JP5347135B2 - 遺伝子工学操作されたｌｉｓｔｅｒｉａおよびその使用方法 - Google Patents

遺伝子工学操作されたｌｉｓｔｅｒｉａおよびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP5347135B2
JP5347135B2 JP2008557419A JP2008557419A JP5347135B2 JP 5347135 B2 JP5347135 B2 JP 5347135B2 JP 2008557419 A JP2008557419 A JP 2008557419A JP 2008557419 A JP2008557419 A JP 2008557419A JP 5347135 B2 JP5347135 B2 JP 5347135B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
listeria
acta
nucleic acid
polynucleotide
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2008557419A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009528065A (ja
JP2009528065A5 (ja
Inventor
ドゥベンスキー，トーマス，ダブリュ．，ジュニア．
スコブル，ジャスティン
ロウアー，ピーター，エム．
クック，デヴィッド，エヌ．
Original Assignee
アドゥロ バイオテック
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US11/395,197 external-priority patent/US7935804B2/en
Priority claimed from US11/396,216 external-priority patent/US20070207171A1/en
Application filed by アドゥロ バイオテック filed Critical アドゥロ バイオテック
Publication of JP2009528065A publication Critical patent/JP2009528065A/ja
Publication of JP2009528065A5 publication Critical patent/JP2009528065A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5347135B2 publication Critical patent/JP5347135B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A61P33/12—Schistosomicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Description

関連する出願の参照
本出願は，（ａ）米国特許出願１１／３９５，１９７（２００６年３月３０日出願）の一部継続出願であり，これは米国特許仮出願６０／７８４，５７６（２００６年３月２１日出願）および米国特許仮出願６０／７７８，４７１（２００６年３月１日出願）に基づく優先権を主張しており，（ｂ）米国特許出願１１／３９６，２１６（２００６年３月３０日出願）の一部継続出願であり，これは米国特許仮出願６０／７８４，５７６（２００６年３月２１日出願）および米国特許仮出願６０／７７８，４７１（２００６年３月１日出願）に基づく優先権を主張しており，そして（ｃ）米国特許仮出願６０／７８４，５７６（２００６年３月２１日出願）および米国特許仮出願６０／７７８，４７１（２００６年３月１日出願）に基づく優先権を主張しており，これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
連邦政府研究開発補助金に関する記述
本発明は，部分的には，米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＮＨＩ１Ｋ２３ＣＡ１０４１６０−０１による支援によりなされたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は，免疫系を刺激し，癌および感染を治療するのに有用な，遺伝子工学操作されたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。また，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび他の細菌種を改変するのに有用なポリヌクレオチド，融合蛋白質パートナー，およびインテグレーションベクターも提供する。
発明の背景
癌および感染は，免疫系を調節する試薬を投与することにより治療することができる。これらの試薬には，ワクチン，サイトカイン，抗体，およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびイミダゾキノリンなどの小分子が含まれる（例えば，Ｂｅｃｋｅｒ（２００５）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３０：２５１−２６６；Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｖｏｌｌｍｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＤｒｕｇＤｅｖｅｌ．７：２０４−２１０；Ｍａｊｅｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４４：１４−１９），Ｈｏｆｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．３２：８６−９１；Ｈｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３３：２５−２９；Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｓ．Ｃａｎｃｅｒ １：１１８−１２９；Ｄｅｃｈａｎｔ ａｎｄ Ｖａｌａｅｒｉｕｓ（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｓ．Ｏｎｃｏｌ．３９：６９−７７；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６２：２０３８−２０４３を参照）。ワクチン類，例えば，伝統的なワクチン（不活性化全生物，抽出物または抗原），樹状細胞（ＤＣ）ワクチン，および核酸系のワクチンはすべて，癌および感染を治療するのに有用である（例えば，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ａｍａｒａ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｐｐｌ．１１：Ｓ２５−Ｓ３２；Ｐｌｏｔｋｉｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｐｐｌ．１１：Ｓ５−Ｓ１１；Ｐａｓｈｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｐｐｌ．１１：Ｓ６３−Ｓ６８；Ｌａｒｃｈｅ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｐｐｌ．１１：Ｓ６９−Ｓ７６を参照）。免疫系を調節するのに有用な別の試薬はＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）であり，この試薬は癌および腫瘍を首尾よく治療することが証明されている（例えば，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１３８３２−１３８３７；Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：８５３−８６０）；Ｓｔａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４２０−４２７；Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３９８７−３９９１を参照）。
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は，ウイルスおよび腫瘍に対するワクチンとして開発されている（例えば，Ｓｔａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４２０−４２７；Ｇｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：６４７１−６４７９；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９−２２１８；Ｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ１９：１４３５−１４４５；Ｍａｔａ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１４４９−１４５６；Ｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２９８５−２９９３；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９９８７−９９９３；Ｓｏｕｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：２７０２−２７１２；Ｓａｋｌａｎｉ−Ｊｕｓｆｏｒｇｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１０８３−１０９０；Ｓｏｕｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６８：１４９８−１５０６；Ｔｖｉｎｎｅｒｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ７０：１５３−１６２；Ｒａｙｅｖｓｋａｙａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：９１８−９２２；Ｆｒａｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４７７５−４７８２；Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４６７−８４７４；Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５８：１４７−１５７；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０２：６２９−６３７；Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＭＳＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：２４３−２５３；Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：５１７６−５１８７；Ｐａｔｅｒｓｏｎ（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７：４５１−４６２；Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ３：Ｓ１１９−Ｓ１３４；Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９２９３−９２９８；Ｈｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１−８８を参照）。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは，天然には肝臓および脾臓に，およびある程度は他の組織，例えば小腸に指向性を有する（例えば，Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５８７−６１０；Ｇｏｕｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：３５−４５；Ｃｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：４０１−４０９；Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４：５８４−６４０；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．２０１：１８８−１９５を参照）。細菌が腸に存在する場合には，血流への通過はリステリアの蛋白質，例えばＡｃｔＡおよびインターナリンＡにより媒介される（例えば，Ｍａｎｏｈａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：３５４２−３５４９；Ｌｅｃｕｉｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：６１５２−６１５７；Ｌｅｃｕｉｔ ａｎｄ Ｃｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８：５３７−５４２を参照）。細菌が一旦宿主細胞に入ると，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのライフサイクルには，ファゴリソソームから細胞質への回避が関与する。このライフサイクルは，ファゴリソソームの内部に存在したままであるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのライフサイクルとは対照的である（例えば，Ｃｌｅｍｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ＩｎｆｅｃｔｉｏｎＩｍｍｕｎｉｔｙ ７０：５８００−５８０７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６６：５９３０−５９３８；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ １１９：７５３−７６６を参照）。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのファゴリソソームからの回避は，リステリアの蛋白質，例えば，リステリオリシン（ＬＬＯ），ＰＩ−ＰＬＣ，およびＰＣ−ＰＬＣにより媒介される（Ｐｏｒｔｎｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５８：４０９−４１４を参照）。
癌または感染を治療するためのワクチンは，適当な試薬がないため，しばしば有効ではない。本発明は，抗原の発現または免疫プロセシングを増強するのに有用な，および癌および感染に対する生存率を増加するのに有用なポリヌクレオチド，融合蛋白質パートナー，プラスミドおよび細菌性ワクチンを提供することにより，この必要性を満たすものである。
発明の概要
本発明は，部分的には，腫瘍をもつ哺乳動物に，腫瘍抗原に連結されたＡｃｔＡ系融合蛋白質をコードする核酸を含むよう遺伝子工学操作された減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与すると，生存が増強されるという認識に基づくものである。
１つの観点においては，本発明は，融合蛋白質をコードする核酸配列と動作可能なように連結されているプロモーターを含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，融合蛋白質は，（ａ）改変型ＡｃｔＡおよび（ｂ）異種抗原を含む。ある態様においては，プロモーターは細菌プロモーター（例えば，リステリアのプロモーター）である。ある態様においては，プロモーターはＡｃｔＡプロモーターである。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多くを含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，最初の３８０アミノ酸未満，または最初の２６５アミノ酸未満を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多く，ＡｃｔＡの最初の３８０アミノ酸未満を含む。例えば，ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの少なくとも最初の約５９アミノ酸およびＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸未満を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多いが，ＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸未満を含む。別の態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多いがＡｃｔＡの最初の３８０アミノ酸未満を含む。さらに別の態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの少なくとも最初の８５アミノ酸およびＡｃｔＡの最初の１２５アミノ酸未満を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡのアミノ酸１−１００を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡのアミノ酸１−１００から構成される。異種抗原は非リステリア性であってもよい。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるか，またはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原は，癌，腫瘍，または感染性因子と，免疫学的に交叉反応性であるか，または少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原は腫瘍抗原であるか，または腫瘍抗原に由来する。ある態様においては，異種抗原は，メソセリンであるか，またはそれに由来する。例えば，ある態様においては，異種抗原は，ヒトメソセリンであるか，またはそれに由来する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８（下記の実施例ＶＩＩの表１１を参照）である。ある態様においては，異種抗原はＥｐｈＡ２抗原性ペプチドを含まない。ある態様においては，融合蛋白質をコードする核酸配列はＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現用にコドン最適化されている。本発明はポリヌクレオチドを含むプラスミドおよび細胞を提供する。本発明はさらに，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は，減弱化されていてもよい（例えば，ａｃｔＡ欠失変異体またはａｃｔＡ挿入変異体）。ある態様においては，細菌は，ａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢにおいて減弱化変異を含んでいてもよい。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａはそのゲノム中にポリヌクレオチドを含む。ある態様においては，ポリヌクレオチドは，リステリアのゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチド（または核酸）はＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされており，ここで，ポリヌクレオチドのインテグレーションは，（ａ）病原性遺伝子の発現を中断させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）か，および／または，（ｂ）病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる。ある態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ依存性である。別の態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ非依存性である。ある態様においては，核酸またはポリヌクレオチドは，ＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムのａｃｔＡ座および／またはｉｎｌＢ座にインテグレートされている。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａはポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む。本発明はＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物および医薬組成物を提供する。本発明はまた，哺乳動物（例えばヒト）において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ（またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む有効量の組成物）を哺乳動物に投与することを含む。例えば，本発明はまた，癌または感染性因子からのまたはこれらに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，癌または感染性因子を有する哺乳動物に有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ（またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）を投与することを含み，ここで，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するか，または免疫学的に交叉反応性である。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡ配列を融合蛋白質中に含めることにより，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａの免疫原性が増強される（例えば，改変型ＡｃｔＡではなく異種抗原および非ＡｃｔＡシグナル配列および／またはリーダー配列を含む融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａの免疫原性と比較して）。ある態様においては，融合蛋白質中に改変型ＡｃｔＡ配列を含めることにより，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける異種抗原の発現および／または分泌が増強される（例えば，改変型ＡｃｔＡではなく非ＡｃｔＡシグナル配列および／またはリーダー配列に融合された異種抗原のＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現および／または分泌と比較して）。
は少なくとも７つの核酸配列がリステリアのゲノム中にインテグレートされている。
別の観点においては，本発明は，改変型ＡｃｔＡ（例えばａｃｔＡ−Ｎ−１００）をコードし，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸を含むが，ＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸より少ないアミノ酸配列を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多いがＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸より少ないアミノ酸配列を含む。ある態様においては，第１の核酸はＡｃｔＡのアミノ酸１−１００をコードする。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性である。例えば，ポリヌクレオチドはａｃｔＡまたはｉｎｌＢ遺伝子中にインテグレートさせてもよい。別のいくつかの態様においては，ポリヌクレオチドはプラスミド系である。ある態様においては，ポリヌクレオチドは以下の１またはそれ以上と動作可能なように連結されている：（ａ）ａｃｔＡプロモーター；または（ｂ）ａｃｔＡプロモーターではない細菌プロモーター。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるか，またはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原は，癌，腫瘍，または感染性因子と免疫学的に交叉反応性であるか，または少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原は，メソセリン（例えば，ヒトメソセリン）であるか，またはこれに由来する。本発明はさらに，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８である（下記の実施例ＶＩＩの表１１を参照）。本発明はまた，癌（例えば，腫瘍または前癌性細胞）または感染性因子（例えば，ウイルス，病原性細菌，または寄生虫生物）からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，癌または感染性因子を有する哺乳動物にＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，ここで，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれらに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するか，または免疫学的に交叉反応性である。この方法のある態様においては，刺激は，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与しない場合の免疫応答に対するものである。この方法のある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるかまたはこれに由来する。
別の観点においては，本発明は，改変型ａｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，改変型ａｃｔＡは，（ａ）ａｃｔＡのアミノ酸１−５９，（ｂ）宿主細胞細胞骨格のａｃｔＡ媒介性制御用の少なくとも１つのドメイン中の不活性化変異，その欠失，またはその前でのトランケーションを含み，ここで，第１の核酸は異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多いアミノ酸配列を含む。ある態様においては，ドメインはコフィリンホモロジー領域（ＫＫＲＲ（配列番号２３））である。ある態様においては，ドメインはリン脂質コア結合ドメイン（ＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩ（配列番号２０））である。ある態様においては，少なくとも１つのドメインは，ＡｃｔＡの４つすべてのプロリンリッチドメイン（ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＩＰ（配列番号２２））を含む。ある態様においては，改変型ａｃｔＡはａｃｔＡ−Ｎ１００である。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性（ｇｅｎｏｍｉｃ）である。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性ではない。ある態様においては，ポリヌクレオチドは以下の１またはそれ以上と動作可能なように連結されている：（ａ）ａｃｔＡプロモーター；または（ｂ）ａｃｔＡプロモーターではない細菌（例えば，リステリア）プロモーター。本発明はまた，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢに減弱化変異を含む。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８である（下記の実施例ＶＩＩの表１１を参照）。本発明はまた，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，癌または感染性因子を有する哺乳動物にＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，ここで，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するかまたは免疫学的に交叉反応性である。ある態様においては，刺激はＬｉｓｔｅｒｉａを投与しない場合の免疫応答に対する相対値である。ある態様においては，癌は，腫瘍または前癌性細胞を含む。ある態様においては，感染性因子は，ウイルス，病原性細菌，または寄生虫生物を含む。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるかまたはこれに由来する。ある態様においては，異種抗原は，癌，腫瘍，または感染性因子と免疫学的に交叉反応性であるかまたは少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原は，メソセリンであるかまたはこれに由来する。例えば，ある態様においては，異種抗原は，ヒトメソセリンであるかまたはこれに由来する。ある態様においては，ポリヌクレオチド中に改変型ＡｃｔＡ配列が含まれることにより，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける異種抗原の発現および／または分泌が増強される。ある態様においては，ポリヌクレオチド中に改変型ＡｃｔＡ配列が含まれることにより，Ｌｉｓｔｅｒｉａを含むワクチン組成物の免疫原性が増強される。
さらに別の観点においては，本発明は，ファージインテグラーゼをコードする第１の核酸，ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’部位）をコードする第２の核酸，および異種抗原または制御核酸をコードする第３の核酸を含むプラスミドを提供し，ここで，プラスミドは，異種抗原をコードする核酸の細菌のゲノム中の，プラスミドのａｔｔＰＰ’部位と適合性の細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’部位）における部位特異的インテグレーションを媒介するのに有用である。ある態様においては，それぞれの核酸はＬ．ｉｎｎｏｃｕａ ００７１に由来してもよく，それぞれの核酸はＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １７６５に由来してもよく，それぞれの核酸はＬ．ｉｎｎｏｃｕａ ２６０１に由来してもよく，またはそれぞれの核酸はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｆ６８５４＿２７０３に由来してもよい。ある態様においては，第１の核酸はｐｈｉＣ３１インテグラーゼをコードする。ある態様においては，プラスミドはｐＩＮＴのポリヌクレオチド配列；またはｐＩＮＴをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり，ここで，ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは，細菌ゲノム中のｐＩＮＴにより用いられているものと同じ細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）における部位特異的インテグレーションを媒介することができる。ある態様においては，細菌のゲノムは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるかまたはこれらに由来する。ある態様においては，制御核酸は細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）である。ある態様においては，プラスミドはさらに，第１のｌｏｘ部位をコードする第４の核酸，第２のｌｏｘ部位をコードする第５の核酸，および選択マーカーをコードする第６の核酸を含み，ここで，第１のｌｏｘ部位および第２のｌｏｘ部位は第６の核酸と動作可能なように連結されており，動作可能なように連結されているｌｏｘ部位は，Ｃｒｅリコンビナーゼにより触媒される第６の核酸の切り出しを媒介するのに有用である。ある態様においては，第１のｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位であり，第２のｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位である。ある態様においては，プラスミドはさらに非適合性細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）を含み，ここで，非適合性ａｔｔＢＢ’部位はファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）と適合性ではない。ある態様においては，プラスミドはさらに，第１の核酸と動作可能なように連結されている第１のプロモーター，および第３の核酸と動作可能なように連結されている第２のプロモーターを含む。本発明はさらに，細菌のゲノムを改変する方法を提供し，この方法は，細菌をプラスミドでトランスフェクションし，インテグレーションに適した条件下で第３の核酸の細菌のゲノム中に，インテグラーゼにより触媒されるインテグレーションが生ずるようにすることを含む。この方法のある態様においては，細菌は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓである。
本発明はさらに，（ａ）細菌のゲノムに相同の第１の領域をコードする第１の核酸，（ｂ）細菌のゲノムに相同の第２の領域をコードする第２の核酸，および（ｃ）細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）を含む第３の核酸を含むプラスミドを提供し，ここで，第３の核酸は，第１の核酸と第２の核酸に挟まれており，第１の核酸および第２の核酸は互いに動作可能なように連結されており，第３の核酸の細菌のゲノム中への相同的インテグレーションを媒介することができる。ある態様においては，細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）は以下のａｔｔＢＢ’を含む：リステリアのｔＲＮＡ Ａｒｇ−ａｔｔＢＢ’；リステリアのｃｏｍＫ ａｔｔＢＢ’；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ００７１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ １２３１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ １７６５；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ２６１０；またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｆ６８５４＿２７０３；またはｐｈｉＣ３１。ある態様においては，ゲノムは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムである。ある態様においては，第３の核酸は，第１のｌｏｘ部位と第２のｌｏｘ部位に挟まれた選択マーカーをコードしており，ここで，ｌｏｘ部位はＣｒｅリコンビナーゼにより基質として認識され，Ｃｒｅリコンビナーゼにより触媒される第３の核酸の切り出しを可能とし，選択マーカーは第３の核酸の細菌のゲノムへのインテグレーションを検出するのに有用である。ある態様においては，第１のｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位であり，第２のｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位である。ある態様においては，第３の核酸は抗生物質耐性遺伝子を含む。ある態様においては，第１の核酸は病原性因子遺伝子の第１の領域に相同であり，第２の核酸は病原性因子遺伝子の第２の領域に相同であり，ここで，病原性因子遺伝子の第１の領域および第２の領域は，互いに異なるものであり，互いに重複しない。ある態様においては，病原性因子遺伝子の第１の領域は病原性因子遺伝子の第２の領域と共有結合的に接触しているかまたは隣接している。別の態様においては，病原性因子遺伝子の第１の領域は病原性因子遺伝子の第２の領域と共有結合的に接触しておらず，その周囲に共有結合的に存在しない。本発明はさらに，プラスミドのインテグレーションにより改変された細菌を提供する。ある態様においては，インテグレーションは，成長または拡散を媒介するのに必要なゲノムの領域中で生ずる。別の態様においては，インテグレーションは，成長または拡散を媒介するのに必要ではないゲノムの領域中で生ずる。
さらに別の観点においては，本発明は，ゲノムが第１の核酸を挟む，動作可能なように連結された２つの異種リコンビナーゼ結合部位を含むポリヌクレオチドを含み，２つの部位は：（ａ）２つのｌｏｘ部位；または（ｂ）２つのＦｒｔ部位であり，２つのｌｏｘ部位により挟まれた核酸はＣｒｅリコンビナーゼにより切り出されることができ，２つのＦｒｔ部位により挟まれた核酸はＦＬＰリコンビナーゼにより切り出されることができる，細菌を提供する。ある態様においては，２つのｌｏｘ部位は両方ともｌｏｘＰ部位である。ある態様においては，第１の核酸は選択マーカーまたは異種抗原をコードする。ある態様においては，第１の核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードする。ある態様においては，細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓである。ある態様においては，ポリヌクレオチドはさらに第２の核酸を含み，ここで，第２の核酸は，第１のおよび第２の異種リコンビナーゼ結合部位に挟まれておらず，これらと動作可能なように連結されていない。ある態様においては，第２の核酸は，異種抗原；または細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）の一方または両方をコードする。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるかまたはこれらに由来する。本発明はさらに，第１の核酸を細菌のゲノムから切り出す方法を提供し，この方法は，ゲノムをＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼと接触させ，そして切り出しを可能とするか容易にする条件下でリコンビナーゼが第１の核酸の切り出しを触媒できるようにすることを含み，ここで，（ａ）第１の核酸はｌｏｘ部位により挟まれており，リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであるか；または（ｂ）第１の核酸はＦｒｔ部位により挟まれており，リコンビナーゼはＦＬＰリコンビナーゼである。ある態様においては，リコンビナーゼは細菌中で過渡的に発現される。
別の観点においては，本発明はゲノムが異種抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供する。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸は部位特異的組換えまたは相同組換えによりゲノム中にインテグレートされている。ある態様においては，ゲノム中のインテグレーションの部位はｔＲＮＡArg座である。ある態様においては，ゲノム中の核酸の存在はＬｉｓｔｅｒｉａを減弱化する。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸は病原性遺伝子の遺伝子座にインテグレートされている。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸はａｃｔＡ座にインテグレートされている。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸はｉｎｌＢ座にインテグレートされている。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムは，第１の遺伝子座（例えば，ａｃｔＡ座）インテグレートにされている異種抗原をコードする第１の核酸，および第２の遺伝子座（例えば，ｉｎｌＢ座）にインテグレートされている第２の異種抗原をコードする第２の核酸を含む。第１の異種抗原および第２の異種抗原は，互いに同一であってもよく，異なっていてもよい。ある態様においては，第１の異種抗原および第２の異種抗原は互いに異なるが，同じ腫瘍抗原または感染性因子抗原に由来する。ある態様においては，第１の異種抗原および第２の異種抗原はそれぞれ，癌細胞，腫瘍，または感染性因子に由来する抗原の異なるフラグメントである。ある態様においては，インテグレートした核酸は，改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。ある態様においては，異種抗原をコードする少なくとも２つ，少なくとも３つ，少なくとも４つ，少なくとも５つ，少なくとも６つまたは少なくとも７つの核酸配列がリステリアのゲノム中にインテグレートされている。
別の観点においては，本発明はゲノムを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し，ここで，ゲノムは異種抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み，ここで，核酸はゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａは，病原性遺伝子の発現の中断または病原性遺伝子のコーディング配列の中断により減弱化されている。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションは病原性遺伝子の発現を中断させるか，または病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる。ある態様においては，病原性遺伝子のすべてまたは一部が欠失している。ある態様においては，病原性遺伝子のいずれも欠失していない。ある態様においては，インテグレーションはＬｉｓｔｅｒｉａを減弱化させる。ある態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ依存性である。別の態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ非依存性である。ある態様においては，病原性遺伝子は細菌の成長または拡散に必要である。ある態様においては，病原性遺伝子は細菌の成長および拡散に必要ではない。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるかまたはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原はメソセリン（例えば，ヒトメソセリン）であるかまたはメソセリンに由来する。ある態様においては，核酸は改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。ある態様においては，細菌は第２の病原性遺伝子中にインテグレートされている第２の異種抗原をコードする第２の核酸を含む。本発明はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンを提供する。本発明はさらに，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
さらに別の観点においては，本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，減弱化細菌）を製造する方法を提供し，この方法は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌のゲノムの病原性遺伝子中にポリヌクレオチドをインテグレートさせることを含み，ここで，ポリヌクレオチドは異種抗原をコードする核酸を含む。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａは病原性遺伝子の発現を中断させるかまたは病原性遺伝子のコーディング配列を中断させることにより減弱化されている。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションは病原性遺伝子の発現を中断させるか，または病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションにより，（ａ）と（ｂ）の両方が生ずる。ある態様においては，この方法は，ワクチンにおいて用いるためのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を製造する。ある態様においては，ポリヌクレオチドは相同組換えにより病原性遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドは部位特異的組換えによりインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションの間に病原性遺伝子のすべてまたは一部が欠失する。別の態様においては，インテグレーションの間に病原性遺伝子のいずれも欠失しない。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるかまたはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原はメソセリン（例えば，ヒトメソセリン）であるか，またはメソセリンに由来する。ある態様においては，核酸は改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。本発明はさらに，この方法により製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，およびこの細菌を含むワクチン組成物を提供する。本発明はまた，この方法により製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の特性を有するＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，ならびにこの細菌を含むワクチンを提供する。有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を投与することを含む，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法も提供される。
別の観点においては，本発明は，ゲノムを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し，ゲノムは，異種抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み，核酸は成長または拡散を媒介するのに必要な遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションにより，Ｌｉｓｔｅｒｉａは成長または拡散について減弱化される。ある態様においては，遺伝子の一部または全部が欠失している。ある態様においては，いずれの遺伝子も欠失していない。ある態様においては，遺伝子はａｃｔＡである。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるか，またはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原はメソセリン（例えば，ヒトメソセリン）であるか，またはメソセリンに由来する。ある態様においては，核酸は改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンを提供する。本発明はさらに，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
さらに別の観点においては，本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，減弱化細菌）を製造する方法を提供し，この方法は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌のゲノム中の成長または拡散を媒介するのに必要な遺伝子中にポリヌクレオチドをインテグレートさせることを含み，ポリヌクレオチドは異種抗原をコードする核酸を含む。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションによりＬｉｓｔｅｒｉａは成長または拡散について減弱化される。ある態様においては，この方法は，ワクチンにおいて用いるためのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を製造する。ある態様においては，ポリヌクレオチドは相同組換えにより遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドは部位特異的組換えによりインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションの間に，成長または拡散を媒介するのに必要な遺伝子の全部または一部が欠失する。別の態様においては，インテグレーションの間にいずれの遺伝子も欠失しない。ある態様においては，成長または拡散を媒介するのに必要な遺伝子はａｃｔＡである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるか，またはこれらに由来する。ある態様においては，異種抗原は，メソセリン（例えば，ヒトメソセリン）であるか，またはメソセリンに由来する。ある態様においては，核酸は改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。本発明はさらに，この方法により製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，および細菌を含むワクチン組成物を提供する。本発明はまた，この方法により製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の特性を有するＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，ならびに細菌を含むワクチンを提供する。有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を投与することを含む，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法も提供される。
さらに別の観点においては，本発明は，ゲノムを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し，ここで，ゲノムは，異種抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み，ここで，核酸は，ゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされており，細菌は，病原性遺伝子の発現の中断または病原性遺伝子のコーディング配列の中断により減弱化されている。ある態様においては，病原性遺伝子の全部または一部が欠失している。ある態様においては，いずれの病原性遺伝子も欠失していない。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるかまたはこれらに由来する。ある態様においては，細菌はさらに第２の病原性遺伝子中にインテグレートされた第２の異種抗原をコードする第２の核酸を含む。ある態様においては，核酸は改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。さらに，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンが提供され，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答刺激する方法も提供される。この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
さらに別の観点においては，本発明は，ワクチンにおいて用いるためのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を製造する方法を提供し，この方法は，ポリヌクレオチドをＬｉｓｔｅｒｉａ細菌のゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートさせることを含み，ここで，ポリヌクレオチドは異種抗原をコードする核酸を含み，細菌は病原性遺伝子の発現の中断または病原性遺伝子のコーディング配列の中断により減弱化されている。ある態様においては，ポリヌクレオチドは相同組換えにより病原性遺伝子中にインテグレートされている。ある態様においては，ポリヌクレオチドの病原性遺伝子中へのインテグレーションの間に，病原性遺伝子の全部または一部が欠失する。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。本発明はさらに，この方法により製造されたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。
別の観点においては，本発明はワクチンにおいて用いるためのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を製造する方法を提供し，この方法は，ポリヌクレオチドをＬｉｓｔｅｒｉａ細菌のゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートさせることを含み，ここで，ポリヌクレオチドは異種抗原をコードする核酸を含み，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は病原性遺伝子の変異により減弱化されるかまたは減弱化されている。本発明はさらに，この方法により製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞から細胞への拡散，および／または非食細胞中への侵入に関して減弱化されている。例えば，ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢ中に減弱化変異を含む。上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，異種抗原を含む融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび／または核酸は，ゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされている。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，異種抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（例えば，ヒトＰＳＣＡ）または，ＰＳＣＡに由来する抗原である。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，異種抗原はメソセリンまたはメソセリンに由来する抗原である。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，ポリヌクレオチドは２つの核酸配列を含み，このそれぞれは，異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。さらに別の態様においては，ポリヌクレオチドは３つの核酸を含み，このそれぞれは異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。ある態様においては，ポリヌクレオチドは４つまたはそれ上の核酸を含み，このそれぞれは異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。
別の観点においては，本発明はゲノムを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し，ここで，ゲノムは，（ａ）第１の異種抗原をコードする第１の核酸を含む第１のポリヌクレオチド，および（ｂ）第２の異種抗原をコードする第２の核酸を含む第２のポリヌクレオチドを含み，ここで，第１のポリヌクレオチドはゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされており，ポリヌクレオチドは異種抗原をコードする核酸を含み，第２のポリヌクレオチドはゲノム中にインテグレートされている。ある態様においては，細菌は，病原性遺伝子の発現の中断により，または病原性遺伝子のコーディング配列の中断により減弱化されている。ある態様においては，第１のポリヌクレオチドのインテグレーションは，病原性遺伝子の発現を中断させるか，または病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる。ある態様においては，病原性遺伝子の全部または一部が欠失している。別のある態様においては，いずれの病原性遺伝子も欠失していない。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。ある態様においては，第１の異種抗原および第２の異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるか，またはこれらに由来する。ある態様においては，第１の異種抗原および／または第２の異種抗原は，メソセリン，メソセリンに由来する抗原，ＰＳＣＡ，またはＰＳＣＡに由来する抗原である（例えば，第１の異種抗原はメソセリンであってもよく，第２の異種抗原はＰＳＣＡであってもよい）。ある態様においては，第２のポリヌクレオチドは，ゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされており，Ｌｉｓｔｅｒｉａは病原性遺伝子の発現の中断または病原性遺伝子のコーディング配列の中断により減弱化されていてもよい。ある態様においては，第２のポリヌクレオチドはａｃｔＡまたはｉｎｌＢ内にインテグレートされている。ある態様においては，第２のポリヌクレオチドはゲノムの病原性遺伝子を含まない領域にインテグレートされている。ある態様においては，第２のポリヌクレオチドはｔＲＮＡArg座にインテグレートされている。ある態様においては，第１の核酸および／または第２の核酸は，改変型ＡｃｔＡ（例えば，ＡｃｔＡ−Ｎ１００）および第１の異種抗原または第２の異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。ある態様においては，第１の核酸および／または第２の核酸は，シグナル配列および第１の異種抗原または第２の異種抗原を含む融合蛋白質をコードし，ここで，シグナル配列は，ＡｃｔＡシグナル配列，ｐ６０シグナル配列，ＬＬＯシグナル配列，ＢａＰａシグナル配列，Ｌｌｕｓｐ４５シグナル配列，またはＰｈｏＤシグナル配列である。さらに，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンも提供される。有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法も提供される。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムはさらに第３の異種抗原をコードする第３の核酸を含む第３のポリヌクレオチドを含み，第３のポリヌクレオチドはゲノム中にインテグレートされている。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，ゲノムの領域にインテグレートされている，異種抗原または異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは，さらに，一旦インテグレートした後に核酸の発現に必要なプロモーターおよび／または他の制御配列を含む。別のある態様においては，異種抗原または異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは，核酸がＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中にすでに存在するプロモーターおよび／または分泌シグナルと動作可能なように連結されるように，ゲノムの領域にインテグレートされている。ある態様においては，病原性遺伝子中に挿入されているポリヌクレオチドはコーディング領域に挿入されている。別のある態様においては，ポリヌクレオチドは病原性遺伝子の非コーディング領域に挿入されている。
