JP2015534822A - 条件的弱毒化細菌種ならびにその調製法および使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、条件的弱毒化細菌種ならびにその調製法および使用法を提供する。本明細書で使用される「条件的弱毒化」という用語は、細菌がその宿主生物外にあるときは細菌が増殖によって成長する能力に実質的に全く影響を及ぼさないが、その宿主生物内、例えばワクチン被接種者の宿主細胞内に導入されたときに細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子の欠失をもたらす１組の規定された組換え修飾を含む、細菌を指す。このような組換え修飾は、哺乳動物宿主内での遺伝子発現を選択的に誘導する制御配列を利用するものである。【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，２３４号の利益を主張し、前述出願は表、図面および請求項をすべて含めたその全体が組み込まれる。

本発明の背景に関する以下の考察は、単に読者が本発明を理解するのを補助するために提供されるものであって、本発明の先行技術を記載するかこれに相当するものとして認められるものではない。

病原生物は、定義によれば、感染した宿主に疾患を引き起こすことができるものである。このような生物体の臨床使用には、病原性の低下または除去を示すが、依然として目的とする病原体または異種抗原（１つまたは複数）に対する所望の免疫応答を刺激するのに十分な生存能を保持している弱毒化ワクチン菌株を作製することが多い。感染症および悪性疾患を含めた多数の実験モデルで弱毒化ベクタープラットフォームが、コードされる異種抗原に特異的な保護応答を誘発することが示されている。

ほとんどの弱毒化ワクチンベクターがウイルスであるが、予防適用および治療適用の両方に細菌ワクチンベクタープラットフォームが開発されてきた。現在、多くの本来病原性の細菌の弱毒化菌株が入手可能であり、組換え菌株を作製する操作が容易であることから、細菌を感染症および癌に関連する抗原などの多数の異種タンパク質の効果的な送達媒体として使用するための手段となっている。特にリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種からは弱毒化生細菌ワクチン菌株が開発されている。

このようなワクチン菌株は病原性の低下を示し得るが、特に易感染性の個体において依然としてその安全性に懸念が残る。細菌ワクチンのリスクをさらに低減する戦略の１つの例が、いわゆる不活化するが代謝活性はもたせる（Ｋｉｌｌｅｄ Ｂｕｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ）（「ＫＢＭＡ」）方法である。ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢなどのＤＮＡ修復遺伝子を欠失させてヌクレオチド除去修復能を無効にすることによりＫＢＭＡワクチン菌株を構築する。この遺伝子欠失により、ソラレンとＵＶＡとを組み合わせた処置による光化学的不活化に対する細菌の感受性が極めて高くなる。ＫＢＭＡ細菌株は形成されるソラレン誘導性ＤＮＡ架橋を修復する能力がないため複製することが不可能であり、したがって機能的に非感染性である。このような特徴により、弱毒化生菌株と比較して安全性プロファイルが向上する。しかし、ごく限られた数の架橋により細菌の抗原発現を含めた代謝活性が保護され、これによりその潜在的免疫性が保護される。しかし、架橋数の設定が制御困難な変数によって左右されるため、一貫した特性を示すＫＢＭＡ菌株の作製は困難であると考えられる。

当該分野において、リスク−便益プロファイルが弱毒生ワクチンに適さない疾患の治療または予防に使用するのに有利な安全性プロファイルを有する弱毒化細菌ワクチン菌株を提供することが依然として必要とされている。

本発明は、条件的弱毒化細菌種ならびにその調製法および使用法を提供する。本明細書で使用される「条件的弱毒化」という用語は、細菌がその宿主生物外にあるときは細菌が増殖によって成長する能力に実質的に全く影響を及ぼさないが、その宿主生物内、例えばワクチン被接種者の宿主細胞内に導入されたときに細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子の欠失をもたらす１組の規定された組換え修飾を含む、細菌を指す。このような組換え修飾は、哺乳動物宿主内での遺伝子発現を選択的に誘導する制御配列を利用するものである。

後述する通り、細菌はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの細胞内病原菌が最も好ましい。

本発明の第一の態様では、本発明は、細菌ゲノム内の細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子が欠失するよう細菌を設計する方法に関し、この欠失は細菌が宿主内に導入されたときに選択的に生じる。この方法は以下のものを含む：
（ｉ）細菌に対して異種性のリコンビナーゼをコードし哺乳動物宿主細胞でリコンビナーゼ発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている核酸を細菌内に組換え導入することならびに
（ｉｉ）細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の上流にリコンビナーゼの第一の結合部位を、また細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の下流にリコンビナーゼの第二の結合部位を細菌に組換え導入すること。

リコンビナーゼは、哺乳動物宿主細胞内に特異的に導入され発現すると、第一および第二の結合部位に隣接する細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）を欠失させる部位特異的組換え事象を触媒する。この部位特異的組換え事象の後、細菌は増殖できなくなる。

本明細書で使用される「細菌が増殖によって成長する能力に実質的に全く影響を及ぼさない」という語句は、コロニー形成が、他の点では同一であるが上記の規定される組換え修飾を欠く細菌の少なくとも７５％である細菌を指す。便宜上、本明細書では組換え導入されたリコンビナーゼ配列ならびに組換え導入された第一および第二の結合部位を欠くこのような細菌を「野生型」細菌と呼ぶ。好ましい実施形態では、コロニー形成は野生型細菌の少なくとも８０％であり、より好ましくは野生型細菌の少なくとも９０％であり、最も好ましくは野生型細菌の少なくとも９５％である。コロニー形成はｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成試験で判定され、コロニー形成単位（ＣＦＵ）で表される。

遺伝子（１つまたは複数）に関して本明細書で使用される「増殖に必須な」という用語は、欠失するとコロニー形成が野生型の１％以下に減少し、かつ／または生物体に含まれる宿主細胞内での細菌の成長（ＣＦＵによって測定される）が野生型の少なくとも１０００倍低下する遺伝子を指す。好ましくは、コロニー形成が野生型の０．０１％以下に減少する。本明細書では、このような遺伝子（１つまたは複数）が欠失した細菌を「増殖ができない」と言う。

本発明の文脈においては、細菌を宿主生物内に導入したとき、増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の欠失が選択的に生じる。本明細書で使用される欠失事象は、細菌の宿主生物内への導入により、コロニー形成が野生型細菌の少なくとも７５％である細菌が、コロニー形成が野生型の１％以下に減少した細菌に変換される場合に「宿主内で選択的に」生じる。好ましくは、コロニー形成が野生型の０．０１％以下に減少する。

「宿主細胞内でのリコンビナーゼ発現を選択的に誘導する制御配列」という用語は、細菌を宿主生物内に導入すると、その制御下での遺伝子発現を少なくとも１０倍誘導する制御配列を指す。単なる例を挙げると、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のａｃｔＡプロモーター下での遺伝子発現は、転写活性化のためのＰｒｆＡとして知られる調節因子に依存する。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）が宿主細胞内に存在するとき、ａｃｔＡ／ＰｒｆＡ調節下にある遺伝子発現がブロスで培養したリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の約２００倍誘導される。したがって、ある特定の実施形態では、制御配列は、ＰｒｆＡ依存性のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）プロモーターを含む。ＰｒｆＡ依存性プロモーターは、ｉｎｌＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ｉｎｌＣプロモーター、ｈｐｔプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ｐｌｃＡプロモーター、ｍｐｌプロモーターおよびａｃｔＡプロモーターからなる群より選択され得る。その他の細菌種の宿主生物内での遺伝子発現を誘導する同様の系については後述する。好ましい実施形態では、細菌を宿主生物内に導入したとき、このような選択的に誘導される発現が少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍増加する。

本明細書で使用される「宿主生物」という用語は、目的とする細菌が、本明細書に記載される増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）が欠失していない状態で増殖することができる生物体を指す。ある特定の実施形態では、宿主生物は哺乳動物種、最も好ましくはヒトである。このほか、ある特定の実施形態では、細菌は細胞内病原菌であり、細菌を哺乳動物宿主細胞内に導入したとき、制御配列がリコンビナーゼの発現を選択的に誘導する。好ましい細菌属は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属からなる群より選択される。ここに挙げたものは限定することを目的とするものではない。最も好ましくは、細菌は通性細胞内細菌、例えばリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）およびブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）などである。後述する特定の例示的な実施形態では、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ΔＡｃｔＡ／ΔＩｎｌＢ（生来のＡｃｔＡおよびＩｎｌＢ遺伝子が欠失しているか、変異によってその機能が欠失しているＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））などの改変型を含めたリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。

上述の通り、細菌に組換え導入するリコンビナーゼ配列は細菌に対して異種性である。本明細書で使用されるこの用語は、細菌ゲノムの通常の構成要素ではないリコンビナーゼを指す。種々の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１インテグラーゼ、φＢＴ１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、ＰＳＡインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、Ｐ２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、Ｌ５インテグラーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、ｇｉｎリコンビナーゼ、ＲＶインテグラーゼ、ＳＰＢｃインテグラーゼ、ＴＧ１インテグラーゼ、φＣ１インテグラーゼ、ＭＲ１１インテグラーゼ、φ３７０インテグラーゼ、φＫ３８インテグラーゼ、ＷβインテグラーゼおよびＢＬ３インテグラーゼからなる群より選択され得る。適切なリコンビナーゼ結合部位は、組換え導入したａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位を含み得る。

ある特定の実施形態では、細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）は、ＤＮＡ複製に関与する遺伝子を少なくとも１つ含む。このような遺伝子は、ｏｒｉ、ｄｎａＡ、ｄｎａＮ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＺ、ｌｉｇＡ、ｄｎａＧ、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｈｏｌＢ、ｄｎａＸ、ＳＭＣおよびｆｔｓＹからなる群より選択され得る。

後述する通り、細菌の増殖に必須な複数の遺伝子を単一のオペロンにまとめることが多い。この場合、部位特異的組換え事象により複数のこのような遺伝子が単一の事象で欠失するよう第一の結合部位をオペロンの一部の上流に選択的に組換え導入し、第二の結合部位をオペロンの一部の下流に組換え導入し得る。好ましくは、第一の結合部位がオペロンの上流にあり、第二の結合部位がオペロンの下流にある。第一および第二の結合部位は、長さ約２０ｋｂ以下、長さ約１０ｋｂ以下および長さ約６ｋｂの核酸配列に隣接し得る。この文脈での「約」という用語は所与の長さの±１０％を指す。

ある特定の実施形態では、例えば、細菌に対して異種性の１つまたは複数の遺伝子から発現する異種タンパク質に対して免疫応答を生じさせる目的で、細菌をこれらの遺伝子を発現するための発現プラットフォームとして用いる。このような実施形態では、細菌は細菌ゲノム内に異種ポリペプチド（１つまたは複数）をコードする外来性核酸配列を含んでよく、ここで、外来性核酸配列は、細菌が哺乳動物宿主内にあるときに異種ポリペプチドの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている。

関連する態様では、本発明は、細菌ゲノム内の細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子を欠失させる方法に関する。この方法は、細菌がリコンビナーゼを発現し、この発現したリコンビナーゼが部位特異的組換え事象によって細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子を欠失させる条件下で、本明細書に記載される条件的弱毒化細菌を宿主生物宿主に導入することを含む。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載される条件的弱毒化細菌またはその細菌培養物などの集団に関する。このような細菌は以下のものを含む：
（ｉ）細菌に対して異種性のリコンビナーゼをコードする核酸であって、宿主内でのリコンビナーゼの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている核酸ならびに
（ｉｉ）細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の上流にある第一のリコンビナーゼ結合部位および細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の下流にある第二のリコンビナーゼ結合部位であって、リコンビナーゼが哺乳動物宿主内で発現したとき、第一および第二の結合部位が隣接する細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）を欠失させる部位特異的組換え事象を触媒するよう作動可能に連結された、第一および第二のリコンビナーゼ結合部位。

上述の通り、ある特定の実施形態では、細菌は細胞内病原菌であり、最も好ましくは通性細胞内細菌であり、細菌が哺乳動物宿主細胞内にあるとき、制御配列がリコンビナーゼの発現を選択的に誘導する。適切な細菌は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属からなる群より選択される属の細菌である。ここに挙げたものは限定することを目的とするものではない。最も好ましくは、細菌は通性細胞内細菌、例えばリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）およびブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）などである。後述する特定の例示的な実施形態では、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ΔＡｃｔＡ／ΔＩｎｌＢなどの改変型を含めたリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。ある特定の実施形態では、細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）は、ＤＮＡ複製に関与する少なくとも１つの遺伝子を含む。このような遺伝子は、ｏｒｉ、ｄｎａＡ、ｄｎａＮ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＺ、ｌｉｇＡ、ｄｎａＧ、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｈｏｌＢ、ｄｎａＸ、ＳＭＣおよびｆｔｓＹからなる群より選択され得る。

同じく上述の通り、細菌内に組換え導入するリコンビナーゼ配列は、細菌に対して異種性である。本明細書で使用されるこの用語は、細菌ゲノムの通常の構成要素ではないリコンビナーゼを指す。種々の実施形態では、リコンビナーゼは、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１インテグラーゼ、φＢＴ１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、ＰＳＡインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、Ｐ２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、Ｌ５インテグラーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、ｇｉｎリコンビナーゼ、ＲＶインテグラーゼ、ＳＰＢｃインテグラーゼ、ＴＧ１インテグラーゼ、φＣ１インテグラーゼ、ＭＲ１１インテグラーゼ、φ３７０インテグラーゼ、φＫ３８インテグラーゼ、ＷβインテグラーゼおよびＢＬ３インテグラーゼからなる群より選択され得る。適切なリコンビナーゼ結合部位は、組換え導入したａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位を含み得る。

後述する通り、細菌の増殖に必須な複数の遺伝子を単一のオペロンにまとめることが多い。この場合、部位特異的組換え事象により複数のこのような遺伝子が単一の事象で欠失するよう第一の結合部位をオペロンの一部の上流に選択的に組換え導入し、第二の結合部位をオペロンの一部の下流に組換え導入し得る。好ましくは、第一の結合部位がオペロンの上流にあり、第二の結合部位がオペロンの下流にある。第一および第二の結合部位は、長さ約２０ｋｂ以下、長さ約１０ｋｂ以下、長さ約６ｋｂまたは宿主細胞内での細菌の増殖を不活化するのに十分な任意の長さの核酸配列に隣接し得る。この文脈での「約」という用語は所与の長さの±１０％を指す。

本発明の細菌は、例えば、細菌に対して異種性の１つまたは複数の遺伝子から発現する異種タンパク質に対して免疫応答を生じさせる目的で、これらの遺伝子を発現するための発現プラットフォームとして用いることができる。このような実施形態では、細菌は細菌ゲノム内に異種ポリペプチド（１つまたは複数）をコードする外来性核酸配列を含んでよく、ここで、外来性核酸配列は、細菌が哺乳動物宿主内にあるときに異種ポリペプチドの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている。

Ｌｍ−ＲＩＩＤの略図である。（Ａ）ブロス培養時すなわち発酵時にはＬｍ−ＲＩＩＤはリコンビナーゼを発現しないため、ワクチンの成長および製造が可能である。（Ｂ）ワクチン接種後、Ｌｍ−ＲＩＩＤは樹状細胞に侵入し、そこで細菌死をもたらすリコンビナーゼおよび特異的免疫原性をもたらすワクチン抗原を同時に発現する。 Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株で欠失した領域の概観を示す図である。 欠失１を示す図である。（Ａ）ジャイレース領域（ｙａａＡ、ｒｅｃＦ、ｇｙｒＢ、ｇｙｒＡ）に隣接するＬｏｘリコンビナーゼ部位；（Ｂ）ブロス培養時の成長曲線；（Ｃ）ＤＣ２．４細胞における細胞内成長曲線。 欠失２を示す図である。（Ａ）ｌｍｏ２５８７、複製起点、ｄｎａＡ、ｄｎａＮおよびｌｍｏ０００３に隣接するＬｏｘリコンビナーゼ部位；（Ｂ）ＢＨＩブロス中での成長曲線；（Ｃ）ＤＣ２．４細胞における細胞内成長曲線。 欠失３を示す図である。（Ａ）ｌｍｏ２５８２−複製起点−ｇｙｒＡ領域に隣接するＬｏｘリコンビナーゼ部位；（Ｂ）ＢＨＩ中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ成長曲線；（Ｃ）ＤＣ２．４細胞における細胞内成長曲線。 欠失４を示す図である。（Ａ）ジャイレース領域（ｙａａＡ、ｒｅｃＦ、ｇｙｒＢ、ｇｙｒＡ）に隣接するＦｒｔリコンビナーゼ部位；（Ｂ）ＢＨＩ中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ成長曲線；（Ｃ）ＤＣ２．４細胞における細胞内成長曲線。 弱毒化生（Ｌｍ１１）プラットフォームおよびＬｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３６１８）プラットフォームからの各種抗原の細胞内発現の比較を示す図である。Ａ〜Ｄ：Ｌｍ１１またはＢＨ３６１８菌株背景の４対の菌株の細胞内ウエスタンブロット。（Ａ）レーン１：生Ｌｍ菌株Ｌｍ１１；レーン２：Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６１８；抗原を付加していないプラットフォーム。（Ｂ）レーン３：生Ｌｍ菌株ＢＨ３９４３；レーン４：Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３９５３；抗原：ＡｃｔＡＮ１００−Ｎｙ−ＥＳＯ−１−ＭＡＧＥ Ａ３融合タンパク質（＜）。（Ｃ）レーン５：生Ｌｍ菌株ＢＨ３９４７；レーン６：Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３９５７；抗原：ＡｃｔＡＮ１００−ＨＢＶポリメラーゼ−ＨＢｘＡｇ融合タンパク質（^＊）。（Ｄ）レーン９：生Ｌｍ菌株ＢＨ３９５１；レーン１０：Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３９６１；抗原：ＡｃｔＡＮ１００−熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳＰ融合タンパク質（▼）。 免疫能のあるマウスおよび免疫不全のマウスにおけるＬｍ−ＲＩＩＤ菌株の排除および安全性の促進を示す図である。 Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株の免疫原性を示す図である。白丸：未処置群；灰色：上記ペプチドで刺激したグループ。 異種攻撃感染に対する防御免疫を示す図である。（Ａ）弱毒化生菌株、ＫＢＭＡ菌株およびＬｍ−ＲＩＩＤ菌株によるＷＴ−Ｌｍ攻撃感染からの防御。（Ｂ）弱毒化生菌株、ＫＢＭＡ菌株およびＬｍ−ＲＩＩＤ菌株を用いたＷＴワクシニアウイルスによる異種攻撃感染からの防御。 ＣＴ−２６腫瘍モデルに対するＬｍ−ＲＩＩＤワクチンの治療効果を示す図である。

