JP5347135B2 - 遺伝子工学操作されたlisteriaおよびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は,(a)米国特許出願11/395,197(2006年3月30日出願)の一部継続出願であり,これは米国特許仮出願60/784,576(2006年3月21日出願)および米国特許仮出願60/778,471(2006年3月1日出願)に基づく優先権を主張しており,(b)米国特許出願11/396,216(2006年3月30日出願)の一部継続出願であり,これは米国特許仮出願60/784,576(2006年3月21日出願)および米国特許仮出願60/778,471(2006年3月1日出願)に基づく優先権を主張しており,そして(c)米国特許仮出願60/784,576(2006年3月21日出願)および米国特許仮出願60/778,471(2006年3月1日出願)に基づく優先権を主張しており,これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は,部分的には,米国政府のNational Cancer Institute NHI1K23CA104160−01による支援によりなされたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は,免疫系を刺激し,癌および感染を治療するのに有用な,遺伝子工学操作されたListeria細菌を提供する。また,Listeriaおよび他の細菌種を改変するのに有用なポリヌクレオチド,融合蛋白質パートナー,およびインテグレーションベクターも提供する。
癌および感染は,免疫系を調節する試薬を投与することにより治療することができる。これらの試薬には,ワクチン,サイトカイン,抗体,およびCpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびイミダゾキノリンなどの小分子が含まれる(例えば,Becker(2005)Virus Genes 30:251−266;Schetter and Vollmer(2004)Curr.Opin.DrugDevel.7:204−210;Majewski,et al.(2005)Int.J.Dermatol.44:14−19),Hofmann,et al.(2005)J.Clin.Virol.32:86−91;Huber,et al.(2005)Infection 33:25−29;Carter(2001)Nature Revs.Cancer 1:118−129;Dechant and Valaerius(2001)Crit.Revs.Oncol.39:69−77;O’Connor,et al.(2004)Neurology 62:2038−2043を参照)。ワクチン類,例えば,伝統的なワクチン(不活性化全生物,抽出物または抗原),樹状細胞(DC)ワクチン,および核酸系のワクチンはすべて,癌および感染を治療するのに有用である(例えば,Robinson and Amara(2005)Nat.Med.Suppl.11:S25−S32;Plotkin(2005)Nat.Med.Suppl.11:S5−S11;Pashine,et al.(2005)Nat.Med.Suppl.11:S63−S68;Larche and Wraith(2005)Nat.Med.Suppl.11:S69−S76を参照)。免疫系を調節するのに有用な別の試薬はListeria monocytogenes(L.monocytogenes)であり,この試薬は癌および腫瘍を首尾よく治療することが証明されている(例えば,Brockstedt,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:13832−13837;Brockstedt,et al(2005)Nat.Med.11:853−860);Starks,et al.(2004)J.Immunol.173:420−427;Shen,et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:3987−3991を参照)。
本発明は,部分的には,腫瘍をもつ哺乳動物に,腫瘍抗原に連結されたActA系融合蛋白質をコードする核酸を含むよう遺伝子工学操作された減弱化Listeriaを投与すると,生存が増強されるという認識に基づくものである。
は少なくとも7つの核酸配列がリステリアのゲノム中にインテグレートされている。
図1は6055bpのプラスミドであるpINTを示す。一旦pINTがリステリアのゲノム中にインテグレートされると,Listeriaはエリスロマイシン耐性(ErmC)により単離することができ,次に,Creリコンビナーゼで処理して,抗生物質耐性遺伝子(CATおよびErmC)をコードするプラスミドの領域を除去する。
本明細書ならびに添付の特許請求の範囲において用いる場合,単語の単数形,例えば,“a”,“an”および“the”は,文脈が明らかにそうではないことを示していない限り,その対応する複数形も含む。本明細書に引用されるすべての参考文献は,各個別の刊行物,GenBank受託番号によりアクセスされる配列,特許出願,特許,配列表,配列表中のヌクレオチドまたはオリゴペプチドまたはポリペプチド配列,ならびに前記刊行物および特許書類中の図面が特定的にかつ個別に引用により本明細書に取り込まれると示されていることと同じ程度で,引用により本明細書に取り込まれる。“本発明”との用語は,本発明のある種の態様または本発明のいくつかの態様を表す。特に記載しない限り,“本発明”との用語は必ずしも本発明のすべての態様を表さない。
遺伝子中の変異,または遺伝子を含む細菌中の変異を示すために用いられる略号は次のとおりである。一例として,“L.monocytogenesΔActA”との略号は,ActA遺伝子の一部または全部が欠失していることを意味する。デルタ記号(Δ)は欠失を意味する。上付のマイナス符号を含む略号(Listeria ActA-)は,ActA遺伝子が変異されていることを意味し,これは例えば,欠失,点突然変異,またはフレームシフト変異によるが,これらのタイプの変異に限定されない。指数が短縮されている場合,例えば,“3e7”は3x107を意味する。
(1)疎水性:ノルロイシン,Ile,Val,Leu,Phe,Cys,Met;
(2)中性親水性:Cys,Ser,Thr;
(3)酸性:Asp,Glu;
(4)塩基性:Asn,Gln,His,Lys,Arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly,Pro;
(6)芳香族:Trp,Tyr,Phe;および
(7)小アミノ酸:Gly,Ala,Ser
本発明は,癌,腫瘍,前癌性疾患,および感染の治療および診断に有用な試薬および方法を提供する。核酸,Listeria細菌,およびListeria細菌を含むワクチンが提供される。本発明は,インビトロで,例えば,保存の間に,またはインビボで改変されているリステリア細胞,例えば,細菌の細胞分裂の産物および細菌の損傷の産物を包含する。
本発明は,分泌配列をコードする核酸または融合蛋白質パートナーとして用いるのに適したリステリアの蛋白質またはそのフラグメントをコードする核酸を包含する。以下のいずれかをコードする核酸が包含される:
i. 分泌配列,
ii. シグナル配列,
iii. その天然の分泌配列を含むリステリアのポリペプチド,
iv. 天然の分泌配列が別のリステリアの蛋白質の分泌配列で置き換えられているリステリアの蛋白質,
v. その天然の分泌配列が非リステリア細菌蛋白質の分泌配列で置き換えられているリステリアの蛋白質,
vi. 分泌配列を含まない,非分泌性リステリアの蛋白質またはそのフラグメント;および
vii. 非分泌性リステリアの蛋白質またはそのフラグメントとインフレームで融合された非リステリア細菌分泌配列。
i. リステリオリシン(LLO)。リステリオリシンOの分泌シグナル配列(hly遺伝子)が同定されている(例えば,Lety,et al.(2003)Microbiol.149:1249−1255を参照)。
ii. ActA。リステリアActAについて,リボソーム結合部位,プロモーター,およびシグナル配列が同定されている。リボソーム結合部位はActA遺伝子の開始コドンの6bp上流にある(Vazquez−Boland,et al.(1992)Infect.Immunity 60:219−230)。
iii. インターナリン。すべてのインターナリン(Inl)蛋白質は,細菌シグナルペプチドの特徴を有する30−35アミノ酸のN末端配列を含む(例えば,Dramsi,et al.(1997)Infect.Immunity 65:1615−1625を参照)。
iv. p60(iap遺伝子)。開始コドンとヌクレオチド524との間の27アミノ酸の領域は,シグナル配列として機能し,Listeria細胞膜を超えるp60の輸送を指示する(Kohler,et al.(1990)Infect.Immunity 58:1943−1950)。Kohlerら(上掲)はまた,L.monocytogenesのp60mRNAのプリンリッチリボソーム(16SRNA)結合部位を開示する。
ある態様においては,本発明は,Listeriaにとって異種である核酸,またはListeriaにとって外来である核酸のコドン最適化を提供する。各アミノ酸についてL.monocytogenesが用いる最適コドンを示す(表2)。核酸中の少なくとも1つのコドンが,L.monocytogenesによってそのアミノ酸について元の配列におけるコドンより高い頻度で用いられるコドンで置き換えられている場合,核酸はコドン最適化されている。
L.monocytogenesは,宿主への侵襲,成長,または定着に寄与する種々の遺伝子および遺伝子産物を発現する(表3)。これらのあるものは“病原性因子”として分類される。これらの病原性因子には,ActA,リステリオリシン(LLO),蛋白質60(p60),インターナリンA(inlA),インターナリンB(inlB),ホスファチジルコリンホスホリパーゼC(PC−PLC),ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC;plcA遺伝子)が含まれる。多数の他のインターナリンが特性決定されており,例えば,InlC2,InlD,InlE,およびInlFが挙げられる(Dramsi,et al.(1997)Infect.Immunity 65:1615−1625)。proPL−PLCをプロセシングして活性なPL−PLCとするメタロプロテアーゼであるMplも病原性因子である(Chakraborty,et al.(2000)Int.J.Med.Microbiol.290:167−174;Williams,et al.(2000)J.Bact.182:837−841)。ある態様においては,病原性遺伝子は,病原性因子をコードする遺伝子である。本発明は本明細書に開示される減弱化された遺伝子に限定されず,表3の配列の1またはそれ以上において変更された,変異した,または減弱化されたListeriaを提供する。
本発明は,本発明の減弱化Listeriaを作成または遺伝子工学操作するための多数のリステリアの種および株を提供する(表4)。表4の参考文献のそれぞれは,その全体が参照として本明細書に取り込まれる。本発明のListeriaは,この表に開示される種および株に限定されない。
ある態様においては,本発明は,少なくとも1つの抗原,1またはそれ以上の保存的変化を有する抗原,特定の抗原の1またはそれ以上のエピトープ,または抗原と免疫学的に交叉反応性であるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を提供する(表5)。本発明の核酸および抗原は表に開示されるものに限定されない。
本発明は,別の態様においては,Listeria変異体を提供し,ここで,変異体は,DNA傷害の修復,例えば,UV光誘発性DNA傷害,放射線誘発性傷害,鎖間架橋,鎖内架橋,共有結合性付加物,嵩高い付加物により修飾されたDNA,脱アミド化塩基,脱プリン化塩基,脱ピリミジン化塩基,酸化的傷害,ソラーレン付加物,シスプラチン付加物,上述の組み合わせ等の修復に欠陥がある(Mu and Sancar(1997)Prog.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.56:63−81;Sancar(1994)Science 266:1954−1956;Lin and Sancar(1992)Mol.Microbiol.6:2219−2224;Selby and Sancar(1990)236:203−211;Grossman(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.726:252−265)。例えば,uvrA,uvrB,uvrAB,uvrC,これらの任意の組み合わせ等に変異を有するListeriaが提供される。