上述の観点ならびに本明細書に記載される他の観点のそれぞれのある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中にインテグレートされているポリヌクレオチドは，相同組換えによりインテグレートされたものである。別のある態様においては，ポリヌクレオチドは，部位特異的インテグレーションによりＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中にインテグレートされている。
ある態様においては，本発明は，ヒトメソセリンまたはその誘導体をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである融合蛋白質パートナーをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。第１の核酸は，例えば，ＬＬＯ６２（非コドン最適化）；ＬＬＯ２６（コドン最適化）；ＬＬＯ４４１（非コドン最適化）；ＬＬＯ４４１（コドン最適化）；全長ＬＬＯ（非コドン最適化）；全長ＬＬＯ（コドン最適化）；ＢａＰＡ分泌配列；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｏＤ分泌配列（ＢｓｐｈｏＤＳＳ）；ｐ６０（非コドン最適化）；ｐ６０（コドン最適化）；ａｃｔＡ（非コドン最適化）；ａｃｔＡ（コドン最適化）；ａｃｔＡ−Ｎ１００（非コドン最適化）；ａｃｔＡ−Ｎ１００（コドン最適化）；ａｃｔＡ（Ａ３０Ｒ）をコードすることができる。第２の核酸は，全長ヒトメソセリン；そのシグナル配列に欠失を有するヒトメソセリン；ＧＰＩアンカーに欠失を有するヒトメソセリン；またはシグナル配列およびＧＰＩアンカーの両方に欠失を有するヒトメソセリンをコードすることができ，ここで，メソセリンのコドン最適化版および非コドン最適化版が提供される。別の観点においては，本発明は，ｉｎｌＢ遺伝子，ａｃｔＡ遺伝子，ｈｌｙ遺伝子の位置にインテグレートされた上述のポリヌクレオチドを提供し，ここで，インテグレーションは相同組換えにより媒介されることができ，インテグレーションは，任意に，ｉｎｌＢ，ａｃｔＡ，またはｈｌｙ遺伝子のプロモーターとの動作可能な連結と伴うことができる。さらに別の観点においては，本発明は，上述のポリヌクレオチドが，リステリアのゲノム中に部位特異的インテグレーションにより，例えばｔＲＮＡArg部位にインテグレートされている，リステリアの態様を提供する。本明細書に記載される個々の態様のそれぞれは，任意に，構成的に活性なｐｆｒＡ遺伝子（ｐｒｆＡ＊）を含むＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。リステリアコンストラクトは，ａｃｔＡプロモーターまたはｈｌｙプロモーターと動作可能なように連結されているポリヌクレオチドに限定されない。他の細菌プロモーター，合成プロモーター，細菌ウイルスプロモーター，および２またはそれ以上のプロモーターの組み合わせとの動作可能な連結も包含される。
ある態様においては，上述または本明細書に記載されるポリヌクレオチド，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，および／またはワクチン中の核酸によりコードされる異種抗原は，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドを含まない。ある態様においては，ポリヌクレオチド，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，および／またはワクチン中の核酸によりコードされる異種抗原は全長ＥｐｈＡ２またはその抗原性フラグメント，類似体または誘導体を含まない。
図面の簡単な説明
図１は６０５５ｂｐのプラスミドであるｐＩＮＴを示す。一旦ｐＩＮＴがリステリアのゲノム中にインテグレートされると，Ｌｉｓｔｅｒｉａはエリスロマイシン耐性（ＥｒｍＣ）により単離することができ，次に，Ｃｒｅリコンビナーゼで処理して，抗生物質耐性遺伝子（ＣＡＴおよびＥｒｍＣ）をコードするプラスミドの領域を除去する。
図２は，相同組換えを媒介する７０９６プラスミドであるｐＫＳＶ７を示す。
図３は，細菌のゲノム中へのｐＫＳＶ７媒介性相同組換えの工程ないし中間体を示す。
図４は，相同アームを有する挿入物を製造する方法を示し，相同アームを有する挿入物はｐＫＳＶ７中に配置される。ｌｏｘＰにより挟まれた領域は相同アームによりひとまとめにされている。細菌のゲノム中へのインテグレーションの後，Ｃｒｅリコンビナーゼに過渡的に暴露して，抗生物質耐性遺伝子の除去を触媒する。インテグレーションにより，相同アームとマッチした区域の間の領域に対応するゲノムの一部の欠失が生ずる。
図５は相同アームを有する挿入物を製造する別の方法を示し，ここで，相同アームを有する挿入物はｐＫＳＶ７中に配置される。ｌｏｘＰにより挟まれた領域は相同アームの外側に位置する。細菌のゲノム中にインテグレーションした後，Ｃｒｅリコンビナーゼに過渡的に暴露すると，抗生物質耐性遺伝子（または他の選択マーカー）の除去が触媒される。インテグレーションは，ゲノムの一部の相同アームとマッチする区域の間の対応する領域の欠失とともに生ずる。
図６は，相同アームを有する挿入物の製造を示し，ここで，相同アームを有する挿入物は，ｐＫＳＶ７中に配置される。ｌｏｘＰに挟まれた領域は，相同アームの間に位置する。この図面にしたがって製造したベクターにおいては，インテグレーションの後に，ゲノムの対応する領域の欠失は生じない。
図７は，例えば，プロモーター，分泌配列，融合蛋白質パートナー等を有する本発明のいくつかのメソセリンコンストラクトの概要である。
図８は，種々のリステリアコンストラクトからのメソセリンの発現を示すゲルである。
図９は，多数のリステリアコンストラクトからのメソセリンの発現を示すゲルである。
図１０−１２は，スポット形成細胞（ＳＦＣ）アッセイからのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ ｇａｍｍａ）の発現を示し，種々の数（コロニー形成ユニット；ｃ．ｆ．ｕ．）の遺伝子工学操作されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを用いてワクチン接種したマウスの免疫応答を比較したものである。
図１３は，腫瘍担持マウスを種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物で処置した後の肝臓の表面における腫瘍転移の数を示す。図１３は生データを示す（固定した肝臓の写真）。
図１４も，腫瘍担持マウスを種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物で処置した後の肝臓の表面における腫瘍転移の数を示す。
図１５Ａ−Ｇはさらに，腫瘍担持マウスを組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで処置した後の，肝臓表面上の腫瘍転移の数を示す。
図１６は種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物で処理した腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存の増加を示す。
図１７はメソセリンコンストラクトおよび種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物によるメソセリンの分泌を示す。
図１８は種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。
図１９は種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。
図２０はさらに，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの発現および免疫応答を示す。
図２１はさらに，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。
図２２は種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの発現および免疫応答を示す。
図２３は種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物でワクチン接種することにより刺激された免疫応答を示す。
図２４はさらに，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。
図２５は多数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物でワクチン接種した後に刺激された免疫応答を示す。
図２６はさらに，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。ｈＭｅｓｏ６：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ，ａｃｔＡプロモーターをコード；ａｃｔＡ−Ｎ１００−ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ；ａｃｔＡ座にインテグレート。ｈＭｅｓｏ２５：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ，ａｃｔＡプロモーターをコード；ａｃｔＡ−Ｎ１００−ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ；ｉｎｌＢ座にインテグレート。
図２７はさらに，メソセリンの分泌および種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激された免疫応答を示す。
図２８は固定した肺の写真を示す。
図２９は固定した肺の写真からのデータのヒストグラムを示す。
図３０は腫瘍担持マウスの生存の改良における種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物の効力を示す。
図３１はメソセリンの分泌および種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激された免疫応答を示す。
図３２は種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物からのメソセリン発現の比較を示す。
図３３は，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種した後のメソセリン分泌および刺激された免疫応答を示す。
図３４は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの調製物で種々の用量でワクチン接種した後に刺激された免疫応答を示す。
図３５Ａおよび３５Ｂは，腫瘍担持マウスを組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの種々の調製物で処置した後の，肝臓上の腫瘍転移の数を示す。図３５Ａは生データ（固定した肝臓の写真）を示す。
図３６は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物が腫瘍担持マウスの生存を改善する有効性を示す。
図３７は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の免疫応答を示し，ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を比較したものである。
図３８は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存を示す。
図３９はさらに，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存を示す。
図４０は，本発明のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す（Ｕ１５３ｉｎｔ：配列番号１；ｌｉｎ１２３１：配列番号２）。
図４１は，本発明のさらに別のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す（ＰＳＡｉｎｔ：配列番号３；ｌｉｎ００７１：配列番号４）。
図４２は，本発明のさらに別のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す（ＰＳＡｉｎｔ：配列番号５；ｌｉｎ１７６５：配列番号６）。
図４３は，本発明のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す（ＰＳＡｉｎｔ：配列番号７；ｌｉｎ２６０１：配列番号８）。
図４４は，本発明の追加のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼをコードする核酸とのアラインメントを示す（ＰＳＡｉｎｔ：配列番号１１９；ｌｍｏｆ６８５４＿２７０３：配列番号１２０）。
図４５Ａおよび４５Ｂは，ｐＩＮＴ−ＡｃｔＡＮ１００−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ，すなわち，ｐＩＮＴ（図１）に基づくＡｃｔＡプロモーター，ａｃｔＡ−Ｎ１００およびＳＩＩＮＦＥＫＬ配列を含む６５９４ｂｐのプラスミドを示す。図４５Ｂは，ｐＩＮＴ−ＡｃｔＡＮ１００−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのクローニング領域を示す（核酸配列は配列番号１５０であり，ペプチド配列は配列番号１５１である）。
図４６は，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ重層を有するＰＳＣＡ分子コンストラクトの概略図を示す。
図４７Ａは，樹状細胞によるレポーター細胞株Ｂ３Ｚに対するペプチドの提示の結果を示す。図４７Ｂは，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質のＪ７７４細胞における発現および分泌のウエスタンブロット分析である。
図４８は，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種後に刺激された免疫応答を示す。
図４９Ａおよび４９Ｂは，２つの異なるヒト腫瘍抗原を発現する２価ワクチン株を示す。図４９Ａは，インテグレートされたコンストラクトによりコードされる融合分子を示す。図４９Ｂは，１価または２価のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンでＪ７７４細胞を感染させた後のＡｃｔＡ融合蛋白質の発現および分泌を示す。
図５０は，１価または２価の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンでワクチン接種後に刺激された免疫応答を示す。
発明の詳細な説明
本明細書ならびに添付の特許請求の範囲において用いる場合，単語の単数形，例えば，“ａ”，“ａｎ”および“ｔｈｅ”は，文脈が明らかにそうではないことを示していない限り，その対応する複数形も含む。本明細書に引用されるすべての参考文献は，各個別の刊行物，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号によりアクセスされる配列，特許出願，特許，配列表，配列表中のヌクレオチドまたはオリゴペプチドまたはポリペプチド配列，ならびに前記刊行物および特許書類中の図面が特定的にかつ個別に引用により本明細書に取り込まれると示されていることと同じ程度で，引用により本明細書に取り込まれる。“本発明”との用語は，本発明のある種の態様または本発明のいくつかの態様を表す。特に記載しない限り，“本発明”との用語は必ずしも本発明のすべての態様を表さない。
Ｉ． 定義
遺伝子中の変異，または遺伝子を含む細菌中の変異を示すために用いられる略号は次のとおりである。一例として，“Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡ”との略号は，ＡｃｔＡ遺伝子の一部または全部が欠失していることを意味する。デルタ記号（Δ）は欠失を意味する。上付のマイナス符号を含む略号（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＡｃｔＡ-）は，ＡｃｔＡ遺伝子が変異されていることを意味し，これは例えば，欠失，点突然変異，またはフレームシフト変異によるが，これらのタイプの変異に限定されない。指数が短縮されている場合，例えば，“３ｅ７”は３ｘ１０7を意味する。
“投与”とは，ヒト，哺乳動物，哺乳動物被験体，動物，獣医学的被験体，プラセボ被験者，研究対象，実験対象，細胞，組織，臓器，または生物学的液体に適用される場合，限定されないが，外的リガンド，試薬，プラセボ，小分子，薬剤，治療剤，診断剤，または組成物を被験者，細胞，組織，臓器または生物学的液体等と接触させることを表す。“投与”は，例えば，治療，薬物動態，診断，研究，プラセボ，および実験方法を表すことができる。細胞の処置は，試薬を細胞と接触させること，ならびに液体が細胞と接触している場合に試薬を液体と接触させることを包含する。“投与”はまた，例えば細胞を試薬，診断，結合組成物，または別の細胞でインビトロおよびエクスビボ処置することを包含する。
リガンドおよびレセプターに関連する場合，“アゴニスト”とは，レセプターを刺激する分子，分子の組み合わせ，複合体，または試薬の組み合わせを含む。例えば，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストは，ＧＭ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦの変異体または誘導体，ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣物，ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子，またはＧＭ−ＣＳＦレセプターを刺激する抗体を包含することができる。アンタゴニストとは，リガンドおよびレセプターに関連する場合，レセプターを阻害するか，対抗するか，ダウンレギュレーションするか，および／または脱感作する分子，分子の組み合わせ，または複合体を含む。“アンタゴニスト”は，レセプターの構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性とは，リガンド／レセプター相互作用の非存在下で現れる活性である。“アンタゴニスト”はまた，レセプターの刺激された（または制御された）活性を阻害または妨害する任意の試薬を包含する。一例として，ＧＭ−ＣＳＦレセプターのアンタゴニストとしては，限定を示唆するものではないが，リガンド（ＧＭ−ＣＳＦ）に結合し，これがレセプターに結合することを防止する抗体，またはレセプターに結合しリガンドがレセプターに結合することを防止する抗体，または，抗体がレセプターを不活性なコンフォメーションでロックする場合が挙げられる。
本明細書において用いる場合，ＥｐｈＡ２ポリペプチド（またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメント）との文脈において“類似体”とは，ＥｐｈＡ２ポリペプチド（またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメント）と類似のまたは同一の機能を有するが，必ずしもＥｐｈＡ２ポリペプチド（またはフラグメント）と類似のまたは同一のアミノ酸配列または構造を含まなくてもよい蛋白性物質（例えば，ペプチド，ポリペプチドまたは蛋白質）を表す。ＥｐｈＡ２ポリペプチドと類似のアミノ酸配列を有するＥｐｈＡ２ポリペプチドの類似体とは，以下の少なくとも１つを満たす蛋白性物質を表す：（ａ）ＥｐｈＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも３０％，少なくとも３５％，少なくとも４０％，少なくとも４５％，少なくとも５０％，少なくとも５５％，少なくとも６０％，少なくとも６５％，少なくとも７０％，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する蛋白性物質；（ｂ）ＥｐｈＡ２ポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸残基，少なくとも３０アミノ酸残基，少なくとも４０アミノ酸残基，少なくとも５０アミノ酸残基，少なくとも６０アミノ酸残基，少なくとも７０アミノ酸残基，少なくとも８０アミノ酸残基，少なくとも９０アミノ酸残基，少なくとも１００アミノ酸残基，少なくとも１２５アミノ酸残基，または少なくとも１５０アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる蛋白性物質；および（ｃ）ＥｐｈＡ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％，少なくとも３５％，少なくとも４０％，少なくとも４５％，少なくとも５０％，少なくとも５５％，少なくとも６０％，少なくとも６５％，少なくとも７０％，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる蛋白性物質。ＥｐｈＡ２ポリペプチドと類似する構造を有する蛋白性物質とはＥｐｈＡ２ポリペプチドと類似する二次，三次または四次構造を有する蛋白性物質を表す。
“抗原提示細胞”（ＡＰＣ）とは，抗原をＴ細胞に提示するために使用される免疫系の細胞である。ＡＰＣには，樹状細胞，単球，マクロファージ，辺縁帯クッパー細胞，小グリア細胞，ランゲルハンス細胞，Ｔ細胞，およびＢ細胞が含まれる（例えば，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｉｎｔｏ ａｎｄ Ｍｏｒｅｎｏ（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０９７−１１０５を参照）。樹状細胞は少なくとも２つのリニアージで生ずる。第１のリニアージは，ｐｒｅ−ＤＣ１，骨髄ＤＣ１，および成熟ＤＣ１を包含する。第２のリニアージは，ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ-初期前駆多能性細胞，ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ+細胞，ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ++ＣＤ４+ＩＬ−３Ｒａｌｐｈａ++ｐｒｏ−ＤＣ２細胞，ＣＤ４+ＣＤ１１ｃ-形質細胞様ｐｒｅ−ＤＣ２細胞，リンパ球様ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２，および成熟ＤＣ２を包含する（例えば，Ｇｉｌｌｉｅｔ ａｎｄ Ｌｉｕ（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：６９５−７０４；Ｂａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０００−５００７；Ａｒｐｉｎａｔｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２４８４−２４９０；Ｋａｄｏｗａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９；Ｌｉｕ（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６３：１０６７−１０７１；ＭｃＫｅｎｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１７−２７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：２２３５−２２４６；Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１３７３−１３８１；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｐａｌｕｃｋａ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６を参照）。
“減弱化”および“減弱化された”とは，宿主に対する毒性が低下するよう改変されている細菌，ウイルス，寄生虫，感染性生物，プリオン，腫瘍細胞，感染性生物中の遺伝子等を包含する。宿主はヒトまたは動物宿主，または臓器，組織，または細胞であってもよい。非限定的例として，細菌を減弱化させて，宿主細胞への結合を低下させ，１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を低下させ，細胞外成長を低下させ，または宿主細胞における細胞内成長を低下させることができる。減弱化は，例えば，毒性の１またはそれ以上の兆候，ＬＤ50，臓器からのクリアランスの速度，または競合指数を測定することにより評価することができる（例えば，Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３−５９５７を参照）。一般に，減弱化の結果として，ＬＤ50および／またはクリアランスの速度の増加は，少なくとも２５％；より一般には少なくとも５０％；最も一般には少なくとも１００％（２倍）；普通は少なくとも５倍；より普通には少なくとも１０倍；最も普通には少なくとも５０倍；頻繁には少なくとも１００倍；より頻繁には少なくとも５００倍；最も頻繁には少なくとも１０００倍；通常は少なくとも５０００倍；より通常は少なくとも１０，０００倍；最も通常は少なくとも５０，０００倍；最も頻繁には少なくとも１００，０００倍である。
“減弱化された遺伝子”は，宿主に対する毒性，病変性，または病原性，宿主の成長，または宿主の生存を媒介する遺伝子を包含し，ここで，遺伝子は，毒性，病変性または病原性を軽減するか，低下させるか，または排除するよう変異されている。低下または排除は，変異した遺伝子により媒介される病原性または毒性を，非変異（または親）遺伝子により媒介されるものと比較することにより評価することができる。“変異した遺伝子”とは，遺伝子の制御領域，遺伝子のコーディング領域，遺伝子の非コーディング領域，またはこれらの任意の組み合わせにおける欠失，点突然変異，およびフレームシフト変異を包含する。
“癌性状態”および“癌性疾患”とは，限定を示唆するものではないが，癌，腫瘍，転移，腫瘍の血管新生および異形成等の前癌性疾患を包含する。
“保存的に改変された変種”は，アミノ酸と核酸配列との両方に適用される。特定の核酸配列に関する場合，保存的に改変された変種とは，同一のアミノ酸配列，または１またはそれ以上の保存的置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸を表す。保存的置換の例は，以下の群の１つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸で交換することである（米国特許５，７６７，０６３，Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．；Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）。
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ，Ｍｅｔ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ；および
（７）小アミノ酸：Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ
ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントの文脈において，“誘導体”とは，アミノ酸残基の置換，欠失または付加（すなわち変異）の導入により変更されているＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントのアミノ酸配列を含む蛋白性物質を表す。ＥｐｈＡ２蛋白性物質の文脈において，“誘導体”との用語はまた，あらゆるタイプの分子のポリペプチドへの共有結合的付加により改変されているＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントを表す。例えば，限定されないが，ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントは，例えば，グリコシル化，アセチル化，ＰＥＧ化，リン酸化，アミド化，既知の保護／ブロッキング基による誘導化，蛋白質分解性切断，細胞性リガンドまたは他の蛋白質への連結等により改変することができる。ＥｐｈＡ２ポリペプチドの誘導体またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントは，当業者に知られる技術，例えば，限定されないが，特異的化学切断，アセチル化，ホルミル化，ツニカマイシンの代謝的合成等を用いる化学的改変により改変することができる。さらに，ＥｐｈＡ２ポリペプチドの誘導体またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントは，１またはそれ以上の非伝統的なアミノ酸を含んでいてもよい。１つの態様においては，ポリペプチド誘導体は，本明細書に記載されるＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントと類似のまたは同一の機能を有する。別の態様においては，ＥｐｈＡ２ポリペプチドの誘導体またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントは，変更されていないポリペプチドと比較して変更された活性を有する。例えば，ＥｐｈＡ２ポリペプチドの誘導体またはそのフラグメントは，ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントとはリン酸化が異なっていてもよい。
“有効量”は，限定されないが，病状または疾患の症状または兆候を軽減させ，快復せ，和らげ，予防し，または診断することができる量を包含する。明示的にまたは文脈からそうではないと記載しない限り，“有効量”は，病状を軽減するのに十分な最少量に限定されない。
“ＥｐｈＡ２抗原性ペプチド”（場合により“ＥｐｈＡ２抗原性ポリペプチド”とも称される）は，米国特許公開２００５／０２８１７８３Ａ１（その中に含まれるすべての配列も含めてその全体が参照として本明細書に取り込まれる）において定義され記載されている。ＥｐｈＡ２は成人上皮で発現されている１３０ｋＤａのレセプターチロシンキナーゼである（Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １０：６２９；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６３１６）。“ＥｐｈＡ２抗原性ペプチド”または“ＥｐｈＡ２抗原性ポリペプチド”とは，ＥｐｈＡ２ポリペプチド，またはＥｐｈＡ２の１またはそれ以上のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含むそのフラグメント，類似体または誘導体を表す。ＥｐｈＡ２ポリペプチドはいかなる種に由来するものであってもよい。例えば，ＥｐｈＡ２ポリペプチドはヒトＥｐｈＡ２ポリペプチドであってもよい。“ＥｐｈＡ２ポリペプチド”との用語は，成熟したプロセシングされた形のＥｐｈＡ２，ならびに未成熟形のＥｐｈＡ２を含む。ある態様においては，ＥｐｈＡ２ポリペプチドは，米国特許公開２００５／０２８１７８３Ａ１の配列番号２として示される配列である。ヒトＥｐｈＡ２のヌクレオチド配列の例は，ＧｅｎＢａｎｋデータベース（例えば，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＢＣ０３７１６６，Ｍ５９３７１およびＭ３６３９５を参照）に見いだすことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の例はまた，ＧｅｎＢａｎｋデータベース（例えば，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００４４２２，ＡＡＨ３７１６６，およびＡＡＡ５３３７５を参照）にも見いだすことができる。ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の別の例としては，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０３４２６９（マウス），ＡＡＨ０６９５４（マウス），ＸＰ＿３４５５９７（ｒａｔ），およびＢＡＢ６３９１０（トリ）として挙げられるものが含まれる。
“細胞外液体”とは，例えば，血清，血漿，血液，間質液，脳脊髄液，分泌された液体，リンパ液，胆汁，汗，糞便および尿を包含する。Ａｎ“細胞外液体”は，コロイドまたは懸濁液，例えば，全血または凝固した血液を含むことができる。
ＥｐｈＡ２ポリペプチドの文脈において，“フラグメント”との用語は，ＥｐｈＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基，少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基，少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基，少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基，少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基，または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むＥｐｈＡ２抗原性ペプチドまたはポリペプチドを含む。
“遺伝子”とは，オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を表す。オリゴペプチドまたはポリペプチドは，生物学的に活性であってもよく，抗原性的に活性であってもよく，生物学的に不活性であってもよく，または抗原性的に不活性であってもよい。遺伝子との用語は，例えば，特定のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の総和；ＯＲＦおよびイントロンをコードする核酸の総和；ＯＲＦおよび動作可能なように連結されたプロモーターの総和；ＯＲＦおよび動作可能なように連結されたプロモーターおよびイントロンの総和；ＯＲＦおよび動作可能なように連結されたプロモーター，イントロン，およびプロモーター，および他の制御要素，例えばエンハンサーの総和を包含する。ある態様においては，“遺伝子"は，遺伝子の発現を制御するためにシスで必要とされる任意の配列を包含する。遺伝子との用語はまた，抗原または，ペプチド，オリゴペプチド，ポリペプチド，または蛋白質の抗原性的に活性なフラグメントを包含するペプチドをコードする核酸を表す。遺伝子との用語は，必ずしもコードされるペプチドまたは蛋白質が何らかの生物学的活性を有すること，またはペプチドまたは蛋白質が抗原性的に活性であることを示唆しなくてもよい。発現できない配列をコードする核酸配列は一般に偽遺伝子と考えられる。遺伝子との用語はまた，リボ核酸，例えばｒＲＮＡ，ｔＲＮＡまたはリボザイムをコードする核酸配列を包含する。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の“成長”は，限定されないが，細菌生理学の機能，およびコロニー形成，複製，リステリアの蛋白質含有量の増加，リステリアの脂質含有量の増加に関連する遺伝子を包含する。明示的にまたは文脈によりそうではないと特に示さない限り，Ｌｉｓｔｅｒｉａの成長は，宿主細胞の外での細菌の成長，および宿主細胞の中での成長を包含する。成長関連遺伝子としては，限定を示唆するものではないが，エネルギー生成（例えば，解糖，クレブス回路，シトクロム），アミノ酸，糖，脂質，無機質，プリン，およびピリミジンの同化および／または異化，栄養輸送，転写，翻訳，および／または複製を媒介するものが挙げられる。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の“成長”は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の細胞内成長，すなわち，哺乳動物細胞等の宿主細胞の内部における成長を表す。Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の細胞内成長は，光学顕微鏡またはコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイにより測定することができるが，成長は測定のいかなる手法にも限定されない。リステリア抗原，リステリア核酸配列，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に特異的な脂質の量等の生化学的パラメータを用いて成長を評価することができる。ある態様においては，成長を媒介する遺伝子は細胞内成長を特異的に媒介するものである。ある態様においては，細胞内成長を特異的に媒介する遺伝子は，限定されないが，遺伝子の不活性化が細胞内成長の速度を低下させるが，検出可能なように，実質的にまたは認めうるほどに細胞外成長（例えば，肉汁培地における成長）の速度を低下させない遺伝子，または遺伝子の不活性化が細胞内成長の速度を細胞外成長の速度を低下させるより大きく低下させる遺伝子を包含する。非限定的例として，ある態様においては，その不活性化が細胞内成長の速度を細胞外成長より大きく低下させる遺伝子としては，その不活性化が細胞内成長を通常のまたは最大値の５０％未満低下させるが，細胞外成長を最大値の１−５％，５−１０％，または１０−１５％しか低下させない状況が含まれる。ある観点においては，本発明は，細胞内成長について減弱化されているが，細胞外成長については減弱化されていないＬｉｓｔｅｒｉａ，細胞内成長について減弱化されておらず，細胞外成長について減弱化されていないＬｉｓｔｅｒｉａ，ならびに細胞内成長については減弱化されていないが細胞外成長については減弱化されているＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。
“免疫状態”または“免疫疾患”とは，免疫系の無効な，不適当な，または病的な応答から生ずる疾患，状態，症候群，または疾病を包含し，例えば，持続的感染または持続的癌を含む（例えば，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８４：２２３−２４３を参照）。“免疫状態”または“免疫疾患”は，例えば，病的炎症，炎症性疾患，および自己免疫疾患または疾病を包含する。“免疫状態”または“免疫疾患”はまた，感染，持続邸感染，癌，腫瘍，前癌性疾患，免疫系により根絶されずに対抗する癌，および腫瘍の血管新生を表すことができる。“免疫状態”または“免疫疾患”はまた，感染体により誘導される癌も包含し，これには，非限定的例として，ｙＢ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，サルウイルス４０（ＳＶ４０），エプスタイン−バーウイルス，パピローマウイルス，ポリオーマウイルス，カポジ肉腫ヘルペスウイルス，ヒトＴ−細胞白血病ウイルス，およびヘリコバクターピロリにより誘導される癌が含まれる（例えば，Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ４：７５７−７６８；Ｐａｇａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１４：４５３−４７１；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５：２６２−２７１を参照）。
“標識”されている組成物は，分光光学，光化学，生化学，免疫化学，同位体，または化学的方法により直接または間接的に検出することができる。たとえは，有用な標識としては，３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，１４Ｃ，３Ｈ，１２５Ｉ，安定同位体，エピトープタグ，蛍光染料，高電子密度試薬，基質，または酵素，例えば酵素結合イムノアッセイにおいて用いられるもの，または蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｔｔｅｓ）が挙げられる（例えば，Ｒｏｚｉｎｏｖ ａｎｄ Ｎｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照）。
“リガンド”とは，レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストである，小分子，ペプチド，ポリペプチド，または膜会合または膜結合分子を表す。“リガンド”はまた，アゴニストまたはアンタゴニストではなく，アゴニストまたはアンタゴニストの特性を有しない結合剤も包含する。便宜的には，リガンドが第１の細胞の膜に結合性である場合，レセプターは通常は第２の細胞上に生ずる。第２の細胞は第１の細胞と同じ種類（同じ名前）を有していてもよく，または異なる種類（異なる名前）を有していてもよい。リガンドまたはレセプターは完全に細胞内であってもよく，すなわち，サイトゾル，核，または別の細胞内コンパートメントに存在していてもよい。リガンドまたはレセプターは，例えば，細胞内コンパートメントから原形質膜の外表面にその位置を変えてもよい。リガンドとレセプターとの複合体は，“リガンドレセプター複合体”と称される。リガンドおよびレセプターがシグナリング経路に関与する場合，リガンドはシグナリング経路の上流の位置で生じ，レセプターは下流の位置で生ずる。
“核酸”とは，一本鎖，二本鎖形，または多鎖形のいずれかの形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらの重合体を表す。核酸の非限定的例は，例えば，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチド，およびポリヌクレオチドである。特定の核酸配列はまた，“アレル変種”および“スプライシング変種”を黙示的に包含しうる。
プロモーターおよびｍＲＮＡをコードする核酸の文脈において，“動作可能なように連結”とは，プロモーターを用いてその核酸の転写を開始させることができることを意味する。
“パーセント配列同一性”および“％配列同一性”との用語は，２またはそれ以上のアミノ酸または核酸配列の比較またはアライメントにより見いだされる配列類似性のパーセントを表す。パーセント同一性は，配列をアライメントすることによって２つの分子の間の配列情報を直接比較することにより，または２つのアライメントした配列の間のマッチの正確な数を計数し，短い方の配列の長さで割り，その結果に１００を乗ずることにより，判定することができる。パーセント同一性を計算するためのアルゴリズムは，Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムである（例えば，Ｋａｎｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４８：３６７−３７６；Ａｒｓｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：３２７−３３７を参照）。
“前癌性状態”には，限定されないが，異形成，前癌結節；大変性結節（ＭＲＮ）；低度異形成結節（ＬＧ−ＤＮ）；高度異形成結節（ＨＧ−ＤＮ）；胆管上皮異形成；変性肝細胞の病巣（ＦＡＨ）；変性肝細胞の結節（ＮＡＨ）；染色体不均衡；テロメラーゼの異常な活性化；テロメラーゼの触媒サブユニットの再発現；内皮細胞マーカー，例えばＣＤ３１，ＣＤ３４，およびＢＮＨ９の発現が包含される（例えば，Ｔｅｒｒａｃｃｉａｎｏ ａｎｄ Ｔｏｒｎｉｌｌｏ（２００３）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ９５：７１−８２；Ｓｕ ａｎｄ Ｂａｎｎａｓｃｈ（２００３）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：１２６−１３３；Ｒｏｃｋｅｎ ａｎｄ Ｃａｒｌ−ＭｃＧｒａｔｈ（２００１）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１９：２６９−２７８；Ｋｏｔｏｕｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｌｉｖｅｒ２２：５７−６９；Ｆｒａｃｈｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：８５０−８５７；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．７：５４２−５５０；Ｎａｋａｎｕｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．１０：２６５−２８１を参照）。癌および異形成を診断する方法は開示されている（例えば，Ｒｉｅｇｌｅｒ（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．７：７４−８７；Ｂｅｎｖｅｇｎｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｌｉｖｅｒ １２：８０−８３；Ｇｉａｎｎｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３４：９５−９７；Ａｎｔｈｏｎｙ（１９７６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３６：２５７９−２５８３を参照）。
ポリペプチドに関する場合，“精製された”および“単離された”とは，ポリペプチドが天然にこれが関連している他の生物学的高分子が実質的にない状態で存在することを意味する。本明細書において用いる場合，“精製された”との用語は，同定されたポリペプチドが，存在するポリペプチドの，頻繁には少なくとも５０％を占める，より頻繁には少なくとも６０％を占める，典型的には少なくとも７０％を占める，より典型的には少なくとも７５％を占める，最も典型的には少なくとも８０％を占める，通常は少なくとも８５％を占める，より通常は少なくとも９０％を占める，最も通常は少なくとも９５％を占める，慣用的には少なくとも９８重量％またはそれ以上を占めることを意味する。水，バッファ，塩，界面活性剤，還元剤，プロテアーゼ阻害剤，安定剤（アルブミン等の添加された蛋白質を含む），および賦形剤，および１０００未満の分子量を有する分子の重量は，一般にポリペプチドの純度の判定には用いられない。例えば，米国特許６，０９０，６１１，Ｃｏｖａｃｃｉ，ｅｔ ａｌにおける純度の議論を参照。
“ペプチド”とは，アミノ酸の短い配列を表し，ここで，アミノ酸はペプチド結合により互いに連結されている。ペプチドは遊離であっても，別の成分，例えば，高分子，脂質，オリゴ−またはポリサッカライド，および／またはポリペプチド．に結合していてもよい。ペプチドがポリペプチド鎖中に組み込まれている場合，“ペプチド”との用語はなお，アミノ酸の短い配列を特に表すために用いられることがある。“ペプチド”は，ペプチド結合または他の何らかの結合により別の成分に連結されていてもよい。ペプチドは少なくとも２アミノ酸の長さであり，一般に約２５アミノ酸未満の長さであり，ここで，最大の長さは慣習または文脈により異なる。“ペプチド”および“オリゴペプチド”との用語は，互換的に用いることができる。
“蛋白質”とは，一般に，ポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を表す。蛋白質はまた，ポリペプチドの三次構造を表してもよい。“変性された蛋白質”とは，ある程度の三次元構造が残存している部分的に変性されたポリペプチド，あるいは，本質的にランダムな三次元構造，すなわち完全に変性された蛋白質を表す。本発明は，ポリペプチド変種，例えばグリコシル化，リン酸化，硫酸化，ジスルフィド結合形成，脱アミノ化，異性化，シグナルまたはリーダー配列のプロセシングにおける切断点，共有結合的にまたは非共有結合的に結合した補因子，酸化された変種等を含む変種の試薬およびこれを用いる方法を包含する。ジスルフィド結合した蛋白質の形成は，記載されている（例えば，Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ ａｎｄ Ｒａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照）。
“組換え”とは，核酸，細胞，動物，ウイルス，プラスミド，ベクター等に関連して用いる場合，外来の，非天然の核酸，天然の核酸の改変を導入することにより，または組換え核酸，細胞，ウイルス，プラスミド，またはベクターから全体または一部を誘導することにより改変することを表す。組換え蛋白質とは，組換え核酸，ウイルス，プラスミド，ベクター等に由来する蛋白質を表す。“組換え細菌”は，ゲノムが組換え法により，例えば，変異，欠失，挿入，および／または再編成により遺伝子工学操作されている細菌を包含する。“組換え細菌”はまた，組換えゲノム外核酸，例えばプラスミドまたは第２染色体を含むよう改変されている細菌，または現存するゲノム外核酸が変更されている細菌を包含する。
“サンプル”とは，ヒト，動物，プラセボ，または研究サンプルからのサンプル，例えば細胞，組織，臓器，液体，気体，エアロゾル，スラリー，コロイド，または凝集した物質を表す。“サンプル”は，インビボで，例えばヒトまたは動物から除去することなく試験してもよく，またはインビトロで試験してもよい。サンプルは，例えば組織学的方法により加工した後に試験してもよい。“サンプル”はまた，例えば，液体または組織サンプルを含む細胞，または液体または組織サンプルから分離した細胞を表す。“サンプル”はまた，ヒトまたは動物から新たに採取した細胞，組織，臓器，または液体を表してもよく，または加工したまたは保存された細胞，組織，臓器，または液体を表してもよい。
“選択マーカー”は，選択マーカーを含む細胞または含まない細胞を選択うることを可能とする核酸を包含する。選択マーカーの例としては，限定されないが，例えば，（１）さもなくば毒性である化合物に対する耐性を与える産物（例えば，抗生物質）をコードする核酸，またはさもなくば有害な化合物（例えば，ショ糖）に対する感受性をコードする核酸；（２）さもなくばレシピエント細胞において欠失している産物をコードする核酸（例えば，ｔＲＮＡ遺伝子，栄養要求マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸；（４）容易に同定することができる産物をコードする核酸（例えば，表現型マーカー，例えば，ベータ−ガラクトシダーゼ，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ），細胞表面蛋白質，エピトープタグ，ＦＬＡＧタグ）；（５）ハイブリダイゼーション手法，例えば，ＰＣＲまたは分子ビーコンにより同定することができる核酸が挙げられる。
リガンド／レセプター，核酸／相補的核酸，抗体／抗原，または他の結合対（例えば，サイトカインとサイトカインレセプター）に関する場合，“特異的に”または“選択的に”結合するとは，蛋白質および他の生物学的物質の異種集団において蛋白質の存在を判定することができる結合反応を表す。すなわち，設定された条件下で，特定のリガンドは特定のレセプターに結合し，サンプル中に存在する他の蛋白質には有意な量で結合しない。特異的結合はまた，例えば，予定された方法の抗体の抗原結合部位に由来する結合化合物，核酸リガンド，抗体，または結合組成物が，他のいずれかの化合物に対する親和性より，頻繁には少なくとも２５％高い，より頻繁には少なくとも５０％高い，最も頻繁には少なくとも１００％（２倍）高い，普通は少なくとも１０倍高い，より普通には少なくとも２０倍高い，最も普通には少なくとも１００倍高い親和性でその標的に結合することを意味する。
典型的な態様においては，抗体は，例えばスキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）により判定して約１０９Ｌ／ｍｏｌより高い親和性を有する。当業者には，ある種の結合化合物は２以上の標的に特異的に結合することができ，例えば，抗体は，その抗原に，抗体のオリゴサッカライドによりレクチンに，および／または，抗体のＦｃ領域によりＦｃレセプターに特異的に結合することが理解される。
細菌の“拡散”は，“細胞から細胞への拡散”すなわち，例えばベシクルにより媒介される細菌の第１の宿主細胞から第２の宿主細胞への伝達を包含する。拡散に関連する機能としては，限定されないが，例えば，アクチンテールの形成，仮足様延長の形成，および二重膜空胞の形成が挙げられる。
リコンビナーゼの“標的部位”は，リコンビナーゼにより認識され，結合され，および／またはその作用を受ける核酸配列または領域である（例えば，米国特許６，３７９，９４３，Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６を参照）。
“治療上有効量”とは，患者に利点，すなわち治療中の症状の低下，予防，または軽減を示すのに十分な試薬または医薬組成物の量であると定義される。薬剤または医薬組成物が診断剤を含む場合，“診断上有効量”とは，シグナル，画像，または他の診断パラメータを生成するのに十分な量であると定義される。医薬製剤の有効量は，個人の感受性の程度，年齢，性別，および個人の体重，および個人の固有の応答等の因子により様々であろう（例えば，米国特許５，８８８，５３０，Ｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．を参照）。
“治療”または“治療する”（状態または疾病に関して）とは，有益なまたは所望の結果，例えば好ましくは臨床上の結果を得るための方法である。本発明の目的のためには，疾病に関連して有益なまたは所望の結果としては，限定されないが，以下の１またはそれ以上が挙げられる：疾病に伴う状態の改善，疾病の治癒，疾病の重篤度の低減，疾病の進行の遅延，疾病に伴う１またはそれ以上の症状の緩和，疾病に罹患した者の生活の質の上昇，および／または生存の延長。同様に，本発明の目的のためには，病的状態に関連して有益なまたは所望の結果としては，限定されないが，以下の１またはそれ以上が挙げられる：病的状態の改善，病的状態の治癒，病的状態の重篤度の低減，病的状態の進行の遅延，病的状態に伴う１またはそれ以上の症状の緩和，病的状態に罹患した者の生活の質の上昇，および／または生存の延長。例えば，本明細書に記載される組成物を癌の治療に用いる態様においては，有益なまたは所望の結果としては，限定されないが，以下の１またはそれ以上が挙げられる：新生物または癌性細胞の増殖の低下（または破壊），癌に見いだされる新生物細胞の転移の減少，腫瘍のサイズの縮小，癌から生ずる症状の低下，癌に罹患した者の生活の質の上昇，疾病を治療するために必要な他の医薬品の投与量の減少，癌の進行の遅延，および／または癌を有する患者の生存の延長。被験者の“治療”は，文脈によって，被験者が治療を必要としていること，例えば，被験者が薬剤の投与により軽減されることが予測される疾患を有している状況を示唆しうる。
“ワクチン”は予防用ワクチンを含む。ワクチンはまた，治療用ワクチン，例えば，ワクチンにより提供される抗原またはエピトープと関連する状態または疾患を含む哺乳動物に投与されるワクチンを含む。
ＩＩ．一般
本発明は，癌，腫瘍，前癌性疾患，および感染の治療および診断に有用な試薬および方法を提供する。核酸，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，およびＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンが提供される。本発明は，インビトロで，例えば，保存の間に，またはインビボで改変されているリステリア細胞，例えば，細菌の細胞分裂の産物および細菌の損傷の産物を包含する。
少なくとも１つの異種抗原（Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌にとって異種）をコードする核酸が提供される。異種抗原は，腫瘍，癌細胞，および／または感染性因子，例えば，ウイルス，細菌，または原生動物に由来するものでありうる。異種抗原はまた，リステリア抗原であってもよく，例えば，抗原がＬｉｓｔｅｒｉａ細菌中で天然に生ずるより多い量で発現される場合，リステリア抗原が非天然の制御配列と動作可能なように連結されている場合，またはリステリア抗原が減弱化されるようにまたはその抗原性を増加させるように改変されている場合が含まれる。
Ｌｉｓｔｅｒｉａが異種抗原をコードする核酸を含む場合，“異種”との用語は，必ずしも限定されないが，（１）非リステリア生物；（２）合成起源の抗原；（３）核酸がリステリアのゲノム中の野生型に見いだされるものと異なる位置にインテグレートされているリステリア起源の抗原；および（４）リステリア起源であるが，核酸が野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでは通常用いられない制御配列と動作可能なように連結されている抗原からのまたはこれらに由来する抗原を包含する。上述の注釈は，例えば，ウイルスベクターの文脈において用いる場合の“異種抗原”との用語にも適用される。ここでは，異種抗原は，そのウイルスベクターからでもこれに由来するものでもない抗原，ならびに，例えば，非天然核酸制御配列により制御されているウイルスベクターからの抗原を包含する。
哺乳動物免疫系を刺激するための，腫瘍の数および／またはサイズを減少させるための，転移を減少させるための，および感染性生物のタイターを低下させるための試薬および方法が提供される。本発明はまた，癌または感染に対する細胞，組織，臓器，または哺乳動物の生存を改良するための試薬および方法を提供する。本発明はまた，細胞（インビボまたはインビトロ），組織（インビボまたはインビトロ），臓器（インビボまたはインビトロ），生物，哺乳動物，獣医学的被験体，研究対象，またはヒト被験者の，癌，腫瘍，または感染に対する生存を改良するための試薬および方法を提供する。包含されるものは，インビボまたはインビトロでの投与，細胞，組織，または臓器のインビトロまたはインビボでの生存，またはこれらの任意の組み合わせである。任意の組み合わせとしては，例えば，投与がインビボであり続く生存がインビトロであるもの，または投与がインビトロであり続く生存がインビボであるものが含まれる。
少なくとも１つの異種抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａが提供され，ここで，１つのポリヌクレオチドはゲノム性である。また，少なくとも１つの異種抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａも包含され，ここで，ポリヌクレオチドはゲノム性であり，Ｌｉｓｔｅｒｉａ中のプラスミドには存在しない。さらに，少なくとも１つの異種抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａが包含され，ここで，ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ中のプラスミドに存在する。さらに，少なくとも１つの異種抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａが提供され，ここで，ポリヌクレオチドはプラスミド上に存在し，ゲノム中へのインテグレートは生じていない。別の観点においては，本発明は少なくとも１つの異種抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａを提供し，ここで，ポリヌクレオチドはゲノム中にインテグレートされており，さらに別にプラスミド上に存在する。