本発明は、条件的弱毒化細菌種を調製および使用するための組成物および方法に関する。本発明は、リスク−便益プロファイルが弱毒生ワクチンに適さない疾患の治療または予防に使用するのに有利な安全性プロファイルを有する弱毒化細菌ワクチン菌株を提供することができる。

本明細書に記載される方法および組成物は、以下でリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に関して詳細に説明されるが、当業者は、これらが細菌種、特に通性細胞内細菌種に一般的に適用できることを理解するであろう。

リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）は、ワクチンがコードするＡｇに特異的な頑強で高度に機能的なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫をもたらす強力な自然免疫応答を誘導する能力を特徴とする通性細胞内細菌である。Ｌｍは、癌または他のウイルス性免疫不全のある患者、妊婦、妊婦、高齢者および乳幼児を含めた易感染性の個体で病原性の高い食品媒介細菌である。

選択された標的病原体または悪性腫瘍に関連する指定された抗原（１つまたは複数）をコードするよう操作された弱毒化生組換えＬｍワクチンプラットフォームがいくつかのヒト臨床試験の基礎を築いてきた。特に、遺伝学的に定義される弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢは、２つの病原性遺伝子が欠失しマウスリステリア症モデルにおいて３ｌｏｇ超に弱毒化されているが、その免疫効力は保持されており、ヒト疾患のマウスモデルおよびヒトの両方において頑強なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞免疫を誘導することが示されているほか、臨床状況において様々な悪性固形腫瘍の患者に安全で耐容性に優れていることが示されている。

所望のＣＤ８ Ｔ細胞応答を刺激するためには、Ｌｍベースのワクチンが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）として知られる孔形成細胞溶解素の発現が仲介する過程で感染樹状細胞（ＤＣ）の空胞から脱出する能力を保持していなければならず、また所望の抗原が細胞質内の細菌から発現し分泌され、次いでＭＨＣクラスＩ分子に処理されて提示されるよう操作する。したがって、不活化Ｌｍワクチン、例えば熱によって不活化され（熱不活化Ｌｍ；ＨＫＬＭ）、代謝的に活性でなく、ワクチン免疫原を含有するか腫瘍担持動物における効果を付与する病原体による攻撃感染から効果的に保護することが可能な所望のＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することができない不活化Ｌｍワクチン。この２つの対立事項は当該分野ではよく知られており、弱毒化生Ｌｍワクチンプラットフォームと同程度の免疫効力を保持しながらＨＫＬＭの安全性を有するＬｍワクチンプラットフォームの開発を進めるワクチン学者の課題となっている。

安全で免疫学的に強力なＬｍベースのワクチンプラットフォームの必要性に応えるために、本明細書でリコンビナーゼ誘導性細胞内死（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅａｔｈ（Ｌｍ−ＲＩＩＤ）と呼ばれる条件的弱毒化Ｌｍが開発された。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンは、目的とするワクチン抗原を発現すると同時に、Ｌｍワクチン菌株が宿主細胞の細胞質ゾル内に脱出した後に細菌の生存に必須な遺伝子の欠損を誘導する。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンはブロス培養で成長し、ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢベースのワクチンなどの弱毒化生Ｌｍワクチンと同じ特性を示すが、宿主細胞内に入ると自死する。これは、必須な標的Ｌｍ遺伝子とリコンビナーゼ（例えば、ｌｏｘＰ）部位とを隣接させ、宿主生物内、この場合は宿主細胞質内で特異的に誘導されるプロモーターからの配列特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の発現およびワクチン抗原の発現を促進することによって達成される。これにより、宿主動物に静脈内しても自己制限的な感染がもたらされる。後述する通り、既に記載されている弱毒化生Ｌｍワクチン菌株、例えばＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢからＬｍ−ＲＩＩＤワクチンを得ることができる。感染した宿主哺乳動物細胞では、ＡｃｔＡタンパク質の発現がブロス培養の２００倍超誘導される。しかし、ＰｒｆＡ依存性ａｃｔＡプロモーターがブロス培養で誘導されることは実質的にはない。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンは、ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ菌株などの弱毒化生Ｌｍワクチンの成長に使用するのと同じ方法で作製することができる。

本発明は、その適用が以下の説明に記載されるか図面に図示される構成要素の構成の詳細および配置に限定されないことを理解するべきである。本発明は、記載される実施形態以外の実施形態も可能であり、また様々な方法で実践および実施が可能である。このほか、本明細書で用いられる表現および用語ならびに要約は説明を目的とするものであり、限定するものとして見なされるべきでなないことを理解するべきである。

したがって、当業者は、本開示の土台となる概念を本発明のいくつかの目的を遂行するための他の構造、方法およびシステムを設計するための土台として容易に用い得ることを理解するであろう。したがって、特許請求の範囲は、このような等価な構成をこれが本発明の趣旨および範囲を逸脱しない限りにおいて含むと見なすことが重要である。

１．定義
遺伝子の変異またはその遺伝子を含む細菌の変異を表すのに使用される略語は以下の通りである。例を挙げると、略語「Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ΔａｃｔＡ」は、ａｃｔＡ遺伝子の一部または全部が欠失したことを意味する。デルタ記号（Δ）は欠失を意味する。上付きのマイナス記号を含む略語（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＡｃｔＡ⁻）は、ａｃｔＡ遺伝子が、例えば欠失、点変異またはフレームシフト変異（ただし、これらの変異に限定されない）によって変異したことを意味する。

ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、獣医学対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官または体液に適用される「投与」は、外来性のリガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療剤、診断剤または組成物と、対象、細胞、組織、器官または体液などとの接触を非限定的に指す。「投与」は、例えば、治療法、薬物動態学的方法、診断法、研究法、プラセボ法および実験法を指すことがある。細胞の治療は、試薬と細胞との接触のほかにも試薬と液体との接触を包含し、この場合、液体は細胞と接触している。「投与」はこのほか、試薬、診断剤、結合組成物による、または別の細胞による、例えば細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ治療を包含する。

リガンドおよび受容体に関連する「アゴニスト」は、受容体を刺激する分子、分子の組合せ、複合体または試薬の組合せを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの変異タンパク質もしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣物、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子またはＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含し得る。

リガンドおよび受容体に関連する「アンタゴニスト」は、受容体を阻害する、受容体と拮抗する、受容体をダウンレギュレートする、および／または受容体を脱感作する分子，分子の組合せまたは複合体を含む。「アンタゴニスト」は、受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性とは、リガンド／受容体相互作用の非存在下で発現する活性のことである。「アンタゴニスト」はこのほか、受容体の活性の刺激（または調節）を阻害するか妨げる任意の試薬を包含する。例を挙げると、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアンタゴニストには、何ら限定されるものではないが、リガンド（ＧＭ−ＣＳＦ）と結合してその受容体との結合を妨げる抗体もしくは受容体と結合してリガンドと受容体との結合を妨げる抗体、またはその抗体が受容体を不活性なコンホメーションに固定する場合がある。

ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書で使用される「類似体」または「誘導体」は、元のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とほぼ同じまたは同一の機能を有するが、元のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とほぼ同じまたは同一のアミノ酸配列または構造を必ずしも含まない別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。類似体は、好ましくは以下のものを少なくとも１つ満たす：（ａ）元のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％一致するアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤、（ｂ）元のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性薬剤；および（ｃ）元のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％一致するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性薬剤。

「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）とは、Ｔ細胞に抗原を提示するのに用いられる免疫系の細胞のことである。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパ―細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる。樹状細胞は少なくとも２つの系列で生じる。１つ目の系列は、プレ−ＤＣ１、骨髄系ＤＣ１および成熟ＤＣ１を包含する。２つ目の系列は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻初期多能性前駆細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ４^＋ＩＬ−３Ｒα^＋プロ−ＤＣ２細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻形質細胞様プレ−ＤＣ２細胞、骨髄系ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２および成熟ＤＣ２を包含する。

「弱毒化」および「弱毒化された」は、宿主に対する毒性が低下するよう改変された細菌、ウイルス、寄生生物、感染性微生物、プリオン、腫瘍細胞、感染性微生物内の遺伝子などを包含する。宿主は、ヒトもしくは動物宿主または器官、組織もしくは細胞であり得る。細菌は、非限定的な例を挙げると、宿主細胞との結合力が低下するよう、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への伝播力が低下するよう、細胞外での成長力が低下するよう、または宿主細胞内での細胞内成長力が低下するよう弱毒化することができる。弱毒化は、例えば、中毒の徴候（１つまたは複数）、ＬＤ_５０、臓器からの排除速度または競合指数を測定することによって評価することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３−５９５７を参照されたい）。一般に、弱毒化により少なくとも２５％；より一般的には５０％；最も一般的には少なくとも１００％（２倍）；通常少なくとも５倍；より通常には少なくとも１０倍；最も通常には少なくとも５０倍；多くの場合少なくとも１００倍；より多くの場合少なくとも５００倍；および最も多くの場合少なくとも１０００倍；通常少なくとも５０００倍；より通常には少なくとも１０，０００倍；および最も通常には少なくとも５０，０００倍；および最も多くの場合少なくとも１００，０００倍のＬＤ_５０増大および／または排除速度増大がもたらされる。

「弱毒化遺伝子」は、宿主に対する毒性、病理もしくは病原性、宿主内での成長または宿主内での生存を仲介する遺伝子を包含し、この場合、遺伝子は毒性、病理または病原性が軽減、低下または消失するように変異している。低下または消失は、変異遺伝子によって仲介される病原性または毒性と、非変異（または親）遺伝子によって仲介される病原性または毒性とを比較することによって評価することができる。「変異遺伝子」は、遺伝子、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域またはその任意の組合せの調節領域における欠失、点変異およびフレームシフト変異を包含する。

「保存的に改変された変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する場合、保存的に改変された変異体は、同一のアミノ酸配列または１つもしくは複数の保存的置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸を指す。保存的置換の例には、以下に挙げるグループのうちの１つに含まれるアミノ酸と、同じグループの別のアミノ酸との交換がある（Ｌｅｅらに対して発行された米国特許第５，７６７，０６３号；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（７）低分子アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ。

「有効量」は、特に限定されないが、医学的状態または障害の症状または徴候を改善、逆転、緩和、予防または診断することができる量を包含する。別途に、明確に、または文脈により指示されない限り、「有効量」は病態を改善するのに十分な最小量に限定されない。

「細胞外液」は、例えば、血清、血漿、血液、間質液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆汁、汗、糞便および尿を包含する。「細胞外液」は、コロイドまたは懸濁液、例えば全血または凝固血を含み得る。

ポリペプチドと関連する「フラグメント」という用語は、より大きいポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含む。

「遺伝子」は、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を指す。オリゴペプチドまたはポリペプチドは、生物学的に活性、抗原的に活性、生物学的に不活性または抗原的に不活性なものなどであり得る。遺伝子という用語は、例えば、特定のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を併せたもの；ＯＲＦにイントロンをコードする核酸を併せたもの；ＯＲＦと作動可能に連結されたプロモーター（１つまたは複数）とを併せたもの；ＯＲＦと、作動可能に連結されたプロモーター（１つまたは複数）と、任意のイントロンとを併せたもの；ＯＲＦと、作動可能に連結されたプロモーター（１つまたは複数）と、イントロン（１つまたは複数）と、プロモーター（１つまたは複数）と、エンハンサー（１つまたは複数）などのその他の調節エレメントとを併せたものを包含する。ある特定の実施形態では、「遺伝子」は、その遺伝子の発現の調節にシスで必要な任意の配列を包含する。遺伝子という用語はほかにも、抗原またはペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の抗原的に活性なフラグメントを包含するペプチドをコードする核酸を指すことがある。遺伝子という用語は、コードされるペプチドまたはタンパク質が何らかの生物活性を有すること、または場合によっては、ペプチドまたはタンパク質が抗原的に活性であることを必ずしも表すわけではない。発現可能でない配列をコードする核酸配列は一般に、偽遺伝子と見なされる。遺伝子という用語はほかにも、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはリボザイムなどのリボ核酸をコードする核酸配列を包含する。

リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）などの細菌の「成長」は、特に限定されないが、コロニー形成、複製、タンパク質含有量の増加および／または脂質含有量の増加に関連する細菌生理および遺伝子の機能を包含する。別途明記されるか、文脈から明らかでない限り、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の成長は、宿主細胞外での細菌の成長のほかにも、宿主細胞内での成長を包含する。成長に関連する遺伝子としては、何ら限定するものではないが、エネルギー産生（例えば、解糖、クレブス回路、シトクローム）、アミノ酸、糖、脂質、ミネラル、プリンおよびピリミジンの同化作用および／または異化作用、栄養素輸送、転写、翻訳ならびに／あるいは複製を仲介する遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌の「成長」はリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌の細胞内成長、すなわち、哺乳動物細胞などの宿主細胞内での成長を指す。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌の細胞内成長は光学顕微鏡法またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定され得るが、成長はいかなる測定技術によっても限定されない。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）抗原の量、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）の核酸配列またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）に特異的な脂質などの生化学的パラメータを用いて成長を評価することができる。いくつかの実施形態では、成長を仲介する遺伝子は、細胞内成長を特異的に仲介する遺伝子である。いくつかの実施形態では、細胞内成長を特異的に仲介する遺伝子は、特に限定されないが、不活性化すると細胞内成長の速度が低下するが、細胞外成長（例えば、ブロス中での成長）の速度は検出可能な程度、実質的にもしくは相当な程度低下することはない遺伝子または不活性化すると細胞内成長の速度が細胞外成長の速度が低下するよりも大きい程度で低下する遺伝子を包含する。非限定的な例を挙げると、いくつかの実施形態では、不活性化すると細胞内成長の速度が細胞外成長よりも大きい程度低下する遺伝子は、不活性化すると細胞内成長が正常値または最大値の５０％未満まで低下するが、細胞外成長の低下は最大値のわずか１〜５％、５〜１０％または１０〜１５％である場合を包含する。本発明は、ある特定の態様では、細胞内成長は減弱しているが細胞外成長は減弱していないリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、細胞内成長も細胞外成長も減弱していないリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）および細胞内成長は減弱していないが細胞外成長は減弱しているリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を包含する。

「標識された」組成物は、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学法、同位体法または化学的方法によって直接的にまたは間接的に検出可能である。例えば、有用な標識としては、例えば、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、安定な同位体、エピトープタグ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素結合免疫測定法に使用する基質もしくは酵素またはフルオレット（ｆｌｕｏｒｅｔｔｅｓ）が挙げられる（例えば、ＲｏｚｉｎｏｖおよびＮｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照されたい）。

「リガンド」は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである小分子、ペプチド、ポリペプチドまたは膜関連もしくは膜結合分子を指す。「リガンド」はほかにも、アゴニストでもアンタゴニストでもなく、かつアゴニスト特性もアンタゴニスト特性もない結合物質を包含する。通常、リガンドが第一の細胞上の膜結合分子である場合、受容体は第二の細胞上にみられるのが普通である。第二の細胞は、第一の細胞と同じ特性（同じ名称）のものであっても、異なる特性（異なる名称）のものであってもよい。リガンドまたは受容体は完全に細胞内にあり得る、すなわち、細胞質ゾル内、核内または何らかの別の細胞内区画内に存在し得る。リガンドまたは受容体は、その位置が、例えば細胞内区画から細胞膜の外表面に変化し得る。リガンドと受容体の複合体は「リガンド受容体複合体」と呼ばれる。リガンドと受容体がシグナル伝達経路に関与する場合、リガンドはシグナル伝達経路の上流の位置にあり、受容体はシグナル伝達経路の下流の位置に存在する。

「核酸」は、一本鎖型，二本鎖型または多重鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。核酸の非限定的な例には、例えば、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドがある。特定の核酸配列はほかにも、「対立遺伝子変異体」および「スプライスバリアント」を暗に包含し得る。

