JP2020517722A - 標的遺伝子破壊方法及び免疫原性組成物 - Google Patents

Abstract

偏性細胞内細菌における特異的遺伝子機能の破壊及びその後のその活性の復元は、複製するための宿主細胞内でのそれらの絶対的必要性に起因して、依然として極めて困難である。本発明では、リケッチア病原体であるエーリキア・シャフェンシスの２つの遺伝子を不活性化し、その後に、その２つの遺伝子のうちの一方を復元するために、標的アレル交換変異体を作製した。本方法は、エーリキア・カニス及びアナプラズマ・ファゴサイトフィルムにも成功裏に用いられた。作製された変異病原体は、リケッチア病原体による感染の発生率または重症度を低減させるための免疫原性組成物において有用である。【選択図】図１

Description

本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から交付された助成金番号ＡＩ０７０９０８の下に、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

偏性細胞内細菌における特異的遺伝子機能の破壊及びその後のその活性の復元は、複製するための宿主細胞内でのそれらの絶対的必要性に起因して、依然として極めて困難である。本発明では、本願発明者は、リケッチア病原体であるエーリキア・シャフェンシス（Ｅ．シャフェンシス）の２つの遺伝子及び遺伝的に相補された１つの遺伝子におけるアレル交換によって、標的変異体を作製した。理論上は、このアプローチは他の偏性細胞内細菌にも適用することができ、細胞内細菌でルーチン的に行われる構造−機能解析を可能にする。また、この方法は、偏性細胞内細菌の弱毒化株の生成にも適用可能であり、生ワクチン候補として有用である。

偏性細胞内細菌は、世界中の何百万もの人々に疾患を引き起こす原因となる。偏性細胞内細菌としては、リケッチア目及びクラミジア目の多くの病原性グラム陰性菌が挙げられる。エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属のリケッチア及びクラミジアにおける標的変異誘発のための効率的なシステムの欠如は、微生物の病原性を理解し、多くの細菌遺伝子の機能的意義を定義する上で、依然として大きな障害である。クラミジア及びリケッチアは、極端なゲノム減少を受けており、各病原体の大部分の遺伝子はそれらの細胞内増殖にとって重要である。そのため、偏性細胞内細菌は、それらの宿主に依存して、ゲノム減少に起因する欠損を補う。この仮説と一致して、従来研究により、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各種における予測遺伝子の約７４〜９２％が、脊椎動物及びベクターの宿主細胞内での細菌複製中に転写的に活性であることを実証されている。標的変異体の作製における課題は、変異誘発のために選択された遺伝子の本質的な性質、細胞内複製依存性、及び細胞外増殖をサポートする方法の欠如に起因し得る。トランスポゾン変異誘発を用いてランダム変異体を作製することに成功したにも関わらず、目的とする特異的遺伝子内に標的変異体を作製し、次いで補完することは困難であり、また、このことは、偏性細胞内細菌について強く求められている。

本開示は、リケッチア目細菌またはクラミジア目細菌におけるアレル交換により、少なくとも１つの安定的な標的変異体を作製する方法を提供することによって、この大きな問題を解決する。有利にことに、本開示は、複数の遺伝子を破壊または不活性化し、その後、別のアレル交換変異体によって少なくとも１つの無傷の遺伝子を復元する能力をさらに提供し、その結果、それ自体のプロモータからの不活性化された遺伝子からの復元された転写が得られる。好ましい形態では、破壊または不活性化された遺伝子は、細菌に特異的な免疫応答を誘導すると共に、偏性宿主内での細菌の複製能力を防止または少なくとも低減させる。したがって、本開示は、予防的に投与された場合にはリケッチア目及びクラミジア目に関連または起因する少なくとも１つの臨床症状の発生率または重症度を低減させ、感染後に投与された場合にはリケッチア目及びクラミジア目に関連または起因する少なくとも１つの臨床症状の期間または重症度を低減させる免疫応答を誘起する免疫原組成物において有用な弱毒化形態の細菌を提供する。

当分野において既知のように、「配列同一性」は、２以上のポリペプチド（ポリアミノ酸）配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち、基準配列とそれと比較される所与の配列との間の関係を指す。配列同一性は、所与の配列及び基準配列を最高度の配列類似性が得られるように最適にアライメントさせた後に、所与の配列を基準配列と比較することにより決定される（これらの配列のストリング間の一致によって決定される）。このようにアライメントした後、配列同一性は１つ１つの位置毎に確認される。例えば、特定の位置においてヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合は、その配列はその位置において「同一」である。このような位置同一性を有する位置の総数を基準配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割り算することにより、配列同一性のパーセントが決定される。配列同一性は、これに限定しないが、「Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)」、「Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)」、「Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)」、「Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)」、「Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)」、及び「Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)」に記載された公知の方法を用いて容易に算出することができる（これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。配列同一性を決定する好適な方法は、検査される配列間で最大の一致が得られるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定することができる公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。このようなプログラムの例には、これに限定しないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）が含まれる（これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、この教示は、参照により本明細書に含まれる）。これらのプログラムは、デフォルトギャップ重み付けを用いて所与の配列と基準配列とを最適にアライメントさせることにより、所与の配列と基準配列との間の最高レベルの配列同一性を得る。例えば、所与のポリヌクレオチドが、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有する場合、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は基準配列と同一であり、ただし、所与のポリヌクレオチド配列は基準ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド毎に１５まで、好ましくは１０まで、より好ましくは５までの点変異を含み得ることを意味する。換言すれば、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、基準配列中の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは、基準配列中のヌクレオチドの総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までの数のヌクレオチドが基準配列中に挿入され得る。基準配列のこれらの変異は、基準ヌクレオチド配列の５´末端位置または３´末端位置、あるいは、これらの末端位置間における、基準配列のヌクレオチド間に個別に散在するか、または基準配列の１以上の連続基内に散在する任意の場所で行われ得る。同様に、所与のポリペプチドが、基準アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する場合、所与のポリペプチドのアミノ酸配列は基準配列と同一であり、ただし、所与のポリペプチド配列は基準アミノ酸配列の１００アミノ酸毎に１５まで、好ましくは１０まで、より好ましくは５までのアミノ酸改変を含み得ることを意味する。換言すれば、基準アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るためには、基準配列中の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までのアミノ酸残基が欠失または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、基準配列中のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までの数のアミノ酸が基準配列中に挿入され得る。基準配列のこれらの改変は、基準アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置、あるいは、これらの末端位置間における、基準配列の残基間に個別に散在するか、または基準配列の１以上の連続基内に散在する任意の場所で行われ得る。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、保存的置換は、配列同一性を決定するときには一致に含まれない。

本明細書で使用するとき、「配列相同性」は、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、２以上の配列が最適にアライメントされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定するときには、保存アミノ酸置換は一致としてカウントされる。換言すれば、基準配列に対して９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るためには、基準配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％が別のアミノ酸もしくはヌクレオチドと一致するかまたは保存的置換を含まなければならない。あるいは、基準配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチド（保存的置換は含まない）の総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までのアミノ酸またはヌクレオチドが基準配列中に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２５０、さらに好ましくは少なくとも５００の一続きのヌクレオチドを含む。

「保存的置換」は、アミノ酸残基またはヌクレオチドを、全体的な機能性が大幅に変化しないような同様の特徴または性質（例えば、サイズ、疎水性など）を有する別のアミノ酸残基またはヌクレオチドで置換することを指す。

当業者には理解されるように、本開示の免疫原性組成物は、非経口の注射または注入用のすぐに使用可能な溶液を調製するために、既知の注射可能な、生理学的に許容される滅菌溶液を含むことができ、等張水溶液、例えば生理食塩水またはそれ対応する血漿タンパク質溶液を容易に利用することができる。加えて、本開示の免疫原性組成物及びワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定剤、またはアジュバント（補助剤）を含み得る。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースなどが含まれ得る。安定剤には、とりわけ、アルブミン、及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。

一態様では、本開示の免疫原性組成物は、追加の要素、抗原、薬学的に許容可能な担体、獣医学的に許容可能な担体、アジュバント、防腐剤、安定剤、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。

本明細書で使用するとき、「アジュバント」には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サボニン、Ｑｕｉｌ Ａ、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、モンタニドゲル、ＱＳ−２１（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、ケンブリッジ・バイオテック社（Cambridge Biotech Inc.）製）、ＧＰＩ−０１００（米国アラバマ州バーミンガム、ガレニカ・ファーマスーティカルズ社（Galenica Pharmaceuticals, Inc.）製）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは、特に、軽質液状パラフィン油（欧州薬局タイプ）、イソプレノイド油（例えば、アルケン（特に、イソブテン、デセン）のオリゴマー化により得られたスクアランまたはスクアレン油）、直鎖アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル（より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリラート／カプラート）、グリセリルトリ（カプリラート／カプラート）、またはプロピレングリコールジオレアート）、あるいは、分枝鎖脂肪酸またはアルコールのエステル（とりわけ、イソステアリン酸エステル）に基づいたものであり得る。これらの油を乳化剤と組み合わせて使用することにより、エマルジョンが形成される。乳化剤は、非イオン性界面活性剤、とりわけ、ソルビタン、マンニド（例えば、アンヒドロマンニトールオレアート）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、またはヒドロキシステアリン酸（これらは任意選択でエトキシル化される）とのエステル、並びに、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンコポリマーブロック、とりわけ、プルロニック社の製品（特に、Ｌ１２１）であることが好ましい。「Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)」を参照されたい。例えば、「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995」の１４７ページに記載されているＳＰＴエマルジョン及び同書の１８３ページに記載されているエマルジョンＭＦ５９が使用可能である。アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、または、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。好適なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーと呼ばれている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者であれば、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置換されたポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許第２、９０９、４６２号明細書も参照することができる。好ましいラジカルは、２ないし４個の炭素原子を含有するラジカルであり、例えば、ビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体が、他の置換基、例えばメチルを含有し得る。さらなる適切なアジュバントには、これに限定しないが、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバントシステム（リビ（Ribi）社製）、ブロックコポリマー（米国ジョージア州アトランタ、サイトレックス（CytRx）社製）、ＳＡＦ−Ｍ（米国カリフォルニア州エメリービル、シロン（Chiron）社製）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の易熱性エンテロトキシン（組換え型または他のもの）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、またはムラミルジペプチドが含まれる。

好ましくは、アジュバントは、１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で添加される。より好ましくは、アジュバントは、１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは、１用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは、１用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは、１用量当たり約１ｍｇの量で添加される。

加えて、本開示の組成物は、１以上の薬学的に許容される担体または獣医学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」または「獣医学的に許容される担体」は、溶媒、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、または吸収遅延剤のいずれかまたは全てを含む。

薬学的に許容可能なビヒクルは、副作用を引き起こすことなく、例えば、活性化合物の投与の容易化、寿命及び／または体内での効力の延長、溶液中での溶解度の増加、または、保存性の改善を可能にする、薬学的組成物またはワクチンに含まれる化合物または化合物の組み合わせを指すと理解されている。これらの薬学的に許容されるビヒクルは周知であり、選択された活性化合物の性質及び投与モードに応じて当業者によって適合され得る。

例えば、本開示による免疫原性組成物またはワクチンは、動物またはヒトの体重の１ｋｇ当たり約０．１〜１０００μｇの量で、一度で、または時間を置いて数回に分けて投与することができる。投与量の範囲または値としては、これに限定しないが、例えば、動物またはヒトの体重の１ｋｇ当たり、０．５〜８００μｇ、１〜１０００μｇ、１〜５００μｇ、１〜３００μｇ、１〜２００μｇ、１〜１５０μｇ、１〜１２５μｇ、１〜１００μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、及び１０００μｇが想定される。他の好ましい形態では、投与量は、動物またはヒトの体重とは無関係に設定される。

本開示によれば、本開示の免疫原性組成物またはワクチンは、Ｅ．シャフェンシス以外の少なくとも１つの別の病原体を含み得、それを組み合わせワクチンまたは免疫原性組成物にする。このような実施形態では、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を有効量で投与することにより、リケッチア細菌またはクラミジア細菌と、少なくとも１つの別の病原体とによって引き起こされる感染症に対する免疫を含む、感染症の臨床症状の重症度または発生率の低減を含む、効果的な保護を提供する。別の病原体は、好ましくは、アクチノバチルス・プルロニューモニア、アデノウイルス、アルファウイルス（例えば、東部ウマ脳炎ウイルス）、気管支敗血症菌、ブラキスピラ種（好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピオシコリ）、ブルセラ・スイス（好ましくは、生物型１、２及び３）、ブタコレラウイルス、クロストリジウム種（好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンスＡ、Ｂ及びＣ型、クロストリジウム・ノーヴィ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ）、コロナウイルス（好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス）、エペリスロゾーノシス・スイス、エリシペロスリクス・ルシオパシエ、大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス（好ましくは、亜型１、７及び１４）、血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ種（好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポチフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラジカエ、プトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナ、レプトスピラ・タラソビ）、マイコバクテリウム種（好ましくは、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・ボビス）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（M hyo）、パスツレラ・マルトシダ、ブタサイトメガロウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、ブタサーコウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ロタウイルス、サルモネラ種（好ましくは、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・コレラスイス）、スタフィロコッカス・ヒイクス、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種（好ましくは、ストレプトコッカス・スイス）、ブタヘルペスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、レプトスピラ・ハルジョー、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブタ水胞病（ＳＶＤＶ）、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。

本開示の免疫原性組成物は、１以上の他の免疫調節剤、例えば、インターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインをさらに含み得る。

本開示の免疫原性組成物は、ゲンタマイシン及びメルチオレートをさらに含み得る。

本発明に関連して有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度は、当業者によって容易に決定され得るが、本発明では、約５０μｇ〜約２０００μｇのアジュバントを含む組成物が想定される。したがって、本明細書で使用するとき、免疫原性組成物は、約１μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌの抗生物質または免疫調節剤、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質または免疫調節剤を含む組成物をさらに指す。

さらなる態様によれば、本開示の免疫原性組成物の少なくとも１回のさらなる投与が、それを必要とする対象に与えられる。本開示の免疫原性組成物の２回目またはそれ以降の投与は、１回目の投与または前回の投与から少なくとも７日の間隔を置いて行われる。好ましくは、本開示の免疫原性組成物は、免疫刺激剤と共に投与される。好ましくは、免疫刺激剤は、少なくとも２回投与されることが好ましい。免疫刺激剤の２回目の投与またはそれ以降の投与は、１回目の投与または前回の投与から少なくとも３日、より好ましくは少なくとも５日、さらにより好ましくは少なくとも７日の間隔を置いて行うことが好ましい。また、免疫刺激剤は、本開示の免疫原性組成物の最初の投与から、少なくとも１０日、好ましくは１５日、より好ましくは２０日、さらにより好ましくは少なくとも２２日の間隔を置いて行うことが好ましい。好ましい免疫刺激剤は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、好ましくは、不完全フロイントアジュバントで乳化される（ＫＬＨ／ＩＣＦＡ）。なお、当業者に既知の任意の他の免疫刺激剤も使用できることを理解されたい。本明細書で使用するとき、用語「免疫刺激剤」は、好ましくは特異的免疫応答を開始または増加させることなく、免疫応答、例えば特異的病原体に対する免疫応答を誘起することができる任意の物質または組成物を意味する。また、免疫刺激剤を適切な用量で投与することが教示される。

