeensis, E. canis, A. phagocyophilum ou A. marginale que sofreram a mutagênese alvejada descrita aqui. Quando E. chaffeensis é a espécie mutada, a composição imunogênica preferivelmente inclui uma bactéria de E. chaffeensis atenuada que inclui uma mutação que inativa as bactérias e interfere com sua capacidade de se replicar. Em algumas formas preferidas, a mutação é uma inserção ou deleção. Em algumas formas, a inserção ou supressão em qualquer lugar dentro de um gene selecionado do grupo consistindo em gene Ech_0379 ou Ech_0660, resultante na inativação da função gênica. Em algumas formas, o genoma da E. chaffeensis inclui uma sequência tendo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo

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16/86 menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de identidade de sequência para Ech___0660 (SEQ ID No. 35). Preferivelmente a comparação de sequência é em comparação a uma versão não mutada da mesma região do genoma de E. chaffeensis. Quando E. canis é a espécie mutada, a composição imunogênica preferivelmente inclui uma bactéria de E. canis atenuada que inclui uma mutação que inativa o gene bacteriano e interfere com sua capacidade de se replicar. Em algumas formas preferidas, a mutação é uma inserção ou supressão. Em algumas formas, a inserção ou supressão é no gene Eca£p381 em qualquer lugar dentro do gene resultante da inativação da função gênica. Em algumas formas, o genoma da E. canis inclui uma sequência tendo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID No. 54. Preferivelmente a comparação de sequência é em comparação a uma versão não mutada da mesma região do genoma de E. canis. Quando A. phagocytophiium é a espécie mutada, a composição imunogênica preferivelmente inclui uma bactéria de A. phagocytophiium atenuada que inclui uma mutação que inativa as bactérias e interfere com sua capacidade de se replicar. Em algumas formas preferidas, a mutação é uma inserção ou supressão. Em algumas formas, a inserção ou supressão é no gene APHJ3634 em qualquer lugar dentro do gene resultante na inativação da função gênica. Em algumas formas, o genoma do gene APHJ3634 de A. phagocytophiium inclui uma sequência tendo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID No. 55. Preferivelmente, a comparação de sequência é em comparação a uma versão não mutada da mesma região do genoma de A. phagocytophiium.

[0028] A composição imunogênica ou vacina e métodos fornecidos

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17/86 nesta descrição não são limitados a E. chaffeensis, E. canis ou A. phygocytophilum, mas também podem incluir qualquer membro das ordens Rickettsiales ou Chlamydiales, incluindo mas não limitados às famílias de Pelaglbacterales, Pelagibacteraceae (incluindo os subgrupos Ib, II, Illa, lllb, IV e V), Pelagibacter, Proro-mitochondira, Anaplasmataceae, espécies dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Wolbachia, Neorickettsia', espécies de Midichloriaceae, Midlchloria, Rickettsiaceae e Rickettsia. Além disso, a composição imunogênica ou vacina também pode incluir, mas não é limitada a, E. ruminantium, E. canis, A. marginate, A. platys, E. muris e combinações destas.

[0029] Em um outro aspecto da presente descrição, a composição imunogênica compreende um homólogo do gene ECH_0660 de E. chaffeensis que foi mutado usando os métodos fornecidos aqui. Em formas preferidas, o homólogo é selecionado do grupo consistindo nos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia, Neorickettsia, Orientia e Chlamydia. Em outras formas preferidas, o gene homólogo é EcajJ3381 de E. canis, preferivelmente tendo pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % e mais preferivelmente pelo menos 92 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 94 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de homologia de sequência com GenBank# CP000107.1. Em outras formas preferidas, o gene homólogo é ErumJ3930 de E. ruminatium, preferivelmente tendo pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % e mais preferivelmente pelo menos 92 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 94 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de homologia de sequência com GenBank# CR767821.1. Em outras formas preferidas, o gene homólogo é APHJ3634 de Anaplasma phagocytophilum, preferivelmente tendo pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % e mais preferivelmente pelo menos 92 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 94 %, ainda mais

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18/86 preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de homologia de sequência com GenBank # CP000235.1. Em outras formas preferidas, o gene homólogo é AMHJ581 de Anapiasma marginale, preferivelmente tendo pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % e mais preferivelmente pelo menos 92 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 94 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de homologia de sequência com GenBank# CP000030.1. Em outras formas preferidas, o gene homólogo é EMURJ32070 de AS145 de Ehrlichia muris, preferivelmente tendo pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % e mais preferivelmente pelo menos 92 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 94 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou ainda 100 % de homologia de sequência com GenBank # CP006917.1.

[0030] A composição imunogênica de acordo com a descrição pode ser administrada intravenosamente, intramuscularmente, intranasalmente, intradermicamente, intratraqualmente, intravaginalmente, intravenosamente, intravascularmente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, oralmente, intratecaimente ou por injeção direta em qualquer tecido alvo. Dependendo da duração e efetividade desejada do tratamento, as composições imunogênicas de acordo com a descrição podem ser administradas uma vez ou várias vezes, também intermitentemente, por exemplo, em uma base diária por vários dias, semanas ou meses e em dosagens diferentes.

[0031] Em um outro aspecto, a composição imunogênica da presente descrição é administrada a um animal em necessidade desta pelo menos de duas semanas de idade. Mais preferivelmente, o animal está entre 2 semanas e 1 ano de idade, ainda mais preferivelmente entre 3 semanas e 6 meses de idade. Certamente, outras idades e faixas são consideradas tais como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 semanas ou mais. Alternativamente, a composição imunogênica

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19/86 é administrada pelo menos 2 semanas antes da exposição a uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale.

[0032] Em algumas formas, a composição imunogênica é administrada depois da infecção pelas bactérias de Rickettsiale ou Chlamydiale. Em tais situações, a administração reduz a duração ou severidade dos sinais clínicos associados com ou causados pela infecção.

[0033] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece uma composição imunogênica compreendendo uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale tendo uma mutação de troca alélica alvejada nesta e um componente selecionado do grupo consistindo em um veículo veterinariamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável, um adjuvants, um conservante, um tampão, um antibiótico, sobrenadante de cultura celular, um agente imunomodulador e qualquer combinação destes. Em algumas formas, a composição imunogênica das bactérias de Rickettsiale ou Chlamydiale é selecionada do grupo consistindo em espécies de Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia, Rickettsia, Oríentia e Chlamydia. Em algumas formas, as bactérias da espécie de Ehrlichia são selecionadas do grupo consistindo em Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia canis, Ehrlichia ruminatium, Ehrlichia muris e agente semelhante a Ehrlichia muris. Em algumas formas, as espécies de bactérias de Anaplasma são selecionadas do grupo consistindo em Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys e Anaplasma marginale. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada inativa um gene. Em algumas formas, a inativação resulta de uma Inserção ou supressão. Em algumas formas, a inativação resulta em uma capacidade diminuída das bactérias de se replicar. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada está em Ech_0230, Ech_0379 ou Ech_0660 em Ehrlichia chaffeensis. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada está em Ecaj_0381 em Ehrlichia canis. Em algumas formas, a mutação de

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20/86 troca alélica alvejada está em APHJ3634 em Anapiasma phagocytophílum.

[0034] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método de reduzir a incidência de ou severidade de pelo menos um sinal clínico causado por uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale compreendendo a etapa de administrar uma composição imunogênica compreendendo uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale tendo uma mutação de troca alélica alvejada nesta e um componente selecionado do grupo consistindo em um veículo veterinariamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, um conservante, um tampão, um antibiótico, sobrenadante de cultura celular, um agente imunomodulador. Em algumas formas, a etapa de administração é selecionada do grupo consistindo em intramuscularmente, intranasalmente, intradermicamente, intratraquealmente, intravaginalmente, intravenosamente, intravascularmente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, oralmente, intraquealmente ou por injeção direta em tecidos-alvo. Em algumas formas, a administração da composição imunogênica pode ser denominada uma primeira administração e esta primeira administração é seguida por uma segunda administração. Em algumas formas, a segunda administração é pelo menos 7 dias depois da primeira administração. Em formas preferidas, a redução na incidência está em um grupo de animais que receberam uma administração da composição imunogênica e pelo menos 10 % é em comparação a um grupo de animais que não receberam uma administração da composição imunogênica. Em formas preferidas, a redução em severidade é avaliada em um único animal que recebeu uma administração da composição imunogênica e é em comparação a um animal que não recebeu a composição imunogênica. Em formas preferidas, esta redução em severidade é pelo menos 10 % quando comparando um animal que recebeu a composição com um animal que não recebeu a composição imunogênica e que foi

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21/86 subsequentemente infectado ou inocuiado por uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale. Em algumas formas, a redução em severidade em um grupo de animais que receberam a composição imunogênica é pelo menos 10 % em comparação a um grupo de animais que não receberam uma administração da composição imunogênica. Em algumas formas, as bactérias de Rickettsiale ou Chlamydiale são selecionadas do grupo consistindo em Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia, Neorickettsia, Orientia e Chlamydia. Em algumas formas, as bactérias de Ehrlicia são selecionadas do grupo consistindo em Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ruminatium, Ehrlichia muris e Ehrlichia canis. Em algumas formas, as bactérias de Anaplasma são selecionadas do grupo consistindo em Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys e Anaplasma marginale. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada inativa um gene. Em algumas formas, a inativação resulta de uma inserção ou supressão. Em algumas formas, a inativação resulta em uma capacidade diminuída das bactérias de se replicarem. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada está em Ech_0230, Ech_0379 ou Echj0660 em Ehrlichia chaffeensis. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada está em Ecaj_0381 em Ehrilichia canis. Em algumas formas, a mutação de troca alélica alvejada está em APH_0634 em Anaplasma phagocytophilum. Em algumas formas, o componente é um adjuvante selecionado do grupo consistindo em uma saponina, GMP-AMP cíclico, gel de montanide ou qualquer combinação destes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] A Figura 1 é uma ilustração que esboça a representação esquemática das estratégias utilizadas para criar mutações de troca alélica alvejadas em E. chaffeensis para inativar genes Ech_0230 e Ech___0379 e para restaurar a função de inativação gênica de Ech_0379, em que A e A’ referem-se aos braços de homologia 5’ e 3’.

[0036] A Figura 2A é uma representação esquemática de um mapa

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22/86 de plasmideo de pHR-Ech_0230-tí#-aadA com uma identificação dos braços de homologia. Os dados de sequência de plasmideo para a construção foram depositados no GenBank (acesso # MF068805).

[0037] A Figura 2B é uma representação esquemática de um mapa de plasmideo de pHR-Echj3379-tuf-aadA com uma identificação dos braços de homologia. Os dados de sequência de plasmideo para toda a construção foram depositados no GenBank (acesso # MF068806).

[0038] A Figura 2C é uma representação esquemática de um mapa de plasmideo com uma identificação dos braços de homologia. Os dados de sequência de plasmideo para a construção foram depositados no GenBank (acesso # MF068807).

[0039] A Figura 3A ilustra mutagênese de troca alélica alvejada para interromper o gene Ech_0230 com a Figura 3A descrevendo o segmento genômico transpondo a região selecionada para preparar uma construção de troca alélica, incluindo os sítios de enzima de restrição (EcoRI (E) e Clal (C)) usados para o mapeamento da inserção. Coordenadas genômicas para sítios de enzima de restrição e o tamanho do fragmento inserido (ft/f-aadA) foram incluídas para permitir a determinação dos tamanhos de DNA esperados em análise de PCR e Southern blot.

[0040] A Figura 3B é uma fotografia mostrando amplicons resolvidos a seguir de três PCRs diferentes usando iniciadores alvejando às regiões genômicas a montante e a jusante da inserção alélica (iniciadores identificados como 1 e 4) e do DNA inserido (iniciadores; 2 e 3). (L, 1 kb mais marcadores de DNA de peso molecular; Tipo selvagem (W), PCR com DNA genômico do tipo selvagem como o padrão; Mutante (M), PCR com DNA genômico mutante como o padrão).

[0041] A Figura 3C é uma ilustração mostrando verificação de Sequência de DNA de PCR de sítios de inserção no mutante alvejado. No painel de topo, a sequência de DNA gerada dos amplicons mostrados

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23/86 acima e à esquerda da seta preta representa a sequência de genoma de E. chaffeensis, enquanto a sequência acima e à direita da seta preta representa a sequência inserida no mutante de interrupção gênica. No painel de fundo, a sequência de DNA gerada de amplicons mostrados acima e à direita da seta preta representa a sequência de genoma de E. chaffeensis, enquanto a sequência acima e à esquerda da seta preta representa a sequência inserida no mutante de interrupção gênica. Limites de sequências nas junções de inserção 5’ e 3’ foram identificados com uma linha de seta preta pequena. Adicionalmente neste painel de topo, a sequência no topo é a SEQ ID NO. 42 e a sequência no fundo é a SEQ ID NO. 48. No painel de fundo, a sequência de topo é a SEQ ID NO. 43 e a sequência de fundo é a SEQ ID NO. 49.

[0042] A Figura 3D é uma fotografia de uma análise de Southern blot de DNAs genômicos (W e M) digeridos com Clal (C) ou EcoRI (E). A análise de mancha foi realizada com o segmento de gene aadA como a sonda.

[0043] A Figura 4 ilustra mutagênese de troca alélica alvejada para interromper o gene EchJ3379 com a Figura 4A descrevendo o segmento genômico transpondo a região selecionada para preparar uma construção de troca alélica, incluindo os sítios de enzima de restrição (Clal (C) e Hindlll (H)) usados para o mapeamento da inserção. Coordenadas genômicas para sítios de enzima de restrição e o tamanho de fragmento inserido (tof-aadA) foram incluídas para permitir a determinação dos tamanhos de DNA esperados em análise de PCR e Southern blot.

[0044] A Figura 4B é uma fotografia mostrando amplicons resolvidos a seguir de três PCRs diferentes usando iniciadores alvejando às regiões genômicas a montante e a jusante da inserção alélica (iniciadores identificados como 1 e 4) e do DNA inserido (iniciadores; 2 e 3). (L, 1 kb mais marcadores de DNA de peso molecular; Tipo selvagem (W),

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PCR com DNA genômico do tipo selvagem como o padrão; Mutante (Μ), PGR com DNA genômico mutante como o padrão).

[0045] A Figura 40 é uma ilustração mostrando a verificação de Sequência de DNA de PCR de sítios de inserção no mutante alvejado. No painel de topo, a sequência de DNA gerada de amplicons mostrados acima e à esquerda da seta preta representa a sequência de genoma de E. chaffeensis, enquanto a sequência acima e à direita da seta preta representa a sequência inserida no mutante de interrupção gênica. No painel de fundo, a sequência de DNA gerada de amplicons mostrados acima e à direita da seta preta representa a sequência de genoma de E. chaffeensis, enquanto a sequência acima e à esquerda da seta preta representa a sequência inserida no mutante de interrupção gênica. Limites de sequências nas junções de inserção 5’ e 3’ foram identificados com uma linha de seta preta pequena. Adicionalmente neste painel de topo, a sequência no topo é a SEQ ID NO. 44 e a sequência no fundo é a SEQ ID NO. 50. No painel de fundo, a sequência de topo é a SEQ ID NO. 45 e a sequência de fundo é a SEQ ID NO. 51.