プラスミド等のポリヌクレオチドと少なくとも1つの変異を有するそのポリヌクレオチドの変種とのハイブリダイゼーションは,以下のストリンジェントな条件下で行うことができる。プラスミドは,2−3kb,3−4kb,4−5kb,5−6kb,6−7kb等でありうる。変異は,1−10ヌクレオチド(nt),10−20nt,20−30nt,30−40nt,40−50nt,50−60nt,60−70kb,70−80kb,80−90kb,90−100kb等からなることができる。
(a). 部位特異的組換えおよび相同組換えによるインテグレーション
ある態様においては,本発明の核酸,ポリヌクレオチド,リステリアのゲノム等の細菌ゲノム,およびListeriaおよびBacillus anthracis等の細菌は,部位特異的組換えにより,および/または相同組換えにより改変される。部位特異的リコンビナーゼは記載されている(例えば,Landy(1993)Curr.Op.Biotechnol.3:699−707;Smith and Thorpe(2002)Mol.Microbiol.44:299−307;Groth and Calos(2004)J.Mol.Biol.335:667−678;Nunes−Duby,et al.(1998)Nucleic Acids Res.26:391−406;Sauer(1993)Methods Enzymol.225:890−900を参照)。転位は,部位特異的組換えとは区別される(例えば,Hallett and Sherratt(1997)FEMS Microbiol.Rev.21:157−178;Grindley(1997)Curr.Biol.7:R608−R612を参照)。
本発明は,核酸,ベクター,またはゲノム中への部位特異的インテグレーションを媒介するためのシステムを提供する。“システム”とは,インテグラーゼをコードする第1の核酸,ならびに発現したインテグラーゼポリペプチド,ファージ付着部位(attPP’)をコードする第2の核酸,および対応する細菌付着部位(attBB’)をコードする第3の核酸を意味する。一般に,任意の所定のattPP’部位は,特定のattBB’部位に対応するか,またはこれに適合性である。本発明のインテグレーションシステムが利用可能であることにより,1またはそれ以上の核酸を任意の所与のポリヌクレオチドまたはゲノム中にインテグレーションすることができる。
MTQGVVTGVDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAA (GenBank Acc. No. AJ414670) (配列番号11)
TGACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCA (配列番号12) (例えば, Thorpe and Smith (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5505-5510を参照)。
gtcgacgatgtaggtcacggtctcgaagccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccacctcacccatctggtccatcatgatgaacgggtcgaggtggcggtagttgatcccggcgaacgcgcggcgcaccgggaagccctcgccctcgaaaccgctgggcgcggtggtcacggtgagcacgggacgtgcgacggcgtcggcgggtgcggatacgcggggcagcgtcagcgggttctcgacggtcacggcgggcatgtcgac (配列番号13) (GenBank Acc. No. X60952)
AAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGTCAGTCGCGCGAGCGCGAGAATTC (配列番号14) (例えば, GenBank Acc. Nos. X57036 and AJ006589; Thorpe and Smith (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5505-5510を参照)
相同組換えの標的部位は,オープンリーディングフレーム,病原性遺伝子,機能未知の遺伝子,偽遺伝子,機能が示されていないDNAの領域,成長を媒介する遺伝子,拡散を媒介する遺伝子,制御領域,リステリアの成長または生存を媒介するゲノムの領域,その中断が減弱化につながる遺伝子,遺伝子間領域等であることができる。
CCAAATTAGCGATCTTACACCATTGGCTAATTTAACAAGAATCACCCAACTAGG
GTTGAATGATCAAGCATGGACAAATGCACCAGTAAACTACAAAGCAAATGTATC
CATTCCAAACACGGTGAAAAATGTGACTGGCGCTTTGATTGCACCTGCTACTAT
TAGCGATGGCGGTAGTTACGCAGAACCGGATATAACATGGAACTTACCTAGTTA
TACAAATGAAGTAAGCTATACCTTTAGCCAACCTGTCACTATTGGAAAAGGAAC
GACAACATTTAGTGGAACCGTGACGCAGCCACTTAAGGCAATTTTTAATGCTAA
GTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATT
GACTGAACCAGCTAAGCCCGTAAAAGAAGGTCACACATTTGTTGGTTGGTTTGA
TGCCCAAACAGGCGGAACTAAGTGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAA
TGACATCAATTTATATGCACAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACCTTTGA
GAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCAAGGCTTGTTACAAGA
ACCTACACCACCAACAAAAGAAGGTTATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGCAAA
AACTGGTGGTGACAAGTGGGATTTCGCAACTAGCAAAATGCCTGCTAAAAACAT
CACCTTATATGCCCAATATAGCGCCAATAGCTATACAGCAACGTTTGATGTTGA
TGGAAAATCAACGACTCAAGCAGTAGACTATCAAGGACTTCTAAAAGAACCAAA
GGCACCAACGAAAGCCGGATATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGAAAAAACAGA
TGGGAAAAAATGGGATTTTGCGACGGATAAAATGCCAGCAAATGACATTACGCT
GTACGCTCAATTTACGAAAAATCCTGTGGCACCACCAACAACTGGAGGGAACAC
ACCGCCTACAACAAATAACGGCGGGAATACTACACCACCTTCCGCAAATATACC
TGGAAGCGACACATCTAACACATCAACTGGGAATTCAGCCAGCACAACAAGTAC
AATGAACGCTTATGACCCTTATAATTCAAAAGAAGCTTCACTCCCTACAACTGG
CGATAGCGATAATGCGCTCTACCTTTTGTTAGGGTTATTAGCAGTAGGAACTGC
AATGGCTCTTACTAAAAAAGCACGTGCTAGTAAATAGAAGTAGTGTAAAGAGCT
AGATGTGGTTTTCGGACTATATCTAGCTTTTTTATTTTTTAATAACTAGAATCA
AGGAGAGGATAGTGGTACCTTGGTGAGCTCCCTACGAAAAGCTACAACTTTAAA
TTCATGAAAAAAGAACTGATTCGCTGAAAACGGATCAGTTCTTTTTTCTTTAGA
CTTATTTTTACAAAAACTTTTCGATAATTTCCATATTCTGGGGTCTGTCTTTGC
TTTCAAGTACAGAAATATCACGAACAATGCTATCTAATTTAATTTTTTCCATTT
CAAATTCTATTTTTTGTTGGAGCAGATCGTATTTACTCGTAAGAACTTGTTGGA
TATTGGCTCCGACAACGCAGTCTGGGTTGGTTTTTGGATCAACGTGAATTAAAT
TCGTATTGCCTTCTATACTCTTATAAACATCAAGCAGTGAAATTTCTTCTGGTG
GTCTAGCAAGAATCGGATTTGCTTTGCCAGTCTGCGTAGTAATTAAATCAGCTT
TTTTTAAATTACTCATGATTTTTCTAATGTTAGCAGGATTTGTTTTTACGCTAC
CAGCAATAATTTCACTCGATAACAAATTCGTATTTTTAAAAATTTCTATATAAG
CCAAAATGTGGATAGCATCGCTAAATTGGATAGAGTATTTCATTTTTTTCAATC
CTTTCAAATTTTCTCCTTGACTTATCTTATCATAATGTTTATTATAAAGGTGTA
AATTATAAATGTACAGCTTTAGTGTTAAAAAATTTAAAGGAGTGGTTTAAATGA
CTTATTTAGTAACTGGTGCAACAGGTGGACTTGGAGGCTACGCATTAAATTATT
TGAAAGAGCTGGTTCCCATGTCCGATATTTATGCTTTAGTTCGTAGCGAAGAAA
AAGGTACAGACTTGAAAGCAGCAGGATTTAATATCCGTATTGGTGATTATAGTG
ATGTAGAATCAATGAAGCAAGCATTCGCAGGCATCGACCGCGTATTATTTGTTT
CAGGAGCACCTGGTAATCGCCAAGTAGAACACGAAAATGTGGTAAATGCGGCAA
AAGAAGCAGGCGTTTCTTACATCGCTTACACAAGTTTCGCGGGCGCAGATAAAT
CCACAAGCGCTTTAGCAGAAGATCATTTCTTTACCGAAAAAGTAATCGAAAAAT
CCGGAATCGCGCACACTTTCTTGCGTAACAACTGGTACTTCGAAAATGAAATGC
CGATGATCGGTGGCGCATTGAGTGCTGGAAAATTTGTATACGCTGCTGAAAATG
GAAAAGTTGGCTGGGCATTAAAACGCGAATACGCAGAAGTAGCCGCAAAAGCTG
TTGCGGACGCTGACTTCCCAGAAATCCTTGAATTATCTGGCCCACTCATGCAAT
TCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC
CACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAG
TGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA
ACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCATGCAATTCA (配列番号15)
GGTACCTTGGTGAGCTC(配列番号121)
(上流相同アーム)
CCAAATTAGCGATCTTACACCATTGGCTAATTTAACAAGAATCACCCAACTAGG
GTTGAATGATCAAGCATGGACAAATGCACCAGTAAACTACAAAGCAAATGTATC
CATTCCAAACACGGTGAAAAATGTGACTGGCGCTTTGATTGCACCTGCTACTAT
TAGCGATGGCGGTAGTTACGCAGAACCGGATATAACATGGAACTTACCTAGTTA
TACAAATGAAGTAAGCTATACCTTTAGCCAACCTGTCACTATTGGAAAAGGAAC
GACAACATTTAGTGGAACCGTGACGCAGCCACTTAAGGCAATTTTTAATGCTAA
GTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATT
GACTGAACCAGCTAAGCCCGTAAAAGAAGGTCACACATTTGTTGGTTGGTTTGA
TGCCCAAACAGGCGGAACTAAGTGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAA
TGACATCAATTTATATGCACAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACCTTTGA
GAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCAAGGCTTGTTACAAGA
ACCTACACCACCAACAAAAGAAGGTTATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGCAAA
AACTGGTGGTGACAAGTGGGATTTCGCAACTAGCAAAATGCCTGCTAAAAACAT
CACCTTATATGCCCAATATAGCGCCAATAGCTATACAGCAACGTTTGATGTTGA
TGGAAAATCAACGACTCAAGCAGTAGACTATCAAGGACTTCTAAAAGAACCAAA
GGCACCAACGAAAGCCGGATATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGAAAAAACAGA
TGGGAAAAAATGGGATTTTGCGACGGATAAAATGCCAGCAAATGACATTACGCT
GTACGCTCAATTTACGAAAAATCCTGTGGCACCACCAACAACTGGAGGGAACAC
ACCGCCTACAACAAATAACGGCGGGAATACTACACCACCTTCCGCAAATATACC
TGGAAGCGACACATCTAACACATCAACTGGGAATTCAGCCAGCACAACAAGTAC
AATGAACGCTTATGACCCTTATAATTCAAAAGAAGCTTCACTCCCTACAACTGG
CGATAGCGATAATGCGCTCTACCTTTTGTTAGGGTTATTAGCAGTAGGAACTGC
AATGGCTCTTACTAAAAAAGCACGTGCTAGTAAATAGAAGTAGTGTAAAGAGCT
AGATGTGGTTTTCGGACTATATCTAGCTTTTTTATTTTTTAATAACTAGAATCA
AGGAGAGGATAGT (配列番号16)
(下流相同アーム)
CCTACGAAAAGCTACAACTTTAAATTCATGAAAAAAGAACTGATTCGCTGAAAA
CGGATCAGTTCTTTTTTCTTTAGACTTATTTTTACAAAAACTTTTCGATAATTT
CCATATTCTGGGGTCTGTCTTTGCTTTCAAGTACAGAAATATCACGAACAATGC
TATCTAATTTAATTTTTTCCATTTCAAATTCTATTTTTTGTTGGAGCAGATCGT
ATTTACTCGTAAGAACTTGTTGGATATTGGCTCCGACAACGCAGTCTGGGTTGG
TTTTTGGATCAACGTGAATTAAATTCGTATTGCCTTCTATACTCTTATAAACAT
CAAGCAGTGAAATTTCTTCTGGTGGTCTAGCAAGAATCGGATTTGCTTTGCCAG
TCTGCGTAGTAATTAAATCAGCTTTTTTTAAATTACTCATGATTTTTCTAATGT
TAGCAGGATTTGTTTTTACGCTACCAGCAATAATTTCACTCGATAACAAATTCG
TATTTTTAAAAATTTCTATATAAGCCAAAATGTGGATAGCATCGCTAAATTGGA
TAGAGTATTTCATTTTTTTCAATCCTTTCAAATTTTCTCCTTGACTTATCTTAT
CATAATGTTTATTATAAAGGTGTAAATTATAAATGTACAGCTTTAGTGTTAAAA
AATTTAAAGGAGTGGTTTAAATGACTTATTTAGTAACTGGTGCAACAGGTGGAC
TTGGAGGCTACGCATTAAATTATTTGAAAGAGCTGGTTCCCATGTCCGATATTT
ATGCTTTAGTTCGTAGCGAAGAAAAAGGTACAGACTTGAAAGCAGCAGGATTTA
ATATCCGTATTGGTGATTATAGTGATGTAGAATCAATGAAGCAAGCATTCGCAG
GCATCGACCGCGTATTATTTGTTTCAGGAGCACCTGGTAATCGCCAAGTAGAAC
ACGAAAATGTGGTAAATGCGGCAAAAGAAGCAGGCGTTTCTTACATCGCTTACA
CAAGTTTCGCGGGCGCAGATAAATCCACAAGCGCTTTAGCAGAAGATCATTTCT
TTACCGAAAAAGTAATCGAAAAATCCGGAATCGCGCACACTTTCTTGCGTAACA
ACTGGTACTTCGAAAATGAAATGCCGATGATCGGTGGCGCATTGAGTGCTGGAA
AATTTGTATACGCTGCTGAAAATGGAAAAGTTGGCTGGGCATTAAAACGCGAAT
ACGCAGAAGTAGCCGCAAAAGCTGTTGCGGACGCTGACTTCCCAGAAATCCTTG
AATTATCTGGCCCACTCATGCAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGT
GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGT
GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCT
CACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCAT
GCAATTCA (配列番号17)
(上流相同アーム)
AGAATTTAGTTCCGCAGTGGATGCTCATTTTTACGCAAGTGAAGTGTACGAATACTATAAAAATGTCCACCAACTAGAGAGTCTAGATGGTAAAGGTGGAGAAATTGATTCGTTTGTCCATTATGGCTTGAATTGCAATAATGCCTTTTGGGATGGCCAAGAAATTCTTTATGGAGATGGGGACAAAAAGAATTTCAAACCATTTTCATGCGCCAAAACTATTGTTGGTCATGAACTAACGCATGCAGTTATCCAGTATTCGGCGGGATTGGAATACGAAGGGCAATCAGGTGCGCTAAACGAGTCGTTCGCCGATGTTTTTGGTTATTTTATTGCGCCAAATCATTGGTTGATTGGTGAGGATGTCTGTGTGCGTGGGTCGCGAGATGGGCGAATAAGAAGCATTAAAGATCCTGACAAATATAATCAAGCGGCTCATATGAAGGATTACGAATCGCTTCCAATCACAGAGGAAGGCGACTGGGGCGGAGTTCATTATAATAGTGGTATCCCGAATAAAGCAGCCTATAATACTATCNCTAAACTTGGAAAAGAAAAAACAGAACAGCTTTATTTTCGCGCCTTAAAGTACTATTTAACGAAAAAATCCCAGTTTACCGATGCGAAAAAAGCGCTTCAACAAGCAGCGAAAGATTTATATGGTGAAGATGCTTCTAAAAAAGTTGCTGAAGCTTGGGAAGCAGTTGGGGTTAACTGATTAACAAATGTTAGAGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAATAATTCATGAATATTTTTTCTTATATTAGCTAATTAAGAAGATAATTAACTGCTAATCCAATTTTTAACGGAATAAATTAGTGAAAATGAAGGCCGAATTTTCCTTGTTCTAAAAAGGTTGTATTAGCGTATCACGAGGAGGGAGTATAA (配列番号18)
(相同下流アーム)
AAACACAGAACGAAAGAAAAAGTGAGGTGAATGATATGAAATTCAAAAATGT
GGTTCTAGGTATGTGCTTGACCGCAAGTGTTCTAGTCTTTCCGGTAACGATA
AAAGCAAATGCCTGTTGTGATGAATACTTACAAACACCCGCAGCTCCGCATG
ATATTGACAGCAAATTACCACATAAACTTAGTTGGTCCGCGGATAACCCGAC
AAATACTGACGTAAATACGCACTATTGGCTTTTTAAACAAGCGGAAAAAATA
CTAGCTAAAGATGTAAATCATATGCGAGCTAATTTAATGAATGAACTTAAAA
AATTCGATAAACAAATAGCTCAAGGAATATATGATGCGGATCATAAAAATCC
ATATTATGATACTAGTACATTTTTATCTCATTTTTATAATCCTGATAGAGAT
AATACTTATTTGCCGGGTTTTGCTAATGCGAAAATAACAGGAGCAAAGTATT
TCAATCAATCGGTGACTGATTACCGAGAAGGGAAATTTGACACAGCGTTTTA
TAAATTAGGCCTAGCAATCCATTATTATACGGATATTAGTCAACCTATGCAC
GCCAATAATTTTACCGCAATATCATACCCTCCAGGCTACCACTGTGCATATG
AAAATTACGTAGATACCATTAAACACAATTATCAAGCAACGGAAGACATGGT
AGCAAAAAGATTTTGCTCAGATGACGTGAAAGACTGGCTCTATGAAAATGCG
AAAAGGGCGAAAGCGGACTACCCGAAAATAGTCAATGCGAAAACTAAAAAAT
CATATTTAGTAGGAAATTCCGAATGGAAAAAGGATACAGTGGAACCTACTGG
AGCTAGACTAAGAGATTCACAGCAAACTTTGGCAGGTTTTTTAGAATTTTGG
TCTAAAAAAACAAATGAATAACAATATTTAGGAATACATTCTTATCCACTCG
TTAGCGGGTGGATATATTTTATGGGGAGGAAGTAAGCCAAATGTATATAAAA
GGGAGGTTAATCTTTTTCTTTGTAATGTTAGTAATCGCGTTATGTTCCGAAG
GGC (配列番号19)
ある態様においては,本発明は,第1の核酸の細菌のゲノムからの迅速なまたは効率的な切り出しを媒介する試薬および方法を提供する。この方法は,リコンビナーゼ媒介性切り出しによるものであり,ここで,リコンビナーゼは,第1の核酸を挟む異種リコンビナーゼ結合部位を認識する。異種リコンビナーゼ結合部位は,例えば,1対のloxP部位または一対のfrt部位でありうる。非限定的例として,第1の核酸は抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーをコードすることができる。
i. 細菌をプラスミドでトランスフェクションし,ここで,プラスミドは,第1の核酸(一対の異種リコンビナーゼ結合部位により挟まれている)の細菌のゲノム内へのインテグレーションを媒介することができる;
ii. 第1の核酸(2つの異種リコンビナーゼ結合部位により挟まれている)を細菌のゲノム中にインテグレーションさせる。メカニズムに関して何らかの限定を示唆するものではないが,インテグレーションは,部位特異的組換えまたは相同組換えにより生ずることができる;
iii. インテグレートした第一の核酸を含む細菌を選択する。第1の核酸が抗生物質耐性遺伝子をコードする場合,選択は抗生物質を含む培地で細菌を培養することを含むことができる。選択工程によりジェノタイプ的に純粋な細菌が得られる;
iv. ジェノタイプ的に純粋な細菌を,リコンビナーゼにより触媒される細菌のゲノムからの第1の核酸の切り出しを容易にする条件で処理する。1対の異種リコンビナーゼ結合部位がloxP部位である場合,リコンビナーゼはCreリコンビナーゼでありうる。Creリコンビナーゼは,この酵素をコードするプラスミドをトランスフェクションすることにより細菌に導入することができる。1つの態様においては,Creリコンビナーゼの発現は過渡的である。CreリコンビナーゼおよびFLPリコンビナーゼは同じ酵素反応メカニズムを使用し,それらに特異的な1対の標的配列の間で正確な部位特異的切り出しを媒介する;
v. Creリコンビナーゼにより触媒される第1の核酸の切り出しの後,希釈またはヌクレアーゼの作用によりプラスミドが失われるまで細菌を培養することができる;
vi. 得られた細菌は,ゲノム中の第1の核酸の存在により識別することができる。また,得られた細菌は,2つの異種リコンビナーゼ結合部位の一方がゲノムから失われることにより識別することができる。すなわち,2つの部位の一方のみが残存している。
A. 改変型ActA融合蛋白質パートナー,改変型ActAを含む融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド,およびポリヌクレオチドを含むListeria
i. 一般
ある観点においては,本発明は,改変型ActAをコードし,異種抗原をコードする第2の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである第1の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた,ポリヌクレオチドを含むListeriaを提供し,ここで,ポリヌクレオチドの発現により,改変型ActAおよび異種抗原を含む融合蛋白質が生成する。改変型ActAは,ActAの天然の分泌配列,別のリステリアの蛋白質に由来する分泌配列,非リステリア細菌蛋白質に由来する分泌配列を含むことができ,または改変型ActAは分泌配列を含まなくてもよい。