さらなる態様では、本開示は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属におけるアレル交換によって、少なくとも１つの安定的な標的変異体を作製する方法を提供する。

本開示のさらなる別の態様では、本開示の方法を用いて変異させたリケッチア目及びクラミジア目は、リケッチア目及びクラミジア目の病原体に対する免疫原性組成物において有用である。好ましい形態では、このような免疫原性組成物は、リケッチア目及びクラミジア目の病原体による感染に起因または関連する感染症の少なくとも１つの臨床症状の発生率または重症度を低減させるのに有効である。いくつかの好ましい形態では、このような免疫原性組成物は、臨床症状の発生率及び／または重症度を低減させるために予防的に投与される。特に好ましい形態では、臨床症状は、リケッチア及び／またはクラミジア病原体に感染するかまたは攻撃される前にこのような免疫原性組成物が投与された動物において予防される。他の形態では、このような免疫原性組成物は、リケッチア及び／またはクラミジア病原体に感染した後に投与される。このような状況では、感染に関連または起因する臨床症状は、発生率、重症度、及び／または発症期間が低減する。

さらなる態様では、安定的な標的変異体は、少なくとも１つの遺伝子の機能を破壊する。

さらなる別の態様では、破壊された遺伝子の機能を復元することができる。

本開示の一態様では、２つの遺伝子が破壊され、その後に１つの遺伝子から機能が復元されたエーリキア・シャフェンシスにおいて、安定的な標的変異体が作製される。これと同一の方法が、エーリキア・カニスを含むエーリキア種、及び、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムを含むアナプラズマ種においても成功裏に用いられた。

別の態様では、本開示は、弱毒化された細菌生物を作製するために、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及び／またはクラミジアの各種における標的化遺伝子の破壊または変異方法を提供する。弱毒化された細菌生物は、それらと同一の種によって引き起こされる毒性疾患に対する保護を付与するための有効な宿主免疫応答の誘導において有益である。

さらなる別の態様では、ヒトまたは動物において免疫応答を誘導する方法であって、本開示の免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要とする動物またはヒトに投与するステップを含む方法が提供される。加えて、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属に由来する病原体による感染に関連または起因する少なくとも１つの臨床症状の発生率及び／または重症度を低減させる方法が提供される。いくつかの形態では、感染は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・カニス、アナプラズマ・プラチス、アナプラズマ・マージナーレ、及び／またはアナプラズマ・ファゴサイトフィルムに起因または関連し、本開示の免疫原性組成物またはワクチンは、それらの種の少なくとも１つを含み、標的遺伝子の破壊または変異はそれらの種に対して行われる。このような方法は、一般的に、本開示の免疫原性組成物の投与後に、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属の種に感染したまたは攻撃された動物において、その感染及びその後に発現する臨床症状に対する免疫応答を誘導するために、免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む。いくつかの形態では、本開示の免疫原性組成物は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、またはクラミジアの改変された生体種を含む。

一態様では、本開示の免疫原性組成物は、本明細書に記載される標的変異誘発を受けたエーリキア・シャフェンシス、エーリキア・カニス、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、またはアナプラズマ・マージナーレを含む。エーリキア・シャフェンシスが変異種である場合、本開示の免疫原性組成物は、細菌を不活性化してその複製能力を阻害する変異を含む弱毒化エーリキア・シャフェンシス細菌を含むことが好ましい。いくつかの好ましい形態では、変異は、挿入または欠失である。いくつかの形態では、挿入または欠失は、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子またはＥｃｈ＿０６６０遺伝子から選択された遺伝子内の任意の場所における挿入または欠失であり、それにより、遺伝子機能を不活性化させる。いくつかの形態では、エーリキア・シャフェンシスのゲノムは、Ｅｃｈ＿０６６０（配列番号３５）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列同一性を有する配列を含む。配列比較は、エーリキア・シャフェンシスのゲノムの同一領域の非変異バージョンと比較することが好ましい。エーリキア・カニスが変異種である場合、本開示の免疫原性組成物は、細菌遺伝子を不活性化してその複製能力を阻害する変異を含む弱毒化エーリキア・カニス細菌を含むことが好ましい。いくつかの好ましい形態では、変異は、挿入または欠失である。いくつかの形態では、挿入または欠失は、Ｅｃａｊ＿０３８１遺伝子内の任意の場所における挿入または欠失であり、それにより、遺伝子機能を不活性化させる。いくつかの形態では、エーリキア・カニスのゲノムは、配列番号５４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列同一性を有する配列を含む。配列比較は、エーリキア・カニスのゲノムの同一領域の非変異バージョンと比較することが好ましい。アナプラズマ・ファゴサイトフィルムが変異種である場合、本開示の免疫原性組成物は細菌遺伝子を不活性化してその複製能力を阻害する変異を含む弱毒化アナプラズマ・ファゴサイトフィルム細菌を含むことが好ましい。いくつかの好ましい形態では、変異は、挿入または欠失である。いくつかの形態では、挿入または欠失は、ＡＰＨ＿０６３４遺伝子内の任意の場所における挿入または欠失であり、それにより、遺伝子機能を不活性化させる。いくつかの形態では、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム ＡＰＨ＿０６３４遺伝子のゲノムは、配列番号５５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列同一性を有する配列を含む。配列比較は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのゲノムの同一領域の非変異バージョンと比較することが好ましい。

本開示により提供される免疫原性組成物またはワクチン及び方法は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・カニス、及びアナプラズマ・ファゴサイトフィルムに限定されるものではなく、リケッチア目またはクラミジア目の任意のメンバー、これに限定しないが、ペラギバクテル目、ペラギバクテル科（亜群Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶ、及びＶを含む）、ペラギバクテル属、プロモミトコンドリア、アナプラズマの各科、エーリキア、アナプラズマ、ボルバキア、ネオリケッチアの各属の種、ミディクロリア科、ミディクロリア、リケッチア科、リケッチアの各種も含む。さらに、本開示の免疫原性組成物またはワクチンは、これに限定しないが、エーリキア・ルミナンチウム、エーリキア・カニス、アナプラズマ・マージナーレ、アナプラズマ・プラチス、エーリキア・ムリス、及びそれらの組み合わせをさらに含み得る。

本開示のさらなる態様では、本開示の免疫原性組成物は、本開示の方法を用いて変異されたエーリキア・シャフェンシス ＥＣＨ＿０６６０遺伝子の相同体を含む。好ましい形態では、相同体は、エーリキア、アナプラズマ、リケッチア、ネオリケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属からなる群より選択される。他の好ましい形態では、遺伝子相同体は、エーリキア・カニスのＥｃａｊ＿０３８１であり、ＧｅｎＢａｎｋの＃ＣＰ ０００１０７．１に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列相同性を有する。他の好ましい形態では、遺伝子相同体は、エーリキア・ルミナンチウムのＥｒｕｍ＿３９３０であり、ＧｅｎＢａｎｋの＃ＣＲ ７６７８２１．１に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列相同性を有する。他の好ましい形態では、遺伝子相同体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのＡＰＨ＿０６３４であり、ＧｅｎＢａｎｋの＃ＣＰ ０００２３５．１に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列相同性を有する。他の好ましい形態では、遺伝子相同体は、アナプラズマ・マージナーレのＡＭＨ＿５８１であり、ＧｅｎＢａｎｋの＃ＣＰ ００００３０．１に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列相同性を有する。他の好ましい形態では、遺伝子相同体は、エーリキア・ムリス ＡＳ１４５のＥＭＵＲ＿０２０７０であり、ＧｅｎＢａｎｋの＃ＣＰ ００６９１７．１に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、またはさらには１００％の配列相同性を有する。

本開示による免疫原性組成物は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、気管内、膣内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、経口、髄腔内、または任意の標的組織への直接注入によって投与され得る。所望の治療期間及び治療効果に応じて、本開示による免疫原性組成物は、１回または数回、または継続的に、例えば数日間、数週間、または数ヶ月間にわたって毎日、様々な用量で投与され得る。

別の態様では、本開示の免疫原性組成物は、それを必要とする少なくとも２週齢の動物に投与される。より好ましくは、本開示の免疫原性組成物が投与される動物は、２週齢〜１歳齢、さらにより好ましくは３週齢〜６カ月齢である。当然ながら、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、及び２０週以上などの他の週齢（または年齢）及び範囲も想定される。あるいは、本開示の免疫原性組成物は、リケッチア細菌またはクラミジア細菌に対する曝露の少なくとも２週間前に投与される。

いくつかの形態では、本開示の免疫原性組成物は、リケッチア目またはクラミジア目の細菌に感染した後に投与される。このような状況では、本開示の免疫原性組成物の投与により、感染に関連または起因する臨床症状の期間または重症度が低減する。

別の態様では、本開示は、免疫原性組成物であって、標的アレル交換変異体を含有するリケッチア目またはクラミジア目の細菌と、獣医学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、アジュバント、防腐剤、緩衝剤、抗生物質、細胞培養上清、免疫調節剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される成分と、を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの形態では、リケッチア目またはクラミジア目の細菌は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各種からなる群より選択される。いくつかの形態では、エーリキア種の細菌は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・カニス、エーリキア・ルミナンチウム、エーリキア・ムリス、及び／またはエーリキア・ムリス様物質からなる群より選択される。いくつかの形態では、アナプラズマ種の細菌は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、アナプラズマ・プラチス、及びアナプラズマ・マージナーレからなる群より選択される。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、遺伝子を不活性化する。いくつかの形態では、不活性化は、挿入または欠失に起因する。いくつかの形態では、不活性化は、細菌の複製能力を低減させる。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、エーリキア・シャフェンシスのＥｃｈ＿０２３０、Ｅｃｈ＿０３７９、またはＥｃｈ＿０６６０内に存在する。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、エーリキア・カニスのＥｃａｊ＿０３８１内に存在する。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのＡＰＨ＿０６３４内に存在する。

別の態様では、本開示は、リケッチアまたはクラミジア目細菌によって引き起こされる臨床症状の発生率及び重症度の少なくとも一方を低減させる方法であって、標的アレル交換変異体を含有するリケッチア目またはクラミジア目の細菌と、獣医学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、アジュバント、防腐剤、緩衝剤、抗生物質、細胞培養上清、免疫調節剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される成分と、を含む免疫原性組成物を投与するステップを有する方法を提供する。いくつかの形態では、投与ステップは、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、気管内、膣内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、経口、髄腔内、任意の標的組織への直接注入からなる群より選択される投与方法を用いる。いくつかの形態では、免疫原性組成物の投与は、第１の投与と称され、この第１の投与の後に第２の投与が行われる。いくつかの形態では、第２の投与は、第１の投与から少なくとも７日後に行われる。好ましい形態では、上記の発生率の低減は、免疫原性組成物の投与を受けた動物におけるものであり、上記の発生率の低減は、免疫原性組成物の投与を受けていない動物群と比較して少なくとも１０％である。好ましい形態では、上記の重症度の低減は、免疫原性組成物の投与を受けた単一の動物において評価され、免疫原性組成物の投与を受けていない動物と比較される。好ましい形態では、この重症度の低減は、免疫原性組成物の投与を受けた動物を、免疫原性組成物の投与を受けておらず、その後にリケッチア目細菌またはクラミジア目細菌に感染したまたは攻撃された動物と比較して少なくとも１０％である。いくつかの形態では、免疫原性組成物の投与を受けた動物群における重症度の低減は、免疫原性組成物の投与を受けていない動物群と比較して少なくとも１０％である。いくつかの形態では、リケッチア細菌またはクラミジア目細菌は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各属からなる群より選択される。いくつかの形態では、エーリキア属の細菌は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ルミナンチウム、エーリキア・ムリス、及びエーリキア・カニスからなる群より選択される。いくつかの形態では、アナプラズマ属の細菌は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、アナプラズマ・プラチス、及びアナプラズマ・マージナーレからなる群より選択される。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、遺伝子を不活化する。いくつかの形態では、不活性化は、挿入または欠失に起因する。いくつかの形態では、不活性化は、細菌の複製能力を低減させる。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、エーリキア・シャフェンシスのＥｃｈ＿０２３０、Ｅｃｈ＿０３７９、またはＥｃｈ＿０６６０内に存在する。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、エーリキア・カニスのＥｃａｊ＿０３８１内に存在する。いくつかの形態では、標的アレル交換変異体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのＡＰＨ＿０６３４内に存在する。いくつかの形態では、上記の成分は、サポニン、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、モンタニドゲル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアジュバントである。