プロモーターおよびｍＲＮＡをコードする核酸と関連する「作動可能に連結された」は、プロモーターを用いてその核酸の転写を開始させ得ることを意味する。

「パーセント配列同一性」および「％配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の比較または整列によって明らかにされる配列類似性の百分率を指す。パーセント同一性は、２つの分子の配列を整列させ、その２つの整列させた配列の間で正確な一致数を計数し、それを短い方の配列の長さで除し、その結果に１００を乗じて２分子間の配列情報を直接比較することによって求めることができる。パーセント同一性を計算するためのアルゴリズムがＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムである（例えば、ＫａｎｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４８：３６７−３７６；Ａｒｓｌａｎら（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：３２７−３３７を参照されたい）．

「精製（された）」および「単離（された）」は、ポリペプチドに関して言えば、そのポリペプチドが、本来一緒に存在する他の生体高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。本明細書で使用される「精製（された）」という用語は、存在するポリペプチドのうち、同定されたポリペプチドが多くの場合少なくとも５０重量％以上を占める、より多くの場合少なくとも６０重量％以上を占める、典型的には少なくとも７０重量％以上を占める、より典型的には少なくとも７５重量％以上を占める、最も典型的には少なくとも８０重量％以上を占める、通常少なくとも８５重量％以上を占める、より通常には少なくとも９０重量％以上を占める、最も通常には少なくとも９５重量％以上を占める、慣例的には少なくとも９８重量％以上を占めることを意味する。一般に水、緩衝剤、塩、界面活性剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定剤（アルブミンなどの添加されたタンパク質を含む）および補形剤ならびに分子量が１０００未満の分子の重量は、ポリペプチドの純度の決定に用いられことはない。例えば、Ｃｏｖａｃｃｉらに対して発行された米国特許第６，０９０，６１１号の純度に関する考察を参照されたい。

「ペプチド」は短いアミノ酸の配列を指し、この場合、アミノ酸はペプチド結合によって互いに連結している。ペプチドは遊離の状態で、あるいは高分子、脂質、オリゴ糖、多糖および／またはポリペプチドなどの別の部分と結合して存在し得る。ペプチドがポリペプチド鎖内に組み込まれている場合でもなお、「ペプチド」という用語は、その短いアミノ酸の配列を具体的に指すのに使用され得る。「ペプチド」は、ペプチド結合または何らかの別のタイプの結合によって別の部分と連結し得る。ペプチドは少なくとも２アミノ酸の長さであり、かつ一般に約２５アミノ酸未満の長さであり、この場合、最大の長さは慣例または文脈に応じて異なる。「ペプチド」と「オリゴペプチド」の両用語は互換的に使用され得る。

「タンパク質」は一般に、ポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を指す。タンパク質はこのほか、ポリペプチドの三次元構造を指すことがある。「変性タンパク質」は、一部分が変性し三次元構造がある程度残っているポリペプチドあるいは実質的にランダムな三次元構造、すなわち完全に変性したポリペプチドを指す。本発明は、例えばグリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、脱アミド化、異性化、シグナル配列またはリーダー配列プロセシングの切断点、共有結合および非共有結合している補因子、酸化変異体などを含めたポリペプチド変異体の試薬およびこれらを用いる方法を包含する。ジスルフィド結合タンパク質の形成が記載されている（例えば、ＷｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙおよびＲａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照されたい）。

「組換え」を例えば、核酸、細胞、動物、ウイルス、プラスミド、ベクターなどに関して使用する場合、これは外来性の非天然核酸の導入、天然の核酸の改変または組換え核酸、細胞、ウイルス、プラスミドもしくはベクターからの全体または一部の誘導による改変を表す。組換えタンパク質は、例えば、組換え核酸、ウイルス、プラスミド、ベクターなどに由来するタンパク質を指す。「組換え細菌」は、例えば変異、欠失、挿入および／または再配列による組換え法によってゲノムが操作されている細菌を包含する。「組換え細菌」はほかにも、組換えゲノム外核酸、例えばプラスミドもしくは２つ目の染色体を含むように改変された細菌または既存のゲノム外核酸が改変された細菌を包含する。

「試料」は、ヒト、動物、プラセボまたは研究試料に由来する試料、例えば、細胞、組織、器官、液体、気体、エアロゾル、スラリー、コロイドまたは凝固物質を指す。「試料」をｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ヒトまたは動物から採取せずに試験するか、「試料」をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。試料を処理した後、例えば組織学的方法によって試験してもよい。「試料」はこのほか、例えば、液体もしくは組織試料を含む細胞または液体もしくは組織試料から分離された細胞を指す。「試料」はほかにも、ヒトもしくは動物から採取したばかりの細胞、組織、器官もしくは液体または処理もしくは保管された細胞、組織、器官もしくは液体を指すことがある。

「選択マーカー」は、選択マーカーを含む細胞または選択マーカーを含まない細胞を選択することを可能にする核酸を包含する。選択マーカーの例としては、特に限定されないが、例えば：（１）本来なら有害な化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を付与する産物をコードするか、本来なら無害な化合物（例えば、スクロース）に対する感受性をコードする核酸；（２）本来ならレシピエント細胞に存在しない産物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸；（４）容易に同定することができる産物（例えば、β‐ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細胞表面タンパク質、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグなどの表現型マーカー）をコードする核酸；（５）ハイブリダイゼーション技術、例えばＰＣＲまたは分子ビーコンによって同定することができる核酸が挙げられる。

「特異的に」または「選択的に」結合するは、リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原またはその他の結合対（例えば、サイトカインとサイトカイン受容体）に関する場合、不均一なタンパク質集団およびその他の生物製剤中にそのタンパク質が存在するかどうかを判定する結合反応を表す。したがって、指定された条件下では、特定のリガンドは特定の受容体と結合し、試料中に存在する他のタンパク質と結合するリガンドの量はあまり多くない。特異的結合はほかにも、例えば、企図とする方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物が、他のあらゆる結合化合物との親和性よりも、多くの場合少なくとも２５％高い、より多くの場合少なくとも５０％高い、最も多くの場合少なくとも１００％（２倍）高い、通常少なくとも１０倍高い、より通常には少なくとも２０倍高い、最も通常には少なくとも１００倍高い親和性でその標的と結合することを意味することがある。

典型的な実施形態では、抗体の親和性が、例えばスキャッチャード解析による測定で約１０^９リットル／ｍｏｌを上回る（Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。一部の結合化合物は２種類以上の標的と特異的に結合することができる、例えば、抗体がその抗原と、抗体のオリゴ糖によってレクチンと、および／または抗体のＦｃ領域によってＦｃ受容体と特異的に結合することが当業者により理解されている。

細菌の「伝播」は「細胞間の伝播」、すなわち細菌が、例えば小胞に仲介されて、第一の宿主細胞から第二の宿主細胞に移ることを包含する。伝播に関連する機能としては、特に限定されないが、例えば、アクチン尾部の形成、仮足様伸長部分の形成および二重膜空胞の形成が挙げられる。

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト生物を指す。したがって、本明細書に記載される方法および組成物はヒト疾患および獣医学的疾患の両方に適用できる。ある特定の実施形態では、対象は「患者」、すなわち、疾患または病態に対する医療を受けている生きたヒトである。これには、明確な疾患がなく病態の徴候を検討中である者が含まれる。

リコンビナーゼの「標的部位」とは、リコンビナーゼが認識、結合および／または作用する核酸配列または領域のことである（例えば、Ｇｒａｈａｍらに対して発行された米国特許第６，３７９，９４３号；ＳｍｉｔｈおよびＴｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；ＧｒｏｔｈおよびＣａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６を参照されたい）。

「治療有効量」は、コードされる異種抗原に特異的な所望の免疫応答を誘導し、患者の便益を示す、すなわち治療する病態の症状の軽減、予防または改善をもたらすのに十分な試薬または医薬組成物の量と定義される。薬剤または医薬組成物が診断剤を含む場合、「診断有効量」は、シグナル、画像をはじめとする診断パラメータを生じるのに十分な量と定義される。医薬製剤の有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別および体重ならびに個体の特異反応などの因子によって異なる（例えば、Ｎｅｔｔｉらに対して発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照されたい）。

「治療」または「治療すること」（病態または疾患に関するもの）とは、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果、好ましくは臨床結果を得るための方法のことである。本発明の目的には、疾患に関する有益なまたは所望の結果として、特に限定されないが、疾患による病態の改善、疾患の治癒、疾患重症度の軽減、疾患進行の遅延、疾患による１つもしくは複数の症状の緩和、疾患罹患者の生活の質の向上および／または生存期間の延長のうちの１つまたは複数のものが挙げられる。同様に、本発明の目的には、病態に関する有益なまたは所望の結果として、特に限定されないが、病態の改善、病態の治癒、病態の重症度の軽減、病態進行の遅延、病態による１つもしくは複数の症状の緩和、病態罹患者の生活の質の向上および／または生存期間の延長のうちの１つまたは複数のものが挙げられる。

「ワクチン」は予防ワクチンを包含する。ワクチンはこのほか、治療ワクチン、例えば、ワクチンによって提供される抗原またはエピトープによる病態または障害を含む哺乳動物に投与するワクチンを包含する。ワクチンとして使用するための細菌が多数開発されており、これを本発明に使用することが可能であり、このようなものとして、特に限定されないが、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種が挙げられる。ここに挙げたものは限定することを目的とするものではない。例えば、それぞれ表、図面および請求項をすべて含めたその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第０４／００６８３７号；同第０７／１０３２２５号；および同第０７／１１７３７１号を参照されたい。ワクチン組成物に使用する細菌ベクターは、条件的細胞内細菌ベクターであり得る。細菌を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドを宿主生物内の抗原提示細胞に送達し得る。本明細書に記載される通り、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）により、本発明の抗原の発現に好適なワクチンプラットフォームが得られる。

２．条件的欠失のための必須遺伝子の標的化
リコンビナーゼ誘導性細胞内死（ＲＩＩＤ）のために操作された細菌は、組換え導入したリコンビナーゼ遺伝子の発現と、細菌が宿主生物内にあるときに条件的に発現するプロモーターとを連動させることによって「自死する」ようプログラムされている。以下に例を挙げると、ｉｎｌＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ｉｎｌＣプロモーター、ｈｐｔプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ｐｌｃＡプロモーター、ｍｐｌプロモーターおよびａｃｔＡプロモーターから選択され得るＰｒｆＡ依存性プロモーターを用いて、リコンビナーゼの発現をリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）内において条件的なものにすることができる。ＰｒｆＡは、細胞内で活性化され、適切に操作されたワクチン菌株内で連動する遺伝子の発現を誘導する転写因子である。

Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のＰｒｆＡの配列は以下の通りである（配列番号１）：
ＭＮＡＱＡＥＥＦＫＫ ＹＬＥＴＮＧＩＫＰＫ ＱＦＨＫＫＥＬＩＦＮ ＱＷＤＰＱＥＹＣＩＦ ＬＹＤＧＩＴＫＬＴＳ ５０
ＩＳＥＮＧＴＩＭＮＬ ＱＹＹＫＧＡＦＶＩＭ ＳＧＦＩＤＴＥＴＳＶ ＧＹＹＮＬＥＶＩＳＥ ＱＡＴＡＹＶＩＫＩＮ １００
ＥＬＫＥＬＬＳＫＮＬ ＴＨＦＦＹＶＦＱＴＬ ＱＫＱＶＳＹＳＬＡＫ ＦＮＤＦＳＩＮＧＫＬ ＧＳＩＣＧＱＬＬＩＬ １５０
ＴＹＶＹＧＫＥＴＰＤ ＧＩＫＩＴＬＤＮＬＴ ＭＱＥＬＧＹＳＳＧＩ ＡＨＳＳＡＶＳＲＩＩ ＳＫＬＫＱＥＫＶＩＶ ２００
ＹＫＮＳＣＦＹＶＱＮ ＬＤＹＬＫＲＹＡＰＫ ＬＤＥＷＦＹＬＡＣＰ ＡＴＷＧＫＬＮ ２３７

上述の通り、以下の例では、ａｃｔＡ遺伝子の発現はＰｒｆＡに応答性であり、ａｃｔＡプロモーターはＰｒｆＡ応答性の調節エレメントである。ＡｃｔＡは最も大量に発現するリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）タンパク質であり、その発現は感染細胞内ではｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件の２００倍超誘導されることから、ａｃｔＡプロモーターはリコンビナーゼ遺伝子の条件的高レベル発現に適したプロモーターである。

リステリア（Ｌｉｓｔｅｒａ）のＰｒｆＡとほぼ同じ方法で使用し得るその他の調節系としては、以下のものが挙げられる：

以下の例では、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）内での発現のためのａｃｔＡプロモーターと連動している。別法では、Ｃｒｅリコンビナーゼについて以下に示す方法とほぼ同じ方法で、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１インテグラーゼ、φＢＴ１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、ＰＳＡインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、Ｐ２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、Ｌ５インテグラーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、ｇｉｎリコンビナーゼ、ＲＶインテグラーゼ、ＳＰＢｃインテグラーゼ、ＴＧ１インテグラーゼ、φＣ１インテグラーゼ、ＭＲ１１インテグラーゼ、φ３７０インテグラーゼ、φＫ３８インテグラーゼ、ＷβインテグラーゼおよびＢＬ３インテグラーゼなどのリコンビナーゼを本発明に使用し得る。

Ｃｒｅが発現すると、隣接するリコンビナーゼ結合部位（例えば、ｌｏｘＰ）の組換え導入によって欠失の標的とした生存に必要な細菌遺伝子を切除する。ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１変異体ｌｏｘＰ部位などの変異体リコンビナーゼ部位を用いるのが有利であり得る。天然のｌｏｘＰとは異なり、標的遺伝子（１つまたは複数）の切除後に連結するｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１部位は、その後Ｃｒｅが仲介する組換えの鋳型として使用することができないため、切除の平衡状態を終了させる。

ＤＮＡ複製に必須な欠失遺伝子（例えば、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ）の標的化により、その同質遺伝子親リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌株と比較して、感染細胞内での細菌の細胞死がもたらされる。しかし、ａｃｔＡプロモーターは発酵時には誘導されないため、細菌成長培地中でのＲＩＩＤの成長を親菌株と区別することはできない。このほか、ＡｃｔＡなどのＰｒｆＡ依存性プロモーターを用いて、Ｌｍがコードする抗原の発現を感染ＡＰＣ内で誘導することが可能であり、この場合、合成された抗原は細菌シグナルペプチド／シャペロンとの結合を介してリステリア菌から細胞質ゾル内に分泌された後、ＭＨＣクラスＩ経路でプロセシングを受けて提示される。ＲＩＩＤ Ｌｍ菌株はＡＰＣに感染した後に死ぬようプログラムされているが、ワクチンは依然として、同質遺伝子の弱毒化生Ｌｍワクチン菌株によるワクチン接種と同程度の強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する。

以下に挙げるものは、ＤＮＡ複製に関与しＲＩＩＤ法の切除の標的となり得る例示的な遺伝子の非限定的なリストである。
ｏｒｉ（複製起点）
ｄｎａＡ（複製開始）
ｄｎａＮ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ベータサブユニット）
ｇｙｒＡ（ＤＮＡジャイレース、サブユニットＡ）
ｇｙｒＢ（ＤＮＡジャイレース、サブユニットＢ）
ｐｏｌＣ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、アルファサブユニット）
ｄｎａＥ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、アルファサブユニット）
ｆｔｓＫ（ＤＮＡ転移酵素、染色体分離）
ｆｔｓＺ（チューブリン様、中隔形成）
ｌｉｇＡ（ＤＮＡリガーゼ）
ｄｎａＧ（ＤＮＡプライマーゼ）
ｐａｒＣ（トポイソメラーゼＩＶサブユニット）
ｐａｒＥ（トポイソメラーゼＩＶサブユニット）
ｈｏｌＢ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、デルタサブユニット）
ｄｎａＸ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ガンマおよびタウサブユニット）
ＳＭＣ（染色体分離）

欠失の標的とするのに好適であるが非限定的な例を遺伝子の例としては、複製および細菌の細胞分裂に関与する、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＺ、ｌｉｇＡ、ｄｎａＧ、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｈｏｌＢ、ｄｎａＸ、ＳＭＣおよびｆｔｓＹなどの遺伝子が挙げられる。ＤＮＡ複製に関与する遺伝子に代えてまたはこれに加えて細胞内切除の標的となり得るリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の増殖に必須な遺伝子がほかにも存在する。Ｌｍ ＲＩＩＤ菌株は、ワクチン効力にＡｇのｄｅ ｎｏｖｏ発現が必要なワクチンプラットフォームとして有用であるため（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００５）、遺伝子標的の選択にあたっては、切除する遺伝子（１つまたは複数）が抗原発現／分泌に及ぼす影響を考慮に入れなければならない。好ましい実施形態では、ＲＮＡ転写およびタンパク質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、免疫効力が低下する可能性があり、これは特定の用途には望まれないことがあり得るため避けるべきである。その他の好ましい非限定的な例としては、病原性に影響を及ぼすｈｌｙおよびｄａｃＡなどの細菌遺伝子を標的とすることが挙げられる。したがって、当業者には、本明細書に記載される方法によって感染宿主細胞の細胞質ゾル内での欠失の標的となる任意の遺伝子が得られることは明らかであろう。すなわち、１番目に、欠失させる必須遺伝子（１つまたは複数）の上流および下流にある遺伝子間領域を特定し；２番目に、所望のｌｏｘＰ変異体を含むＰＣＲプライマーを設計し；３番目に、非必須／遺伝子間スペースにｌｏｘ部位を挿入するための対応する対立遺伝子交換ベクターを構築し；４番目に、対立遺伝子交換によってｌｏｘ部位を順次リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ワクチン菌株に挿入する。あるいは、欠失の標的となる遺伝子が小さい場合、両方のｌｏｘ部位を単一の対立遺伝子交換段階で付加することが可能であることが当業者には明らかであろう。さらなる実施形態では、感染細胞の細胞質ゾル内でＣｒｅリコンビナーゼ発現を誘導するためのＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットを部位特異的組込み（例えば、ｐＰＬ１を用いるｃｏｍＫ）が可能な別の位置または対立遺伝子交換法を用いた挿入が可能な任意の染色体上の位置に導入することができる。さらに別の実施形態では、細胞質ゾル内でのＣｒｅリコンビナーゼ発現誘導にａｃｔＡ以外のＰｒｆＡ依存性プロモーターを使用することができ、ｉｎｌＣが代替プロモーターの非限定的な例である。