マウスはヒト免疫応答のモデルとして受け入れられている。詳細には，マウスＴ細胞はヒトＴ細胞のモデルであり，マウス樹状細胞（ＤＣ）はヒトＤＣのモデルであり，マウスＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞のモデルであり，マウスＮＫＴ細胞はヒトＮＫＴ細胞のモデルであり，マウス先天性応答はヒト先天性応答の受け入れられているモデルである。モデル研究は，例えば下記に開示されている：ＣＤ８＋Ｔ細胞，中心記憶Ｔ細胞，およびエフェクター記憶Ｔ細胞（例えば，Ｗａｌｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２７０４−２７１１を参照）；２つのサブセットのＮＫ細胞（例えば，Ｃｈａｋｉｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４９８５−４９９３；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１３４１−１３５４；Ｅｈｒｌｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１９２２−１９３１；Ｐｅｒｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５８２１−５８２４を参照）；ＮＫＴ細胞（例えば，Ｃｏｕｅｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４３９１−４３９７；Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：Ｓ４４５−Ｓ４５１；Ｓａｉｋｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：１５６２−１５７０；Ｅｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：５００３−５００９；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４８３−５１３；Ｓｉｄｏｂｒｅ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：１２２５４−１２２５９を参照）；単球／マクロファージ（Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４４１０−４４１７）；２つのリニアージのＤＣ（Ｂｏｏｎｓｔｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１０１−１０９；Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１９４６−１９５１；Ｂｅｃｋｅｒ（２００３）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２６：１１９−１３０；Ｃａｒｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６４６６−６４７７；Ｐｅｎｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６６７３−６６７６；Ａｌｆｅｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：５８５−５９９）。
マウス先天性応答，例えば，Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅレセプター（ＴＬＲ）は，ヒト先天性免疫応答のモデルであり，開示されている（例えば，Ｊａｎｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｂｅｙａｅｒｔ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｖｓ．１６：６３７−６４６を参照）。マウス好中球は許容されているヒト好中球のモデルである（例えば，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１０９４８−１０９５３；Ｔｏｒｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）７２：２１３１−２１３９；Ｓｉｂｅｌｉｕｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：１１２５−１１３０；Ｔｖｉｎｎｅｒｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１９９４−２００２を参照）。Ｌｉｓｔｅｒｉａに対するネズミの免疫応答はＬｉｓｔｅｒｉａに対するヒトの応答の許容されているモデルである（例えば，Ｋｏｌｂ−Ｍａｕｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８：３６８０−３６８８；Ｂｒｚｏｚａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ Ｆｅｂ．３（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）；Ｐａｓｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３４４７−３４５６；Ｗａｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５９１８−５９２２；Ｏｕａｄｒｈｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８０：１１９５−１２０４；Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：３４３−３５４；Ｃａｌｏｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １９：２５９−２６４；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５６００−５６０６；Ｆｌｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２０６４−２０６９；Ｃａｌｏｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １９：２５９−２６４；Ｂｒｚｏｚａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｂｒｚｏｚａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：１９０６−１９１２；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５６００−５６０６を参照）。
米国特許公開２００４／０２２８８７７および２００４／０１９７３４３（このそれぞれはその全体が参照として本明細書に取り込まれる）は，本発明のある態様において有用なＬｉｓｔｅｒｉａを記載する。米国特許公開２００５／０２４９７４８（その全体が参照として本明細書に取り込まれる）はさらに，本発明のある態様において有用なＬｉｓｔｅｒｉａおよびポリヌクレオチドを記載する。
（ａ）． 分泌またはシグナル配列
本発明は，分泌配列をコードする核酸または融合蛋白質パートナーとして用いるのに適したリステリアの蛋白質またはそのフラグメントをコードする核酸を包含する。以下のいずれかをコードする核酸が包含される：
ｉ． 分泌配列，
ｉｉ． シグナル配列，
ｉｉｉ． その天然の分泌配列を含むリステリアのポリペプチド，
ｉｖ． 天然の分泌配列が別のリステリアの蛋白質の分泌配列で置き換えられているリステリアの蛋白質，
ｖ． その天然の分泌配列が非リステリア細菌蛋白質の分泌配列で置き換えられているリステリアの蛋白質，
ｖｉ． 分泌配列を含まない，非分泌性リステリアの蛋白質またはそのフラグメント；および
ｖｉｉ． 非分泌性リステリアの蛋白質またはそのフラグメントとインフレームで融合された非リステリア細菌分泌配列。
これらの態様は，以下のリステリアの蛋白質およびそのフラグメントまたはドメインを包含することができる。
ｉ． リステリオリシン（ＬＬＯ）。リステリオリシンＯの分泌シグナル配列（ｈｌｙ遺伝子）が同定されている（例えば，Ｌｅｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：１２４９−１２５５を参照）。
ｉｉ． ＡｃｔＡ。リステリアＡｃｔＡについて，リボソーム結合部位，プロモーター，およびシグナル配列が同定されている。リボソーム結合部位はＡｃｔＡ遺伝子の開始コドンの６ｂｐ上流にある（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０：２１９−２３０）。
ｉｉｉ． インターナリン。すべてのインターナリン（Ｉｎｌ）蛋白質は，細菌シグナルペプチドの特徴を有する３０−３５アミノ酸のＮ末端配列を含む（例えば，Ｄｒａｍｓｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：１６１５−１６２５を参照）。
ｉｖ． ｐ６０（ｉａｐ遺伝子）。開始コドンとヌクレオチド５２４との間の２７アミノ酸の領域は，シグナル配列として機能し，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細胞膜を超えるｐ６０の輸送を指示する（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５８：１９４３−１９５０）。Ｋｏｈｌｅｒら（上掲）はまた，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｐ６０ｍＲＮＡのプリンリッチリボソーム（１６ＳＲＮＡ）結合部位を開示する。
表１は，異種抗原等の融合蛋白質パートナー配列との融合において用いるためのシグナルペプチドの多数の非限定的例を示す。シグナルＰアルゴリズムを用いて，グラム陽性細菌のシグナル配列を決定することができる。このプログラムは以下のウエブサイトから利用可能である：ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌＰ／。シグナルペプチドは，３つのドメイン，すなわち，正に荷電したＮ末端（１−５残基の長さ）；中心疎水性ドメイン（７−１５残基の長さ）；および中性であるが極性のＣ末端ドメインを有する傾向がある（例えば，Ｌｅｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９：１２４９−１２５５；Ｐａｅｔｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８７：２７−４９を参照）。Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムまたは別の細菌のゲノムまたはプラスミドによりコードされるシグナルペプチドおよび分泌配列は，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける最適発現のためにコドン最適化する必要がないため，本発明はまた，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムまたは別の細菌のゲノムまたはプラスミドを起源とし，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる発現のためにコドン最適化により変更されている核酸も提供する。本発明は，分泌されるポリペプチドおよびペプチド抗原に限定されず，Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは他の細菌から分泌されないか，または分泌されることができないポリペプチドおよびペプチドも包含する。
ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａにより発現される異種抗原を含むポリペプチドは，非リステリアシグナル配列であるシグナル配列を含む。ある態様においては，シグナル配列はｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。別のある態様においては，シグナル配列はｓｅｃＡ２またはＴａｔシグナルペプチドである。ある態様においては，シグナルペプチドはａｃｔＡシグナルペプチドである。ある態様においては，異種抗原を分泌させるために用いられるシグナルペプチドは，ｐ６０シグナル配列，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＬＬＯシグナル配列，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原（ＢａＰａ）シグナル配列，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓｕｓｐ４５シグナル配列，およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＰｈｏＤシグナル配列から選択される。異種抗原の発現および分泌のために用いることができるシグナルペプチドは，例えば，米国特許公開２００５／０２４９７４８（その全体が参照として本明細書に取り込まれる）に記載されている。
（ｂ）．コドン最適化
ある態様においては，本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａにとって異種である核酸，またはＬｉｓｔｅｒｉａにとって外来である核酸のコドン最適化を提供する。各アミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが用いる最適コドンを示す（表２）。核酸中の少なくとも１つのコドンが，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによってそのアミノ酸について元の配列におけるコドンより高い頻度で用いられるコドンで置き換えられている場合，核酸はコドン最適化されている。
通常は，任意の非最適コドンの少なくとも１％が変更されて最適コドンを与え，より通常には少なくとも５％が変更されており，最も通常には少なくとも１０％が変更されており，頻繁には少なくとも２０％が変更されており，より頻繁には少なくとも３０％が変更されており，最も頻繁には少なくとも４０％，普通は少なくとも５０％が変更されており，より普通には少なくとも６０％が変更されており，最も普通には少なくとも７０％が変更されており，最適には少なくとも８０％が変更されており，より最適には少なくとも９０％が変更されており，最も頻繁には少なくとも９５％が変更されており，慣用的には任意の非最適コドンの１００％がＬｉｓｔｅｒｉａ発現用にコドン最適化されている（表２）。
ある態様においては，異種抗原をコードする核酸は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現用にコドン最適化されている。ある態様においては，融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは，改変型ＡｃｔＡまたは変更されたシグナルペプチド配列を含み，異種抗原はコドン最適化されている。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現用のヌクレオチド配列のコドン最適化に関する追加の情報は，米国特許公開２００５／０２４９７４８（その全体が参照として本明細書に取り込まれる）に見いだすことができる。
（ｃ）． 病原性因子および減弱化
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは，宿主への侵襲，成長，または定着に寄与する種々の遺伝子および遺伝子産物を発現する（表３）。これらのあるものは“病原性因子”として分類される。これらの病原性因子には，ＡｃｔＡ，リステリオリシン（ＬＬＯ），蛋白質６０（ｐ６０），インターナリンＡ（ｉｎｌＡ），インターナリンＢ（ｉｎｌＢ），ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ），ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子）が含まれる。多数の他のインターナリンが特性決定されており，例えば，ＩｎｌＣ２，ＩｎｌＤ，ＩｎｌＥ，およびＩｎｌＦが挙げられる（Ｄｒａｍｓｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：１６１５−１６２５）。ｐｒｏＰＬ−ＰＬＣをプロセシングして活性なＰＬ−ＰＬＣとするメタロプロテアーゼであるＭｐｌも病原性因子である（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０：１６７−１７４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８２：８３７−８４１）。ある態様においては，病原性遺伝子は，病原性因子をコードする遺伝子である。本発明は本明細書に開示される減弱化された遺伝子に限定されず，表３の配列の１またはそれ以上において変更された，変異した，または減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａを提供する。
ある態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆ−Ａ依存性遺伝子である。別の態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆ−Ａ非依存性遺伝子である。
ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢに減弱化変異を含む。ある態様においては，異種抗原をコードするポリヌクレオチドがａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢ遺伝子中にインテグレートされている。
ＤＮＡ修復遺伝子もまた減弱化変異の標的でありうる。ＤＮＡ修復遺伝子の変異または欠失により減弱化した細菌を得ることができる（例えば，Ｄａｒｗｉｎ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎ（２００５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７３：４５８１−４５８７を参照）。
リステリオリシン（ＬＬＯ）の生物学は記載されている（例えば，Ｇｌｏｍｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：６７５４−６７６５；Ｇｅｄｄｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：９９９−１００３；Ｇｌｏｍｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５６：１０２９−１０３８；Ｄｕｂａｉｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：２６７９−２６８８；Ｄｒａｍｓｉ ａｎｄ Ｃｏｓｓｓａｒｔ（２００２）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５６：９４３−９４６を参照）。ＡｃｔＡの生化学および生理学は開示されている（例えば，Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３；Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７；Ｐｏｒｔｎｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５８：４０９−４１４を参照）。インターナリンの生化学および生理学は入手可能である（例えば，Ｂｉｅｒｎｅ ａｎｄ Ｃｏｓｓａｒｔ（２０００）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１５：３３５７−３３６７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：５９３０−５９３８；Ｄｏｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１０１−１０９を参照）。ソルターゼ蛋白質は記載されている（例えば，Ｂｉｅｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：８６９−８８１を参照）。２つのホスホリパーゼ，すなわちＰＩ−ＰＬＣ（ｐｌｃＡ遺伝子によりコードされる）およびＰＣ−ＰＬＣ（ｐｌｃＢ遺伝子によりコードされる）は開示されている（例えば，Ｃａｍｉｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１５７；Ｓｃｈｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：５９３０−５９３８）。蛋白質ｐ６０は記載されている（Ｐｉｌｇｒｉｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３４７３−３４８４を参照）。
本発明はまた，少なくとも１つの制御因子，例えば，プロモーターまたは転写因子において減弱化されているＬｉｓｔｅｒｉａを企図する。以下はプロモーターに関する説明である。ＡｃｔＡ発現は２つの異なるプロモーターにより制御されている（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６）。ｉｎｌＡおよびｉｎｌＢは，一緒に，５つのプロモーターにより制御されている（Ｌｉｎｇｎａｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。転写因子ｐｒｆＡは，多数のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子，例えば，ｈｌｙ，ｐｌｃＡ，ＡｃｔＡ，ｍｐｌ，ｐｒｆＡ，およびｉａｐの転写に必要である。ＰｒｆＡの制御特性は，例えば，ＰｒｆＡ依存性プロモーター（ＰｉｎｌＣ）およびＰｒｆＡ−ｂｏｘにより媒介される。本発明は，ある態様においては，不活性化されているか，変異しているか，または欠失しているＡｃｔＡプロモーター，ｉｎｌＢプロモーター，ＰｒｆＡ，ＰｉｎｌＣ，ＰｒｆＡ−ｂｏｘ等の少なくとも１つをコードする核酸を提供する（例えば，Ｌａｌｉｃ−Ｍｕｌｌｔｈａｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０；Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７−１５５１；Ｌｕｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９−５２を参照）。ＰｒｆＡはＧｌｙ１４５Ｓｅｒ変異，Ｇｌｙ１５５Ｓｅｒ変異，またはＧｌｕ７７Ｌｙｓ変異により構成的に活性にすることができる（例えば，Ｍｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｔａｇ（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：１９１７−１９２６；Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｆｒｅｉｔａｇ（２００４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：６２６５−６２７６；Ｒｉｐｉｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１５３３−１５４０を参照）。
減弱化は，例えば，熱処理または化学的修飾により行うことができる。減弱化はまた，例えば，代謝，細胞外成長，または細胞内成長を調節する核酸の遺伝的改変，または病原性因子，例えば，リステリアｐｒｆＡ，ＡｃｔＡ，リステリオリシン（ＬＬＯ），接着媒介因子（例えば，ｉｎｌＡまたはｉｎｌＢ等のインターナリン），ｍｐｌ，ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ），ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子），これらの任意の組み合わせ等をコードする核酸の遺伝的改変等によっても行うことができる。減弱化は，減弱化したＬｉｓｔｅｒｉａの生物学的機能を，適当な親Ｌｉｓｔｅｒｉａの対応する生物学的機能と比較することにより評価することができる。
別の態様においては，本発明は，核酸標的化剤，例えば架橋剤，ソラーレン，ナイトロジェンマスタード，シスプラチン，嵩高い付加物，紫外線，ガンマ線照射，これらの任意の組み合わせ等で処理することにより減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａを提供する。典型的には，架橋剤の１分子により生成される傷害は二重らせんの両方の鎖の架橋を含む。本発明のＬｉｓｔｅｒｉａはまた，少なくとも１つの核酸修復遺伝子，例えば，ｕｖｒＡ，ｕｖｒＢ，ｕｖｒＡＢ，ｕｖｒＣ，ｕｖｒＤ，ｕｖｒＡＢ，ｐｈｒＡ，および／または組換的修復を媒介する遺伝子，例えばｒｅｃＡを変異させるとによっても減弱化することができる。さらに，本発明は，核酸標的化剤および核酸修復遺伝子の変異の両方により減弱化したＬｉｓｔｅｒｉａを提供する。さらに，本発明は，ソラーレン等の光感受性核酸標的化剤で処理すること，および／またはソラーレン等の光感受性核酸架橋剤で処理した後に紫外線に暴露することを包含する。
ある態様においては，本発明のＬｉｓｔｅｒｉａは，減弱化されている。本発明において有用な減弱化したＬｉｓｔｅｒｉａは，例えば，米国特許公開２００４／０２２８８７７および２００４／０１９７３４３（このそれぞれはその全体が参照として本明細書に取り込まれる）に記載されている。Ｌｉｓｔｅｒｉａの特定の株が所望の減弱化を有しているかを評価するための種々のアッセイは，例えば，米国特許公開．２００４／０２２８８７７，２００４／０１９７３４３および２００５／０２４９７４８（このそれぞれはその全体が参照として本明細書に取り込まれる）に提供される。
（ｄ）． Ｌｉｓｔｅｒｉａ株
本発明は，本発明の減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａを作成または遺伝子工学操作するための多数のリステリアの種および株を提供する（表４）。表４の参考文献のそれぞれは，その全体が参照として本明細書に取り込まれる。本発明のＬｉｓｔｅｒｉａは，この表に開示される種および株に限定されない。
（ｅ）． 抗原
ある態様においては，本発明は，少なくとも１つの抗原，１またはそれ以上の保存的変化を有する抗原，特定の抗原の１またはそれ以上のエピトープ，または抗原と免疫学的に交叉反応性であるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を提供する（表５）。本発明の核酸および抗原は表に開示されるものに限定されない。
本発明は，限定されないが，上述の抗原の少なくとも１つをコードする核酸，または上述の完全ゲノムの１つによりコードされる少なくとも１つの抗原を含む減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａを提供する。本発明は，開示される抗原の変異体，突然変異蛋白質，スプライシング変種，フラグメント，トランケート型変種，可溶性変種，細胞外ドメイン，細胞内ドメイン，成熟配列等をコードする核酸を包含する。これらの抗原のエピトープ，オリゴペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸が提供される。また，コドン最適化された，すなわち，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現用に最適化された態様も提供される。引用される参考文献，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびこれらに開示される核酸，ペプチドおよびポリペプチドは，その全体が本明細書に参照として取り込まれる。
ある態様においては，抗原は非リステリア性である。ある態様においては，抗原は癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものである。ある態様においては，抗原は癌細胞，腫瘍，または感染性因子からの抗原に由来する。ある態様においては，別の抗原“に由来する”抗原は，その抗原のフラグメントまたは他の誘導体である。ある態様においては，誘導化された抗原は，少なくとも８アミノ酸，少なくとも１２アミノ酸，少なくとも２０アミノ酸，少なくとも５０アミノ酸，少なくとも７５アミノ酸，少なくとも１００アミノ酸，または少なくとも２００アミノ酸のフラグメントを含む。ある態様においては，抗原の誘導体は，それが由来する抗原またはそのフラグメントに対して，少なくとも約８０％の配列同一性，少なくとも約８５％の配列同一性，少なくとも約９０％の配列同一性，少なくとも約９５％の配列同一性，または少なくとも約９８％の配列同一性を有する。ある態様においては，誘導化された抗原はそのシグナル配列および／または膜アンカーを欠失した抗原を含む。ある態様においては，別の抗原に由来する抗原は，元の（全長）抗原からの少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。ある態様においては，抗原は腫瘍抗原である。抗原の免疫原性を試験するアッセイは，本明細書に記載され，当該技術分野においてよく知られている。
ある態様においては，異種抗原はヒト腫瘍抗原またはヒト腫瘍抗原に由来する抗原である。ある態様においては，腫瘍抗原に由来する抗原は，腫瘍抗原に対して少なくとも約６５％の配列同一性，腫瘍抗原に対して少なくとも７０％の配列同一性，または腫瘍抗原に対して少なくとも約７５％の配列同一性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，抗原は，腫瘍抗原に対して少なくとも８５％の配列同一性，腫瘍抗原に対して少なくとも９０％の配列同一性，または腫瘍抗原に対して少なくとも約９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，腫瘍抗原に由来する抗原は，腫瘍抗原の少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００アミノ酸を含む。ある態様においては，腫瘍抗原に由来する抗原は，腫瘍抗原の少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００個の連続するアミノ酸から構成される。
ある態様においては，抗原は，メソセリンであるか，またはメソセリンに由来する。ある態様においては，メソセリンはヒトメソセリンである。ある態様においては，メソセリンは全長（例えば，全長ヒトメソセリン）である。ある態様においては，メソセリンに由来する抗原は，そのシグナル配列を欠失した，そのＧＰＩアンカーを欠失した，またはシグナル配列およびＧＰＩアンカーの両方が欠失したメソセリン（例えば，ヒトメソセリン）を含む。メソセリンをコードするポリヌクレオチドは，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現について，コドン最適化されていてもよく，コドン最適化されていなくてもよい。
ある態様においては，メソセリンに由来する抗原は，ヒトメソセリンに対して少なくとも約６５％の配列同一性，ヒトメソセリンに対して少なくとも７０％の配列同一性，またはヒトメソセリンに対して少なくとも約７５％の配列同一性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，メソセリンポリペプチド配列は，ヒトメソセリンに対して少なくとも８５％の配列同一性，ヒトメソセリンに対して少なくとも９０％の配列同一性，またはヒトメソセリンに対して少なくとも約９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，メソセリンに由来する抗原は，メソセリンポリペプチド，例えばヒトメソセリンまたはそのシグナルペプチド配列および／またはＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリンの，少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００個のアミノ酸を含む。ある態様においては，メソセリンに由来する抗原は，メソセリンポリペプチド，例えばヒトメソセリンまたはそのシグナルペプチド配列および／またはＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリンの，少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００個の連続するアミノ酸から構成される。
ある態様においては，抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）であるか，またはＰＳＣＡに由来する抗原である。ある態様においては，ＰＳＣＡはヒトＰＳＣＡである。ある態様においては，ＰＳＣＡは全長（例えば全長ヒトＰＳＣＡ）である。ある態様においては，ＰＳＣＡに由来する抗原は，（ａ）そのシグナルペプチド領域の一部または全部，（ｂ）そのＧＰＩアンカー領域，または（ｃ）そのＧＰＩアンカー領域およびそのシグナルペプチド領域の一部または全部が欠失したＰＳＣＡ（例えば，ヒトＰＳＣＡ）を含む。ＰＳＣＡをコードするポリヌクレオチドは，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現用にコドン最適化されたものであってもコドン最適化されていないものであってもよい。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ中で発現させたときに特定の抗原誘導体が所望の免疫原性を刺激しうるか否かを評価するための種々のアッセイは当業者に知られている。特定の例は下記の実施例に提供される。種々のアッセイはまた例えば，米国特許公開２００４／０２２８８７７，２００４／０１９７３４３，および２００５／０２４９７４８（このそれぞれはその全体が参照として本明細書に取り込まれる）にも提供される。
ある態様においては，ＰＳＣＡに由来する抗原は，ヒトＰＳＣＡに対して少なくとも約６５％の配列類似性，ヒトＰＳＣＡに対して少なくとも７０％の配列類似性，またはヒトＰＳＣＡに対して少なくとも約７５％の配列類似性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，ＰＳＣＡポリペプチド配列は，ヒトＰＳＣＡに対して少なくとも８５％の配列類似性，ヒトＰＳＣＡに対して少なくとも９０％の配列類似性，またはヒトＰＳＣＡに対して少なくとも約９５％の配列類似性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，ＰＳＣＡに由来する抗原は，ＰＳＣＡポリペプチド，例えばヒトＰＳＣＡ，またはそのシグナルペプチド配列および／またはＧＰＩアンカーを欠失したヒトＰＳＣＡの，少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００アミノ酸を含む。ある態様においては，ＰＳＣＡに由来する抗原は，ＰＳＣＡポリペプチド，例えばヒトＰＳＣＡまたはそのシグナルペプチド配列および／またはＧＰＩアンカーを欠失したヒトＰＳＣＡの，少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００個の連続するアミノ酸から構成される。
ある態様においては，抗原（例えば，異種抗原）は，米国特許公開２００５／０２８１７８３Ａ１（中に含まれるすべての配列を含め，その全体が参照として本明細書に取り込まれる）において定義され記載されている，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチド（しばしば“ＥｐｈＡ２抗原性ポリペプチド”と称される）を含まない。ある態様においては，本明細書に記載される方法および組成物において使用から除外されるＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，ＥｐｈＡ２を発現する過増殖疾患に関与する細胞に対する免疫応答を引き起こすことができる任意のＥｐｈＡ２抗原性ペプチドであってもよい。すなわち，ある態様においては，除去されるＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，（１）抗ＥｐｈＡ２抗体に結合するか，または結合についてＥｐｈＡ２と競合する能力を示す，（２）ＥｐｈＡ２に結合する抗体を生成する能力を示す，および／または（３）ＥｐｈＡ２の１またはそれ以上のＴ細胞エピトープを含む，ＥｐｈＡ２ポリペプチド（例えば，米国特許公開２００５／０２８１７８３Ａ１（その全体が参照として本明細書に取り込まれる）の配列番号２のＥｐｈＡ２ポリペプチド），またはＥｐｈＡ２ポリペプチドのフラグメントまたは誘導体でありうる。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，下記のヌクレオチド配列，またはそのフラグメントまたは誘導体の１つによりコードされる配列である：Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４４３１（ヒト）；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０１３９（マウス）；またはＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０３８９８６（トリ，部分配列）。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは全長ヒトＥｐｈＡ２（例えば，米国特許公開２００５／０２８１７８３Ａ１の配列番号２）である。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインまたはＥｐｈＡ２の細胞内ドメインを含む。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，ＥｐｈＡ２のアミノ酸残基６４６におけるリジンからメチオニンへの置換を有する全長ＥｐｈＡ２またはそのフラグメントから構成される。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチド配列は，ヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも約６５％の配列類似性，ヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも７０％の配列類似性，またはヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも約７５％の配列類似性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，ＥｐｈＡ２ポリペプチド配列は，ヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも８５％の配列類似性，ヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも９０％の配列類似性，またはヒトＥｐｈＡ２に対して少なくとも約９５％の配列類似性を示すアミノ酸配列から構成される。ある態様においては，除去されるＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，ＥｐｈＡ２ポリペプチドの少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００アミノ酸から構成される。ある態様においては，ＥｐｈＡ２抗原性ペプチドは，ＥｐｈＡ２ポリペプチドの少なくとも１０，２０，３０，４０，５０，７５，１００，または２００個の連続するアミノ酸から構成される。
本発明は，感染，例えば肝臓の感染に対する免疫応答を刺激する方法および試薬を提供する。これらには，肝臓指向性ウイルスおよび肝炎を媒介するウイルス，例えば，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，およびサイトメガロウイルスの感染が含まれる。本発明は，他の肝臓指向性ウイルス，例えばヘルペス単純ウイルス，エプスタインバーウイルス，およびデングウイルスを治療する方法を企図する（例えば，Ａｈｌｅｎｓｔｉｅｌ ａｎｄ Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：６７５−６７７；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．１２：３８−４５；Ｓｕｎ ａｎｄ Ｇａｏ（２００４）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２７：１５２５−１５３９；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：１１７１−１１７９；Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ａｌｖａｒｅｚ（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：７４３−７５９；Ｃｏｏｋ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．９：１２３９−１２４７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｒｉｏｒｄａｎ（２０００）Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５（Ｓｕｐｐｌ．）Ｇ１７−Ｇ２５；Ｖａｒａｎｉ ａｎｄ Ｌａｎｄｉｎｉ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．４８：３９−４４；Ｒｕｂｉｎ（１９９７）Ｃｌｉｎ．ＬｉｖｅｒＤｉｓ．１：４３９−４５２；Ｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６６１−６６７；Ｓｈｒｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１９：２６２−２７３；Ｆｊａｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ９：６８−７３；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：３４０９−３４１３；Ｃｏｌｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４１：１７４−１７５；Ｏｈｇａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４４：２０３−２１５を参照）。
別の観点においては，本発明は，寄生虫感染，例えば肝臓の寄生虫感染を治療および／または予防する方法および試薬を提供する。これらには，限定されないが，肝臓吸虫（例えば，Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ，Ｆａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ，Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ），Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ，Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ，Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ，および蠕虫が含まれる。蠕虫は，例えば，線虫（蛔虫），条虫（サナダムシ），および吸虫（扁形動物または吸虫類）を含む（例えば，Ｔｌｉｂａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３３：３２７−３３２；Ｋｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｕｔｚｉｎｇｅｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：１７１１−１７２６；Ｋａｅｗｋｅｓ（２００３）ＡｃｔＡ Ｔｒｏｐ．８８：１７７−１８６；Ｓｒｉｖａｔａｎａｋｕｌ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｓｉａｎ Ｐａｃ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：１１８−１２５；Ｓｔｕａｆｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｔｒａｖｅｌ Ｍｅｄ．１１：１５７−１５９；Ｎｙｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：４５７−４６７；Ｂｕｋｔｅ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｂｄｏｍ．Ｉｍａｇｉｎｇ ２９：８２−８４；Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｓｉｖａｋｕｍａｒ（２００３）４９：５５−６０；Ｗｙｌｅｒ（１９９２）Ｐａｒｉｓｉｔｏｌ．Ｔｏｄａｙ８ ：２７７−２７９；Ｗｙｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１：１５６−１６７；Ａｓｓｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５４：１１−２０；Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１３０：６５−７４；Ｐｏｃｋｒｏｓ ａｎｄ Ｃａｐｏｚｚａ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｒｅｐ．７：６１−７０；Ｈｓｉｅｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６９９−２７０４；Ｋｏｒｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５１９９−５２０６；Ｐｏｃｋｒｏｓ ａｎｄ Ｃａｐｏｚｚａ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｒｅｐ．６：２８７−２９６を参照）。
本発明のさらに別の観点は，細菌感染，例えば，肝臓指向性細菌による感染を治療および／または予防するための方法および試薬を提供する。例えば，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ，およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐを治療する方法および試薬が提供される（例えば，Ｃｏｏｋ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．９：１２３９−１２４７；Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１３０−１３７；Ｓｅｌｌａｔｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４１３１−４１４０；Ｊａｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ．１８２：４７４−４８１；Ｋｉｒｂｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４４５０−４４５９；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｃｋ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２４９６−２５０３；Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４３：５２１−５２３；Ａｋｃａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．５８：６２５−６２７；ｄｅｌａＢａｒｒｅｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１０５−１１３を参照）。
さらに別の態様においては，本発明の異種抗原は，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），例えば，ｇｐ１２０；ｇｐ１６０；ｇｐ４１；ｐ２４ｇａｇまたはｐ５５ｇａｇ等のｇａｇ抗原，ならびにＨＩＶのｐｏｌ，ｅｎｖ，ｔａｔ，ｖｉｒ，ｒｅｖ，ｎｅｆ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，およびＬＴＲ領域に由来する蛋白質に由来する。企図される異種抗原としては，１型および２型ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ），サイトメガロウイルス，エプスタインバーウイルス，または水疱瘡ウイルスからの抗原が挙げられる。また包含されるものは，肝炎ウイルス，例えば，Ａ，Ｂ，Ｃ，デルタ，Ｅ，またはＧ型肝炎ウイルスに由来する抗原である。さらに，抗原はまた，Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（ポリオウイルス；ライノウイルス）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（風疹；デング熱）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄｉａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（おたふく風邪；はしか）；Ｂｕｎｙｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＩＶ−１）；パピローマウイルス，ダニ媒介脳炎ウイルス等からの抗原を包含する。
さらに別の観点においては，本発明は，細菌および寄生虫感染，例えば，サルモネラ，ナイセリア，ボレリア，クラミジア，ボルデテラ，マラリア原虫，トキソプラズマ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ，ジフテリア，百日咳，破傷風，細菌性または真菌性肺炎，中耳炎，淋病，コレラ，腸チフス，髄膜炎，単核球症，ペスト，細菌性赤痢，サルモネラ症，レジオネラ病，ライム病，ハンセン病，マラリア，鉤虫，Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ，Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ，トリパノソーマ，リーシュマニア，ジアルジア，アメーバ症，フィラリア，ボレリア，および旋毛虫病を予防および治療するための試薬および方法を提供する（例えば，Ｄｅｓｐｏｍｍｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｄｉｅａｓｅｓ，４ｔｈｅｄ．，Ａｐｐｌｅ Ｔｒｅｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ（２００２）２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＥＩＤ）−Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １９９５ ｔｏ ２００２ ｗｉｔｈ Ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｄｏｚｅｎｓ ｏｆ Ｓｅｒｉｏｕｓ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｉｌｌｎｅｓｓｅｓ−Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩＤＳ，Ｍａｌａｒｉａ，ＴＢ，Ｐｏｘ，Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ，Ｓｍａｌｌｐｏｘ，Ａｎｔｈｒａｘ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅ，Ｒａｂｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｆｅｖｅｒｓ，Ｅｂｏｌａ，Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＣｏｒｅＦｅｄｅｒａｌ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｅｒｉｅｓを参照）。
本発明は，少なくともある態様においては，癌および感染の両方を含む疾患または状態を治療するか，または疾患または状態に対する免疫応答を刺激する試薬および方法を提供する。例えば，ある種のウイルス感染においては，ある抗原は腫瘍抗原およびウイルス抗原の両方でありうる（例えば，Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：４３５−４４５；Ｉｃｈａｓｏ ａｎｄ Ｄｉｌｗｏｒｔｈ（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７９０８−７９１６；Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９３３−３９４１；Ｄａｅｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．９：７３３−７４２；Ｂｏｕｄｅｗｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９６：９９８−１００６；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１４５６７−１４５７１を参照）。
ある態様においては，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれらに由来する抗原と，少なくとも１つのエピトープを共有するか，またはこれと免疫学的に交叉反応性である。
（ｆ）．ＤＮＡ修復変異体および核酸標的化剤
本発明は，別の態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａ変異体を提供し，ここで，変異体は，ＤＮＡ傷害の修復，例えば，ＵＶ光誘発性ＤＮＡ傷害，放射線誘発性傷害，鎖間架橋，鎖内架橋，共有結合性付加物，嵩高い付加物により修飾されたＤＮＡ，脱アミド化塩基，脱プリン化塩基，脱ピリミジン化塩基，酸化的傷害，ソラーレン付加物，シスプラチン付加物，上述の組み合わせ等の修復に欠陥がある（Ｍｕ ａｎｄ Ｓａｎｃａｒ（１９９７）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：６３−８１；Ｓａｎｃａｒ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５４−１９５６；Ｌｉｎ ａｎｄ Ｓａｎｃａｒ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２２１９−２２２４；Ｓｅｌｂｙ ａｎｄ Ｓａｎｃａｒ（１９９０）２３６：２０３−２１１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７２６：２５２−２６５）。例えば，ｕｖｒＡ，ｕｖｒＢ，ｕｖｒＡＢ，ｕｖｒＣ，これらの任意の組み合わせ等に変異を有するＬｉｓｔｅｒｉａが提供される。
さらに，そのゲノムＤＮＡ中に少なくとも１つの鎖間架橋，または，そのゲノムＤＮＡ中に少なくとも２個，少なくとも３個，少なくとも４個，少なくとも５個，少なくとも１０個，少なくとも２０個，少なくとも３０個，少なくとも４０個，少なくとも５０個，少なくとも１００個またはそれ以上の架橋を含むＬｉｓｔｅｒｉａが提供される。
本発明の１つの態様は，異種抗原を発現するよう遺伝子工学操作されたＬｉｓｔｅｒｉａｕｖｒＡＢを含み，ここで，遺伝子工学操作された細菌を，核酸架橋剤，ソラーレン化合物，ナイトロジェンマスタード化合物，４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラーレン，またはベータ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルで処理する（例えば，米国特許公開２００４／０１９７３４３，Ｄｕｂｅｎｓｋｙ；Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：８５３−８６０を参照）。
（ｇ）ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション
プラスミド等のポリヌクレオチドと少なくとも１つの変異を有するそのポリヌクレオチドの変種とのハイブリダイゼーションは，以下のストリンジェントな条件下で行うことができる。プラスミドは，２−３ｋｂ，３−４ｋｂ，４−５ｋｂ，５−６ｋｂ，６−７ｋｂ等でありうる。変異は，１−１０ヌクレオチド（ｎｔ），１０−２０ｎｔ，２０−３０ｎｔ，３０−４０ｎｔ，４０−５０ｎｔ，５０−６０ｎｔ，６０−７０ｋｂ，７０−８０ｋｂ，８０−９０ｋｂ，９０−１００ｋｂ等からなることができる。
ホルムアミド中でのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は，以下のハイブリダイゼーション溶液を用いることができる：４８ｍｌホルムアミド；２４ｍｌ ２０ｘＳＳＣ；１．０ｍｌ ２Ｍ ＴｒｉｓＣｌ，ｐＨ７．６；１．０ｍｌ １００ｘデンハルト溶液；５．０ｍｌ水；２０ｍｌの５０％硫酸デキストラン，１．０ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（総容量１００ｍｌ）。ハイブリダイゼーションは，４２℃で一晩行うことができる（例えば，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．２３，ｐａｇｅｓ ６．３．３−６．３．４を参照）。最もストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は，上述のバッファを用いて，ただし，温度は４３℃，４４℃，４５℃，４６℃，４７℃，４８℃，４９℃，５０℃，５１℃，５２℃，５３℃，５４℃等である。
水性条件下でのストリンジェントなハイブリダイゼーションは，１％ウシ血清アルブミン；１ｍＭＥＤＴＡ；０．５ＭＮａＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７％ドデシル硫酸ナトリウムで，６５℃で一晩のインキュベーションである。よりストリンジェントな水性ハイブリダイゼーション条件は，上述のバッファの使用を含むが，ただし温度は６６℃，６７℃，６８℃，６９℃，７０℃，７１℃，７２℃，７３℃，７４℃，７５℃等である（例えば，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．２３，ｐａｇｅｓ ６．３．３−６．３．４を参照）。
ホルムアミド濃度を増加させると，ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが高くなる。プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチは，１０％のミスマッチごとにハイブリダイゼーションの速度を約２倍遅くする。同様に，ミスマッチしたＤＮＡデュープレックスの溶融温度は，１．７％のミスマッチごとに約１℃低下する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７０−７２；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；Ｒｏｓｓ（ｅｄ．）（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；米国特許６，５５１，７８４，Ｆｏｄｏｒ，ｅｔ ａｌ．）。
本発明は，ストリンジェントな条件下で本発明の第２のプラスミドにハイブリダイズする第１のプラスミドの変種を包含し，ここで，両方のプラスミドは機能的に同等であり，ハイブリダイゼーションは，第１のプラスミドを第２のプラスミドに直接ハイブリダイズさせることにより，または第１の変種プラスミドの全長にわたるオリゴヌクレオチドプローブ（個々に，またはプローブの集合として）を第２のプラスミドにハイブリダイズさせること等により，判定することができる。
当業者は，プローブ核酸と標的核酸との区別が可能となるようにハイブリダイゼーション温度を調節または上昇させることができ，ここで，プローブの配列と標的の配列との相違は，５−１０ヌクレオチド，１０−１５ヌクレオチド，１５−２０ヌクレオチド，２０−２５ヌクレオチド，２５−３０ヌクレオチド，３０−３５ヌクレオチド，３５−４０ヌクレオチド，４０−４５ヌクレオチド，４５−５０ヌクレオチド，５０−５５ヌクレオチド，５５−６０ヌクレオチド，６０−６５ヌクレオチド，６５−７０ヌクレオチド，７０−８０ヌクレオチド等である。
本発明は，本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
ＩＩＩ． 本発明のいくつかの詳細な態様
（ａ）． 部位特異的組換えおよび相同組換えによるインテグレーション
ある態様においては，本発明の核酸，ポリヌクレオチド，リステリアのゲノム等の細菌ゲノム，およびＬｉｓｔｅｒｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ等の細菌は，部位特異的組換えにより，および／または相同組換えにより改変される。部位特異的リコンビナーゼは記載されている（例えば，Ｌａｎｄｙ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：６９９−７０７；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６；Ｓａｕｅｒ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８９０−９００を参照）。転位は，部位特異的組換えとは区別される（例えば，Ｈａｌｌｅｔｔ ａｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔｔ（１９９７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：１５７−１７８；Ｇｒｉｎｄｌｅｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ６０８−Ｒ６１２を参照）。