遺伝子Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９を不活性化し、Ｅｃｈ＿０３７９の不活性化された遺伝子機能を復元するために、Ｅ．シャフェンシスにおける標的アレル交換変異体の作製に使用されるストラテジーの概略図である。図中のＡ及びＡ´は、５´及び３´相同アームを指す。 相同アームの同定を含むｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０２３０−ｔｕｆ−ａａｄＡのプラスミドマップの概略図である。この構築物のプラスミド配列データは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（登録番号＃ＭＦ０６８８０５）。 相同アームの同定を含むｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０３７９−ｔｕｆ−ａａｄＡのプラスミドマップの概略図である。全ての構築物についてのプラスミド配列データは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（登録番号＃ＭＦ０６８８０６）。 相同アームの同定を含むプラスミドマップの概略図である。この構築物のプラスミド配列データは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（登録番号ＭＦ０６８８０７）。 Ｅｃｈ＿０２３０遺伝子を破壊する標的アレル交換変異誘発を示す図であり、挿入をマッピングするために使用される制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＣｌａＩ（Ｃ））を含む、アレル交換構築物を調製するために選択された領域にわたるゲノムセグメントを示す。制限酵素部位のゲノム座標及び挿入断片（ｔｕｆ−ａａｄＡ）のサイズにより、ＰＣＲ及びサザンブロット分析で予想されるＤＮＡサイズを決定した。 アレル挿入（１及び４と同定されたプライマー）及び挿入されたＤＮＡ（プライマー２及び３）の上流及び下流のゲノム領域を標的とするプライマーを使用して、３つの異なるＰＣＲに続いて解像されたアンプリコンを示す図である（Ｌ、１ｋｂ及び分子量ＤＮＡマーカー；野生型（Ｗ）、野生型ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ；変異体（Ｍ）、変異体ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ）。 標的変異体における挿入部位のＰＣＲ ＤＮＡ配列の検証を示す図である。上側の図では、黒い矢印の左上に示したアンプリコンから生成されたＤＮＡ配列は、Ｅ．シャフェンシスのゲノムからの配列を表し、黒い矢印の右上の配列は、遺伝子破壊変異体に挿入された配列を表す。下側の図では、黒い矢印の左上に示したアンプリコンから生成されたＤＮＡ配列は、Ｅ．シャフェンシスのゲノムからの配列を表し、黒い矢印の右上の配列は、遺伝子破壊変異体に挿入された配列を表す。５´及び３´挿入接合部における配列境界は、小さな黒い矢印線で識別された。また、上側の図では、上側の配列は配列番号４２であり、下側の配列は配列番号４８である。下側の図では、上側の配列は配列番号４３であり、下側の配列は配列番号４９である。 ＣｌａＩ（Ｃ）またはＥｃｏＲＩ（Ｅ）で消化されたゲノムＤＮＡ（Ｗ及びＭ）のサザンブロット分析（Ｓ−ｂｌｏｔ）の写真である。ａａｄＡ遺伝子セグメントをプローブとしてブロット分析を行った。 Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子を破壊する標的アレル交換変異誘発を示す図であり、挿入をマッピングするために使用される制限酵素部位（ＣｌａＩ（Ｃ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ））を含む、アレル交換構築物を調製するために選択された領域にわたるゲノムセグメントを示す。制限酵素部位のゲノム座標及び挿入断片（ｔｕｆ−ａａｄＡ）のサイズにより、ＰＣＲ及びサザンブロット分析で予想されるＤＮＡサイズを決定した。 アレル挿入（１及び４と同定されたプライマー）及び挿入されたＤＮＡ（プライマー２及び３）の上流及び下流のゲノム領域を標的とするプライマーを使用して、３つの異なるＰＣＲに続いて解像されたアンプリコンを示す図である（Ｌ、１ｋｂ及び分子量ＤＮＡマーカー；野生型（Ｗ）、野生型ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ；変異体（Ｍ）、変異体ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ）。 標的変異体における挿入部位のＰＣＲ ＤＮＡ配列の確認を示す図である。上側の図では、黒い矢印の左上に示したアンプリコンから生成されたＤＮＡ配列は、Ｅ．シャフェンシスのゲノムからの配列を表し、黒い矢印の右上の配列は、遺伝子破壊変異体に挿入された配列を表す。下側の図では、黒い矢印の左上に示したアンプリコンから生成されたＤＮＡ配列は、Ｅ．シャフェンシスのゲノムからの配列を表し、黒い矢印の右上の配列は、遺伝子破壊変異体に挿入された配列を表す。５´及び３´挿入接合部における配列境界は、小さな黒い矢印線で識別された。また、上側の図では、上側の配列は配列番号４４であり、下側の配列は配列番号５０である。下側の図では、上側の配列は配列番号４５であり、下側の配列は配列番号５１である。 ＣｌａＩ（Ｃ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）で消化されたゲノムＤＮＡ（Ｗ及びＭ）のサザンブロット分析の写真である。ａａｄＡ遺伝子セグメントをプローブとしてブロット分析を行った。 図３と同様のＥｃｈ＿０３７９遺伝子を復元するための標的アレル交換変異誘発を示す。ただし、ゲノムセグメントを示す上側の図は、Ｅｃｈ＿０３７９変異体からのゲノムを示す。 ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＥｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体培養物を示す。ＩＳＥ６細胞中で培養した復元された変異体生物を、４０倍拡大レンズを使用した共焦点顕微鏡により、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について評価した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、矢印で示されている。 アレル挿入（１及び４と同定されたプライマー）及び挿入されたＤＮＡ（プライマー２及び３）の上流及び下流のゲノム領域を標的とするプライマーを使用して、３つの異なるＰＣＲに続いて分解されたアンプリコンを示す図である（Ｌ、１ｋｂ＋分子量ＤＮＡマーカー；野生型（Ｗ）、野生型ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ；変異体（Ｍ）、変異ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ）。 Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子を復元するための標的アレル交換変異誘発を示す図である。この図は図３Ｃと同様であるが、サザンブロット実験（図５Ｅに示す）に使用した制限酵素及びプローブが、それぞれＣｌａ ＩとＥｃｈ＿０３７９遺伝子を表すＤＮＡ断片である点が図３Ｃと異なる。また、上側の図では、上側の配列は配列番号４６であり、下側の配列は配列番号５２である。下側の図では、上側の配列は配列番号４７であり、下側の配列は配列番号５３である。 ＣｌａＩ（Ｃ）またはＥｃｏＲＩ（Ｅ）で消化されたゲノムＤＮＡ（Ｗ及びＭ）のサザンブロット分析の写真である。ａａｄＡ遺伝子セグメントをプローブイラストレートとしてブロット分析を行った。レーンＭ１及びＭ２は、それぞれ、ＤＨ８２及びＩＳＥ６培養物から回収したＥ．シャフェンシス Ｅｃｈ＿０３７９変異体培養物から回収したゲノムＤＮＡからのデータを表す。同様に、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、ＤＨ８２及びＩＳＥ６培養から回収したＥ．シャフェンシス Ｅｃｈ＿０３７９復帰変異体培養物から回収したゲノムＤＮＡからのデータを表す。 ＲＴ−ＰＣＲによって評価された野生型及びアレル交換変異体Ｅ．シャフェンシス生物から回収されたＲＮＡの転写分析を示す。野生型（Ｗ）及びＥｃｈ＿０２３０変異体（Ｍ）生物由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を解像した（Ｌ、１ｋｂ及び分子量ＤＮＡマーカーが解像された；＋、野生型Ｅ．シャフェンシス由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた；−、鋳型が追加されていない陰性対照反応）。 Ｅｃｈ＿０３７９破壊（Ｍ）及び復元（Ｒ）変異体生物から回収したＲＮＡを使用して分析を行ったことを除いて、図６Ａと同様である。この実験のための陽性対照は、Ｗ、Ｍ及びＲからの鋳型としてゲノムＤＮＡを含む（Ｗ及びＲのＰＣＲにおけるＤＮＡ鋳型については０．３８ｋｂのアンプリコンが予想され、鋳型としてのＭ ＤＮＡについては１．６ｋｂの産物が予想される。） ＲＴ−ＰＣＲによって評価された野生型及びアレル交換変異体Ｅ．シャフェンシス生物から回収されたＲＮＡの転写分析を示す。Ｅｃｈ＿０３７９を不活性化して遺伝子活性を復元させる変異は、隣接する遺伝子からの遺伝子発現を変化させなかった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、野生型、遺伝子不活性化及び遺伝子レスキュー変異体について、Ｅｃｈ＿０３７８、Ｅｃｈ＿０３７９及びＥｃｈ＿０３８０について３０、３５及び４０ＰＣＲサイクルで実施し、３５サイクルのデータを提示した。Ｗ、Ｍ及びＲは、Ｅｃｈ＿０３７８及びＥｃｈ＿０３８０について同様の量のアンプリコンを有していた；Ｅｃｈ＿０３７９アンプリコンもＷ及びＲについて同様であったが、Ｍについては存在しなかった。 アンチポータ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＰ４３２におけるＥｃｈ＿０３７９遺伝子の表現型の特性評価を示す。ＥＰ４３２中のＥｃｈ＿０３７９転写物を標的とするＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。

本開示は、宿主において免疫原性応答を生成可能な安定的な免疫原性細菌を提供する方法を提供する。本開示の方法は、好ましくは、細菌株のゲノムにおける標的破壊のステップと、それに続いてアレル交換を行うステップとを含む。

本開示は、本明細書に開示された免疫原性細菌の投与を含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する。本開示の免疫原性組成物またはワクチンに使用するための免疫原性細菌は、死滅菌、改変死滅菌、改変生体菌、組換えタンパク質、タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。好ましい形態では、改変生体免疫原性菌は弱毒化される。

リケッチア症、エーリキア症、ロッキー山紅斑熱、ヒト単球エーリキア症、顆粒球アナプラズマ症、及び／またはアナプラズマ症の少なくとも１つを予防または治療する方法が提供される。本開示の方法は、一般的に、本明細書に開示された免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要とするヒトまたは動物に投与するステップを含む。

また、リケッチア症、エーリキア症、ロッキー山紅斑熱、ヒト単球エーリキア症、顆粒球アナプラズマ症、及び／またはアナプラズマ症の少なくとも１つに関連する臨床症状の発生率または重症度を低減させる方法であって、本明細書に開示された免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要とするヒトまたは動物に投与するステップを含む方法が提供される。臨床症状としては一般的に、これに限定しないが、発熱、頭痛、悪寒、倦怠、筋肉痛、腹痛、吐き気、嘔吐、下痢、錯乱、結膜充血（赤目）、発疹、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、リケッチア症、エーリキア症、ロッキー山斑点熱、ヒト単球エーリキア症、顆粒球アナプラズマ症、及び／またはアナプラズマ症の少なくとも１つに関連する臨床症状は、発生率及び／または重症度が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低減する。これは、本開示の免疫原性組成物またはワクチンの投与を受けていない動物またはヒトと比較したものである。動物またはヒトの群との比較も本明細書において意図される。

本開示の製品及び方法の受益者は、ヒトまたは動物であり得る。動物は、好ましくは、これに限定しないが、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、シカ、コヨーテ、ネコ、家禽、及び他の関連する野生動物及び家畜から選択される。好ましい態様では、受益者は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、またはブタである。

改変されたまたは改変された生のヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術にしたがった変異誘発によって得られ、かつ本開示による正常配列に対する改変、例えば、ポリペプチド発現の調節及び／またはプロモータ配列における変異を含み、特にポリペプチドの発現速度の改変または複製サイクルの調節をもたらす、任意のヌクレオチド配列を意味するものと理解される。

本開示では、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、単量体及び二量体（いわゆる、タンデム）の形態における二本鎖または一本鎖ＤＮＡ及び該ＤＮＡの転写産物の両方を意味すると理解される。

本開示は、自然環境、すなわち自然状態で得られるゲノムヌクレオチド配列と関係しないことを理解されたい。本開示は、分離方法（例えば、分子サイズに基づく除外または親和性によるイオン交換クロマトグラフィ、または、異なる溶媒中の溶解度に基づく別の分離技術）から開始して単離、精製、部分的に精製することが可能な配列、または、遺伝子工学の方法（例えば、増幅、クローニング、及びサブクローニング）から開始してベクターにより実施することが可能な配列に関する。さらに、本開示の配列は、部位特異的変異誘発または連続継代などの他の弱毒化技術によって誘発された変異を含むように自然界で見られるものから改変されており、本開示の配列がヒトの手によって作製され、自然界に見られないことをさらに示している。

本開示の弱毒化改変生ワクチンまたは免疫原性組成物は、ヒトの手によって構築されているので、自然界に見られるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含まない。したがって、本開示の免疫原性組成物またはワクチンは、自然界に見られるものとは著しく異なる。本開示の免疫原性組成物またはワクチンは、例えば自然発生のエーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffeensis）と機能的に異なる特性を提供する配列内の変異またはウイルスの不活化などの付加的要素を有するので、２０１４年に米国特許庁によって発行された３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１０１条に基づく特許適格性を有する自然由来の物の実施例についての実施例５のクレーム２と同様である。

既に定義されたＥｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子のランダム挿入変異部位の上流及び下流の約１ｋｂのエーリキア・シャフェンシス（Ｅ．シャフェンシス）のゲノムＤＮＡセグメントをＰＣＲによって取得し、プラスミドベクターにクローニングした。Ｅ．シャフェンシスの伸長因子Ｔｕ遺伝子、Ｔｕｆ−２、（Ｅｃｈ＿０４０７）のプロモータセグメントを、ａａｄＡ遺伝子コード配列の前で、別のプラスミドに同様にクローニングした（ａａｄＡ遺伝子は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与する）。ａａｄＡタンパク質発現のためにＴｕｆ−２遺伝子プロモータ（ｔｕｆ）を選択した。ｔｕｆは、タンパク質翻訳機構におけるポリペプチド伸長過程に必要な、高度に保存され構成的に発現されるタンパク質、Ｔｕの発現を駆動するためである。さらに、本願発明者のバイオインフォマティクス解析及びプライマー伸長実験による転写マッピングは、ｔｕｆは、その大部分が３０Ｓ及び５０Ｓリボソームタンパク質をコードし、かつ複数の転写開始部位（図示せず）を有する、遺伝子の転写に関与する強力なプロモータであることを示唆した。ａａｄＡ遺伝子は、Ｅ．シャフェンシス及びアナプラズマ種における抗生物質耐性付与において良好に作用するので選択された。ｔｕｆ−ａａｄＡセグメントを、Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９（ｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０２３０ｔｕｆ−ａａｄＡ及びｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０３７９ｔｕｆ−ａａｄＡ）の相同組換え構築物に改変した。ｔｕｆ−ａａｄＡセグメントによって分離された遺伝子の５´及び３´相同アームを含む構築物からの線状ＤＮＡ断片を、標的変異体の作製に使用するためにＰＣＲによって作製した。Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子内の標的遺伝子変異を逆転させるレスキュー変異誘発鋳型を作製するために、遺伝子の変異部位から下流の０．５ｋｂ断片を、Ｅ．シャフェンシスのゲノムからＰＣＲによって取得し、それをｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０３７９ｔｕｆ−ａａｄＡ構築物に改変して、改変構築物を作製した；５´末端にＥｃｈ＿０３７９遺伝子全体のＯＲＦを含み、それに続いてＡｍｔｒプロモータ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びゲンタマイシン耐性カセット（Ｇｅｎｔ）のＯＲＦ（Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔ）、並びに、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子の３´部分を含む１ｋｂゲノムセグメントが存在する、ｐＨＲ−ｒｅｓ−Ｅｃｈ＿０３７９−Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔ。Ｇｅｎｔは、Ｅ．シャフェンシスにおける効率的な翻訳のために最適化されたコドンであった。次いで、レスキュー構築物から、線状断片であって、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子から始まり、それに続いて、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔセグメント、及びＥｃｈ＿０３７９挿入物の下流にある３´末端ゲノムセグメントが存在する５´相同アームを含み、３´相同アームとしての機能を果たす、線状断片を作製した。Ｅｃｈ＿０２３０またはＥｃｈ＿０３７９遺伝子を破壊するための線状ＤＮＡ断片を、ＩＳＥ６ダニ細胞から回収した宿主細胞フリー野生型Ｅ．シャフェンシス生物にエレクトロポレーション（電気穿孔）し、その後、ＩＳＥ６ダニ細胞に再感染させた。この変異体は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンを含有する培地中で数週間増殖する能力のために選択され、そして、マクロファージ細胞株ＤＨ８２に感染させ、数ヶ月継続して増殖させた。レスキュー変異実験のために、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元鋳型の線状ＤＮＡ断片を、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子内に変異を含むＥ．シャフェンシス生物に、同様にエレクトロポレーションした。そして、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子を復元したＥ．シャフェンシス培養物が、ゲンタマイシン含有培地中で増殖する能力のために選択された。抗生物質を含む培地で増殖させたＥ．シャフェンシス培養物の回収後、Ｅｃｈ＿０２３０またはＥｃｈ＿０３７９における標的遺伝子不活性化が、（１）アレル交換部位及び挿入特異的ＤＮＡに対するゲノム領域５´、及び（２）ゲノム上の挿入ＤＮＡ及びアレル交換部位の３´を標的とする、２つの挿入特異的ＰＣＲ分析によって確認された。その後、クローン純度が、アレル交換挿入部位の上流及び下流のゲノム領域を標的とする別のＰＣＲ分析によって確認された。ＰＣＲ産物の完全性は、ＰＣＲ−ＤＮＡ配列分析によって確認された。また、蛍光顕微鏡（図５Ｂ）によって、Ｃｈｅｒｒｙタンパク質発現について、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体生成も評価した。また、Ｅ．シャフェンシスのゲノムにおける変異の存在は、遺伝子破壊変異と遺伝子復元変異の両方に対するサザンブロット解析によっても確認された。ＲＴ‐ＰＣＲ分析により、Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９転写物は、野生型Ｅ．シャフェンシスには存在するが、遺伝子破壊変異生物には存在しないことが明らかにされた。相補変異株は、野生型Ｅ．シャフェンシスと同様に、Ｅｃｈ＿０３７９転写物に対して陽性であった。さらに、本願発明者は、Ｅｃｈ＿０３７９の遺伝子活性を不活性化し復元するアレル交換変異体が、それに隣接する遺伝子からの遺伝子発現の変化において極性効果を引き起こせるかどうかを試験した。この分析は、３セットのＰＣＲサイクル（３０、３５、４０）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって行われた。ＰＣＲサイクル数とは無関係に、Ｅｃｈ＿０３７８及びＥｃｈ＿０３８０のＲＴ‐ＰＣＲ産物は、野生型、遺伝子不活性化変異体、及び遺伝子救済変異体では類似しており、Ｅｃｈ＿０３７９のＲＴ‐ＰＣＲ産物は、遺伝子不活性化変異体でのみ存在しなかったが、野生型及び遺伝子救済変異体では類似していた（図６Ｃ）。３つの全ての変異実験中に生成されたオフターゲットの挿入体の存在を支持する証拠はなかった。Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子オープンリーディングフレームは、相補性アレル交換変異実験から得られたそれ自体のプロモータの前で完全に復元され、そのため、その遺伝子構造は、ｍＣｈｅｒｒｙ及びゲンタマイシン耐性タンパク質をさらに発現することを除いて、野生型のＥ．シャフェンシスと同様であった。完全なゲノムを有する点で野生型と類似しているこの改変されたＥ．シャフェンシスは、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）について開示された従来の研究と同様に、インビトロ及びインビボでの蛍光イメージングによる病原体のリアルタイムモニタリングにおける新規の研究に有用であろう。