上述のＣｒｅ／ｌｏｘ戦略の別法として、ＦＬＰリコンビナーゼおよびｆｒｔ部位により同じく細胞内切除の標的とすることができるリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の増殖に必須な遺伝子。１番目に、欠失させる必須遺伝子（１つまたは複数）の上流および下流にある遺伝子間領域を特定し；２番目に、所望のｆｒｔ部位を含むＰＣＲプライマーを設計し；３番目に、非必須／遺伝子間スペースにｆｒｔ部位を挿入するための対応する対立遺伝子交換ベクターを構築し；４番目に、対立遺伝子交換によってｆｒｔ部位を順次リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ワクチン菌株に挿入する。あるいは、欠失の標的となる遺伝子が小さい場合、両方のｆｒｔ部位を単一の対立遺伝子交換段階で付加することが可能であることが当業者には明らかであろう。さらなる実施形態では、感染細胞の細胞質ゾル内でＦＬＰリコンビナーゼ発現を誘導するためのＰａｃｔＡ−ＦＬＰカセットを部位特異的組込み（例えば、ｐＰＬ１を用いるｃｏｍＫ）が可能な別の位置または対立遺伝子交換法を用いた挿入が可能な任意の染色体上の位置に導入することができる。

４．抗原性構築物
標的抗原
ワクチンプラットフォームとして使用する場合の本明細書に記載されるＲＩＩＤ細菌の好ましい特徴は、組換え発現された抗原（１つまたは複数）に対して自然免疫応答と抗原特異的Ｔ細胞応答の両方を惹起する能力である。例えば、本明細書に記載される抗原（１つまたは複数）を発現するＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ワクチン誘導性免疫応答の性質を決定する１型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）ならびに共調節されるケモカインおよびサイトカインタンパク質のカスケードを誘導することができる。この免疫刺激に応答して、ＮＫ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）が静脈内ワクチン接種経路後の肝臓またはこの代わりに、例えば、筋肉内、皮下または真皮内免疫感作経路による他のワクチン接種経路後のワクチン接種部位に動員される。ある特定の実施形態では、本発明のワクチンプラットフォームは、対象にワクチンプラットフォームを送達した２４時間後におけるＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１からなる群より選択されるサイトカインおよびケモカインのうちの１つまたは複数、好ましくはこのすべての血清中濃度の上昇を引き起こし；かつワクチンプラットフォームによって発現される１つまたは複数の抗原に対してＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する。他の実施形態では、本発明のワクチンプラットフォームはほかにも、マウスモデル系におけるＤＸ５、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４３などの活性化マーカーのアップレギュレーションによって、または標的細胞として使用された^５１Ｃｒ標識ＹＡＣ−１細胞を用いて測定されるＮＫ細胞仲介性細胞溶解活性によって示される、常在未熟肝ＮＫ細胞の成熟を誘導する。

Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）がワクチンベクターとしての役割を果たす能力については、Ｗｅｓｉｋｉｒｃｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５８：１５９−１６９（１９９７）に概説されている。Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生得的な生理には望ましい特性が多数みられることから、治療ワクチンに適用するための魅力的なプラットフォームとなっている。その主たる理論的根拠は、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の細胞内生活環がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の効果的刺激を可能にするということにある。感染時にＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）高分子との相互作用に応答して、ＴＬＲ（ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含めた多数の病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体が作動することにより、自然免疫エフェクターの総活性化およびＴｈ−１極性化サイトカインの放出が起こり、発現した抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発現に大きな影響を及ぼす。

近年、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の菌株が、免疫系に抗原を送達して癌およびＨＩＶなどの疾患の原因となる薬剤の注射が不可能な臨床状態に免疫応答を誘導するための効果的な異種タンパク質の細胞内送達媒体として開発されている。例えば、それぞれ表、図面および請求項をすべて含めたその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５１，２３７号；Ｇｕｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：６４７１−６４７９（２００１）；Ｌｉａｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２：２２８７−２２９３（２００２）；米国特許第６，０９９，８４８号；国際公開第９９／２５３７６号；国際公開第９６／１４０８７号；および米国特許第５，８３０，７０２号を参照されたい。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原を発現する組換えＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ワクチンが、この抗原に対して防御的細胞性免疫を誘導することが示されている（Ｓｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３９８７−３９９１（１９９５）。

ある特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物に使用するＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢの弱毒化変異ならびに好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの全部または一部の欠失（「ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と呼ばれる）をさらに含み、１つまたは複数の目的とする抗原（１つまたは複数）の発現をコードする組換えＤＮＡを含む、ＲＩＩＤ菌株である。抗原（１つまたは複数）は、好ましくは細菌の発現配列の制御下にあり、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のゲノム内に安定に組み込まれている。

本発明はほかにも、少なくとも１つの調節因子、例えば、プロモーターまたは転写因子が弱毒化されたリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を考慮する。以下はプロモーターに関するものである。ＡｃｔＡ発現は２つの異なるプロモーターによって調節される（Ｖａｚｗｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２１９−２３０）。ＩｎｌＡおよびＩｎｌＢの発現はともに５つのプロモーターによって調節される（Ｌｉｎｇｎａｕら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。転写因子ｐｒｆＡは多数のＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、例えば、ｈｌｙ、ｐｌｃＡ、ＡｃｔＡ、ｍｐｌ、ｐｒｆＡおよびｉａｐの転写に必要とされる。ＰｒｆＡの調節特性は、例えば、ＰｒｆＡ依存性プロモーター（ＰｉｎｌＣ）およびＰｒｆＡボックスによって仲介される。本発明は、ある特定の実施形態では、ＡｃｔＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ＰｒｆＡ、ＰｉｎｌＣ、ＰｒｆＡボックスなどのうちの少なくとも１つが不活化、変異または欠失したものをコードする核酸を提供する（例えば、Ｌａｌｉｃ Ｍｕｌｌｔｈａｌｅｒら（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０；Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７−１５５１；Ｌｕｏら（２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９−５２を参照されたい）。ＰｒｆＡはＧｌｙ１４５Ｓｅｒ変異、Ｇｌｙ１５５Ｓｅｒ変異またはＧｌｕ７７Ｌｙｓ変異によって構成的活性化型にすることができる（例えば、ＭｕｅｌｌｅｒおよびＦｒｅｉｔａｇ（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：１９１７−１９２６；ＷｏｎｇおよびＦｒｅｉｔａｇ（２００４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：６２６５−６２７６；Ｒｉｐｉｏら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１５３３−１５４０を参照されたい）。

本発明に使用し得る標的抗原の例を下の表に挙げる。標的抗原はこのほか、表に挙げた抗原の免疫学的に活性な部分を含むフラグメントまたは融合ポリペプチドであってもよい。ここに挙げるものは限定することを目的とするものではない。

適切な抗原として当該技術分野で公知のその他の生物体としては、特に限定されないが、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種（チフィ（ｔｙｐｈｉ）、チフィリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）（ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｌｏｒｉ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）およびその他のＤ群シゲラ種を含む）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびＶ．バルニフィカス（Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。ここに挙げたものは限定することを目的とするものではない。

ある特定の実施形態では、抗原配列（１つまたは複数）は、ワクチン接種した宿主内での細菌による融合タンパク質の発現および分泌を可能にする、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡｃｔＡタンパク質のアミノ末端部分と融合した単一のポリペプチドとして発現し得る。このような実施形態では、抗原性構築物は、融合タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターを含み、融合タンパク質が（ａ）改変ＡｃｔＡと、（ｂ）改変ＡｃｔＡ配列の後に融合タンパク質として発現する１つまたは複数の抗原性エピトープとを含む、ポリヌクレオチドであり得る。

「改変ＡｃｔＡ」は、少なくともＡｃｔＡシグナル配列を含むがＡｃｔＡ配列全体は含まないか、このようなＡｃｔＡ配列と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性もしくは少なくとも約９８％の配列同一性を有する、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡｃｔＡタンパク質の連続する一部分を意味する。ＡｃｔＡシグナル配列はＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０７／１０３２２５号；および同第０７／１１７３７１号のＡｃｔＡプロモーターである。

例を挙げると、改変ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸またはＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性もしくは少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、改変されたＡｃｔＡは、ＡｃｔＡの少なくとも最初の１００アミノ酸またはＡｃｔＡの最初の１００アミノ酸と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性もしくは少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を含む。換言すれば、いくつかの実施形態では、改変ＡｃｔＡ配列は、残基１００以降で切断されたＡｃｔＡのＮ末端フラグメント（ＡｃｔＡシグナル配列を含む）に対応するものである。

ＡｃｔＡ−Ｎ１００は以下の配列（配列番号３）を有する：
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ １００

この配列では、最初の残基がバリンとして表されている。このポリペプチドは、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）により、この位置がメチオニンである状態で合成される。したがって、ＡｃｔＡ−Ｎ１００はこのほか、以下の配列（配列番号４）を有し得る：
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ １００

ＡｃｔＡ−Ｎ１００はほかにも、改変ＡｃｔＡのＣ末端残基と抗原配列との間に１つまたは複数の追加の残基を含み得る。以下の配列では、ＡｃｔＡ−Ｎ１００が、ＢａｍＨ１部位を含ませることによって追加された２つの残基の分だけ延長されている（配列番号５）：
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ １００
ＧＳ
この配列が、最初の残基がメチオニンである状態で合成されると、以下の配列（配列番号６）を有する：
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ １００
ＧＳ。

１つの生物体によってコードされる配列が、必ずしも選択するワクチンプラットフォーム細菌株での至適発現にコドン最適化されているとは限らないため、本発明はほかにも、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの細菌による発現に最適化されたコドンによって改変した核酸を提供する。

種々の実施形態において、最適なコドンを得るために、任意の最適でないコドンの少なくとも１パーセントを変化させ、より通常には少なくとも５パーセントを変化させ、最も通常には少なくとも１０パーセントを変化させ、多くの場合少なくとも２０％を変化させ、より多くの場合少なくとも３０％を変化させ、最も多くの場合少なくとも４０％、通常少なくとも５０％を変化させ、より通常には少なくとも６０％を変化させ、最も通常には少なくとも７０％を変化させ、最適には少なくとも８０％を変化させ、より最適には少なくとも９０％を変化させ、最も最適には少なくとも９５％を変化させ、慣例的には任意の最適でないコドンの１００％をリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）での発現にコドン最適化する（表２）。

本発明は、本発明の弱毒化細菌を作製または操作するためのリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌種および菌株を多数提供する。本発明のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は、表３に開示される菌種および菌株に限定されるものではない。

４．治療用組成物
本明細書に記載されるワクチン組成物は、単独で、または薬学的に許容される補形剤と組み合わせて、しかるべき免疫応答を誘導するのに十分な量で宿主に投与することができる。免疫応答は、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的応答および非特異的応答の両方、自然応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化およびサイトカイン発現を非限定的に含み得る。本発明のワクチンは、例えば、凍結させて、凍結乾燥させて、懸濁液として、細胞ペーストとして、または固体マトリックスもしくはゲルマトリックスと複合体を形成させて保管することができる。

ある特定の実施形態では、対象に有効量の第一のワクチンを投与して免疫応答を初回刺激した後、第二のワクチンを投与する。これを当該技術分野では「プライムブースト」レジメンと呼ぶ。このようなレジメンでは、本発明の組成物および方法を「初回刺激」送達として、「追加免疫」送達として、または「初回刺激」および「追加免疫」の両方として用い得る。ワクチン誘導性免疫応答の強度または効果を維持するため、「追加免疫」による免疫感作を任意の回数実施することができる。

例として、不活化されているが代謝活性があり、抗原ポリペプチド（１つまたは複数）をコードし発現するリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からなる第一のワクチンを「初回刺激」として送達し、抗原ポリペプチド（１つまたは複数）をコードする弱毒化した（生きている、または不活化されているが代謝活性がある）リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からなる第二のワクチンを「追加免疫」として送達し得る。しかし、初回刺激および追加免疫のそれぞれに本発明の方法および組成物を用いる必要はないことを理解するべきである。むしろ、本発明は、他のワクチン様式を本発明の細菌ワクチンの方法および組成物とともに使用することを考慮する。以下に挙げるものは適切な混合プライムブーストレジメンの例である：ＤＮＡ（例えば、プラスミド）ワクチン初回刺激／細菌ワクチン追加免疫；ウイルスワクチン初回刺激／細菌ワクチン追加免疫；タンパク質ワクチン初回刺激／細菌ワクチン追加免疫；ＤＮＡ初回刺激／細菌ワクチン追加免疫とタンパク質ワクチン追加免疫；細菌ワクチン初回刺激／ＤＮＡワクチン追加免疫；細菌ワクチン初回刺激／ウイルスワクチン追加免疫；細菌ワクチン初回刺激／タンパク質ワクチン追加免疫；細菌ワクチン初回刺激／細菌ワクチン追加免疫とタンパク質ワクチン追加免疫など。ここに挙げたものは限定することを目的とするものではない。

初回刺激ワクチンおよび追加免疫ワクチンは同じ経路で投与しても、異なる経路で投与してもよい。「異なる経路」という用語は、特に限定されないが、体の異なる部位、例えば、口腔、非口腔、腸内、非経口、直腸内、節内（リンパ節）、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周囲、注入、粘膜、鼻腔、脳脊髄腔または脳脊髄液内などの部位のほか、異なる方式、例えば、経口、静脈内および筋肉内によるもの包含する。

有効量の初回刺激または追加免疫ワクチンを１回の投与で投与してもよいが、１回の投与に限定されるわけでなない。したがって、投与は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回またはそれ以上のワクチン投与であり得る。本発明の方法で１つまたは複数のワクチンを２回以上投与する場合、投与に１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分またはそれ以上の時間間隔で、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間などの間隔で間を空け得る。時間に関して、「約」という用語は、±３０分以内の任意の時間間隔を意味する。このほか、投与に１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日およびその組合せの時間間隔で間を空けてもよい。本発明は、等しい時間を空けた投与間隔に限定されるわけではなく、単なる非限定的な例を挙げると、１日、４日、７日および２５日の投与からなる初回刺激スケジュールなど間隔の等しくない投与を包含する。

ある特定の実施形態では、追加免疫ワクチン接種を初回刺激ワクチン接種開始の約５日後；初回刺激ワクチン接種開始の約１０日後；初回刺激ワクチン接種の約１５日後；約２０日後；約２５日後；約３０日後；約３５日後；約４０日後；約４５日後；約５０日後；約５５日後；約６０日後；約６５日後；約７０日後；約７５日後；約８０日後、約６か月後および約１年後に開始し得る。好ましくは、初回刺激ワクチン接種および追加免疫ワクチン接種の一方または両方が本発明の組成物の送達を含む。

「薬学的に許容される補形剤」または「診断学的に許容される補形剤」としては、特に限定されないが、無菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、アミノ酸ベースの緩衝液または炭酸水素緩衝溶液が挙げられる。選択する補形剤および使用する補形剤の量は投与方式によって決まる。投与は、経口、静脈内、皮下、経皮、真皮内、筋肉内、粘膜、非経口、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼内、筋肉内、血管内、節内、乱刺法によるもの、直腸内、腹腔内または各種周知の投与経路のいずれか１つもしくは組合せであり得る。投与は注射、注入またはその組合せを含み得る。

非経口経路による本発明のワクチンの投与では免疫寛容を回避することができる。静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経口投与、経粘膜投与、経尿路投与、経生殖管投与、経消化管投与または吸入投与の方法が当該技術分野で公知である。

特定の患者に対する有効量は、治療する病態，患者の全般的健康状態，投与する経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子によって異なり得る。治療および診断方法の指針が利用可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい）。

本発明のワクチンは１つまたは複数の用量で投与することが可能であり、この場合、各用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも１００個以上の細菌細胞；ある特定の実施形態では、体重１ｋｇ当たり１０００個以上の細菌細胞；体重１ｋｇ当たり、通常少なくとも１０，０００個；より通常には少なくとも１００，０００個；最も通常には少なくとも１００万個；多くの場合少なくとも１０００万個；より多くの場合少なくとも１億個；典型的には少なくとも１０億個；通常少なくとも１００億個；慣例的には少なくとも１０００億個；場合によっては少なくとも１兆個の細胞を含む。本発明は、細菌投与の単位がソラレン処理前のコロニー形成単位（ＣＦＵ）に相当するＣＦＵである、またはその単位が細菌細胞数である上記用量を提供する。