Ａ． 部位特異的組換え
本発明は，核酸，ベクター，またはゲノム中への部位特異的インテグレーションを媒介するためのシステムを提供する。“システム”とは，インテグラーゼをコードする第１の核酸，ならびに発現したインテグラーゼポリペプチド，ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）をコードする第２の核酸，および対応する細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）をコードする第３の核酸を意味する。一般に，任意の所定のａｔｔＰＰ’部位は，特定のａｔｔＢＢ’部位に対応するか，またはこれに適合性である。本発明のインテグレーションシステムが利用可能であることにより，１またはそれ以上の核酸を任意の所与のポリヌクレオチドまたはゲノム中にインテグレーションすることができる。
本発明のインテグレーション部位は，存在する部位（例えば，ｔＲＮＡＡｒｇインテグレーション部位またはｃｏｍＫインテグレーション部位）における部位特異的インテグレーションにより，リステリアのゲノム中のあらかじめ決定された位置に移植することができる。加えて，またはその代わりに，インテグレーションシステムの部位は相同的インテグレーションによりあらかじめ決定された位置に移植することができる。
ホモロジーの領域（“相同アーム”）の設計によって，相同組換えによりインテグレーション部位から物質が欠失する場合もあり，または欠失しない場合もある。相同組換えの間に生ずる欠失は，“相同アーム”にハイブリダイズしうる標的ＤＮＡの領域の間に存在する標的ＤＮＡの領域に対応する。相同組換えを用いて，後に部位特異的組換えに用いるためのインテグレーション部位（ａｔｔＢＢ’）を細菌のゲノム中に移植することができる。
図１は，細菌のゲノム中への部位特異的インテグレーションに用いるためのプラスミドｐＩＮＴを製造する戦略を示す。ｐＩＮＴはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子を含む（例えば，Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２６９−２７０を参照）。ｐＩＮＴが核酸のリステリアのゲノム中への部位特異的インテグレーションを媒介する場合，次にＣｒｅリコンビナーゼに過渡的に暴露することにより抗生物質耐性遺伝子を排除することができる。図１に示されるように，抗生物質耐性遺伝子は第１のｌｏｘＰ部位と第２のｌｏｘＰ部位との間に存在する。Ｃｒｅリコンビナーゼは，２つのｌｏｘＰ部位の間に存在する物質の除去を触媒することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼの過渡的発現は，Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドのエレクトロポレーションにより，または多くの他の手法により行うことができる。
本発明のＬｉｓｔｅｒｉａゲノムまたは染色体は，プラスミドｐＰＬ１，ｐＰＬ２，および／またはｐＩＮＴ１を用いて改変する（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６）。プラスミドｐＰＬ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４８８）は，Ｕ１５３インテグラーゼをコードする核酸を含み，ここで，このインテグラーゼはリステリアのゲノムのｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ’位置におけるインテグレーションを触媒する（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６）。ｃｏｍＫの構造は入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１７４５８８のヌクレオチド５４２−１１１４）。ｐＰＬ１はカセットの挿入に適した多数の制限部位を含む。例えば，ある態様においては，本発明のカセットは，少なくとも１つの異種抗原およびｌｏｘＰにより挟まれている領域をコードし，ここで，ｌｏｘＰにより挟まれている領域は，インテグラーゼをコードする第１の核酸および抗生物質耐性因子をコードする第２の核酸を含む。制限部位のいくつかは表６に示される。制限部位は，標準的な方法によりデノボで導入することもできる。
当業者は，ｐＰＬ１およびｐＰＬ２を調製するのに用いた手法，およびｐＰＬ１およびｐＰＬ２を用いて部位特異的インテグレーションを媒介するのに用いた手法を，本発明のインテグラーゼ，ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’），および細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）に適用しうることを理解するであろう。
ｐＰＬ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４９９）はＰＳＡインテグラーゼをコードする核酸を含み，ここで，このインテグラーゼはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムのｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子におけるインテグレーションを触媒する（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６）。７４ヌクレオチドｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子は，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤゲノムのヌクレオチド１，２６６，６７５−１，２６６，７４８（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０を参照），およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株４ｂＦ２６５のヌクレオチド１，２４３，９０７−１，２４３，９８０（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００２９７３を参照）に見いだされる。ｐＰＬ２は，カセットの挿入に適した多数の制限部位を含む。本発明は，例えば，異種抗原およびｌｏｘＰに挟まれた領域をコードするカセットを提供し，ここで，ｌｏｘＰに挟まれた領域は，インテグラーゼをコードする第１の核酸および抗生物質耐性因子をコードする第２の核酸を含む。制限部位のいくつかは表６に示される。標準的な方法を用いて他の制限部位をデノボで導入することができる。
部位特異的組換えの第１の態様は，インテグラーゼにより触媒される，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中の特定のｔＲＮＡＡｒｇ領域に位置するインテグレーション部位における核酸の部位特異的インテグレーションを含む。
第２の態様は，ＬｉｓｔｅｒｉａゲノムのＣｏｍＫ領域における核酸のインテグレーションを利用する。
別の態様はプロファージ付着部位を含み，ここで，標的は，例えば，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｆ６８５４φＦ６８５４．３のｔＲＮＡ−Ｔｈｒ４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９８３．１のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＥＧＤのヌクレオチド２７７，６６１−２７７７１０），Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ １１２６２φ１１２６２．１のｔＲＮＡ−Ｌｙｓ４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９６１６３．１のヌクレオチド１１５，５０１−１１５，５４８）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １２６２と同様にＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １１２６２ｐｈｉ１１２６２．３；Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ １１２６２φ１１２６２．４の遺伝子間（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９６１６９．１のヌクレオチド１６２，１２３−１６２，１４３）；およびＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １１２６２φ１１２６２．６のｔＲＮＡ−Ａｒｇ４（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９６１７３．１のヌクレオチド１５９０８−１５９２２またはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＥＧＤのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９８３．１のヌクレオチド１４５，２２９−１４５，２４３）に見いだされる（例えば，Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２３８６−２３９５を参照）。
部位特異的組換えのさらに別の態様は，ｔＲＮＡＡｒｇ領域またはＣｏｍＫ領域における部位特異的インテグレーションによるｌｏｘＰ部位（またはＦｒｔ部位）の挿入を含み，ここで，ｌｏｘＰ部位の挿入の後に，核酸のＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中へのＣｒｅリコンビナーゼ媒介性挿入が生ずる。
ｐＰＬ１は，ｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ’染色体位置（６，１０１ｂｐ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４８８）にインテグレートする。このインテグレーションはＵ１５３インテグラーゼにより触媒される。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｃｏｍＫ遺伝子は開示されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１７４５８８のヌクレオチド５４２−１１１４）。ｐＰＬ１のインテグレーション部位はプラスミド配列ＡＪ４１７４８８のヌクレオチド２６９４−２６９６を含む。以下の２つのＰＣＲプライマーはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムの付着部位ｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ’をひとまとめにする：プライマーＰＬ６０は５’−ＴＧＡＡＧＴＡＡＡＣＣＣＧＣＡＣＡＣＧＡＴＣ−３’（配列番号９）であり；プライマーＰＬ６１は５’−ＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１０）である。プライマー対ＰＬ６０およびＰＬ６１は，ｃｏｍＫ−ａｔｔＢＢ’を増幅して，非溶原性株，例えばＤＰ−Ｌ４０５６中で４１７ｂｐの産物を与える。
ｐＰＬ２はｔＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢ’の染色体位置にインテグレートする（６，１２３ｂｐ；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４４９）。このインテグレーションは，ＰＳＡインテグラーゼにより触媒される。ｐＰＬ２はｐＰＬ１と類似するが，ただし，ｐＰＬ１のＰＳＡファージ付着部位およびＵ１５３インテグラーゼが欠失しており，ＰＳＡインテグラーゼおよびＰＳＡファージ付着部位で置き換えられている。ｐＰＬ２インテグレーション部位はプラスミドｐＰＬ２（ＡＪ４１７４４９）のヌクレオチド２８５２−２８６８に位置する１７ｂｐ領域を含み，対応する細菌の領域はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０）のヌクレオチド１，２６６，７３３−１，２６６，７４９に存在する。
Ｕ１５３リステリアファージと密接に関連するファージであるリステリアファージＡ１１８については，ａｔｔＢの位置は５７３ｂｐのｃｏｍＫ ＯＲＦのヌクレオチド１８７−１８９にある（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３２４−３４０）。この５７３ｂｐＯＲＧ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１７４５８８のヌクレオチド５４２−１１１４）およびａｔｔＢ部位（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１７４５８８のヌクレオチド７０１−７５７）は，両方ともＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１７４５８８に開示されている。ａｔｔＰ部位はリステリアファージＡ１１８ゲノムのヌクレオチド２３５００−２３４４４に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ２４２５９３）。
本発明は，核酸，例えばプラスミドの，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中のインテグレーション部位におけるインテグレーションを触媒するための試薬および方法を提供する。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムは開示されている（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３１９８，Ｈｅ ａｎｄ Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８０−３４８７，Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３２：２３８６−２３９５；Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：２０７−２１３；Ｄｏｕｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：１０７２−１０８３；Ｇｌａｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：８４９−８５２を参照）。
核酸のＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中へのインテグレーションを触媒するのに適当な酵素としては，例えば，Ｕ１５３インテグラーゼ（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４８８のヌクレオチド２７４１−４０９９の相補体；Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６）を参照）およびＰＳＡインテグラーゼ（例えば，ＰＳＡファージゲノムのヌクレオチド１９，４１３−２０，５６７の相補体（３７，６１８ｂｐゲノム）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２９１）を参照）が挙げられる。
ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子について，およびこの遺伝子中に見いだされるコアインテグレーション部位について，類似のまたは同一のヌクレオチド配列はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの多数の株について開示されている。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤの完全ゲノム（２，９４４，合計５２８ｂｐ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０）は，ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子中にインテグレーション部位を含む。７４ヌクレオチドのｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０のヌクレオチド１，２６６，６７５−１，２６６，７４８に見いだされる。同様に，ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ４ｂＦ２６５株（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００２９７３）のヌクレオチド１，２４３，９０７−１，２４３，９８０に生ずる。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＷＳＬＣ１０４２株のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子の配列はＬａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６に開示されている。Ｌａｕｅｒら（上掲）は，細菌コアインテグレーション部位および対応するファージコアインテグレーション部位を開示する。
機能的クラスター中における存在は，そのクラスター中に存在する核酸の機能を確立する。細菌遺伝子またはバクテリオファージ遺伝子の機能は，機能が知られている他の遺伝子とともに機能的クラスターにグループ化されるか，類似の機能をもつ他の遺伝子に対するその転写方向，および類似の機能をもつ他の遺伝子とともに１つのオペロン上で発生するかにしたがって同定することができる（例えば，Ｂｏｗｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：Ｒ３５．１−Ｒ３５．１３を参照）。例えば，ファージインテグラーゼをコードする遺伝子は，多数のファージ（または細菌のゲノム内にインテグレートされているファージ）のゲノム中で同定されており，ここで，ファージインテグラーゼ遺伝子は溶原性制御クラスター中に存在し，このクラスターは非常に限定された数の遺伝子（３個の遺伝子から９個の遺伝子）を含む（例えば，Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３２４−３４０；Ｚｉｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：３０３−３１７；Ｚｉｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４３５９−４３６８を参照）。
ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）はファージインテグラーゼ遺伝子と本質的に隣接して位置する。Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓによれば，インテグラーゼ遺伝子（ｉｎｔ）およびａｔｔＰは，典型的には隣接しており，これらが共進化することを容易にしている（Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：８５９−８６０）．例えば，ｐｈｉＣ３１ファージにおいては，ファージインテグラーゼはヌクレオチド（ｎｔ）：３８，４４７−４０，２６４によりコードされ，一方，ａｔｔＰ部位はｎｔ３８，３４６−３８，４２９の近傍に存在する。ＰｈｉＣ３１ファージインテグラーゼはインテグレーション反応を触媒するために補因子を必要とせず，異質の細胞環境，例えば哺乳動物細胞中で機能することができる（例えば，Ｔｈｏｒｐｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５５０５−５５１０；Ｇｒｏｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：５９９５−６０００；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ００６５８９を参照）。さらに，ファージＳＭ１，ファージＨＰ１，ファージｐｈｉ３６２６，種々の放線菌ファージ（ｉｎｔＭ遺伝子），ファージラムダ，およびファージＡａｐｈｉ２３については，インテグラーゼ遺伝子およびａｔｔＰ部位は互いにすぐ隣に位置している。インテグラーゼ遺伝子およびａｔｔＰ部位は，“溶原性制御クラスター”として知られる遺伝子の小さな群の中で一緒に生ずることができる。ゲノム上の位置，およそのサイズ，最大活性サイズ，および／またはａｔｔＰＰ’部位（ａｔｔＰ部位）の最小サイズを決定する方法が利用可能である（例えば，Ｚｉｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４３５９−４３６８；Ｓｉｂｏｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：６９６８−６９７５；Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：１２２７−１２３７；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４９：２４４３−２４５３；Ｈｏｅｓｓ ａｎｄ Ｌａｎｄｙ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：５４３７−５４４１；Ｒｅｓｃｈ（２００５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ａａｐｈｉ２３，Ｉｎａｕｇｕｒａｌ ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．Ｂａｓｅｌ；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１９３−２２２を参照）。
本発明は，リステリアのゲノムを改変するのに用いるためのベクターを提供し，ここで，ベクターは，ｐｈｉＣ３１ファージインテグラーゼ，ｐｈｉＣ３１ａｔｔＰＰ’部位をコードし，リステリアのゲノムはｐｈｉＣ３１ａｔｔＢＢ’部位を含むよう改変されている。細菌のゲノム，例えばＬｉｓｔｅｒｉａまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノムを相同組換えにより改変してａｔｔＢＢ’部位を含むようにすることができる。ｐｈｉＣ３１ａｔｔＢＢ’部位は，Ｔｈｏｒｐｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５５０５−５５１０により開示されている。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼのアミノ酸配列は以下に開示される（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１４６７０）：
MTQGVVTGVDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAA (GenBank Acc. No. AJ414670) (配列番号11)
本発明は，以下の関連するｐｈｉＣ３１標的ａｔｔＢＢ’部位およびその機能的変種を提供する：
TGACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCA (配列番号12) (例えば， Thorpe and Smith (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5505-5510を参照)。
gtcgacgatgtaggtcacggtctcgaagccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccacctcacccatctggtccatcatgatgaacgggtcgaggtggcggtagttgatcccggcgaacgcgcggcgcaccgggaagccctcgccctcgaaaccgctgggcgcggtggtcacggtgagcacgggacgtgcgacggcgtcggcgggtgcggatacgcggggcagcgtcagcgggttctcgacggtcacggcgggcatgtcgac (配列番号13) (GenBank Acc. No. X60952)
さらに，本発明は，以下の関連するｐｈｉＣ３１ａｔｔＰＰ’部位およびその機能的変種を提供する。
AAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGTCAGTCGCGCGAGCGCGAGAATTC (配列番号14) (例えば， GenBank Acc. Nos. X57036 and AJ006589; Thorpe and Smith (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5505-5510を参照)
本発明は，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，ｐＰＬ１のファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしないベクターを包含する。また，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，ｐＰＬ２のファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしないベクターを包含する。さらに，本発明は，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，ｐＰＬ１またはｐＰＬ２のファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしないベクターを包含する。
本発明は，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，Ｕ１５３ファージのファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしない異種核酸を細菌のゲノム中にインテグレートさせるのに有用なベクターを包含する。また，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，ＰＳＡファージのファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしない異種核酸を細菌のゲノム中にインテグレートさせるのに有用なベクターも包含する。さらに，本発明は，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，Ｕ１５３ファージおよびＰＳＡファージのいずれのファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位もコードしない異種核酸を細菌のゲノム中にインテグレートさせるのに有用なベクターを包含する。別の観点においては，本発明は，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，Ａ１１８ファージのファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位をコードしない異種核酸を細菌のゲノム中にインテグレートさせるのに有用なベクターを包含する。本発明により包含される別のものは，ファージインテグラーゼおよび機能的に活性なａｔｔＰＰ’部位をコードするが，Ａ１１８ファージ，Ｕ１５３ファージ，またはＰＳＡファージのいずれのファージインテグラーゼおよびａｔｔＰＰ’部位もコードしない異種核酸を細菌のゲノム中にインテグレートさせるのに有用なベクターである。
Ｂ． 相同組換え
相同組換えの標的部位は，オープンリーディングフレーム，病原性遺伝子，機能未知の遺伝子，偽遺伝子，機能が示されていないＤＮＡの領域，成長を媒介する遺伝子，拡散を媒介する遺伝子，制御領域，リステリアの成長または生存を媒介するゲノムの領域，その中断が減弱化につながる遺伝子，遺伝子間領域等であることができる。
最初の例としては，抗原（プロモーターと動作可能なように連結されている）をコードする核酸を病原性遺伝子中に埋め込むと，２倍の結果，すなわち病原性遺伝子の活性化および発現可能な抗原の作成が得られる。
本発明は，相同組換え（またはアレル交換等）によりリステリアの病原性遺伝子中にインテグレートされた発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。インテグレーションは，リステリアのゲノムの対応する核酸の欠失を伴っても伴わなくてもよい。
発現カセットは，病原性遺伝子の１またはそれ以上のプロモーター（親または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａにすでに存在するプロモーター）と動作可能なように連結されていてもよい。あるいは，発現カセットは，（１）発現カセットにより供給される１またはそれ以上のプロモーター；および（２）親または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａにより供給される１またはそれ以上のプロモーターの両方と動作可能なように連結されていてもよい。
ある態様においては，発現カセットは，発現カセットにより供給される１またはそれ以上のプロモーターと動作可能なように連結されており，Ｌｉｓｔｅｒｉａのいずれのプロモーターとも動作可能なように連結されていなくてもよい。
いかなる限定をも示唆するものではないが，病原性因子遺伝子は，ａｃｔＡ，ｉｎｌＢ，ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの１またはそれ以上であってもよく，ならびに表３に開示される遺伝子の１またはそれ以上であってもよい。別の観点においては，相同組換えは，成長，拡散，または，成長および拡散の両方を媒介する１またはそれ以上の遺伝子の遺伝子座において生ずることができる。
別の観点においては，本発明は，ポリヌクレオチドを有するＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し，ここで，ポリヌクレオチドは，病原性因子の遺伝子座にインテグレートされている核酸（異種抗原をコードする）を含む。ある態様においては，インテグレーションは相同組換えにより生ずる。ある態様においては，本発明は，病原性因子遺伝子の制御領域における，病原性因子遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における，または病原性因子の制御領域およびＯＲＦの両方におけるインテグレーションを提供する。インテグレーションは，病原性因子遺伝子の全部または一部の欠失を伴っていても伴っていなくてもよい。
異種抗原をコードする核酸の発現は，病原性因子のプロモーターにより媒介されていてもよく，ここで，このプロモーターは，核酸と動作可能なように連結されている。例えば，ａｃｔＡ遺伝子中にインテグレートした核酸は，ａｃｔＡプロモーターと動作可能なように連結されていてもよい。また，ｉｎｌＢ遺伝子座にインテグレートした核酸は，ｉｎｌＢプロモーターと動作可能なように連結されかつインフレームであってもよい。さらに，または代替として，オープンリーディングフレームの発現の制御は，すべて核酸により供給されるプロモーターにより媒介されてもよい。
発現カセットおよび上述の核酸は，１またはそれ以上のリステリアプロモーター，１またはそれ以上の非リステリア細菌プロモーター，ａｃｔＡプロモーター，ｉｎｌＢプロモーター，およびこれらの任意の組み合わせを提供することができる。プロモーターは発現カセットの発現を媒介する。また，プロモーターは上述の核酸の発現を媒介する。さらに，プロモーターはＯＲＦと動作可能なように連結されている。
ある態様においては，病原性遺伝子中へのインテグレーション，または病原性遺伝子の遺伝子座におけるインテグレーションの結果，病原性遺伝子の全部または一部が欠失し，および／または病原性遺伝子の制御が中断する。ある態様においては，インテグレーションの結果，病原性遺伝子が減弱化するか，または，病原性遺伝子が活性化する。さらに，本発明は，ｐｒｆＡ依存性であるプロモーター，ｐｒｆＡ非依存性であるプロモーター，合成起源のプロモーター，部分的に合成起源のプロモーター等を提供する。
上述のＬｉｓｔｅｒｉａを製造する方法が提供される。また，発現カセットを発現させるために，または上述の核酸を発現させるために上述のＬｉｓｔｅｒｉａを使用する方法も提供される。さらに，ある態様においては，哺乳動物免疫系を刺激する方法が提供され，この方法は，上述のＬｉｓｔｅｒｉａを哺乳動物に投与することを含む。
別の例を挙げると，一旦細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）が病原性遺伝子中に移植されると，その結果は２倍であり，すなわちその遺伝子が活性化され，これに加えて，核酸をそのａｔｔＢＢ’部位に効率的にインテグレーションすることを可能とするツールが作成される。
ｐＫＳＶ７プラスミドまたは別の適当なプラスミドの，リステリアのゲノム中への相同的インテグレーションの指示においては，本発明は，普通は少なくとも０．０１ｋｂ，より普通には少なくとも０．０２ｋｂ，最も普通には少なくとも０．０４ｋｂ，頻繁には少なくとも０．０８ｋｂ，より頻繁には少なくとも０．１ｋｂ，最も頻繁には少なくとも０．２ｋｂ，通常は少なくとも０．４ｋｂ，うより通常は少なくとも０．８ｋｂ，一般に少なくとも１．０ｋｂ，より一般には少なくとも１．５ｋｂ，最も一般には少なくとも２．０ｋｂである，ホモロジーの領域を提供する。
図２は，ｐＫＳＶ７を細菌のゲノム中への相同組換えにおいて用いる戦略を示す。工程１においては，プラスミドはゲノム中のホモロジーの領域と交叉する。工程２においては，プラスミドはゲノム中にインテグレートされて，部分２倍体中間体を生成する。ＷＸＹＺは，ｐＫＳＶ７中の任意の配列，例えば抗生物質耐性をコードする遺伝子を表す。工程３は，第２の交叉を示し，工程４はｐＫＳＶ７プラスミドの“体部”の脱離およびＷＸＹＺの脱離を示す。次にＣｒｅリコンビナーゼで処理すると，例えば，組換えＣｒｅを過渡的に発現させると，ｌｏｘＰ部位の間の物質の除去が触媒される。
図３は挿入物を調製する方法を示し，ここで，挿入物はｐＫＳＶ７中に配置される。挿入物はリステリアのゲノム中への相同組換えを媒介して，その結果種々の要素（抗原，ｌｏｘＰ部位，および抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸）がリステリアゲノム中にインテグレーションされる。次にＣｒｅリコンビナーゼで処理すると，ｌｏｘＰ部位の間の物質の除去が触媒される。
図４は挿入物を調製する方法を示し，ここで挿入物はｐＫＳＶ７中に配置される。挿入物はリステリアのゲノム中への相同組換えを媒介し，その結果種々の要素（抗原をコードする核酸）がリステリアのゲノム中にインテグレーションされる。ｌｏｘＰ部位および抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸は，改変型ｐＫＳＶ７によりコードされる。次にＣｒｅリコンビナーゼで処理すると，例えば，組換えＣｒｅを過渡的に発現させると，ｌｏｘＰ部位の間の物質の除去が触媒される。
図５は，インテグレーションのみが生じ，欠失が生じない態様を示す。次にＣｒｅリコンビナーゼで処理すると，例えば，組換えＣｒｅを過渡的に発現させると，ｌｏｘＰ部位の間の物質の除去が触媒される。
相同組換えにより製造される本発明の試薬および方法は，ｐＫＳＶ７またはその誘導体の使用に限定されない。相同組換えに適した他のベクターが利用可能である（例えば，Ｍｅｒｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４５７３−４５８１；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５９７８−５９８３；Ｓｍｉｔｈ（１９８８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．５２：１−２８；Ｂｉｓｗａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７５：３６２８−３６３５；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５９７８−５９８３；Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｔｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：１２３−１２８を参照）。
相同組換えにより核酸をインテグレートさせるためには，細菌にｐＫＳＶ７をエレクトロポレーションし，ここで，ｐＫＳＶ７は異種蛋白質をコードするか，またはｐＫＳＶ７は発現カセットを含む。細菌は適当な抗生物質，例えばクロラムフェニコール（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩ寒天培地（または動物蛋白質に基づかない培地）に播種することにより選択し，許容温度の３０℃でインキュベーションする。細菌染色体へのシングルクロスオーバーインテグレーションは，いくつかの独立したコロニーを抗生物質を含む培地中で非許容温度である４１℃で数代継代することにより選択される。最後に，いくつかの独立したコロニーを抗生物質を含まないＢＨＩ培地中で許容温度である３０℃で数代継代することにより，プラスミドの切り出しおよび救済（ダブルクロスオーバー）が達成される。
相同組換えを用いて，標的ＤＮＡからの物質の欠失を伴うかまたは伴わずに，核酸を標的ＤＮＡ中に挿入することができる。相同組換えを媒介するベクターは，第１の相同アーム（第１の核酸），第２の相同アーム（第２の核酸），２つの相同アームの間に存在し異種抗原をコードする第３の核酸を含む。相同アームと標的ゲノムＤＮＡとの相関に関しては，標的領域は互いに隣接していてもよく，または標的領域は互いに離れていてもよい。標的領域が互いに隣接する場合，相同組換えの事象の結果，単に第３の核酸が挿入される。しかし，標的領域が互いに離れている場合，相同組換えの事象の結果，第３の核酸が挿入され，かつ２つの標的領域の間に存在するＤＮＡの欠失も生ずる。
ｉｎｌＢ遺伝子における相同組換えは，ｐＫＳＶ７が媒介することができ，ここで，ｐＫＳＶ７は下記の中心構造を含む。下記の中心構造は，本質的に，第１の相同アーム（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムのｉｎｌＢ遺伝子の上流），ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む領域（下線），および第２の相同アーム（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｉｎｌＢ遺伝子の下流）から構成される。ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む領域は，挿入物を受け入れるのに適しており，ここで，挿入物も５’−プライムおよび３’−プライム末端（または３’末端および５’末端）にＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む。
CCAAATTAGCGATCTTACACCATTGGCTAATTTAACAAGAATCACCCAACTAGG
GTTGAATGATCAAGCATGGACAAATGCACCAGTAAACTACAAAGCAAATGTATC
CATTCCAAACACGGTGAAAAATGTGACTGGCGCTTTGATTGCACCTGCTACTAT
TAGCGATGGCGGTAGTTACGCAGAACCGGATATAACATGGAACTTACCTAGTTA
TACAAATGAAGTAAGCTATACCTTTAGCCAACCTGTCACTATTGGAAAAGGAAC
GACAACATTTAGTGGAACCGTGACGCAGCCACTTAAGGCAATTTTTAATGCTAA
GTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATT
GACTGAACCAGCTAAGCCCGTAAAAGAAGGTCACACATTTGTTGGTTGGTTTGA
TGCCCAAACAGGCGGAACTAAGTGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAA
TGACATCAATTTATATGCACAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACCTTTGA
GAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCAAGGCTTGTTACAAGA
ACCTACACCACCAACAAAAGAAGGTTATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGCAAA
AACTGGTGGTGACAAGTGGGATTTCGCAACTAGCAAAATGCCTGCTAAAAACAT
CACCTTATATGCCCAATATAGCGCCAATAGCTATACAGCAACGTTTGATGTTGA
TGGAAAATCAACGACTCAAGCAGTAGACTATCAAGGACTTCTAAAAGAACCAAA
GGCACCAACGAAAGCCGGATATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGAAAAAACAGA
TGGGAAAAAATGGGATTTTGCGACGGATAAAATGCCAGCAAATGACATTACGCT
GTACGCTCAATTTACGAAAAATCCTGTGGCACCACCAACAACTGGAGGGAACAC
ACCGCCTACAACAAATAACGGCGGGAATACTACACCACCTTCCGCAAATATACC
TGGAAGCGACACATCTAACACATCAACTGGGAATTCAGCCAGCACAACAAGTAC
AATGAACGCTTATGACCCTTATAATTCAAAAGAAGCTTCACTCCCTACAACTGG
CGATAGCGATAATGCGCTCTACCTTTTGTTAGGGTTATTAGCAGTAGGAACTGC
AATGGCTCTTACTAAAAAAGCACGTGCTAGTAAATAGAAGTAGTGTAAAGAGCT
AGATGTGGTTTTCGGACTATATCTAGCTTTTTTATTTTTTAATAACTAGAATCA
AGGAGAGGATAGTGGTACCTTGGTGAGCTCCCTACGAAAAGCTACAACTTTAAA
TTCATGAAAAAAGAACTGATTCGCTGAAAACGGATCAGTTCTTTTTTCTTTAGA
CTTATTTTTACAAAAACTTTTCGATAATTTCCATATTCTGGGGTCTGTCTTTGC
TTTCAAGTACAGAAATATCACGAACAATGCTATCTAATTTAATTTTTTCCATTT
CAAATTCTATTTTTTGTTGGAGCAGATCGTATTTACTCGTAAGAACTTGTTGGA
TATTGGCTCCGACAACGCAGTCTGGGTTGGTTTTTGGATCAACGTGAATTAAAT
TCGTATTGCCTTCTATACTCTTATAAACATCAAGCAGTGAAATTTCTTCTGGTG
GTCTAGCAAGAATCGGATTTGCTTTGCCAGTCTGCGTAGTAATTAAATCAGCTT
TTTTTAAATTACTCATGATTTTTCTAATGTTAGCAGGATTTGTTTTTACGCTAC
CAGCAATAATTTCACTCGATAACAAATTCGTATTTTTAAAAATTTCTATATAAG
CCAAAATGTGGATAGCATCGCTAAATTGGATAGAGTATTTCATTTTTTTCAATC
CTTTCAAATTTTCTCCTTGACTTATCTTATCATAATGTTTATTATAAAGGTGTA
AATTATAAATGTACAGCTTTAGTGTTAAAAAATTTAAAGGAGTGGTTTAAATGA
CTTATTTAGTAACTGGTGCAACAGGTGGACTTGGAGGCTACGCATTAAATTATT
TGAAAGAGCTGGTTCCCATGTCCGATATTTATGCTTTAGTTCGTAGCGAAGAAA
AAGGTACAGACTTGAAAGCAGCAGGATTTAATATCCGTATTGGTGATTATAGTG
ATGTAGAATCAATGAAGCAAGCATTCGCAGGCATCGACCGCGTATTATTTGTTT
CAGGAGCACCTGGTAATCGCCAAGTAGAACACGAAAATGTGGTAAATGCGGCAA
AAGAAGCAGGCGTTTCTTACATCGCTTACACAAGTTTCGCGGGCGCAGATAAAT
CCACAAGCGCTTTAGCAGAAGATCATTTCTTTACCGAAAAAGTAATCGAAAAAT
CCGGAATCGCGCACACTTTCTTGCGTAACAACTGGTACTTCGAAAATGAAATGC
CGATGATCGGTGGCGCATTGAGTGCTGGAAAATTTGTATACGCTGCTGAAAATG
GAAAAGTTGGCTGGGCATTAAAACGCGAATACGCAGAAGTAGCCGCAAAAGCTG
TTGCGGACGCTGACTTCCCAGAAATCCTTGAATTATCTGGCCCACTCATGCAAT
TCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC
CACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAG
TGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA
ACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCATGCAATTCA (配列番号15)
下記は発現カセットを挿入するためのＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む“中心領域”の領域である：
ＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＣＴＣ（配列番号１２１）
上流相同アームは下記に示される（ｉｎｌＢ遺伝子の上流）。この配列はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １０４０３Ｓからのものである。下記に，別のリステリアの株である，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ４ｂＦ２３６５との比較を示す。この株においては，ｉｎｌＢ遺伝子はｎｔ１９６，２４１−１９８，１３３に存在する（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ０１７３２３；１０セグメントのセグメント２）。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １０４０３Ｓについて本明細書に開示される上流相同アームは，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ４ｂＦ２３６５のｎｔ１９４，９３２−１９６，２４０に対応する配列を有する（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ０１７３２３；１０セグメントのセグメント２）。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １０４０３Ｓについてここで開示される下流相同アームは，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ４ｂＦ２３６５のｎｔ１９８，１３４−１９９，６２９に対応する（ただし完全に同一ではない）配列を有する（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ０１７３２３；１０セグメントのセグメント２）。
(上流相同アーム)
CCAAATTAGCGATCTTACACCATTGGCTAATTTAACAAGAATCACCCAACTAGG
GTTGAATGATCAAGCATGGACAAATGCACCAGTAAACTACAAAGCAAATGTATC
CATTCCAAACACGGTGAAAAATGTGACTGGCGCTTTGATTGCACCTGCTACTAT
TAGCGATGGCGGTAGTTACGCAGAACCGGATATAACATGGAACTTACCTAGTTA
TACAAATGAAGTAAGCTATACCTTTAGCCAACCTGTCACTATTGGAAAAGGAAC
GACAACATTTAGTGGAACCGTGACGCAGCCACTTAAGGCAATTTTTAATGCTAA
GTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATT
GACTGAACCAGCTAAGCCCGTAAAAGAAGGTCACACATTTGTTGGTTGGTTTGA
TGCCCAAACAGGCGGAACTAAGTGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAA
TGACATCAATTTATATGCACAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACCTTTGA
GAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCAAGGCTTGTTACAAGA
ACCTACACCACCAACAAAAGAAGGTTATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGCAAA
AACTGGTGGTGACAAGTGGGATTTCGCAACTAGCAAAATGCCTGCTAAAAACAT
CACCTTATATGCCCAATATAGCGCCAATAGCTATACAGCAACGTTTGATGTTGA
TGGAAAATCAACGACTCAAGCAGTAGACTATCAAGGACTTCTAAAAGAACCAAA
GGCACCAACGAAAGCCGGATATACTTTCAAAGGCTGGTATGACGAAAAAACAGA
TGGGAAAAAATGGGATTTTGCGACGGATAAAATGCCAGCAAATGACATTACGCT
GTACGCTCAATTTACGAAAAATCCTGTGGCACCACCAACAACTGGAGGGAACAC
ACCGCCTACAACAAATAACGGCGGGAATACTACACCACCTTCCGCAAATATACC
TGGAAGCGACACATCTAACACATCAACTGGGAATTCAGCCAGCACAACAAGTAC
AATGAACGCTTATGACCCTTATAATTCAAAAGAAGCTTCACTCCCTACAACTGG
CGATAGCGATAATGCGCTCTACCTTTTGTTAGGGTTATTAGCAGTAGGAACTGC
AATGGCTCTTACTAAAAAAGCACGTGCTAGTAAATAGAAGTAGTGTAAAGAGCT
AGATGTGGTTTTCGGACTATATCTAGCTTTTTTATTTTTTAATAACTAGAATCA
AGGAGAGGATAGT (配列番号16)
下流相同アームは下記に示される（ｉｎｌＢ遺伝子の下流）：
（下流相同アーム）
CCTACGAAAAGCTACAACTTTAAATTCATGAAAAAAGAACTGATTCGCTGAAAA
CGGATCAGTTCTTTTTTCTTTAGACTTATTTTTACAAAAACTTTTCGATAATTT
CCATATTCTGGGGTCTGTCTTTGCTTTCAAGTACAGAAATATCACGAACAATGC
TATCTAATTTAATTTTTTCCATTTCAAATTCTATTTTTTGTTGGAGCAGATCGT
ATTTACTCGTAAGAACTTGTTGGATATTGGCTCCGACAACGCAGTCTGGGTTGG
TTTTTGGATCAACGTGAATTAAATTCGTATTGCCTTCTATACTCTTATAAACAT
CAAGCAGTGAAATTTCTTCTGGTGGTCTAGCAAGAATCGGATTTGCTTTGCCAG
TCTGCGTAGTAATTAAATCAGCTTTTTTTAAATTACTCATGATTTTTCTAATGT
TAGCAGGATTTGTTTTTACGCTACCAGCAATAATTTCACTCGATAACAAATTCG
TATTTTTAAAAATTTCTATATAAGCCAAAATGTGGATAGCATCGCTAAATTGGA
TAGAGTATTTCATTTTTTTCAATCCTTTCAAATTTTCTCCTTGACTTATCTTAT
CATAATGTTTATTATAAAGGTGTAAATTATAAATGTACAGCTTTAGTGTTAAAA
AATTTAAAGGAGTGGTTTAAATGACTTATTTAGTAACTGGTGCAACAGGTGGAC
TTGGAGGCTACGCATTAAATTATTTGAAAGAGCTGGTTCCCATGTCCGATATTT
ATGCTTTAGTTCGTAGCGAAGAAAAAGGTACAGACTTGAAAGCAGCAGGATTTA
ATATCCGTATTGGTGATTATAGTGATGTAGAATCAATGAAGCAAGCATTCGCAG
GCATCGACCGCGTATTATTTGTTTCAGGAGCACCTGGTAATCGCCAAGTAGAAC
ACGAAAATGTGGTAAATGCGGCAAAAGAAGCAGGCGTTTCTTACATCGCTTACA
CAAGTTTCGCGGGCGCAGATAAATCCACAAGCGCTTTAGCAGAAGATCATTTCT
TTACCGAAAAAGTAATCGAAAAATCCGGAATCGCGCACACTTTCTTGCGTAACA
ACTGGTACTTCGAAAATGAAATGCCGATGATCGGTGGCGCATTGAGTGCTGGAA
AATTTGTATACGCTGCTGAAAATGGAAAAGTTGGCTGGGCATTAAAACGCGAAT
ACGCAGAAGTAGCCGCAAAAGCTGTTGCGGACGCTGACTTCCCAGAAATCCTTG
AATTATCTGGCCCACTCATGCAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGT
GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGT
GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCT
CACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCAT
GCAATTCA (配列番号17)
リステリアのゲノムのＡｃｔＡ遺伝子における挿入に関して，以下にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １０４０３ＳのＡｃｔＡ座における相同組換えインテグレーションを媒介するための適当な上流および下流相同アームを記載する。
（上流相同アーム）
AGAATTTAGTTCCGCAGTGGATGCTCATTTTTACGCAAGTGAAGTGTACGAATACTATAAAAATGTCCACCAACTAGAGAGTCTAGATGGTAAAGGTGGAGAAATTGATTCGTTTGTCCATTATGGCTTGAATTGCAATAATGCCTTTTGGGATGGCCAAGAAATTCTTTATGGAGATGGGGACAAAAAGAATTTCAAACCATTTTCATGCGCCAAAACTATTGTTGGTCATGAACTAACGCATGCAGTTATCCAGTATTCGGCGGGATTGGAATACGAAGGGCAATCAGGTGCGCTAAACGAGTCGTTCGCCGATGTTTTTGGTTATTTTATTGCGCCAAATCATTGGTTGATTGGTGAGGATGTCTGTGTGCGTGGGTCGCGAGATGGGCGAATAAGAAGCATTAAAGATCCTGACAAATATAATCAAGCGGCTCATATGAAGGATTACGAATCGCTTCCAATCACAGAGGAAGGCGACTGGGGCGGAGTTCATTATAATAGTGGTATCCCGAATAAAGCAGCCTATAATACTATCNCTAAACTTGGAAAAGAAAAAACAGAACAGCTTTATTTTCGCGCCTTAAAGTACTATTTAACGAAAAAATCCCAGTTTACCGATGCGAAAAAAGCGCTTCAACAAGCAGCGAAAGATTTATATGGTGAAGATGCTTCTAAAAAAGTTGCTGAAGCTTGGGAAGCAGTTGGGGTTAACTGATTAACAAATGTTAGAGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAATAATTCATGAATATTTTTTCTTATATTAGCTAATTAAGAAGATAATTAACTGCTAATCCAATTTTTAACGGAATAAATTAGTGAAAATGAAGGCCGAATTTTCCTTGTTCTAAAAAGGTTGTATTAGCGTATCACGAGGAGGGAGTATAA (配列番号18)
以下に，リステリアＡｃｔＡ遺伝子への挿入を媒介するための適当な下流相同アームを記載する。
（相同下流アーム）
AAACACAGAACGAAAGAAAAAGTGAGGTGAATGATATGAAATTCAAAAATGT
GGTTCTAGGTATGTGCTTGACCGCAAGTGTTCTAGTCTTTCCGGTAACGATA
AAAGCAAATGCCTGTTGTGATGAATACTTACAAACACCCGCAGCTCCGCATG
ATATTGACAGCAAATTACCACATAAACTTAGTTGGTCCGCGGATAACCCGAC
AAATACTGACGTAAATACGCACTATTGGCTTTTTAAACAAGCGGAAAAAATA
CTAGCTAAAGATGTAAATCATATGCGAGCTAATTTAATGAATGAACTTAAAA
AATTCGATAAACAAATAGCTCAAGGAATATATGATGCGGATCATAAAAATCC
ATATTATGATACTAGTACATTTTTATCTCATTTTTATAATCCTGATAGAGAT
AATACTTATTTGCCGGGTTTTGCTAATGCGAAAATAACAGGAGCAAAGTATT
TCAATCAATCGGTGACTGATTACCGAGAAGGGAAATTTGACACAGCGTTTTA
TAAATTAGGCCTAGCAATCCATTATTATACGGATATTAGTCAACCTATGCAC
GCCAATAATTTTACCGCAATATCATACCCTCCAGGCTACCACTGTGCATATG
AAAATTACGTAGATACCATTAAACACAATTATCAAGCAACGGAAGACATGGT
AGCAAAAAGATTTTGCTCAGATGACGTGAAAGACTGGCTCTATGAAAATGCG
AAAAGGGCGAAAGCGGACTACCCGAAAATAGTCAATGCGAAAACTAAAAAAT
CATATTTAGTAGGAAATTCCGAATGGAAAAAGGATACAGTGGAACCTACTGG
AGCTAGACTAAGAGATTCACAGCAAACTTTGGCAGGTTTTTTAGAATTTTGG
TCTAAAAAAACAAATGAATAACAATATTTAGGAATACATTCTTATCCACTCG
TTAGCGGGTGGATATATTTTATGGGGAGGAAGTAAGCCAAATGTATATAAAA
GGGAGGTTAATCTTTTTCTTTGTAATGTTAGTAATCGCGTTATGTTCCGAAG
GGC (配列番号19)
（ｂ）．ＬｏｘＰに挟まれた抗生物質耐性遺伝子
ある態様においては，本発明は，第１の核酸の細菌のゲノムからの迅速なまたは効率的な切り出しを媒介する試薬および方法を提供する。この方法は，リコンビナーゼ媒介性切り出しによるものであり，ここで，リコンビナーゼは，第１の核酸を挟む異種リコンビナーゼ結合部位を認識する。異種リコンビナーゼ結合部位は，例えば，１対のｌｏｘＰ部位または一対のｆｒｔ部位でありうる。非限定的例として，第１の核酸は抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーをコードすることができる。