本明細書は、実施例を用いて、最良の実施の形態（ベストモード）を含む本発明の内容を開示し、かつ本発明を当業者が実施（任意の装置またはシステムの作製及び使用、並びに記載内容に組み入れられたあらゆる方法の実施を含む）することを可能にしている。本発明の特許される技術範囲は、特許請求の範囲の請求項の記載によって特定され、当業者が想到可能な他の実施形態もそれに含まれ得る。そのような他の実施形態は、各請求項の文言と異なっていない構成要素を含む場合、またはそれらが各請求項の文言とは実質的には異ならない均等な構成要素を含む場合、それらの請求項の特定する技術範囲内にあるものとする。

実施例

実施例１

材料及び方法

＜Ｅ．シャフェンシスのインビトロ培養＞
Ｅ．シャフェンシス・アーカンソー（E. chaffeensis Arkansas）分離株を、Ｉ．スカプラリス（I. scapularis）胚細胞株であるＩＳＥ６ダニ細胞株内で継代培養した（Elwell, C., Mirrashidi, K., and Engel, J., Nat. Rev. Microbiol.; 14, 385-400 (2016).）。また、イヌマクロファージ細胞株（ＤＨ８２）を使用して、以前に報告されたプロトコールに従ってＥ．シャフェンシスを培養した（Walker, D.H., Paddocl, C.D. and Dumler, J.S., Med Clin North Am; 92, 1345-1361 (2008).）。

＜相同組換えプラスミド及びセグメントの構築＞
標的変異誘発実験のために開発された組換えプラスミド構築物の作製に使用される全てのプライマーを表１に記載した。また、本実験で使用及び作製されたプラスミドを表２に列挙した。

アレル交換変異誘発実験のための構築物を作製するときに従う詳細な分子ステップを図１に示す。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ・ハイフィデリティ（Taq DNA Polymerase High Fidelity）（米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロジェン社（Invitrogen））を、全てのＰＣＲ実験での構築物の作製に使用した。Ｅ．シャフェンシスのＥｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子を使用して、本願発明者により以前に報告されたＨｉｍａｒ１ランダム変異誘発法によるこれらの遺伝子内のランダム変異のようにして、アレル交換変異を作製した。変異体はインビトロ培養下で正常に増殖した。遺伝子（図１ではＡ及びＡ´で示す）の既に同定された変異挿入部位の両側からそれぞれ約１ｋｂにわたる約２．０ｋｂゲノムＤＮＡセグメントを、Ｅ．シャフェンシスのゲノムから増幅させた（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＰ０００２３６．１；Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃＨ＿０３７９に対するＨｉｍａｒ１変異挿入部位は、それぞれ２１９、０９７及び３７４、４６１である）。Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子の増幅されたセグメントのゲノム座標は、それぞれ２１８、０６０〜２２０、１３３及び３７３、２６５〜３７５、８１０である。アンプリコンを、まず、製造業者の説明書に従って、プラスミド、ｐＣＲＭ（ＴＭ）２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクター（米国メリーランド州ロックビル、ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies））にクローニングした。また、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに耐性を付与するためのａａｄＡ遺伝子産物の構成的発現に使用するために、０．３７ｋｂＤＮＡにわたるＴｕｆ−２遺伝子（Ｅｃｈ＿０４０７）プロモータ（ｔｕｆ）を、Ｅ．シャフェンシスのゲノムから増幅させた（このセグメントのゲノム座標は、３９６、３８５〜３９６、７５１である）。ａａｄＡ遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＰＣＲによって、ｐＣｉｓ ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳＳ Ｈｉｍａｒ Ａ７プラスミドから取得された（Sahni, S.K., Narra, H.P.., Sahni, A., and Walker, D.H.; Future Microbiol; 8, 1265-1288 (2013).）。また、ｔｕｆプロモータ及びａａｄＡ ＯＲＦを別個のｐＣＲＭ（ＴＭ）２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクターにクローニングし、その後、このプラスミドを使用して、最終的な標的遺伝子破壊変異誘発構築物に組み込むためのｔｕｆ−ａａｄＡセグメントの線状断片（断片１）を作製した。続いて、遺伝子断片を含むプラスミド全体（それぞれ、ｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０２３０及びｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０３７９）から線状断片（断片２）を作製した。この作製には、これらの遺伝子断片を線状断片の各末端に位置する２つの均等な半分に分割し、かつプラスミド骨格を中央に維持するように設計されたＥｃｈ＿０２３０またはＥｃｈ＿０３７９遺伝子特異的プライマーを使用した。次に、ギブソンアセンブリ法（Gibson Assembly）法（米国マサチューセッツ州イプスウィッチ、ニューイングランド・バイオラブス社（New England Biolabs））のプロトコールに従って、線状断片１及び線状断片２を互いに連結させて、最終的な相同組換えプラスミド構築物を作製し、そこで、ｔｕｆ−ａａｄＡセグメントの挿入により遺伝子セグメントを破壊した。最終構築物は、それぞれ、ｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０２３０ｔｕｆ−ａａｄＡ及びｐＨＲ−Ｅｃｈ＿０３７９ｔｕｆ−ａａｄＡと命名した（それぞれ、図２Ａ及び図２Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ申請番号２０１２０１５及び２０１２０２３；まだ受理されていない）。次いで、ｔｕｆ−ａａｄＡカセットと共に各遺伝子破壊セグメントの５´及び３´相同アームの両方を含むこれらの構築物からの線状断片を、ＰＣＲによって作製した（図３Ａ）。そして、アンプリコンを１％アガロースゲル（図３Ｂ）上で解像した。標的遺伝子破壊を引き起こすアレル交換変異誘発実験に使用するために、ＤＮＡをゲルで単離し、ヌクレアーゼを含まない水中で１μｇ／μｌに濃縮した。

Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子機能レスキュー鋳型を構築するために、Ｅ．シャフェンシスのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲによって、変異部位から下流の３´末端０．５ｋｂ断片を鋳型として作製した（ゲノム座標は、３７４、４６２〜３７４、８３７である）。アナプラズマ・マージナーレ（Anapmasma marginale）転写調節因子（Ｔｒ）遺伝子プロモータ及びｍＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦを構成するＡｍｔｒ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｍｔｒ−ｍＣｈ）ＤＮＡセグメントを、ｐＣｉｓ ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳＳ Ｈｉｍａｒ Ａ７プラスミドを鋳型として使用して増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子コード配列（Ｇｅｎｔ）は、Ｅ．シャフェンシスのゲノムの高頻繁で見られるコドンにより、商業的に最適化されたコドンであった（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ、ジェンスクリプト社（GenScript））（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＫＢ９７７４５２）。続いて、Ｇｅｎｔセグメントを使用して、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ断片の下流のクローニングを行い、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔ融合断片を作製した。次いで、重複ＰＣＲを行うことによって、３´末端の０．５ｋｂのＥｃｈ＿０３７９セグメントを、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔ断片の５´末端に連結させた。その後、ギブソンアセンブリ・クローニングストラテジーを行うことによって、最終アンプリコンをＥｃｈ＿０３７９ｔｕｆ−ａａｄＡ−ＨＲ１構築物にクローニングし、ｔｕｆ−ａａｄＡセグメントを３´末端の０．５ｋｂのＥｃｈ＿０３７９ＯＲＦセグメントを含むＡｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔセグメントで置換した。最終的なＥｃｈ＿０３７９レスキュープラスミド構築物；ｐＨＲ−ｒｅｓ−Ｅｃｈ＿０３７９−Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔは、それ自体のプロモータの前で復元された全長Ｅｃｈ＿０３７９のＯＲＦと、それに続く、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔ、及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子の３´末端１ｋｂゲノムセグメントを含む（図２Ｃ）（ＧｅｎＢａｎｋ申請番号＃２０１２０３３；まだ受理されていない）。次に、この構築物を鋳型として使用して、ＰＣＲによって線状断片を作製した。作製された線状断片は、５´末端に、それ自体のプロモータ及び完全ＯＲＦと、それに続く、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子全体を含み、次いで、Ａｍｔｒ−ｍＣｈ−Ｇｅｎｔセグメント及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子変異部位の下流の追加的な３´末端１ｋｂセグメントを含む（図５Ａ）。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｒｕｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ドイツ国ヒルデン、キアゲン社（Qiagen））によって精製し、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子破壊を有するＥ．シャフェンシス生物における遺伝子の完全性を復元するためのアレル交換変異誘発実験に使用するために、上記で概説したようにヌクレアーゼを含まない水中で１μｇ／μｌに濃縮した。

＜細胞フリーＥ．シャフェンシス生物の精製＞
約８０〜９０％感染のコンフルエントＩＳＥ６細胞培養フラスコからの５ｍｌのＥ．シャフェンシス細胞培養物を使用して、宿主細胞フリーＥ．シャフェンシス微生物を作製した。簡単に説明すると、感染細胞懸濁液を、４°Ｃにて１５、０００ｇで１０分間、遠心分離することによって回収し、上清を捨てた後、１．５ｍｌの０．３Ｍ氷冷スクロース溶液及び１００μｌの量のオートクレーブ処理ロックタンブラーグリット＃１（米国ワシントン州ロートン、６０／９０グリットシリコンカーバイド）を細胞ペレットに添加し、テーブルトップボルテックス装置を使用して最大速度で３０秒間ボルテックスして、感染宿主細胞から細菌を放出させた。その後、細胞懸濁液を、４°Ｃにて２００ｇで１０分間遠心分離して、宿主細胞破片をペレット化した。上清を３ｍｌシリンジに注意深く回収し、１．６μｍフィルタ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ、ワットマン社（Whatman Ltd.））に通した。Ｅ．シャフェンシスを含む濾液を、４°Ｃにて１５、０００ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化した。細胞ペレットを、０．３Ｍの氷冷スクロース溶液４５μｌ中に再懸濁させた０．３Ｍ氷冷スクロース溶液で２回洗浄し、直ちにエレクトロポレーション実験に使用した。

＜Ｅ．シャフェンシスの形質転換及び変異体のクローン単離＞
アレル交換変異誘発プラスミド構築物（上記に概説した）からの精製された線状ＤＮＡ断片３〜１０μｇを、４５μｌの量で、宿主細胞フリーＥ．シャフェンシス生物に添加し、穏やかに混合し、内容物を１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベット（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオラッド研究所（Bio-Rad Laboratories））に移した。このキュベットを氷上で１５分間インキュベートし、その後、２、０００ボルト、２５μＦ、及び４００Ωの設定でエレクトロポレーションに供した（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオラッド研究所、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＴＭ））。エレクトロポレーションされた細胞を、０．５ｍｌのＦＢＳと、ダニ細胞培養感染培地中に約１×１０^６個のＩＳＥ６細胞を含有する１ｍｌの非感染ＩＳＥ６細胞懸濁液とを含むマイクロ遠心チューブに移した。この混合試料を５、０００ｇで５分間遠心分離し、室温で１５分間インキュベートし、次いで、細胞を５ｍｌ培養培地中に再懸濁させ、全内容物を、コンフルエントＩＳＥ６細胞を含有するＴ２５フラスコに移し、加湿された３４°Ｃのインキュベーター中で２４時間インキュベートし、その後、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンの各々１００μｇ／ｍｌを培養培地に添加した。変異体を選択するために、インキュベートは３４°Ｃで数週間継続した。一般的に、変異体は２〜３週間後にＰＣＲ分析によって検出されたが、評価はこの時点を超えて数週間継続した。８０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する培地をエレクトロポレーションの２４時間後に使用したことを除いて、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体を得るために同様の実験を行った。また、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体培養物も、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡（米国ニューヨーク州メルビル、ニコン社（Nikon））を使用して培養物を調べてｍＣｈｅｒｒｙの発現を検出することによって評価した。同定後、抗生物質耐性培養物を、さらなる増殖及び維持のためにＤＨ８２細胞培養物に移した。また、液体窒素ストックも作製し、変異株の確立後の最初の２週間以内に貯蔵した。

＜Ｅ．シャフェンシス変異体の存在の確認＞
抗生物質の存在下で良好に増殖したＥ．シャフェンシスの培養物を、挿入特異的ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ分析によって、アレル交換変異陽性についてスクリーニングした。全ゲノムＤＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して培養物から回収した（米国ウィスコンシン州マディソン、プロメガ社（Promega））。精製ゲノムＤＮＡを使用して３種類のＰＣＲ分析を行った（図４Ｂ）。第１及び第２のＰＣＲ分析（図４Ｂの第１のパネル）は、（１）アレル交換部位及び挿入特異的ＤＮＡに対するゲノム領域５´（図４Ｂの第２パネル）、及び（２）ゲノム上の挿入ＤＮＡ及びアレル交換部位の３´を標的とした。第３のＰＣＲ分析（図４Ｂの第３パネル）は、変異体のクローン純度を試験するように設計された。この分析で使用されたプライマーは、アレル交換挿入部位の上流及び下流のゲノム領域を標的とした（図４Ｃ）。ＰＣＲ産物を０．９％アガロースゲル上で解像して特異的予測長アンプリコンを同定し、次いで配列決定分析に供して、アンプリコンの両端からの挿入のゲノム結合をマッピングすることによって完全性をさらに確認した。変異及びクローン純度は、その後、サザンブロット分析によって確認された（図４Ｄ）。変異生物及び野生型生物由来のゲノムＤＮＡを、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて制限酵素消化に供した。消化されたＤＮＡを１％アガロースゲル上で解像し、ナイロン膜に移した（米国インディアナ州インディアナポリス、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics））。挿入特異的ａａｄＡ遺伝子セグメントプローブを、サザンブロットハイブリダイゼーション実験において使用して、Ｅｃｈ＿０２３０及びＥｃｈ＿０３７９の標的破壊変異体における挿入されたＤＮＡの位置を特定した。また、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子セグメントプローブを使用して、ＤＮＡブロット分析の標準手順に従って、Ｅｃｈ＿０３７９の標的遺伝子挿入及び復元変異体クローンにおけるゲノム挿入の位置を特定した。