[0046] A Figura 4D é uma fotografia de uma análise de Southern blot de DNAs genômicos (W e M) digeridos com Clal (C) e Hindi 11 (H). A análise de mancha foi realizada com o segmento de gene aadA como a sonda.

[0047] A Figura 5A ilustra a mutagênese de troca alélica alvejada para restaurar o gene EchJD379 similar à Figura 3 exceto que a ilustração descrevendo o segmento genômico na porção de topo do painel representa o genoma de mutante de Ech_0379.

[0048] A Figura 5B ilustra a cultura mutante de restauração de gene Ech_0379 que expressa mCherry. Os organismos mutantes restaurados cultivados em células ISE6 foram avaliados quanto à expressão de mCherry por microscópio confocal usando lente de ampliação de 40 X em que a expressão de mCherry foi exibida na seta.

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[0049] A Figura 50 é uma fotografia mostrando amplicons resolvidos a seguir de três PCRs diferentes usando íniciadores alvejando às regiões genômicas a montante e a jusante da inserção alélica (iniciadores identificados como 1 e 4) e do DNA inserido (Íniciadores; 2 e 3). (L, 1 kb mais marcadores de DNA de peso molecular; Tipo selvagem (W), PCR com DNA genômico do tipo selvagem como o padrão; Mutante (M), PCR com DNA genômico mutante como o padrão.

[0050] A Figura 5D é uma fotografia mostrando a mutagênese de troca alélica alvejada para restaurar o gene EchJ3379. Esta figura é similar à Figura 3C exceto que a enzima de restrição e a sonda usadas para o experimento de Southern blot (mostrado na Figura 5E) foram Cia I e um segmento de DNA representando o gene Ech_0379, respectivamente. Adicionalmente no painel de topo da Figura 5D, a sequência no topo é a SEQ ID NO. 46 e a sequência no fundo é a SEQ ID NO. 52. No painel de fundo, a sequência de topo é a SEQ ID NO. 47 e a sequência de fundo é a SEQ ID NO. 53.

[0051] A Figura 5E é uma fotografia de uma análise de Southern blot de DNAs genômicos (W e M) digeridos com Ciai (C) ou EcoRI (E). A análise de mancha foi realizada com segmento de gene aadA conforme a sonda ilustra. As faixas Mi e M2 representam os dados de DNA genômico recuperados da cultura mutante de EchJ3379 de E. chaffeensis recuperada da cultura de DH82 e ISE6, respectivamente. Similarmente, R1 e R2 representam dados do DNA genômico recuperado da cultura mutante reversa de Ech_0379 de E. chaffeensis recuperada da cultura de DH82 e ISE6, respectivamente.

[0052] A Figura 6A ilustra a análise transcricional de RNA recuperado de organismos de E. chaffeensis do tipo selvagem e mutantes de troca alélica avaliados por RT-PCR. Produtos de RT-PCR dos organismos do tipo selvagem (W) e mutantes de Ech_0230 (M) foram resolvidos (L, 1 kb mais marcadores de DNA de peso molecular resolvidos; +,

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DNA genômico de E. chaffeensis do tipo selvagem foi usado como o padrão; -, reação de controle negativo sem nenhum padrão adicionado). [0053] A Figura 6B é similar à Figura 6A, exceto que a análise foi realizada usando RNA recuperado de organismos mutantes de interrupção de Ech___0379 (M) e restauração (R). Controles positivos para estes experimentos incluiram DNAs genômicos como os padrões de W, M e R. (amplicons de 0,38 kb são esperados para padrões de DNA em PCRs de W e R e 1,6 kb de produto é esperado para M DNA como o padrão. [0054] A Figura 6C ilustra a análise transcricional de RNA recuperado de organismos de E. chaffeensis mutantes do tipo selvagem e troca alélica avaliada por RT-PCR. Mutações para inativar e restaurar a atividade do gene em Ech_0379 não alteraram a expressão de gene de seus genes vizinhos. Ensaios de RT-PCR semi-quantitativos foram realizados em 30, 35 e 40 ciclos de PCR para Ech_0378, EchJD379 e Ech_0380 para organismos mutantes do tipo selvagem, de inativação gênica e de resgate gênico e os dados para 35 ciclos foram apresentados. W, M e R tiveram quantidades similares de amplicons para Ech_0378 e Ech_0380; amplicons de Ech_0379 também foram similares para W e R, enquanto ausentes para M.

[0055] A Figura 7 ilustra a caracterização fenotipica de gene Ech_0379 em cepa EP432 de E. coii deficiente de antiporter. A análise de RT-PCR alvejando para transcritos de Ech_0379 em EP432 foi realizada Caracterização fenotipica de gene Echj3379 em cepa EP432 de E. coii deficiente de anti porter.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0056] A presente descrição leva em consideração um método de fornecer bactérias imunogênicas, estáveis capazes de produzir uma resposta imunogênica em um hospedeiro. O método preferivelmente compreende as etapas de uma interrupção alvejada no genoma da cepa bacteriana e depois realização de uma troca alélica.

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[0057] A presente descrição leva em consideração uma composição imunogênica ou vacina que compreende a administração das bactérias imunogênicas divulgadas aqui. As bactérias imunogênicas para o uso na composição imunogênica ou vacina podem ser mortas, modificadas mortas, modificadas vivas, uma proteína recombinante, uma proteína e combinações destas. Em formas preferidas, as bactérias imunogênicas modificadas vivas são atenuadas.

[0058] Um método para prevenir ou tratar pelo menos um de riquetsiose, erliquiose, febre maculosa das montanhas rochosas, erliquiose monocítica humana, anaplasmose granulocítica e/ou anaplasmose é fornecido. As etapas do método geralmente incluem a administração da composição imunogênica ou vacina divulgada aqui a um ser humano ou animal em necessidade deste.

[0059] Um método para reduzir a incidência ou severidade de sintomas clínicos associados com pelo menos um de riquetsiose, erliquiose, febre maculosa das montanhas rochosas, erliquiose monocítica humana, anaplasmose granulocítica e/ou anaplasmose é fornecido, onde as etapas geralmente incluem a administração da composição imunogênica ou vacina divulgada aqui a um ser humano ou animal em necessidade deste. Os sintomas clínicos geralmente incluem, mas não são limitados a, febre, dor de cabeça, calafrios, mal-estar, dor muscular, dor abdominal, náusea, vômito, diarréia, confusão, injeção conjuntival (olhos vermelhos), erupção e combinações destes. Preferivelmente os sintomas clínicos associados com pelo menos um de riquetsiose, erll· quiose, febre maculosa das montanhas rochosas, erliquiose monocítica humana, anaplasmose granulocítica e/ou anaplasmose são reduzidos em frequência e/ou severidade em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou reduzidos

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28/86 em 100 %. Isto é em comparação a um animal ou ser humano não recebendo a composição imunogênica ou vacina da presente descrição. Comparações aos grupos de animais ou seres humanos também são consideradas aqui.

[0060] O receptor do produto e método da presente descrição pode ser um ser humano ou um animal. O animal é preferivelmente selecionado de, mas não limitado a, porcino, porcos, gado, cabras, cavalos, cães, cervo, coiote, gatos, aves domésticas e outros animais selvagens e domésticos relacionados. Em uma modalidade preferida, o receptor é um ser humano, um cão, uma vaca ou gado, um cavalo ou um porco.

[0061] A sequência de nucleotídeo modificada ou modificada viva será entendida como significando qualquer sequência de nucleotídeo obtida por mutagênese de acordo com técnicas bem conhecidas à pessoa habilitada na técnica e contendo modificações com respeito às sequências normais de acordo com a descrição, por exemplo mutações nas sequências reguladoras e/ou promotoras da expressão de polipeptídeo, especialmente levando a uma modificação da taxa de expressão do dito polipeptídeo ou a uma modulação do ciclo replicativo.

[0062] Sequência de nucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucleico será entendida de acordo com a presente descrição como significando tanto um DNA de filamento duplo ou de filamento único nas formas monoméricas e diméricas (assim chamadas, em tandem) e nos produtos de transcrição dos ditos DNAs.

[0063] Deve ser entendido que a presente descrição não refere-se às sequências de nucleotídeo genômicas tomadas em seu ambiente natural, isto é, no estado natural. Ela diz respeito a sequências para as quais foi possível isolar, purificar ou parcialmente purificar, partindo de métodos de separação tais como, por exemplo, cromatografia de troca tônica, por exclusão com base em tamanho molecular ou por afinidade

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29/86 ou alternativamente técnicas de fracionamento com base na solubilidade em diferentes solventes ou partindo de métodos de engenharia genética tais como amplificação, clonagem e subclonagem, sendo possível que as sequências da descrição sejam carregadas por vetores. Além disso, as sequências foram alteradas do que é encontrado na natureza para incluir mutações induzidas através de mutagênese sítio-dirigida ou outras técnicas de atenuação, tais como passagem serial, demonstrando ainda que as sequências sâo feitas artificialmente e não encontradas na natureza.

[0064] A vacina modificada viva atenuada ou composição imunogênica da presente invenção não contém uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido encontrada na natureza, visto que ela foi construída artificialmente. Portanto, a composição imunogênica ou vacina da presente invenção é acentuadamente diferente do que é encontrado na natureza. Similar ao Exemplo 5 para Exemplos de Produto com Base na Natureza de objeto elegível sob 35 U.S.C. 101 emitido pelo Escritório de Patentes dos EUA em 2014, a composição imunogênica ou vacina da presente invenção é semelhante à reivindicação 2 deste exemplo porque o gene da composição imunogênica ou vacina tem elementos adicionais, tais como as mutações dentro da sequência ou inativação do vírus que o fornece com uma característica funcionalmente diferente de, por exemplo, E. chaffeensis que ocorre naturalmente.

[0065] Cerca de 1 kb de segmentos de DNA genômico de E. chaffeensis a montante e a jusante dos sítios de mutação de inserção aleatória previamente definidos do gene Ech_0230 e Ech___0379 foi obtido por PCR e clonado em um vetor de plasmídeo. O segmento promotor de gene Tu de fator de alongamento de E. chaffeensis, Tuf-2, (Ech_0407) foi similarmente clonado na frente da sequência de codificação de gene aadA em um plasmídeo separado (gene aadA confere resistência a espectinomicina e estreptomicina). O promotor de gene

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Tuf-2 (tuf) foi escolhido para expressão de proteína de aadA porque ele conduz a expressão de uma proteína altamente conservada e constitutivamente expressada, Tu que é necessária para o processo de alongamento de polipeptídeo no mecanismo de tradução de proteína. Além disso, a análise bioinformática e mapeamento de transcrição por experimento de extensão de iniciador sugeriu que este é um promotor forte responsável por transcrever genes, a maioria dos quais codifica proteínas ríbossômicas 30S e 50S e ter sítios de início de transcrição múltiplos (não mostrados). O gene aadA foi escolhido visto que ele trabalha bem em conferir resistência antibiótica em E. chaffeensis e em espécies de Anaplasma. O segmento tuf-aadA foi engendrado nas construções de recombinação homóloga de Ech_0230 e EchJ3379 (pHR-EchJ3230-tufaadA e pHR-Ech_0379-tufraadA, respectivamente). Fragmentos de DNA lineares das construções contendo os braços de homologia 5’ e 3’ dos genes separados pelo segmento tuf-aadA foram gerados por PCR para o uso em criar mutações alvejadas. Para criar um padrão de mutagênese de resgate em reverter a mutação de gene alvejada dentro do gene Ech_0379, o fragmento de 0,5 kb a jusante do sítio de mutação do gene foi obtido por PCR de genoma de E. chaffeensis e ele foi engendrado na construção de pHR-Ech_0379-tuf-aadA para gerar uma construção modificada; pHR-res-EchJ3379-Amtr-mCh-Gent contendo a ORF de gene Ech_0379 inteiro ORF na extremidade 5’ seguido pela presença do promotor Amtr, as ORFs de mCherry e os cassetes de resistência à gentamicina (Gent) (Amtr-mCh-Gent) e um segmento genômico de 1 kb contendo a porção 3’ do gene Ech_0379. Gent foi otimizado de códon para a tradução eficiente em E. chaffeensis. Fragmentos lineares da construção de resgate depois foram preparados que continham o braço de homologia 5’ começando com o gene Ech_0379 seguido por segmento Amtr-mCh-Gent e o segmento genômico de extremidade 3’ a jusante da inserção de Ech_0379 para servir como o braço

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31/86 de homologia 3’. Fragmentos de DNA lineares para interromper os genes Ech Jj230 ou Ech jj379 foram eietroporados em organismos de E. chaffeensis do tipo selvagem isentos de célula hospedeira recuperados de células de carrapato ISE6 e depois deixados reinfectar células de carrapato ISE6. Os mutantes foram selecionados quanto à sua capacidade de crescer no meio contendo espectinomicina e estreptomicina por várias semanas e depois deixados infectar a linhagem de célula de macrófago, DH82, para crescimento contínuo por vários meses. Para o experimento de mutação de resgate, fragmentos de DNA lineares do padrão de restauração de gene Ech_0379 foram similarmente eietroporados em organismos de E. chaffeensis contendo mutação no gene Ech_0379. Culturas de E. chaffeensis com o gene Ech_0379 restaurado depois foram selecionadas por sua capacidade de crescer no meio contendo gentamicina. A seguir da recuperação de culturas de E. chaffeensis crescendo nos meios contendo antibióticos, inativações gênicas alvejadas em Ech_Q230 ou Ech_0379 foram confirmadas por dois ensaios de PCR específicos de inserção alvejando 1) à região genômica 5’ ao sítio de troca alélica e ao DNA específico de inserção e 2) ao DNA de inserção e ao 3’ do sítio de troca alélica no genoma. A pureza clonal depois foi confirmada por um outro ensaio de PCR alvejando as regiões genômicas a montante e a jusante dos sítios de inserção de troca alélica. A integridade dos produtos de PCR foi confirmada por análise de PCR-sequência de DNA. Para a restauração de gene Ech_0379 a geração de mutante também foi avaliada quanto à expressão de proteína mCherry por microscopia de fluorescência (Figura 5B). A presença de mutações no genoma de E. chaffeensis também foi validada por análise de Southern blot tanto para as mutações de interrupção gênica quanto para a mutação de restauração de gene. A análise de RT-PCR revelou que os transcritos de EchJ3230 e EchJ3379 estavam presentes em E.

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32/86 chaffeensis do tipo selvagem e estavam ausentes nos organismos mutantes de interrupção gênica. A cepa mutante complementar testou positivo para o transcrito de Ech_0379 similar a E. chaffeensis do tipo selvagem. Além disso, nós testamos se as mutações de troca alélica para inativar e restaurar a atividade do gene em Ech J3379 pode causar efeitos polares em alterar a expressão de gene de seus genes vizinhos. A análise foi realizada por ensaios de RT-PCR semiquantitativos onde três conjuntos de ciclos de PCR foram usados; 30, 35 e 40. Independente dos números de ciclos de PCR realizados, os produtos de RT-PCR foram similares para Ech_0378 e Ech_0380 para o mutante de inativação gênica do tipo selvagem e para o mutante de resgate gênico e produtos de RT-PCR de Ech_0379 estavam ausentes apenas no mutante de inativação gênica, enquanto pareceram similares para o mutante do tipo selvagem e de resgate gênico (Figura 6C). Não houve nenhuma evidência para sustentar a presença de interações fora de alvo desenvolvidas durante todos os três experimentos mutacionais. O quadro aberto de leitura de gene Ech J3379 é completamente restaurado na frente de seu próprio promotor resultante do experimento de mutação de troca alélica de complementação e sua estrutura de gene é, portanto, similar à E. chaffeensis do tipo selvagem, exceto que ele também expressa proteínas mCherry e de resistência à gentamicina. Esta E. chaffeensis modificada, que é similar ao tipo selvagem em ter o genoma completo, será útil para novos estudos em monitorar o patógeno em tempo real por imagiologia de fluorescência in vitro e in vivo, similar a estudos anteriores descritos para Borreiia burgdorferi.