本発明のワクチンは１つまたは複数の用量で投与することが可能であり、この場合、各用量は、湿重量で、体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり；または肝重量１．５ｋｇ当たり）１０^７〜１０^８個；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり；または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^７〜２×１０^８個；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり；または肝重量１．５ｋｇ当たり）５×１０^７〜５×１０^８個；体重７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり１０^８〜１０^９個；または肝重量１．５ｋｇ当たり）；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２．０×１０^８〜２．０×１０^９個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）５．０×１０^８〜５．０×１０^９個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）１０^９〜１０^１０個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^９〜２×１０^１０個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）５×１０^９〜５×１０^１０個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）１０^１１〜１０^１２個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^１１〜２×１０^１２個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）５×１０^１１〜５×１０^１２個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり）１０^１２〜１０^１３個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^１２〜２×１０^１３個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）５×１０^１２〜５×１０^１３個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）１０^１３〜１０^１４個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^１３〜２×１０^１４個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）５×１０^１３〜５×１０^１４個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）１０^１４〜１０^１５個；７０ｋｇ当たり（または表面積１．７平方メートル当たり、または肝重量１．５ｋｇ当たり）２×１０^１４〜２×１０^１５個などの細菌を含む。

このほか、投与を毎日１回の注射、２日に１回の注射、３日に１回の注射、４日に１回の注射、５日に１回の注射、６日に１回の注射または７日に１回の注射により実施する１つまたは複数の上記用量が提供され、この場合、注射スケジュールを、例えば、１日のみ、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上の間維持する。本発明はほかにも、例えば、初回の細菌量を比較的多くし、次いで次の細菌量を比較的少なくする、または初回の細菌量を比較的少なくし、次いで細菌量を多くする、上記用量およびスケジュールの組合せを包含する。

本発明に例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週７回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回などの投与スケジュールを用いることができる。投与スケジュールは、合計期間が例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月および１２か月の投与を包含する。

上記投与スケジュールのサイクルが提供される。サイクルは例えば、約７日毎；１４日毎；２１日毎；２８日毎；３５日毎；４２日毎；４９日毎；５６日毎；６３日毎；７０日毎などで繰り返すことができる。サイクルの間に投与しない期間があってもよく、この場合、その期間は例えば、約７日；１４日；２１日；２８日；３５日；４２日；４９日；５６日；６３日；７０日などであり得る。この文脈において、「約」という用語は、±１日、±２日、±３日、±４日、±５日、±６日または±７日を意味する。

本発明は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の経口的な投与方法を包含する。このほか、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の静脈内への投与方法が提供される。さらに、提供されるものには、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を経口的に、筋肉内に、静脈内に、真皮内に、および／または皮下に投与する方法がある。本発明は、肉ベースの培地または肉もしくは動物生成物に由来するポリペプチドを含有する培地で培養することによって調製したリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌の培養物もしくは懸濁物を提供する。ほかにも、肉もしくは動物生成物を含有しない培地で培養することによって調製した、植物性ポリペプチドを含有する培地で培養することによって調製した、酵母生成物をベースにしない培地で培養することによって調製した、または酵母ポリペプチドを含有する培地で培養することによって調製したリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）菌の培養物もしくは懸濁物が本発明によって提供される。

追加の治療剤との共投与の方法は当該技術分野で周知である（Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。

同様に、細胞溶解性Ｔ細胞応答を生じさせるのに有益な追加の薬剤を使用し得る。このような薬剤を本明細書では担体と呼ぶ。これには、特に限定されないが、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン−２、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＯＸ−４０／ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミソール、ワクシニアウイルス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、解毒内毒素、鉱油、リポレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドおよび油性または炭化水素乳剤が含まれる。抗体応答に対して細胞溶解性Ｔ細胞応答を選択的に刺激するＴ細胞免疫応答を誘導する担体が好ましいが、両方のタイプの応答を刺激する担体も使用することができる。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチド自体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することができる。担体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞などの細胞であってもよい。抗原提示細胞としては、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞などの細胞型が挙げられる。その他の専門化した抗原提示細胞としては、単球、辺縁帯クッパ―細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、指状嵌入樹状細胞、濾胞樹状細胞およびＴ細胞が挙げられる。このほか条件的抗原提示細胞を使用してもよい。条件的抗原提示細胞の例としては、アストロサイト、濾胞細胞、内皮細胞および線維芽細胞が挙げられる。担体は、ポリペプチドを発現する、またワクチン接種した個体の細胞でのちに発現するポリヌクレオチドを送達するよう形質転換した細菌細胞であってもよい。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントを添加して、ワクチンが免疫応答を誘発する、増強する、または延長する能力を増大させてもよい。ほかにも、記載されている組成物と別個にまたは組み合わせて使用する追加の物質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびＣｐＧのような細菌核酸配列、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９アゴニスト、ならびにリポタンパク質、ＬＰＳ、モノホスホリルリピッドＡ、リポテイコ酸、イミキモド、レシキモドを含めたＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９に対する追加のアゴニスト、ならびにｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃ−ジ−ＡＭＰ、ｃ−ジ−ＩＭＰおよびｃ−ＡＭＰ−ＧＭＰを含めた環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストなどの他の同様な免疫モジュレーターなどがアジュバントとなる可能性がある。アジュバントのその他の代表的な例としては、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から精製される均質なサポニンとコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）とを含む合成アジュバントＱＳ−２１が挙げられる（ＭｃＣｕｎｅら，Ｃａｎｃｅｒ，１９７９；４３：１６１９）。アジュバントには最適化が施されることが理解されよう。換言すれば、当業者は、ルーチンの実験を実施して使用に最適なアジュバントを決定することができる。

治療剤の有効量とは、症状を通常少なくとも１０％、より通常には少なくとも２０％、最も通常には少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、最も典型的には少なくとも６０％、多くの場合少なくとも７０％、より多くの場合少なくとも８０％、最も多くの場合少なくとも９０％、慣例的には少なくとも９５％、より慣例的には少なくとも９９％、最も慣例的には少なくとも９９．９％軽減または改善する量のことである。

本発明の試薬および方法は、１回のみのワクチン接種を含む；または第一のワクチン接種を含む；または少なくとも１回の追加免疫ワクチン接種；少なくとも２回の追加免疫ワクチン接種；もしくは少なくとも３回の追加免疫ワクチン接種を含むワクチンを提供する。追加免疫ワクチン接種のパラメータの指針が利用可能である。例えば、Ｍａｒｔｈ（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２５：１９９−２０３；Ｒａｍｓａｙら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：３８２−３８８；Ｇｈｅｒａｒｄｉら（２００１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：６５５−６６７；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら（２００１）ＡｃｔＡ Ｃｌｉｎ．Ｂｅｌｇ．５６：２０９−２１９；Ｇｒｅｉｎｅｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：６９４４−６９５１；Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７０：Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ３８−Ｓ４１；Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ａｍｏｒら（２００２）ワクチン２０：２７９０−２７９５を参照されたい。

治療剤の製剤は、生理的に許容される担体、補形剤または安定剤と、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で混合することによって、保管用に調製し得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｓｅ ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｓｅ ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｓｅ ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
実施例

以下の実施例は本発明を説明する役割を果たすものである。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１．Ｌｍ ＲＩＩＤ（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）リコンビナーゼ誘導性細胞内死（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅａｔｈ）菌株の構築
ＤＮＡの操作、精製およびベクター組立て。
対立遺伝子交換（Ｃａｍｉｌｌｉ，１９９３）を用いて、必須なリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）遺伝子セットの遺伝子間領域５’および３’にリコンビナーゼ認識部位（ｌｏｘＰ、ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１変異体またはｆｒｔ）を挿入した。１０４０３Ｓ（Ｂｉｓｈｏｐ，１９８７）ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、対立遺伝子交換ベクターにリコンビナーゼ部位を付加した。ＰＣＲはＭｙＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）で高正確性酵素Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて実施した。クローン化に使用したオリゴヌクレオチド（オリゴ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を下の表に列挙する。

下の表に以下の実施例で使用する配列を列挙する。

ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で精製し、しかるべき制限酵素（ＮＥＢ）で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて温度感受性対立遺伝子交換ベクターｐＫＳＶ７の誘導体ｐＫＳＶｏｒｉＴ（Ｓｍｉｔｈ、１９９２）と連結した。クローン化に使用したベクターはすべて、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）で処理した。クローン化、接合およびＬｍ親菌株に使用した細菌株をのちの表６に列挙する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＳＭ１０をＺ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）に化学的にコンピテントにした。ＸＬ１−ｂｌｕｅおよびＳＭ１０の形質転換体をともにルリア−ベルターニブロス（ＬＢ）でしかるべき抗生物質を選択し（ｐＫＳＶｏｒｉＴ：７５μｇ／ｍｌカルベニシリン；ｐＰＬ２系ベクター：２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）３７℃にて培養した。Ｌｍ菌株を植物性ペプトンリン酸ブロス（ＶＰＰ）（Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）で増殖させた。７．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＶＰＰプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ）上でＬｍを選択した。対立遺伝子交換ベクターを診断コロニーＰＣＲ、制限消化および配列決定により確認した（ＳｅｑＸｃｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）。確認したプラスミドをＳＭ１０細胞内に形質転換し、記載されるＬｍ内に接合させた。リコンビナーゼ遺伝子を部位特異的組込みベクターｐＰＬ２またはその誘導体のａｃｔＡの下流にクローン化した（Ｌａｕｅｒ、２００２）。

実施例２．Ｃｒｅ／ｌｏｘ仲介性Ｌｍ ＲＩＩＤ菌株の設計
ＲＩＩＤ菌株の実例となる非限定的な例は、Ｌｍジャイレースの２つのサブユニットをコードしＤＮＡ複製時に細菌ゲノムのらせんの導入／解消に関与する細菌遺伝子、ｇｙｒＢ（ｌｍｏ０００６）およびｇｙｒＡ（ｌｍｏ０００７）の標的化に基づいたものである。構築の第一の段階では、ｒｅｃＦ（ｌｍｏ０００５）の上流、ＭＡＴＥ排出（ｌｍｏ０００３）とｙａａＡ（ｌｍｏ０００４）のコード配列の間にｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら，１９９５）を配列させ、これは既に記載されている対立遺伝子交換（Ｃａｍｉｌｌｉら，１９９３）によって実施した。Ｌｍ ＲＩＩＤ菌株を作製するのに使用する対立遺伝子交換ベクターを設計するために、プライマーＰＬ２８６３／ＰＬ２８６４を用いたＰＣＲによって標的遺伝子の上流隣接領域を増幅し、標的遺伝子の下流隣接領域をプライマーＰＬ２８６５／ＰＬ２８６６で増幅した。次いで、ｏｒｉＴ（ｐＫＳＶｏｒｉＴ）を含むよう改変したシャトルベクタープラスミドｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈら，１９９２）の誘導体内にＰＣＲ産物をクローン化して、プラスミドｐＢＨＥ１９３７を得た。ＰＣＲによって既存のベクターからｌｏｘ７１を含む４００ｂｐ領域を増幅した後、ｐＢＨＥ１９３７内にクローン化することによって、ｌｏｘ７１配列をｌｍｏ０００３／ｌｍｏ０００４隣接領域の間に挿入し、プラスミドｐＢＨＥ２０９９を得た。プラスミドの配列を確認し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＭ１０内に形質転換してＬｍ内に接合させた。ＳＭ１０菌株と、ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、ｕｖｒＡＢのコード配列が欠失したＤＰ−Ｌ４０５６の弱毒化生誘導体であるＬｍ菌株ＢＨ１９５９とを交配させた。さらに、この菌株は、自死性菌株およびその非自死性対照の免疫原性をモニタリングするためにｉｎｌＢ遺伝子座に抗原発現カセットを含んでいる（Ｌａｕｅｒら，２００８に記載される通り）。接合完了体に対立遺伝子交換を実施し、最終的にＬｍ菌株ＢＨ３１４１を得た。

既に記載されている重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，１９９３）によりスプライシングを用いて、ｇｙｒＡ（ｌｍｏ０００７）とカルジオリピン合成酵素（ｌｍｏ０００８）との間、ｌｏｘ７１（表５）の下流に第二の変異ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ６６）を導入した。ｇｙｒＡに隣接する領域をプライマーＰＬ３１４１／ＰＬ３１４２で増幅し、下流領域（ｌｍｏ０００８に隣接する）をＰＬ３１３９／ＰＬ３１４０で増幅した。ｌｏｘ６６配列はプライマーＰＬ３１３９およびＰＬ３１４２に含ませた。次いで、ＳＯＥ ＰＣＲの一次産物を第二のＰＣＲ段階によって合わせた後、このＳＯＥ産物をｐＫＳＶ７ｏｒｉＴ内にクローン化し、プラスミドｐＢＨＥ２１９３を得た。ｌｏｘ７１含有菌株ＢＨ３１４１内へのｐＢＨＥ２１９３との対立遺伝子交換を実施し、Ｌｍ菌株ＢＨ３２１０を得た。この菌株は、ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６が隣接するｙａａＡ−ｒｅｃＦ−ｇｙｒＢ−ｇｙｒＡからなるゲノム領域を含んでいた（図２Ｂ）。

Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株作製の最終段階では、リコンビナーゼ遺伝子発現を被ワクチン接種者の感染細胞の細胞質ゾルに限定するａｃｔＡプロモーターと機能的に連結されたＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドのクローン化および組込みを実施した。Ｃｒｅのヌクレオチド配列はＬｍでの発現にコドン最適化されたものであった（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）。Ｃｒｅ配列をプライマーＰＬ１５３６／ＰＬ１５３７で増幅し、ａｃｔＡプロモーター（２２１ｂｐ、表５）を含むｐＰＬ２系プラスミド（ｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座での部位特異的組込みを可能にする）内にＥａｇＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化し、プラスミドｐＢＨＥ２１３０を得た。このプラスミドを親菌株（ＢＨ１９５９）およびｌｏｘ７１／ｌｏｘ６６含有変異体（ＢＨ３２１０）の両方に接合させ、それぞれＢＨ３０９９（非自死性対照）およびＢＨ３２２６（Ｌｍ ＲＩＩＤ）を得た。

Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンの第二の非限定的な実例として、ＢＨ３１４１のｌｍｏ０００３とｌｍｏ０００４との間にｌｏｘ７１を含む菌株ＢＨ３１４１の起点の反対側にｌｏｘ６６部位を配置させることによって、切除に必須な遺伝子の第二のセットを標的化した。この第二の菌株で欠失している領域には、ｌｍｏ２５８７、複製起点（ｏｒｉＣ）、必須な複製開始遺伝子ｄｎａＡおよびｄｎａＮ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットをコードする）ならびにｌｍｏ０００３が含まれる（図２Ｃ）。最初にオリゴセットＰＬ４０７５／ＰＬ４０１７を用いたＰＣＲにより、ｒｎｐＡの３’末端からｒｐｍＨの１５０ｂｐ下流まで伸長している領域を増幅することによって、対立遺伝子交換ベクターｐＢＨＥ２７２４を設計した（隣接領域１）。オリゴセットＰＬ４０１８／ＰＬ４０７６を用いて、ｌｍｏ２８５７の大部分からなる第二の隣接領域を増幅した（隣接領域２）。ｌｏｘ６６配列は順方向プライマーＰＬ４０１８に含ませた。制限酵素による３方向連結を用いて、２つの隣接領域をベクターｐＫＳＶｏｒｉＴに組み立てた。同じ対立遺伝子交換工程を繰り返して、ｒｐｍＨとｌｍｏ２８５７との間の遺伝子間領域に組み込んだ。ｌｏｘ６６含有配列が菌株ＢＨ３１４１内に挿入されたのを確認した後、新たな菌株をＢＨ３９０１と命名した。接合によってｐＢＨＥ２１３０（ＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットを含む）を導入し、Ｌｍ ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３９０８を得た。

同様の方法を用いて、ｌｍｏ２５８２からｇｙｒＡまでの１４キロベースの領域にわたる欠失を標的化することによってＬｍ−ＲＩＩＤワクチンの第三の非限定的な実例を作製した（図２Ｄ）。ｌｍｏ２８５１を含めた１０３１ｂｐにわたる第一の隣接領域をプライマーＰＬ３２４６／ＰＬ３２４７を用いたＰＣＲによって増幅した。ｌｍｏ２８５２およびｌｍｏ２８５３の大部分を含めた１０２９ｂｐにわたる第二の隣接領域をオリゴＰＬ３２４８／ＰＬ３２４９を用いたＰＣＲによって増幅した。両フラグメントをベクターｐＢＨＥ２２９２のｐＫＳＶｏｒｉＴ内にクローン化した。プライマーＰＬ３３３９／ＰＬ３３４０を用いたＰＣＲによってｐＢＨＥ２０９９（上記）のＬｏｘ７１を増幅し、ｐＢＨＥ２２９２のＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位内にクローン化して、ｐＢＨＥ２３５８を得た。ｌｏｘ７１部位とＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットの両方を同じ対立遺伝子交換で同時に組み込むことを可能にするため、ｐＢＨＥ２１３０のＣｒｅカセットをＰＬ３３７８／ＰＬ３３７９で増幅し、ｐＢＨＥ２３５８内のｌｏｘ７１とｌｍｏ２８５２隣接領域との間にクローン化して、対立遺伝子交換ベクターｐＢＨＥ２３８２を得た。ｐＢＨＥ２１９３（上記）を用いて、ｌｏｘ６６部位を弱毒化生Ｌｍ１１菌株（弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢワクチン菌株）内に導入し、中間菌株ＢＨ３２９１を得た。第二の対立遺伝子交換を実施して、ｌｍｏ２８５１とｌｍｏ２８５２との間にｌｏｘ７１およびＰａｃｔＡ−Ｃｒｅを挿入してＢＨ３２９１のｐＢＨＥ２３８２に含ませ、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３４１０を得た。

ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ菌株を背景として第四のＬｍ−ＲＩＩＤ菌株を構築し、これにより、のちに様々なワクチン抗原組成物をｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座に導入し、免疫原性試験で試験することを可能にした。ＢＨ３２１０を生じる同じ連続した対立遺伝子交換工程をＬｍ１１菌株背景で繰り返した。最初にｐＢＨＥ２１９３を用いてｇｙｒＡの下流にｌｏｘ６６部位を挿入し、次いでｐＢＨＥ２０９９を用いてｙａａＡの上流にｌｏｘ７１部位を挿入した。ｌｏｘ７１−ｙａａＡ−ｒｅｃＦ−ｇｙｒＢ−ｇｙｒＡ−ｌｏｘ６６という構成を含む菌株（図２Ｂ）をＢＨ３３３９と命名した。ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ菌株の欠失したａｃｔＡ遺伝子座にＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットを対立遺伝子交換によって導入し、のちにｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座にワクチン抗原発現カセットを導入することを可能にして、動物試験で評価するためのワクチン菌株を作製した。プライマーＰＬ３５４６／ＰＬ３５４７を用いたＰＣＲによって、ｍｐｌ遺伝子の８２５ｂｐを含むａｃｔＡ上流隣接領域を増幅した。ｐｌｃＢ遺伝子の７９７ｂｐを含むａｃｔＡ下流隣接領域をプライマーＰＬ３５４８／ＰＬ３５４９でＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を３方向連結によってｐＫＳＶｏｒｉＴ内にクローン化し、ベクターｐＢＨＥ２５１９を得た。ｐＢＨＥ２５１９プラスミドベクターは、２つの隣接領域の間に固有のＫｐｎＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含んでいた。ＰａｃｔＡ−ＣｒｅカセットをｐＢＨＥ２１３０からｐＢＨＥ２５１９内にサブクローン化し、ｐＢＨＥ２５２５を得た。対立遺伝子交換を用いて、ΔａｃｔＡ遺伝子座にＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットを導入し、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６１８を得た。

実施例３．ＦＬＰ／ｆｒｔ系ＲＩＩＤ菌株
当業者には、ほかのリコンビナーゼ法を用いて感染宿主細胞の細胞質ゾル内での増殖に必要なＬｍ遺伝子を選択的に欠失させることができることは明らかであろう。非限定的な１つの例が、酵母リコンビナーゼＦＬＰをＣｒｅ／ｌｏｘＰ系の代わりにｆｒｔ組換え部位とともに用いてＬｍ−ＲＩＩＤワクチンを作製することである。ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１部位をｆｒｔ組換え部位に置き換え（図２Ｅ）、Ｃｒｅリコンビナーゼの代わりにＦＬＰリコンビナーゼを用いることによって、ＢＨ３２２６と組成が類似した菌株（図２Ｂ）を作製した。以下のように、ｌｍｏ０００３とｌｍｏ０００４との間にｆｒｔ部位を挿入することによって、ｐＢＨＥ１９３７（実施例１に記載されている）に類似した対立遺伝子交換ベクターを構築した：プライマーペア、ＰＬ２８６３／ＰＬ３４７２（ＭＡＴＥ排出、ｌｍｏ０００３）およびＰＬ３４７１／ＰＬ２８６６（ｙａａＡ、ｌｍｏ０００４）を用いて、１０４０３Ｓ ＤＮＡにＰＣＲを実施した。プライマーＰＬ３４７１およびＰＬ３４７２により天然のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）配列にｆｒｔ配列が付加された。第二のＳＯＥ ＰＣＲを用いて、ｆｒｔ部位が介在する２つの隣接領域を含む単一ＤＮＡフラグメント内にＰＣＲ産物を組み込んだ。この構築物をＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＫＳＶ７ｏｒｉＴ内にクローン化し、ｐＢＨＥ２５０３を得た。ｐＢＨＥ２５０３を接合によってＬｍ１１内に導入し、対立遺伝子交換を実施して、ＢＨ３５５８を得た。ＳＯＥ ＰＣＲ反応の第二のセットを用いて、ｇｙｒＡとｌｍｏ０００８との間にｆｒｔ組換え部位を導入した対立遺伝子交換ベクターｐＢＨＥ２５２２を組み立てた。ｐＢＨＥ２１９３（実施例１に記載されている）にみられる隣接領域をプライマーセットＰＬ３５５３／ＰＬ３４７０（ｇｙｒＡ）およびＰＬ３４６９／ＰＬ３５５２（ｌｍｏ０００８）で増幅した。プライマーＰＬ３４６９およびＰＬ３４７０により天然のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）配列にｆｒｔ配列が付加された。ＳＯＥ ＰＣＲを用いて、ｆｒｔ部位が介在する２つの隣接領域を有するＤＮＡフラグメントを組立て、ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントとしてｐＫＶＳ７ｏｒｉＴ内にクローン化し、ｐＢＨＥ２５２２を得た。ｐＢＨＥ２５２２を接合によりＢＨ３５５８内に導入し、対立遺伝子交換の後、ジャイレース領域がｆｒｔ部位に隣接する菌株ＢＨ３５７８を得た（図４Ｅ）。最後に、ａｃｔＡプロモーターからＦＬＰリコンビナーゼを発現するベクターを構築した。ＦＬＰリコンビナーゼコード配列をリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）での発現にコドン最適化し（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、ｄｅ ｎｏｖｏ合成してクローン化し、ベクターｐＪ２０１：６４３４９をＣｌａＩ／ＥａｇＩフラグメントとして得た。ａｃｔＡプロモーターをｐＰＬ２のエリスロマイシン耐性誘導体（Ｌａｕｅｒ，２００８）内にクローン化し、ＦＬＰコード配列をｐＪ２０１：６４３４９からａｃｔＡプロモーター下流にサブクローン化して、ベクターｐＢＨＥ２５１６を得た。ｐＢＨＥ２５１６の配列を確認し、接合により菌株ＢＨ３５７８内に導入し、ｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座に組み込んで、ＦＬＰ／ｆｒｔ系Ｌｍ ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６０２を得た。

実施例４．実験室分析法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長曲線
ＢＨＩ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で一晩培養した培養物を新鮮なＢＨＩで１：１００に希釈し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。ＢｉｏＲａｄ ＳｍａｒｔＳｐｅｃ３０００（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で吸光度（ＯＤ_６００ｎｍ）を測定した。あるいは、ＢＨＩで一晩培養した培養物を１：１００に希釈し、９６ウェル平底プレートに１５０μＬ／ウェルずつ分注し、Ｖｅｒｓａ ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を用いて増殖をモニターした。

細胞内成長
樹状細胞系ＤＣ２．４（Ｓｈｅｎ、１９９７）における成長曲線を２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５２４、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で実施した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２３．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１×非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１×１０^−２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）および５０μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にＤＣ２．４細胞を１ウェル当たり２×１０^５個播いた。感染には、Ｌｍ菌株をＢＨＩ中、攪拌せずに３０℃で一晩培養した後、ＲＰＭＩで最終濃度４×１０^６ｃｆｕ／ｍＬに希釈し、最終感染多重度（ｍｏｉ）が２０になるよう０．５ｍＬを用いて各ウェルを感染させた。細胞を４５分間感染させ、ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ ＵＴ）１ｍｌで洗浄し、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ完全培地を加えて細胞外の細菌の増殖を抑えた。いくつかの時点で、培地を吸引し、細胞単層をＤＰＢＳで洗浄し、滅菌水１ｍＬで細胞単層を低浸透圧により溶解させることによって、細胞内での細菌増殖をモニターした。２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ）を添加したＢＨＩ寒天プレートで連続１０倍希釈物を平板培養した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、計数してｃｆｕ／ウェルを算出した。

ウエスタンブロット
ＤＣ２．４細胞に半定量的細胞内ウエスタンブロットを実施した。１２ウェル組織培養プレートの各ウェルにＤＣ２．４細胞を３×１０^５個播き、一晩インキュベートした。細胞を１ウェル当たり６×１０^６個の被験Ｌｍ菌株に感染させた（ＭＯＩ２０）。細胞を１時間インキュベートし、ＤＰＢＳで洗浄し、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ完全培地を加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２でさらに７時間培養した後、各ウェルをＤＰＢＳ １ｍＬで洗浄し、１×ＬＤＳ（４×ＬＤＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）２５０μＬ、ＴＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）６５０μＬ、試料還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）１００μＬ）１５０μＬ中で細胞を溶解させた。細胞溶解物を加熱ブロックで９５℃にて１０分間加熱し、２０μＬのアリコートを１×ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中４〜１２％のビス‐トリスＰＡＧＥゲルで泳動し、検出用のニトロセルロース膜に転写した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）でインキュベートした。抗原発現のための融合体として使用するＡｃｔＡタンパク質の成熟１８アミノ酸アミノ末端を認識するＡ１８Ｋポリクローナルウサギ抗体を１：４０００希釈で用いて、異種抗原を検出した。モノクローナル抗体ＭＡＢ８００１を１：４０００希釈で用いて、発現レベルをリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）Ｐ６０タンパク質に対して正規化した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｐ６０発現レベルはｃｆｕと相関する。二次抗体α−ＭＳ８００Ｃｗおよびα−Ｒｂ６８０（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を１：１０００希釈で用いた。ウエスタンブロットをスキャンし、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムで定量化した。

動物
Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤ１、ＣＤ１^{ｎｕ／ｎｕ}およびＳＣＩＤベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。マウスは米国国立衛生研究所のガイドラインに従って取り扱った。動物プロトコルはすべてＡｄｕｒｏ ＢｉｏＴｅｃｈ社のＩＡＣＵＣによって承認されたものである。特に明記されない限り、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のワクチン接種は静脈内に５×１０^６で実施した。

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
実験中、マウス全血から単離したリンパ球にＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍａｍｍａｌ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）およびマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔペア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてＥＬＩＳｐｏアッセイを実施して免疫原性をモニターした。実験終了時、脾細胞にＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。抗マウスＩＦＮ−γでコートしたＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で１ウェル当たり２×１０^５個の細胞をしかるべきペプチドとともに３７℃で一晩インキュベートした。ネガティブ対照として、細胞をペプチドなしでインキュベートした。アルカリホスファターゼ検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてマウスＥＬＩＳｐｏｔｓを発色させ、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレートリーダーおよびソフトウェア（ＣＴＬ Ｌｔｄ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いてスキャンし定量化した。

ＷＴリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）による攻撃感染
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに各Ｌｍ菌株５×１０^６を１回ワクチン接種した。３４日後、マウスに２×ＬＤ_５０のＷＴ Ｌｍ菌株ＤＰ−Ｌ４０５６（Ｌａｕｅｒ、２００２）を攻撃感染させた。３日後、脾臓および肝臓を採取しホモジナイズした。２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＢＨＩプレートに希釈物を播き、１臓器当たりのｃｆｕを求めた。

ワクシニアによる攻撃感染
第０日および第２９日、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^６ｃｆｕの各種Ｌｍ菌株をワクチン接種した。２回目のワクチン接種の４９日後、マウスの腹腔内にＷＴワクシニアを１×１０^６ｐｆｕで攻撃感染させた。５日後、卵巣を採取し、プラークアッセイを実施して防御のレベルを判定した（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、２００５）。

腫瘍試験
第０日、ヒトメソテリンを発現するよう操作したＣＴ２６腫瘍細胞系２×１０^５個をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内攻撃感染させた。４日後、５×１０^６ｃｆｕのＬｍ ＲＩＩＤをしかるべき対照とともにマウスにワクチン接種し、１４日後、同じワクチン接種量で追加免疫した。毎日マウスの体重を測定しモニターした。死亡時、肺を採取し、転移を計数した。

実施例５．結果
ワクチンが効果的であるためには、免疫原性、効力および安全性の間でのバランスが必要である。実用面での理由から、確立された発酵方法を用いてワクチンを大規模に製造できることがさらに望ましい。Ｌｍは、それが細胞質に接触しそこで増殖するという特性により免疫学的に強力なワクチンプラットフォームとなり、さらに、のちに処理されてＭＨＣクラスＩ分子上に提示されるコードされた抗原を発現および分泌し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激するよう操作することができる（ＢｒｏｃｋｓｔｅｄｔおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ，２００８）。野生型Ｌｍ菌株またはＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢなどの弱毒化生Ｌｍ菌株はブロス培養で成長および増殖するほか、細胞内でも成長および増殖し、そこでさらに宿主細胞質ゾルに抗原性標的タンパク質を送達して免疫応答を誘導することができる。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンはブロス培養で容易に成長し宿主細胞にワクチン抗原を送達するよう開発されているが、感染細胞の細胞質ゾル内で「自死する」プログラムを開始して細菌増殖を抑え、ワクチンプラットフォームの安全性が増大するようさらに操作されている（図１）。

Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンプラットフォームの成長特性を評価するため、親菌株ＢＨ３２１０（ｌｏｘ６６部位およびｌｏｘ７１部位をともに含むが、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現カセットを欠く；全菌株の遺伝子型および菌株の特性を表６に列挙する）に対して欠失１と称するジャイレース領域が欠失したＬｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３２２６およびＢＨ３６１８（図３Ａ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ（ブロス培養での発酵）および宿主細胞内での成長特性について比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長は８時間にわたるＢＨＩブロス培養での経時的吸光度によって測定した（実施例１に記載されている通り）。全菌株ともｉｎ ｖｉｔｒｏ成長曲線が極めて類似しており（図３Ａ）、親菌株およびＬｍ−ＲＩＩＤ菌株ともに従来の発酵方法によって増殖させ得ることが示された。次いで、親Ｌｍ菌株ＢＨ３２１０とＬｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３２２６およびＢＨ３６１８のＤＣ２．４マウス樹状細胞系での細胞内成長速度を比較した。ＢＨ３２１０は典型的な野生型Ｌｍ菌株と同じように成長し、７時間の間に約２ｌｏｇ増殖した（Ｐｏｒｔｎｏｙら，１９８８）。これに対して、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３２２６およびＢＨ３６１８はともに、同じ時間の間にコロニー形成単位を生じる能力が２〜４ｌｏｇ低下した（図３Ｃ）。以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株が発酵培養で従来の方法により増殖させることが可能であり、宿主哺乳動物細胞への感染後、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が誘導され、その結果、のちに必須なジャイレース遺伝子、ｇｙｒＢおよびｇｙｒＡを含む領域の切除ならびに生存能の低下が起こることを示している。

この方法の追加の非限定的な実例として、必須遺伝子の第二のセットを標的化したＬｍ−ＲＩＩＤ菌株のブロス培養での成長および細胞内での成長の速度を明らかにした。染色体複製起点（ｏｒｉＣ）ならびに必須な複製開始遺伝子、ｄｎａＡおよびｄｎａＮが欠失するよう操作したＬｍ−ＲＩＩＤ欠失２菌株（図４Ａ）。Ｌｍ−ＲＩＩＤ ＢＨ３９０８菌株は、ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１部位をｏｒｉＣ、ｄｎａＡおよびｄｎａＮに隣接して含み、ブロス培養において親ＢＨ１９５９菌株と同じ速度で成長した（図４Ｂ）。これに対して、ＤＣ２．４マウス樹状細胞に感染した後、Ｌｍ−ＲＩＩＤ ＢＨ３９０８菌株は７時間の間に急速に生存能が低下したが（ｃｆｕで２ｌｏｇ超）、親Ｌｍ ＢＨ１９５９菌株はｃｆｕで２ｌｏｇ超増殖し、これはＬｍ−ＲＩＩＤ菌株と比較して４〜５ｌｏｇの差であった。以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株が発酵培養で従来の方法により増殖させることが可能であり、宿主哺乳動物細胞への感染後、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が誘導され、その結果、のちに必須なｏｒｉＣ、ｄｎａＡおよびｄｎａＮ遺伝子を含む領域の切除ならびに生存能の低下が起こる第二の非限定的な例を提供するものである。

この方法のさらなる非限定的な実例として、必須遺伝子の第三のセットを標的化したＬｍ−ＲＩＩＤ菌株のブロス培養での成長および細胞内での成長の速度を明らかにした。本明細書に記載される欠失１および欠失２の両方にわたる欠失３の構成を含むほか、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ゲノムに同定されている５つ追加のオープンリーディングフレーム（ｌｍｏ２８５２からｒｐｍＨ）を含むＬｍ−ＲＩＩＤ菌株を構築した（図５Ａ）。ブロス培養におけるＬｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３４１０の成長特性と、ｌｍｏ２８５１とｌｍｏ２８５２との間に単一のｌｏｘ７１部位を含み、さらに同遺伝子間領域内に挿入されたＰａｃｔＡ−Ｃｒｅカセットを含む親菌株ＢＨ３４０８とを比較した。Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株と親菌株との間で成長特性を区別することは不可能であり、これもまた、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株が従来のブロス培養発酵により増殖させることが可能であることを示すものであった（図５Ｂ）。さらに、細胞内成長曲線が菌株、欠失１および欠失２のデータと極めて近似していた。これに対して、ＤＣ２．４マウス樹状細胞に感染した後、Ｌｍ−ＲＩＩＤ ＢＨ３４１０菌株は７時間の間に急速に生存能が低下したが（ｃｆｕで約３ｌｏｇ）、親Ｌｍ ＢＨ１９５９菌株はｃｆｕで２ｌｏｇ超増殖し、これはＬｍ−ＲＩＩＤ菌株と比較して５ｌｏｇの差であった（図５Ｃ）。