この態様の試薬としては，第１の核酸を挟む２つの異種リコンビナーゼ結合部位を含むプラスミド；第１の核酸を挟む２つの異種リコンビナーゼ結合部位を含む細菌のゲノム；および第１の核酸を挟む２つの異種リコンビナーゼ結合部位を含むゲノムを含む細菌が挙げられる。
この態様の方法は，下記の工程により記述される。
ｉ． 細菌をプラスミドでトランスフェクションし，ここで，プラスミドは，第１の核酸（一対の異種リコンビナーゼ結合部位により挟まれている）の細菌のゲノム内へのインテグレーションを媒介することができる；
ｉｉ． 第１の核酸（２つの異種リコンビナーゼ結合部位により挟まれている）を細菌のゲノム中にインテグレーションさせる。メカニズムに関して何らかの限定を示唆するものではないが，インテグレーションは，部位特異的組換えまたは相同組換えにより生ずることができる；
ｉｉｉ． インテグレートした第一の核酸を含む細菌を選択する。第１の核酸が抗生物質耐性遺伝子をコードする場合，選択は抗生物質を含む培地で細菌を培養することを含むことができる。選択工程によりジェノタイプ的に純粋な細菌が得られる；
ｉｖ． ジェノタイプ的に純粋な細菌を，リコンビナーゼにより触媒される細菌のゲノムからの第１の核酸の切り出しを容易にする条件で処理する。１対の異種リコンビナーゼ結合部位がｌｏｘＰ部位である場合，リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼでありうる。Ｃｒｅリコンビナーゼは，この酵素をコードするプラスミドをトランスフェクションすることにより細菌に導入することができる。１つの態様においては，Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は過渡的である。ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦＬＰリコンビナーゼは同じ酵素反応メカニズムを使用し，それらに特異的な１対の標的配列の間で正確な部位特異的切り出しを媒介する；
ｖ． Ｃｒｅリコンビナーゼにより触媒される第１の核酸の切り出しの後，希釈またはヌクレアーゼの作用によりプラスミドが失われるまで細菌を培養することができる；
ｖｉ． 得られた細菌は，ゲノム中の第１の核酸の存在により識別することができる。また，得られた細菌は，２つの異種リコンビナーゼ結合部位の一方がゲノムから失われることにより識別することができる。すなわち，２つの部位の一方のみが残存している。
上述の開示は，本発明の方法を記載される工程に限定することを意図するものではなく，本発明の方法を開示される工程の順番に限定することを意図するものではなく，これらの工程のすべてが生ずることを意味することを意図するものではない。本発明は，２つの異種リコンビナーゼ結合部位に限定される必要はない。２つのｌｏｘＰ部位および２つのＦｒｔ部位を含むポリヌクレオチドを用いることができ，例えば，２つのｌｏｘＰ部位が第１の核酸を挟み，２つのＦｒｔ部位が第２の核酸を含み，Ｃｒｅリコンビナーゼの過渡的発現により第１の核酸を切り出すことができ，ＦＬＰリコンビナーゼの過渡的発現（おそらくは異なる時点で）により第２の核酸を切り出すことができる場合などである。
部位特異的リコンビナーゼの標準的なＤＮＡ標的部位は，２つのリコンビナーゼ結合部位から構成され，ここで，２つのリコンビナーゼ結合部位はコア領域（スペーサー領域）を挟む。本発明は，２つの標準的なＤＮＡ標的部位（標準的なＤＮＡ標的部位）を提供し，ここで，この部位は第１の核酸を挟む。ＬｏｘＰは１つのタイプの標準的なＤＮＡ標的部位である。ＬｏｘＰは８ｂｐのコア領域またはスペーサーを挟む２つの１３ｂｐリコンビナーゼ結合部位（１３ｂｐ逆方向反復）を有する。すなわち，各ｌｏｘＰ部位は３４個の連続するヌクレオチド（３４ｂｐ）の配列である。
ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦＬＰリコンビナーゼは部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーのメンバーである。ＣｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼは，チロシン残基を利用してＤＮＡ切断を触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼはｌｏｘ部位を認識し，ＦＬＰリコンビナーゼはＦｒｔ部位を認識する。
代替および変種Ｌｏｘ部位およびＦｒｔ部位を設計するガイダンスが利用可能である。代替のスペーサー領域が望まれる場合，当業者は，Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介される切り出しは第１のｌｏｘ部位および第２のｌｏｘ部位に同一のスペーサー領域を必要とするようであることを理解するであろう（例えば，Ａｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ１０３；Ｎａｇｙ（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：９９−１０９；Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４０−４６；Ｓａｕｅｒ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８９０−９００；Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３０６７−３０７７；Ｌａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ１１５；Ｂａｅｒ ａｎｄ Ｂｏｄｅ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：４７３−４８０；Ｎａｋａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：６５７−６６５を参照）。
本発明は，第１のｌｏｘ部位および第２のｌｏｘ部位を含むポリヌクレオチドを包含し，ここで，１対のｌｏｘ部位は第１の核酸を挟み，第１の核酸は，例えば，選択マーカー，抗生物質耐性遺伝子，制御領域，または抗原をコードすることができる。また，第１のｌｏｘ部位および第２のｌｏｘ部位を含むポリヌクレオチドも企図され，ここで，１対のｌｏｘ部位は第１の核酸を挟み，第１の核酸は，例えば，選択マーカー，抗生物質耐性遺伝子，制御領域，または抗原をコードすることができる。
当業者は，Ｃｒｅリコンビナーゼが８−１０ｂｐ程度の短いリコンビナーゼ結合部位により機能しうるという報告に鑑みて，リコンビナーゼ結合部位が１３ｂｐ未満である変種Ｌｏｘ部位が利用可能であることを容易に理解するであろう。
ｌｏｘ部位の代替として，非限定的例を提供するためにｌｏｘＹが利用可能である。本発明は，第１のｌｏｘＹ部位および第２のｌｏｘＹ部位を含むポリヌクレオチドを包含し，ここで，１対のｌｏｘＹ部位は第１の核酸を挟み，第１の核酸は，例えば，選択マーカー，抗生物質耐性遺伝子，制御領域，または抗原等をコードすることができる。ｌｏｘＰのコア領域はプリンとピリミジン塩基とを交互に有することにも注意すべきである。しかし，この交互パターンはＣｒｅリコンビナーゼによる認識に必要であり，本発明は，変異したコア領域を有するＬｏｘＰ部位の変種を包含する（例えば，Ｓａｕｅｒ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４６０８−４６１３；Ｈｏｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：２２８７−２３００を参照）。
Ｆｒｔ部位は，３つの１３ｂｐの対称要素および１つの８ｂｐコア領域を含む（合計４８ｂｐ）。ＦＬＰリコンビナーゼは，Ｆｒｔならびに変種Ｆｒｔ部位，例えば，３４ｂｐ程度の短いＦｒｔ部位，および変種コア領域を有するＦｒｔ部位を基質として認識する（例えば，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：６７−７７；Ｂｏｄｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：８０１−８１３を参照）。
本発明は，第１のｌｏｘＰ部位および動作可能なように連結された第２のｌｏｘＰ部位を含むポリヌクレオチドを提供し，第１のｌｏｘＰ部位および第２のｌｏｘＰ部位が第１の核酸を挟むものは非限定的例である。本発明は他の異種リコンビナーゼ結合部位，例えばｌｏｘＰの変種，ならびにｆｒｔ部位およびｆｒｔ部位変種を包含することが理解されるであろう。
“動作可能なように連結”との用語は，第１のｌｏｘＰ部位および第２のｌｏｘＰ部位について適用され，２つのｌｏｘＰ部位が第１の核酸を挟む場合，以下を包含する。ここでは，“動作可能なように連結”とは，Ｃｒｅリコンビナーゼが基質として第１のｌｏｘＰ部位および第２のｌｏｘＰ部位を認識することができ，かつ第１の核酸の細菌のゲノムからの切り出しを触媒することができることを意味する。“動作可能なように連結”との用語は，ｌｏｘＰ部位に限定されず，任意の“異種リコンビナーゼ結合部位”，例えば，他のｌｏｘ部位，またはｆｒｔ部位を包含する。また，“動作可能なように連結”との用語は，リコンビナーゼにより触媒される切り出しに限定されず，この用語はまたリコンビナーゼにより触媒されるインテグレーションも包含する。さらに，“動作可能なように連結”との用語は，ゲノム中に存在する核酸に限定されず，プラスミド中に存在する核酸，遺伝子工学に用いられる中間体等も包含する。
リコンビナーゼをコードする核酸は表７Ａに示され，これらのリコンビナーゼにより認識される核酸標的部位は表７Ｂに示される。
種々の抗生物質耐性因子をコードする核酸配列は開示される（表８）。典型的な配列は，Ｌｉｓｔｅｒｉａに毒性の抗生物質，例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する耐性をコードするものである（表８）。
抗生物質耐性因子をコードする第１の核酸は，リボソーム結合部位，プロモーターと動作可能なように連結されており，翻訳開始部位，および／または翻訳終止部位を含み，２つの異種リコンビナーゼ結合部位により挟まれている。
本発明は，第１の核酸を挟む１対の動作可能なように連結されたｌｏｘＰ部位，および第２の核酸（ｌｏｘＰ部位により挟まれていない）を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，ポリヌクレオチドは，第１の鎖および第２の鎖から構成され，第１の核酸は第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し，第２の核酸は第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。１つの観点においては，第１のＯＲＦは第１鎖上にあり，第２のＯＲＦもまた第１鎖上にある。別の観点においては，第１のＯＲＦは第１の鎖上にあり，第２のＯＲＦは第２の鎖上にある。さらに別の観点では，第１のＯＲＦは第２の鎖上にあり，第２のＯＲＦは第１の鎖上にある。さらに，両方のＯＲＦが第２の鎖上に存在していてもよい。本発明は，１つの観点においては，上述のポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。また，上述のポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａも提供され，ここで，ポリヌクレオチドはプラスミド上にあってもよく，および／またはゲノム中にインテグレートされていてもよい。上述の態様のそれぞれは，ｌｏｘＰ以外の異種リコンビナーゼ結合部位を含んでいてもよい。例えば，ｌｏｘ変種，Ｆｒｔ部位，Ｆｒｔ変種，およびｌｏｘまたはＦｒｔとは無関係のリコンビナーゼ結合部位が利用可能である。
（ｃ）． ＡｃｔＡ融合蛋白質パートナーおよびその誘導体
Ａ． 改変型ＡｃｔＡ融合蛋白質パートナー，改変型ＡｃｔＡを含む融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド，およびポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ
ｉ． 一般
ある観点においては，本発明は，改変型ＡｃｔＡをコードし，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａを提供し，ここで，ポリヌクレオチドの発現により，改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質が生成する。改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの天然の分泌配列，別のリステリアの蛋白質に由来する分泌配列，非リステリア細菌蛋白質に由来する分泌配列を含むことができ，または改変型ＡｃｔＡは分泌配列を含まなくてもよい。
ＡｃｔＡ由来融合蛋白質パートナーは，発現を増加させ，安定性を増加させ，分泌を増加させ，免疫提示を増強し，免疫応答を刺激し，腫瘍に対する生存を改善し，癌に対する生存を改善し，感染性因子に対する生存を改善する等の用途を有する。
１つの観点においては，本発明は，融合蛋白質をコードする核酸配列と動作可能なように連結されているプロモーターを含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，融合蛋白質は，（ａ）改変型ＡｃｔＡおよび（ｂ）異種抗原を含む。ある態様においては，プロモーターはＡｃｔＡプロモーターである。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より長いアミノ酸配列を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡのシグナル配列を含むＡｃｔＡのフラグメントである（またはＡｃｔＡのシグナル配列を含むＡｃｔＡのフラグメントに由来する）。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，少なくともＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸を含むが，ＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸未満を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より長いが，ＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸より短いアミノ酸配列を含む。言い換えると，ある態様においては，改変型ＡｃｔＡ配列は，ＡｃｔＡ配列のアミノ酸５９とおよそアミノ酸２６５との間のいずれかにおいてトランケートしているＡｃｔＡのＮ末端フラグメント（ＡｃｔＡシグナル配列を含む）に対応する。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１２５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の５９−１１０アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１２５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の５９−１１０アミノ酸からなる。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の約６５−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の約６５−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の約６５−１２５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の約６５−１１０アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の約６５−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の約６５−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の約６５−１２５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の約６５−１１０アミノ酸からなる。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の７０−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８０−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８５−１２５アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９０−１１０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９５−１０５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の約１００アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の７０−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８０−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８５−１２５アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９０−１１０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９５−１０５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の約１００アミノ酸からなる。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡのアミノ酸１−１００を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡのアミノ酸１−１００からなる。ある態様においては，異種抗原は癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるかまたはこれに由来する。ある態様においては，異種抗原は癌，腫瘍，または感染性因子と免疫学的に交叉反応性であるか，またはこれと少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原は腫瘍抗原であるか，または腫瘍抗原に由来する。ある態様においては，異種抗原はヒトメソセリンであるかまたはこれに由来する。ある態様においては，融合蛋白質をコードする核酸配列は，Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現用にコドンが最適化されている。本発明はポリヌクレオチドを含むプラスミドおよび細胞を提供する。本発明はさらに，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムＤＮＡはポリヌクレオチドを含む。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ中のａｃｔＡ遺伝子の部位またはｉｎｌＢ遺伝子の部位に位置する。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａはポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む。本発明はさらに，Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性の医薬組成物を提供する。本発明はまた，哺乳動物（例えば，ヒト）において異種抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ（またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む有効量の組成物）を哺乳動物に投与することを含む。例えば，本発明はまた，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量のＬｉｓｔｅｒｉａ（またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）を癌または感染性因子を有する哺乳動物に投与することを含み，ここで，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するかまたはこれと免疫学的に交叉反応性である。
ＡｃｔＡ−Ｎ−１００異種抗原融合パートナーコンフィギュレーションを利用する抗原発現カセットの好ましい態様は，前記抗原融合コンストラクトを天然のａｃｔＡプロモーターおよび５’非翻訳領域（ＵＴＲ）ＲＮＡと機能的に連結することである。ａｃｔＡプロモーターからのＰｒｆＡ依存性転写により，ＡｃｔＡ蛋白質ＧＵＧ翻訳開始部位の前に１５０ヌクレオチドの５’ＵＴＲ ＲＮＡが合成される。ａｃｔＡプロモーター５’ＵＴＲを欠失したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ変異体は低レベルのＡｃｔＡを発現し，細胞内アクチンリクルートメントがないこと，細胞から細胞への拡散ができないこと，および野生型親細菌と比較して減弱化されていることにより特徴づけられる表現型となる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：１５５−１６６）。
ある態様においては，改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質を発現させるために用いられるプロモーターはｈｌｙプロモーターである。別の態様においては，プロモーターはａｃｔＡプロモーターである。これらのリステリアプロモーターは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の株に由来するものであることができる。例えば，ｈｌｙまたはａｃｔＡプロモーターは，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤに由来するものであってもよい。ＥＧＤ株のゲノム配列は，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９７４として公共的に利用可能である（完全ゲノムセグメント２／１２）（ｈｌｙプロモーター：ｎｔｓ５５８１−５８１８；ａｃｔＡ遺伝子：ｎｔｓ９４５６−１１３８９）（その全体が参照として本明細書に取り込まれる）。あるいは，用いられる配列は，別の株，例えばＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株１０４０３Ｓからのものであってもよい。
別の観点においては，本発明は，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，改変型ＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの少なくとも最初の５９アミノ酸を含むが，ＡｃｔＡの最初の約２６５アミノ酸未満を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の５９−１２５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の５９−１１０アミノ酸を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の７０−２００アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８０−１５０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の８５−１２５アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９０−１１０アミノ酸，ＡｃｔＡの最初の９５−１０５アミノ酸，またはＡｃｔＡの最初の約１００アミノ酸を含む。ある態様においては，第１の核酸は，ＡｃｔＡのアミノ酸１−１００をコードする。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性である。ある別の態様においては，ポリヌクレオチドはプラスミド系である。ある態様においては，ポリヌクレオチドはプロモーターと動作可能なように連結されている。例えば，ポリヌクレオチドは，以下の１またはそれ以上と動作可能なように連結されていてもよい：（ａ）ａｃｔＡプロモーター；または（ｂ）ａｃｔＡプロモーターではない細菌プロモーター。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍または感染性因子であるかまたはこれに由来する。ある態様においては，異種抗原は，癌，腫瘍，または感染性因子と免疫学的に交叉反応性であるか，または少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原はヒトメソセリンであるかまたはこれに由来する。本発明はさらに，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，．，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８である（下記の実施例ＶＩＩの表１１を参照）。本発明はまた，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，癌または感染性因子を有する哺乳動物にＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，ここで，異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するかまたは免疫学的に交叉反応性である。
ある態様においては，ＡｃｔＡの最初の１００アミノ酸をコードするＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの天然の配列を所望の異種抗原配列とインフレームで機能的に連結する。ある態様においては，異種抗原配列は，低ＧＣパーセンテージ生物であるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの最適コドン使用にしたがって合成する。ある態様においては，ａｃｔＡプロモーターを５’非翻訳配列とともに利用する組成物が望ましい。
別の観点においては，本発明は改変型ＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，改変型ＡｃｔＡは，（ａ）ａｃｔＡのアミノ酸１−５９，（ｂ）宿主細胞の細胞骨格のａｃｔＡ媒介性制御のための少なくとも１つのドメインにおける不活性化変異，その欠失，またはその前のトランケーションを含み，ここで，第１の核酸は，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである。ある態様においては，ドメインはコフィリンホモロジー領域（ＫＫＲＲ（配列番号２３））である。ある態様においては，ドメインはリン脂質コア結合ドメイン（ＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩ（配列番号２０））である。ある態様においては，少なくとも１つのドメインは，ＡｃｔＡの４つすべてのプロリンリッチドメイン，すなわち（ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＰＰ（配列番号２１），ＦＰＰＩＰ（配列番号２２））を含む。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはａｃｔＡ−Ｎ１００である。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性である。ある態様においては，ポリヌクレオチドはゲノム性ではない。ある態様においては，ポリヌクレオチドは，以下の１またはそれ以上と動作可能なように連結されている：（ａ）ａｃｔＡプロモーター；または（ｂ）ａｃｔＡプロモーターではない細菌（例えば，リステリアの）プロモーター。本発明はさらに，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ならびにＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンを提供する。ある態様においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８である（下記の実施例ＶＩＩの表１１を参照）。本発明はまた，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，癌または感染性因子を有する哺乳動物にＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，ここで異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するかまたはこれに免疫学的に交叉反応性である。ある態様においては，また，刺激はＬｉｓｔｅｒｉａを投与しない場合における免疫応答に関連する。
ある態様においては，癌は腫瘍または前癌性細胞を含む。ある態様においては，感染性因子は，ウイルス，病原性細菌，または寄生虫生物を含む。ある態様においては，異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子であるかまたはこれに由来する。ある態様においては，異種抗原は，癌，腫瘍，または感染性因子と免疫学的に交叉反応性であるかまたは少なくとも１つのエピトープを共有する。ある態様においては，異種抗原はヒトメソセリンであるかまたはこれに由来する。
ある態様においては，ＡｃｔＡの少なくともアミノ酸１−５９を含む改変型ＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含み，さらに野生型ＡｃｔＡ配列中に少なくとも１つの改変を含むポリヌクレオチドが提供され，ここで，少なくとも１つの改変は，宿主細胞細胞骨格のＡｃｔＡ媒介性制御に特異的に用いられるドメインにおける不活性化変異，その欠失，またはその位置もしくは前のトランケーションを含み，第１の核酸は，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである。
また，少なくとも１つの改変がコフィリンホモロジー領域ＫＫＲＲ（配列番号２３）における不活性化変異，その欠失またはそこでの停止を含む上述のポリヌクレオチドも包含される。さらに，少なくとも１つの改変がリン脂質コア結合ドメイン（ＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩ（配列番号２０））における不活性化変異，その欠失またはそこでの停止である上述のポリヌクレオチドも包含される。
さらに別の観点においては，少なくとも１つの改変が，１番目のプロリンリッチドメイン（ＦＰＰＰＰ（配列番号２１）），２番目のプロリンリッチドメイン（ＦＰＰＰＰ（配列番号２１）），３番目のプロリンリッチドメイン（ＦＰＰＰＰ（配列番号２１）），および４番目のプロリンリッチドメイン（ＦＰＰＩＰ（配列番号２２）），または１番目のプロリンリッチドメインの末端のそれぞれにおける不活性化変異，またはその欠失を含む，上述のポリヌクレオチドが企図される。別の観点においては，改変型ＡｃｔＡがＡｃｔＡ−Ｎ１００である，上述のポリヌクレオチドが提供される。
さらに別の態様は，上述のポリヌクレオチドの１またはそれ以上を含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。ポリヌクレオチドはゲノム性であってもよく，プラスミド系であってもよく，またはプラスミドおよびリステリアのゲノムの両方に存在していてもよい。また，ポリヌクレオチドがゲノム性ではない上述のＬｉｓｔｅｒｉａ，ならびにポリヌクレオチドがプラスミド性ではない上述のＬｉｓｔｅｒｉａも提供される。Ｌｉｓｔｅｒｉａは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ，または他のいくつかのリステリア種であることができる。
さらに別の態様により提供されるものは，腫瘍，癌細胞，または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法であり，この方法は，哺乳動物に上述のＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，異種抗原は，腫瘍，癌細胞，または感染性因子に由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有する。刺激が，Ｌｉｓｔｅｒｉａ（第２の核酸によりコードされる抗原に特異的）を投与しない場合における抗原特異的免疫応答と関連する，上述の方法も提供される。
任意に，異種抗原は，腫瘍，癌細胞，または感染性因子からの（またはそれに由来する）抗原と同一であってもよい。
ＡｃｔＡ−Ｎ１００は，ＡｃｔＡのアミノ酸１−１００をコードする核酸，ならびにこの核酸から発現されるポリペプチドを包含する（この番号付けはＡｃｔＡの分泌配列をすべて含む）。異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，ＡｃｔＡ−Ｎ１００をコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドが提供される。
さらに別の態様は，上述のポリヌクレオチドの１またはそれ以上を含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。ポリヌクレオチドはゲノム性であってもよく，プラスミド系であってもよく，またはプラスミドおよびリステリアのゲノムの両方に存在していてもよい。また，ポリヌクレオチドがゲノム性ではない上述のＬｉｓｔｅｒｉａ，ならびにポリヌクレオチドがプラスミド性ではない上述のＬｉｓｔｅｒｉａも提供される。Ｌｉｓｔｅｒｉａは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ，または他のいくつかのリステリア種であることができる。
ＡｃｔＡ−Ｎ１００を使用する方法もまた利用可能である。腫瘍，癌細胞，または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法が提供され，この方法は，哺乳動物に上述のＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含み，ここで，異種抗原は腫瘍，癌細胞，または感染性因子に由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有する。また，刺激がＬｉｓｔｅｒｉａ（第２の核酸によりコードされる抗原に特異的）を投与しない場合における抗原特異的免疫応答に関連する上述の方法も提供される。あるいは，異種抗原は，腫瘍，癌細胞，または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と同一であってもよい。
ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡシグナル配列が除去されたＡｃｔＡまたはＡｃｔＡの他の誘導体のフラグメントから構成される。ある態様においては，そのような改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは，さらにＡｃｔＡシグナル配列ではないシグナル配列を含む。ＡｃｔＡシグナル配列は以下のとおりである：ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡ（配列番号１２５）。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡはＡｃｔＡのアミノ酸３１−１００（すなわち，シグナル配列を欠失したＡｃｔＡ−Ｎ１００）から構成される。
本発明は，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，改変型ＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ＡｃｔＡは多数のドメインを含み，そのそれぞれは哺乳動物細胞骨格の成分に対する結合に役割を果たしており，本発明は，これらのドメインの１またはそれ以上を除去することを企図する。
ＡｃｔＡは，Ｎ−末端ドメイン（アミノ酸１−２３４），プロリンリッチドメイン（アミノ酸２３５−３９３），およびＣ末端ドメイン（アミノ酸３９４−６１０）等の多くのドメインを含む。最初の２つのドメインは，細胞骨格に対して異なる効果を有する（Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３６１６−３３６２６）。プロリンリッチドメインは４つのプロリンリッチモチーフを含む。プロリンリッチモチーフは，Ｅｎａ／ＶＡＳＰファミリーの蛋白質のためのドッキング部位である。ＡｃｔＡのプロリンリッチドメインが欠失すると，アクチン繊維のアセンブリが非常に低下する（Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３６１６−３３６２６）。Ｍａｃｈｎｅｒらは，もはやドッキングしない変異プロリンリッチモチーフを設計するためのガイダンスを提供しており，このガイダンスは本発明の態様において利用することができる（Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３）。例えば，プロリンリッチモチーフのフェニルアラニンは重要である。別の態様においては，本発明は，少なくとも１つの異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，ＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，各プロリンリッチモチーフ中のフェニルアラニンに対するコドンはアラニンコドンに変更されている。別の観点においては，ＡｃｔＡをコードする第１の核酸は，１番目のプロリンリッチモチーフにおいてのみ，２番目のプロリンリッチモチーフにおいてのみ，３番目のプロリンリッチモチーフにおいてのみ，４番目のプロリンリッチモチーフにおいてのみ，またはこれらの任意の組み合わせで，プロリンからアラニンへの変異を含む。別の観点においては，変更されたＡｃｔＡをコードする核酸は，１またはそれ以上のプロリンリッチモチーフのコドンにおける変異を，例えばコフィリンホモロジー領域および／またはリン脂質相互作用用のコア結合配列における変異または欠失との組み合わせで含むことができる。
また，プロリンから別のアミノ酸，例えばセリンへの変異を採用してもよい。変異の設計についての上述のガイダンスはプロリンリッチモチーフの変更に限定されず，コフィリンホモロジー領域，リン脂質相互作用用のコア結合配列，およびＡｃｔＡと哺乳動物細胞骨格との相互作用に寄与する他の任意のモチーフまたはドメインについても同様に適用される。
ＡｃｔＡは“リン脂質相互作用用のコア結合配列”であるドメインをＡｃｔＡのアミノ酸１８５−２０１に含み，ここで，リン脂質結合の機能は結合研究によって示されている（Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３６１６−３３６２６）。Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉら（上掲）によれば，リン脂質結合はアクチン結合蛋白質の活性を制御する。
ＡｃｔＡはコフィリンホモロジー領域ＫＫＲＲ（配列番号２３）を含む。ＫＫＲＲ（配列番号２３）領域の変異はＡｃｔＡがアクチン重合を刺激する能力を失わせる（例えば，Ｂａｏｕｊｅｍａａ−Ｐａｔｅｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１１３９０−１１４０４；Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７；Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１３：３２７７−３２８７を参照）。
以下は，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅによる，アミノ酸２６３からアミノ酸５９がトランケートしているトランケート型ａｃｔＡ誘導体の発現に関する。他のトランケート型誘導体とは異なり，ａｃｔＡＮ５９は発現されないが，より長いものはすべて発現された（Ｓｋｏｂｌｅ，Ｊ．（未発表））。試験した次に長い誘導体はａｃｔＡ−Ｎ１０１であった。ａｃｔＡ分泌配列である第１の融合蛋白質パートナーおよび第２の融合蛋白質パートナーから構成される融合蛋白質コンストラクトを，ａｃｔＡプロモーターから発現させると，蛋白質分泌は第１の融合蛋白質パートナーがａｃｔＡ−Ｎ１００である場合よりはるかに少なかった。欠失コンストラクトに関しては，第１の融合蛋白質パートナーがアミノ酸３１−５９が欠失した可溶性ａｃｔＡである場合にも良好な発現が認められた。さらに，良好な発現は第１の融合蛋白質パートナーがアミノ酸３１−１６５が欠失した可溶性ａｃｔＡである場合に認められた（Ｓｋｏｂｌｅ，Ｊ．（未公開））。
ある態様においては，本発明は，少なくとも１つの改変を含む改変型ＡｃｔＡをコードする第１の核酸および異種抗原をコードする第２の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，少なくとも１つの改変は，ＡｃｔＡポリペプチド配列における不活性化変異，その欠失，または宿主細胞の細胞骨格のＡｃｔＡ媒介性制御に必要なドメインまたはその前におけるその終止である。改変型ＡｃｔＡは，運動性が低下するか，および／またはプラークサイズが小さくなるものであることができ，変異体３４，３９，４８，および５６の１つをコードする核酸を含む（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７）。本発明はまた，ＡｃｔＡ変異体４９，５０，５１，５２，および５４の１つをコードする核酸を企図する。また，ＡｃｔＡ変異体４０，４１，４２，４３，４４，４５，４５，および４７の１つをコードする核酸も提供される。アクチンモノマー結合領域ＡＢ領域における変異体，すなわち，変異体４１，４２，４３，および４４も提供される（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７）。
別の観点においては，本発明の改変型ＡｃｔＡは，欠失変異体からなっていてもよく，欠失変異体を含んでいてもよく，または細胞中でアクチンを重合できないか，および／またはプラーク形成を支持できないか，または最大より低いプラーク形成しか支持できない欠失変異体ＡｃｔＡに由来するものであってもよい。これらのＡｃｔＡ欠失変異体としては，Δ３１−１６５；Δ１３６−２００；Δ６０−１６５；Δ１３６−１６５；Δ１４６−１５０，Δ３１−５８；Δ６０−１０１；およびΔ２０２−２６３等をコードする核酸が挙げられる（Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７）。より狭い欠失およびより広い欠失を有するＡｃｔＡ欠失変異体をコードする核酸も包含される。下記の一連の例は，コフィリンホモロジー領域における欠失を開示しており，本明細書に記載されるＡｃｔＡ欠失のそれぞれに任意に適用することができる。本発明は，コフィリンホモロジー領域におけるこれらの欠失をコードする核酸を提供する：Δ１４６−１５０；Δ１４５−１５０；Δ１４４−１５０；Δ１４３−１５０；Δ１４２−１５０；Δ１４１−１５０；Δ１４０−１５０；Δ１３９−１５０；Δ１３８−１５０；Δ１３７−１５０；Δ１３６−１５０等。また，以下の欠失を有するＡｃｔＡをコードする核酸も包含される：Δ１４６−１５０；Δ１４６−１５１；Δ１４６−１５２；Δ１４６−１５３；Δ１４６−１５４；Δ１４６−１５５；Δ１４６−１５６；Δ１４６−１５７；Δ１４６−１５８；Δ１４６−１５９；Δ１４６−１６０等。さらに，欠失変異体：Δ１４６−１５０；Δ１４５−１５１；Δ１４４−１５２；Δ１４３−１５３；Δ１４２−１５４；Δ１４１−１５５；Δ１４０−１５６；Δ１３９−１５７；Δ１３８−１５８；Δ１３７−１５９；Δ１３６−１６０等をコードする核酸も包含される。問題とする領域のＮ−末端およびＣ末端の両方に欠失がある場合，これらの２つの欠失のサイズは互いに同じである必要はない。
欠失の態様も提供され，これには以下のものが含まれるが，限定されない。全長ａｃｔＡ，貫膜アンカーを欠失したａｃｔＡ，またはａｃｔＡの他の変種をコードする核酸が提供され，ここで，ａｃｔＡは，以下のアミノ酸を含む（あるいは以下のアミノ酸からなる）セグメントを欠失している：
３１−５９，３１−６０，３１−６１，３１−６２，３１−６３，３１−６４，３１−６５，３１−６６，３１−６７，３１−６８，３１−６９，３１−７０，３１−７１，３１−７２，３１−７３，３１−７４，３１−７５，３１−７６，３１−７７，３１−７８，３１−７９，３１−８０，３１−８１，３１−８２，３１−８３，３１−８４，３１−８５，３１−８６，３１−８７，３１−８８，３１−８９，３１−９０，３１−９１，３１−９２，３１−９３，３１−９４，３１−９５，３１−９６，３１−９７，３１−９８，３１−９９，３１−１００，３１−１０１，３１−１０２，３１−１０３，３１−１０４，３１−１０５，３１−１０６，３１−１０７，３１−１０８，３１−１０９，３１−１１０，３１−１１１，３１−１１２，３１−１１３，３１−１１４，３１−１１５，３１−１１６，３１−１１７，３１−１１８，３１−１１９，３１−１２０，３１−１２１，３１−１２２，３１−１２３，３１−１２４，３１−１２５，３１−１２６，３１−１２７，３１−１２８，３１−１２９，３１−１３０，３１−１３１，３１−１３２，３１−１３３，３１−１３４，３１−１３５，３１−１３６，３１−１３７，３１−１３８，３１−１３９，３１−１４０，３１−１４１，３１−１４２，３１−１４３，３１−１４４，３１−１４５，３１−１４６，３１−１４７，３１−１４８，３１−１４９，３１−１５０，３１−１５１，３１−１５２，３１−１５３，３１−１５４，３１−１５５，３１−１５６，３１−１５７，３１−１５８，３１−１５９，３１−１６０，３１−１６１，３１−１６２，３１−１６３，３１−１６４，３１−１６５等。
さらに別の観点においては，ａｃｔＡ誘導体をコードする第１の核酸および異種核酸をコードする第２の核酸を含むポリペプチドが提供され，ここで，ａｃｔＡ誘導体は欠失または保存的アミノ酸変異を含む可溶性ａｃｔＡであり，欠失または保存的アミノ酸変異は，アミノ酸：２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８，１１９，１２０，１２１，１２２，１２３，１２４，１２５，１２６，１２７，１２８，１２８，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４２，１４３，１４４，１４５，１４６，１４７，１４８，１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７，１６８，１６９，１７０，１７１，１７２，１７３，１７４，１７５，１７６，１７７，１７８，１７９，１８０，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８７，１８８，１８９，１９０，１９１，１９２，１９３，１９４，１９５，１９６，１９７，１９８，１９９，２００，等を含む（あるいは，別の態様においては，欠失はこれらのものからなる）。
また，別の態様においては，異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，変更されたＡｃｔＡをコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドが提供され，ここで，第１の核酸は，例えば，ΔＡｃｔＡ３（アミノ酸１２９−１５３の欠失）；ΔＡｃｔＡ９（アミノ酸１４２−１５３の欠失）；ΔＡｃｔＡ６（アミノ酸６８−１５３の欠失）；ΔＡｃｔＡ７（アミノ酸９０−１５３の欠失）；またはΔＡｃｔＡ８（アミノ酸１１０−１５３の欠失）等に由来する（例えば，Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３：３２７７−３２８７を参照）。
ＡｃｔＡの多数の誘導体は，開始メチオニン（Ｎ末端）を含有し，未成熟のまま停止して新規Ｃ末端を生ずる。これらの誘導体のいくつかは，Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７により報告されている）。これらの誘導体をコードする核酸をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに導入して，発現を調べた。アミノ酸５９で終わるＡｃｔＡ誘導体（ＡｃｔＡ−Ｎ５９）はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより発現されなかった。これに対し，ＡｃｔＡ−Ｎ１０１およびより長いＡｃｔＡの誘導体は発現された。ＡｃｔＡシグナル配列および融合蛋白質パートナーのみからなる融合蛋白質（ＡｃｔＡプロモーターから発現）は，ＡｃｔＡ−Ｎ１００および融合蛋白質パートナーからなる融合蛋白質よりはるかに低い分泌を示した。
トランケーション，欠失，または不活性化変異は，ＡｃｔＡの４つのＦＰ４ドメイン（（Ｅ／Ｄ）ＦＰＰＰＸ（Ｄ／Ｅ））（配列番号１３５）の１またはそれ以上の機能を低下させるかまたは排除することができる。ＡｃｔＡのＦＰ４ドメインは以下の蛋白質への結合を媒介する：ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎａｂｌｅｄ（Ｍｅｎａ）；Ｅｎａ／ＶＡＳＰ様蛋白質（Ｅｖｌ）；および血管拡張剤刺激性リン蛋白質（ＶＡＳＰ）（Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３）。したがって，本発明の核酸は，そのＦＰ４ドメインの１またはそれ以上が欠失または変異しており，このことによりＭｅｎａ，Ｅｖｌ，および／またはＶＡＳＰへの結合が低下または妨害されているトランケート型ＡｃｔＡをコードする。トランケート型の，部分的に欠失または変異したＡｃｔＡおよび異種抗原をコードする核酸が提供され，ここで，トランケーション，部分的欠失，または変異は，ＡｃｔＡのアミノ酸２３６−２４０；アミノ酸２７０−２７４；アミノ酸３０６−３１０；および／またはアミノ酸３５１−３５５で生ずる（番号付けはＭａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３にしたがう）。
本発明は，ＡｃｔＡ変種をコードする第１の核酸および少なくとも１つの異種抗原をコードする第２の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，ＡｃｔＡ変種はＡｃｔＡの１つの“長反復”２つの長反復，または３つすべての長反復を欠失しているか変異されているＡｃｔＡである。ＡｃｔＡの長反復は，ＦＰ４ドメインの間に位置する２４アミノ酸の配列である（例えば，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３５：６４７−６６０を参照）。長反復はアクチン重合を力を生ずるメカニズムに変換することを助ける。
さらに別の例として，”からなる”との表現を用いて，下記のＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーをコードする核酸が提供される：ヒトａｃｔＡのアミノ酸１−５０（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ５１２４７６またはその同等物，番号付けは開始アミノ酸から始まる），アミノ酸１−６０；１−６１；１−６２；１−６３；１−６４；１−６５；１−６６；１−６７；１−６８；１−６９；１−７０；１−７２；１−７３；１−７４；１−７５；１−７６；１−７７；１−７８；１−７９；１−８０；１−８１；１−８２；１−８３；１−８４；１−８５；１−８６；１−８７；１−８８；１−８９；１−９０；１−９１；１−９２；１−９３；１−９４；１−９５；１−９６；１−９７；１−９８；１−９９；１−１００；１−１０１；１−１０２；１−１０３；１−１０４；１−１０５；１−１０６；１−１０７；１−１０８；１−１０９；１−１１０；１−１１１；１−１１２；１−１１３；１−１１４；１−１１５；１−１１６；１−１１７；１−１１８；１−１１９；１−１２０；１−１２１；１−１２２；１−１２３；１−１２４；１−１２５；１−１２６；１−１２７；１−１２８；１−１２９；１−１３０；１−１３１；１−１３２；１−１３３；１−１３４；１−１３５；１−１３６；１−１３７；１−１３８；１−１３９；１−１４０；１−１４１；１−１４２；１−１４３；１−１４４；１−１４５；１−１４６；１−１４７；１−１４８；１−１４９；１−１５０；１−１５１；１−１５２；１−１５３；１−１５４；１−１５５；１−１５６；１−１５７；１−１５８；１−１５９；１−１６０等からなる融合蛋白質パートナーをコードする核酸が提供される。
さらに別の例として，”含む”との表現を用いて，下記のＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーをコードする核酸が提供される：ヒトａｃｔＡのアミノ酸１−５０（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ５１２４７６またはその同等物，番号付けは開始アミノ酸から始まる），アミノ酸１−６０；１−６１；１−６２；１−６３；１−６４；１−６５；１−６６；１−６７；１−６８；１−６９；１−７０；１−７２；１−７３；１−７４；１−７５；１−７６；１−７７；１−７８；１−７９；１−８０；１−８１；１−８２；１−８３；１−８４；１−８５；１−８６；１−８７；１−８８；１−８９；１−９０；１−９１；１−９２；１−９３；１−９４；１−９５；１−９６；１−９７；１−９８；１−９９；１−１００；１−１０１；１−１０２；１−１０３；１−１０４；１−１０５；１−１０６；１−１０７；１−１０８；１−１０９；１−１１０；１−１１１；１−１１２；１−１１３；１−１１４；１−１１５；１−１１６；１−１１７；１−１１８；１−１１９；１−１２０；１−１２１；１−１２２；１−１２３；１−１２４；１−１２５；１−１２６；１−１２７；１−１２８；１−１２９；１−１３０；１−１３１；１−１３２；１−１３３；１−１３４；１−１３５；１−１３６；１−１３７；１−１３８；１−１３９；１−１４０；１−１４１；１−１４２；１−１４３；１−１４４；１−１４５；１−１４６；１−１４７；１−１４８；１−１４９；１−１５０；１−１５１；１−１５２；１−１５３；１−１５４；１−１５５；１−１５６；１−１５７；１−１５８；１−１５９；１−１６０等を含む融合蛋白質パートナーをコードする核酸が提供される。
ａｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーをコードする，本発明により企図される核酸としては，ａｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーをコードする核酸であって，１またはそれ以上のヌクレオチドが１またはそれ以上の保存的アミノ酸の変更を与えるよう変更されている核酸が含まれる。１つの保存的アミノ酸変更，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０個またはそれ以上の保存的アミノ酸変更が企図される。さらに，少なくとも１つの短い欠失をコードする少なくとも１つの変異，または少なくとも１つの短い挿入，またはこれらの任意の組み合わせを含む，ａｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーをコードする核酸が企図される。
ＡｃｔＡおよびその誘導体をコードする核酸の種類に関しては，開始メチオニンのコドンはバリン開始コドンであってもよい。すなわち，Ｌｉｓｔｅｒｉａはバリン開始コドンを使用してメチオニンをコードする。
企図される発明は，ＡｃｔＡ，および１またはそれ以上の細胞骨格結合ドメインを欠失したＡｃｔＡ，およびＡｃｔＡ−Ｎ１００融合蛋白質パートナーを包含し，これらはすべてリステリア種，例えばＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉからのものである（Ｇｅｒｓｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：１９２９−１９３６；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ８１１３５；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＹ５１００７３）。
ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡの最初の５９アミノ酸より多く，ＡｃｔＡの最初の３８０アミノ酸より少ないアミノ酸配列を含むＡｃｔＡのフラグメントに対して，少なくとも約８０％の配列同一性，少なくとも約８５％の配列同一性，少なくとも約９０％の配列同一性，または少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列から構成される。例えば，ある態様においては，改変型ＡｃｔＡは，ＡｃｔＡ−Ｎ１００に対して少なくとも約８０％の配列同一性，少なくとも約８５％の配列同一性，少なくとも約９０％の配列同一性，または少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列から構成される。ある態様においては，改変型ＡｃｔＡをコードする核酸分子は，ストリンジェントな条件下で，ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列をコードする核酸分子またはその相補体にハイブリダイズする。
本発明は，ある態様においては，異種抗原，例えばヒトメソセリンまたはその誘導体をコードする第２の核酸と動作可能なように連結されかつインフレームである，ａｃｔＡ−Ｎ１００をコードする第１の核酸を含むポリヌクレオチドを包含する。多数のコンストラクトからヒトメソセリンを発現させ，ここで，これらのコンストラクトは，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中への部位特異的インテグレーションまたは相同的インテグレーションにより作成される。これらのコンストラクトのいくつかを図６に示す。図６は，シグナル配列およびＧＰＩ−配列を含む，天然に生ずるヒトメソセリンを示す。下記の実施例では，シグナル配列およびＧＰＩ−配列が欠失しており，天然に生ずるシグナル配列を，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原分泌配列（ＢａＰＡ），ＬＬＯ−６２，ＬＬＯ−６０ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ（ＬＬＯ−６０ｏｐｔ），またはＡｃｔＡ−Ｎ１００で置き換えた（図６）。ＡｃｔＡ−Ｎ１００の配列はＡｃｔＡの天然に生ずる分泌配列を含む。
ｉｉ． 野生型ＡｃｔＡにより生ずる異常な細胞生理学
本発明の少なくともいくつかの態様の改変型ＡｃｔＡは，哺乳動物細胞骨格との相互作用が低下するかまたは除去されるよう変化している。ＡｃｔＡの生理学的機能は哺乳動物細胞骨格に結合して，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の細胞質を通るアクチン媒介性運動を可能とすることであるが，融合蛋白質のＡｃｔＡ成分においてはこの結合が低下しているかまたは除去されている。
真核生物発現ベクターにより哺乳動物細胞質において可溶性ＡｃｔＡを発現させると，細胞骨格が異常となり，例えば，“Ｆ−アクチンの再分配”および組換えＡｃｔＡの“膜突出部”における隔離が生じた。言い換えると，Ｆ−アクチンの正常な位置が変化して，新たな位置は膜突出部中にあった。さらに，“ＡｃｔＡ染色は膜突起部においてＦ−アクチンと共分布する”。哺乳動物細胞における他の異常には，“ストレスファイバーの喪失”が含まれる。“ＡｃｔＡのアミノ末端部分はアクチンフィラメントの核形成に関与し，一方プロリンリッチ反復領域を含むセグメントは重合を促進または制御する”ことが認められた（Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：２７３１−２７４４）。さらに，Ｏｌａｚａｂａｌ ａｎｄ Ｍａｃｈｅｓｋｙによれば，蛋白質の過剰発現は，ＷＡＳＰ蛋白質であるＡｃｔＡと同様に，“細胞の機能不良につながるアクチンの組織化の障害”を引き起こすことが示された（Ｏｌａｚａｂａｌ ａｎｄ Ｍａｃｈｅｓｋｙ（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５４：６７９−６８２）。この刊行物の表題（“Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡｃｔＡ ｍｉｍｉｃｓ ＷＡＳＰ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”）は，この類似性を示す（Ｂｏｕｊｅｍａａ−Ｐａｔｅｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１１３９０−１１４０４）。