[0066] Esta descrição escrita usa exemplos para divulgar a invenção, incluindo o melhor modo e também para permitir que qualquer pessoa habilitada na técnica pratique a invenção, incluindo fabricar e usar quaisquer dispositivos ou sistemas e realizar quaisquer métodos incor

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33/86 porados. O escopo patenteável da invenção é definido pelas reivindicações e pode incluir outros exemplos que ocorrem àqueles habilitados na técnica. Tais outros exemplos são intencionados a estarem dentro do escopo das reivindicações se eles tiverem elementos estruturais que não diferem da linguagem literal das reivindicações ou se eles incluírem elementos estruturais equivalentes com diferenças insubstanciais das linguagens literais das reivindicações.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Materiais e Métodos

[θθθ7] Cultivo /n vitro de E. chaffeensis. Isolado de Arkansas de E. chaffeensis foi continuamente cultivado em linhagem de célula de carrapato ISE6, uma linhagem de célula embrionária de /. scapularis, como descrito mais no início (Elwell, C., Mirrashidi, K. e Engel, J., Nat. Rev. Microbiol.', 14, 385 - 400 (2016).). A linhagem de célula de macrófago canina (DH82) também foi usada para cultivar E. chaffeensis seguindose os protocolos relatados mais no início (Walker, D.H., Paddocl, C.D. e Dumler, J.S., Med Clin North Am: 92, 1345 - 1361 (2008)).

[θθθθ] Construção para plasmídeos e segmentos de recombinação homóloga. Todos os iniciadores usados para a preparação de construções de plasmídeo recombinantes desenvolvidas para os experimentos de mutagênese alvejada são descritos na tabela 1. Plasmídeos usados e preparados neste estudo foram listados na tabela 2.

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo.

Sequências em letra maiúscula são específicas de gene; sequências em letra minúscula sâo superposições de Montagem de Gibson.

Iniciador* Sequência Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBÍNAÇÃO

Para interrupção de gene Ech 0230

Clonagem do segmento de gene Ech_0230

RRG1591 TATGGGCCTAAGATAGTATTACC (SEQ ID No. 1) dianteira 2074

RRG1602 AAGACACACAAGAACATGACACTGCC (SEQ ID No. 2) reversa

Iniciadores específicos de inserção para dividir a construção de plasmídeo de pHR-Ech__ 023G

RRG1599 gatcaccaaggtagtcggcaaataactcgagTATATATAATCATGTATCGATTATATATAACTGTGTGC dianteira 6081 (SEQ ID No. 3; INICIADOR)

R RG1592 cctaattaaaaaaagtcaaaattaatagtcacatttttctcgagCT GT AGT ACCAT GT GTT ACTT ACCCT CTTTC reversa (SEQ ID No. 4, INICIADOR)

Para interrupção de gene Ech 0230

Clonagem do segmento de gene Ech_0379

RRG1603 ACCTGCTGTACTGAGTATGTTCTTG (SEQ ID No. 5) dianteira 2546

RRG1608 AGACAAGAACATGCTTCAGGTGCTAC (SEQ ID No. 6) reversa

Iniciadores específicos de inserção para dividir a construção de plasmídeo de pHR-Ech_0379

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo.

Iniciador* Sequência Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBÍNAÇÃO jpjQMÕLÕGA^r‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘“

RRG1604 cctaattaaaaaaagtcaaaattaatagtcacatttttctcgagTGCTGCATTAATTCTATGTAATTATCTTTAG dianteira 6552 (SEQ ID No. 7- INICIADOR)

RRG1605 gatcaccaaggtagtcggcaaataactcgagTATTATGCTTTATAAATGTTCTCAGTCTATTGGC (SEQ reversa

ID No. 8- INICIADOR)

Para clonagem de promotor de Tuf-2 (Ech 0407)

RRG1595 AAAAATGTGACTATTAATTTTGACTTTTTTTAATTAGG (SEQ ID No. 9; PROMOTOR) dianteira 387

RRG1596 gcgatcaccgcttccctcatAAACAAATACCTTTAACATCATTAAACCATTTC (SEQ ID No. 10; PRO- reversa MOTOR) ω

CM

CO

Para clonagem de gene aadA

RRG1597 gaaatggtttaatgatgttaaaggtatttgtttATGAGGGAAGCGGTGATCGC (SEQ ID No. 11) dianteira 789

RRG1598 TTATTTGCCGACTACCTTGGTGATC (SEQ ID No. 12) reversa

Para restauração da função do gene Ech 0379

Clonagem de segmento de extremidade 3’ de Ech__0379

RG8 GATAATTACATAGAATTAATGCAGCATATTATGCTTTATAAATGTTCTCAG (SEQ ID No. 13) dianteira 427

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Tabela 1: Lista de olígonucleotídeos usados neste estudo.

Iniciador* Sequência

Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBINAÇAO HOMOLOGA:

RG9 GCATGCGGCGATCGTTCTAGGAGCTATAAATCTACACTTTCTTCAAC (SEQ ID No. 14)	reversa
Para clonagem de promotor Amtr com gene mCherry (Amtr-mCh) RG10 CTCCTAGAACGATCGCCGCATGCTAGC (SEQ ID No, 15; INICIADOR) RG11 AATTTAATCCCTATTTGTATAATTCG (SEQ ID No. 16; INICIADOR)	dianteira 950 reversa
Para clonagem de gene de gentamicina a partir do piasmídeo pEchjpsI-GENT RG12 atacaaatagggattaaattATGTTAAGATCATCAAATGATG (SEQ ID No. 17) RRG914 ACTACTAGTTTATGTTGCTGTACTTGGATCAATATC (SEQ ID No. 18)	dianteira 563 reversa

36/86

Iniciadores específicos de inserção para dividir a construção de piasmídeo de pHR-Ech_0379 para a construção de resgate

RG6 TGCTGCATTAATTCTATGTAATTATCTTTAG (SEQ ID No. 19; INICIADOR) dianteira 6499

RG22 tacagcaacataaactagtagtTATTATGCTTTATAAATGTTCTCAGTCTATTGGC (SEQ ID No. 20; reversa

INICIADOR)

INICIADORES PARA A TRIAGEM DE MUTANTE:

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo. Sequências em letra maiúscula são específicas de gene; sequências em letra minúscula sâo superposições de Montagem de Gibson.
Iniciador* Sequência	Orientação	Tamanho (bp)
CONSTRUÇÕES DE RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA: Mutante de interrupção de Ech 0230 PCR 1 RRG1944 ATTAGTGCTATGGCATTTGGTC (SEQ ID No. 21)	dianteira	1525
RRG1596	reversa
	dianteira	2057
PCR II RRG1597 RRG1945 CAATTTACATGACATACTAACAAGC (SEQ ID No. 22)	reversa
PCR III RRG1944	dianteira	3582
RRG1945	reversa
Mutante de interrupção de Ech 0379 PCR 1 RRG1946 TGAGTGCTATGATACTCAAAGC (SEQ ID No. 23)	dianteira	1779
RRG1596	reversa

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo.

Iniciador*

Sequência

Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBINAÇAO HOMOLOGA:

PCR //

RRG1597

RRG1947 AGAATCAACAAGGCCTACATACC (SEQ ID No. 24)

PCR III

RRG1946

RRG1947 dianteira 2352 reversa dianteira 4131 reversa

38/86

Mutante de resgate de Ech 0379 PCR! RRG1946 RG97 TCCGCAGGATGTTTCACATA (SEQ ID No. 25)	dianteira reversa	2243
PCR II RRG94 RRG1947	AAGCAAATGCTTTAGGTGCAT (SEQ ID No. 26)	dianteira reversa	1711

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo.

Iniciador*

Sequência

Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBINAÇAO HOMOLOGA:

PCR III

RRG1946

RRG1947 dianteira 4824 reversa

INICIADORES DE AMPLIFICAÇÃO DE SONDA DE SOUTHERN BLOT:

Sonda de gene aadA

RRG1200 GTTACGGTGACCGTAAGGCTT (SEQ ID No. 27; INICIADOR)

RRG1201 CACGTAGTGAACAAATTCTTCCAACTG (SEQ ID No. 28; INICIADOR) dianteira 603 reversa

39/86

Sonda de gene Ech 0379

RRG1282 TGAAAATCTGATCGATAGTGCTGTGG (SEQ ID No. 29; INICIADOR)

RRG1283 GGTTGCATTCCCTACAACCTTAG (SEQ ID No. 30; INICIADOR) dianteira 384 reversa

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Tabela 1: Lista de oligonucleotídeos usados neste estudo.

Iniciador* Sequência Orientação Tamanho (bp)

CONSTRUÇÕES DE RECOMBINAÇÃO

RT-PCR INICIADORES:

Ech 0230

RG26 RG27	GCTTTGGATTGTTTGTCTTA (SEQ ID No. TCCATCCCATAACAAATCTA (SEQ ID No.	31; INICIADOR) 32; INICIADOR)	dianteira reversa	320
Ech 0379
RRG1276	CTAAGGTTGTAGGGAATGCAACC (SEQ I	D No. 33; INICIADOR)	dianteira	376
RRG1277	ACAAGGTAAGTACCTTGCTTGCTC (SEQ	ID No. 34; INICIADOR)	reversa

40/86 *Sequência para os iniciadores foi fornecida apenas uma vez se um iniciador for listado múltiplas vezes.

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Tabela 2: Plasmídeos e cepas de E. coli usados neste estudo

Nome pCis mCherry-SS Himar A7 pHR-Ech_0230 pHR-Ech..Q379 pHR-EchJ3230-tuf-aadA pHR-Ech_0379-tuf-aadA pHR-rescue-Ech__0379-Amtr-mCh-Gent pEch_rpsl-GENT

Descrição

Expressão de gene Himar transposase, mCherry e aadA conduzida por promotor Amtr

Braços de homologia de Ech_0230; vetor pCR™2,1-TOPO

Braços de homologia de Ech.,0379, vetor pCR™2,1-TOPO

Braços de homologia de Ech_0230, expressão de aadA conduzida por promotor tuf-2, vetor pCR™2,1-TOPO

Braços de homologia de Ech_0379, expressão de aadA conduzida por promotor tuf-2, vetor pCR™2,1-TOPO

Braços de homologia de Ech_0379, expressão de mCherry e gentamicina conduzida por promotor Amtr, vetor pCR™2,1-TOPO

Gene de gentamicina otimizado de códon para genoma de Echrlichia, vetor PUC57

Referência

Este estudo

GenScript (submeterá a seq a NCBI)

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[0069] Uma ilustração das etapas moleculares detalhadas seguidas em preparar as construções para experimentos de mutagênese de troca alélica é descrita na Figura 1. O Platina® Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado em todos os experimentos de PGR enquanto preparando as construções. Os genes Ech___0230 e Ech_0379 de E. chaffeensis foram usados para criar mutações de troca alélica visto que nós previamente relatamos mutações aleatórias dentro destes genes por método de mutagênese aleatório Himarl e que os organismos mutantes crescem normalmente sob culturas in vitro. Segmentos de DNA genômico de cerca de 2,0 kb transpondo cerca de 1 kb de cada um de ambos os lados dos sítios de mutação de inserção previamente identificados dos genes (referidos como A e A’ na Figura 1) foram amplificados a partir do genoma de E. chaffeensis (GenBank # CP000236.1; sítios de mutação de inserção Himarl para Echj3230 e EcHJj379 são 219,097 e 374,461, respectivamente). Coordenadas de genoma dos segmentos amplificados de genes Ech_0230 e Ech_0379 são 218.060 a 220.133 e 373.265 a 375.810, respectivamente. Os amplicons foram primeiro clonados no plasmídeo, vetor pCR™2,1-TOPO TA (Life Technologies, Rockville, MD) seguindo-se as instruções do fabricante. O promotor do gene Tuf~2 (EchJQ407) (tuf) transpondo 0,37 kb de DNA também foi amplificado do genoma de E. chaffeensis (coordendadas de genoma deste segmento são 396,385 a 396,751) para o uso na expressão constitutiva do produto de gene aadA para conferir resistência à espectinomicina e estreptomicina. O quadro aberto de leitura (ORF) de gene aadA foi obtido por PCR a partir do plasmídeo pCis mCherry~SS Himar A7 (Sahni, S.K., Narra, H.P.., Sahni, A. e Walker, D.H.; Future Microbiol; 8, 1265 - 1288 (2013).) O promotor tuf e ORF de aadA também foram clonados em um vetor pCR™2,1-TOPO TA separado e o plasmídeo depois foi usado para gerar fragmentos lineares de segmento â/f-aadA (fragmento 1) para incorporação nas construções de

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43/86 mutagênese de interrupção gênica alvejada finais. Fragmentos lineares depois foram gerados dos plasmídeos inteiros (pHR-Ech___0230 e pHREch_0379 respectivamente) contendo os segmentos de gene usando os íniciadores específicos de gene Ech_0230 ou EchJ3379 designados para dividir estes fragmentos de gene a duas metades iguais posicionadas em cada extremidade dos fragmentos lineares e mantendo a cadeia principal do plasmídeo no centro (fragmento 2). Seguindo-se os protocolos do método de Montagem de Gibson (New England Biolabs, Ipswich, MA), os fragmentos lineares 1 e 2 depois foram ligados para criar as construções de plasmídeo recombinantes homólogas finais, onde os segmentos de gene foram interrompidos com a inserção de segmentos tuf-aadA. As construções finais foram denominadas como pHR-Ech_0230-tüf-aadA e pHR-Ech_0379-tüf-aadA, respectivamente (Figuras 2A e 2B, respectivamente), (submissão no GenBank #s 2012015 e 2012023; números de acesso ainda devem ser recebodps.) Subsequentemente, fragmentos lineares destas construções contendo tanto os braços de homologia 5’ quanto 3’ de cada um dos segmentos de interrupção gênica junto com o cassete de tifr-aadA foram gerados por PCR (Figura 3A). Os amplicons depois foram resolvidos em géis de agarose a 1 % (Figura 3B); os DNAs foram isolados do gel e concentrados a 1 pg/μΙ em água isenta de nuclease para o uso nos experimentos de mutagênese de troca alélica para criar interrupções gênicas alvejadas.