当業者は、感染宿主細胞の細胞質ゾル内で増殖するのに必要なＬｍ遺伝子を選択的に欠失させるのに別のリコンビナーゼ系を使用し得ることを理解するであろう。ブロス培養中およびＤＣ２．４細胞に感染後のＬｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６０２の成長特性を弱毒化生親菌株Ｌｍ１１（ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ）のものと比較した。Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６０２は、別のリコンビナーゼ系ＦＬＰ／ｆｒｔを利用することを除いて、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３２２６およびＢＨ３６１８の欠失１で標的とした遺伝子とほぼ同じ必須遺伝子ｙａａＡ、ｒｅｃＦ、ｇｙｒＢ、ｇｙｒＡを欠失の標的にしたものである（図６Ａ）。Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株ＢＨ３６０２とＬｍ１１親菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長速度は区別することが不可能であった。これに対して、ＤＣ２．４マウス樹状細胞に感染した後、Ｌｍ−ＲＩＩＤ ＢＨ３６０２菌株は７時間の間に急速に生存能が低下したが（ｃｆｕで約２ｌｏｇ）、Ｌｍ１１親菌株はｃｆｕで２ｌｏｇ超増殖し、これはＬｍ−ＲＩＩＤ菌株と比較して４ｌｏｇの差であった（図５Ｃ）。

下の表に本明細書に記載される通りに調製細菌株を列挙する：

実施例６．抗原発現プラットフォームとしての使用
ワクチン効力に必要な条件には、免疫学的に重要な関係性での標的抗原の送達がある。Ｌｍベースのワクチンでは、抗原が発現して宿主抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の細胞質ゾルまで送達され、そこでコード抗原が発現し、細菌から細胞質ゾル内に分泌され、次いで抗原が処理されてＭＨＣクラスＩ分子上に提示されることにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞が刺激されなければならない。当業者には、抗原発現の強度がワクチン誘導性免疫応答の強度に影響を及ぼし得ることが理解されよう。マウスＤＣ２．４樹状細胞に感染後のＬｍ−ＲＩＩＤワクチンによる細胞内でのコード異種抗原発現のレベルを測定した。非限定的な例として、異なる異種抗原をコードする４つの無関係なＬｍ−ＲＩＩＤ菌株の抗原発現レベルを測定した。抗原発現カセット構築物はすべて、既に記載されている通り、異種抗原とインフレームでクローン化したリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＡｃｔＡ）タンパク質（ＡｃｔＡＮ１００）のアミノ末端の１００アミノ酸からなる融合タンパク質をコードするものであった（Ｌａｕｅｒら，２００８）。ＡｃｔＡの成熟アミノ末端に対するポリクローナル抗体を用いて、感染細胞溶解物のウエスタンブロット分析により細胞内での抗原発現を検出した（実施例１に記載されている）。全抗原の発現は、ブロス培養中での発現が最小限に抑えられるａｃｔＡプロモーターと機能的に連結され、宿主細胞の細胞質ゾル内では約２００倍誘導されるものであった（Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら，２００２）。このほか、ａｃｔＡプロモーターをＣｒｅまたはＦＬＰリコンビナーゼ発現に使用して、ワクチン抗原の時間的発現と、被ワクチン接種者の感染宿主細胞の細胞質ゾル内での細菌の細胞内死とを連動させた。抗原発現カセットはすべて、既に記載されている通り、部位特異的組込みベクターｐＰＬ２の誘導体内にクローン化し、Ｌｍ１１（弱毒化生菌株）およびＢＨ３６１８（Ｌｍ−ＲＩＩＤ）菌株の両方のｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座に組み込んだ（Ｌａｕｅｒら，２００８）。

全抗原の遺伝子をリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）での発現にコドン最適化し、ｄｅ ｎｏｖｏ合成した（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）。次いで、ＰＣＲおよびクローン化によって癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１とＭＡＧＥ Ａ３（図７Ｂ）および感染症抗原ＨＢＶポリメラーゼとＨＢｘＡｇ（図７Ｃ）または熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）（図７Ｄ）の融合体を組み立てた。実施例１に記載されているリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）Ｐ６０タンパク質に対して発現を正規化した。Ｌｍ−ＲＩＩＤからの相対的発現を、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株で測定された発現を、対にした弱毒化対照菌株の発現で除した比として算出した。測定された発現比は、ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＭＡＧＥ Ａ３が１倍、ＨＢＶポリメラーゼ−ＨＢｘＡｇ融合体が１．１倍、Ｐｆ−ＣＳＰ抗原構築物が１．８倍であった。以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株が、細菌の細胞内死とともに、コードされるワクチン抗原を堅固なレベルで発現し、これを処理のために宿主細胞に送達し、親組換え弱毒化生Ｌｍワクチン菌株で観察されたものと同等のレベルで有意に免疫応答を誘導することを示している。

実施例７．ｉｎ ｖｉｖｏでのＬｍ−ＲＩＩＤワクチン菌株の排除
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）の静脈内（ＩＶ）投与後にマウスで感染する主要な臓器は肝臓と脾臓である（Ｐｏｒｔｎｏｙら，２００２）。弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンプラットフォームの中間致死率によって求められる急性毒性は、マウスリステリア症モデルでは野生型Ｌｍ（ＷＴ Ｌｍ）に比して３ｌｏｇ超減弱され、このことは、採取した臓器から調製した細胞溶解物におけるコロニー形成単位の定量化によって測定される感染マウスの肝臓および脾臓における迅速な排除に反映される（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００４）。

本明細書に含まれる実施例に示される通り、Ｌｍ−ＲＩＩＤは弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（すなわち、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ病原性遺伝子の欠失または変異）ワクチン菌株から誘導することができる。しかし、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢとは対照的に、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンは、それ自体がワクチン接種した哺乳動物の感染細胞内で自発的に自死を開始するよう予めプログラムされている（すなわち、操作されている）。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンをベースとするワクチン菌株がＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンに比して安全性プロファイルが増大していることを示すため、免疫能のあるＣ５７ＢＬ／６マウスと、機能的な自然免疫および適応免疫を欠く免疫不全のＳＣＩＤベージュマウスとの両方で排除の速度を比較した。５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなるグループに５×１０^６ｃｆｕのＬｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）またはＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）ワクチン菌株をＩＶ注射によって投与し、注射の０．２時間、４時間および２４時間後に採取した臓器を処理して清澄化した溶解物の段階希釈物を栄養寒天上で平板培養することによって肝臓および脾臓内の細菌量を求めた。肝臓または脾臓で測定されたＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）ワクチン菌株の量は、４時間および２４時間の時点でほぼ同じレベルであった；すなわち、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）ワクチン菌株細菌量はこの時間の間に低下しなかった（図８Ａ）。これとは著しく対照的に、Ｌｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）の量は、注射後４時間の時点で注射後０．２時間の時点に比して急速に減少し、感染の２４時間後に評価した最終時点の培養ではＬｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）のコロニーを全く検出することができなかった（図８Ａ）。

以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）がＩＶ投与後に弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）よりも有意に迅速にマウスの肝臓および脾臓から排除されることを示す明確な証拠を提供するものである。宿主免疫応答が弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＬｍ−ＲＩＩＤワクチン菌株の排除に依存するかどうかを評価するため、別の実験では、４匹の雌ＳＣＩＤ／ベージュ免疫不全マウスからなるグループに５×１０^６ｃｆｕのＬｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）またはＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）ワクチン菌株をＩＶ注射によって投与し、注射の２０分、１日、2日、および４日後に採取した臓器を処理して清澄化した溶解物の段階希釈物を栄養寒天上で平板培養することによって脾臓内の細菌量を求めた。弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）を投与したＳＣＩＤ／ベージュ免疫マウスの脾臓で測定された細菌量は、注射後１日に注射後２０分で測定されたレベルに比して増大しており、このことは投与細菌の増殖を示している。ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ３０９９）注射の１日後に観察された細菌のピークレベルは脾臓当たり少なくとも５×１０^６であり、その後の評価した次の２つの時点にわたって減少し、最後に評価した注射後４日の時点での測定では脾臓当たり約５×１０^４のレベルであった（図８Ｂ）。これとは著しく対照的に、Ｌｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）ワクチン菌株を投与したＳＣＩＤ／ベージュ免疫マウスの脾臓には各時点の間のｃｆｕ増加によって求められる細菌の増殖は全く測定されず；細菌量は、注射の２０分後に評価した最初の時点から急速に減少し、注射後４日の時点までに脾臓にＬｍ−ＲＩＩＤ（ＢＨ３２２６）のコロニーを検出することができなくなった（図８Ｂ）。まとめると、図８Ａおよび図８Ｂに示す結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチン菌株がワクチン接種した宿主からのそれ自体の排除を自発的に開始し、排除には機能的な免疫応答が実質的に必要ないことを示している。当業者は、この自発的な排除という特性がＬｍ−ＲＩＩＤベースの菌株を予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方に広く適用するのに望ましい特性であることを理解するであろう。

実施例８．Ｌｍ−ＲＩＩＤ菌株の免疫原性
組換えＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、マウスおよびヒトにおいてコード異種抗原に対する強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘導することが示されている（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００４；Ｌｅら，２０１２）。マウスにおけるＬｍ−ＲＩＩＤの免疫原性を弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよび不活化されているが代謝活性のあるＬｍ（ＫＢＭＡ；ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ）のものと比較した。Ｌｍ−ＲＩＩＤ、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＫＢＭＡワクチンの免疫原性の比較を可能にするため、弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＫＢＭＡワクチンによってコードされているとマウスに様々なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが既に示されている５つの規定されたＨ−２^ｂ拘束性主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩエピトープ（Ｌａｕｅｒら，２００８）をコードする同じＡｇ発現カセットを各ワクチン菌株に含ませた。一連の正確なクラスＩ拘束性エピトープの使用により、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性評価に最適化された方法が得られ、Ｌｍ−ＲＩＩＤ、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＫＢＭＡワクチンプラットフォームの比較が簡便になる。

Ａｇ発現カセット構築物は、間隔をあけて直列に配置された４つのワクシニアウイルス（Ａ４２Ｒ、Ｃ４Ｌ、Ｋ３ＬおよびＢ８Ｒ）クラスＩエピトープおよびニワトリＯＶＡ（ＳＬ８）エピトープをコードするものであり、これを合成後、ＰｒｆＡによって調節されるａｃｔＡプロモーターの制御下にＡｃｔＡの１００個のＮ末端アミノ酸との融合タンパク質としてクローン化した（Ｌａｕｅｒら，２００８）。この構築物はＱｕａｄｖａｃとして知られ、ｐＰＬ２組込みベクターの誘導体内にクローン化した後、既に記載されている通りにＬｍ−ＲＩＩＤ、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＫＢＭＡワクチン菌株のｔＲＮＡ^Ａｒｇ部位内に組み込んだ（Ｌａｕｅｒら，２００２；Ｌａｕｅｒら，２００８）。

相対的免疫原性を評価するため、５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）マウスからなるグループを３６日の間隔で２回、それぞれＱｕａｄｖａｃをコードする５×１０^６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の用量レベルのＬｍ−ＲＩＩＤ、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢおよびＫＢＭＡワクチン菌株で免疫感作させた。ＫＢＭＡワクチンの用量レベルは、既に記載されている通りに光化学的不活化の前に測定した（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００５）。２回目の免疫感作の５日後、ワクチン接種したマウスから脾臓を採取し、既に記載されている以下のアミノ酸配列：Ａ４２Ｒ_{８８〜９６}、ＹＡＰＶＳＰＩＶＩ；Ｃ４Ｌ_{１２５〜１３２}、ＬＮＦＲＦＥＮＶ；Ｋ３Ｌ_６〜１５、ＹＳＬＰＮＡＧＤＶＩ；Ｂ８Ｒ_{２０〜２７}、ＴＳＹＫＦＥＳＶ；およびＳＬ８_{２５７〜２６４}、ＳＩＩＮＦＥＫＬを有する各ＭＨＣクラスＩエピトープに対応する１μＭのペプチドで一晩刺激した後、５つのコードされるエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強度をＥＬＩＳｐｏｔ分析により測定した（Ｌａｕｅｒら，２００８；Ｍｏｕｔａｆｔｓｉら，２００６）。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンは５つのＭＨＣクラスＩエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、その強度は弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチン菌株で免疫感作させたマウスと同程度であり、かつＫＢＭＡワクチンで免疫感作させたマウスで測定されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強度よりも有意に高かった（図９）。

以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが被ワクチン接種個体の感染細胞内で自死するプログラムを開始するよう操作されており、排除するのに機能的な免疫応答を必要としないが、驚くべきことに弱毒化生Ｌｍワクチンに匹敵する堅固な特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する能力を保持していることを示している。これらの結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが弱毒化生Ｌｍワクチンとほぼ同じ免疫効力を有するが、免疫応答に依存しない自発的な排除という特性により安全性プロファイルが大幅に向上しているという特性があるため、ヒトに所望のＡｇに特異的なＴ細胞応答を誘導する予防または治療ワクチンとして一般的な有用性があることを当業者は解するであろう。

実施例９．Ｌｍ−ＲＩＩＤベースのワクチン菌株のワクチン接種によってもたらされる防御免疫
本明細書に提供される実施例は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが予めプログラムされた宿主細胞内での自死を自ら開始し、ワクチン接種した宿主からの排除に機能的な免疫応答を必要としないが、弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチン菌株のワクチン接種に匹敵するコード抗原に特異的な細胞性免疫を誘導する能力を保持していることを示している。しかし、当業者は、効果的な免疫感作の重要な尺度の１つに、ワクチン候補がのちの毒性病原体による攻撃からの防御をもたらし得るかどうかがあることを理解するであろう。

当該分野では、マウスを致死量未満の野生型Ｌｍ（ＷＴ Ｌｍ）またはしかるべき弱毒化生菌株で単回感作すると、ＷＴ Ｌｍによる致死的攻撃に対して、攻撃の３日後の肝臓または脾臓内の細菌量によって測定される防御が生涯もたらされることがよく理解されている（Ｂａｈｊａｔら，２００６）。防御の関連要因はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫であり、液性免疫は防御に何ら役割を果たしていない（Ｂｅｒｃｈｅら，１９８７）。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチン接種が防御免疫をもたらす相対的能力を評価するため、５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなるグループにハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）をネガティブ対照として、または５×１０^６ｃｆｕのＬｍ−ＲＩＩＤもしくは弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンを、または１×１０^８ｃｆｕ（光学的不活化の前に測定）のＫＢＭＡワクチンを接種した。ワクチン誘導性記憶Ｔ細胞応答が２０ＬＤ_５０用量（２×１０^５ｃｆｕ）のＷＴ Ｌｍによる致死的な細菌攻撃に対する防御をもたらす能力を評価するため、ワクチン接種の４１日後、ワクチン接種マウスおよび対照マウスを攻撃感染させた。

Ｌｍ−ＲＩＩＤのワクチン接種により、ＨＢＳＳネガティブ対照群に比してＷＴ Ｌｍ攻撃感染に対する４ｌｏｇの防御がもたらされた（図１０Ａ）。Ｌｍ−ＲＩＩＤによってもたらされた防御のレベルはＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢのワクチン接種の約２０分の１であり、ＫＢＭＡワクチンの接種に比して３ｌｏｇ超上回っていた（図１０Ａ）。Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチン誘導性Ｔ細胞応答が病原体攻撃感染に対する防御をもたらす機能的な能力を評価する２つ目の尺度として、本発明者らはワクシニアウイルス攻撃感染モデルを用いた。このモデルでは、免疫感作に用いる被験ワクチンと同種の抗原をコードするワクシニアウイルスによる攻撃感染の５日後にプラークアッセイでマウス卵巣内の攻撃感染ウイルスを定量化することによって防御を測定する（Ｂｅｌｙａｋｏｖら，１９９８；Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００５）。防御免疫を評価するため、マウスに２９日の間隔で２回、５×１０^６ｃｆｕのＬｍ−ＲＩＩＤもしくは弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンまたは１×１０^８ｃｆｕ（光学的不活化の前に測定）のＫＢＭＡワクチンを接種した。全被験ワクチンとも、実施例９に記載されているＱｕａｄｖａｃワクシニアウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＳＬ８ ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをコードしていた。追加免疫ワクチン接種の４９日後、マウスにニワトリオボアルブミンをコードするワクシニアウイルスを１×１０^６プラーク形成単位（ｐｆｕ）の腹腔内攻撃感染により攻撃感染させ、４日後、処理し清澄化した臓器ホモジネートの段階希釈物のＢＳＣ細胞にプラークアッセイを実施することにより卵巣内のｐｆｕを測定した。