＜転写の消失及び復元を検証するためのＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ解析＞
ＩＳＥ６またはＤＨ８２細胞培養で増殖した野生型及び変異体のＥ．シャフェンシス生物由来の全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＴＲＩ試薬全ＲＮＡ単離法を用いて単離した（米国ミズーリ州セントルイス、シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））。次いで、ＲＮＡ試料をＲＱ１ＤＮａｓｅ（米国ウィスコンシン州マディソン、プロメガ社）により３７°Ｃで６０分間処理して、残存するゲノムＤＮＡを除去した。Ｅｃｈ＿０２３０またはＥｃｈ＿０３７９ＯＲＦを標的とするプライマーをＲＴ−ＰＣＲ分析に使用し、０．９％アガロースゲル分析によって、及び産物をＤＮＡ配列解析に供することによって、特異的アンプリコンの存在を評価した。野生型変異体、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子破壊変異体、及びＥｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体（図５Ｂ、図５Ｃ、図６Ａ、及び図６Ｂ）から回収した等量のＥ．シャフェンシスのＲＮＡを使用して、遺伝子Ｅｃｈ＿０３７８、Ｅｃｈ＿０３７９、及びＥｃｈ＿０３８０からのｍＲＮＡ発現の評価において上述したように、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。この分析は、３０、３５、及び４０サイクルで実施された（図６Ｃ）。確認のために、サザンブロットが使用された（図５Ｅ）。

実施例２

材料及び方法

＜Ｅ．カニス及びアナプラズマ・ファゴサイトフィルムのインビトロ培養＞
Ｅ．カニス（E. canis）及びＡ．ファゴサイトフィルム（A. phagocytophilum）を、Ｉ．スカプラリス胚細胞株であるＩＳＥ６ダニ細胞株内で継代培養した（Munderloh, U.G. et al. J. Clin. Microbiol. 37, 2518-2524 (1999)、及び、Cheng, C. & Ganta, R.R. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 3, Unit 3A 1 (2008)）。

＜相同組換えプラスミド及びセグメントの構築＞
組換えプラスミド構築物の作製に使用される全てのプライマーは、病原体の遺伝子標的特異的プライマーを使用することを除けば、Ｅ．シャフェンシスについて記載したのと同様のプロトコールに従って、標的変異誘発実験のために開発された。同様に、アレル交換変異誘発実験のための構築物を作製するときに従う詳細な分子ステップは、Ｅ．シャフェンシスについて説明した標準的な分子的方法に従うものと同様である（Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. (2001)）。簡単に説明すると、遺伝子の既に同定された変異挿入部位の両側からそれぞれ約１ｋｂにわたる約２．０ｋｂのゲノムＤＮＡセグメントを、Ｅ．シャフェンシス遺伝子Ｅｃｈ＿０６６０の場合と同様に、Ｅ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルム遺伝子相同体から増幅させた。Ｅ．カニス及びＡ．ファゴサイトフィルムのＥｃｈ＿０６６０相同配列は、本開示では、それぞれ配列番号５４及び配列番号５５として提供される。まず、アンプリコンをプラスミドベクター中にクローニングする。そして、抗生物質選択マーカー遺伝子を駆動するエーリキア（Ehrlichia）またはアナプラズマ（Anaplasma）遺伝子プロモータを、蛍光レポーター遺伝子と共に最終的な標的遺伝子破壊変異誘発構築物中に挿入して、細菌の配列を略均等な半分に分割する。次に、Ｅ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルム特異的破壊遺伝子セグメントを含む組換えプラスミド全体から、ＰＣＲによって線状断片を作製する。その後、アンプリコンを精製し、標的遺伝子破壊を作製するためのアレル交換変異誘発実験に使用するために、ヌクレアーゼを含まない水中で１μｇ／μｌに濃縮する。

＜細胞フリーＥ．カニス及びＡ．ファゴサイトフィルム生物の精製＞
Ｅ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルムの宿主細胞フリー生物を回収するための精製方法は、実施例１において上述したＥ．シャフェンシスの場合と本質的に同じであるが、Ｅ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルムを含有する約８０〜９０％感染のコンフルエントＩＳＥ６細胞培養フラスコをそれぞれ使用して、「Felsheim, R.F. et al. BMC Biotechnol. 6, 42 (2006)」におけるプロトコールに従って特定の宿主細胞フリー生物を作製する点が異なる。

＜Ｅ．シャフェンシスの形質転換及び変異体のクローン単離＞
アレル交換変異誘発プラスミド構築物（上記に概説した）からの精製された線状ＤＮＡ断片３μｇを、４５μｌの量で、宿主細胞フリーＥ．シャフェンシス生物に添加し、穏やかに混合し、内容物を１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベット（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオラッド研究所）に移した。このキュベットを氷上で１５分間インキュベートし、その後、２、０００ボルト、２５μＦ、及び４００Ωの設定でエレクトロポレーションに供した（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオラッド研究所、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＴＭ））。エレクトロポレーションされた細胞を、０．５ｍｌのＦＢＳと、ダニ細胞培養感染培地中に約１×１０^６個のＩＳＥ６細胞を含有する１ｍｌの非感染ＩＳＥ６細胞懸濁液とを含むマイクロ遠心チューブに移した。この混合試料を５、０００ｇで５分間遠心分離し、室温で１５分間インキュベートし、次いで、細胞を５ｍｌ培養培地中に再懸濁させ、全内容物を、コンフルエントＩＳＥ６細胞を含有するＴ２５フラスコに移し、加湿された３４°Ｃのインキュベーター中で２４時間インキュベートし、その後、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンの各々１００μｇ／ｍｌを培養培地に添加した。変異体を選択するために、インキュベートは３４°Ｃで数週間継続した。一般的に、変異体は２〜３週間後にＰＣＲ分析によって検出されたが、評価はこの時点を超えて数週間継続した。８０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する培地をエレクトロポレーションの２４時間後に使用したことを除いて、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体を得るために同様の実験を行った。また、Ｅｃｈ＿０３７９遺伝子復元変異体培養物も、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡（米国ニューヨーク州メルビル、ニコン社）を使用して培養物を調べてｍＣｈｅｒｒｙの発現を検出することによって評価した。同定後、抗生物質耐性培養物を、さらなる増殖及び維持のためにＤＨ８２細胞培養物に移した。また、液体窒素ストックも作製し、変異株の確立後の最初の２週間以内に貯蔵した。

＜Ｅ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルムの変異体の存在の確認＞
抗生物質の存在下で良好に増殖したＥ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルムの培養物を、挿入特異的ＰＣＲによるゲノムＤＮＡ分析によって、アレル交換変異陽性についてスクリーニングした。プロトコールは、Ｅ．シャフェンシスについて説明したものと同一である。

＜転写の消失及び復元を検証するためのＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ解析＞
野生型及び変異体のＥ．カニスまたはＡ．ファゴサイトフィルム生物由来の全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬全ＲＮＡ単離法に従って単離し、ＲＱ１ＤＮａｓｅで処理した。病原遺伝子特異的プライマーをＲＴ−ＰＣＲ分析に使用し、アガロースゲル分析によって、及び産物をＤＮＡ配列解析に供することによって、特異的アンプリコンの存在を評価した（Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. (2001)）。

実施例３

材料及び方法

インビトロ培養及び細胞フリーＥ．シャフェンシスの回収

Ｅ．シャフェンシス・アーカンソー分離株の野生型及びその変異体を、イヌマクロファージ細胞株ＤＨ８２内で増殖させた。細胞フリーＥ．シャフェンシスの野生型及びその変異体の単離及び精製は、次のように行った。簡単に説明すると、ＤＨ８２細胞における細菌感染率を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色により評価した。感染が約８０〜９０％に達した７２時間の感染後、４つのＴ−１５０コンフルエントフラスコから培養物を回収し、５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（米国インディアナ州インディアナポリス、ロシュ社）を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、１０ｍＬシリンジ中で２３ｇニードルを使用して１５〜２０回ストロークすることにより、細胞を氷上で均質化させた。均質化の効率、８０〜９０％の溶解を、光学顕微鏡下で調べた。全細胞溶解物を、４°Ｃにて５００×ｇで５分間遠心分離した。得られた細胞フリーエーリキア生物を含む上清を、２μｍの無菌メンブレンフィルタ（米国マサチューセッツ州ビルリカ、ミリポア社（Millipore））に通して濾過した。濾液からの細胞フリーエーリキアを１５、０００×ｇで１５分間遠心分離することによりペレット化し、そのペレットをＰＢＳ中に懸濁させ、その後、３０％ジアトリゾ酸メグルミン及びナトリウム溶液（Renografin）ＭＤ−７６Ｒ（米国ミズーリ州セントルイス、マリンクロット社（Mallinckrodt Inc））上に積層させた。懸濁液を、Ｓ５０−ＳＴスイングバケットロータ（米国インディアナ州インディアナポリス、ベックマン社（Beckman））中で、４°Ｃにて１００、０００×ｇで１時間遠心分離した。細胞フリーエーリキアのペレットを、１５、０００×ｇで１５分間洗浄し、実験に使用した。

細菌のｍＲＮＡ濃縮と配列決定

細菌ｍのＲＮＡ濃縮、ｃＤＮＡライブラリ作製、及びＲＮＡ配列決定を次のように行った。簡単に説明すると、野生型及び変異体からのＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（米国ミズーリ州セントルイス、シグマ−アルドリッチ社）を使用して、精製された細胞フリーエーリキアから単離した。次に、ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅＩ（米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロジェン社）で処理し、ＭＩＣＲＯＢＥｎｒｉｃｈ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州フォスターシティ、アンビオン社（Ambion））を使用して宿主１８Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡ、及びポリアデニル化ｍＲＮＡを除去することによって細菌ＲＮＡを濃縮した。濃縮前後の細菌ＲＮＡの量と完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（米国マサチューセッツ州ウォルサム、サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific））、及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（米国カリフォルニア州サンタクララ、アジレント・テクノロジー社（Agilent Technologies））を使用して評価した。Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡ試料からｍＲＮＡを単離し、次いで製造業者のプロトコールに従って短い断片に断片化した（米国ウィスコンシン州マディソン、エピセンター社（Epicentre））。続いて、ｍＲＮＡ断片を鋳型としてｃＤＮＡを合成した。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ドイツ国インゴルシュタット、イルミナ社（Illumina））を使用して、野生型及び変異体のｃＤＮＡライブラリを作製した。試料ライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザを使用して定量化した。試料ライブラリの品質は、試料をＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＴＭ４０００（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、ＢＧＩ社（Beijing Genomics Institute））による配列決定に供する前に、リアルタイムＰＣＲ（ABI StepOnePlus）によって評価した。

バイオインフォマティクス分析

元の画像データは、ベースコールにより生のシーケンスデータに転送された。生の読み取り値を品質評価に供して、マッピングに適しているかどうかを判断した。低品質（２０未満）の塩基は、分析から除外した。次に、生の読み取り値をフィルタ処理してアダプター配列及び低品質読み取り値を除外し、次いで、ＳＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ／ＳＯＡＰ２を使用して、最初に注釈付けされたＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＰ０００２３６．１に従って、クリーンな読み取り値をＥ．シャフェンシス・アーカンソー株完全ゲノムに整列させた。この登録番号が選択され使用されたのは、本願発明者の以前の刊行物及び同様に他の研究者が、そこに記載されている遺伝子名及び番号を参照するためにそれを広く使用したからである。アライメント解析に使用される標準カットオフであるアライメントでは、最大５つのミスマッチが許容された。アライメントデータを使用して、参照遺伝子上の読み取り値の分布を計算し、遺伝子範囲を決定した。アライメント結果を品質チェックのために評価し、次いで、ＤＧＥの分析を続けた。遺伝子発現レベルは、全読み取り長及び配列読み取り数を正規化するＲＰＫＭ方法を用いて計算した。遺伝子発現の有意差を判断するための閾値として、ｐ値＜０．０５、偽陽性率（ＦＤＲ）≦０．００１、及びＬｏｇ２比の絶対値≧１を用いた。ＦＤＲは、正確なｐ値を、ＲＮＡ配列データの多重試料比較における対照の尺度として使用する。偽陽性誤差及び偽陰性誤差の補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ法を用いて行った。

定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ

ＳＹＢＲグリーン検出に基づく定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ分析）を行い、ＲＮＡ配列データ分析で観察された遺伝子発現変化を検証した。また、ＲＮＡ配列データの生成に使用された野生型、ＥＣＨ＿０３７９変異体、ＥＣＨ＿０４９０変異体、及びＥＣＨ＿０６６０変異体のＲＮＡを使用して、転写物レベルを決定した。転写物レベルの決定は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロジェン社）を使用して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ分析による定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することより行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩを使用して全ての複製物からＲＮＡを逆転写し、次いで、順方向及び逆方向プライマーをそれぞれ０．５μＭ含有する２５μＬ反応において定量的ＰＣＲを実施した。温度サイクラーの条件は、９４°Ｃで１５秒間、６０°Ｃで３０秒間、７４°Ｃで１５秒間の４０サイクルであった。１３のランダムに選択された特異的に転写された遺伝子を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＴＭ）リアルタイムＰＣＲ機器（米国カリフォルニア州フォスターシティ、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を使用した検証実験で使用し、データをＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．３によって分析した。Ｅ．シャフェンシス１６Ｓ ｒＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化し、検証実験を実施する前に様々なＲＮＡバッチ間のＲＮＡ濃度の標準化に用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲデータについて、デルタ−デルタＣｔ（ΔΔＣｔ）計算を用いて発現の相対的変化を計算し、遺伝子発現の複製値及び標準誤差を平均化することによりフォールド変化を求めた。ＥＣＨ＿０４９０遺伝子のトランスポゾン変異下流の近傍のＥ．シャフェンシス遺伝子ＥＣＨ＿０４９０及びＥＣＨ＿０４９２を標的とする半定量的一段階ＲＴ−ＰＣＲ（米国カリフォルニア州カールスバッド、ライフ・テクノロジーズ社）を、以前の研究（PLoS One; 10, e0132657 (2015)）で説明された遺伝子特異的プライマーを用いて、３０サイクルの増幅で実施した。簡単に説明すると、野生型及びＥＣＨ＿０４９０変異体由来のＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。逆転写酵素または鋳型ＲＮＡを有さない１本のチューブを陰性対照として用いた。鋳型としてＤＮＡを有する１本のチューブを陽性対照として用いた。温度サイクラーの条件は、逆転写ステップについて、５０°Ｃで１時間、３５°Ｃで９４秒間、３０°Ｃで５５秒間、及び３０°Ｃで７２秒間の３０サイクルであった。最終的に、７２°Ｃでの２分間の伸長ステップが反応の一部であった。