[0070] Para construir o padrão de resgate de função de gene Ech_0379, o fragmento de 0,5 kb na extremidade 3’ a jusante do sítio de mutação por PCR usando DNA genômico de E. chaffeensis foi gerado como o padrão (coordenadas genômicas são 374,462 a 374,837). Os segmentos de DNA Amfr-mCherry (Amfr-mCh) constituindo o promotor de gene regulador de transcrição (77) de Anapmasma marginaie e ORF de mCherry foram amplificados usando o plasmídeo pCis

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44/86 mCherry-SS Himar A7 como o padrão. A sequência de codificação de gene de resistência à gentamicina (Gent) foi otimizada de códon comercialmente (GenScript, Piscataway, NJ) (GenBank # KY977452) como para os códons frequentemente encontrados de genoma de E. chaffeensis. O segmento Gent depois foi usado para clonar a jusante do fragmento Amfr-mCh para gerar o fragmento de fusão Amfr-mCh-Gent. O segmento Ech_0379 de 0,5 kb da extremidade 3’ depois foi ligado na extremidade 5’ do fragmento TWr-mCh-Gent realizando-se PCR de sobreposição e o amplicon final foi subsequentemente clonado na construção Ech_0379-tof-aadA-HR 1 para substituir o segmento M-aadA com o segmento Amfr-mCh-Gent contendo o segmento de ORF EchJJ379 de 0,5 kb de extremidade 3’ realizando-se a estratégia de clonagem de Montagem de Gibson. A construção de plasmideo de resgate Ech_0379 final; pHR-res-EchJ3379-Amfr~mCh-Gent incluiu a ORF de Ech_0379 de tamanho natural restaurada na frente de seu próprio promotor, seguido pelo Amfr-mCh-Gent e o segmento genômico de 1 kb de extremidade 3’ de gene Echjj379 (Figura 2C) (Submissão no GenBank #2012033; número de acesso ainda deve ser recebido). Esta construção depois foi usada como o padrão para gerar fragmentos lineares por PCR que continham o gene Ech_0379 inteiro na extremidade 5’, incluindo seu próprio promotor e o ORF completo, seguido por segmento Amfr-mCh-Gent e o segmento de 1 kb de extremidade 3’ adicional a jusante do sitio de mutação de gene Ech_0379 (Figura 5A). O produto de PCR foi purificado pelo Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Germany) e concentrado a 1 pg/μΙ em água isenta de nuclease como esboçado acima para o uso no experimento de mutagênese de troca alélica para restaurar a integridade do gene em organismos de E. chaffeensis tendo interrupção de gene EchJ3379.

[0071 ] Purificação de organismos de E. chaffeensis isentos de células. Cinco ml de cultura celular de E. chaffeensis de cerca de frasco

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45/86 de cultura de célula ISE6 confluents infectada a 80 a 90 % foram usados para gerar organismos de E. chaffeensis isentos de célula hospedeira. Brevemente, a suspensão de célula infectada foi recuperada por centrifugação a 15.000 g por 10 min a 4 °C e depois de descartar o sobrenadante, 1,5 ml de solução de sacarose 0,3 M gelada e volume de 100 μΙ de grão de pedra autoclavado #1 (carbureto de silício de grão a 60/90, Lortone, WA) foram adicionados a pélete celular e turbilhonados usando um turbilhão de bancada em velocidade máxima por 30 s para liberar bactérias das céluias hospedeiras infectadas. A céiula suspensão depois foi centrifugada a 200 g por 10 min a 4 °C para peletizar os fragmentos da célula hospedeira. O sobrenadante foi cuidadosamente recuperado em uma seringa de 3 ml e passado através de um filtro de 1,6 pm (Whatman Ltd., Piscataway, NJ); o filtrado contendo organismos de E. chaffeensis foi peletizado centrifugando-se a 15.000 g por 10 min a 4 °C. O pélete celular foi lavado duas vezes com solução de sacarose gelada 0,3 M recolocada em suspensão em 45 μΙ de solução de sacarose gelada 0,3 M e usada imediatamente para experimentos de eletroporação.

[0072] Transformação de E. chaffeensis e isolamento clonal de mutantes. Entre 3 e 10 pg de fragmentos de DNA lineares purificados das construções de plasmídeo de mutagênese de troca alélica (esboçadas acima) foram adicionados aos organismos de E. chaffeensis isentos de célula hospedeira em volume de 45 μΙ, misturados suavemente e os conteúdos transferidos em um cuveta de eletroporção de intervalo de 1 mm (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). A cuveta foi incubada em gelo por 15 min e depois submetida à eletroporação em ajuste de 2.000 volts, 25 pF e 400 Ω (Gene Pulser Xcell™, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As células eletroporadas foram transferidas para um tubo de microcentrífuga contendo 0,5 ml de FBS e 1 ml de suspensão de célula ISE6 não infectada contendo cerca de 1x10⁶ células ISE6 em meio de

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46/86 infecção de cultura de célula de carrapato. A amostra mista foi centrifugada a 5.000 g por 5 min, incubada na temperatura ambiente por 15 min, as células depois foram recolocadas em suspensão em meio de cultura de 5 ml e os conteúdos inteiros foram transferidos para um frasco T25 contendo células ISE6 confluentes e incubados por 24 h em uma incubadora a 34 °C umedecida e depois 100 pg/ml de cada um de espectinomicina e estreptomicina foram adicionados ao meio de cultura; as incubações foram continuadas a 34 °C por vários semanas para selecionar os mutantes. Tipicamente, mutantes foram detectados por análise de PCR depois de duas a três semanas, embora a avaliação continuasse por várias semanas além deste ponto no tempo. Experimento similar foi realizado para obter mutante de restauração de gene Ech_0379, exceto que o meio contendo 80 pg/ml de gentamicina foi usado depois de 24 h de eletroporação. Culturas mutantes de restauração de gene EchJ)379 também foram avaliadas detectando-se a expressão de mCherry examinando-se as culturas usando um microscópio invertido Nikon Diaphot (Nikon, Melville, NY). Uma vez identificado, as culturas resistentes a antibiótico foram transferidas para culturas de célula DH82 para crescimento e manutenção adicionais. Estoques de nitrogênio liquido também foram preparados e armazenados dentro das primeiras duas semanas depois do estabelecimento das cepas mutantes.

[0073] Confirmação da presença de mutantes de E. chaffeensis. As culturas de E. chaffeensis que cresceram bem na presença de antibióticos foram subsequentemente triadas quanto a positivos para mutação de troca alélica por análise de DNA genômico por inserção de PCRs específicas. DNAs genômicos totais foram recuperados das culturas usando um kit de Purificação de DNA Genômico Wizard como pelas instruções do fabricante (Promega, Madison, Wl). Três ensaios de PCR

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47/86 diferentes foram realizados usando os DNAs genômicos purificados (Figura 4B). O primeiro e o segundo ensaios de PCR (Figura 4B primeiro painel) alvejaram 1) à região genômica 5’ aos sítios de troca aléiica e ao DNA específico de inserção (Figura 4B segundo painel) o DNA de inserção e à 3’ dos sítios de troca aléiica no genoma. O 3^fi ensaio PCR (Figura 4B terceiro painel) foi designado para também testar a pureza clonal dos mutantes; iniciadores usados neste ensaio foram alvejados às regiões genômicas a montante e a jusante dos sítios de inserção de troca aléiica (Figura 4C). Os produtos de PCR foram resolvidos em um gel de agarose a 0,9 % para identificar amplicons de comprimento prognosticado específico e depois submetidos à anáiise de sequenciamento para confirmar ainda a integridade mapeando-se as junções genômicas das inserções de ambas as extremidades dos amplicons. Mutações e pureza clonal foram subsequentemente confirmadas por análise de Southern blot (Figura 4D). DNAs genômicos dos organismos mutantes e dos organismos do tipo selvagem foram submetidos a digestões com enzima de restrição usando as enzimas de restrição Clal, EcoRI ou Hindl 11; os DNAs digeridos foram resolvidos em um gel de agarose a 1 % e transferidos para uma membrana de náilon (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). A sonda de segmento de gene aadA específica da inserção foi usada no experimento de hibridização de Southern blot para localizar o DNA inserido em mutantes interrompidos alvejados de Ech_0230 e Ech_0379, enquanto a sonda de segmento de gene Ech_0379 foi usada para localizar as inserções genômicas em inserção de gene alvejada e clones mutantes de restauração de Ech jj379 como por procedimentos padrão de análise de mancha de DNA.

[0074] Análise de RNA por RT-PCR para verificar a perda e a restauração da transcrição. RNAs totais de organismos de E. chaffeensis tipo selvagem e mutantes cultivados em culturas de células ISE6 ou DH82 foram isolados seguindo-se o método de isolamento de RNA total

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48/86 de tri-reagente como pelas instruções do fabricante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As amostras de RNA depois foram tratadas com RQ1 DNase (Promega, Madison, Wl) a 37 °C por 60 min para remover quaisquer DNAs genômicos residuais. Iniciadores alvejando a ORF de Echj3230 ou Ech___0379 foram usados em análise de RT-PCR e a presença de amplicons específicos foi avaliada por análise em gel de agarose a 0,9 % e submetendo-se os produtos à análise de sequência de DNA. Ensaios de RT-PCR semiquantitativos foram realizados conforme nós previamente descrevemos para avaliar a expressão de mRNA a partir dos genes Ech_0378, EchJD379 e Ech_0380 usando quantidades iguais de RNAs de E. chaffeensis recuperados da interrupção de gene Ech_0379 do tipo selvagem e mutantes de restauração de gene Ech_0379 (Figs 5B, 5C, 6A e 6B). Os ensaios foram realizados em 30, 35 e 40 ciclos (Figura 6C). Southern blot foi usado para confirmar (Figura 5E).

EXEMPLO 2

[0075] Materiais e Métodos Cultivo in vitro de E. canis e Anaplasma phagocytophilum. E. canis e A. phagocytophilum são continuamente cultivados em linhagem de célula de carrapato ISE6, uma linhagem de célula embrionária de /. scapularis, como descrito mais no início (Munderloh, U.G. et al· J. Clin. Microbiol. 37, 2518 - 2524 (1999) e Cheng, C. & Ganta, R.R. Curr. Protoc. Microbiol· Capítulo 3, Unidade 3A 1 (2008)). [0076] Construção para plasmídeos e segmentos de recombinação homóloga. Todos os iniciadores usados para a preparação de construções de plasmídeo recombinantes são desenvolvidos para os experimentos de mutagênese alvejada seguindo-se protocolos similares conforme descrevem-se para E. chaffeensis, exceto que os iniciadores específicos de gene alvo de patógenos são usados. Similarmente, as etapas moleculares detalhadas a seguir em preparar as construções para experimentos de mutagênese de troca alélica são similares àquelas

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49/86 descritas para E. chaffeensis seguindo-se métodos moleculares padrão (Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. (2001)). Brevemente, segmentos de DNA genômico de cerca de 2,0 kb transpondo cerca de 1 kb cada de ambos os lados dos sítios de mutação de inserção previamente identificados dos genes são amplificados de homólogos gênicos de E. canis ou A. phagocytophilum que são similares ao gene de E. chaffeensis Ech___0660. As sequências homólogoas de Ech_0660 de E. canis e A phagocytophilum são fornecidas aqui como SEQ ID NO. 54 e SEQ ID NO. 55, respectivamente. Os amplicons são primeiro clonados em um vetor de plasmídeo e o promotor de gene de Ehrlichia ou Anaplasma conduzindo o gene marcador de seleção de antibiótico, junto com um gene repórter fluorescente são inseridos nas construções de mutagênese de interrupção gênica alvejada finais para dividir a sequência das bactérias sobre metades iguais. Fragmentos lineares são depois gerados por PCR a partir dos plasmídeos recombinantes inteiros contendo segmentos de gene de interrupção específicos de E. canis ou A. phagocytophilum. Os amplicons depois são purificados e concentrados a 1 pg/μΙ em água isenta de nuclease para o uso nos experimentos de mutagênese de troca alélica para criar interrupções gênicas alvejadas.

[0077] Purificação de organismos de E. canis e A phagocytophilum isentos de célula. O método de purificação para recuperar organismos isentos de célula hospedeira de E. canis ou A. phagocytophilum é essencialmente o mesmo como E. chaffeensis descrito acima no exemplo 1 exceto que os frascos de cultura de célula ISE6 confluente infectada, infectados a 80 a 90 % contendo E. canis ou A. phagocytophilum são usados, respectivamente, para gerar os organismos isentos de célula hospedeira específicos seguindo-se o protocolo como em Felsheim, R.F. et al. BMC Biotechnol. 6, 42 (2006).

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[0078] Transformação de E. chaffeensis e isolamento clonal de mutantes. Três pg de fragmentos de DNA lineares purificados das construções de plasmídeo de mutagênese de troca alélica (esboçadas acima) foram adicionados aos organismos de E. chaffeensis isentos de célula hospedeira em volume de 45 μΙ, misturados suavemente e os conteúdos transferidos em uma cuveta de eletroporção de intervalo de 1 mm (BioRad Laboratories, Hercules, CA). A cuveta foi incubada em gelo por 15 min e depois submetida à eletroporação em ajuste de 2.000 volts, 25 pF e 400 Ω (Gene Pulser Xcell™, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As células eletroporadas foram transferidas para um tubo de microcentrífuga contendo 0,5 ml de FBS e 1 ml de suspensão de célula ISE6 não infectada contendo cerca de 1x10^s céluias ISE6 em meio de infecção de cultura de célula de carrapato. A amostra mista foi centrifugada a 5.000 g por 5 min, incubada na temperatura ambiente por 15 min, as células depois foram recolocadas em suspensão em meio de cultura de 5 ml e os conteúdos inteiros foram transferidos para um frasco T25 contendo células ISE6 confluentes e incubados por 24 h em uma incubadora a 34 °C umedecida e depois 100 pg/ml de cada um de espectinomicina e estreptomicina foram adicionados ao meio de cultura; incubações foram continuadas a 34 °C por várias semanas para selecionar os mutantes. Tipicamente, os mutantes foram detectados por análise de PCR depois de duas a três semanas, embora a avaliação continuasse por várias semanas além deste ponto no tempo. Experimento similar foi realizado para obter mutante de restauração de gene EchJ3379, exceto que os meios contendo 80 pg/ml de gentamicina foram usados depois de 24 h de eletroporação. Culturas de mutante de restauração de gene Ech_0379 também foram avaliadas detectando-se a expressão de mCherry examinando-se as culturas usando um microscópio invertido Nikon Diaphot (Nikon, Melville, NY). Uma vez identificadas, as culturas resistentes a antibiótico foram transferidas para culturas de célula DH82

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51/86 para crescimento e manutenção adicionais. Estoques de nitrogênio líquido também foram preparados e armazenados dentro das primeiras duas semanas depois do estabelecimento das cepas mutantes.

[0079] Confirmação da presença de mutantes de E. canis ou A. phaqocytophilum. As culturas de E. canis ou A. phagocytophiium que crescem bem na presença de antibióticos são tríadas quanto a positivos para mutação de troca alélica por análise de DNA genômico por PCRs específicas de inserção. Os protocolos são os mesmos conforme nós descrevemos para E. chaffeensis.