31−59,31−60,31−61,31−62,31−63,31−64,31−65,31−66,31−67,31−68,31−69,31−70,31−71,31−72,31−73,31−74,31−75,31−76,31−77,31−78,31−79,31−80,31−81,31−82,31−83,31−84,31−85,31−86,31−87,31−88,31−89,31−90,31−91,31−92,31−93,31−94,31−95,31−96,31−97,31−98,31−99,31−100,31−101,31−102,31−103,31−104,31−105,31−106,31−107,31−108,31−109,31−110,31−111,31−112,31−113,31−114,31−115,31−116,31−117,31−118,31−119,31−120,31−121,31−122,31−123,31−124,31−125,31−126,31−127,31−128,31−129,31−130,31−131,31−132,31−133,31−134,31−135,31−136,31−137,31−138,31−139,31−140,31−141,31−142,31−143,31−144,31−145,31−146,31−147,31−148,31−149,31−150,31−151,31−152,31−153,31−154,31−155,31−156,31−157,31−158,31−159,31−160,31−161,31−162,31−163,31−164,31−165等。
本発明の少なくともいくつかの態様の改変型ActAは,哺乳動物細胞骨格との相互作用が低下するかまたは除去されるよう変化している。ActAの生理学的機能は哺乳動物細胞骨格に結合して,Listeria細菌の細胞質を通るアクチン媒介性運動を可能とすることであるが,融合蛋白質のActA成分においてはこの結合が低下しているかまたは除去されている。
ActAコーディング領域は,L.monocytogenesにとって最適ではない多数のコドンを含む。これらのうちの多数は,リステリアのゲノム中で最も一般的に用いられるコドンの25%以下の頻度で生ずる。以下にL.monocytogenes 10403S ActAのコドン分析を示す。アミノ酸101−400をコードするコドンにおいて,グルタミン酸のレアコドン(GAG)は12回現れ;リジンのレアコドン(AAG)は3回現れ;イソロイシンのレアコドン(ATA)は3回現れ;アルギニンのレアコドン(CGG)は1回現れ;グルタミンのレアコドン(CAG)1回現れ;ロイシンのレアコドン(CTG;CTC)は3回現れる。以下の説明は,レアコドンのみならず非最適コドンに関連する。さらに,アミノ酸101−400をコードするコドン(300コドン)において,非最適コドン(これはレアコドンに加えて)は152回現れる(合計300コドンのうち)。
本発明は,異種抗原との融合蛋白質パートナーとして有用なSecA2リステリア分泌蛋白質のファミリーを提供する。分泌蛋白質由来の融合蛋白質パートナーは,発現を増加させ,安定性を増加させ,分泌を増加させ,免疫提示を増強し,免疫応答を刺激し,腫瘍に対する生存を改善し,癌に対する生存を改善し,感染性因子に対する生存を増加させる等のために用いることができる。
MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASA (配列番号24) (Bubert, et al. (1992) J. Bacteriol. 174:8166-8171; Bubert, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2625-2632; J. Bacteriol. 173:4668-4674)。
N−アセチル−ムラミダーゼシグナル配列(52アミノ酸)は次のとおりである:MDRKFIKPGIILLIVAFLVVSINVGAETGGSRTAQVNLTTSQQAFIDEILPA (配列番号25) (nt 2679599 − 2681125 ,GenBank Acc. No. NC_003210; GenBank Acc. No. AY542872; nt 2765101 −2766627 ,GenBank Acc. No. NC_003212; Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437)。
ヒトメソセリンcDNAは2138bpであり,1884bpのオープンリーディングフレームを含み,69kDの蛋白質をコードする。メソセリン前駆体蛋白質は628アミノ酸およびフリン切断部位(RPRFRR,アミノ酸288−293)を含む。69kd蛋白質の切断により,40kDの膜結合蛋白質(“メソセリン”と称される)および巨核球増強因子(MPF)と称される31kDの可溶性蛋白質が生ずる。メソセリンはそのC末端に親油性配列を有し,これは除去されてホスファチジルイノシトールで置き換えられ,このことによりメソセリンは膜結合性となる。メソセリンはC末端の近傍にグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーシグナル配列を含む。メソセリンのドメイン,癌および腫瘍細胞によるメソセリンの発現,およびメソセリンの抗原性特性は記載されている(例えば,Hassan,et al.(2004)Clin.Cancer Res.10:3937−3942;Ryu,et al.(2002)Cancer Res.62:819−826;Thomas,et al.(2003)J.Exp.Med.200:297−306;Argani,et al.(2001)Clin.Cancer Res.7:3862−3868;Chowdhury,et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:669−674;Chang and Pastan(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:136−140;Muminova,et al.(2004)BMC Cancer 4:19;GenBank Acc.Nos.NM_005823およびNM_013404;米国特許5,723,318,Yamaguchi,et al.を参照)。
RTLAGETGQEAAPLDGVLTNPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERV
RELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFS
GPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADV
RALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGP
PYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWR
QPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALL
ATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPE
DIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDT
LTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARL
AFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL
PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGI
PNGYLVLDLSVQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA (配列番号26)
RTLAGETGQEAAPLDGVLTNPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERV
RELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFS
GPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADV
RALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGP
PYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWR
QPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALL
ATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPE
DIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDT
LTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARL
AFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL
PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQG (配列番号27)
本発明は,野生型または親Listeriaにおいて成長または拡散を媒介する第1の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し,ここで,第1の核酸は,少なくとも1つの抗原をコードする第2の核酸のインテグレーションにより改変されている。1つの観点においては,インテグレーションによりListeriaは減弱化される。別の観点においては,インテグレーションによってListeriaは減弱化されない。さらに別の観点においては,親Listeriaは減弱化されており,インテグレーションによりさらに減弱化される。さらに,別の非限定的例としては,親Listeriaは減弱化されており,インテグレーションによりさらに減弱化されない。
(a). 治療用組成物
本明細書において提供される減弱化Listeria,ワクチン,小分子,生物学的試薬,およびアジュバントは,単独でまたは薬学的に許容しうる賦形剤との組み合わせで,免疫疾患,癌,腫瘍,または感染に対する適当な免疫応答を誘導するのに十分な量で,宿主に投与することができる。免疫応答は,限定されないが,特異的免疫応答,非特異的免疫応答,特異的および非特異的応答,先天性応答,一次免疫応答,適応免疫,二次免疫応答,記憶免疫応答,免疫細胞活性化,免疫細胞増殖,免疫細胞の分化およびサイトカイン発現を含むことができる。
ある態様においては,本発明は,改変型Listeria細菌,例えば,少なくとも1つの異種抗原を発現するよう遺伝子工学操作されたL.monocytogenesを提供する。本発明は,免疫応答の増強,免疫応答の刺激,免疫提示の増強,発現されたmRNAまたはポリペプチドの安定性の増加,発現されたポリペプチドの蛋白質分解性プロセシングの増加,変異した自己抗原に対する免疫応答の増加,癌または感染に対する生存の増加,および/または癌または感染の治療に有用である。本発明はまた,例えば,工業,農業,または医療用に,異種抗原の発現を増強するのに有用である。
免疫応答を決定,評価,モニタリング,および/または診断する試薬および方法は入手可能である。本発明は,ある状況では,本発明の組成物を投与する哺乳動物被験者を診断する以下の方法を提供する。別の観点においては,投与された本発明の組成物の1またはそれ以上に対する免疫応答を評価するための以下の方法が提供される。例えば,インビボ,インビトロ,エクスビボ,インウテロで;生きているかまたは死亡した哺乳動物に;細胞に;組換え,キメラまたはハイブリッド細胞に;生物学的液体に,単離された核酸に適用することができる方法としては以下の方法が挙げられる。