ＡｃｔＡのある種のドメインを哺乳動物細胞に導入すると，宿主細胞の細胞質が破壊される。詳細には，ＡｃｔＡの反復オリゴプロリン配列をマイクロインジェクションすると，“ストレスファイバーの喪失，”“末梢膜の劇的な退縮”および“退縮する末梢膜の近傍における線維状アクチンの蓄積”が誘導される（Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ ａｎｄ Ｐｕｒｉｃｈ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５１６８−５１７２）。Ｌｉｓｔｅｒｉａにより発現される蛋白質であるＡｃｔＡは，種々の細胞骨格関連蛋白質，例えば，Ａｒｐ２／３複合体およびアクチンを隔離するか，“ハイジャックする”か，または利用する（Ｏｌａｚａｂａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１４１３−１４１８；Ｚａｌｅｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３４６８−３４７５；Ｂｒｉｅｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６５：２３３−２４２）。
本発明のＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーは，貫膜ドメインを欠失しているＡｃｔＡと比較してポリペプチドの長さが短い。ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーは，アクチン依存性活性，例えば，免疫提示，宿主細胞増殖，細胞の極性，細胞移動，エンドサイトーシス，分離した小胞のシーリング，エンドサイトーシス小胞の運動，分泌，細胞の極性，および創傷に対する応答（創傷治癒）の中断を低下させる（例えば，Ｓｅｔｔｅｒｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１８７６−１８８６；Ｔｓｋｖｉｔａｒｉａ−Ｆｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２２８７−２２９５を参照）。本発明を限定することを示唆するものではないが，この文脈において中断（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が低下しているとは，全長ＡｃｔＡ，貫膜ドメインにおいてのみ欠失を有するＡｃｔＡ，または貫膜ドメインにおいてトランケート型のＡｃｔＡについて見られるものに対して相対的なものである。膜アンカー配列を欠失しているＡｃｔＡは，哺乳動物細胞において“アクチンの認識しうる再分配”を生ずる（例えば，Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：７５８−７６３を参照）。
細胞のアクチン依存性活性としては，免疫細胞機能，創傷治癒，キャッピング，レセプター内在化，食作用，アクチンを利用するＦｃ−レセプタークラスタリングおよびＦｃ−レセプター媒介性食作用が挙げられる（例えば，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６：５３７−５５０；Ｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１５０７−１５１６；Ｆｕｋａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８９７６−４８９８２；Ｂｏｔｅｌｈｏ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４４２３−４４２９；Ｋｒｉｓｈｎａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：４１８９−４１９５；Ｇｏｍｅｚ−Ｇａｒｃｉａ ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１５８７６−１５８８０；Ｋｕｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５０６８３−５０６９２；Ｒｏｏｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３４：６７−８０；Ｃｈｏｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７：３９４７−３９５９；Ｍｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｌ１３−Ｌ１８；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒａｆｆｉｃ１：１６１−１７１；Ｚｕａｌｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：Ｆ１１１−Ｆ１１６；Ｏｌａｚａｂａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１４１３−１４１８；Ｍａｇｄａｌｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １４：６７０−６８４を参照）。
ＡｃｔＡは，（哺乳動物の細胞質で）“Ｎ末端ルール経路”により分解される（例えば，Ｍｏｏｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２４９−２５７；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１２１４２−１２１４９を参照）。
Ｂ． ＡｃｔＡのレアコドン；ＡｃｔＡの免疫原性
ＡｃｔＡコーディング領域は，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにとって最適ではない多数のコドンを含む。これらのうちの多数は，リステリアのゲノム中で最も一般的に用いられるコドンの２５％以下の頻度で生ずる。以下にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ １０４０３Ｓ ＡｃｔＡのコドン分析を示す。アミノ酸１０１−４００をコードするコドンにおいて，グルタミン酸のレアコドン（ＧＡＧ）は１２回現れ；リジンのレアコドン（ＡＡＧ）は３回現れ；イソロイシンのレアコドン（ＡＴＡ）は３回現れ；アルギニンのレアコドン（ＣＧＧ）は１回現れ；グルタミンのレアコドン（ＣＡＧ）１回現れ；ロイシンのレアコドン（ＣＴＧ；ＣＴＣ）は３回現れる。以下の説明は，レアコドンのみならず非最適コドンに関連する。さらに，アミノ酸１０１−４００をコードするコドン（３００コドン）において，非最適コドン（これはレアコドンに加えて）は１５２回現れる（合計３００コドンのうち）。
ＡｃｔＡはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに暴露されたヒトによる免疫応答のための主要な標的である（例えば，Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３９７６−３９８０を参照）。ある態様においては，本発明は，ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーを提供し，ここで，ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーは免疫原性が低下しており，例えば，全長ＡｃｔＡより少ないエピトープを含むか，または免疫原性の低下したエピトープを与えるよう改変されている。
本発明の試薬および方法は，抗原性エピトープの数が減少しているか，または抗原性の増加した１またはそれ以上の領域を欠失しているＡｃｔＡ，トランケート型ＡｃｔＡ，および／または変異型ＡｃｔＡ（例えば，点突然変異または欠失）をコードする核酸を提供する。抗原性の増加した領域としては，Ｗｅｌｌｉｎｇプロットにより判定して，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３のアミノ酸８５−９０；１４０−１５０；１６０−１９０；２２０−２３０；２５０−２６０；２７０−２８０；３０５−３１５；３５０−３７０；４３５−４４５；４５０−４６０；４９０−５２０；５４５−５５５；および５９５−６１０が挙げられる。ＡｃｔＡは免疫原性蛋白質として同定されている（例えば，Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：３９７６−３９８０；Ｄａｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２４１４−２４２０；Ｎｉｅｂｕｈｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２７９３−２８０２；Ｌｉｎｇｎａｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３を参照）。ＡｃｔＡの免疫原性の特性は，可溶型のアクチン，例えば，そのＣ末端領域（アミノ酸３９４−６１０，番号付けはＭｏｕｒｒａｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１００３４−１００３９による）の全部または一部を欠失しているアクチンの発現に伴って増加する（例えば，Ｄａｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２４１４−２４２０；Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３６１６−３３６２６も参照）。したがって，本発明のトランケート型，部分欠失型，または変異型のＡｃｔＡが膜結合に用いられるドメインを欠失（または機能的に欠失）しており，このことにより免疫原性が増加している場合，本発明は，トランケート型ＡｃｔＡの免疫原性を低下させるために，さらなるトランケーションまたは変異を提供する。
Ｃ． ＡｃｔＡ誘導体の細胞骨格蛋白質への結合を測定するアッセイ，およびＬｉｓｔｅｒｉのＡｃｔＡ依存性移動，アクチンまたは他の蛋白質のＡｃｔＡまたはＡｃｔＡの変種へのリクルーティングを測定するアッセイが利用可能である。リクルーティングは，細菌移動アッセイ，すなわち，真核細胞抽出物におけるかまたは真核細胞内におけるＬｉｓｔｅｒｉａ移動のアクチン依存性速度を測定するアッセイにより合理的に評価することができる（例えば，Ｍａｒｃｈａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：３３１−３４３を参照）。細菌移動アッセイは，野生型ＡｃｔＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａと変異体型のＡｃｔＡ，例えばＦＰ４ドメインを欠失した変異体ＡｃｔＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａとを区別することができる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３５：６４７−６６０）。
リクルートメントはまた，ＡｃｔＡで被覆したビーズの表面またはＡｃｔＡを発現する細菌の表面における局所アクチン濃度を測定することにより評価することができる。ビーズに基づくアッセイは記載されている（例えば，Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３；Ｆｒａｄｅｌｉｚｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：６９９−７０７；Ｔｈｅｒｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ７６：５０５−５１７；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：９４５−９５１；Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：４９０８−４９１３を参照）。超遠心分離によりＡｃｔＡに結合した細胞骨格蛋白質の数を評価することができる（例えば，Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，上掲を参照）。
当業者に利用可能なアッセイとしては，例えば，自発的アクチン重合アッセイ；Ｂ端からの伸張アッセイ；およびＰ端からの伸張アッセイが挙げられる（例えば，Ｚａｌｅｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３４６８−３４７５を参照）。ＡｃｔＡ誘導性アクチン重合の極性を評価する方法も利用可能である（例えば，Ｍｏｇｉｌｎｅｒ ａｎｄ Ｏｓｔｅｒ（２００３）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８４：１５９１−１６０５；Ｎｏｉｒｅａｕｚ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：１６４３−１６５４を参照）。
（ｄ）． 融合蛋白質パートナーとして用いるためのＳｅｃＡ２−分泌蛋白質
本発明は，異種抗原との融合蛋白質パートナーとして有用なＳｅｃＡ２リステリア分泌蛋白質のファミリーを提供する。分泌蛋白質由来の融合蛋白質パートナーは，発現を増加させ，安定性を増加させ，分泌を増加させ，免疫提示を増強し，免疫応答を刺激し，腫瘍に対する生存を改善し，癌に対する生存を改善し，感染性因子に対する生存を増加させる等のために用いることができる。
企図されるリステリア分泌蛋白質としては，ｐ６０オートリシン；Ｎ−アセチル−ムラミダーゼ（ＮａｍＡ）；ペニシリン結合蛋白質２Ｂ（ＰＢＰ−２Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０）；フェロモントランスポーター（ＯｐｐＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９８２のｎｔ１８４，５３９−１８６，２１５の相補体）；マルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーター（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９８２のｎｔ１０４，８５７−１０５，７０８の相補体）；抗原性リポ蛋白質（Ｃｓａ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９１９８２のｎｔ３６４６−４７１９）；およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＥＧＤの保存されたリポ蛋白質（例えば，Ｌｅｎｚ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１２４３２−１２４３７；Ｌｅｎｚ ａｎｄ Ｐｏｒｔｎｏｙ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１０４３−１０５６を参照）が挙げられる。
ｐ６０は，１，４５２ｂｐのオープンリーディングフレームによりコードされ，Ｎ末端シグナル配列，Ｎ末端領域中のＳＨ３ドメイン，トレオニン−アスパラギン反復を含む中心領域，およびオートリシン触媒部位を包含するＣ末端領域を有する（例えば，Ｐｉｌｇｒｉｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３４７３−３４８４を参照）。ｐ６０は浸潤関連蛋白質（ｉａｐ）としても知られる（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５２２６８；ＮＣ＿００３２１０）。
本発明は，ｐ６０またはｐ６０誘導体をコードする第１の核酸，および異種抗原をコードする第２の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。ｐ６０またはｐ６０誘導体は，全長ｐ６０蛋白質（例えば，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ，Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ，Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ，Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ，Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ，および／またはＬ．ｇｒａｙｉからのもの），Ｎ末端７０アミノ酸から本質的に構成されるトランケート型ｐ６０蛋白質；加水分解を触媒する領域を欠失したトランケート型ｐ６０蛋白質；ｐ６０蛋白質のシグナル配列；またはそのシグナル配列が異なるシグナル配列で置き換えられているｐ６０蛋白質（例えば，ＡｃｔＡ，ＬＬＯ，ＰＦＯ，またはＢａＰＡのシグナル配列），および異種抗原をコードする第２の核酸を包含する。ｐ６０シグナル配列（２７アミノ酸）は次のとおりである：
MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASA (配列番号24) (Bubert, et al. (1992) J. Bacteriol. 174:8166-8171; Bubert, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2625-2632; J. Bacteriol. 173:4668-4674)。
Ｎ−アセチル−ムラミダーゼシグナル配列（５２アミノ酸）は次のとおりである：MDRKFIKPGIILLIVAFLVVSINVGAETGGSRTAQVNLTTSQQAFIDEILPA (配列番号25) (nt 2679599 − 2681125 ，GenBank Acc. No. NC＿003210; GenBank Acc. No. AY542872; nt 2765101 −2766627 ，GenBank Acc. No. NC＿003212; Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437)。
本発明は，ｐ６０変種，例えば，アミノ酸６９（Ｌ）および７０（Ｑ）のコドンがユニークなＰｓｔＩ制限部位を与えるよう変更されているものを提供し，ここで，ＰｓｔＩ部位は異種抗原をコードする核酸の挿入に用いられる。
ＳｅｃＡ２−経路で分泌される蛋白質および異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸が企図される。また，ＳｅｃＡ２−経路で分泌される蛋白質の誘導体またはトランケート型および異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸が企図される。さらに，ＳｅｃＡ２−経路で分泌される蛋白質および異種抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸を含むか，またはＳｅｃＡ２−経路で分泌される蛋白質および異種抗原の誘導体またはトランケート型を含む融合蛋白質をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌が企図される。
（ｅ） メソセリン
ヒトメソセリンｃＤＮＡは２１３８ｂｐであり，１８８４ｂｐのオープンリーディングフレームを含み，６９ｋＤの蛋白質をコードする。メソセリン前駆体蛋白質は６２８アミノ酸およびフリン切断部位（ＲＰＲＦＲＲ，アミノ酸２８８−２９３）を含む。６９ｋｄ蛋白質の切断により，４０ｋＤの膜結合蛋白質（“メソセリン”と称される）および巨核球増強因子（ＭＰＦ）と称される３１ｋＤの可溶性蛋白質が生ずる。メソセリンはそのＣ末端に親油性配列を有し，これは除去されてホスファチジルイノシトールで置き換えられ，このことによりメソセリンは膜結合性となる。メソセリンはＣ末端の近傍にグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーシグナル配列を含む。メソセリンのドメイン，癌および腫瘍細胞によるメソセリンの発現，およびメソセリンの抗原性特性は記載されている（例えば，Ｈａｓｓａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：３９３７−３９４２；Ｒｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：８１９−８２６；Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：２９７−３０６；Ａｒｇａｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：３８６２−３８６８；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６６９−６７４；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６−１４０；Ｍｕｍｉｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ４：１９；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏｓ．ＮＭ＿００５８２３およびＮＭ＿０１３４０４；米国特許５，７２３，３１８，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．を参照）。
メソセリンのシグナル配列を欠失したヒトメソセリンは以下に示される：
RTLAGETGQEAAPLDGVLTNPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERV
RELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFS
GPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADV
RALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGP
PYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWR
QPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALL
ATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPE
DIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDT
LTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARL
AFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL
PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGI
PNGYLVLDLSVQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA (配列番号26)
メソセリンのシグナル配列を欠失し，さらにメソセリンのＧＰＩ−アンカーを欠失したヒトメソセリンは以下に開示される：
RTLAGETGQEAAPLDGVLTNPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERV
RELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFS
GPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADV
RALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGP
PYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWR
QPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALL
ATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPE
DIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDT
LTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARL
AFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL
PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQG (配列番号27)
以下の書類は参照により本明細書に取り込まれる（例えば，米国特許５，７２３，３１８，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．；米国特許６，１５３，４３０，Ｐａｓｔａｎ，ｅｔ ａｌ．；米国特許６，８０９，１８４，Ｐａｓｔａｎ，ｅｔ ａｌ．；米国特許公開ＵＳ２００５／０２１４３０４，Ｐａｓｔａｎ，ｅｔ ａｌ．；国際公開ＷＯ０１／９５９４２，Ｐａｓｔａｎ，ｅｔ ａｌ．を参照）。
（ｆ）インテグレーションの部位
本発明は，野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて成長または拡散を媒介する第１の核酸を含むポリヌクレオチドを提供し，ここで，第１の核酸は，少なくとも１つの抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変されている。１つの観点においては，インテグレーションによりＬｉｓｔｅｒｉａは減弱化される。別の観点においては，インテグレーションによってＬｉｓｔｅｒｉａは減弱化されない。さらに別の観点においては，親Ｌｉｓｔｅｒｉａは減弱化されており，インテグレーションによりさらに減弱化される。さらに，別の非限定的例としては，親Ｌｉｓｔｅｒｉａは減弱化されており，インテグレーションによりさらに減弱化されない。
第１の核酸，少なくとも１つの抗原をコードする第３の核酸，少なくとも１つの抗原をコードする第４の核酸，少なくとも１つの抗原をコードする第５の核酸等がインテグレートされることによる改変をさらに含む態様も提供される。
いかなる限定をも暗示するものではないが，抗原は，異種抗原（Ｌｉｓｔｅｒｉａにとって異種），腫瘍抗原または腫瘍抗原に由来する抗原，感染性因子抗原または感染性因子抗原に由来する抗原等であることができる。
第１の核酸は，ａｃｔＡ遺伝子またはｉｎｌＢ遺伝子でありうる。インテグレーションは，ａｃｔＡまたはｉｎｌＢのプロモーターまたは制御領域であってもよく，および／または，ａｃｔＡまたはｉｎｌＢのオープンリーディングフレーム内であってもよく，ここで，インテグレーションは，適当な条件下で判定しうるように，Ｌｉｓｔｅｒｉａを減弱させる。インテグレーションは，ａｃｔＡまたはｉｎｌＢのプロモーターまたは制御領域の一部または全部の欠失を伴っていてもよく，またはａｃｔＡまたはｉｎｌＢのオープンリーディングフレームの一部または全部の欠失を伴っていてもよく，またはプロモーターまたは制御領域プラスａｃｔＡまたはｉｎｌＢのオープンリーディングフレームの一部または全部の両方の欠失を伴っていてもよく，ここで，インテグレーションは，適当な条件下で判定してＬｉｓｔｅｒｉａを減弱させる。
上述の態様のそれぞれについて，本発明は，ポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。ポリヌクレオチドはゲノム性（ｇｅｎｏｍｉｃ）であってもよい。
ある態様においては，少なくとも１つの抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変される第１の核酸は，野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて成長または拡散を媒介する。ある態様においては，改変される第１の核酸は，細胞から細胞への拡散を媒介する。ある態様においては，第１の核酸はａｃｔＡである。
ある態様においては，少なくとも１つの抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変される第１の核酸は，以下の１つにより識別される遺伝子を含む：ｈｌｙ遺伝子（リステリオリシンＯ；ＬＬＯをコードする）；インターナリンＡ；インターナリンＢ；ａｃｔＡ；ＳｖｐＡ；ｐ１０４（別名ＬＡＰ）；ｌｐｌＡ；ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）（ｐｌｃＡ遺伝子）；ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）（ｐｌｃＢ遺伝子）；亜鉛メタロプロテアーゼ前駆体（Ｍｐｌ遺伝子）；ｐ６０（蛋白質６０；浸潤関連蛋白質（ｉａｐ）；ソルターゼ；リステリオリシン陽性制御蛋白質（ＰｒｆＡ遺伝子）；ＰｒｆＢ遺伝子；ＦｂｐＡ遺伝子；Ａｕｔｏ遺伝子；Ａｍｉ（接着を媒介するアミダーゼ）；ｄｌｔオペロン（ｄｌｔＡ；ｄｌｔＢ；ｄｌｔＣ；ｄｌｔＤ）；ｐｒｆＡボックスのいずれか；またはＨｔｐ（糖−Ｐトランスポーター）。
さらに，上述のポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａも包含される。ポリヌクレオチドはゲノム性であってもよい。１つの観点においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであってもよい。適当な条件下で判定して，インテグレーションによりＬｉｓｔｅｒｉａが減弱化する，上記に開示される態様のそれぞれが提供される。また，適当な条件下で判定して，インテグレーションによりＬｉｓｔｅｒｉａが減弱化しない，上記に開示される態様のそれぞれが提供される。さらに別の観点においては，親Ｌｉｓｔｅｒｉａが減弱化されており，インテグレーションによりさらに減弱化される。さらに，別の例として，親Ｌｉｓｔｅｒｉａは減弱化されており，インテグレーションによりさらに測定可能なように減弱化されない。
別の観点においては，第１の核酸はゲノム性であってもよい。別の観点においては，インテグレーションは相同組換えにより媒介され，ここで，インテグレーションの結果第１の核酸の欠失は生じず，インテグレーションの結果第１の核酸の全部または一部の欠失が生じ，ここで，第１の核酸はプロモーターまたは他の制御領域を含み，第２の核酸はプロモーターまたは他の制御領域と動作可能なように連結され，および／またはこれらとインフレームであり，第１の核酸はプロモーターまたは他の制御領域を含み，第２の核酸は，全く，プロモーターまたは他の制御領域と動作可能なように連結されておらず，および／またはこれらとインフレームではない。
“インテグレーションにより改変された遺伝子”との用語は，“遺伝子であるインテグレーションの座”を包含するが，これに限定されない。
本発明はまた，野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて成長または拡散を媒介する第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含み，ここで，第１の核酸は病原性島または病原性遺伝子クラスターの全部または一部を含み，ここで，病原性島または病原性遺伝子クラスターの全部または一部は少なくとも１つの抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変されており，インテグレーションの結果，適当な条件下で判定して，Ｌｉｓｔｅｒｉａは減弱化する。病原性島および病原性遺伝子クラスターは開示されている（例えば，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０：１６７−１７４；Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．１４：５８４−６４０を参照）。成長および拡散を媒介する遺伝子は，病原性を特異的に媒介する遺伝子に限定されず，エネルギー生成（例えば，解糖，クレブス回路，チトクローム），アミノ酸，糖，脂質，ミネラル，プリン，およびピリミジンの同化および／または異化を媒介する遺伝子などの成長を媒介する遺伝子，および栄養輸送，転写，翻訳，および／または複製等を媒介する遺伝子を包含する。
別の観点においては，野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて成長または拡散を媒介する第１の核酸を含むポリヌクレオチドが提供され，ここで，核酸は，抗原をコードする複数の核酸のインテグレーションにより改変されている。
インテグレーションは，第２の核酸の対応する欠失を伴わずに第２の核酸中で生じてもよい。あるいは，インテグレーションは，第２の核酸の対応する欠失またはその一部を伴って，第２の核酸中で生じてもよい。第１の核酸が野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａがプロモーターおよび／または他の制御部位を含む場合には，インテグレーションはプロモーターおよび／または制御部位中で生じてもよい。
第１の核酸がプロモーターおよび／または他の制御部位を含む場合には，本発明はインテグレートされた第２の核酸を提供し，ここで，第２の核酸は，プロモーターおよび／または制御部位と動作可能なようにかつインフレームで連結されているコーディング領域を含む。あるいは，本発明は，インテグレートされた第２の核酸を提供し，ここで，第２の核酸は，プロモーターおよび／または制御部位と動作可能なようにかつインフレームで連結されていないコーディング領域を含む。上述のそれぞれの態様においては，インテグレートした核酸（第２の核酸）はプロモーターおよび／または制御部位を含み，プロモーターおよび／または制御部位は，第１の核酸中に存在するプロモーターおよび／または他の制御部位の代わりとして，またはそれに加えて働くことができる。
１つの観点においては，第１の核酸はプロモーターまたは他の制御要素を含み（あるいはそれから構成され），第２の核酸はプロモーターおよび／または他の制御要素と動作可能なように連結されている。別の観点においては，抗原をコードする第２の核酸はさらにプロモーターおよび／または他の制御要素を含む。
第１の核酸は制御領域またはボックスであってもよいため，第１の核酸はポリペプチドをコードしている必要はない。以下は，例えば相同的インテグレーションにより媒介されるインテグレーションに関する。本発明は上述のポリヌクレオチドを提供し，ここで，第２の核酸は第１の核酸のいずれかの欠失なしにインテグレートされている。
１つの態様においては，第１の核酸は成長を媒介するが拡散は媒介しない。別の態様においては，第１の核酸は拡散を媒介するが成長は媒介しない。さらに別の態様においては，第１の核酸は成長および拡散の両方を媒介する。１つの観点においては，インテグレーションは，成長を低下させるかまたは排除し，拡散を低下させるかまたは排除し，または成長および拡散の両方を低下させるかまたは排除する。
さらに，１つの態様においては，第１の核酸は，その不活性化の結果，少なくとも１０％の成長の低下，時には少なくとも２０％の成長の低下，典型的には少なくとも３０％の成長の低下，より典型的には少なくとも４０％の成長の低下，最も典型的には少なくとも５０％の成長の低下，頻繁には少なくとも６０％の成長の低下，より頻繁には少なくとも７０％の成長の低下，最も頻繁には少なくとも８０％の成長の低下，慣用的には少なくとも８５％の成長の低下，より慣用的には少なくとも９０％の成長の低下，最も慣用的には少なくとも９５％の成長の低下，時には少なくとも９９％の成長の低下が生ずる特性を有する。１つの観点においては，成長は，限定培地中で，成長培地中で，寒天中で，宿主細胞中で，宿主細胞の細胞質等の中で測定することができる。
さらに，１つの態様においては，第１の核酸は，その不活性化の結果，少なくとも１０％の細胞から細胞への拡散の低下，時には少なくとも２０％の拡散の低下，典型的には少なくとも３０％の拡散の低下，より典型的には少なくとも４０％の拡散の低下，最も典型的にはｉｎ少なくとも５０％の拡散の低下，頻繁には少なくとも６０％の拡散の低下，より頻繁には少なくとも７０％の拡散の低下，最も頻繁には少なくとも８０％の拡散の低下，慣用的には少なくとも８５％の拡散の低下，より慣用的には少なくとも９０％の拡散の低下，および最も慣用的には少なくとも９５％の拡散の低下，およびしばしば少なくとも９９％の拡散の低下が生ずる特性を有する。１つの観点においては，成長は，限定培地中で，肉汁培地中で，寒天中で，宿主細胞中で，宿主細胞の細胞質中等で測定することができる。
上述のポリヌクレオチドのそれぞれを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌が提供される。１つの観点においては，ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。限定を示唆するものではないが，本発明は，ゲノム性であるか，プラスミド系であるか，または，ゲノム性およびプラスミド系の両方の形で存在する，上述のそれぞれのポリヌクレオチドを包含する。
上述の態様のそれぞれにおいて，インテグレーションは，部位特異的インテグレーションにより媒介されることができる。部位特異的インテグレーションには，ゲノムａｔｔＢＢ’部位を認識するプラスミドのａｔｔＰＰ’部位が関与する。ある態様においては，ａｔｔＢＢ’部位は成長または拡散を媒介する遺伝子中に天然に存在していてもよい。別の態様においては，ａｔｔＢＢ’部位は例えば相同的インテグレーションにより成長または拡散を媒介する遺伝子中にインテグレートされていてもよく，次に上述の第２の核酸の部位特異的インテグレーションが生ずる。
本発明は，野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは親Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて成長または拡散，または成長および拡散の両方を媒介する第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａを提供し，ここで，核酸は抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変されている．本明細書に記載される態様のそれぞれのさらに別の例においては，成長を低下させるかまたは排除し，拡散を低下させるかまたは排除し，または成長および拡散の両方を低下させるかまたは排除するインテグレーションが提供される。
また，野生型または親Ｌｉｓｔｅｒｉａの成長または拡散を媒介する第１の核酸を含むポリヌクレオチドも包含され，ここで，第１の核酸はシグナル配列または分泌配列を含み，第１の核酸は少なくとも１つの抗原をコードする第２の核酸のインテグレーションにより改変されており，インテグレーションの結果Ｌｉｓｔｅｒｉａは減弱化されており，インテグレーションはシグナルまたは分泌配列（第１の核酸によりコードされる）を第２の核酸によりコードされるオープンリーディングフレームと動作可能なように連結させる。１つの観点においては，上述のインテグレーションの結果，第１の核酸によりコードされるポリペプチドは，第１の核酸によりコードされるシグナルまたは分泌配列を除いてすべて欠失する（シグナルまたは分泌配列は無傷のまま残る）。
本明細書に記載されるそれぞれの態様のポリヌクレオチドを含むゲノムがさらに企図される。さらに，上述の態様のそれぞれを含むリステリアのゲノムが提供される。さらに，本発明は，本明細書に記載されるそれぞれの態様のポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。
１つの態様においては，本発明は，ゲノムが異種抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む，Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供する。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸は部位特異的組換えまたは相同組換えによりゲノム中にインテグレートされている。ある態様においては，ゲノム中の核酸の存在はＬｉｓｔｅｒｉａを減弱化させる。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸は病原性遺伝子の座にインテグレートされている。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸はａｃｔＡ座にインテグレートされている。ある態様においては，異種抗原をコードする核酸はｉｎｌＢ座にインテグレートされている。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムは，第１の遺伝子座（例えば，ａｃｔＡ座）にインテグレートされている異種抗原をコードする第１の核酸，および第２の遺伝子座（例えば，ｉｎｌＢ座）にインテグレートされている第２の異種抗原をコードする第２の核酸を含む。第１の異種抗原および第２の異種抗原は，互いに同一であっても異なっていてもよい。ある態様においては，第１の異種抗原および第２の異種抗原は，互いに異なるが，同じ腫瘍抗原または感染性因子抗原に由来する。ある態様においては，第１の異種抗原および第２の異種抗原は，それぞれ，癌細胞，腫瘍，または感染性因子に由来する抗原の異なるフラグメントである。ある態様においては，インテグレートした核酸は，改変型ＡｃｔＡおよび異種抗原を含む融合蛋白質をコードする。ある態様においては，異種抗原をコードする少なくとも２個，少なくとも３個，少なくとも４個，少なくとも５個，少なくとも６個，または少なくとも７個の核酸配列がリステリアのゲノム中にインテグレートされている。
ある態様においては，本明細書に記載されるポリヌクレオチド（または核酸）は，Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムの病原性遺伝子中にインテグレートされており，ここで，ポリヌクレオチドのインテグレーションは，（ａ）病原性遺伝子の発現を中断させるか；および／または（ｂ）病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａは病原性遺伝子の発現の中断により減弱化されるか，および／または病原性遺伝子のコーディング配列の中断がＬｉｓｔｅｒｉａを減弱化させる。ある態様においては，病原性遺伝子は成長または拡散を媒介するのに必要である。別の態様においては，病原性遺伝子は成長または拡散を媒介するのに必要ではない。ある態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ依存性遺伝子である。ある態様においては，病原性遺伝子はｐｒｆＡ依存性遺伝子ではない。ある態様においては，病原性遺伝子はａｃｔＡまたはｉｎｌＢである。ある態様においては，ポリヌクレオチド／核酸がインテグレートされている病原性遺伝子の発現は，発現レベルを測定することにより判定して，少なくとも１０％，少なくとも２５％，少なくとも５０％，少なくとも７５％，少なくとも９０％，または約１００％（インテグレートされたポリヌクレオチド／核酸が存在しない場合の病原性遺伝子の発現に対して）中断している。病原性遺伝子のコーディング配列の中断には，フレームシフト変異，トランケーション，挿入，欠失または置き換え／置換等のあらゆる種類のコーディング配列の変更が包含される。ある態様においては，ポリヌクレオチドの病原性遺伝子中へのインテグレーションの間に病原性遺伝子の全部または一部が欠失する。別の態様においては，ポリヌクレオチドのインテグレーションの間にいずれの病原性遺伝子も欠失しない。ある態様においては，病原性遺伝子のコーディング配列の一部または全部がインテグレートしたポリヌクレオチドにより置き換えられる。

ある態様においては，本明細書に記載される複数のポリヌクレオチドは，Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中の１またはそれ以上の異なる部位にインテグレートされている。複数のポリヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。ある態様においては，本明細書に記載される第１のポリヌクレオチドはａｃｔＡ座にインテグレートされており，および／または本明細書に記載される第２のポリヌクレオチドはｉｎｌＢ座にインテグレートされている。ある態様においては，本明細書に記載される第１のポリヌクレオチドはａｃｔＡ座にインテグレートされており，本明細書に記載される第２のポリヌクレオチドはｉｎｌＢ座にインテグレートされている。第１のポリヌクレオチドにコードされる異種抗原は，第２のポリヌクレオチドによりコードされるものと同じであっても異なっていてもよい。ある態様においては，インテグレートされた抗原によりコードされる２つの異種抗原は異なるが，同じ抗原に由来するものである。
ＩＶ． 治療用組成物および使用
（ａ）． 治療用組成物
本明細書において提供される減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ，ワクチン，小分子，生物学的試薬，およびアジュバントは，単独でまたは薬学的に許容しうる賦形剤との組み合わせで，免疫疾患，癌，腫瘍，または感染に対する適当な免疫応答を誘導するのに十分な量で，宿主に投与することができる。免疫応答は，限定されないが，特異的免疫応答，非特異的免疫応答，特異的および非特異的応答，先天性応答，一次免疫応答，適応免疫，二次免疫応答，記憶免疫応答，免疫細胞活性化，免疫細胞増殖，免疫細胞の分化およびサイトカイン発現を含むことができる。
“薬学的に許容しうる賦形剤”または“診断的に許容しうる賦形剤”としては，限定されないが，滅菌蒸留水，食塩水，リン酸バッファ溶液，アミノ酸系バッファ，または炭酸バッファ溶液が挙げられる。選択される賦形剤および用いられる賦形剤の量は，投与のモードにより異なるであろう。投与は，経口，静脈内，皮下，皮膚，皮膚内，筋肉内，粘膜，非経口，臓器内，病巣内，鼻腔内，吸入，眼内，筋肉内，静脈内，結節内，乱切経由，直腸，腹腔内，または投与のよく知られる様々な経路の任意の１つまたは組み合わせであることができる。投与は，注射，注入またはこれらの組み合わせであってもよい。非経口経路による本発明のＬｉｓｔｅｒｉａの投与は，耐性を回避しうる（例えば，Ｌｅｃｕｉｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１７２２−１７２５；Ｋｉｒｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１４：４４９−４６２；Ｆａｒｉａ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０６：２３２−２５９；Ｋｒａｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２２３４−２２４３；Ｍｕｃｉｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１９２３−１９３３を参照）。Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与する方法としては，例えば，静脈内，皮下，筋肉内，腹腔内，経口，粘膜，尿管経由，生殖管経由，胃腸管経由，または吸入が利用可能である（Ｄｕｓｔｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：９１６−９２４；Ｇｒｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｗｉｎｇ（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７２：２３９−２４８；Ｈｏｆ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．１０：３４５−３５７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．２０１：１８８−１９５；Ｈｏｆ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：１７２７−１７３５；Ｈｅｙｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １６（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ１０６−Ｓ１１１；Ｙｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ １１１：５２４−５３０）。
本発明は，本明細書に記載されるいずれかのＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はさらに，本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａのいずれかおよび薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある態様においては，免疫原性組成物または医薬組成物はワクチンである。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む組成物は，さらにアジュバントを含むワクチンである。
以下の記載は，任意に，本明細書に記載される態様のそれぞれに適用される。純粋なまたは精製された，投与される試薬が提供され，ここで，例えば，投与される試薬は，哺乳動物に純粋なまたは精製した形で，すなわち，単独で，薬学的に許容しうる組成物として，または賦形剤中で，投与することができる。さらに，下記の記載はまた，任意に，本明細書に記載される態様のそれぞれに適用することができる。純粋なまたは精製された，投与される試薬が提供され，ここで，投与される試薬は，純粋なまたは精製した形で，すなわち，単独で，薬学的に許容しうる組成物として，または賦形剤中で投与することができ，試薬は投与の後に生成されない（哺乳動物中で生成されない）。１つの態様においては，本明細書に開示されるそれぞれの試薬のそれぞれに任意に適用してもよいものは，純粋なまたは精製したポリペプチド（例えば，単独で，薬学的に許容しうる組成物として，または賦形剤中で）として投与されるポリペプチド試薬であり，ここで，投与されるポリペプチド試薬はそのポリペプチドをコードする核酸の形では投与されず，その結果，哺乳動物の内部でポリペプチドを生成することができる核酸は投与されない。
本発明のＬｉｓｔｅｒｉａは，例えば，凍結して，凍結乾燥して，懸濁液として，細胞ペーストとして，または固体マトリクスまたはゲルマトリクスと複合体化させて保存することができる。
特定の患者にとっての有効量は，治療している病状，患者の全体的健康状態，投与の経路および投与量および副作用の重篤度等の因子によって様々でありうる。特定の患者にとっての有効量は，治療している病状，患者の全体的な健康状態，投与の経路および投与量，および副作用の重篤性等の因子によって様々でありうる。治療および診断方法のガイダンスは入手可能である（例えば，Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＡＨ ａｎｄ ｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ ＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照）。
本発明のＬｉｓｔｅｒｉａは，１回投与量でまたは複数回投与量で投与することができ，各投与量は，少なくとも１０００個のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞／ｋｇ体重；普通は少なくとも１０，０００個の細胞；より普通には少なくとも１００，０００個の細胞；最も普通には少なくとも１００万個の細胞；頻繁には少なくとも１０００万個の細胞；より頻繁には少なくとも１億個の細胞；典型的には少なくとも１０億個の細胞；通常は少なくとも１００億個の細胞；慣用的には少なくとも１０００億個の細胞；しばしば少なくとも１兆個のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞／ｋｇ体重を含む。本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ投与の単位がコロニー形成ユニット（ＣＦＵ），ソラーレン処理前の等価ＣＦＵであるか，または投与量単位がＬｉｓｔｅｒｉａ細胞の数である，上述の投与量を提供する。
本発明のＬｉｓｔｅｒｉａは１回または複数回投与量として投与することができ，ここで，各投与量は，湿潤重量で，体重７０ｋｇあたり１０７−１０８個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり；または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；体重７０ｋｇあたり２ｘ１０７−２ｘ１０８個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり；または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；体重７０ｋｇあたり５ｘ１０７−５ｘ１０８個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり；または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；体重７０ｋｇあたり１０８−１０９個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり；または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり２．０ｘ１０８−２．０ｘ１０９個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり５．０ｘ１０８−５．０ｘ１０９個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり１０９−１０１０個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり２ｘ１０９−２ｘ１０１０個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり５ｘ１０９−５ｘ１０１０個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり１０１１−１０１２個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり２ｘ１０１１−２ｘ１０１２個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり５ｘ１０１１−５ｘ１０１２個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり１０１２−１０１３個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり）；７０ｋｇあたり２ｘ１０１２−２ｘ１０１３個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり５ｘ１０１２−５ｘ１０１３個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり１０１３−１０１４個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり２ｘ１０１３−２ｘ１０１４個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり５ｘ１０１３−５ｘ１０１４個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり１０１４−１０１５個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）；７０ｋｇあたり２ｘ１０１４−２ｘ１０１５個のＬｉｓｔｅｒｉａ（または表面積１．７平方メートルあたり，または肝臓重量１．５ｋｇあたり）等を含む。
マウス肝臓は，本発明のＬｉｓｔｅｒｉａを投与する時点で，約１．５グラムの重さである。ヒト肝臓は約１．５キログラムの重さである。
また，上述の投与量の１またはそれ以上が提供され，ここで，１回投与量は，毎日１回の注射，２日に１回の注射，３日に１回の注射，４日に１回の注射，５日に１回の注射，６日に１回の注射，または７日に１回の注射により投与され，ここで，注射スケジュールは，１日のみ，２日，３日，４日，５日，６日，７日，２週間，３週間，４週間，５週間またはそれ以上維持される。本発明はまた，上述の投与量およびスケジュールの組み合わせ，例えば，比較的多い初期投与量のＬｉｓｔｅｒｉａ，次に比較的少ない投与量のＬｉｓｔｅｒｉａ，または比較的少ない初期投与量，次により多い用量を包含する。
例えば，１回／週，２回／週，３回／週，４回／週，５回／週，６回／週，７回／週，２週間に１回，３週間に１回，４週間に１回，５週間に１回等の投与スケジュールが本発明について利用可能である。投与スケジュールは，合計で，例えば，１週間，２週間，３週間，４週間，５週間，６週間，２か月，３か月，４か月，５か月，６か月，７か月，８か月，９か月，１０か月，１１か月，および１２か月の期間の投与を包含する。
上述の投与スケジュールのサイクルが提供される。サイクルは，例えば，７日ごとに；１４日ごとに；２１日ごとに；２８日ごとに；３５日ごとに；４２日ごとに；４９日ごとに；５６日ごとに；６３日ごとに；７０日ごと等に反復することができる。サイクルの間には投与しない間隔があってもよく，この間隔は，例えば，約７日；１４日；２１日；２８日；３５日；４２日；４９日；５６日；６３日；７０日等であることができる。この文脈において，“約”との用語は，プラスマイナス１日，プラスマイナス２日，プラスマイナス３日，プラスマイナス４日，プラスマイナス５日，プラスマイナス６日，またはプラスマイナス７日を意味する。
本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａを経口で投与する方法を包含する。また，Ｌｉｓｔｅｒｉａを静脈内で投与する方法も提供される。さらに，Ｌｉｓｔｅｒｉａを筋肉内に投与する方法が提供される。本発明は，肉汁系の，または肉または動物製品に由来するポリペプチドを含む培地中で成長させることにより製造される，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の培養物または懸濁液を提供する。本発明はまた，肉または動物背品を含まない培地中で成長させることにより製造される，植物性ポリペプチドを含む培地中で成長させることにより製造される，酵母産物に基づかない培地中で成長させることにより製造される，または，酵母ポリペプチドを含む培地中で成長させることにより製造される，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の培養物または懸濁液を提供する。
本発明は，経口ではなくＬｉｓｔｅｒｉａを投与する方法を包含する。また，静脈内ではなくＬｉｓｔｅｒｉａを投与する方法も提供される。さらに，筋肉内ではなくＬｉｓｔｅｒｉａを投与する方法が提供される。本発明は，肉汁系ではない，または肉または動物性製品に由来するポリペプチドを含まない培地中で成長させることにより製造される，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の培養物または懸濁液を提供する。また本発明は，植物性製品に基づく，植物ポリペプチドを含む，酵母製品に基づく，または酵母ポリペプチドを含む培地中で成長させることにより製造されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の培養物または懸濁液を提供する。
追加の治療用薬剤，例えば，小分子，抗生物質，先天性免疫調節剤，耐性調節剤，サイトカイン，化学療法剤，または放射線照射を用いる共投与の方法は当該技術分野においてよく知られている（Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。
本発明は，減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａと併用して投与するための試薬を提供する。これらの試薬としては，例えば下記の生物学的試薬が挙げられる：（１）サイトカイン，抗体，樹状細胞，減弱化腫瘍細胞細胞；（２）小分子剤，例えば５−フルオロウラシル，メトトレキセート，パクリタキセル，ドセタキセル，シスプラチン，ゲムシタビン；（３）制御Ｔ細胞を調節する試薬，例えばシクロホスファミド，抗ＣＴＬＡ４抗体，抗ＣＤ２５抗体（例えば，Ｈａｗｒｙｆａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：３４４−３３５１を参照）；および（４）ワクチン（ポリペプチドワクチン，核酸ワクチン，減弱化腫瘍細胞ワクチン，および樹状細胞ワクチンを含む）．試薬は，Ｌｉｓｔｅｒｉａとともに，またはＬｉｓｔｅｒｉａとは独立して（前または後に）投与することができる。例えば，試薬は，同じ日にＬｉｓｔｅｒｉａの直前（または直後）に投与してもよく，Ｌｉｓｔｅｒｉａの１日前（または後），一週間前（または後），一か月前（または後），または２か月前（または後）等に投与してもよい。