[0080] Análise de RNA por RT-PCR para verificar a perda e restauração da transcrição. RN As totais de organismos de E. canis ou A. phagocytophiium do tipo selvagem e mutantes cultivados em culturas de célula ISE6 são isolados seguindo-se o método de isolamento de RNA total com reagente de TRI e tratados com RQ1 DNase. Iniciadores específicos de gene patogênico são usados em análise de RT-PCR e a presença de amplicons específicos é avaliada por análise em gel de agarose e submetendo-se os produtos à análise de sequência de DNA (Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. (2001)). EXEMPLO 3

Materiais e Métodos

Cultivo in vitro e recuperação de E. chaffeensis isenta de célula

[0081] Tipo selvagem de isolado de Arkansas de E. chaffeensis e os mutantes foram cultivados na linhagem de célula de macrófago canina, DH82. O isolamento e purificação do tipo selvagem de E. chaffeensis isento de célula e seus mutantes foram realizados como segue. Brevemente, a taxa de infecção bacteriana em células DH82 foi avaliada com manchamento Diff-Quik. Depois de 72 h de infecção quando a infecção atingiu cerca de 80 a 90 %, a cultura de quatro frascos confluen

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52/86 tes T-150 foi colhida e centrifugada a 500 χ g por 5 min. Péletes celulares foram recolocados em suspensão em 1 χ solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo inibidores de protease (Roche, Indianapolis, IN) e as células foram homogeneizadas em gelo por passagem, de 15 a 20 cursos com uma agulha de 23 g em uma seringa de 10mL. A eficiência de homogeneização, 80 a 90 % de lise, foi verificada sob microscópio óptico. O lisato de célula integral foi centrifugado a 500 χ g por 5 min a 4 °C. O sobrenadante resultante contendo organismos de Ehrlichia isentos de célula foi filtrado através de um filtro de membrana estéril de 2 pm (Mlllipore, Billerica, MA). Ehrlichia isento de célula dos filtrados foram peletizados por centrifugação em 15,000 χ g por 15 min e o pélete foi colocado em suspensão em PBS e depois disposto em camadas sobre solução a 30 % de diatrizoato meglumina e sódio (Renografln) MD76R (Malllnckrodt Inc, St. Louis, MO). A suspensão foi centrifugada por 1 h em 100.000 x g a 4 °C em um S50-ST rotor de balde oscilante (Beckman, Indianapolis, IN). O pélete de Ehrlichia isento de célula foi lavado em 15.000 χ g por 15 min e usada para os experimentos.

Enriquecimento e sequenciamento de mRNA bacteriano

[0082] O enriquecimento de mRNA bacteriano e a preparação de biblioteca de cDNA e o sequenciamento de RNA foram realizados como segue: Brevemente, RNA de tipo selvagem e mutantes foram isolados de Ehrlichia isento de célula purificado usando Reagente TRIzol (SigmaAldrich, St. Louis, MO). Amostras de RNA depois foram tratadas com DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o RNA bacteriano foi enriquecido removendo-se 18 S rRNA do hospedeiro, 28 S rRNA e mRNA poliadenilado usando o Kit MICROBEnrich (Ambion, Foster City, CA). A quantidade e integridade do RNA bacteriano antes e depois do enriquecimento foi avaliada usando um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) e Bloanallsador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O Kit Magnético Ribo-Zero foi usado

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53/86 para isolar o mRNA de amostras de RNA total e depois fragmentado em fragmentos curtos como pelos protocolos do fabricante (Epicentre, Madison, Wl). Subsequentemente, o cDNA foi sintetizado usando os fragmentos de mRNA como padrões. Bibliotecas de cDNAs para tipo selvagem e mutantes foram preparadas usando o Kit de Prep de Amostra de RNATruSeq (Illumina, Ingolstadt, Germany). Bibliotecas de amostra foram quantificadas usando o Bioanalisador Agilent 2100 e a qualidade da biblioteca foi avaliada por PCR em Tempo Real (ABI StepOnePlus) antes de submeter as amostras ao sequenciamento em Illumina HiSeqTM 4000 (Beijing Genomics Institute (BGi), Philadelphia, PA).

Análise bioinformática

[0083] Os dados da imagem originai foram transferidos em dados de sequência brutos por intermédio de chamada de base. Leituras brutas foram submetidas à avaliação da qualidade para determinar se as leituras brutas foram qualificadas para o mapeamento. As bases com qualidade baixa (<20) foram excluídas da análise. Leituras brutas depois foram filtradas para remover as sequências adaptadoras e leituras de qualidade baixa, depois leituras limpas foram alinhadas ao genoma completo da cepa Arkansas de E. chaffeensis como pelo primeiro GenBank anotado # CP000236.1 usando SOAPaligner/SOAP2. Este número de acesso foi selecionado e usado porque nossas publicações anteriores e similarmente outros investigadores, amplamente o usaram para referir-se aos nomes e números listados neste. Não mais do que cinco incompatibilidades foram deixadas no alinhamento, que é um corte padrão usado para a análise de alinhamento. Os dados de alinhamento foram usados para calcular a distribuição de leituras em genes de referência e determinar a cobertura de gene. Os resultados do alinhamento foram avaliados quanto à verificação da qualidade e depois procedem com a análise de DGE. O nível de expressão de gene foi calculado usando o método RPKM de normalizar o comprimento de leitura

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54/86 total e o número de leituras de sequenciamento. Nós usamos o valor de p < 0,05, Taxa de Descoberta Falsa (FDR) < 0,001 e o valor absoluto da Razão Log2 > 1 como o limiar para julgar a diferença de significância na expressão de gene. O FDR usa valores de p exatos como uma medida de controle em comparação de amostras múltiplas de dados de seq de RNA. Correções para erros falso positivos e falso negativos foram realizadas usando o método descrito por Benjamini e Yekutieli.

PCR de transcrição reversa em tempo real quantitativa

[0084] PCR de transcrição reversa em tempo real quantitativa com base em detecção com verde SYBR (Ensaios de qRT-PCR foram realizados para validar as mudanças de expressão de gene observadas na análise de dados de seq de RNA). RNAs de mutantes do tipo selvagem, ECH_0379, ECHJ3490 e ECHJ3660 usados em gerar os dados de seq de RNA também foram usados para determinar níveis de transcrito realizando-se RT-PCR quantitativa por ensaios com verde SYBR usando um SUPERSCRIPT® III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). O RNA foi transcrito reverso a partir de todas as réplicas usando Superscript III e depois PCRs quantitativas foram realizadas em uma reação de 25 pL contendo 0,5 μΜ de cada um de iniciadores dianteiros e reversos. Condições de ciclizador térmico foram; 94 °C por 15s, 60 °C por 30 s e 74 °C por 15 s para 40 ciclos. Treze genes diferencialmente transcritos aleatoriamente selecionados foram usados em experimentos de validação usando o instrumento de PCR em Tempo Real StepOnePlus™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) e os dados foram analisados pelo software StepOne v2.3.16 S rRNA de E. chaffeensis foi quantificado por RT-PCR em tempo real e usado para a normalização de concentrações de RNA entre diferentes lotes de RNA, antes de realizar os experimentos de validação. Para dados de qRT-PCR, o cálculo de delta-delta Ct (AACt) foi utilizado para calcular a mudança relativa na expressão e a modulação foi obtida ponderando

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55/86 se os valores replicados da expressão de gene e o erro padrão. RTPCR de etapa única semi-quantitativa (Life Technologies, Carlsbad, CA) alvejando a genes de E. chaffeensis ECHj0490 e ECH_0492 perto da mutação de transposon a jusante do gene ECHJ3490 foi realizada com 30 ciclos de amplificação usando os iniciadores específicos de gene como descrito em um estudo prévio (PLoS A; 10, e0132657 (2015)). Brevemente, o RNA do tipo selvagem e o mutante de ECH_0490 foram usados como os padrões para RT-PCR. Um tubo sem transcriptase reversa ou RNA padrão foi usado como controle negativo. Um tubo com DNA como o padrão foi usado como controle positivo. Condições de ciclizador térmico foram como segue: 50 °C por 1 h para etapa de transcrição reversa depois seguido por 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; finalmente uma etapa de extensão de 2 min a 72 °C foi parte da reação.

[0085] O patógeno riquetsiano Ehrlichia chaffeensis causa uma doença transmitida por carrapato, erliquiose monocítica humana. Mutações dentro de certos locais genômicos do patógeno auxiliam em entender a patogênese e em desenvolver vacinas atenuadas. Nossos estudos prévios demonstraram que mutações em diferentes sítios genômicos em E. chaffeensis causaram impactos variáveis sobre seu crescimento e atenuação em hospedeiros vertebrados e de carrapato. Aqui, nós avaliamos o efeito de três mutações sobre mudanças transcricionais usando tecnologia de sequenciamento profundo de RNA. O sequenciamento de RNA auxiliou em detectar 66 a 80 % dos transcritos de E. chaffeensis do tipo selvagem e mutante. A mutação em um gene antiporter (ECHjO379) causando crescimento atenuado em hospedeiros vertebrados resultou na infrarregulação de muitos genes transcritos. Similarmente, uma mutação a jusante da sequência de codificação de ECHJ3490 resultou em impacto mínimo sobre o crescimento in vivo do patógeno, mas causou maiores mudanças em seu transcriptoma. Esta

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56/86 mutação causou a expressão realçada de vários genes de resposta ao estresse do hospedeiro. Ainda que a mutação do gene ECH_0660 causasse a depuração rápida do patógeno em hospedeiros vertebrados e auxiliasse em gerar uma resposta protetiva, houve impacto mínimo sobre o transcriptoma. Os dados transcriptômicos oferecem novas percepções sobre o impacto de mutações sobre a expressão de gene global e como eles podem contribuir para a resistência e/ou depuração do patógeno do hospedeiro.

[0086] Ehriichía chaffeensis é um patógeno bacteriano intracelular transmitido por carrapato causando erliquiose monocítica humana (HME) e ele também infecta cães, cervo, cabras e coiotes. Mutações em certos locais genômicos, levando a mudanças de expressão de gene, impactam a capacidade do patógeno de causar infecção e persistência em um hospedeiro. O genoma de E. chaffeensis pode ter desenvolvido dentro de um ambiente da célula hospedeira levando ao desenvolvimento de mecanismos para enfraquecer a resposta imune do hospedeiro resposta. Genes de E. chaffeensis associados à patogênese são provavelmente altamente ativos em um microambiente de hospedeiro e compatíveis com esta hipótese, a expressão de gene diferencial em resposta à defesa da célula hospedeira é conhecida ocorrer. Progresso foi feito para identificar genes cruciais para a sobrevivência de Ehrlichia em um ambiente de célula hospedeira. Entretanto, até agora, apenas alguns genes abundantemente expressados são identificados como associado com a patogênese. Definir os genes envolvidos na patogênese e virulência e documentar sua expressão diferencial pode auxiliar na descoberta de novas proteínas valiosas como alvos para intervenções terapêuticas e desenvolvimento de vacina para HME.

[0087] Patógenos intracelulares geneticamente mutados são fontes importantes para estudar a patogênese microbiana e também auxiliam

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57/86 nos esforços do desenvolvimento de vacinas. Nosso estudo prévio demonstrou a praticabilidade de mutações com base em transposon em E. chaffeensis. Nós também descobrimos que algumas mutações de inserção resultantes na inativação transcricional de genes de proteína de membrana causam atenuação do crescimento do patógeno em hospedeiros vertebrados. Inserções dentro das regiões de codificação de gene ECHJ3379 e ECH__0660 ofereceram níveis variados de proteção contra infecção em um hospedeiro vertebrado. Neste estudo, nós hipotetizamos que os locais genômicos específicos das mutações podem impactar a expressão de gene global e contribuir para a sobrevivência alterada do patógeno, progressão da infecção e replicação em um ambiente de célula hospedeira. Para testar esta hipótese, nós avaliamos o impacto das três mutações, relatadas mais no início por Cheng et ai., sobre a transcrição gênica global. Nós selecionamos dois mutantes com mutações dentro das regiões de codificação do gene ECHJj660 que codifica uma proteína semelhante a fago (ECH_0660) e do gene ECHjO379 que codifica uma proteína anti-porter (ECHJ3379). A mutação de inserção no gene ECHJ3660 é localizada na posição de nucleotídeo 213 do quadro aberto de leitura de 555 bases de comprimento. Similarmente, a mutação no gene ECHJ3379 é localizada na posição de nucleotídeo 682 do quadro aberto de leitura de 1056 bases de comprimento. A terceira cepa mutante de inserção, ECH J3490, tem a mutação de inserção 166 nucleotídeos a jusante do códon de parada do gene ECHJ3490.

[0088] Tecnologias de sequenciamento de RNA de alto rendimento (seq de RNA) provaram ser confiáveis e ferramentas robustas para determinar a atividade de transcriptoma global em bactérias intracelulares obrigatórias. Estudos genômicos comparativos identificaram várias classes de fatores de virulência envolvidos na secreção e tráfego de moléculas entre o patógeno e as células hospedeiras e na modulação da

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58/86 resposta imune do hospedeiro. Entretanto, estudos focados na expressão de gene de Ehrlichia foram limitados principalmente para genes de proteínas de membrana externa, genes do Sistema de Secreção Tipo IV (T4SS), genes de proteína de repetição em tandem (TRP) e genes de repetição de anquirina (Anks). Dentre eles, os genes que codificam proteínas de T4SS e proteínas de p28-OMP foram descobertos serem críticos para a patogenicidade.

[0089] A natureza intracelular obrigatória de E. chaffeensis apresenta um desafio em obter Ehrlichia isento de célula de células hospedeiras. Restrições técnicas em isolar RNA de Ehrlichia de RNA de hospedeiro altamente abundante permanecem um impedimento no perfiIhamento de transcritos de patógeno. Para superar esta limitação, nós usamos uma estratégia de lise celular eficaz seguido por centrifugação com gradiente de densidade. Além disso, nós enriquecemos o RNA de Ehrlichia removendo-se eficientemente o RNA poliadenilado (RNA poli(A)) e RNAs ribossômicos eucarióticos e procarióticos de misturas de RNA do hospedeiro e bacteriano. O sequenciamento do RNA enriquecido auxiliou na detecção de transcritos para 66 a 80 % dos genes de E. chaffeensis anotados como para o genoma anotado: GenBank #CP000236.1. A comparação de níveis de transcrito de cepas do tipo selvagem e mutantes revelou o grau mais alto de modulação em genes proteicos imunogênicos e secretórios, particularmente nas cepas mutantes de ECHJj490 e ECHJ3379, enquanto mudanças mínimas foram observadas na cepa mutante de ECHJ3660.