生化学および分子生物学の標準的な方法は記載されている(例えば,Maniatis,et al.(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY;Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA;Innis,et al.(eds.)(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,N.Yを参照)。標準的な方法はAusbelら(2001)Curr.Protocols in Mol.Biol.,Vols.1−4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NYにも見いだされ,これは細菌細胞におけるクローニングおよびDNA変異導入(Vol.1),哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング(Vol.2),複合糖質および蛋白質発現(Vol.3),およびバイオインフォマティクス(Vol.4))を記載する。融合蛋白質を製造する方法は記載されている(例えば,Invitrogen(2005)Catalogue,Carlsbad,CA;Amersham Pharmacia Biotech.(2005)Catalogue,Piscataway,NJ;Liu,et al.(2001)Curr.Protein Pept.Sci.2:107−121;Graddis,et al.(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:285−297を参照)。
この実験で用いたListeria monocytogenes株は記載されている(Brockstedt,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:13832−13837を参照)。L.monocytogenesΔActAΔinlB(DP−L4029inlBとしても知られる)は,American Type Culture Collection(ATCC)(10801University Blvd.,Manassas,Virginia 20110−2209,United States of America)に2003年に10月3日に,the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedureの規定により寄託され,受託番号PTA−5562が与えられた。L.monocytogenesΔActAΔuvrAB(DP−L4029uvrABとしても知られる)は,the American Type Culture Collection(ATCC)(10801 University Blvd.,Manassas,Virginia 20110−2209,United States of America)に,2003年10月3日に,the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedureの規定により寄託され,受託番号PTA−5563を与えられた。グルコースを含まない酵母培地は,25グラム/Lの酵母エキス(Bacto(登録商標)Yeast extract)(BD Biosciences,Sparks,MD);9グラム/Lのリン酸カリウム1塩基,pH7.2を含む。
(配列番号28, pKSV7) CTCGCGGATTGTTGATGATTACGAAAATATTAAGAGCACAGACTATTACACAGAAAATCAAGAATTAAAAAAACGTAGAGAGAGTTTGAAAGAAGTAGTGAATACATGGAAAGAGGGGTATCACGAAAAAAGTAAAGAGGTTAATAAATTAAAGCGAGAGAATGATAGTTTGAATGAGCAGTTGAATGTATCAGAGAAATTTCAAGATAGTACAGTGACTTTATATCGTGCTGCGAGGGCGAATTTCCCTGGGTTTGAGAAAGGGTTTAATAGGCTTAAAGAGAAATTCTTTAATGATTCCAAATTCGAGCGTGTGGGACAGTTTATGGATGTTGTACAGGATAATGTCCAGAAGGTCGATAGAAAGCGTGAGAAACAGCGTACAGACGATTTAGAGATGTAGAGGTACTTTTATGCCGAGAAAACTTTTTGCGTGTGACAGTCCTTAAAATATACTTAGAGCGTAAGCGAAAGTAGTAGCGACAGCTATTAACTTTCGGTTGCAAAGCTCTAGGATTTTTAATGGACGCAGCGCATCACACGCAAAAAGGAAATTGGAATAAATGCGAAATTTGAGATGTTAATTAAAGACCTTTTTGAGGTCTTTTTTTCTTAGATTTTTGGGGTTATTTAGGGGAGAAAACATAGGGGGGTACTACGACCTCCCCCCTAGGTGTCCATTGTCCATTGTCCAAACAAATAAATAAATATTGGGTTTTTAATGTTAAAAGGTTGTTTTTTATGTTAAAGTGAAAAAAACAGATGTTGGGAGGTACAGTGATGGTTGTAGATAGAAAAGAAGAGAAAAAAGTTGCTGTTACTTTAAGACTTACACAGAAGAAAATGAGATATTAAATAGAATCCAAGAAAAATATAATATTAGCAAATCAGATGCACCGGTATTCTAATAAAAAATATGYRMAGGAGGAATACSGTGCATTTTAACAAAAAAAGATAGACAGCACTGGCATGCTGCCTATCTATGACTAAATTTTGTTAAATGTATTAGCACCGTTATTATATCATGAGCGAAAATGTAATAAAAGAAACTGAAAACAAGAAAAATTCAAGAGGACGTAATTGGACATTTGTTTTATATCCAGAATCAGCAAAAGCCGAGTGGTTAGAGTATTTAAAAGAGTTACACATTCAATTTGTAGTGTCTCCATTACATGATAGGGATACTGATACAGAAGATAGGATGAAAAAAGAGCATTATCATATTCTAGTGATGTATGAGGGTAATAAATCTTATGAACAGATAAAAATAATTACAGAAGAATTGAATGCGACTATTCCGCAGATTGCAGGAAGTGTGAAAGGTCTTGTGAGATATATGCTTCACATGGACGATCCTAATAAATTTAAATATCAAAAAGAAGATATGATAGTTTATGGCGGTGTAGATGTTGATGAATTATTAAAGAAAACAACAACAGATAGATATAAATTAATTAAAGAAATGATTGAGTTTATTGATGAACAAGGAATCGTAGAATTTAAGAGTTTAATGGATTATGCAATGAAGTTTAAATTTGATGATTGGTTCCCGCTTTTATGTGATAACTCGGCGTATGTTATTCAAGAATATATAAAATCAAATCGGTATAAATCTGACCGATAGATTTTGAATTTAAGAGTGTCACAAGACACTCTTTTTTCGCACCAACGAAAACTGGTTTAAGCCGACTGCGCAAAAGACATAATCGATTCACAAAAAATAGGCACACGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTANCTTACTTATTAAATAATTTATAGCTATTGAAAAGAGATAAGAATTGTTCAAGCTAATATTGTTTAAATCGTCCATTCCTGCATGTTTTANGGAAWTGTTAANTTGATTTTTTGTAATATTTTCTKGTATYCTTTGTTAMCCCATTTCATAACGAAATAATTATACTTTTGTTTATCTTTGTGTGATATTCTTGATTTTTTTCTACTTAATCTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAATATTCTCTTGGAACCATACTTAATATAGAAATATCAACTTCTGCCATTAAAAGTAATGCCAATGAGCGTTTTGTATTTAATAATCTTTTAGCAAACCCGTATTCCACGATTAAATAAATCTCATTAGCTATACTATCAAAAACAATTTTGCGTATTATATCCGTACTTATGTTATAAGGTATATTACCATATATTTTATAGGATTGGTTTTTAGGAAATTTAAACTGCAATATATCCTTGTTTAAAACTTGGAAATTATCGTGATCTTCCTTCAGGTTATGACCATCTGTGCCAGTTCGTAATGTCTGGTCAACTTTCCGACTCTGAGAAACTTCTGGAATCGCTAGAGAATTTCTGGAATGGGATTCAGGAGTGGACAGAACGACACGGATATATAGTGGATGTGTCAAAACGCATACCATTTTGAACGATGACCTCTAATAATTGTTAATCATGTTGGTTACGTATTTATTAACTTCTCCTAGTATTAGTAATTATCATGGCTGTCATGGCGCATTAACGGAATAAAGGGTGTGCTTAAATCGGGCCATTTTGCGTAATAAGAAAAAGGATTAATTATGAGCGAATTGAATTAATAATAAGGTAATAGATTTACATTAGAAAATGAAAGGGGATTTTATGCGTGAGAATGTTACAGTCTATCCCGGCAATAGTTACCCTTATTATYWSGATAAGAANGAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAATCCTTTAAAAAAACACAAAAGACCACATTTTTTAATGTGGTCTTTTATTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACGAAAATTGGATAARGTGGGATATTTTWAAWATAATWTATKTATGTTACAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAGCCTCCTAAATTCACTTTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATGGACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTATTACNGCAGGAAANTTCATTAATAANGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCNGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACRGTCGGTTTTCTAACGATMCATTAATAGGTMCGAAAAAGCMACTTTTTTKSCGCTTAAAACCAGTCATACCAATAACTTAAGGGTAACTAGCCTCGCCGGAAAGAGCGAAAATGCCTCACATTTGTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAGTTATGCAGTTTGTAGAATGCAAAAAGTGAAATCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTRSSYACKSSKMYCCTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAAMAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGRKKASTCWCMCMAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCNGGSGTCAATACGGGATAATACCGCSCCACATAGCARAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACMATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTYCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCNGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCATGCAATTTCATAATCAAAGAGAGCGAAAAAGTAGAACGAATGATGATATTGACCATGAGCGAACACGTGAAAATTATGATTTGAAAAATGATAAAAATATTGATTACAACGAACGTGTCAAAGAAATTATTGAATCACAAAAAACAGGTACAAGAAAAACGAGGAAAGATGCTGTTCTTGTAAATGAGTTGCTAGTAACATCTGACCGAGATTTTTTTGAGCAACTGGATCAGTACAAGAAAGATACTGTATTTCATAAACAGGAACTGCAAGAAGTTAAGGATGAGTTACAGAAGGCAAATAAGCAGTTACAGAGTGGAATAGAGCATATGAGGTCTACGAAACCCTTTGATTATGAAAATGAGCGTACAGGTTTGTTCTCTGGACGTGAAGAGACTGGTAGAAAGATATTAACTGCTGATGAATTTGAACGCCTGCAAGAAACAATCTCTTCGAACGGATTGTTGATGATTACGAAATATAAGAGCCCGACTATTCCCAGAAATCAGAATTAAAAACGTAGAGAGAG (配列番号28, pKSV7).