本発明の生物学的試薬または高分子は，サイトカインのアゴニストまたはアンタゴニスト，サイトカインのアゴニストまたはアンタゴニストをコードする核酸，サイトカインを発現する細胞，またはアゴニスト性またはアンタゴニスト性抗体を包含する。生物学的試薬としては，限定されないが，ＴＨ−１サイトカイン，ＴＨ−２サイトカイン，ＩＬ−２，ＩＬ−１２，ＦＬＴ３−リガンド，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＦＮ ｇａｍｍａ，サイトカインレセプター，可溶型サイトカインレセプター，ケモカイン，腫瘍壊死因子（ＴＮＦ），ＣＤ４０リガンド，またはプロテオソームサブユニットの免疫プロテオソームサブユニットでの置き換えを刺激する試薬が挙げられる。
本発明は，生物学的試薬，例えば，以下の少なくとも１つ：ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−１２，ＩＬ−１８，腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を発現するように，またはＰｒｏｔｅｉｎ−１０を誘導するように遺伝子工学操作された細胞を包含する。他の企図される試薬としては，Ｂ７−１，Ｂ７−２，ＣＤ２８，ＣＤ４０リガンド，またはＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）のアゴニスト，および可溶性となるように遺伝子工学操作された，または膜結合性となるように遺伝子工学操作された新規の形態が挙げられる（例えば，Ｋａｒｎｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５６９−２５７６；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３８９−４１８；Ｐａｒｎｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１０：３７−４３；Ｇｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：９９−１０６；Ｃｈｉｏｄｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１２５−１３３；Ｅｎｚｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１２１３−１２１９；ＳｏｏＨｏｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：７３４３−７３４９；Ｍｉｈａｌｙｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５３３８−５３４５；Ｃｈａｐｏｖａｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６９７７−６９８４を参照）。
限定を示唆するものではないが，本発明は，以下の生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を提供する。例えば，ＭＣＰ−１，ＭＩＰ１アルファ，ＴＮＦアルファおよびインターロイキン２は種々の腫瘍を治療するのに有効である（例えば，Ｎａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（６Ａ）：４０８７−４０９６；Ｋａｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６４１６−６４２０；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４０２３−４０２８；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｗａｉ Ｋｅ Ｚａ Ｚｈｉ ４０：７８９−７９１；Ｈｏｖｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：４３００−４３０８；Ｔｓｕｃｈｉｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２６０−２６９；Ｓａｋａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：６９５−７０４を参照）。
本発明は，Ｆｌｔ３−リガンドアゴニスト，およびＬｉｓｔｅｒｉａと組み合わせたＦｌｔ３−リガンドアゴニストを包含する試薬および方法を提供する。Ｆｌｔ３−リガンド（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）は，抗腫瘍免疫応答を生成することができるサイトカインである（例えば，Ｄｒａｎｏｆｆ（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１８８：１４７−１５４；Ｍａｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２３９−３２４６；Ｆｕｒｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：７７４−７８３；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：５２２８−５２３７；Ｍａｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２３９−３２４６を参照）。
別の態様においては，本発明は，少なくとも１つの腫瘍抗原，または感染性疾患抗原を発現する樹状細胞（ＤＣ）の投与を企図する。ＤＣによる抗原の発現は，例えば，ペプチド負荷，腫瘍細胞抽出物，腫瘍細胞との融合，ｍＲＮＡによる形質導入，またはベクターによるトランスフェクション等の方法により行うことができる（例えば，Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６９９−１７０８；Ｃｏｎｒａｄ ａｎｄ Ｎｅｓｔｌｅ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４０５−４１２；Ｇｉｌｂｏａ ａｎｄ Ｖｉｅｗｅｇ（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：２５１−２６３；Ｐａｃｚｅｓｎｙ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１３：４３９−４４７；Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２６４−２７１を参照）。
本発明の方法および試薬はまた，小分子剤，例えば５−フルオロウラシル，メトトレキセート，イリノテカン，ドキソルビシン，プレドニゾン，ドロスタチン−１０（Ｄ１０），コンブレタスタチンＡ−４，マイトマイシンＣ（ＭＭＣ），ビンクリスチン，コルチシン，ビンブラスチン，シクロホスファミド，真菌ベータグルカンおよびその誘導体等（例えば，Ｈｕｒｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２３３５−２３４２；Ｐｅｌａｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６６０８−６６１５；Ｈａｖａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ９：１９４−２０４；Ｔｕｒｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：７７１−７８２；Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：３３６−３４４；Ａｎｄｒａｄｅ−Ｍｅｎａ（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ．１６：９５−１０３；Ｃｈｒｉｓｃｈｉｌｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０：３９６−４０３を参照）。また，分子ではない組成物，例えば，塩およびイオンも包含される。
シクロホスファミドの類似体も提供される（例えば，Ｊａｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：３８４３−３８５２；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５３９４−５４００；Ｂｏｒｃｈ ａｎｄ Ｃａｎｕｔｅ（１９９１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３０４４−３０５２；Ｌｕｄｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２：１５１−１５８；Ｚｏｎ（１９８２）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９：２０５−２４６を参照）。
また本発明に包含されるものは，生来の（ｉｎｎａｔｅ）免疫応答を刺激する小分子剤，例えば，ＣｐＧオリゴヌクレオチド，イミキモド，およびａｌｐｈａＧａｌＣｅｒである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドはＴＬＲ９を介して免疫応答を媒介する（例えば，Ｃｈａｇｎｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：１３０２−１３１１；Ｓｐｅｉｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｆｅｂ．３（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）；Ｍａｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：３６１−３６９；Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：８７５４−８７６０；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４８３−５１３；Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−３７６；Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３１１４−３１２２を参照）。
他の有用な小分子剤としては，細菌ペプチドグリカン，例えばある種のＮＯＤ２リガンド（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１１３８６−１１３９１）に由来するものが挙げられる。
本発明は，Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ；サプレッサーＴ細胞）の活性を調節するための試薬および方法を含む。Ｔｒｅｇ細胞活性の減弱化または阻害は，免疫系による腫瘍細胞の殺傷を増強することができる。Ｔｒｅｇ細胞活性を阻害する多数の試薬が同定されている。これらの試薬としては，例えば，シクロホスファミド（別名Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＣＴＸ），抗ＣＤ２５抗体，ＧＩＴＲ−ＬまたはＧＩＴＲの調節剤，フォークヘッドボックス転写因子（Ｆｏｘ）の調節剤，ＬＡＧ−３の調節剤，抗ＩＬ−２Ｒ抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば，Ｐａｒｄｏｌｌ（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：８０７−８３９；Ｅｒｃｏｌｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１５９１−１６０２；Ｈａｅｒｙｆａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：３３４４−３３５１；Ｍｉｈａｌｙｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５３３８−５３４５；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５００８−５０２０；Ｓｃｈｉａｖｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２０２４−２０３０；Ｃａｌｍｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｏｃｔ．０８（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）；Ｍｉｎｃｈｅｆｆ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓｅｐｔ．１７［ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｍｕｒｉｇｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１４９−１５７；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５００８−５０２０；Ｃｏｆｆｅｒ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：８８９−８９９；Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１８：８３０−８５０；Ｃｏｂｂｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６００３−６０１０；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１：５０３−５１３を参照）。ＣＴＸは免疫系に対して二面的な作用を示し，低用量のＣＴＸはＴｒｅｇｓを阻害する（例えば，Ｌｕｔｓｉａｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：２８６２−２８６８を参照）。
ＣＴＬＡ４ブロッキング剤，例えば抗ＣＴＬＡ４ブロッキング抗体は，癌，腫瘍，前癌性疾患，感染等に対する免疫応答を増強することができる（例えば，Ｚｕｂａｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１４３３−１４４０；Ｅｓｐｅｎｓｃｈｉｅｄ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３４０１−３４０７；Ｄａｖｉｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３２８１−３２８８；Ｈｏｄｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：４７１２−４７１７を参照）。本発明で抗ＣＴＬＡ４抗体等を用いる場合，本発明はＴｒｅｇｓを阻害するための使用に限定される必要はなく，また，常にＴｒｅｇｓの阻害を包含する必要もない。
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）ブロッキング剤，例えば抗ＬＡＧ−３抗体または可溶型ＬＡＧ−３（例えばＬＡＧ−３Ｉｇ）は，癌または感染に対する免疫応答を増強することができる。抗ＬＡＧ−３抗体は，Ｔｒｅｇｓの活性を低下させる（例えば，Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１：５０３−５１３；Ｔｒｉｅｂｅｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６１９−６２２；Ｗｏｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｖｉｇｎａｌｉ（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９７０−９７９；Ｃａｐｐｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：２５１８−２５２５；Ｗｏｒｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５４５０−５４５５；Ｍａｃｏｎ−Ｌｅｍａｉｔｒｅ ａｎｄ Ｔｒｉｅｂｅｌ（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１５：１７０−１７８を参照）。
腫瘍抗原を含むワクチン，腫瘍抗原をコードする核酸，腫瘍抗原をコードする核酸を含むベクター，腫瘍抗原を含む細胞，腫瘍細胞，または減弱化された腫瘍細胞が本発明により包含される。腫瘍抗原をコードする核酸に由来する試薬，例えば，コドン最適化核酸，または２またはそれ以上の異なる腫瘍抗原をコードする核酸，または再配置された腫瘍抗原のエピトープ（例えば，エピトープの天然の順番はＡＢＣＤであり，遺伝子工学操作された順番がＡＤＢＣである）を発現する核酸，または少なくとも２つの異なる腫瘍抗原を含む融合蛋白質をコードする核酸が提供される。
投与された抗体，抗体に由来する結合化合物，サイトカイン，または他の治療剤が毒性を生ずる場合，適当な投与量は，治療効果が毒性効果を上回る量でありうる。一般に，本発明の最適投与量は，治療効果を最大にし，一方で毒性効果を患者の生命を脅かさないか，治療剤の効力を低下させないレベルまで制限する量である。毒性効果ないし抗治療効果の兆候としては，限定されないが，例えば，抗イディオタイプ応答，治療用抗体に対する免疫応答，アレルギー反応，血液及び血小板毒性，アミノトランスフェラーゼ，アルカリホスファターゼ，クレアチンキナーゼの上昇，神経毒性，吐き気および嘔吐が挙げられる（例えば，Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：４３１−４３４を参照）。
有効量の治療薬は，症状を，通常は少なくとも１０％，より普通には少なくとも２０％，最も普通には少なくとも３０％，典型的には少なくとも４０％，より典型的には少なくとも５０％，最も典型的には少なくとも６０％，多くの場合少なくとも７０％，より多くの場合少なくとも８０％，最も多くの場合少なくとも９０％，慣用的には少なくとも９５％，より慣用的には少なくとも９９％，最も慣用的には少なくとも９９．９％，低下または軽減させるであろうものである。
本発明の試薬および方法は，１回のみのワクチン接種；第１回のワクチン接種；または少なくとも１回のブースターワクチン接種；少なくとも２回のブースターワクチン接種；または少なくとも３回のブースターワクチン接種を含むワクチンを提供する。ブースターワクチン接種用のパラメータに関するガイダンスは入手可能である（例えば，Ｍａｒｔｈ（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ２５：１９９−２０３；Ｒａｍｓａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：３８２−３８８；Ｇｈｅｒａｒｄｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：６５５−６６７；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１）ＡｃｔＡ Ｃｌｉｎ．Ｂｅｌｇ．５６：２０９−２１９；Ｇｒｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：６９４４−６９５１；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７０：Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ３８−Ｓ４１；Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ａｍｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：２７９０−２７９５を参照）。
Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌（またはＬｉｓｔｅｒｉａワクチン）を含む第１の試薬，および例えば，サイトカイン，シクロホスファミドまたはメトトレキセート等の小分子，またはワクチンを含む第２の試薬，例えば，減弱化腫瘍細胞またはサイトカインを発現する減弱化腫瘍細胞が提供される。第１の試薬および第２の試薬を投与する下記の方法が提供される。
Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび第２の試薬は併用して投与することができ，すなわち，これらの試薬のそれぞれは，互いに部分的にまたは完全に重複する時間間隔で投与することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび第２の試薬は，互いに重複しない時間間隔の間に投与することができる。例えば，第１の試薬はｔ＝０−１時間の時間枠の中で投与することができ，一方，第２の試薬はｔ＝１−２時間の時間枠の中で投与することができる。また，第１の試薬はｔ＝０−１時間の時間枠の中で投与することができ，一方，第２の試薬は，ｔ＝２−３時間，ｔ＝３−４時間，ｔ＝４−５時間，ｔ＝５−６時間，ｔ＝６−７時間，ｔ＝７−８時間，ｔ＝８−９時間，ｔ＝９−１０時間等の時間枠内のいずれかに投与することができる。さらに，第２の試薬は，ｔ＝マイナス２−３時間，ｔ＝マイナス３−４時間，ｔ＝マイナス４−５時間，ｔ＝５−６マイナス時間，ｔ＝マイナス６−７時間，ｔ＝マイナス７−８時間，ｔ＝マイナス８−９時間，ｔ＝マイナス９−１０時間等の時間枠内のいずれかに投与することができる。
別の例を挙げると，第１の試薬はｔ＝０−１日の時間枠の中で投与することができ，一方，第２の試薬はｔ＝１−２日の時間枠の中で投与することができる。また，第１の試薬は，ｔ＝０−１日の時間枠の中で投与することができ，一方，第２の試薬は，ｔ＝２−３日，ｔ＝３−４日，ｔ＝４−５日，ｔ＝５−６日，ｔ＝６−７日，ｔ＝７−８日，ｔ＝８−９日，ｔ＝９−１０日等の時間枠内のいずれかに投与することができる。さらに，第２の試薬は，ｔ＝マイナス２−３日，ｔ＝マイナス３−４日，ｔ＝マイナス４−５日，ｔ＝マイナス５−６日，ｔ＝マイナス６−７日，ｔ＝マイナス７−８日，ｔ＝マイナス８−９日，ｔ＝マイナス９−１０日等の時間枠内のいずれかに投与することができる。
別の観点においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａの投与はｔ＝０時間に開始することができ，ここで投与の結果，Ｌｉｓｔｅｒｉａの血漿濃度ピーク（または最大プラトー）となり，第２の試薬の投与は，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の９５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の９０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の８５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の８０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の７５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の７０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の６５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の６０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の５５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の５０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の４５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の４０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の３５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の３０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の２５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の２０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の１５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の１０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の２．０％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の０．５％に達した時，およそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の０．２％に達した時，またはおよそ血漿Ｌｉｓｔｅｒｉａの濃度が前記ピーク濃度の０．１％またはそれ以下に達した時に開始することができる。
別の観点においては，第２の試薬の投与はｔ＝０時間に開始することができ，ここで，投与の結果第２の試薬の血漿濃度はピーク（または最大プラトー）となり，Ｌｉｓｔｅｒｉａの投与は，およそ第２の試薬の血漿レベルの濃度が前記ピーク濃度に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の９５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の９０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の８５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の８０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の７５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の７０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の６５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の６０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の５５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の５０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の４５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の４０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の３５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の３０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の２５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の２０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の１５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の１０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の２．０％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の０．５％に達した時，およそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の０．２％に達した時，またはおよそ血漿第２の試薬の濃度が前記ピーク濃度の０．１％またはそれ以下に達した時に開始することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは第２の試薬の減弱化はインビボでも生じうることが理解されているため，上述の濃度は，無傷の試薬の測定後に評価してもよく，または，無傷の試薬の識別可能な分解生成物の測定後に評価してもよい。
治療剤および診断剤の製剤は，生理学的に許容しうる担体，賦形剤，または安定化剤と混合して，例えば，凍結乾燥粉体，スラリー，水性溶液または懸濁液の形で，保存用に調製することができる（例えば，Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。
本発明はまた，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細胞，リステリア細胞培養物または凍結乾燥細胞調製物およびコンパートメントを含むキットを提供する。さらに，本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細胞，リステリア細胞培養物，または凍結乾燥細胞調製物および試薬を含むキットを提供する。また，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細胞，リステリア細胞培養物，または凍結乾燥細胞調製物および使用または廃棄の指針を含むキットも提供される。さらに，本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細胞，リステリア細胞培養物，または凍結乾燥細胞調製物，および区画および試薬を含むキットを提供する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，およびＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を小分子の抗癌剤，および／または小分子の免疫調節剤（例えばシクロホスファミド），および／または小分子の抗感染剤等とともに使用するための指針を含むキットも提供される。また，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，および／または，Ｌｉｓｔｅｒｉａと投与するための指針，および／または投与したＬｉｓｔｅｒｉａに対する免疫応答をモニターするための指針，および／または，投与したＬｉｓｔｅｒｉａによりコードされる異種抗原に対する免疫応答をモニターするための指針を含むキットも提供される。
（ｂ）． 使用
ある態様においては，本発明は，改変型Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌，例えば，少なくとも１つの異種抗原を発現するよう遺伝子工学操作されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを提供する。本発明は，免疫応答の増強，免疫応答の刺激，免疫提示の増強，発現されたｍＲＮＡまたはポリペプチドの安定性の増加，発現されたポリペプチドの蛋白質分解性プロセシングの増加，変異した自己抗原に対する免疫応答の増加，癌または感染に対する生存の増加，および／または癌または感染の治療に有用である。本発明はまた，例えば，工業，農業，または医療用に，異種抗原の発現を増強するのに有用である。
癌，腫瘍，または感染性因子に対する免疫応答を刺激，増強または増加させる方法について；および癌，腫瘍，または感染性因子に対する生存を刺激，増強または増加させる方法について；増加は，異種抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａを投与することにより生ずる。実験対照を提供する目的のためには，増加は，この特定の異種抗原を発現する核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａを投与したときの応答に対するものであってもよい。代替として，増加は，異種抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａ，例えば親または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与したときの応答に対するものであってもよい。さらに別の代替として，増加は，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与しないときの応答に対するものであってもよい。
癌，腫瘍，または感染性因子に対する免疫応答を刺激し，増強し，または増加させる方法について，および癌，腫瘍，または感染性因子に対する生存を刺激し，増強しまたは増加させる方法について，増加は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ（異種抗原をコードする核酸を含むかまたは含まない）を免疫調節剤，例えば，アゴニスト抗体，サイトカイン，または癌，腫瘍，または感染性因子の抗原に特異的に結合する抗体とともに投与することにより生じうる。実験対照を提供する目的のためには，増加は，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与するが免疫調節剤を投与しないときの応答に対するものであってもよい。代替として，増加は，免疫調節剤を投与するが，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与しないときの応答に対するものであってもよい。さらに別の代替として，増加は，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与せず，免疫調節剤を投与しないときの応答に対するものであってもよい。
ある態様においては，本発明は哺乳動物において抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量の本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。ある態様においては，本発明は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原に対する免疫応答を刺激する方法を提供し，この方法は，有効量の本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａ細菌，またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａにより発現される異種抗原は，癌または感染性因子からのまたはこれに由来する抗原と少なくとも１つのエピトープを共有するかまたはこれと免疫学的に交叉反応性である。ある態様においては，免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞免疫応答である。ある態様においては，免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞免疫応答である。
本発明は，殺されるが代謝的に活性な（ｋｉｌｌｅｄ ｂｕｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ；ＫＢＭＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を提供する（例えば，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：８５３−８６０を参照）。ＫＢＭＡ Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は，代謝的に活性であるが，例えば寒天上にコロニーを形成することができない。少なくとも１つのＤＮＡ修復遺伝子における不活性化変異，例えばΔｕｖｒＡＢは，低濃度の核酸架橋剤（例えば，ソラーレン）を用いてＬｉｓｔｅｒｉａを殺すことを可能とし，ここで，これらの濃度は，コロニー形成を防止するのには十分であるが，実質的に代謝を弱めるか，または検出可能なように代謝を弱めるのには不十分である。ソラーレン／ＵＶＡ光による限定された処理，および／またはゲノムの鎖間架橋を形成するのに高度に特異的な核酸架橋剤による処理の結果，細菌細胞は殺されるがなお代謝的に活性である。
ある態様においては，本発明により，異常に増殖する細胞の数の低減，癌細胞の数の低減，腫瘍細胞の数の低減，腫瘍体積の低減，体液または組織（例えば，血清）単位量あたりの感染性生物または病原体の数の低減，ウイルスタイターの低減（例えば，血清）が得られ，ここで，これは普通は少なくとも５％の低下であり，より普通には少なくとも１０％の低下であり，最も普通には少なくとも１５％の低下であり，典型的には少なくとも２０％の低下であり，より典型的には少なくとも２５％の低下であり，最も典型的には少なくとも３０％の低下であり，通常は少なくとも４０％の低下であり，より通常は少なくとも５０％の低下であり，最も通常は少なくとも６０％の低下であり，慣用的には少なくとも７０％の低下であり，より慣用的には少なくとも８０％の低下であり，最も慣用的には少なくとも９０％の低下であり，さらに最も慣用的には少なくとも９９％の低下である。低下の単位は，限定されないが，哺乳動物被験者あたりの腫瘍細胞の数；肝臓あたりの腫瘍細胞の数；脾臓あたりの腫瘍細胞の数；哺乳動物被験者あたりの腫瘍細胞の重量；腫瘍細胞／肝臓の重量；腫瘍細胞／脾臓の重量；肝臓１グラムあたりのウイルス粒子またはウイルスまたはタイターの数；細胞１個あたりのウイルス粒子またはウイルスまたはタイターの数；血液１ｍｌあたりのウイルス粒子またはウイルスまたはタイターの数等でありうる。
Ｌｉｓｔｅｒｉａを調製するために用いる成長培地は，化学分析，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），質量分析，ガスクロマトグラフィー，分光分析法等により特性決定することができる。成長培地はまた，その培地の成分に特異的な抗体を用いて特性決定することができ，ここで，かかる成分は，Ｌｉｓｔｅｒｉａへの夾雑物，例えば，リステリア粉体，凍結調製物，または細胞ペースト中の夾雑物として生ずる。ペプチドまたは蛋白質抗原，または糖脂質，糖ペプチド，またはリポペプチド抗原に特異的な抗体は，動物起源の夾雑物を検出するために処方されたＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いることができる。抗原または抗原性フラグメントを検出するのに用いるための動物起源の抗体が利用可能である（例えば，Ｆｕｋｕｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊｐｎ．ＨｅａｒｔＪ．１８：６９６−７０４；ＤｅＶａｙ ａｎｄ Ａｄｌｅｒ（１９７６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１４７−１６８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４６：３４−４１；Ｋａｗａｋｉｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊｐｎ．Ｃｉｒ．Ｊ．４３：４５２−４５７；Ｈａｎｌｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌｕｐｕｓ ３：１９３−１９９；Ｈｕｐｐｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１２：６５９−６６５；Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５：２９１−２９９を参照）。本発明は，Ｌｉｓｔｅｒｉａが免疫系に及ぼす影響を試験することを容易にするキットおよび診断方法を提供する。試験は，Ｌｉｓｔｅｒｉａの１つの株をＬｉｓｔｅｒｉａの別の株と比較すること，または親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と比較することを含むことができる。試験の方法は，例えば，食作用，拡散，抗原提示，Ｔ細胞刺激，サイトカイン応答，宿主毒性，ＬＤ５０，および病的状態の軽減における有効性を含む。
本発明は，癌，腫瘍，前癌性疾患，免疫疾患，および／または感染性因子にタイする被験者，宿主，患者，試験対象者，実験対象者，動物対象物等の生存を増加させる方法を提供する。感染性因子は，ウイルス，細菌，または寄生虫，またはこれらの任意の組み合わせでありうる。この方法は，減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａを，例えば，懸濁液，ボーラス，ゲル，マトリクス，注射，または注入等として投与することを含む。投与されたＬｉｓｔｅｒｉａは，適当な対照（例えば，何も投与しないか，またはプラセボを投与する等）と比較して，通例は少なくとも１日；より通例では少なくとも４日；最も通例では少なくとも８日，普通には少なくとも１２日；より普通には少なくとも１６日；最も普通には少なくとも２０日，多くの場合少なくとも２４日；より多くの場合少なくとも２８日；最も多くの場合少なくとも３２日，慣用的には少なくとも４０日，より慣用的には少なくとも４８日；最も慣用的には少なくとも５６日；典型的には少なくとも６４日；より典型的には少なくとも７２日；最も典型的には少なくとも８０日；通常は少なくとも６ヶ月；より通常は少なくとも８ヶ月；最も通常は少なくとも１０ヶ月；一般には少なくとも１２か月；より一般には少なくとも１６か月；最も一般には少なくとも２０か月またはそれ以上，生存を増加させる。
ある態様においては，Ｌｉｓｔｅｒｉａを投与する被験者／宿主／患者は哺乳動物である。ある態様においては，哺乳動物は霊長類である。ある態様においては，霊長類はヒトである。
上述の方法のそれぞれは，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび賦形剤を含む組成物，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび担体，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよびバッファ，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび試薬，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび薬学的に許容しうる担体，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび農業的に許容しうる担体，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび獣医学的に許容しうる担体，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび安定剤，Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび保存剤等を含む組成物を投与することを企図する。
本発明は癌性（新生物，悪性腫瘍，癌，腫瘍，および／または前癌性疾患，異形成等）と感染性（感染）の両方の状態を治療するための試薬および方法を提供する。癌性（新生物，悪性腫瘍，癌，腫瘍，および／または前癌性疾患，異形成等）および感染の両方の疾患を治療するための試薬および方法が提供される。ある種のウイルス，例えばパピローマウイルスおよびポリオーマウイルスによる感染の結果癌性状態になることがあり，ここでは，この状態は癌性および感染性の両方の状態でありうる。癌性でありかつ感染性である状態は，非限定的例として，ウイルス感染の結果癌性細胞が生ずる場合，および癌性細胞がウイルスがコードする抗原を発現する場合に，検出することができる。別の非限定的例として，癌性でありかつ感染性である状態は，腫瘍細胞に対する免疫応答には，ウイルスにコードされる抗原に対する特異的認識が関与する状態である（例えば，Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：４３５−４４５；Ｉｃｈａｓｏ ａｎｄ Ｄｉｌｗｏｒｔｈ（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７９０８−７９１６；Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９３３−３９４１；Ｄａｅｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．９：７３３−７４２；Ｂｏｕｄｅｗｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９６：９９８−１００６；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１４５６７−１４５７１を参照）。
ある態様においては，異種抗原（またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）を発現する本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａは，被験者中で抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するために用いられる。ある態様においては，本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａ，ワクチン，および他の組成物は，癌性疾患，前癌性疾患，腫瘍，感染，および／または腫瘍および癌の血管新生を治療するために用いられる。ある態様においては，本明細書に記載されるＬｉｓｔｅｒｉａ，ワクチン，および他の組成物は，被験者において癌を治療するために用いられる。
以下の態様は，本明細書に記載される個々の態様に関連する。本発明は，ある態様においては，感染性疾患に対して免疫系を刺激する方法を含み，ここで感染性疾患はＬｉｓｔｅｒｉａ感染である。また，感染性疾患に対して免疫系を刺激する方法が含まれ，ここで，感染性疾患はＬｉｓｔｅｒｉａ感染ではなく，すなわちＬｉｓｔｅｒｉａ感染は除外される。
それぞれの態様は，代替のまたは追加の試薬として，減弱化されていないＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。また，それぞれの態様は，代替のまたは追加の試薬として，減弱化されているＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。それぞれの態様は，代替のまたは追加の方法として，減弱化されていないＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法を包含する。また，それぞれの態様は，代替のまたは追加の方法として，減弱化されているＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法を包含する。
本明細書に記載される態様のそれぞれは，少なくとも１つの腫瘍抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａ，少なくとも１つの癌抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａ，少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａ，ならびに少なくとも１つの腫瘍抗原，癌抗原，および／または異種抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。
本明細書に記載される態様のそれぞれは，腫瘍抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａ，癌抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａ，異種抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａ，ならびに腫瘍抗原，癌抗原，および／または異種抗原を発現しないＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。
本明細書に記載される態様のそれぞれは，非リステリア感染性生物からの抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。上述の態様のそれぞれは，ウイルス，寄生虫，細菌，腫瘍，腫瘍に由来する自己抗原，または腫瘍に由来する非自己抗原からの少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。
本明細書に記載される態様のそれぞれは，非リステリア感染性生物からの抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。上述の態様のそれぞれは，ウイルス，寄生虫，細菌，腫瘍，腫瘍に由来する自己抗原，または腫瘍に由来する非自己抗原からの少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａを用いる方法および試薬を包含する。
本明細書に記載される態様のそれぞれはまた，動物蛋白質に基づく培地で成長させることにより調製されたものではなく，異なるタイプの培地で成長させることにより調製されたＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。上述の態様のそれぞれはまた，動物蛋白質に由来するペプチドを含む培地で成長させることにより調製されたものではなく，異なるタイプの培地で成長させることにより調製されたＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。さらに，上述の態様のそれぞれは，経口ではない経路または経腸ではない経路によりＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを包含する。さらに，上述の態様のそれぞれは，腸管内腔からリンパ管または血流への移動を必要としない経路によりＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを含む。
本明細書に記載される態様のそれぞれは，さらに，Ｌｉｓｔｅｒｉａが腫瘍内に直接注入されないか，または癌，前癌性疾患，腫瘍，または感染により影響を受けた部位に直接注入されない方法を含む。
さらに，本明細書に開示される態様のそれぞれは，腫瘍への直接注射により，癌病巣への直接注射により，および／または感染病巣への直接注射によりＬｉｓｔｅｒｉａを投与することを包含する。また，本発明は，投与が腫瘍への直接注射によらない，癌病巣への直接注射によらない，および／または感染病巣への直接注射によらないものである，上述の態様のそれぞれを含む。
本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が腫瘍抗原であるか腫瘍抗原に由来するワクチンが提供される。また，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が癌抗原であるかまたは癌抗原に由来するワクチンが提供される。さらに，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が感染性生物，例えば，ウイルス，細菌，または多細胞生物の抗原であるか，または感染性生物の抗原に由来するワクチンが提供される。
さらに別の態様においては，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が腫瘍抗原であるかまたは腫瘍抗原に由来する核酸が提供される。また，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が癌抗原であるか癌抗原に由来する核酸も提供される。さらに，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が，感染性生物の抗原であるか，または感染性生物，例えばウイルス，細菌，または多細胞生物の抗原に由来する核酸が提供される。
別の態様においては，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が腫瘍抗原であるかまたは腫瘍抗原に由来するＬｉｓｔｅｒｉａが提供される。また，本明細書に開示される例のいずれかにおいて，異種抗原が癌抗原であるかまたは癌抗原に由来するＬｉｓｔｅｒｉａが提供される。さらに，本明細書に記載される態様のいずれかにおいて，異種抗原が感染性生物，例えば，ウイルス，細菌，寄生虫，または多細胞生物からの抗原であるか，または感染性生物の抗原に由来するＬｉｓｔｅｒｉａが提供される。
上述の態様のそれぞれはまた，動物または肉蛋白質に基づく培地で成長させることにより調製されたものではないが，別のタイプの培地で成長させることにより調製されたものである，減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａを包含する。肉または動物蛋白質に基づく培地で成長させることにより調製されたものではないが，酵母および／または植物由来蛋白質に基づく培地で成長させることにより調製された減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａが提供される。
特にそうではないと明記しない限り，本明細書に記載される態様のそれぞれは，異種抗原をコードする核酸を含まない細菌また，特にそうではないと明記しない限り，本明細書に記載される態様のそれぞれは，異種制御配列をコードする核酸を含まない細菌を包含する。任意に，本明細書に記載される態様のいずれも，異種抗原をコードする，および／または異種制御配列をコードする核酸を含む細菌を包含する。
以下の説明は，細菌の態様，例えば分泌される抗原，分泌されない抗原，分泌以外のメカニズムによって細菌から放出されうる分泌抗原，および分泌以外のメカニズムによって放出されうる非分泌抗原をコードする，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ，または別の細菌の態様に関する。核酸を含むポリヌクレオチドを含む細菌が包含され，ここで，核酸は分泌配列を含み，適当な条件下で分泌されるポリペプチドをコードし；核酸は分泌配列を含まないポリペプチドをコードし；核酸は分泌配列を含み，ポリペプチドは酵素的傷害または細胞膜または細胞壁への穿孔等の別のメカニズムにより放出されることができ；および核酸は分泌配列を含まないポリペプチドをコードするがポリペプチドは酵素的傷害または細胞膜および／または細胞壁への穿孔等の別のメカニズムにより放出されることができる。
いかなる限定も示唆するものではないが，本発明の狭さまたは広さに関して，当業者は，本発明を，以下の態様のいずれか１つを含むよう，または，以下の態様のいずれか１つから構成されるよう，改変することができる（表１０）。
代謝の速度は，種々の指標，例えば，翻訳，呼吸，分泌，輸送，発酵，解糖，アミノ酸代謝，またはクレブス回路により測定することができる。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの代謝の種々の指標は開示されている（例えば，Ｋａｒｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：６１８２−６１８７；Ｇｉｌｂｒｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：９５−９８を参照）。しばしば，代謝は，無傷の細菌を用いて，放射活性，重同位体，または蛍光タグ付き代謝産物により評価される。当業者は，翻訳を測定するための適当な遺伝子，または解糖，アミノ酸代謝，またはクレブス回路を測定するための適当な酵素を選択することができる。熱死滅細菌は，一般に，本質的にまたは総合的に代謝的に不活性であり．本質的にまたは総合的に代謝的に不活性な細菌の見かけの残存代謝活性は，脂質の酸化，スルフヒドリルの酸化，重金属により触媒される反応，または熱処理に対して安定な酵素に起因するものでありうる。
（ｃ） 免疫応答を評価する方法；診断の方法
免疫応答を決定，評価，モニタリング，および／または診断する試薬および方法は入手可能である。本発明は，ある状況では，本発明の組成物を投与する哺乳動物被験者を診断する以下の方法を提供する。別の観点においては，投与された本発明の組成物の１またはそれ以上に対する免疫応答を評価するための以下の方法が提供される。例えば，インビボ，インビトロ，エクスビボ，インウテロで；生きているかまたは死亡した哺乳動物に；細胞に；組換え，キメラまたはハイブリッド細胞に；生物学的液体に，単離された核酸に適用することができる方法としては以下の方法が挙げられる。
ｉ． 細胞パラメータを測定する方法。測定しうるものとしては，エフェクターＴ細胞；中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）；エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ），およびこれらの構成成分が挙げられる。また，これらの細胞の生物学的機能，例えば，細胞毒性機能，マーカーの発現，抗原に対する親和性，血清等の生物学的コンパートメント中の細胞の数，体内における好ましい位置，例えばリンパ節または脾臓，および抗原に暴露または再暴露されたときの応答の速度も測定することができる。
ｉｉ． 抗体を測定する方法。測定しうるものは，抗体の親和性成熟（例えば，ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ（２００５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：４８７−５１３を参照），抗体のタイターまたはアイソタイプ，例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１；ＩｇＧ２；ＩｇＧ３；ＩｇＧ４）；ＩｇＡ（ＩｇＡ１；ＩｇＡ２）；ＩｇＭ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；抗体のアイソタイプスイッチング，例えば，ＩｇＭの減少およびＩｇＧの増加（例えば，Ｈａｓｂｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５５−６３；Ｒｙｆｆｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１２６−２１３３；Ｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５２３６−５２４３；Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０７５−２０８１；Ｋａｒｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７６８−７７８を参照）；Ｔｈ１型またはＴｈ２型応答の機能であるアイソタイプスイッチング（Ｄｅｌａｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６７２３−６７３２；ＭｃＫｅｎｚｉｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１５６５−１５７２；Ｆａｙｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１９０９−１９１８）である。
ｉｉｉ． Ｂ細胞のパラメータ。測定しうるものとしては，ナイーブＢ細胞（膜ＩｇＤが高く，ＣＤ２７が低い），記憶Ｂ細胞（ＩｇＤが低く，ＣＤ２７が高い），およびこれらの細胞の構成成分が挙げられる（例えば，Ｆｅｃｔｅａｕ ａｎｄ Ｎｅｒｏｎ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４６２１−４６２９を参照）。胚中心内における記憶Ｂ細胞の形成を測定することができる（例えば，Ｏｈｋｕｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７７０３−７７１０を参照）。測定しうるものには，最終的に分化したＢ細胞，例えば，細胞がＣＸＣＬ１２に応答する能力（例えば，Ｒｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１６７６−１６８２を参照）が含まれる。測定しうるものには，契約抗体分泌細胞（ＡＳＣ）（例えば，Ｈａｓｂｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５５−６３を参照）が含まれる。