Resultados

Isolamento e purificação de E. chaffeensis isenta de célula de células hospedeiras

[0090] O maior desafio de compreender os estudos de transcriptoma de patógenos intracelulares é a dificuldade em isolar bactérias livres de célula de hospedeiro e subsequentemente recuperar o RNA

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59/86 bacteriano de alta qualidade. Organismos riquetsianos, incluindo E. chaffeensis, constituem apenas uma fração muito pequena de RNA total isolado. Por causa da presença de RNA de célula hospedeira altamente abundante, a recuperação do RNA bacteriano é um desafio para executar experimentos de análise de seq de RNA. Neste estudo, nós primeiro purificamos as bactérias isentas de célula hospedeira de células hospedeiras infectadas (linhagem de célula de macrófago canina, DH82) utilizando-se um método eficiente de lise celular, ligado com protocolos de centrifugação de gradiente de densidade. A lise de célula hospedeira foi realizada para romper eficientemente as células hospedeiras sem causar um dano maior às bactérias. Organismos de E. chaffeensis são cerca de 0,5 a 1 pmem diâmetro. Portanto, o lisato de célula hospedeira infectado foi filtrado através de membrana de 2 pm para remover a maioria dos fragmentos da célula hospedeira. Uma centrifugação de gradiente de densidade de Renografin de alta velocidade da suspensão celular de E. chaffeensis resultante auxiliou em peletizar bactérias enquanto fragmentos da célula hospedeira permaneceram na camada de topo da solução. Depois do isolamento de RNA total e tratamento de DNase, a análise com Bioanalisador revelou que apesar do fracionamento anterior de bactérias isentas de célula hospedeira, o 28 S e 18 S RNA do hospedeiro permaneceu em concentrações altas no RNA recuperado. O enriquecimento de mRNA bacteriano foi realizado suprimindo-se o RNA poli(A) do hospedeiro e RNA ribossômico eucariótico usando um protocolo de enriquecimento de RNA bacteriano, resultando em níveis quase indetectáveis de 28S e 18S RNA do hospedeiro. A ausência de DNA genômico de E. chaffeensis contaminante nas amostras de RNA purificadas foi confirmada por PCR quantitativa em tempo real usando iniciadores de gene de 16S rRNA de E. chaffeensis. Nós também confirmamos a ausência de sequências de DNA nos dados brutos de seq de RNA alinhando-se 20 sequências que não de codificação

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60/86 de DNA intergênicas de E. chaffeensis aleatoriamente selecionadas (dados nâo mostrados).

Transição ubíqua de genes em mutantes de E. chaffeensis

[0091] Illumina HiSeq. 4000 seq de RNA de tipo selvagem e mutantes de E. chaffeensis foram geradas entre 75 a 130 milhões de leituras. Os dados de transcriptoma foram depositados no NOB! Bio-Project ID:PRJNA428837 e SRA access:SRP128532 (encontrado na web no sítio ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP128532). Apesar da supressão eficiente de RNA ribossômico do hospedeiro, apenas uma fração (menos do que 19 %) de leituras foi mapeada para genomas de E. chaffeensis. O mapeamento das leituras (mínimo de 10 leituras/gene) identificou cerca de 66 a 80 % dos genes sendo expressados do genoma de Ehrlichia como para o genoma anotado (GenBank# CP000236.1); o transcriptoma dos organismos do tipo selvagem (n - 3) continham transcritos para cerca de 920 genes do total de 1158 genes e similarmente 888, 895 e 768 transcritos de gene (n = 3) foram identificados em organismos mutantes ECHj0660, ECH J3379 e ECH J3490, respectivamente (Tabela 3). Os dados de seq de RNA replicados do tipo selvagem (R² - 0,9) e mutantes de ECHJ3379 (R²-0,93), ECHJM90 (R²-0,68) e ECHJ3660 (R² ·· 0,89) mostrou um alto grau de correlação da expressão. Os dados de expressão de gráfico de dispersão do tipo selvagem vs. ECHJ3379 (R² = 0,18) e tipo selvagem vs. ECH___0490 (R² = 0,38) mostrou uma correlação negativa. Notavelmente, o gráfico de expressão do tipo selvagem vs. ECHJ3660 mostrou uma correlação positiva (R²~0,96). Apenas transcritos com leituras por quilobase de transcriptoma por milhão de leituras mapeadas (RPKM) > 1 foram considerados para análise diferencial de expressão.

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Tabela 3

N² de genes identificados (>3 RPKM, mínimo de 10 leituras)

Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Média (desvio padrão)

Tipo selvagem	888	900	973	920 (46)
ECH__0379	920	882	883	895 (21)
ECH_0490	841	670	793	768 (88)
ECHJ3660	780	917	969	888 (97)

Transcriptoma global de E. chaffeensis

[0092] Distribuição dos transcritos em E. chaffeensis do tipo selvagem incluiu 481 transcritos representados por menos do que cinco transcritos, seguido por transcritos de proteína hipotéticos (178) representando 19 % de transcriptoma e 127 transcritos de gene de proteína ribossômica (14 %). Transcritos das principais proteínas de membrana externa (22 transcritos) representam o próximo grupo mais abundante. Transcritos de proteína de domínio conservado codificados de 14 genes são associados com o complexo de NADH desidrogenase i. Outros genes altamente expressados incluíram chaperonas moleculares, ATP sintase, proteína de membrana putativa, citocromo c oxidase, proteína de ligação a GTP, lipoproteína putativa, fator de alongamento da tradução, transportador de ABC e DNA polimerases; todos os quais representaram 0,5 a 1,7 % do transcriptoma.

[0093] A mutação de ECHjO379 causou infrarregulação transcricional de muitos genes envolvidos na atividade de antiporter, proteínas de fago e aqueles envolvidos no transporte e função da transcrição.

[0094] A expressão diferencial de gene (DGE) foi determinada comparando-se os valores de expressão de RPKM de mutantes e tipo selvagem. Modulações foram consideradas significativas com um valor de

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62/86 p < 0,05, Taxa de Descoberta Falsa (FDR) < 0,001 e consistência de valores de expressão valores entre as réplicas. A mudança na expressão de gene não foi significativa entre o tipo selvagem e mutantes para genes de manutenção. Com base nestes critérios, 41 genes foram identificados como predominantemente infrarregulados e dois genes foram suprarregulados no mutante de ECH_0379 comparado ao tipo selvagem (Tabela 4). Os genes mais proeminentes que mostraram uma diminuição significativa nos níveis de transcrição foram aqueles que codificam proteínas antiporter, transportadores de ABC e Clp protease dependente de ATP (ECHJ3367). Quatro genes de proteína antiporter: antiporter de cátion/próton monovalente (ECH_0466), subunidade C de antiporter Na(+)/H(+) (mrpC) (ECHJM69), proteína de captação de potássio TrkH (ECEM093) e proteína de regulação de nitrogênio NtrY (ECH_0299) mostrou um declínio significativo nos níveis de transcrito. Além disso, transcritos para transportadores de duas membranas: transcrito de proteína permeasse de transportador de ABC catiônico do gene ECHjO517 e um outro transcrito de proteína permeasse de transportador de ABC do gene ECHJ3972 foram infrarregulados. Três genes que codificam proteínas semelhantes a fago {prohead protease de fago (ECH_0032), proteína portal de fago (ECHJ3033) e proteína de capsídeo principal de fago (ECH_0830)} também foram infrarreguladas na cepa mutante. Transcritos para 6 genes envolvidos na transcrição, isto é, proteína de reparo e replicação de DNA RecF (ECHJ3076), formamidopirimidina-DNA glicosilase (ECHJJ602), dimetiladenosina transferase (ECH J3648), proteína de ligação a GTP EngA (ECHJ3504), leuciltRNA sintetase (ECH_0794) e endonuclease III (ECH_0857) também foram infrarreguladas nesta cepa mutante. As enzimas de processos metabólicos tais como glutamato cisteína ligase (GCL) (ECH_0125), flavoproteína de metabolismo de DNA/pantotenato (PMF) (ECHJJ374), ATPase, AGF1 (ECHJJ392), uroporfirinogênio III sintase (UPGS)

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63/86 (ECH_0480), diaminopimelato descarboxhase (DAPDC) (ECHJ3485), biotina-acetil-CoA-carboxilase ligase (BACL) (ECH....0848) e argininessuccinato liase (ASL) (ECHJ3937) também são infrarreguladas. Transcritos para 8 genes de proteína hipotética; ECHJjO21, ECHJ3161, ECH....0264, E CH... 0289, ECH..0725, ECH...0879, ECH..0913 e ECHJ053 também estavam entre os genes infrarregulados neste mutante.

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Tabela 4

ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH_0379 (RPKM)	Modulação (ECH_0379/Tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
Genes infrarregulados
ECH__0021 391	211	-1,88	proteína hipotética conservada
ECH__0032 82	26	-3,2	prohead protease de fago, família HK97
ECH__0033 41	20	-1,53	proteína portal de fago, família HK97
ECH__0076 287	59	-5	proteína de reparo e replicação de DNA putativa
			RecF
ECH_0125 386	185	-2,08	glutamato-cisteína ligase
ECH__0161 81	42	-1,92	proteína hipotética
ECH__0188 586	121	-5	proteína de superfície putativa
ECH__0264 814	194	-4,16	proteína hipotética conservada
ECH__0289 102	52	-1,96	proteína hipotética
ECH__0299 1432	442	-1,81	proteína de regulação de nitrogênio putativa NtrY
ECH__0367 3407	1784	-1,92	Clp protease dependente de ATP, subunidade de
			ligação a ATP CIpB

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH...0379 (RPKM)	Modulação (ECH_0379/Tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECH__0374 411	157	-2,63	proteína da família de flavoproteína de metabolismo de DNA/pantotenato
ECH__0392 845	159	-5,55	ATPase, família de AFG1
ECH_0466 432	252	-1,72	antiporter de cátion/próton monovalente
ECH__0469 137	52	”5,55	subunidade C de antiporter de Na(+)/H(+)
ECH__0473 793	306	-5,55	família de proteína rica em aromáticos
ECH__0480 319	92	-3,22	uroporflrinogênio-llI sintase
ECH__0485 537	172	“3,14	diaminopimelato descarboxilase
ECH__0504 859	288	“3,03	proteína de ligação a GTP EngA
ECH__0517 503	52	”10	transportador de ABC de cátion putativo, proteína permease
ECH_0523 1525	159	~10	proteína de domínio conservado
ECH__0541 251	124	”2	proteína da família de 5-formiltetraidrofolato ciclollgase
ECH_0602 84	24	“3,57	formamidopirimidina-DNA glicosilase
ECH__0648 399	138	-2,94	dimetiladenosina transferase

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH...0379 (RPKM)	Modulação (ECH_0379/Tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECH__0725 648	280	-2,32	proteína hipotética conservada
ECH__0756 815	153	-5,55	proteína de tolerância a ion bivalente CutA1
ECH__0789 1154	363	-3,22	proteína de biogênese do tipo citocromo c CcmE
ECH__0794 1593	306	-5,26	leucil-tRNA sintetase
ECH_0830 397	123	-3,22	proteína de capsideo principal de fago, familia HK97
ECH__0848 1015	253	-4	biotina—acetil-CoA-carboxilase ligase
ECH.0857 638	311	-2,04	endonuclease III
ECH__0864 455	246	“1,85	proteína de domínio conservado
ECH__0879 520	153	”3,44	proteína hipotética
ECH__0913 570	114	~5	proteína hipotética conservada
ECH_0937 521	284	”1,85	argininossuccinato liase
ECH__0972 524	285	-1,85	transportador de ABC, proteína permease
ECH__0998 722	332	”2,17	biossíntese de ubiquinona/menaquinona metil- transferase UbiE
ECH__1053 541	248	-2,22	proteína hipotética conservada

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH...0379 (RPKM)	Modulação (ECH_0379/Tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECHJ063 201	106	-1,92	metilase de modificação, família HemK
ECH__1081 310	78	-4	proteína da família SURF1
ECHJ084 684	364	-1,88	proteína AraM
ECH.1093 973	320	--2,32	proteína de captação de potássio putativa TrkH
ECH_1101 1143	190	-6,25	pró-lipoproteína diacilgliceril transferase
Genes suprarregulados ECH__0684 1765	3651	2,06	proteína de repetição de anquirina
ECH__0495 942	1492	1,58	proteína do sistema de secreção tipo IV VirB4

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Regulação transcricional diferencial de genes de agrupamento de gene T4SS e p-28 QMP em mutante de ECH 0490

[0095] Na cepa mutante de ECHJj490, 37 genes foram significativamente infrarregulados e 17 genes foram suprarregulados (Tabela 5). Quatro dos genes infrarregulados pertencentes ao T4SS são ECH j3494 (VirB3), ECHjO496 (VirB6), ECHJ)498 (VirB6) e ECHJD499 (VirB6); e uma proteína de fusão de membrana de secreção do tipo I (T1 SSJHIyD) (ECH JJ970). Genes chaperonas moleculares, tais como uma proteína de chogue frio (CSP) (ECH_0298) e Clp protease dependente de ATP e uma subunidade de ligação a ATP CIpA (CIpA) também foram infrarregulados. As proteínas de transporte incluindo a proteína de membrana de exportação de proteína (SecF) (ECHJ3095), pré-proteína translocase (SecY) (ECHJ3428), proteína de captação de potássio (TrkH) (ECH_1093) e proteína de regulação de nitrogênio (NtrY) (ECHJ3299) também estavam entre os genes infrarregulados. Enzimas metabólicas envolvidas em processos biossintéticos, {tetraidropiridina-2-carboxilato N-succiniltransferase (dapD) (ECHJ3058), quinona oxidorredutase (ECH_0385), metaloendopeptidase, (MEP) (ECHJ3644), peptídeo deformilase (PDF) (ECHJ3939), serina/treonina fosfatase (PSP) (ECH_0964), pirofosfatase (PPi) (ECHJ014) e orotato fosforribosiltransferase (OPRTase) (ECHJ108)}, também foram infrarreguladas. Genes relacionados à transcrição e tradução, tais como fatores de alongamento (EF-Tu) (ECHJ3515), aminoacil-tRNA sintetases (IARS) (ECH_0538), proteína de ligação a DNA (HU) (ECHJ3804), domínio de exonuclease 3-5' (ECHJ011) e regulador de resposta de ligação a DNA (ECH_1012), também foram infrarregulados.