リケッチア病原体のエーリキア・シャフェンシスは、ダニ媒介疾患であるヒト単球性エーリキア症を引き起こす。病原体の特定のゲノム位置内の変異は、発症機序の理解及び弱毒化ワクチンの開発に役立つ。本願発明者の以前の研究は、Ｅ．シャフェンシスの異なるゲノム部位の変異が、脊椎動物及びダニ宿主におけるそれらの成長及び減弱化に様々な影響を与えることを示した。ここでは、ＲＮＡディープシークエンシング技術を用いて、３つの変異の転写変化に対する影響を評価した。ＲＮＡ配列決定は、野生型及び変異体のＥ．シャフェンシスの転写物の６６〜８０％の検出に役立った。脊椎動物宿主の成長を抑制するアンチポータ遺伝子（ＥＣＨ＿０３７９）における変異は、多くの転写遺伝子の下方制御をもたらした。同様に、ＥＣＨ＿０４９０コード配列の下流の変異は、病原体のインビボでの増殖に対してはほとんど影響を与えなかったが、そのトランスクリプトームについては大きな変化をもたらした。この変異は、いくつかの宿主ストレス応答遺伝子の発現増強を引き起こした。ＥＣＨ＿０６６０遺伝子変異は、脊椎動物宿主において病原体の迅速な除去を引き起こして防御反応の発生を助けるにも関わらず、トランスクリプトームへの影響は最小限であった。トランスクリプトームデータは、全体的な遺伝子発現に対する変異の影響、及び変異が宿主からの病原体の抵抗性及び／またはクリアランスに対してどのように寄与するかに関する新規の知見を提供する。

エーリキア・シャフェンシスは、ヒト単球性エーリキア症（ＨＭＥ）を引き起こすダニ媒介細胞内細菌病原体であり、イヌ、シカ、ヤギ、及びコヨーテにも感染する。特定のゲノム位置における変異は、遺伝子発現の変化をもたらし、宿主において感染及び持続を引き起こす病原体の能力に影響を与える。Ｅ．シャフェンシスのゲノムは宿主細胞環境内で進化し、宿主免疫応答を低下させる機序を開発する恐れがある。発症機序に関連するＥ．シャフェンシス遺伝子は、宿主微小環境内で高度に活性化される可能性が高く、この仮説と一致して、宿主細胞防御に応答して異なる遺伝子発現が起こることが知られている。宿主細胞環境内でのエーリキアの生存に重要な遺伝子の同定に向けて進展があった。しかしながら、今日まで、発症機序に関連すると同定された豊富に発現している遺伝子はわずかである。発症機序及び病原性に関与する遺伝子を明らかにし、それらの差次的発現を記録することは、ＨＭＥに対する治療的介入及びワクチン開発の目標として価値のある新規のタンパク質の発見に役立つであろう。

遺伝的に変異した細胞内病原体は、微生物の発症機序を研究するための重要な資源であり、また、ワクチン開発にも役立つ。本願発明者の以前の研究は、Ｅ．シャフェンシスにおけるトランスポゾン・ベースの変異の実現可能性を示した。また、本願発明者は、膜タンパク質遺伝子の転写不活性化をもたらすいくつかの挿入変異が、脊椎動物宿主内での病原体の増殖の減衰を引き起こすことを見出した。ＥＣＨ＿０３７９遺伝子及びＥＣＨ＿０６６０遺伝子のコード領域内への挿入により、脊椎動物宿主における感染に対する様々なレベルの保護が提供された。本研究では、変異の特異的ゲノム位置が全体的な遺伝子発現に影響を与え、宿主細胞環境における病原体の生存、感染進行、及び複製の変化に寄与すると仮定した。この仮説を検証するために、Ｃｈｅｎｇらによって以前に報告された３つの変異が全体的な遺伝子転写に与える影響を評価した。ファージ様タンパク質（ＥＣＨ＿０６６０）をコードするＥＣＨ＿０６６０遺伝子、及びアンチポータタンパク質（ＥＣＨ＿０３７９）をコードするＥＣＨ＿０３７９遺伝子のコード領域内に変異を有する２つの変異体が選択された。ＥＣＨ＿０６６０遺伝子の挿入変異は、５５５塩基長オープンリーディングフレームのヌクレオチド位置２１３に位置する。同様に、ＥＣＨ＿０３７９遺伝子の変異は、１０５６塩基長のオープンリーディングフレームのヌクレオチド位置６８２に位置する。第３の挿入変異株ＥＣＨ＿０４９０は、ＥＣＨ＿０４９０遺伝子の終止コドンから１６６ヌクレオチド下流に挿入変異を有する。

高スループットＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ配列）技術は、偏性細胞内細菌におけるグローバルトランスクリプトーム活性を決定するための、信頼性のあるロバストなツールであることが証明されている。比較ゲノム研究により、病原体及び宿主細胞間の分子の分泌と、輸送及び宿主免疫応答の調節とに関与する病原性因子のいくつかのクラスが同定された。しかしながら、エーリキア遺伝子発現に焦点を当てた研究は、主に、外膜タンパク質遺伝子、ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）遺伝子、縦列反復タンパク質（ＴＲＰ）遺伝子、及びアンキリン反復遺伝子（Ａｎｋｓ）に限られていた。それらの中で、Ｔ４ＳＳタンパク質とｐ２８−ＯＭＰタンパク質をコードする遺伝子が、病原性に重要であることが見出されている。

Ｅ．シャフェンシスの偏性細胞内性質は、宿主細胞からの細胞フリーエーリキアの取得において問題がある。非常に豊富な宿主ＲＮＡからのエーリキアＲＮＡの単離における技術的制約は、病原体転写産物のプロファイリングにおける障害となっている。この短所を克服するために、本願発明者は、効果的な細胞溶解ストラテジー、及びそれに続く密度勾配遠心分離を用いた。さらに、本願発明者は、宿主と細菌のＲＮＡ混合物からポリアデニル化ＲＮＡ（ポリ（Ａ）ＲＮＡ）及び真核生物と原核生物のリボソームＲＮＡとを効率的に除去することにより、エーリキアＲＮＡを濃縮した。濃縮されたＲＮＡの配列決定は、注釈付けされたゲノム：ＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＰ０００２３６．１に従って、注釈付けされたＥ．シャフェンシス遺伝子の６６〜８０％の転写物の検出に役立つ。野生型株及び変異株からの転写物レベルの比較は、特にＥＣＨ＿０４９０及びＥＣＨ＿０３７９の変異株において、免疫原性及び分泌タンパク質遺伝子における最も高い程度の調節を明らかにしたが、ＥＣＨ＿０６６０変異株ではわずかな変化しか観察されなかった。

結果

宿主細胞からの細胞フリーＥ．シャフェンシスの単離及び精製

細胞内病原体のトランスクリプトーム研究を行うときの主な問題は、宿主細胞フリー細菌を単離し、次いで、高品質の細菌ＲＮＡを回収することの困難さである。Ｅ．シャフェンシスを含むリケッチア生物は、単離された全ＲＮＡのうちのほんの一部にすぎない。非常に豊富な宿主細胞ＲＮＡが存在するため、細菌ＲＮＡの回収は、ＲＮＡ配列解析実験の実施における問題である。本研究では、まず、密度勾配遠心分離プロトコールと組み合わせた効率的な細胞溶解法を用いて、感染宿主細胞（イヌのマクロファージ細胞株ＤＨ８２）から宿主細胞フリー細菌を精製した。宿主細胞溶解を実施し、細菌に大きな損傷を与えることなく宿主細胞を効率的に破壊した。Ｅ．シャフェンシス生物の直径は、約０．５〜１μｍである。したがって、感染した宿主細胞溶解物を２μｍの膜を通して濾過し、宿主細胞残屑の大部分を除去した。得られたＥ．シャフェンシス細胞懸濁液の高速レノグラフィン密度勾配遠心分離は、細菌のペレット化に役立ったが、宿主細胞の残骸が溶液の最上層に残った。全ＲＮＡ単離及びＤＮａｓｅ処理後、バイオアナライザ分析により、宿主細胞フリー細菌の事前分画にも関わらず、宿主２８Ｓ及び１８Ｓ ＲＮＡが回収ＲＮＡ中に高濃度で残存することが明らかになった。細菌ｍＲＮＡ濃縮は、細菌ＲＮＡ濃縮プロトコールを用いて、宿主ポリ（Ａ）ＲＮＡ及び真核生物リボソームＲＮＡを枯渇させることによって実施され、その結果、宿主２８Ｓ及び１８Ｓ ＲＮＡは、ほとんど検出できないレベルになった。精製ＲＮＡ試料中の汚染Ｅ．シャフェンシスのゲノムＤＮＡの不在を、Ｅ．シャフェンシス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーを使用したリアルタイム定量ＰＣＲによって確認した。また、ランダムに選択した２０のＥ．シャフェンシス遺伝子間非コード化ＤＮＡ配列（データは図示せず）を整列させることにより、ＲＮＡ配列生データにおけるＤＮＡ配列の欠如を確認した。

Ｅ．シャフェンシス変異体における遺伝子の普遍的転写

Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ． ４０００を用いたＥ．シャフェンシス野生型及び変異体のＲＮＡシーケンスにより、７５００万〜１億３０００万個の読み取り値が生成された。トランスクリプトームデータは、ＮＣＢＩバイオプロジェクトＩＤ：ＰＲＪＮＡ４２８８３７、及びＳＲＡ登録番号：ＳＲＰ１２８５３２に寄託された（Ｗｅｂサイトのｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｒａ／ＳＲＰ１２８５３２を参照）。宿主リボソームＲＮＡの効率的な枯渇にも関わらず、読み取り値の一部（１９パーセント未満）のみがＥ．シャフェンシスのゲノムにマップされた。読み取り値（１０個の読み取り値以上／ｇｅｎｅ）のマッピングにより、注釈付きゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＰ０００２３６．１）に基づいて、エーリキアゲノムから発現される遺伝子の約６６〜８０％が同定された。野生型生物（ｎ＝３）のトランスクリプトームは、全部で１１５８の遺伝子の約９２０の遺伝子の転写産物を含み、同様に、変異体生物ＥＣＨ＿０６６０、ＥＣＨ＿０３７９、及びＥＣＨ＿０４９０において、それぞれ８８８、８９５、及び７６８の遺伝子転写産物（ｎ＝３）が同定された（表３）。野生型（Ｒ^２＝０．９）及び変異体ＥＣＨ＿０３７９（Ｒ^２＝０．９３）、ＥＣＨ＿０４９０（Ｒ^２＝０．６８）、及びＥＣＨ＿０６６０（Ｒ^２＝０．８９）の複製ＲＮＡ配列データは、高度の発現相関を示した。野生型対ＥＣＨ＿０３７９（Ｒ^２＝０．１８）、及び野生型対ＥＣＨ＿０４９０（Ｒ^２＝０．３８）の散布図発現データは、負の相関を示した。注目すべきことに、野生型対ＥＣＨ＿０６６０の発現プロットは、正の相関を示した（Ｒ^２＝０．９６）。差次的発現分析には、キロベースあたりのトランスクリプトーム数／百万のマップ読み取り値（ＲＰＫＭ）≧１の転写物のみが検討された。

Ｅ．シャフェンシスのグローバルトランスクリプトーム

野生型Ｅ．シャフェンシスにおける転写産物の分布は、５以下の転写産物で表される４８１の転写産物を含み、それに、トランスクリプトームの１９％に相当する仮想タンパク質転写産物（１７８）及び１２７のリボソームタンパク質遺伝子転写産物（１４％）が続いた。次に多いのは、主要な外膜タンパク質（２２の転写産物）の転写産物であった。１４の遺伝子からコードされる保存されたドメインタンパク質転写物は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ複合体と関連している。他の高度に発現された遺伝子には、分子シャペロン、ＡＴＰシンターゼ、推定膜タンパク質、シトクロムｃオキシダーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質、推定リポタンパク質、翻訳伸長因子、ＡＢＣトランスポータ、及びＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらは全てトランスクリプトームの０．５〜１．７％に相当する。

ＥＣＨ＿０３７９変異は、アンチポータ活性に関与する様々な遺伝子、ファージタンパク質、並びに、輸送及び転写機能に関与する遺伝子の転写下方制御を引き起こす。

変異体と野生型とのＲＰＫＭ発現値を比較することにより、差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）を測定した。ｐ値＜０．０５、ＦＤＲ（False Discovery Rate）≦０．００１、及び複製間の表現値の一致性により、折り畳みの変化が有意であると見なされた。遺伝子発現の変化は、ハウスキーピング遺伝子の変異体と野生型との間で有意ではなかった。これらの基準に基づき、野生型と比較して、ＥＣＨ＿０３７９遺伝子変異体では、４１の遺伝子が主に下方制御され、２つの遺伝子が上方制御されたと判断された（表４）。転写レベルの有意な低下を示した最も顕著な遺伝子は、アンチポータタンパク質、ＡＢＣトランスポータ、及びＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ（ＥＣＨ＿０３６７）をコードする遺伝子であった。４つのアンチポータタンパク質遺伝子：一価カチオン／プロトンアンチポータ（ＥＣＨ＿０４６６）、Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）アンチポータサブユニットＣ（ｍｒｐＣキー）（ＥＣＨ＿０４６９）、カリウム取込タンパク質ＴｒｋＨ（ＥＣＨ＿１０９３）、及び窒素調節タンパク質ＮｔｒＹ（ＥＣＨ＿０２９９）は転写レベルの有意な低下を示した。加えて、２つの膜トランスポータの転写物、すなわち、遺伝子ＥＣＨ＿０５１７のカチオンＡＢＣトランスポータ・パーミアーゼ・タンパク質転写物、及び遺伝子ＥＣＨ＿０９７２の別のＡＢＣトランスポータ・パーミアーゼ・タンパク質転写物が下方制御された。ファージ様タンパク質｛ファージプロヘッドプロテアーゼ（ＥＣＨ＿００３２）、ファージポータルタンパク質（ＥＣＨ＿００３３）、ファージメジャーキャプシドタンパク質（ＥＣＨ＿０８３０）｝をコードする３つの遺伝子も、この変異株で下方制御された。転写に関与する６つの遺伝子、すなわち、ＤＮＡ複製及び復元タンパク質ＲｅｃＦ（ＥＣＨ＿００７６）、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＥＣＨ＿０６０２）、ジメチルアデノシントランスフェラーゼ（ＥＣＨ＿０６４８）、ＧＴＰ結合タンパク質ＥｎｇＡ（ＥＣＨ＿０５０４）、ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥＣＨ＿０７９４）、及びエンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＣＨ＿０８５７）の転写物も、この変異株で下方制御された。また、グルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ）（ＥＣＨ＿０１２５）、ＤＮＡ／パントテン酸（ＰＭＦ）代謝フラビンタンパク質（ＥＣＨ＿０３７４）（ＥＣＨ＿０３９２）、ＡＴＰアーゼ、ＡＧＦ１（ＵＰＧＳ）、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ（ＥＣＨ＿０４８０（ＥＣＨ＿０４８０））、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＤＡＰＤＣ）（ＥＣＨ＿０４８５）、ビオチン−アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼリガーゼ（ＢＡＣＬ）（ＥＣＨ＿０８４８）、及びアルギニノスクシナートリアーゼ（ＡＳＬ）（ＥＣＨ＿０９３７）などの代謝過程の酵素も下方制御される。８つの仮想タンパク質遺伝子の転写産物；ＥＣＨ＿００２１、ＥＣＨ＿０１６１、ＥＣＨ＿０２６４、ＥＣＨ＿０２８９、ＥＣＨ＿０７２５、ＥＣＨ＿０８７９、ＥＣＨ＿０９１３、及びＥＣＨ＿１０５３も、この変異体における下方制御された遺伝子中に存在した。