pINTベクター
AGATCTCCAAAAATAAACAGGTGGTGGTATTAATGAAGATAAAAAAATTAGCA
AACGGTAAATATTGTGTTCGCCTACGTATAAAAGTCGATGGTGAATGGAAAGA
AAAGCGTTTGACAGATACAAGTGAAACAAACTTAATGTATAAAGCATCTAAAT
TATTAAAACAAGTTCAGCATGATAGTAGTTCTCTGAAAGAATGGAACTTCAAA
GAATTTTATACGCTATTCATGAAAACATTTAAAGATGGGAAAAGTAGTCAATC
TACTATTAATTTATACGATCTTGCTTATAATCAATTCGTTGATTATTTCGATG
AAAAAATTAAATTTAATTCGATTGATGCGGTTCAATATCAACAATTTATTAAT
CATTTATCTGTAGACTATGCAATATCCACTGTAGACACCAGACACCGCAAAAT
TAGAGCGATTTTTAACAAGGCTGTTCATTTAGGTTACATGAAGAAAAACCCCA
CTATAGGGGCTCATATAAGCGGACAGGACGTAGCGAAAAATAAAGCACAATTT
ATGGAAACAGACAAAGTTCATTTACTATTAGAAGAACTTGCAAAATTTCATTC
TATATCACGAGCAGTTATCTTTCTAGCTGTCCAGACAGGCATGAGGTTCGAAG
AAATTATTGCACTAACAAAGAAGGATATTAATTTCACTAAACGTTCAATAACT
GTGAATAAAGCTTGGGATTACAAGTACACTAATACATTCATTGATACCAAAAC
AAAAAAATCACGAGTGATCTATATTGATAACTCTACCGCTCAATATTTACATT
CGTATTTAAATTGGCATACTGAATATATGAAGGAACATGCTATTAAGAATCCA
TTGATGTTATTATTCATCACTTACCACAATAAGCCAGTAGACAACGCGTCTTG
TAATAAAGCTTTGAAGAAGATATGTAGTACAATCAATTCTGAACCAGTGACAT
TACACAAGCTACGACATACGCATACAGGCTTATGTGTAGAAGCGGGTATGGAT
ATTATTTATGTAGCTGATAGGCTTGGTCATGATGACATTAATACAACATTAAA
ATACTATAGTCATCTAAGCTCTAATTTAAGACAACATAATCAGTCCAAAGTAG
ATGCTTTTTTCACACTAAAAACAGATGAAAATACCACAAATTTTACCACAAAT
GCCACAAAAACAACGGAATAACCTAGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATAC
GAAGTTATATGCATGGGTATTATACGATATAAAAAAAACTCCAAAACATTCAT
CCGCCCTTTAATATCAAGGCTTTTCAACGTTTTAGAGATTTCTTTACATTACT
ATTTAACGTCCTGAGAGGGATTAACACACACTGATATAAAGCCATTTAGGATA
TATATACCACAAATAATACCACAAACATTTTATGTAATAATAAATATTATTTA
TTATTACATTGAAATAAATATTCGTTATAAATAGTTTTTATATCAAGATGTTT
TTTCTCAAGGTTTTTATAAAATGACTTTAATTCTTTTGTTTCAAGTAGTCCAG
AGAAGATTTTTTCAACAGCGTTCTTCTTTCCCTCCACGCATGCGACGTCAATA
CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTA
TCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGA
GCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAA
TTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGATCGCCTCTCGC
CTGTCCCCTCAGTTCAGTAATTTCCTGCATTTGCCTGTTTCCAGTCGGTAGAT
ATTCCACAAAACAGCAGGGAAGCAGCGCTTTTCCGCTGCATAACCCTGCTTCG
GGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACA
GGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCA
GCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCA
CTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGC
TGGCCGGCTACCGCCGGCGTAACAGATGAGGGCAAGCGGCGGAGAATTACAAC
TTATATCGTATGGGGCTGACTTCAGGTGCTACATTTGAAGAGATAAATTGCAC
TGAAATCTAGAAATATTTTATCTGATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTT
TTGGTCTGCGCGTAATCTCTTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGC
GGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCT
TGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCGC
ATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG
TGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGG
CGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGA
ACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATA
ACAGCGGAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGG
GAGCCGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA
CCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGG
CATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGT
CGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTA
TCACATATTCTGCTGACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAG
CACTTCACTGACACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAAGCCAGTATACACTCCG
CTAGCGCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTGCCGTTACGCACCACCCCGTCAGTAG
CTGAACAGGAGGGACAGCTGATAGAAACAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAAA
CACCATCATACACTAAATCAGTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCG
CCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGT
GTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGT
TGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTAC
CGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG
GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAA
AGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCG
TTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAG
TTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGA
ATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACC
CTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGT
GAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGC
GTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGT
TTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTG
GCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATAC
GCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTT
GTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT
GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAAC
GCCTGGTTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATT
CGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCGA
CGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCA
CGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACAC
ATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAG
ACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTA
ACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACAATCGCATCCGATTG
CAGTATAAATTTAACGATCACTCATCATGTTCATATTTATCAGAGCTCGTGCT
ATAATTATACTAATTTTATAAGGAGGAAAAAATATGGGCATTTTTAGTATTTT
TGTAATCAGCACAGTTCATTATCAACCAAACAAAAAATAAGTGGTTATAATGA
ATCGTTAATAAGCAAAATTCATATAACCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACG
AGAAAAATATAAAACACAGTCAAAACTTTATTACTTCAAAACATAATATAGAT
AAAATAATGACAAATATAAGATTAAATGAACATGATAATATCTTTGAAATCGG
CTCAGGAAAAGGCCATTTTACCCTTGAATTAGTAAAGAGGTGTAATTTCGTAA
CTGCCATTGAAATAGACCATAAATTATGCAAAACTACAGAAAATAAACTTGTT
GATCACGATAATTTCCAAGTTTTAAACAAGGATATATTGCAGTTTAAATTTCC
TAAAAACCAATCCTATAAAATATATGGTAATATACCTTATAACATAAGTACGG