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TABELA 5

ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM) Genes infrarregulados	Expressão de gene ECH.0490 (RPKM)	Modulação (ECH__0490/tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECH__0058 1902	1006	-1,88	2,3,4,5-tetraidropiridina-2-carboxilato N~ succiniltransferase
ECH.0085 1119	523	-2,17	transportador de ABC, proteína de ligação a ATP
ECH__0095 1921	990	“1,96	proteína de membrana de exportação de proteína SecF
ECH__0264 814	310	-5,55	proteína hipotética conservada
ECH...0298 8295	3870	-2,17	proteína de choque frio, família CSD;
ECH__0299 719	314	-2,17	proteína de regulação de nitrogênio putativa NtrY
ECH__0300 557	283	-2	ribonuclease D putativa
ECH__0385 1659	663	~2,5	quinona oxidorredutase
ECH.0428 979	425	”2,32	pré-proteína translocase, subunidade SecY
ECH__0470 1220	598	-2	ribonuclease, família Rne/Rng

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH__0490 (RPKM)	Modulação (ECH_0490/tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECH__0475 977	444	-2,22	proteína particulada de reconhecimento de sinal
ECH__0483 158	77	-2,04	proteína primossômica N
ECH__0494 2326	1034	-2,17	proteína do sistema de secreção tipo IV VirB3
ECH__0496 1059	435	”2,43	proteína do sistema de secreção tipo IV VirB6
ECH_0498 1154	490	-2,38	proteína do sistema de secreção tipo IV, família VirB6
ECH__0499 1129	558	-2	proteína do sistema de secreção tipo IV,família VirB6
ECH__0515 1968	910	”2,17	fator de alongamento de tradução Ts
ECH__0525 1055	427	”2,5	proteína de domínio conservado
ECH__0538 729	355	”2,08	isoleucil-tRNA sintetase
ECH_0567 626	177	“3,57	Clp protease dependente de ATP, subuni dade de ligação a ATP CIpA
ECH_0585 475	229	-2,08	proteína de domínio conservado

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH__0490 (RPKM)	Modulação (ECH_0490/tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECH... 0644 1902	764	-2,5	metaloendopeptidase putativa, família de glicoprotease
ECH__0700 2670	1073	-2,5	proteína hipotética
ECH__0804 3113	1292	-2,43	proteína de ligação a DNA HU
ECH__0820 409	167	-2,5	proteína hipotética conservada
ECH__0840 935	296	-3,22	2-poliprenilfenol 6-hidroxilase
ECH....0939 752	276	-2,77	polipeptídeo deformilase putativa
ECH__0953 2914	1480	-2	proteína ribossômica L7/L12
ECH... .0964 1281	557	-2,32	serina/treonlna fosfoproteina fosfatase
ECH.0970 474	247	-1,92	proteína de fusão de membrana de secreção do tipo I, família HlyD
ECHJ011 2253	1104	-2,04	proteína da família de exonuclease 3-5'
ECH.1012 3353	1605	-2,08	regulador de resposta de ligação a DNA
ECH__1014 1661	536	-3,12	pirofosfatase inorgânica
ECH....1093 973	416	-2,38	proteína de captação de potássio putativa TrkH
ECH 1108 1903	938	-2,04	orotato fosforrlbosiltransferase

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ID do gene Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene ECH__0490 (RPKM)	Modulação (ECH_0490/tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
ECHJ139 545	285	-1,92	proteína de membrana externa principal OMP-1D
Genes suprarregulados
ECH__0009 7047	16828	2,38	proteína de membrana putativa
ECH__0039 316	931	2,94	proteína de superfície imunodominante de 120 kDa
ECH.0166 42488	96364	2,26	proteína hipotética conservada
ECH__0167 718	2654	3,70	triptofanil-tRNA sintetase
ECH.0169 161	397	2,46	proteína de biossintese de riboflavina RibD
ECH__0230 991	4109	4,15	proteína de membrana putativa
ECH.0251 1042	2185	2,1	proteína hipotética
ECH_0303 1018	2856	2,80	proteína da família BolA
ECH__0367 849	1274	2,49	Clp protease dependente de ATP, subunidade de ligação a ATP CIpB
ECH_0450 1261	3710	2,94	proteína hipotética conservada
ECH__0531 1363	11788	8,65	proteína hipotética

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ID do gene Expressão de gene do	Expressão de gene ECH__0490 (RPKM)	Modulação (ECH_0490/tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
tipo selvagem (RPKM)
ECH__0630 732	1688	2,30	andaime de montagem de agrupamento de FeS IscU
ECH__0655 1840	2763	2,03	fator sigma-32 de RNA polimerase
ECH__0753 1932	4153	2,15	proteína hipotética conservada
ECH.0818 374	1222	3,26	transportador da família de facilitador prin cipal
ECH__0878 217	1126	5,17	proteína hipotética
ECHJ121 1578	3132	3,1	proteína de membrana externa principal Omp-1N
ECH__1136 698	8270	2,37	proteína de membrana externa principal OMP-1B
ECHJ143 3957	8359	2,24	proteína de membrana externa principal P28
ECHJ146 190	1100	6,73	proteína de membrana externa principal

P2S-2

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[0096] Genes de proteína suprarregulados neste mutante incluíram 7 que pertenceram à categoria de proteína de transmembrane. Destes, quatro pertenceram ao agrupamento de gene p-28 OMP {ECHJ143 (OMP-P28), ECHM146 (OMP-p28-2), ECH_1136 (OMP-1B) e ECHJ121 (OMP-1N)}. Além disso, dois genes de proteína de membrana putativa (ECHJ3009, ECHJj230) e um gene de proteína de superfície imunodominante (ECHJD039) foram suprarregulados. Transcritos para as proteínas de choque térmico Clp protease dependente de ATP, CIpA (ECHJJ567) e chaperona de ligação a ATP, CIpB (ECHJJ367) e o fator sigma de RNA polimerase associado à resposta ao estresse (RpoH) (ECH JJ655) também foram suprarregulados. Transcritos para dois genes que codificam partículas de ferro e enxofre {Proteína da família BolA (ECHJ3303) e andaime de montagem de agrupamento de FeS (IscU) (ECH_0630)} foram similarmente suprarregulados. Nós observamos a expressão diferencial de seis genes de proteína hipotética, que incluíram ECH_0166, ECH__0251, ECHJ)450, ECH_0531, ECHJ3753 e ECH...0878.

[0097] A mutação em gene ECHJ3660 levou a alterações transcricionais mínimas.

[0098] Embora nós observemos mudanças drásticas de expressão de gene tanto em mutantes de ECHJ3379 e ECH JJ490, o transcriptoma mutante de ECH jO66O mostrou variações mínimas comparado ao tipo selvagem; nós observamos apenas cinco genes como notavelmente di~ ferencialmente expressados neste mutante (Tabela 6). Os genes incluíram proteína de regulação de nitrogênio (NtrY) (ECH J3299) e o transportador de ABC proteína permease (ECHJ3972) como genes infrarreguiados, ao passo que a proteína exportadora de heme CcmA (ECHJ3295) e chaperonina (ECH JJ364) foram suprarreguladas. Nós também identificamos vários genes comumente diferencialmente expressados em ECHJj379 e ECHJD490 (Tabela 7). A ribonuclease D

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75/86 (ECH_0300) e proteína de captação de potássio (ECHJ093) foram comumente infrarreguladas em ECHJ3379 e ECHj3490. O gene VirB4 de proteína T4SS foi infrarregulado em mutante de ECH_0490, ao passo que este gene foi suprarregulado em mutante de ECHJ3379. Contrário a isto, CIpB foi infrarregulado em mutante de ECHJ3379 e suprarregulado em mutante de ECH_0490.

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TABELA 6

ID do gene Expressão de gene do	Expressão de gene ECH_0660 (RPKM)	Modulação (ECH_0660/Tipo selvagem) FDR < 0,001, valor de p <0,05	Nome do gene
tipo selvagem (RPKM)
Genes infrarregulados ECH.0299 1432	720	-2	proteína de regulação de nitrogê-
ECH__0972 524	309	-1,69	nio putativa NtrY transportador de ABC, proteína
Genes suprarregulados ECH__0295 336	631	1,87	permease exportador de heme putativo prote-
ECH__0364 6801	12150	1,78	ína Cem A chaperonina, 10 kDa
ECHJ147 1982	4756	2,39	proteína hipotética conservada

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TABELA 7

ID do gene	Expressão de gene do tipo selvagem (RPKM)	Expressão de gene mutante (RPKM)	Modulação FDR< 0,001, valor de p < 0,05	Nome do gene	mutantes
Genes infrarregulados
ECH-0299	1432	442	-1,81	proteína de regulação de nitrogênio putativa I NtrY	ECH-0379 ECH-0490
ECH„Q264	814	310	”2,63	proteína hipotética conservada \|	ECH-0379 ECH.0490
ECH-0300	557	283	”2	ribonuclease D putativa \|	ECH-0379 ECH-0490
ECH„Q864	279	193	”1,44	proteína de domínio conservado \|	ECH-0379 ECH-0490
ECHJ093	972	416	”1,81	proteína de captação de potássio putativa TrkH	ECH-0379 ECH-0490
ECH_0495	833	517	”1,63 \|	proteína do sistema de secreção tipo IV VirB4 \|	ECH„Q490
ECH„0367	3407	1783	”1,92	Clp protease dependente de ATP, subunidade de ligação a ATP CIpB	ECH„0379
ECH_0745	712	437	“1,63	proteína de domínio conservado \|	ECH-0379
Suprarregulado
ECH-0495	942	1492	1,58	proteína do sistema de secreção tipo IV VirB4 \|	ECH-0379
ECH„Q367 \|	849	1275	2,49	Clp protease dependente de ATP, subunidade I de ligação a ATP CIpB	ECH-0490
ECH„Q745	547	920	1,68	proteína de domínio conservado \|	ECH-0490 .....................................J

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Validação dos dados de seq de RNA por PCR de transcrição reversa em tempo real quantitativa

[0099] Análise de PCR de transcriptase reversa quantitativa em tempo real quantitativo (qRT-PCR) foi realizada em treze genes aleatoriamente selecionados identificados como diferencialmente transcritos de acordo com os dados de seq de RNA. Para gerar dados de qRTPCR, nós primeiro normalizamos amostras de RNA a um gene de E. chaffeensis constitutivamente expressado que codifica o 16S RNA como previamente descrito em Cheng et al. A abundância de transcrito para 7 genes infrarregulados em mutante de ECHJ379, incluindo EC H... 0466 e mrpC, CIpB, ECH__0033, NtrY, TrkH e ECHJ3972 foi validada. Similarmente, 6 genes suprarregulados de cepa mutante de ECH_0490, incluindo quatro transcritos pertencendo a um agrupamento de gene OMP (OMP~p28, OMP-1 Β, OMP-1N, OMP-p28~2) e um de cada um dos genes CIpB e RpoH foram verificados por qRT-PCR. Do mesmo modo, a infrarregulação de transcritos para os genes ECH__0299 e ECHjO972 foi confirmada em mutante de ECH___0660 por qRT-PCR.

Debate

[00100] O isoiamento de RNA bacteriano isento de célula de RNA de hospedeiro altamente abundante é o primeiro desafio no perfilhamento transcricional de patógenos intracelulares. Rickettsiales requer cultivar em células hospedeiras e depois precisam ser purificados antes de extrair o RNA para experimentos de avaliação de transcriptoma. Para documentar o impacto de três mutações de transposon sobre a transcrição de E. chaffeensis, primeiro desenvolveu-se um método para o isolamento e purificação de organismos de E. chaffeensis isentos de célula hospedeira, dos quais isolou-se o RNA e depois submeteu-se à análise de sequenciamento de nova geração (NGS). Para isolar E. chaffeensis isenta de célula, iniciou-se com um protocolo de lise de célula hospedeira eficiente e depois filtração de lisato de célula integral, seguido por

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79/86 uma centrifugação de gradiente de densidade de renografin. O segundo desafio foi obter RNA isento de célula hospedeira para perfilhamento de transcriptoma. Estudos prévios relatam que métodos de enriquecimento de RNA bacteriano resultam no enriquecimento de leituras de RNA bacteriano apenas de 3 a 10 %. O isolamento de bactérias isentas de célula hospedeira e as etapas de purificação de RNA bacteriano implementadas no estudo permitiram um maior enriquecimento de RNA de E. chaffeensis. Nos estudos correntes, enriqueceu-se o RNA bacteriano, que ajudou em gerar até 19 % de leituras de RNA de mapeamento alto. Notavelmente, análise de sequenciamento de RNA profundo auxiliou no mapeamento em 80 % de genes de E. chaffeensis expressados em células hospedeiras de macrófago infectado.

[00101] Entre os genes altamente expressados, o agrupamento de multigene p28-OMP foi dominante no transcriptoma. O loco de multigene p28-OMP de E. chaffeensis contém 22 genes arranjados em tandem que codificam as proteínas imunodominantes bacterianas. A presença de todos os 22 transcritos nos dados de seq de RNA sugere que o agrupamento de gene está entre os genes mais abundantemente expressados. Estas observações são compatíveis com o estudo proteômico prévio onde nós relatamos a abundância de expressão de genes p28-OMP. Genes do complexo de NADH desidrogenase I também foram altamente expressados em E. chaffeensis. NADH desidrogenase agiu contra a resposta de NOX2 fagossômico para inibir a apoptose 34 da célula hospedeira. Proteínas efetoras T4SS em algumas bactérias patogênicas são consideradas como importantes em manipular uma expressão de gene hospedeiro para enfraquecer a resposta imune do hospedeiro. As contribuições de efetores de T4SS na patogenicidade já são relatadas para rickettsiales, incluindo para A. marginale, A. phagocytophilum, E. canis e E. chaffeensis. A análise de seq de RNA identificou vários transcritos que codificam proteínas de T4SS, incluindo VirB3,

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B4, B6, B8, B9, B10 e B11. Genes de proteína chaperona DnaK, DnaJ, GroE e CIpB também foram altamente expressados tanto em cepas do tipo selvagem quanto em cepas mutantes. A presença de tais proteínas envolvidas na homeostase celular e na resposta a estresse oxidativo é relatada em outros rickettsiales, sugerindo que seus produtos genéticos também são críticos para a resposta ao estresse de E. chaffeensis se o proteoma do patógeno for similarmente alterado como para o transcriptoma relatado no estudo corrente. De fato, nosso estudo recente sugere que as proteínas de resposta ao estresse são importantes para E. chaffeensis. Outros genes de proteína altamente expressados incluíram aqueles que codificam proteínas ribossômicas de manutenção envolvidas na síntese de proteína, proteínas de membrana putativas, transportador de ABC e lipoproteina; todos os quais são provavelmente importantes para a síntese de proteína do patógeno, transporte, tráfego e secreção de efetor nas células hospedeiras. A subunidade de ATP sintase, citocromo c oxidase, DNA polimerases, proteína de ligação a GTP e fatores de alongamento de tradução envolvendo metabolismo energético, divisão celular e regulação transcricional também estavam entre os genes altamente expressados tanto em organismos do tipo selvagem quanto mutantes. A extensão da cobertura de transcriptoma é mais alta do que o previamente relatado para E. chaffeensis em células de carrapato ISE6 e AAE2 8. Isto é substancial tanto para a detecção realçada de transcritos de patógeno intracelulares quanto também por causa da abundância de expressões de gene observadas. A cobertura mais alta do transcriptoma provavelmente resultou de sequenciamento profundo dos RNAs por sequenciamento de nova geração comparado à análise de microarranjo. Este conjunto global de genes altamente expressados pode representar produtos envolvidos em patogenicidade, replicação e sobrevivência de E. chaffeensis em ambiente de célula hospedeira. Quatro transcritos que codificam proteínas de repetição de anquirina,

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81/86 que são mostrados como mediando as interações proteína-proteína, também foram identificados no transcriptoma. Notavelmente, o transcriptoma dos organismos do tipo selvagem e mutantes continha 216 transcritos que codificam proteínas hipotéticas com função desconhecida. Visto que estes estavam dentro do transcriptoma de núcleo, nós antecipamos que eles representam um importante conjunto de genes transcritos para replicação de E. chaffeensis.