変異体ＥＣＨ＿０４９０におけるＴ４ＳＳ及びｐ−２８ＯＭＰ遺伝子クラスタ遺伝子の差次的転写調節

ＥＣＨ＿０４９０変異株では、３７の遺伝子が有意に下方制御され、１７の遺伝子が上方制御された（表５）。Ｔ４ＳＳに属する下方制御された遺伝子のうちの４つは、ＥＣＨ＿０４９４（ＶｉｒＢ３）、ＥＣＨ＿０４９６（ＶｉｒＢ６）、ＥＣＨ＿０４９８（ＶｉｒＢ６）、及びＥＣＨ＿０４９９（ＶｉｒＢ６）；及びＩ型分泌膜融合タンパク質（（Ｔ１ＳＳ＿ＨｌｙＤ）ＥＣＨ＿０９７０）である。また、低温ショックタンパク質（ＣＳＰ）（ＥＣＨ＿０２９８）及びＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼなどの分子シャペロン遺伝子、並びに、ＡＴＰ結合サブユニットＣｌｐＡ（ＣｌｐＡ）も下方制御された。また、タンパク質輸出膜タンパク質（ＳｅｃＦ）（ＥＣＨ＿００９５）、前タンパク質トランスロカーゼ（ＳｅｃＹ）（ＥＣＨ＿０４２８）、カリウム取り込みタンパク質（ＴｒｋＨ）（ＥＣＨ＿１０９３）、及び窒素調節タンパク質（ＮｔｒＹ）（ＥＣＨ＿０２９９）を含む輸送タンパク質も下方制御された。また、生合成プロセスに関与する代謝酵素｛テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）（ＥＣＨ＿００５８）、キノンオキシドレダクターゼ（ＥＣＨ＿０３８５（ＥＣＨ＿０３８５））、メタロエンドペプチダーゼ（ＭＥＰ）（ＥＣＨ＿０６４４）、ペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）（ＥＣＨ＿０９３９）、セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰ）（ＥＣＨ＿０９６４）、ピロホスファターゼ（ＰＰｉ）（ＥＣＨ＿１０１４）、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴａｓｅ）（ＥＣＨ＿１１０８）｝も下方制御された。また、伸長因子（ＥＦ−Ｔｕ）（ＥＣＨ＿０５１５）、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＩＡＲＳ）（ＥＣＨ＿０５３８）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＨＵ）（ＥＣＨ＿０８０４）、３´−５´エキソヌクレアーゼドメイン（ＥＣＨ＿１０１１）、及びＤＮＡ結合応答調節因子（ＥＣＨ＿１０１２）などの転写及び翻訳関連遺伝子も下方制御された。

この変異体の上方制御されたタンパク質遺伝子には、膜貫通タンパク質カテゴリーに属する７つの遺伝子が含まれる。これらのうちの４つは、ｐ−２８ＯＭＰ遺伝子クラスタ｛ＥＣＨ＿１１４３（ＯＭＰ−ｐ２８）、ＥＣＨ＿１１４６（ＯＭＰ−ｐ２８−２）、ＥＣＨ＿１１３６（ＯＭＰ−１Ｂ）、及びＥＣＨ＿１１２１（ＯＭＰ−１Ｎ）｝に属する。加えて、２つの推定膜タンパク質遺伝子（ＥＣＨ＿０００９、ＥＣＨ＿０２３０）と免疫優性表面タンパク質遺伝子（ＥＣＨ＿００３９）が上方制御された。また、熱ショックタンパク質ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ、ＣｌｐＡ（ＥＣＨ＿０５６７）とＡＴＰ結合シャペロン、ＣｌｐＢ（ＥＣＨ＿０３６７）、及びストレス応答関連ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子（ＲｐｏＨ）（ＥＣＨ＿０６５５）に対する転写も上方制御された。また、鉄硫黄タンパク質｛ＢｏｌＡファミリータンパク質（ＥＣＨ＿０３０３）及びＦｅＳクラスタ集合足場（ＩｓｃＵ）（ＥＣＨ＿０６３０）｝をコードする２つの遺伝子の転写物も同様に上方制御された。ＥＣＨ＿０１６６、ＥＣＨ＿０２５１、ＥＣＨ＿０４５０、ＥＣＨ＿０５３１、ＥＣＨ＿０７５３、及びＥＣＨ＿０８７８を含む６つの仮想タンパク質遺伝子の差次的発現を観察した。

ＥＣＨ＿０６６０遺伝子の変異は最小限の転写変化をもたらした。

ＥＣＨ＿０３７９変異体及びＥＣＨ＿０４９０変異体の両方において劇的な遺伝子発現変化が観察されたが、ＥＣＨ＿０６６０変異体トランスクリプトームの変化は、野生型と比較してわずかであった。この変異体で、顕著に差次的に発現する５つの遺伝子のみが観察された（表６）。窒素調節タンパク質（ＮｔｒＹ）（ＥＣＨ＿０２９９）及びＡＢＣトランスポータ・パーミアーゼ・タンパク質（ＥＣＨ＿０９７２）は下方制御されたが、ヘムエクスポータタンパク質ＣｃｍＡ（ＥＣＨ＿０２９５）及びシャペロニン（ＥＣＨ＿０３６４）は上方制御された。また、本願発明者は、ＥＣＨ＿０３７９及びＥＣＨ＿０４９０（表７）に共通して差次的に発現するいくつかの遺伝子を同定した。リボヌクレアーゼＤ（ＥＣＨ＿０３００）及びカリウム取り込みタンパク質（ＥＣＨ＿１０９３）は、ＥＣＨ＿０３７９及びＥＣＨ＿０４９０において共通して下方制御された。Ｔ４ＳＳタンパク質ＶｉｒＢ４遺伝子は、ＥＣＨ＿０４９０変異体では下方制御されたが、この遺伝子はＥＣＨ＿０３７９変異体では上方制御された。これと逆に、ＣｌｐＢは、ＥＣＨ＿０３７９変異体では下方制御され、ＥＣＨ＿０４９０変異体では上方制御された。

定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによるＲＮＡ配列データの検証

定量的リアルタイム定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を、ＲＮＡ配列データに従って差次的に転写されたと同定された、ランダムに選択された１３の遺伝子について実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータを生成するために、まず、Ｃｈｅｎｇらの文献に記載されているように、ＲＮＡ試料を、１６Ｓ ＲＮＡをコードする構成的に発現されたＥ．シャフェンシス遺伝子に対して正規化した。ＥＣＨ＿０４６６、並びに、ｍｒｐＣ、ＣｌｐＢ、ＥＣＨ＿００３３、ＮｔｒＹ、ＴｒｋＨ、及びＥＣＨ＿０９７２を含むＥＣＨ＿３７９変異体における７つの下方制御された遺伝子についての転写産物量を検証した。同様に、ＯＭＰ遺伝子クラスタに属する４つの転写物（ＯＭＰ−ｐ２８、ＯＭＰ−１Ｂ、ＯＭＰ−１Ｎ、ＯＭＰ−ｐ２８−２）、並びに、ＣｌｐＢ及びＲｐｏＨ遺伝子の各々からの１つを含むＥＣＨ＿０４９０変異株からの６つの上方制御された遺伝子を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検証した。同様に、ＥＣＨ＿０２９９及びＥＣＨ＿０９７２遺伝子の転写物の下方制御を、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＥＣＨ＿０６６０変異体で確認した。

考察

非常に豊富な宿主ＲＮＡからの細胞フリー細菌ＲＮＡの単離は、細胞内病原体の転写プロファイリングにおける最初の問題である。リケッチア目は、宿主細胞内で培養する必要があり、その後に、トランスクリプトーム評価実験のためにＲＮＡを抽出する前に精製する必要がある。Ｅ．シャフェンシス転写に対する３つのトランスポゾン変異の影響を実証するために、本願発明者は、まず、宿主細胞フリーＥ．シャフェンシス生物を単離及び精製するための方法を開発し、そして、Ｅ．シャフェンシス生物からＲＮＡを単離して、次世代配列（ＮＧＳ）解析に供した。細胞フリーＥ．シャフェンシスを単離するために、まず、効率的な宿主細胞溶解プロトコールを実施し、次いで、全細胞溶解物の濾過を行い、その後に、レノグラフィン密度勾配遠心分離を行った。第２の問題は、トランスクリプトームプロファイリングのための宿主細胞無ＲＮＡを得ることであった。以前の研究では、細菌ＲＮＡ濃縮法での細菌ＲＮＡ読み取り濃縮はわずか３〜１０％であると報告されている。本研究で実施した宿主細胞フリー細菌の単離及び細菌ＲＮＡ精製ステップは、Ｅ．シャフェンシスＲＮＡのより高い濃縮を可能にした。本願発明者による本研究では、細菌ＲＮＡを濃縮することができ、これは、最大１９％の高マッピングＲＮＡ読み取り値の生成を助けた。注目すべきことに、ディープＲＮＡ配列解析は、感染マクロファージ宿主細胞内で発現したＥ．シャフェンシス遺伝子の８０％のマッピングに役立った。

高度に発現した遺伝子のうちで、ｐ２８−ＯＭＰ多遺伝子クラスタは、トランスクリプトームにおいて優性であった。Ｅ．シャフェンシスｐ２８−ＯＭＰ多遺伝子座は、細菌免疫優性タンパク質をコードする２２のタンデムに配置された遺伝子を含む。ＲＮＡ配列データにおける２２の転写物すべての存在は、この遺伝子クラスタは、最も豊富に発現された遺伝子のうちの１つであることを示唆する。これらの観察結果は、ｐ２８−ＯＭＰ遺伝子の発現量を報告した本願発明者の以前のプロテオミクス研究と一致する。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ複合体遺伝子も、Ｅ．シャフェンシスにおいて高度に発現した。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、ファゴソームのＮＯＸ２応答に対抗して宿主細胞のアポトーシス３４を阻害する。いくつかの病原性細菌におけるＴ４ＳＳエフェクタタンパク質は、宿主免疫応答を弱体化させるために宿主遺伝子発現を操作するのに重要であると考えられている。病原性におけるＴ４ＳＳエフェクタの寄与は、Ａ．マージナーレ、Ａ．ファゴサイトフィルム、Ｅ．カニス、及びＥ．シャフェンシスを含むリケッチア目で既に報告されている。ＲＮＡ配列解析により、ＶｉｒＢ３、Ｂ４、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１を含むＴ４ＳＳタンパク質をコードするいくつかの転写物が同定された。また、シャペロンタンパク質遺伝子ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥ、及びＣｌｐＢも、野生型株及び変異株の両方で高度に発現した。細胞恒常性及び酸化ストレス応答に関与するこのようなタンパク質の存在は、他のリケッチア目でも報告されており、これは、病原体プロテオームが本研究で報告されたトランスクリプトームにより同様に変化するならば、それらの遺伝子産物もＥ．シャフェンシスのストレス応答に重要であることを示唆する。実際、本願発明者による本研究は、ストレス応答タンパク質がＥ．シャフェンシスにとって重要であることを示唆している。他の高度に発現されたタンパク質遺伝子には、タンパク質合成に関与するハウスキーピングリボソームタンパク質、推定上の膜タンパク質、ＡＢＣトランスポータ、及びリポタンパク質をコードするものが含まれる。これらは全て、病原体のタンパク質合成、運搬、輸送、及び宿主細胞へのエフェクタ分泌に重要である可能性が高い。また、ＡＴＰシンターゼサブユニット、チトクロームｃオキシダーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質、並びに、エネルギー代謝、細胞分裂、及び転写調節に関与する翻訳伸長因子も、野生型生物及び変異体生物の高発現遺伝子中に存在した。トランスクリプトームのカバー率は、ＩＳＥ６及びＡＡＥ２ダニ細胞８においてＥ．シャフェンシスに関して以前に報告されたものよりも高い。これは、細胞内病原体転写物の検出の増強と、観察される遺伝子発現量の両方にとって重要である。トランスクリプトームのより高いカバー率は、マイクロアレイ分析と比較して、次世代配列決定によるＲＮＡのディープ配列決定の結果である可能性が高い。この高発現遺伝子のグローバルセットは、宿主細胞環境におけるＥ．シャフェンシスの病原性、複製、及び生存に関与する産物を示し得る。また、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが知られているアンキリン反復タンパク質をコードする４つの転写物も、トランスクリプトームで同定された。注目すべきことに、野生型生物及び変異体生物由来のトランスクリプトームは、機能不明の仮想タンパク質をコードする２１６の転写物を含む。これらはコアトランスクリプトーム中に存在していたので、本願発明者は、これらがＥ．シャフェンシスの複製のための重要な転写遺伝子セットであると予想した。