ATATAATACGCAAAATTGTTTTTGATAGTATAGCTAATGAGATTTATTTAATC
GTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTGGCATT
ACTTTTAATGGCAGAAGTTGATATTTCTATATTAAGTATGGTTCCAAGAGAAT
ATTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAGCTCACTTATCAGATTAAGTAGAAAA
AAATCAAGAATATCACACAAAGATAAACAAAAGTATAATTATTTCGTTATGAA
ATGGGTTAACAAAGAATACAAGAAAATATTTACAAAAAATCAATTTAACAATT
CCTTAAAACATGCAGGAATTGACGATTTAAACAATATTAGCTTTGAACAATTC
TTATCTCTTTTCAATAGCTATAAATTATTTAATAAGTAAGTTAAGGGATGCAT
AAACTGCATCCCTTAACTTGTTTTTCGTGTGCCCGATCGGTGCGGGCCTCTTC
GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG
TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAG
CTAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTCTCATTATATAACATCCTCCATACCTT
CTATTATAGAATACCATAAACTCATCTGGCAATTCATTTCGAGTCACGAAGAA
CGGAAAAACTGCCGGTTTTTATATTACAAATGTATTAAGTTTTTCTATTAACA
AAAAACAATAGGTTTCCCATAGCGAAAGTTGTTGATTAACGTTCACATCCCAC
TTACACTATAAAGGTTTACCCAGCAATACATCTCAAGCCCTAAGAATACACGT
TCGCTTTTCAACTGTTACAGAATTATTACAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTA
GCCTTTGGAGCTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAAC
TTAGTATTAATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGA
TTTTCTGAAAAAA
(配列番号29)
ある態様においては,本発明は,少なくとも1つの異種抗原をコードする第2の核酸と動作可能なようにかつインフレームで連結されている,ActA系融合蛋白質パートナーをコードする第1の核酸を含む試薬および方法を提供する。開示される核酸のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸が提供される。
以下に,ActA−N100を融合蛋白質パートナーとして含むコンストラクトを作成するために用いた核酸およびポリペプチドを説明する。L.monocytogenesにおける発現用の配列コドン最適化およびコドン非最適化配列を示す。
本発明は,SecA2依存性経路により分泌される蛋白質をコードする第1の核酸および異種抗原をコードする第2の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。オートリシン,例えばp60およびNamA(N−アセチル−ムラミダーゼ)は,ListeriaからSecA2依存性経路により分泌される蛋白質である(Lenz,et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:12432−12437)。1つの態様においては,融合蛋白質パートナー(例えば,p60またはNamA)はその酵素的または構造的活性を保持する。別の態様においては,融合蛋白質パートナーはその酵素的または構造的活性を欠失している。さらに別の態様においては,異種蛋白質をコードする核酸は,シグナル配列(SS)と細胞壁結合ドメイン(LysSM)および触媒ドメインLyz−2(NamA)およびp60−dom(p60)をコードする核酸との間に配置または挿入される。
M N M K K A T I A A T A G I A V T A F A A P T I A S A S T V V V E A G D T L W G I A Q S K G T T V D A I K K A N N L T T D K I V P G Q K L Q (配列番号61)
hlyプロモーター−p60(p60の70N末端アミノ酸)
ユニークPstI部位(CTGCAG)が3’末端に見られる。
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAG (配列番号62)
フォワードプライマー:
5'- CGC CTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTG (配列番号63)
リバースプライマー:
5'-CGCGGATCCTTAATTATACGCGACCGAAG (配列番号64)
hlyプロモーター−p60−[p60の70N末端アミノ酸1−77(コドン最適化)]−[PstI]−[p60のC末端アミノ酸78−478(非コドン最適化)]
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC (配列番号65)
フォワードプライマー (huMeso 3F):
5'-AAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCC (配列番号66)
リバースプライマー (hMeso 1935R):
5'-AAACTGCAGAGCTAATGTACTGGCTAATAATAATGCTAAC (配列番号67)
ヒト メソセリン (ΔSSΔGPI アンカー)を増幅するために用いたPCR プライマー
フォワードプライマー (huMeso 133F):
5'- CGCCTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGG (配列番号68)
リバースプライマー (huMeso 1770R):
5'-CGCCTGCAGGCCTTGTAAACCTAAACCTAATGTATC (配列番号69)
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCCATTACTAGGTAGTTGCGGTACACCAGCACTAGGTTCTTTATTATTTTTGTTATTTTCTCTAGGTTGGGTTCAACCAAGTCGTACATTAGCAGGTGAAACAGGTCAAGAAGCAGCACCACTTGACGGTGTATTAACGAATCCACCAAATATATCAAGTTTAAGTCCACGTCAATTATTAGGTTTTCCATGTGCAGAAGTTTCAGGTTTAAGTACAGAACGTGTCCGTGAGTTAGCAGTTGCATTAGCACAAAAAAACGTTAAATTATCTACAGAACAGTTACGTTGTTTAGCCCATAGATTAAGCGAACCACCAGAAGACTTAGATGCACTTCCTTTAGACCTTCTTTTATTCTTAAATCCAGATGCATTTTCAGGACCACAAGCATGTACACGTTTTTTTAGTCGAATTACAAAAGCCAATGTTGATTTATTACCTCGTGGGGCTCCTGAAAGACAACGTTTATTACCTGCTGCATTAGCATGCTGGGGTGTTCGCGGTAGCTTATTAAGTGAAGCCGATGTTCGTGCTTTAGGGGGTTTAGCATGTGATTTACCTGGTCGTTTCGTTGCAGAATCAGCAGAAGTGTTATTACCGAGATTAGTTTCATGCCCAGGACCTTTAGATCAAGATCAACAAGAGGCAGCTAGAGCAGCTCTTCAAGGAGGAGGCCCACCATATGGCCCACCAAGTACATGGAGTGTTTCTACAATGGATGCGTTAAGAGGTTTATTACCGGTTTTAGGACAACCAATTATTCGTAGTATTCCACAAGGCATTGTAGCAGCATGGCGTCAACGTAGTTCTCGTGATCCGTCTTGGCGACAACCAGAACGTACAATTCTACGTCCAAGATTTCGTAGAGAAGTAGAAAAAACGGCGTGTCCTAGTGGCAAAAAAGCACGTGAAATTGATGAAAGTTTAATTTTTTATAAAAAATGGGAATTAGAAGCATGTGTCGATGCAGCATTACTAGCTACACAAATGGATCGTGTTAATGCTATTCCATTCACATATGAACAATTAGATGTTTTAAAGCATAAATTAGACGAATTATATCCACAAGGTTATCCAGAATCAGTTATTCAACATTTAGGTTACTTATTTTTAAAAATGAGTCCAGAAGACATACGCAAATGGAATGTTACAAGTTTAGAAACATTAAAAGCGCTTTTAGAAGTTAACAAAGGTCATGAAATGAGTCCACAAGTTGCTACGTTAATTGATAGATTCGTTAAAGGCCGTGGTCAATTAGATAAAGATACTTTAGATACATTAACAGCATTTTATCCTGGCTACTTATGCAGTTTATCACCAGAAGAATTAAGTTCCGTTCCACCGAGTAGTATCTGGGCAGTTCGTCCGCAAGATTTAGATACATGCGACCCACGTCAATTAGATGTTTTATATCCAAAAGCAAGATTAGCTTTCCAAAATATGAACGGTAGTGAATATTTCGTAAAAATTCAATCCTTTTTAGGTGGTGCACCAACTGAAGATCTAAAAGCATTAAGCCAACAAAATGTAAGTATGGATTTAGCTACGTTTATGAAATTACGTACAGATGCAGTTCTACCATTAACAGTTGCAGAAGTTCAAAAATTATTAGGTCCACACGTAGAAGGATTAAAAGCAGAAGAACGTCACCGTCCAGTTCGCGATTGGATTTTACGTCAACGTCAAGATGATTTAGATACATTAGGTTTAGGTTTACAAGGCGGTATTCCGAATGGATATTTAGTGTTAGATTTATCTGTTCAAGAAGCATTAAGTGGTACACCGTGTTTATTAGGTCCAGGTCCAGTTTTAACAGTGTTAGCATTATTATTAGCCAGTACATTAGCTCTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC (配列番号136)