[00102] A transcrição de números grandes de genes em mutante de ECHJ3379 foi descoberta ser reduzida comparado ao tipo selvagem. Genes representando antiporteres, transportadores de ABC, chaperonas, enzimas metabólicas e reguladores de transcrição estão entre os genes infrarregulados (Tabela 4). Nós prognosticamos que a mutação no gene de proteína antiporter causou uma depressão metabólica. Proteínas antiporter e de transporte desempenham um papel importante no transporte de ions e solutos através das membranas celulares das bactérias. Antiporteres são proteínas de membrana integrais que realizam o transporte secundário de Na+ e/ou K+ para H+ através de uma membrana de fosfolipídeo. O genoma de E. chaffeensis contém vários genes tendo homologia a proteínas antiporter ou suas subunidades, sugerindo que eles são necessários para a replicação intrafagossômica do patógeno e sobrevivência em um hospedeiro. Em particular, antiporteres auxiliam as bactérias em manter as condições de pH, sal e temperatura. Nós observamos um declínio significativo na transcrição de genes antiporteres tais como subunidade C de cátion monovalente/H + antiporter (ECHJ3469) e ECH jO466. Interromper a função de antiporter ou impedir sua expressão pode afetar o crescimento do patógeno in vivo. De fato, a mutação no gene ECHJ3379 resultou no crescimento atenuado do organismo tanto em um hospedeiro secundário (cão) quanto no hospedeiro de depósito (cariacu). Transportadores de ABC também estão envolvidos na captação de ions e aminoácidos e podem desempenhar um papel

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82/86 importante na capacidade de um patógeno de infectar e sobreviver em um ambiente de célula hospedeira. O mutante de ECH J3379 tinha níveis baixos de atividade transcricional dos genes ECHJQ517 e ECH_0972 que codificam transportadores de ABC, que funcionam em diferentes estágios na patogênese da infecção. Estas proteínas promovem a sobrevivência de patógenos nos microambientes do hospedeiro. A mutação possivelmente interfere com os mecanismos de transporte, afetando desse modo sua capacidade de infectar e sobreviver em células hospedeiras. A mutação também pode ter causado alterações às transcrições de genes envolvidos em respostas fisiológicas, tais como regulação das atividades metabóiicas do patógeno. Também descobriu-se a infrarregulação de vários transcritos que codificam enzimas metabóiicas: glutamato-cisteína ligase, proteína da família de flavoproteína de metabolismo de DNA/pantotenato, ATPase, uroporfirinogênio-lll sintase, diaml· nopimeiato descarboxilase, biotina-acetil-CoA-carboxilase ligase e argininossuccinato liase. Em geral, a sobrevivência de um patógeno em um ambiente intracelular depende de sua capacidade de derivar nutrientes da célula hospedeira. Bactérias patogênicas usam vias metabóiicas e fatores associados à virulência que enfraquecem o sistema imune do hospedeiro de modo que eles possam derivar os nutrientes de suas células hospedeiras. É possível que a infrarregulação dos transcritos dos genes anteriormente mencionados no mutante de ECH JJ379 dificulte a resposta metabólica bacteriana e sua capacidade de derivar nutrientes do hospedeiro. A mutação também causou expressão diminuída de genes que codificam a proteína de reparo e replicação de DNA, formamidopirimidina-DNA glicosilase, dimetiladenosina transferase e leuciltRNA sintetase. Isto pode ter contribuído também para os defeitos no crescimento intracelular e sobrevivência do patógeno. Os estudos anteriores sugerem que apesar do crescimento atenuado do mutante, isto falhou ao oferecer proteção completa contra o desafio de injeção do tipo

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83/86 selvagem. Se as mudanças no transcriptoma correlacionam-se com mudanças no proteoma, variações na expressão de proteína nos organismos em relação a E. chaffeensis do tipo selvagem podem resultar em uma resposta alterada do hospedeiro, tomando assim o hospedeiro menos eficaz em iniciar uma resposta protetiva do hospedeiro quando exposto aos organismos mutantes.

[00103] Bactérias patogênicas produzem efetores de T4SS para enfraquecer a expressão de gene de célula hospedeira e contribui para a virulência bacteriana. Dados de seq de RNA sugeriram expressões declinadas de vários transcritos de gene de proteína componente de T4SS em mutante de ECHJ3490. Nós também observamos a transcrição diminuída de proteínas chaperonas e vários genes envolvidos na transcrição e mecanismo traducional e exonuclease e transcritos de gene reguladores de ligação a DNA na cepa mutante de ECH_0490. Ao contrário, CIpB (uma proteína de choque térmico de resposta a estresse principal) e RpoH (subunidade transcricional de RNA polimerase de resposta ao estresse) mostrou transcrição aumentada no mutante.

[00104] Proteínas chaperonas desempenham um papel-chave na desagregação de proteína e em auxiliar o patógeno a superar o estresse provavelmente induzido por célula hospedeira. CIpB reativa as proteínas agregadas que acumulam sob condições de estresse e foi abundantemente expressado durante o estágio de replicação de E. chaffeensis. Impedir ou reduzir a agregação de proteína e a inativação de proteína associada durante o crescimento bacteriano dentro de uma célula hospedeira pode beneficiar o patógeno em realçar sua sobrevivência. O regulador de transcrição de RNA polimerase, RpoH, também é importante para o crescimento contínuo do patógeno visto que ele auxilia em promover a expressão das proteínas de resposta ao estresse. Compatível com o prognóstico, a expressão aumentada de CIpB e RpoH foi

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84/86 observada no estudo corrente para o mutante de ECHJ3490. A expressão realçada destes dois genes importantes provavelmente permite que o mutante cresça similarmente a E. chaffeensis do tipo selvagem em hospedeiros vertebrados e de carrapato, como relatado em nossos estudos prévios. Proteínas de membrana externa realizam uma variedade de funções tais como invasão, transporte, resposta imune e adesão que são vitais para a sobrevivência de espécies de Ehrlichia, incluindo E. chaffeensis e E. ruminantium em um hospedeiro. O mutante de ECHJ3490 aumentou a abundância de OMPs comparado aos organismos do tipo selvagem. Descobriram-se sete genes de transmembrana que codificam a família P28/OMP imunodominante de proteínas (OMP_p28, OMP_p28-2, OMP-1B e OMP-1N) e proteínas de membrana (ECH_0039, ECH_0009 e ECHJ3230) a serem suprarreguladas. Mudanças significativas na abundância das proteínas de membrana externa podem ser associadas com mudanças globais na arquitetura de membrana, alterando desse modo a suscetibilidade do patógeno à defesa do hospedeiro. As mudanças transcricionais observadas no mutante de ECHJ3490 podem não ter tido nenhum impacto negativo sobre o patógeno, visto que o mutante cresce similar ao patógeno do tipo selvagem tanto em cariacu (o hospedeiro de depósito) quanto em cães (um hospedeiro secundário) e em seu hospedeiro de carrapato, Ambhyomma americanum. A avaliação da atividade transcricional dos genes ECH J3490 (ácido lipoico sintetase) e ECH_0492 (transportador de ABC de fosfato putatlvo), ambos os quais são localizados a montante e a jusante da mutação de inserção de transposon, respectivamente, sugeriu que a mutação não tenha nenhum efeito sobre a transcrição destes genes. As mudanças diversas no transcriptoma do mutante, enquanto não tendo nenhum impacto perto do sítio de mutação, sugerem que a mutação impactou a expressão de gene global e ainda não afetou adversamente a sobrevivência do patógeno em hospedeiros vertebrados e de

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85/86 carrapato.

[00105] A observação mais notável foi a variação mínima aparente no transcriptoma do mutante de ECHJ3660 comparou-se a E. chaffeensis do tipo selvagem. Importantemente, a mutação dentro do gene ECHj0660 causou defeitos de crescimento severos in vivo em hospedeiros vertebrados. Além disso, a infecção com este mutante também inicia uma resposta forte do hospedeiro e confere proteção contra o desafio de infecção de patógeno do tipo selvagem. No estudo corrente, observaram-se apenas mudanças menores na expressão de gene neste mutante comparado ao tipo selvagem. As mudanças menores na expressão de gene incluiram genes que codificam proteína de regulação de nitrogênio putativa, transportador de ABC, proteína exportadora de heme e GroES, mas as variações foram significativamente menores comparado a numerosas mudanças descritas nos dois mutantes prévios. Juntamente, estes dados sugerem que a mutação em gene ECH J3660 levou a menos alterações transcricionais. Assumindo que os proteomas das cepas do tipo selvagem e mutantes de E. chaffeensis são similarmente alterados como os transcriptomas, então o proteoma do mutante de ECHJJ660 pode ser muito similar à bactéria do tipo selvagem. O maior grau de similaridade entre este mutante e o tipo selvagem pode permitir que os hospedeiros vertebrados reconheçam este mutante como muito próximos ao organismo do tipo selvagem, induzindo assim uma resposta mais forte do hospedeiro que imita a infecção do tipo selvagem. O defeito de replicação relatado mais no início com este mutante pode ter resultado devido à perda da expressão de gene de poucos genes tais como ECHjO659 e ECH_0660, enquanto mantendo a maioria do transcriptoma similar ao tipo selvagem.

Conclusões

[00106] Estudos de sequenciamento de profundidade de RNA em bactérias intracelulares ainda são um desafio principal. Os dados de seq

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86/86 de RNA relatados aqui fornecem o primeiro instantâneo de transcriptômicos comparativos de E. chaffeensis. O sequenciamento de RNA bacteriano enriquecido de cepas do tipo selvagem e mutantes produziu uma alta cobertura de genes. Uma mutação no ORF de gene ECH_0379 causou infrarregulação drástica de genes levando à depressão metabólica, que pode ter contribuído para a atenuação do mutante em hospedeiros vertebrados. Embora uma mutação a jusante da sequência de codificação de proteína de gene ECH JJ490 induzisse mudanças globais na expressão de gene, a suprarregulação de genes reguladores de resposta ao estresse pode ter ajudado o mutante a sobreviver nos hospedeiros vertebrados e hospedeiros de carrapato. Uma mutação dentro da sequência de codificação de gene ECHJ3660 resultou em poucas mudanças transcricionais, mantendo assim a integridade de seu transcriptoma similar ao tipo selvagem. Embora os dados de transcriptoma sejam sugestivos de variações de expressão de proteína, a validação experimental adicional de estudos de análise de proteína é necessária para confirmar os resultados. Juntamente, este estudo oferece a primeira descrição detalhada de dados de transcriptoma para E. chaffeensis, sugerindo que variações observadas na capacidade do patógeno de sobreviver em um hospedeiro e a capacidade do hospedeiro de induzir proteção contra o patógeno pode ser o resultado de mudanças globais na expressão de gene, que por sua vez, pode impactar as mudanças no proteoma do patógeno.

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende:

uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale tendo uma mutação de troca alélica alvejada nesta; e um componente selecionado do grupo consistindo em um veículo veterinariamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, um conservante, um tampão, um antibiótico, sobrenadante de cultura celular, um agente imunomodulador e qualquer combinação destes.

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale é selecionada do grupo consistindo nas espécies de Ehrlichia, Anapiasma, Neorickettsia, Rickettsia, Orientia e Chiamydia.

3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação

2, caracterizada pelo fato de que a espécie bacteriana de Ehrlichia é selecionada do grupo consistindo em Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ru~ minatium e Ehrlichia canis.

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a bactéria de Anapiasma é selecionada do grupo consistindo em Anapiasma phagocytophilum, Anapiasma platys e Anapiasma marginale

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mutação alélica alvejada atenua a bactéria.

6. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada inativa um gene.

7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o gene funciona como um auxiliar para

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2/6 a replicação.

8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em Ech J3379 ou Ech_066Q em Ehrlichia chaffeensis ou genes homólogos de outras cepas da mesma espécie.

9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em Ecaj_0381 em Ehrilichia canis ou em genes homólogos de outras cepas da mesma espécie.

10. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em APH_0634 em Anaplasma phagocytophilum ou em genes homólogos de outras cepas da mesma espécie.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em Ech_0660 ou um homólogo deste em outras cepas de Ehrlichia chaffeensis relacionadas ou outras espécies de Ehrlichia relacionadas e suas cepas.

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito componente é um adjuvante selecionado do grupo consistindo em uma saponina, um GMP-AMP cíclico, gel de montaníde ou qualquer combinação destes.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno de um outro organismo causador de doença.

14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria inclui uma sequência com pelo menos 70 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO. 35, 54 ou 55.

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15. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em homólogos de gene EchJD379 ou Ech_0660 de Ehrlichia chaffeensis de outras espécies de Ehrlichia.

16. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em homólogos de gene APH__0634 de Anaplasma phagocytophilum de outras espécies de Anaplasma.

17. Método de reduzir a incidência ou severidade de pelo menos um sinal clínico causado por uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:

administrar uma composição imunogênica compreendendo uma bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale tendo uma mutação de troca alélica alvejada nesta e um componente selecionado do grupo consistindo em um veículo veterinariamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, um conservante, um tampão, um estabilizante, um antibiótico, sobrenadante de cultura celular, um agente imunomodulador e qualquer combinação destes.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita composição imunogênica é administrada usando um modo de administração selecionado do grupo consistindo em intravenosamente, intramuscularmente, intranasalmente, intradermicamente, intratraquealmente, intravaginalmente, intravenosamente, intra vascularmente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, oralmente, intraquealmente, por injeção direta em qualquer tecido-alvo ou qualquer combinação destes.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita administração é seguida por uma segunda administração.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado

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4/6 pelo fato de que a dita segundo administração é pelo menos 7 dias depois da primeira administração ou em qualquer tempo posteriormente.

21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita redução em incidência é pelo menos 10 % e é em comparação a um grupo de animais que não receberam uma administração da composição imunogênica.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita redução em severidade é em comparação a um animal que não recebeu a composição imunogênica.

23. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita redução em severidade é pelo menos 10 % em comparação a um grupo de animais que não receberam uma administração da composição imunogênica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a bactéria de Rickettsiale ou Chlamydiale é selecionada do grupo consistindo em espécies de Ehrlichia, Anapiasma, Neorickettsia, Rickettsia, Orientia e Chlamydia.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a bactéria de Ehrlichia é selecionada do grupo consistindo em Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ruminatium e Ehrlichia canis.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a bactéria de Anapiasma é selecionada do grupo consistindo em Anapiasma phagocytophium, Anapiasma platys e Anapiasma marginale.

27. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada inativa um gene.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o gene inativado é envolvido na replicação.

29. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em Ech_0379

Petição 870190107992, de 24/10/2019, pág. 980/984

5/6 ou Ech_0660 em Ehrlichia chaffeensis ou em homólogos de gene tendo 70 % ou mais de homologia para Ech___0379 ou Ech___0660 e pertencendo a diferentes isolados geográficos e cepas do mesmo organismo ou outras espécies de Ehrlichia relacionadas.

30. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em Ecaj_0381 em Ehrilichia canis ou em homólogos de gene tendo 70 % ou mais de homologia para Ecaj_0381 e pertencendo a diferentes isolados geográficos e cepas do mesmo organismo ou outras espécies de Ehrlichia relacionadas.

31. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mutação de troca alélica alvejada está em APHJ3634 em Anaplasma phagocytophilum ou em homólogos de gene tendo 70 % ou mais de homologia para APH_0634 e pertencendo a diferentes isolados geográficos e cepas do mesmo organismo ou outras espécies de Anaplasma relacionadas.

32. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito componente é um adjuvante selecionado do grupo consistindo em uma saponina, um GMP-AMP cíclico, gel de montanida ou qualquer combinação destes.

33. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria inclui uma sequência com pelo menos 70 % de identidade de sequência com SEQ ID NO. 35, 54 ou 55

34. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito animal é selecionado do grupo consistindo em porcos, gado, cabras, cavalos, cães, cervo, coiote, gatos e aves domésticas.

35. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito animal é entre 3 semanas e 6 meses de idade quando recebendo a dita administração.

Petição 870190107992, de 24/10/2019, pág. 981/984

6/6

36. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita mutação alélica alvejada inativa Ech___0660 ou um homólogo deste de qualquer espécie relacionada e cepas associadas e isolados de gene.