ＥＣＨ＿０３７９変異体の多数の遺伝子からの転写が野生型に比べて減少していることが分かった。アンチポータ、ＡＢＣトランスポータ、シャペロン、代謝酵素、転写調節因子を代表する遺伝子は、下方制御される遺伝子のうちの１つである（表４）。本願発明者は、アンチポータタンパク質遺伝子における変異が代謝低下を引き起こしたと予想した。アンチポータタンパク質及びトランスポータタンパク質は、細菌の細胞膜を横断してのイオン及び溶質の輸送において重要な役割を果たす。アンチポータは、膜内在性タンパク質であり、リン脂質膜を横断してのＮａ^＋及び／またはＫ^＋のＨ^＋への二次輸送を行う。Ｅ．シャフェンシスのゲノムは、アンチポータタンパク質またはそれらのサブユニットと相同性を有するいくつかの遺伝子を含み、それらが、病原体の染色体内複製及び宿主での生存に必要であることを示唆する。特に、アンチポータは、細菌のｐＨ、塩、温度の状態を維持することを助ける。本願発明者は、一価カチオン／Ｈ^＋アンチポータサブユニットＣ（ＥＣＨ＿０４６９）及びＥＣＨ＿０４６６などのアンチポータ遺伝子の転写の有意な低下を観察した。アンチポータ機能を破壊するか、またはそれらの発現を妨げることにより、インビボでの病原体の増殖に影響を与えることができる。実際、ＥＣＨ＿０３７９遺伝子の変異は、偶生宿主（イヌ）及び保有宿主（オジロジカ）の両方で生物の増殖を抑制した。ＡＢＣトランスポータは、イオン及びアミノ酸の取り込みにも関与しており、宿主細胞環境に感染して生き残るための病原体の能力に重要な役割を果たし得る。ＥＣＨ＿０３７９変異体は、ＡＢＣトランスポータをコードする遺伝子ＥＣＨ＿０５１７及びＥＣＨ＿０９７２の転写活性のレベルが低く、感染の発症機序の様々なステージで機能する。これらのタンパク質は、宿主の微小環境における病原体の生存を促進する。この変異は、おそらくは輸送機構を阻害し、それにより、宿主細胞に感染して生存する病原体の能力に影響を与える。また、この変異は、病原体の代謝活性の調節などの生理学的反応に関与する遺伝子の転写の変化を引き起こし得る。また、本願発明者は、代謝酵素をコードするいくつかの転写物、すなわち、グルタミン酸−システインリガーゼ、ＤＮＡ／パントテン酸代謝フラビンタンパク質ファミリータンパク質、ＡＴＰアーゼ、ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ビオチン−アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼリガーゼ、及びアルギニノスクシナートリアーゼの下方制御も見出した。一般的に、細胞内環境内での病原体の生存は、宿主細胞から栄養を得る能力に依存する。病原性細菌は、代謝経路と病原性関連因子を用いて宿主免疫系を弱体化させて、宿主細胞から栄養を得る。ＥＣＨ＿０３７９変異体における前述の遺伝子からの転写物の下方制御により、細菌の代謝応答及び宿主から栄養を得る能力を妨げることが可能である。また、この変異は、ＤＮＡ複製及び復元タンパク質、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ、ジメチルアデノシントランスフェラーゼ、及びロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードする遺伝子の発現低下も引き起こした。また、これは、病原体の細胞内増殖及び生存における欠陥にも寄与し得る。本願発明者の以前の研究は、変異体の増殖が抑制されているにも関わらず、野生型感染の問題に対する完全な保護を提供できなかったことを示唆する。トランスクリプトームの変化がプロテオームの変化と相関する場合、野生型Ｅ．シャフェンシスと比較した変異体生物のタンパク質発現の変化は、宿主応答の変化をもたらし得る。したがって、変異体生物に暴露された場合、宿主が防御的宿主応答を開始するときの効果を低下させる。

病原性細菌は、宿主細胞遺伝子発現を弱めるＴ４ＳＳエフェクタを産生し、細菌毒性に寄与する。ＲＮＡ配列データは、ＥＣＨ＿０４９０変異体における様々なＴ４ＳＳ成分タンパク質遺伝子転写物の発現低下を示唆する。また、本願発明者は、ＥＣＨ＿０４９０変異株において、転写及び翻訳機構に関与するシャペロンタンパク質及びいくつかの遺伝子、並びに、エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡ結合調節因子遺伝子転写物の転写低下を観察した。それどころか、ＣｌｐＢ（主要なストレス応答熱ショックタンパク質）及びＲｐｏＨ（ストレス応答ＲＮＡポリメラーゼ転写サブユニット）は、変異体において転写の増加を示した。

シャペロンタンパク質は、タンパク質の脱凝集、及び病原体が、宿主細胞誘導ストレスを克服するのを助けるのに重要な役割を果たす。ＣｌｐＢは、ストレス条件下で蓄積した凝集タンパク質を再活性化し、Ｅ．シャフェンシスの複製ステージで豊富に発現した。宿主細胞内の細菌増殖中のタンパク質凝集及び関連するタンパク質不活性化を予防または減少させることは、病原体の生存を高める上で有益であり得る。ＲＮＡポリメラーゼの転写調節因子であるＲｐｏＨは、ストレス応答タンパク質の発現を促進するため、病原体の継続的な増殖にも重要である。予想と一致して、ＣｌｐＢ及びＲｐｏＨの発現増加が、ＥＣＨ＿０４９０変異体についての本研究で観察された。これらの２つの重要な遺伝子からの発現増強は、本願発明者の以前の研究で報告されたように、脊椎動物及びダニ宿主内の野生型Ｅ．シャフェンシスと同様に変異体を成長させることを可能にする可能性が高い。外膜タンパク質は、宿主におけるＥ．シャフェンシス及びＥ．ルミナンチウムを含むエーリキア種の生存に不可欠な侵入、輸送、免疫応答、及び接着などの様々な機能を果たす。ＥＣＨ＿０４９０変異体は、野生型生物と比較して、ＯＭＰの個体数が増加した。本願発明者は、上方制御するべき、免疫優性Ｐ２８／ＯＭＰファミリータンパク質（ＯＭＰ＿ｐ２８、ＯＭＰ＿ｐ２８−２、ＯＭＰ−１Ｂ、及びＯＭＰ−１Ｎ）、及び膜タンパク質（ＥＣＨ＿００３９、ＥＣＨ＿０００９、及びＥＣＨ＿０２３０）をコードする７つの膜貫通遺伝子を見出した。外膜タンパク質の個体数の有意な変化は、膜構造の全体的な変化と関連しており、それにより、病原体の宿主防御に対する感受性を変化させる。ＥＣＨ＿０４９０変異体で認められた転写変化は、病原体に悪影響を与えなかった。その理由は、この変異体は、オジロジカ（保有宿主）とイヌ（偶生宿主）の両方、及びそのダニの宿主であるアムブリオンマ−アメリカヌム（Amblyomma americanum）において野生型病原体と同様に増殖するためである。トランスポゾン挿入変異の上流及び下流にそれぞれ位置する遺伝子ＥＣＨ＿０４９０（リポ酸シンテターゼ）及びＥＣＨ＿０４９２（推定リン酸ＡＢＣトランスポータ）の転写活性評価は、この変異がこれらの遺伝子転写に影響を与えないことを示唆する。この変異体のトランスクリプトームにおける多様な変化は、変異部位の付近には影響を与えないが、この変異体が全体的な遺伝子発現に影響を与え、なおかつ、脊椎動物及びダニ宿主における病原体の生存には悪影響を与えないことを示唆する。

最も注目すべき観察結果は、野生型Ｅ．シャフェンシスと比較して、ＥＣＨ＿０６６０変異体のトランスクリプトームにおける明らかな最小変異であった。重要なことに、ＥＣＨ＿０６６０遺伝子内の変異は、脊椎動物宿主においてインビボでの重度の増殖障害を引き起こす。さらに、この変異体の感染は、強力な宿主応答を開始し、野生型病原体感染の問題に対する保護を与える。本研究では、野生型と比較して、この変異体における遺伝子発現のわずかな変化のみが観察された。遺伝子発現の微細な変化は、推定窒素調節タンパク質、ＡＢＣトランスポータ、ヘム輸出タンパク質、及びＧｒｏＥＳをコードする遺伝子が含まれるが、その変化は、以前の２つの変異体において記載された様々な変化と比較して有意に少なかった。まとめると、これらのデータは、ＥＣＨ＿０６６０遺伝子の変異により転写変化が減少したことを示唆している。Ｅ．シャフェンシスの野生型及び変異株のプロテオームがトランスクリプトームと同様に変化すると仮定すると、ＥＣＨ＿０６６０変異体プロテオームは野生型細菌と非常に類似している。この変異体と野生型との間の類似度が高いと、この変異体を野生型生物により似ているものとして脊椎動物宿主に認識させることが可能となり、これにより、野生型感染を模倣した強力な宿主応答を誘導することができる。この変異体について以前に報告された複製欠損は、ＥＣＨ＿０６５９及びＥＣＨ＿０６６０などのより少ない遺伝子からの遺伝子発現の喪失に起因し、その一方で、野生型と同様にトランスクリプトームの大部分を維持している。

結論

細胞内細菌におけるＲＮＡディープ配列決定の研究は、依然として大きな問題である。ここで報告されたＲＮＡ配列データは、Ｅ．シャフェンシスの比較トランスクリプトミクスの最初のスナップショットを提供する。野生型及び変異株由来の豊富な細菌ＲＮＡの配列決定は、遺伝子の高カバー率をもたらした。ＥＣＨ＿０３７９遺伝子のＯＲＦにおける変異は、代謝低下をもたらす遺伝子の劇的な下方制御を引き起こし、これは、脊椎動物宿主における変異の減弱化に寄与した。ＥＣＨ＿０４９０遺伝子のタンパク質コード配列の下流の変異は、遺伝子発現の全体的変化を誘導したが、ストレス応答調節遺伝子の上方制御は、変異体が脊椎動物宿主及びダニ宿主内で生存するのを助けた。ＥＣＨ＿０６６０遺伝子コード配列内の変異は、ほとんど転写変化せず、したがって、トランスクリプトームの完全性を野生型と同様に維持した。トランスクリプトームデータは、タンパク質発現変動を示唆するが、結果を確認するためにはタンパク質分析研究からの追加的な実験的検証が必要である。まとめると、本研究は、Ｅ．シャフェンシスについてのトランスクリプトームデータの最初の詳細な説明を提供し、宿主内での病原体の生存能力、及び病原体に対する防御を誘導する宿主の能力における観察された変動は、遺伝子発現の全体的な変化の結果であり、それは、病原体のプロテオームの変化に影響することを示唆する。

Claims (36)

1. 免疫原性組成物であって、
   標的アレル交換変異体を含有するリケッチア目またはクラミジア目の細菌と、
   獣医学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、アジュバント、防腐剤、緩衝剤、抗生物質、細胞培養上清、免疫調節剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される成分と、を含むことを特徴とする免疫原性組成物。
2. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
   前記リケッチア目またはクラミジア目の細菌は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各種からなる群より選択されることを特徴とする免疫原性組成物。
3. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
   前記エーリキア種の細菌は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ルミナンチウム、及びエーリキア・カニスからなる群より選択されることを特徴とする免疫原性組成物。
4. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
   前記アナプラズマ種の細菌は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、アナプラズマ・プラチス、及びアナプラズマ・マージナーレからなる群より選択されることを特徴とする免疫原性組成物。
5. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
   前記標的アレル交換変異体は、前記細菌を弱毒化することを特徴とする免疫原性組成物。
6. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
   前記標的アレル交換変異体は、遺伝子を不活化することを特徴とする免疫原性組成物。
7. 請求項６に記載の免疫原性組成物であって、
   前記遺伝子は、複製を助ける役割を果たすことを特徴とする免疫原性組成物。
8. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
   前記標的アレル交換変異体は、エーリキア・シャフェンシスのＥｃｈ＿０３７９若しくはＥｃｈ＿０６６０、または、同種の別の株由来の相同遺伝子内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
9. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
   前記標的アレル交換変異体は、エーリキア・カニスのＥｃａｊ＿０３８１、または、同種の別の株由来の相同遺伝子内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
10. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
    前記標的アレル交換変異体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのＡＰＨ＿０６３４、または、同種の別の株由来の相同遺伝子内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
11. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
    前記標的アレル交換変異体は、Ｅｃｈ＿０６６０、または、別の近縁のエーリキア・シャフェンシス株若しくは別の近縁のエーリキア種及びそれら株における相同体内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
12. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
    前記成分は、サポニン、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、モンタニドゲル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアジュバントであることを特徴とする免疫原性組成物。
13. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
    別の病原体由来の抗原をさらに含むことを特徴とする免疫原性組成物。
14. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
    前記細菌は、配列番号３５、配列番号５４、または配列番号５５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする免疫原性組成物。
15. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
    前記標的アレル交換変異体は、別のエーリキア種由来のエーリキア・シャフェンシス Ｅｃｈ＿０３７９またはＥｃｈ＿０６６０遺伝子相同体内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
16. 請求項２に記載の免疫原性組成物であって、
    前記標的アレル交換変異体は、別のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム種由来のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム ＡＰＨ＿０６３４遺伝子相同体内に存在することを特徴とする免疫原性組成物。
17. リケッチアまたはクラミジア目細菌によって引き起こされる臨床症状の発生率及び重症度の少なくとも一方を低減させる方法であって、
    免疫原性組成物を投与するステップであって、
    前記免疫原性組成物が、
    標的アレル交換変異体を含有するリケッチア目またはクラミジア目の細菌と、
    獣医学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、アジュバント、防腐剤、緩衝剤、抗生物質、細胞培養上清、免疫調節剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される成分と、を含む、該ステップを有することを特徴とする方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記免疫原性組成物が、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、気管内、膣内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、経口、髄腔内、任意の標的組織への直接注入、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される投与方法を用いて投与されることを特徴とする方法。
19. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記投与ステップの後に、第２の投与ステップが行われることを特徴とする方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、
    前記第２の投与ステップは、前記投与ステップの少なくとも７日後、またはそれ以降の任意の時点で行われることを特徴とする方法。
21. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記発生率の低減は、前記免疫原性組成物の投与を受けていない動物群と比較して少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
22. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記重症度の低減は、前記免疫原性組成物の投与を受けていない動物群と比較した場合のものであることを特徴とする方法。
23. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記重症度の低減は、前記免疫原性組成物の投与を受けていない動物群と比較して少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
24. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記リケッチア目またはクラミジア目の細菌は、エーリキア、アナプラズマ、ネオリケッチア、リケッチア、オリエンティア、及びクラミジアの各種からなる群より選択されることを特徴とする方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、
    前記エーリキア種の細菌は、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ルミナンチウム、及びエーリキア・カニスからなる群より選択されることを特徴とする方法。
26. 請求項２４に記載の方法であって、
    前記アナプラズマ種の細菌は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、アナプラズマ・プラチス、及びアナプラズマ・マージナーレからなる群より選択されることを特徴とする方法。
27. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記標的アレル交換変異体は、遺伝子を不活化することを特徴とする方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、
    前記不活化される遺伝子は、複製に関与することを特徴とする方法。
29. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記標的アレル交換変異体は、エーリキア・シャフェンシスのＥｃｈ＿０３７９若しくはＥｃｈ＿０６６０、または、Ｅｃｈ＿０３７９若しくはＥｃｈ＿０６６０に対して７０％以上の相同性を有し、かつ同一生物または別の近縁のエーリキア種の別の地理的隔離物若しくは株に属する遺伝子相同体内に存在することを特徴とする方法。
30. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記標的アレル交換変異体は、エーリキア・カニスのＥｃａｊ＿０３８１、または、Ｅｃａｊ＿０３８１に対して７０％以上の相同性を有し、かつ同一生物または別の近縁のエーリキア種の別の地理的隔離物若しくは株に属する遺伝子相同体内に存在することを特徴とする方法。
31. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記標的アレル交換変異体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルムのＡＰＨ＿０６３４、または、ＡＰＨ＿０６３４に対して７０％以上の相同性を有し、かつ同一生物または別の近縁のアナプラズマ種の別の地理的隔離物若しくは株に属する遺伝子相同体内に存在することを特徴とする方法。
32. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記成分は、サポニン、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ、モンタニドゲル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアジュバントであることを特徴とする方法。
33. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記細菌は、配列番号３５、配列番号５４、または配列番号５５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする方法。
34. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記動物は、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、シカ、コヨーテ、ネコ、及び家禽からなる群より選択されることを特徴とする方法。
35. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記動物は、前記投与を受けたときに３週齢から６ヶ月齢であることを特徴とする方法。
36. 請求項１７に記載の方法であって、
    前記標的アレル交換変異体は、近縁種、近縁株、及び遺伝子単離物由来のＥｃｈ＿０６６０またはその相同体を不活化することを特徴とする方法。