驚くべきことに、Ｌｍ−ＲＩＩＤまたは弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンによる免疫感作によってもたらされた防御のレベルは区別することが不可能であり、ＨＢＳＳネガティブ対照群の１０００倍高く、ＫＢＭＡワクチンの接種によってもたらされた防御のレベルの１００倍超高かった（図１０Ｂ）。当業者には、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチンに比して望ましい安全性プロファイルを有するが、病原体攻撃感染に対する防御の程度による測定でこれに匹敵する免疫効力をもたらすことが容易に理解されるであろう。

実施例１０．Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンは治療的な抗腫瘍効果を誘導した
Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが、ベクターにコードされる抗原に特異的で、同種抗原をコードする病原体による攻撃感染に対する防御をもたらす機能のあるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を刺激し、その防御は弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢワクチン菌株に匹敵することが示されたことから、当業者は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンにはこのほか、癌免疫療法での用途があることを理解するであろう。効果的な免疫療法の障壁には、しかるべき強度および機能の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を制限し得る標的化された腫瘍関連抗原（１つまたは複数）に対する耐性、生じたＴ細胞の悪性細胞部位への輸送不良および誘導されたＴ細胞応答の不十分な持続性があることがよく理解されている（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎら，２０１２；Ｔｏｐａｌｉａｎら，２０１１）。効力を測定する方法の１つは、選択されたプラットフォームが、腫瘍担持動物に投与したときに腫瘍進行を逆行させ、対照に比して生存期間を増加させる能力を評価することである。

ＣＴ−２６マウス結腸腫瘍細胞系を用いてＬｍ−ＲＩＩＤワクチンの治療的接種の有益性を試験した（Ｓｌａｎｓｋｙら，２０００）。ＣＴ−２６腫瘍細胞を静脈内（ＩＶ）接種により投与して肺腫瘍小結節を確立し、これを移植後の所望の時点で処置マウスから採取した肺で定量化するか、あるいはマウスをモニターし、過剰な腫瘍成長が十分な呼吸を妨げることによりマウスが瀕死状態に陥ったときに屠殺することができる。ＣＴ２６腫瘍モデルに治療効果をもたらすには、ｇｐ７０内因性腫瘍抗原由来のＨ−２Ｌ^ｄ拘束性免疫優性エピトープＡＨ１に対する自己寛容を崩壊させる必要がある（Ｓｌａｎｓｋｙら，２０００）。既に記載されている通りに、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）の固有のＡｖａ ＩＩ制限酵素部位内にインフレームで組み込まれたＭＨＣクラスＩエピトープの第５位のバリンからアラニンへのヘテロクリティックな変化を含む変化したペプチドリガンドＡＨ１−Ａ５エピトープ（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ）を発現するＬｍ−ＲＩＩＤワクチンを構築した（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００４）。Ｌｍ−ＲＩＩＤの治療効果を評価するため、３０匹の各雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＨＢＳＳ １００μｌに懸濁させたＣＴ２６細胞２×１０^５個を尾静脈注射により投与した後、１０匹のマウスからなる３つのグループに無作為化により割り付けた。４日後、３つのグループのマウスにＨＢＳＳ １００μｌ、ＯＶＡを発現する５×１０^６ｃｆｕの弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（ＢＨ８９２）またはＯＶＡ−ＡＨ１−Ａ５を発現する５×１０^６ｃｆｕのＬｍ ＲＩＩＤ（ＢＨ３７０９）を投与した。１４日後、全３つのグループのマウスにこれと同じ注射を実施した後、全マウスの生存を毎日モニターした。

ＨＢＳＳまたはＯＶＡを発現する弱毒化生ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢで処置したネガティブ対照群の腫瘍担持マウスでは、ＣＴ−２６腫瘍細胞移植後の生存期間中央値が約２４日であった（図１１）。これとは著しく対照的に、ＯＶＡ−ＡＨ１−Ａ５を発現するＬｍ ＲＩＩＤを投与したマウスのグループでは生存期間中央値が５５日であり、これはいずれの対照群よりも有意に長い日数であった（ｐ＜０．００１、ログランクマンテル・コックス検定）（図１１）。さらに、腫瘍細胞移植の１６０日後に実験を終了時点で、ＯＶＡ−ＡＨ１−Ａ５を発現するＬｍ−ＲＩＩＤワクチンで処置したマウスの３０％が長期生存個体であった（図１１）。以上の結果は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが被ワクチン接種個体の宿主細胞内で自死するよう予めプログラムされているにもかかわらず、腫瘍担持動物に機能的な腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起し、ネガティブ対照に比して有意な有益性および全生存期間をもたらすことを示す明確な証拠を提供するものである。当業者は、Ｌｍ−ＲＩＩＤワクチンが安全性と治療効果の特性を併せもつことから、臨床癌免疫療法に直接適用できるプラットフォームとなることを理解するであろう。

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１１．Ｌａｕｅｒ，Ｐ．，Ｃｈｏｗ，Ｍ．Ｙ．，Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｃａｌｅｎｄａｒ，Ｒ．（２００２）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８４，４１７７−４１８６．
１２．Ｌａｕｅｒ，Ｐ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｂ．，Ｌｅｍｍｅｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｌｕｃｋｅｔｔ，Ｗ．Ｓ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｍ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｓｋｏｂｌｅ，Ｊ．，Ｂａｈｊａｔ，Ｋ．Ｓ．，Ｆｒｅｉｔａｇ，Ｎ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰｒｆＡ ｒｅｇｕｌｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｂｕｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６，３７４２−３７５３．
１３．Ｌｅ，Ｄ．Ｔ．，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｎｉｒ−Ｐａｚ，Ｒ．，Ｈａｍｐｌ，Ｊ．，Ｍａｔｈｕｒ，Ｓ．，Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，Ｊ．，Ｓｔｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．，Ｌｕｔｚ，Ｅ．，Ｍｏｙｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ （ＡＮＺ−１００） ａｎｄ ａ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ （ＣＲＳ−２０７） ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ：ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８，８５８−８６８．
１４．Ｍｏｕｔａｆｔｓｉ，Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．，Ｐａｓｑｕｅｔｔｏ，Ｖ．，Ｔｓｃｈａｒｋｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．，Ｂｕｉ，Ｈ．Ｈ．，Ｇｒｅｙ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｅｔｔｅ，Ａ．（２００６）．Ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｂｒｅａｄｔｈ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｔ（ＣＤ８＋）−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４，８１７−８１９．
１５．Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．，Ａｕｅｒｂｕｃｈ，Ｖ．，ａｎｄ Ｇｌｏｍｓｋｉ，Ｉ．Ｊ．（２００２）．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５８，４０９−４１４．
１６．Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．，Ｊａｃｋｓ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６７，１４５９−１４７１．
１７．Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｇ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．（１９９７）．Ｃｌｏｎｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｂｏｔｈ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８，２７２３−２７３０．
１８．Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｒｑｕｉｓ，Ｈ．，Ｂｏｕｗｅｒ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｆｒｅｉｔａｇ，Ｎ．Ｅ．（２００２）．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｃｔＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０，１０８７−１０９６．
１９．Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．，Ｐｒｉｅｆｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｐｕｌｈｌｅｒ，Ａ．（１９８３）．Ａ ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １，７８４−７９１．
２０．Ｓｌａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｒａｔｔｉｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｏｙｄ，Ｌ．Ｆ．，Ｆａｈｍｙ，Ｔ．，Ｊａｆｆｅｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｓｃｈｎｅｃｋ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（２０００）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｈａｔ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｔｈｅ ＭＨＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ＴＣＲ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，５２９−５３８．
２１．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｐ．（１９９２）．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｐｏＩＩＭ ｇｅｎｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７４，７０５−７１１．
２２．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（２０１１）．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２９，４８２８−４８３６．

当業者は、本発明が、目的を達成し、述べられる結果および利点ならびにそれに本来備わっている結果および利点を得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に提供される例は、代表的な好ましい実施形態であり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。

当業者には、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、本明細書に開示される本発明にさまざまな置換および修正を施し得ることが容易に明らかになるであろう。

本明細書で言及される特許および刊行物はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示すものである。特許および刊行物はすべて、個々の刊行物がそれぞれ具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で具体的に説明されている本発明は、本明細書に具体的に開示される任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限が存在しなくても適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「〜を含む」、「〜から実質的になる」および「〜からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられてきた用語および表現は、限定するための用語ではなく説明するための用語として使用されるものであり、このような用語および表現の使用にあたっては、示され記載されている特徴またはその一部の均等物を除外する意図は全く存在せず、むしろ特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが理解される。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示される概念の修正および変形を用いることができ、このような修正および変形は添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内にあると見なされることを理解するべきである。

その他の実施形態については、以下の特許請求の範囲内で明らかにされている。

Claims (40)

1. 細菌ゲノム内の細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子が欠失するよう細菌を設計する方法であって、
   前記欠失が、前記細菌が哺乳動物宿主内に導入されたときに選択的に生じ、
   （ｉ）前記細菌に対して異種性のリコンビナーゼをコードし前記哺乳動物宿内で前記リコンビナーゼの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている核酸を前記細菌内に導入することと、
   （ｉｉ）前記リコンビナーゼが前記哺乳動物宿主内で発現したとき、第一の結合部位および第一の結合部位が隣接する前記細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）を欠失させる部位特異的組換え事象を触媒し、前記部位特異的組換え事象後に前記細菌が増殖できなくなるよう、前記細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の上流に前記リコンビナーゼの第一の結合部位を、また前記細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の下流に前記リコンビナーゼの第二の結合部位を前記細菌ゲノム内に導入することと
   を含む、方法。
2. 前記細菌が細胞内病原菌であり、前記細菌が哺乳動物宿主細胞内にあるとき、前記制御配列がリコンビナーゼの発現を選択的に誘導し、最も好ましくは通性細胞内細菌である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細菌が、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属からなる群より選択される属の細菌である、請求項１に記載の方法。
4. 前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である、請求項１に記載の方法。
5. 前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）であり、前記リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）がΔＡｃｔＡ／ΔＩｎｌＢである、請求項４に記載の方法。
6. 前記制御配列が、ＰｒｆＡ依存性であるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のプロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
7. ＰｒｆＡ依存性プロモーターが、ｉｎｌＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ｉｎｌＣプロモーター、ｈｐｔプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ｐｌｃＡプロモーター、ｍｐｌプロモーターおよびａｃｔＡプロモーターからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＰｒｆＡ依存性プロモーターがａｃｔＡプロモーターである、請求項６に記載の方法。
9. 前記リコンビナーゼが、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１インテグラーゼ、φＢＴ１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、ＰＳＡインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、Ｐ２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、Ｌ５インテグラーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、ｇｉｎリコンビナーゼ、ＲＶインテグラーゼ、ＳＰＢｃインテグラーゼ、ＴＧ１インテグラーゼ、φＣ１インテグラーゼ、ＭＲ１１インテグラーゼ、φ３７０インテグラーゼ、φＫ３８インテグラーゼ、ＷβインテグラーゼおよびＢＬ３インテグラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記第一の結合部位がａｔｔＢ部位であり、前記第二の結合部位がａｔｔＰ部位である、請求項１に記載の方法。
11. 前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子が、ＤＮＡ複製に関与する少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＤＮＡ複製に関与する少なくとも１つの遺伝子が、ｏｒｉ、ｄｎａＡ、ｄｎａＮ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＺ、ｌｉｇＡ、ｄｎａＧ、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｈｏｌＢ、ｄｎａＸ、ＳＭＣおよびｆｔｓＹからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子がオペロンの一部であり、前記第一の結合部位が前記オペロンの全部または一部の上流にあり、前記第二の結合部位が前記オペロンの全部または一部の下流にある、請求項１に記載の方法。
14. 前記第一の結合部位が前記オペロンの上流にあり、前記第二の結合部位が前記オペロンの下流にある、請求項１３に記載の方法。
15. 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼであり、前記制御配列がａｃｔＡプロモーターを含み、前記第一の結合部位および前記第二の結合部位がｌｏｘＰ部位を含み、前記第一の結合部位および前記第二の結合部位が隣接する前記細菌の病原性に必須な遺伝子（１つまたは複数）がＤＮＡ複製に関与する、請求項１に記載の方法。
16. 前記第一の結合部位および前記第二の結合部位が、長さ約２０ｋｂ以下の核酸配列に隣接する、請求項１に記載の方法。
17. 前記核酸配列が長さ約１０ｋｂ以下である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記核酸配列が長さ約６ｋｂ以下である、請求項１６に記載の方法。
19. 前記細菌が、前記細菌ゲノム内に異種ポリペプチドをコードする外来性核酸配列を含み、前記外来性核酸配列が、前記細菌が哺乳動物宿主内にあるときに前記異種ポリペプチドの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
20. 細菌ゲノム内の細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子を欠失させる方法であって、
    前記細菌によってリコンビナーゼが発現される条件下で、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細菌を哺乳動物宿主に導入することを含み、
    前記発現されたリコンビナーゼが、部位特異的組換え事象によって前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子を欠失させる、
    方法。
21. 前記細菌が、前記細菌ゲノム内に異種ポリペプチドをコードする外来性核酸配列を含み、前記外来性核酸配列が、前記細菌が前記哺乳動物宿主内にあるときに前記異種ポリペプチドの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されており、前記細菌が、前記哺乳動物宿主内で前記異種ポリペプチドを発現する、請求項２０に記載の方法。
22. 細菌であって、
    （ｉ）前記細菌に対して異種性のリコンビナーゼをコードし哺乳動物宿主内で前記リコンビナーゼの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている核酸と、
    （ｉｉ）前記細菌ゲノム内の前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子の上流にある、前記リコンビナーゼの第一の結合部位および前記細菌ゲノム内の前記細菌の増殖に必須な遺伝子（１つまたは複数）の下流にある、前記リコンビナーゼの第二の結合部位と
    を含む、細菌。
23. 細胞内病原菌であり、最も好ましくは通性細胞内細菌であり、前記細菌が哺乳動物宿主細胞内にあるとき、前記制御配列が前記リコンビナーゼの発現を選択的に誘導する、請求項２２に記載の細菌。
24. 前記細菌が、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属からなる群より選択される属の細菌である、請求項２２に記載の細菌。
25. 前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である、請求項２２に記載の細菌。
26. 前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）であり、前記リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）がΔＡｃｔＡ／ΔＩｎｌＢである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記制御配列が、ＰｒｆＡ依存性であるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のプロモーターを含む、請求項２２に記載の細菌。
28. ＰｒｆＡ依存性プロモーターが、ｉｎｌＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ｉｎｌＣプロモーター、ｈｐｔプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ｐｌｃＡプロモーター、ｍｐｌプロモーターおよびａｃｔＡプロモーターからなる群より選択される、請求項２７に記載の細菌。
29. 前記ＰｒｆＡ依存性プロモーターがａｃｔＡプロモーターである、請求項２７に記載の細菌。
30. 前記リコンビナーゼが、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１インテグラーゼ、φＢＴ１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、ＰＳＡインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、Ｐ２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、Ｌ５インテグラーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、ｇｉｎリコンビナーゼ、ＲＶインテグラーゼ、ＳＰＢｃインテグラーゼ、ＴＧ１インテグラーゼ、φＣ１インテグラーゼ、ＭＲ１１インテグラーゼ、φ３７０インテグラーゼ、φＫ３８インテグラーゼ、ＷβインテグラーゼおよびＢＬ３インテグラーゼからなる群より選択される、請求項２２に記載の細菌。
31. 前記第一の結合部位がａｔｔＢ部位であり、前記第二の結合部位がａｔｔＰ部位である、請求項２２に記載の細菌。
32. 前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子が、ＤＮＡ複製に関与する少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項２２に記載の細菌。
33. 前記ＤＮＡ複製に関与する少なくとも１つの遺伝子が、ｏｒｉ、ｄｎａＡ、ｄｎａＮ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＺ、ｌｉｇＡ、ｄｎａＧ、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｈｏｌＢ、ｄｎａＸ、ＳＭＣおよびｆｔｓＹからなる群より選択される、請求項３０に記載の細菌。
34. 前記細菌の増殖に必須な１つまたは複数の遺伝子がオペロンの一部であり、前記第一の結合部位が前記オペロンの全部または一部の上流にあり、前記第二の結合部位が前記オペロンの全部または一部の下流にある、請求項２２に記載の細菌。
35. 前記第一の結合部位が前記オペロンの上流にあり、前記第二の結合部位が前記オペロンの下流にある、請求項３４に記載の細菌。
36. 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼであり、前記制御配列がａｃｔＡプロモーターを含み、前記第一の結合部位および前記第二の結合部位がｌｏｘＰ部位を含み、前記第一の結合部位および前記第二の結合部位が隣接する前記細菌の病原性に必須な遺伝子（１つまたは複数）がＤＮＡ複製に関与する、請求項２２に記載の細菌。
37. 前記第一の結合部位および前記第二の結合部位が、長さ約２０ｋｂ以下の核酸配列に隣接する、請求項２２に記載の細菌。
38. 前記核酸配列が長さ約１０ｋｂ以下である、請求項３７に記載の細菌。
39. 前記核酸配列が長さ約６ｋｂ以下である、請求項３８に記載の細菌。
40. 前記細菌が、前記細菌ゲノム内に異種ポリペプチドをコードする外来性核酸配列を含み、前記外来性核酸配列が、前記細菌が哺乳動物宿主内にあるときに前記異種ポリペプチドの発現を選択的に誘導する制御配列と作動可能に連結されている、請求項２２に記載の細菌。

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