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGGTCAAGAAGCAGCACCACTTGACGGTGTATTAACGAATCCACCAAATATATCAAGTTTAAGTCCACGTCAATTATTAGGTTTTCCATGTGCAGAAGTTTCAGGTTTAAGTACAGAACGTGTCCGTGAGTTAGCAGTTGCATTAGCACAAAAAAACGTTAAATTATCTACAGAACAGTTACGTTGTTTAGCCCATAGATTAAGCGAACCACCAGAAGACTTAGATGCACTTCCTTTAGACCTTCTTTTATTCTTAAATCCAGATGCATTTTCAGGACCACAAGCATGTACACGTTTTTTTAGTCGAATTACAAAAGCCAATGTTGATTTATTACCTCGTGGGGCTCCTGAAAGACAACGTTTATTACCTGCTGCATTAGCATGCTGGGGTGTTCGCGGTAGCTTATTAAGTGAAGCCGATGTTCGTGCTTTAGGGGGTTTAGCATGTGATTTACCTGGTCGTTTCGTTGCAGAATCAGCAGAAGTGTTATTACCGAGATTAGTTTCATGCCCAGGACCTTTAGATCAAGATCAACAAGAGGCAGCTAGAGCAGCTCTTCAAGGAGGAGGCCCACCATATGGCCCACCAAGTACATGGAGTGTTTCTACAATGGATGCGTTAAGAGGTTTATTACCGGTTTTAGGACAACCAATTATTCGTAGTATTCCACAAGGCATTGTAGCAGCATGGCGTCAACGTAGTTCTCGTGATCCGTCTTGGCGACAACCAGAACGTACAATTCTACGTCCAAGATTTCGTAGAGAAGTAGAAAAAACGGCGTGTCCTAGTGGCAAAAAAGCACGTGAAATTGATGAAAGTTTAATTTTTTATAAAAAATGGGAATTAGAAGCATGTGTCGATGCAGCATTACTAGCTACACAAATGGATCGTGTTAATGCTATTCCATTCACATATGAACAATTAGATGTTTTAAAGCATAAATTAGACGAATTATATCCACAAGGTTATCCAGAATCAGTTATTCAACATTTAGGTTACTTATTTTTAAAAATGAGTCCAGAAGACATACGCAAATGGAATGTTACAAGTTTAGAAACATTAAAAGCGCTTTTAGAAGTTAACAAAGGTCATGAAATGAGTCCACAAGTTGCTACGTTAATTGATAGATTCGTTAAAGGCCGTGGTCAATTAGATAAAGATACTTTAGATACATTAACAGCATTTTATCCTGGCTACTTATGCAGTTTATCACCAGAAGAATTAAGTTCCGTTCCACCGAGTAGTATCTGGGCAGTTCGTCCGCAAGATTTAGATACATGCGACCCACGTCAATTAGATGTTTTATATCCAAAAGCAAGATTAGCTTTCCAAAATATGAACGGTAGTGAATATTTCGTAAAAATTCAATCCTTTTTAGGTGGTGCACCAACTGAAGATCTAAAAGCATTAAGCCAACAAAATGTAAGTATGGATTTAGCTACGTTTATGAAATTACGTACAGATGCAGTTCTACCATTAACAGTTGCAGAAGTTCAAAAATTATTAGGTCCACACGTAGAAGGATTAAAAGCAGAAGAACGTCACCGTCCAGTTCGCGATTGGATTTTACGTCAACGTCAAGATGATTTAGATACATTAGGTTTAGGTTTACAAGGCCTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC. (配列番号76)
表11は,調製した細菌株のいくつかを示す。細菌は腫瘍担持マウスへのワクチン接種に用いた。示される場合,ワクチン接種の結果,抗腫瘍免疫応答,腫瘍数およびサイズの減少,および生存の増加が生じた。
レーンP,親Listeriaを用いる対照実験は明白な染色バンドを示さない。
レーン1−4はバンドをほとんどまたは全く示さない。
レーン5は,LLOopthmesoΔSSΔGPI−12−rasのある程度の分泌を示すが,ここでは,インテグレーションはリステリアtRNAArg遺伝子中へのpPL2媒介性インテグレーションによるものであった。
レーン6は,マウスメソセリンを分泌させる試みを表すが,明確な染色バンドを示さない。
レーン7はActA−N100hMesoΔSSΔGPI−12−rasの著しい分泌を示し,ここで,インテグレーションは,pKSV7により媒介され,リステリアのゲノムのActA部位である。
レーン8はさらに高い分泌を示し,ここで,コンストラクトはActAN100hMesoΔSSΔGPIであり,インテグレーションはpKSV7により媒介され,リステリアのゲノムのActA部位である(図7)。
レーン9はほとんどまたは全くバンドを示さない。
ポリヌクレオチド中への第1の核酸の部位特異的インテグレーションは,ファージインテグラーゼ,第1の核酸中に存在するattPP’部位,およびポリヌクレオチド中に存在する対応するかまたは適合するattBB’部位により媒介することができる。本発明は,第1の核酸のポリヌクレオチド中へのインテグレーションを媒介するのに有用な,ファージインテグラーゼ,attPP’部位,およびattBB’部位をコードする多数の核酸を提供し,ここで,ポリヌクレオチドはプラスミドであっても細菌のゲノムであってもよく,そしていくつかの非限定的例を提供する。
あるいは,組換えL.monocytogenes(Lm)株における異種抗原は,ActAN100−PSCA融合蛋白質のカルボキシル末端にインフレームで位置する8アミノ酸のSIINFEKL(配列番号142)ペプチド(SL8およびオバルブミン257-264としても知られる)をコードするヌクレオチド配列を含むよう構築してもよい。SL8エピトープ等の組成物は,組換えL.monocytogenesワクチン株が抗原提示細胞により取り込まれることができ,次にインビトロ抗原提示アッセイを用いて,MHCクラスI経路を介して抗原を提示するようプログラムされていることを示すための代理物として働く。
ActAN100−前立腺幹細胞抗原(PSCA)に基づく融合蛋白質をコードする発現カセットを含む組換えL.monocytogenesの構築および免疫原性は,本発明に記載される組成物および方法の用途のさらに別の非限定的例である。この実施例は,感染した哺乳動物宿主細胞における,抗原に特異的な細胞性免疫応答につながる,組換えListeriaからの異種抗原の発現および分泌を示す。
MKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL-(配列番号:145)
コドン最適化PSCA,BamHI−SpeIデルタSS,デルタGPI(アミノ酸18−101):
ggatccGGTACAGCACTTTTATGTTATTCCTGTAAAGCACAAGTATCAAATGAAGACTGTTTACAAGTAGAAAATTGTACACAATTGGGAGAACAATGTTGGACTGCGAGAATTCGAGCCGTAGGTTTATTAACTGTAATTAGTAAAGGATGTTCGTTAAACTGTGTAGATGACTCACAAGATTATTACGTTGGCAAAAAAAATATTACATGCTGTGACACTGATTTATGCAATGCAAGTGGCGCTCACGCTCTTCAAactagt(配列番号:146)
コドン最適化PSCA−BamHI−SpeIデルタSS,デルタGPIの翻訳(GSおよびTSはそれぞれBamHIおよびSpeI制限部位である):
GSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTS(配列番号:147)
ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL (核酸配列に基づく推定配列,最初のアミノ酸はバリンである)(PSCA配列は下線で示す):
VGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGGSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTSQLADLVLAKVLQLESIINFEKLADLVA(配列番号:148)
ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL (最初のアミノ酸はメチオニンである,最初のアミノ酸がアミノ末端アミノ酸である場合にListeria monocytogenesで発現される実際の配列,PSCA配列は下線で示す):
MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGGSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTSQLADLVLAKVLQLESIINFEKLADLVA (配列番号:149)
当該技術分野においては,特定の腫瘍は腫瘍に関連するいくつかの抗原を発現すること,およびこれらの腫瘍関連抗原の2以上に対する細胞性免疫応答を誘導することにより特定の癌ワクチンの効力を増強しうることがよく知られている。本発明は,2以上の異種抗原を発現し分泌する組換えL.monocytogenesワクチン株の組成物および方法を提供し,ここで,ワクチン接種は,ワクチン接種した動物における,発現した異種抗原のそれぞれに対する細胞性免疫の誘導につながる。実施例XIは,非限定的例として,2つの異なるActAN100−異種抗原融合蛋白質をコードする組換え二価L.monocytogenes株の組成物および方法の有用性を示す。
Claims (17)
- (a)actAプロモーター;および
(b)actAプロモーターと動作可能なように連結されている核酸
を含むポリヌクレオチドであって,ここで核酸は,
(i)配列番号38の少なくとも最初の59アミノ酸残基を含み,配列番号38の最初の380アミノ酸より短く,ここで、配列番号38の最初のアミノ酸残基はメチオニンで置換されていてもよいトランケート型ActA;および
(ii)異種抗原
を含む融合蛋白質をコードする,
ことを特徴とするポリヌクレオチド。 - トランケート型ActAは,配列番号38のアミノ酸1−100を含み,ここで,配列番号38の最初のアミノ酸残基はメチオニンで置換されていてもよい,請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- トランケート型ActAは,コフィリンホモロジー領域(KKRR)(配列番号23),およびリン脂質コア結合ドメイン(KVFKKIKDAGKWVRDKI)(配列番号20)からなる群より選択される少なくとも1つのドメインの、ドメイン中の不活性化変異,ドメインの欠失,またはドメインの前でのトランケーションを含む,請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- トランケート型ActAは,配列FPPPP(配列番号21)を有する3つのプロリンリッチドメインの欠失,またはドメインの前でのトランケーションを含む,請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 異種抗原は,癌細胞,腫瘍,または感染性因子からのものであるかまたはそれに由来する,請求項1−4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 異種抗原はヒトメソセリンである,請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 異種抗原は,そのシグナルペプチド領域,そのGPIアンカー領域,またはそのシグナルペプチドとGPIアンカー領域との両方を欠失したヒトメソセリンの誘導体である,請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 異種抗原はヒトPSCAである,請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 異種抗原は,
(a) そのシグナルペプチド領域の一部または全部;
(b) そのGPIアンカー領域;または
(c) そのGPIアンカー領域およびそのシグナルペプチド領域の一部または全部,
を欠失しているヒトPSCAの誘導体である,請求項5に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項1−9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 請求項1−9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むListeria細菌。
- Listeria monocytogenesである,請求項11に記載のListeria細菌。
- 細胞から細胞への拡散,および/または非食細胞中への侵入について減弱化されている,請求項12に記載のListeria細菌。
- Listeria細菌はそのゲノム中に請求項1−9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む,請求項11−13のいずれかに記載のListeria細菌。
- 該ポリヌクレオチドはゲノム中の病原性遺伝子中にインテグレートされており,ここで,ポリヌクレオチドのインテグレーションは:
(a) 病原性遺伝子の発現を中断させる(disrupt)か;または
(b) 病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる(disrupt),
ことを特徴とする,請求項14に記載のListeria細菌。 - 病原性遺伝子はprfA依存性遺伝子actAまたはinlBである,請求項15に記載のListeria細菌。
- 請求項11−16のいずれかに記載のListeria細菌を含むワクチン。
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