ｉｖ． Ｔ細胞のパラメータ。測定しうるものは，Ｔ細胞レセプターに対するペプチドの親和性，Ｔ細胞レセプターの親和性成熟（例えば，Ｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：９７８１−９７８６；ＭｃＫｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１９４１−１９５０を参照）である。測定しうるものは，細胞毒性Ｔ細胞の標的細胞に対する親和性（例えば，Ｍｏｎｔｏｙａ ａｎｄ ＤｅｌＶａｌ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１９１４−１９２２を参照）である。測定しうるものには，マーカーが含まれ，例えば，エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）はＣＤ６２ＬＬＯＷおよびＣＣＲ７ＬＯＷとして識別することができ，ここで，これらの細胞は，抗原再会により即時エフェクター機能を示す。中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）はＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の比較的高い発現により識別することができ，ここで，細胞は比較的低い活性化動力学を示す。他の利用可能なマーカーとしては，例えば，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＸＣＬ１，グラニュリシン，グランザイムＡ，グランザイムＢ等が挙げられる（例えば，Ｃｈｔａｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：７８３７−７８４７；Ｋｏｎｄｒａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：１７９７−１８０６；Ｈｕｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：５６１０−５６１５；Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：９２６−９３５；Ｇｏｌｄｒａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１６８８５−１６８９０；Ｗｈｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２２５−２３４；Ｓａｌｌｕｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：７４５−７６３を参照）。異なるタイプの免疫細胞，ならびに特定の細胞の異なる成熟段階，または細胞の異なる活性化段階は，所与のマーカーに特異的な試薬を用いて評定することにより区別することができる（例えば，Ａｈｍａｄｚａｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：９２６−９３５を参照）。
ｖ． 抗原提示細胞（ＡＰＣ），例えば樹状細胞（ＤＣｓ）のパラメータ。測定しうるものは，１ｍｍｏｌｅのＭＨＣ ＣｌａｓｓＩあたりに提示された（または結合した）ペプチドのｍｍｏｌｅである。さらに，測定しうるものは，１ｍｍｏｌのＭＨＣクラスＩＩあたりに提示されたまたは結合したペプチドのｍｍｏｌｅである。また，測定しうるものは，結合したペプチドのアミノ酸配列（例えば，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４８８−５４９４を参照）である。さらに，測定しうるものはＡＰＣが蛋白質に由来するエピトープに対してペプチドに由来するエピトープを提示する相対的能力，ならびに高レベルのペプチドに対して低レベルのペプチドから得たエピトープを提示する能力であり，別の観点においては提示に適したＡＰＣの種類である（例えば，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４９１５−４９２３を参照）。
候補発現コンストラクトおよび候補Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づくワクチンの発現，分泌，提示，免疫原性，および／または治療上の効力を評価する，一般に適用可能な方法の多数の特定の例は下記の実施例に例示される。例えば，下記の実施例ＩＸを参照。特定の候補Ｌｉｓｔｅｒｉａ系のワクチンの免疫原性を評価するためのアッセイは，さらに，例えば米国特許公開２００５／０２４９７４８，２００５／０２８１７８３，および２００４／０２２８８７７に提供される（このそれぞれはその全体が参照として本明細書に取り込まれる）。
当業者には診断上の適当な対照を設計するためのガイダンスが利用可能である（例えば，Ｗｉｌｓｏｎ（１９９１）Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｉｎｅｏｌａ，ＮＹを参照）。
本発明の広範な範囲は下記の実施例を参照することにより最もよく理解しうるが，本発明をいかなる特定の態様にも限定することを意図するものではない。
Ｉ． 一般的方法．
生化学および分子生物学の標準的な方法は記載されている（例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙを参照）。標準的な方法はＡｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹにも見いだされ，これは細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異導入（Ｖｏｌ．１），哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２），複合糖質および蛋白質発現（Ｖｏｌ．３），およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４））を記載する。融合蛋白質を製造する方法は記載されている（例えば，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２００５）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２：１０７−１２１；Ｇｒａｄｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５−２９７を参照）。
変異，制限部位，ｌｏｘＰ部位等を作成するためのスプライスオーバーラップ伸張ＰＣＲおよび他の方法は記載されている（例えば，Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：５２８−５３５；Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８；Ｈｏｒｔｏｎ（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：９３−９９；Ｃｕｔｒｏｎｅ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１４０−１７１４８；Ｃｏｘ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ１０８；Ｗａｒｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ １８６：２９−３５；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｂｉ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９２：１１１−１１９；Ｊｏｈｎｓｏｎ（２０００）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４１：２０１−２０９；Ｌａｎｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．５：８７−１３０；Ｇｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｂｕｒｋ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：８５−９０；ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入キット，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡを参照）。シグナルペプチド，分泌蛋白質，および異種抗原のコドン選択性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を遺伝子工学操作して宿主の最適コドンに適合させることは記載されている（Ｓｈａｒｐ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：１２８１−１２９５；Ｕｃｈｉｊｉｍａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５５９４−５５９９）。シグナルペプチド，分泌蛋白質，および異種抗原のコドン選択性を遺伝子工学操作して，宿主の最適コドンに適合させることは記載されている（Ｓｈａｒｐ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１２８１−１２９５；Ｕｃｈｉｊｉｍａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５５９４−５５９９）。ポリヌクレオチドおよび核酸は，例えば，Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手可能である。
例えば，細菌，ファージおよびプラスミド中で相同組換えを生じさせる方法は利用可能である（例えば，Ｋｕｚｍｉｎｏｖ（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：７５１−８１３；Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ ａｎｄ Ｈｓｉｅｈ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：５０９−５５２；Ａｍｕｎｄｓｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００３）Ｃｅｌｌ １１２：７４１−７４４；Ｃｏｘ（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３５：５３−８２；Ｑｕｉｂｅｒｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：１３１−１３９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：４８１−４８６；Ｗｅｄｌａｎｄ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４４：１１５−１２３；Ｍｕｔｔｕｃｕｍａｒｕ ａｎｄ Ｐａｒｉｓｈ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４５−１５７；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．４：９１−９８を参照）。
多数の伝達性リステリアファージ，ならびにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにリステリアファージを感染させる手法は利用可能である。これらのリステリアファージには，例えば，Ｐ３５，Ｕ１５３，およびこれらの誘導体がある（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｈｏｄｇｓｏｎ（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３１２−３２３；Ｍｅｅ−Ｍａｒｑｕｅｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３３７４−３３７７；Ｚｉｎｋ ａｎｄ Ｌｏｅｓｓｎｅｒ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：２９６−３０２；Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３７：３１−３５；Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７０１−７１０；Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３２４−３４０を参照）。
核酸をＬｉｓｔｅｒｉａに導入するためにエレクトロポレーションおよびＥ．ｃｏｌｉ媒介性コンジュゲーションを使用する方法は記載されている。核酸を細菌内に導入するのに適したプラスミドとしては，例えば，ｐＰＬ１（ＧｅｎＢａｎｋａ ｓｓｅｓｓｉｏｎｎｏ：ＡＪ４１７４８８），ｐＰＬ２（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ４１７４４９），ｐＬＵＣＨ８０，ｐＬＵＣＨ８８，およびこれらの誘導体が挙げられる（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５０１６−５０２４；Ｃｈｅｓｎｅａｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７７：９３−１００；Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ（１９９０）Ｇｅｎｅ ９４：１２９−１３２；Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：５３７−６４６；Ｈｅ ａｎｄ Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８０−３４８７を参照）。
蛋白質を精製する方法，例えば，免疫沈殿，カラムクロマトグラフィー，電気泳動，等電点集束，遠心分離，および結晶化は記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。蛋白質の化学的分析，化学的修飾，翻訳後修飾，およびグリコシル化は記載されている。例えば，Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ．）（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗｏｔａ，ＮＪ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照。結合相互作用を特性決定するための手法は記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐａｒｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５：７７−８８；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９−２４０；Ｎｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１２７１−１２７５；Ｊｏｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７；Ｆｒｉｇｕｅｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７：３０５−３１９；Ｈｕｂｂｌｅ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：３０５−３０６；Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７３１１−４７３１９）を参照。
例えば，抗原性フラグメント，リーダー配列，蛋白質フォールディング，機能的ドメイン，グリコシル化部位を決定し，配列アラインメントをするためのソフトウエアパッケージが利用可能である（例えば，ベクターＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（Ｔｉｍｅ Ｌｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。コーディング配列（ＣＤＳ）を判定する方法は利用可能である（Ｆｕｒｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：１４７８−１４８７）。
ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを同定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば，ＢＩＭＡＳ；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）は利用可能である（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：２９７−３０６）。これらのアルゴリズムは，同定されたペプチドを含む蛋白質をコードする本発明の核酸を与えることができる。
リステリアの蛋白質および核酸の配列は，以下のウエブサイトに見いだすことができる：（１）ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；（２）ｇｅｎｏｌｉｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ（ｗｉｔｈｃｌｉｃｋｉｎｇｏｎ“ｌｉｓｔｉｌｉｓｔ”）；および（３）ｔｉｇｒ．ｏｒｇ（“ｄａｔａｂａｓｅｓ”をクリックし，次に“ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｏｕｒｃｅ”をクリックする）。
ＡＰＣによるＬｉｓｔｅｒｉａの内在化を評価する方法，およびリステリアにコードされた抗原のＡＰＣによる提示を評価する方法は利用可能である。また，これらの抗原をＴ細胞に提示する方法，およびＴ細胞の抗原依存性プライミングを評価する方法も利用可能である。適当なＡＰＣは，ネズミＤＣ２．４細胞株であり，適当なＴ細胞はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマである（例えば，米国特許仮出願６０／４９０，０８９（２００３年７月２４日出願）；Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２７２３−２７３０；Ｋａｗａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００２Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５７０９−５７１５；Ｇｅｇｉｎａｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８７７−１８８４；Ｓｋｏｂｅｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２２０９−２２１８；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０９１−１０９７；Ｂｕｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２３５４−２３６１；Ｌｉｐｐｏｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５０８９−５０９７を参照）。樹状細胞（ＤＣ）を調製し，ＤＣをエクスビボで改変し，改変したＤＣを，例えば癌，病原性因子または感染性因子の治療用に投与する方法は利用可能である（例えば，Ｒｉｂａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：３５４−３６７；Ｇｉｌｂｏａ ａｎｄ Ｖｉｅｗｅｇ（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：２５１−２６３；Ｄｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：７７７−７８５；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１２７２−１２８１；Ｇｏｌｄｓｚｍｉｄ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５９４０−５９４７；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ａｎｄ Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：４６６−４７０；Ｃｏｌｉｎｏ ａｎｄ Ｓｎａｐｐｅｒ（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．５：３１１−３１９を参照）。
Ｌｉｓｔｅｒｉａのプラークサイズ，ＬＤ５０，および運動性のアッセイは記載されている。プラークの直径は，細菌が成長し，細胞から細胞へ移動し，隣接する細胞中で形成された二次的ベシクルを避ける能力の関数である（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７；Ｔｈｅｒｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：５０５−５１７；Ｔｈｅｒｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９８：１１４−１２２；Ｐｏｒｔｎｏｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１４５９−１４７１を参照）。
免疫細胞を特性決定するためのＥｌｉｓｐｏｔアッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）が利用可能である（例えば，Ｌａｌｖａｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５；Ｗａｌｄｒｏｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７３９−１７５０；Ｈｕｄｇｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８８：１９−３４；Ｇｏｕｌｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１３３９−１３４７；Ｇｏｕｌｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１８１９−１８３１；Ａｎｔｈｏｎｙ ａｎｄ Ｌｅｈｍａｎ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：２６０−２６９；Ｂａｄｏｖｉｎａｃ ａｎｄ Ｈａｒｔｙ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３８：１０７−１１７を参照）。“テトラマー染色”法も利用可能である（例えば，Ｓｅｒｂｉｎａ ａｎｄ Ｐａｍｅｒ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：４３６−４４２；Ｓｋｉｎｎｅｒ ａｎｄ Ｈａａｓｅ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６８：２９−３４；Ｐｉｔｔｅｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：１２３５−１２３７を参照）。
抗原またはエピトープが直接提示により提示されているかまたはクロス提示により提示されているかを判定する方法が利用可能である。これらの方法は，ＴＡＰ−欠損マウスを利用して目的とする抗原を含む細胞（別の起源からのもの）を投与することを含む。別の方法は，特異的エピトープを提示するのに必要なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子，例えば，ＭＨＣクラスＩＨ−２ｂを遺伝的に欠損したマウスを用意し，目的とする抗原を含む（または目的とするエピトープでパルスした）Ｈ−２ｂ−発現抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）（別の起源からのもの）を投与することを含む（例えば，ｖａｎＭｉｅｒｌｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７５３−６７５９；Ｐｏｚｚｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：２０７１−２０８１を参照）。
結合親和性，結合特異性，および親和性成熟を判定する方法は入手可能である。本発明は，例えば抗体および／またはＴ細胞の成熟に適用するため，親和性成熟を刺激および／または診断する方法を提供する（例えば，Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５０２１−５０２７；Ｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：９７８１−９７８６；Ｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｐａｍｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７０１−７０９；Ｐｌｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５９９８−６００５；Ｂｒａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８；Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５１１６−５１２３を参照）。
癌，転移，および血管新生の研究に動物を使用する方法，および動物腫瘍データを用いてヒトの治療に外挿する方法は利用可能である（例えば，Ｈｉｒｓｔ ａｎｄ Ｂａｌｍａｉｎ（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４０：１９７４−１９８０；Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１０：２５５−２６１；Ｈｏｆｆｍａｎ（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １７：３４３−３５９；Ｂｏｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２−９；Ｍｏｕｌｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１４：９１３−９２７；Ｔｕｖｅｓｏｎ ａｎｄ Ｊａｃｋｓ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：１０５−１１０；Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｇｒｕｓｂｙ（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：５５０４−５５１４；Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００１）Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｈａｓａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ７：１−１６；Ｒａｄｏｖａｎｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．１１７：９７−１１４；Ｋｈａｎｎａ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｅｐｔ．９［ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｃｒｎｉｃ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４８：５７３−５８１を参照）。
結腸直腸癌の肝転移は，初代肝臓細胞の注入，門脈注入，または腫瘍細胞の全脾臓注入を用いて生成することができる（例えば，Ｓｕｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７２：２１８−２２４；Ｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｉｎｌｅｙ−Ｊｏｎｅｓ（１９８５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：５３３−５４１；Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７６：７４５−７５０；Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９：１２６−１３８を参照）。
実施例ＩＩ．部位特異的組換えおよび相同組換えを媒介するために用いるベクター
この実験で用いたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は記載されている（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１３８３２−１３８３７を参照）。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ（ＤＰ−Ｌ４０２９ｉｎｌＢとしても知られる）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に２００３年に１０月３日に，ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの規定により寄託され，受託番号ＰＴＡ−５５６２が与えられた。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｕｖｒＡＢ（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢとしても知られる）は，ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に，２００３年１０月３日に，ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの規定により寄託され，受託番号ＰＴＡ−５５６３を与えられた。グルコースを含まない酵母培地は，２５グラム／Ｌの酵母エキス（Ｂａｃｔｏ（登録商標）Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）；９グラム／Ｌのリン酸カリウム１塩基，ｐＨ７．２を含む。
相同組換えは，ｐＫＳＶ７（配列番号３）により行ってもよい（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７４：７０５−７１１；Ｃａｍｉｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１５７；Ｃａｍｉｌｌｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｔｈｅｓｉｓも参照）。
(配列番号28, pKSV7) CTCGCGGATTGTTGATGATTACGAAAATATTAAGAGCACAGACTATTACACAGAAAATCAAGAATTAAAAAAACGTAGAGAGAGTTTGAAAGAAGTAGTGAATACATGGAAAGAGGGGTATCACGAAAAAAGTAAAGAGGTTAATAAATTAAAGCGAGAGAATGATAGTTTGAATGAGCAGTTGAATGTATCAGAGAAATTTCAAGATAGTACAGTGACTTTATATCGTGCTGCGAGGGCGAATTTCCCTGGGTTTGAGAAAGGGTTTAATAGGCTTAAAGAGAAATTCTTTAATGATTCCAAATTCGAGCGTGTGGGACAGTTTATGGATGTTGTACAGGATAATGTCCAGAAGGTCGATAGAAAGCGTGAGAAACAGCGTACAGACGATTTAGAGATGTAGAGGTACTTTTATGCCGAGAAAACTTTTTGCGTGTGACAGTCCTTAAAATATACTTAGAGCGTAAGCGAAAGTAGTAGCGACAGCTATTAACTTTCGGTTGCAAAGCTCTAGGATTTTTAATGGACGCAGCGCATCACACGCAAAAAGGAAATTGGAATAAATGCGAAATTTGAGATGTTAATTAAAGACCTTTTTGAGGTCTTTTTTTCTTAGATTTTTGGGGTTATTTAGGGGAGAAAACATAGGGGGGTACTACGACCTCCCCCCTAGGTGTCCATTGTCCATTGTCCAAACAAATAAATAAATATTGGGTTTTTAATGTTAAAAGGTTGTTTTTTATGTTAAAGTGAAAAAAACAGATGTTGGGAGGTACAGTGATGGTTGTAGATAGAAAAGAAGAGAAAAAAGTTGCTGTTACTTTAAGACTTACACAGAAGAAAATGAGATATTAAATAGAATCCAAGAAAAATATAATATTAGCAAATCAGATGCACCGGTATTCTAATAAAAAATATGYRMAGGAGGAATACSGTGCATTTTAACAAAAAAAGATAGACAGCACTGGCATGCTGCCTATCTATGACTAAATTTTGTTAAATGTATTAGCACCGTTATTATATCATGAGCGAAAATGTAATAAAAGAAACTGAAAACAAGAAAAATTCAAGAGGACGTAATTGGACATTTGTTTTATATCCAGAATCAGCAAAAGCCGAGTGGTTAGAGTATTTAAAAGAGTTACACATTCAATTTGTAGTGTCTCCATTACATGATAGGGATACTGATACAGAAGATAGGATGAAAAAAGAGCATTATCATATTCTAGTGATGTATGAGGGTAATAAATCTTATGAACAGATAAAAATAATTACAGAAGAATTGAATGCGACTATTCCGCAGATTGCAGGAAGTGTGAAAGGTCTTGTGAGATATATGCTTCACATGGACGATCCTAATAAATTTAAATATCAAAAAGAAGATATGATAGTTTATGGCGGTGTAGATGTTGATGAATTATTAAAGAAAACAACAACAGATAGATATAAATTAATTAAAGAAATGATTGAGTTTATTGATGAACAAGGAATCGTAGAATTTAAGAGTTTAATGGATTATGCAATGAAGTTTAAATTTGATGATTGGTTCCCGCTTTTATGTGATAACTCGGCGTATGTTATTCAAGAATATATAAAATCAAATCGGTATAAATCTGACCGATAGATTTTGAATTTAAGAGTGTCACAAGACACTCTTTTTTCGCACCAACGAAAACTGGTTTAAGCCGACTGCGCAAAAGACATAATCGATTCACAAAAAATAGGCACACGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTANCTTACTTATTAAATAATTTATAGCTATTGAAAAGAGATAAGAATTGTTCAAGCTAATATTGTTTAAATCGTCCATTCCTGCATGTTTTANGGAAWTGTTAANTTGATTTTTTGTAATATTTTCTKGTATYCTTTGTTAMCCCATTTCATAACGAAATAATTATACTTTTGTTTATCTTTGTGTGATATTCTTGATTTTTTTCTACTTAATCTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAATATTCTCTTGGAACCATACTTAATATAGAAATATCAACTTCTGCCATTAAAAGTAATGCCAATGAGCGTTTTGTATTTAATAATCTTTTAGCAAACCCGTATTCCACGATTAAATAAATCTCATTAGCTATACTATCAAAAACAATTTTGCGTATTATATCCGTACTTATGTTATAAGGTATATTACCATATATTTTATAGGATTGGTTTTTAGGAAATTTAAACTGCAATATATCCTTGTTTAAAACTTGGAAATTATCGTGATCTTCCTTCAGGTTATGACCATCTGTGCCAGTTCGTAATGTCTGGTCAACTTTCCGACTCTGAGAAACTTCTGGAATCGCTAGAGAATTTCTGGAATGGGATTCAGGAGTGGACAGAACGACACGGATATATAGTGGATGTGTCAAAACGCATACCATTTTGAACGATGACCTCTAATAATTGTTAATCATGTTGGTTACGTATTTATTAACTTCTCCTAGTATTAGTAATTATCATGGCTGTCATGGCGCATTAACGGAATAAAGGGTGTGCTTAAATCGGGCCATTTTGCGTAATAAGAAAAAGGATTAATTATGAGCGAATTGAATTAATAATAAGGTAATAGATTTACATTAGAAAATGAAAGGGGATTTTATGCGTGAGAATGTTACAGTCTATCCCGGCAATAGTTACCCTTATTATYWSGATAAGAANGAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAATCCTTTAAAAAAACACAAAAGACCACATTTTTTAATGTGGTCTTTTATTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACGAAAATTGGATAARGTGGGATATTTTWAAWATAATWTATKTATGTTACAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAGCCTCCTAAATTCACTTTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATGGACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTATTACNGCAGGAAANTTCATTAATAANGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCNGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACRGTCGGTTTTCTAACGATMCATTAATAGGTMCGAAAAAGCMACTTTTTTKSCGCTTAAAACCAGTCATACCAATAACTTAAGGGTAACTAGCCTCGCCGGAAAGAGCGAAAATGCCTCACATTTGTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAGTTATGCAGTTTGTAGAATGCAAAAAGTGAAATCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTRSSYACKSSKMYCCTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAAMAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGRKKASTCWCMCMAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCNGGSGTCAATACGGGATAATACCGCSCCACATAGCARAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACMATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTYCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCNGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGGACTAAAAGGCATGCAATTTCATAATCAAAGAGAGCGAAAAAGTAGAACGAATGATGATATTGACCATGAGCGAACACGTGAAAATTATGATTTGAAAAATGATAAAAATATTGATTACAACGAACGTGTCAAAGAAATTATTGAATCACAAAAAACAGGTACAAGAAAAACGAGGAAAGATGCTGTTCTTGTAAATGAGTTGCTAGTAACATCTGACCGAGATTTTTTTGAGCAACTGGATCAGTACAAGAAAGATACTGTATTTCATAAACAGGAACTGCAAGAAGTTAAGGATGAGTTACAGAAGGCAAATAAGCAGTTACAGAGTGGAATAGAGCATATGAGGTCTACGAAACCCTTTGATTATGAAAATGAGCGTACAGGTTTGTTCTCTGGACGTGAAGAGACTGGTAGAAAGATATTAACTGCTGATGAATTTGAACGCCTGCAAGAAACAATCTCTTCGAACGGATTGTTGATGATTACGAAATATAAGAGCCCGACTATTCCCAGAAATCAGAATTAAAAACGTAGAGAGAG (配列番号28, pKSV7).
部位特異的インテグレーションは，ｐＰＬ１，ｐＰＬ２，ｐＩＮＴ，またはこれらの変種により媒介することができる（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６；Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０３／１３４９２（Ｉｎｔ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ０３／０９２６００），Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｃａｌｅｎｄａｒ，ａｎｄ Ｌａｕｅｒを参照）。
ｐＩＮＴプラスミドは，リステリア染色体からのプラスミドのほとんどを特異的に除去して，ａｔｔＰおよびＭＣＳ（マルチクローニング部位），およびマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の内容物（例えば，抗原カセット）を残すことができるｌｏｘＰ部位を有する。ｐＩＮＴはｐＰＬ２とは異なるように次のように作用することができる。ｐＰＬ２コンジュゲートの１０：１希釈物の１００マイクロリットルまでのアリコートを二重選択プレートに播種することができる。ｐＰＬ２コンジュゲートの１０：１希釈物の１００マイクロリットルまでのアリコートを播種すると一般に５０−１００個のコロニーが得られる。ｐＰＬ２コンジュゲートの１０：１希釈物を１００マイクロリットルを超えて播種すると，Ｅ．ｃｏｌｉドナーのバックグラウンド成長のため，コロニーがほとんどまたは全く生じない。一方，エリスロマイシン（Ｅｒｍ）はＥ．ｃｏｌｉに対してクロラムフェニコールより選択的であるため，ｐＩＮＴは希釈せずに播種することができ，さらにコンジュゲートミックスを濃縮してもよい。ｐＩＮＴを使用することにより，インテグレーションの成功のダイナミックレンジを約２対数広げることができる。
ｐＩＮＴベクター
AGATCTCCAAAAATAAACAGGTGGTGGTATTAATGAAGATAAAAAAATTAGCA
AACGGTAAATATTGTGTTCGCCTACGTATAAAAGTCGATGGTGAATGGAAAGA
AAAGCGTTTGACAGATACAAGTGAAACAAACTTAATGTATAAAGCATCTAAAT
TATTAAAACAAGTTCAGCATGATAGTAGTTCTCTGAAAGAATGGAACTTCAAA
GAATTTTATACGCTATTCATGAAAACATTTAAAGATGGGAAAAGTAGTCAATC
TACTATTAATTTATACGATCTTGCTTATAATCAATTCGTTGATTATTTCGATG
AAAAAATTAAATTTAATTCGATTGATGCGGTTCAATATCAACAATTTATTAAT
CATTTATCTGTAGACTATGCAATATCCACTGTAGACACCAGACACCGCAAAAT
TAGAGCGATTTTTAACAAGGCTGTTCATTTAGGTTACATGAAGAAAAACCCCA
CTATAGGGGCTCATATAAGCGGACAGGACGTAGCGAAAAATAAAGCACAATTT
ATGGAAACAGACAAAGTTCATTTACTATTAGAAGAACTTGCAAAATTTCATTC
TATATCACGAGCAGTTATCTTTCTAGCTGTCCAGACAGGCATGAGGTTCGAAG
AAATTATTGCACTAACAAAGAAGGATATTAATTTCACTAAACGTTCAATAACT
GTGAATAAAGCTTGGGATTACAAGTACACTAATACATTCATTGATACCAAAAC
AAAAAAATCACGAGTGATCTATATTGATAACTCTACCGCTCAATATTTACATT
CGTATTTAAATTGGCATACTGAATATATGAAGGAACATGCTATTAAGAATCCA
TTGATGTTATTATTCATCACTTACCACAATAAGCCAGTAGACAACGCGTCTTG
TAATAAAGCTTTGAAGAAGATATGTAGTACAATCAATTCTGAACCAGTGACAT
TACACAAGCTACGACATACGCATACAGGCTTATGTGTAGAAGCGGGTATGGAT
ATTATTTATGTAGCTGATAGGCTTGGTCATGATGACATTAATACAACATTAAA
ATACTATAGTCATCTAAGCTCTAATTTAAGACAACATAATCAGTCCAAAGTAG
ATGCTTTTTTCACACTAAAAACAGATGAAAATACCACAAATTTTACCACAAAT
GCCACAAAAACAACGGAATAACCTAGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATAC
GAAGTTATATGCATGGGTATTATACGATATAAAAAAAACTCCAAAACATTCAT
CCGCCCTTTAATATCAAGGCTTTTCAACGTTTTAGAGATTTCTTTACATTACT
ATTTAACGTCCTGAGAGGGATTAACACACACTGATATAAAGCCATTTAGGATA
TATATACCACAAATAATACCACAAACATTTTATGTAATAATAAATATTATTTA
TTATTACATTGAAATAAATATTCGTTATAAATAGTTTTTATATCAAGATGTTT
TTTCTCAAGGTTTTTATAAAATGACTTTAATTCTTTTGTTTCAAGTAGTCCAG
AGAAGATTTTTTCAACAGCGTTCTTCTTTCCCTCCACGCATGCGACGTCAATA
CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTA
TCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGA
GCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAA
TTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGATCGCCTCTCGC
CTGTCCCCTCAGTTCAGTAATTTCCTGCATTTGCCTGTTTCCAGTCGGTAGAT
ATTCCACAAAACAGCAGGGAAGCAGCGCTTTTCCGCTGCATAACCCTGCTTCG
GGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACA
GGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCA
GCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCA
CTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGC
TGGCCGGCTACCGCCGGCGTAACAGATGAGGGCAAGCGGCGGAGAATTACAAC
TTATATCGTATGGGGCTGACTTCAGGTGCTACATTTGAAGAGATAAATTGCAC
TGAAATCTAGAAATATTTTATCTGATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTT
TTGGTCTGCGCGTAATCTCTTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGC
GGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCT
TGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCGC
ATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG
TGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGG
CGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGA
ACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATA
ACAGCGGAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGG
GAGCCGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA
CCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGG
CATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGT
CGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTA
TCACATATTCTGCTGACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAG
CACTTCACTGACACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAAGCCAGTATACACTCCG
CTAGCGCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTGCCGTTACGCACCACCCCGTCAGTAG
CTGAACAGGAGGGACAGCTGATAGAAACAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAAA
CACCATCATACACTAAATCAGTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCG
CCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGT
GTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGT
TGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTAC
CGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG
GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAA
AGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCG
TTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAG
TTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGA
ATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACC
CTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGT
GAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGC
GTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGT
TTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTG
GCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATAC
GCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTT
GTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT
GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAAC
GCCTGGTTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATT
CGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCGA
CGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCA
CGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACAC
ATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAG
ACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTA
ACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACAATCGCATCCGATTG
CAGTATAAATTTAACGATCACTCATCATGTTCATATTTATCAGAGCTCGTGCT
ATAATTATACTAATTTTATAAGGAGGAAAAAATATGGGCATTTTTAGTATTTT
TGTAATCAGCACAGTTCATTATCAACCAAACAAAAAATAAGTGGTTATAATGA
ATCGTTAATAAGCAAAATTCATATAACCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACG
AGAAAAATATAAAACACAGTCAAAACTTTATTACTTCAAAACATAATATAGAT
AAAATAATGACAAATATAAGATTAAATGAACATGATAATATCTTTGAAATCGG
CTCAGGAAAAGGCCATTTTACCCTTGAATTAGTAAAGAGGTGTAATTTCGTAA
CTGCCATTGAAATAGACCATAAATTATGCAAAACTACAGAAAATAAACTTGTT
GATCACGATAATTTCCAAGTTTTAAACAAGGATATATTGCAGTTTAAATTTCC
TAAAAACCAATCCTATAAAATATATGGTAATATACCTTATAACATAAGTACGG
ATATAATACGCAAAATTGTTTTTGATAGTATAGCTAATGAGATTTATTTAATC
GTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTGGCATT
ACTTTTAATGGCAGAAGTTGATATTTCTATATTAAGTATGGTTCCAAGAGAAT
ATTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAGCTCACTTATCAGATTAAGTAGAAAA
AAATCAAGAATATCACACAAAGATAAACAAAAGTATAATTATTTCGTTATGAA
ATGGGTTAACAAAGAATACAAGAAAATATTTACAAAAAATCAATTTAACAATT
CCTTAAAACATGCAGGAATTGACGATTTAAACAATATTAGCTTTGAACAATTC
TTATCTCTTTTCAATAGCTATAAATTATTTAATAAGTAAGTTAAGGGATGCAT
AAACTGCATCCCTTAACTTGTTTTTCGTGTGCCCGATCGGTGCGGGCCTCTTC
GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG
TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAG
CTAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTCTCATTATATAACATCCTCCATACCTT
CTATTATAGAATACCATAAACTCATCTGGCAATTCATTTCGAGTCACGAAGAA
CGGAAAAACTGCCGGTTTTTATATTACAAATGTATTAAGTTTTTCTATTAACA
AAAAACAATAGGTTTCCCATAGCGAAAGTTGTTGATTAACGTTCACATCCCAC
TTACACTATAAAGGTTTACCCAGCAATACATCTCAAGCCCTAAGAATACACGT
TCGCTTTTCAACTGTTACAGAATTATTACAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTA
GCCTTTGGAGCTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAAC
TTAGTATTAATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGA
TTTTCTGAAAAAA
(配列番号29)
実施例ＩＩＩ．ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナー，例えば，１またはそれ以上のモチーフでトランケートしているか欠失しているＡｃｔＡ誘導体
ある態様においては，本発明は，少なくとも１つの異種抗原をコードする第２の核酸と動作可能なようにかつインフレームで連結されている，ＡｃｔＡ系融合蛋白質パートナーをコードする第１の核酸を含む試薬および方法を提供する。開示される核酸のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸が提供される。
互いに動作可能なように，かつ互いにインフレームで連結されている第１の核酸および第２の核酸が包含される。この文脈において，“互いに動作可能なように連結されている”とは，第１の核酸および第２の核酸を含む任意のコンストラクトが融合蛋白質をコードすることを意味する。別の態様においては，第２の核酸は第１の核酸中に埋め込まれていてもよい。
ＡｃｔＡ系融合蛋白質パートナーは，以下の１またはそれ以上を含むことができる。“からなる”態様もまた利用可能であり，ここでは，ＡｃｔＡ系融合蛋白質パートナーは，以下の態様の１またはそれ以上からなることができる。
（１）ＡｃｔＡ−Ｎ１００（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−１００）。
（２）少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸が，全長ＡｃｔＡのＣ末端と連結（かつインフレームである）されているか，ＡｃｔＡの内部位置に存在するか，または全長ＡｃｔＡのＣ末端に連結されかつＡｃｔＡの内部位置に存在する全長ＡｃｔＡ。
（３）通常は全長ＡｃｔＡの活性と比較してＡｒｐ２／３複合体の核形成の活性の９０％未満を指示し；慣用的には全長ＡｃｔＡの核形成活性の８０％未満を指示し；特徴的には全長ＡｃｔＡの核形成活性の７０％未満を指示し；典型的には全長ＡｃｔＡの核形成活性の６０％未満を指示し；より典型的には全長ＡｃｔＡの核形成活性の５０％未満を指示し；最も典型的には全長ＡｃｔＡの核形成活性の４０％未満を指示し；頻繁には全長ＡｃｔＡの核形成活性の３０％未満を指示し；より頻繁には全長ＡｃｔＡの核形成活性の２０％未満を指示し；最も頻繁には全長ＡｃｔＡの核形成活性の１０％未満を指示し；普通は全長ＡｃｔＡの核形成活性の５％未満を指示し；より普通には全長ＡｃｔＡの核形成活性の２％未満を指示し；最も普通にはＡｒｐ２／３複合体を核形成させる能力が検出できないトランケート型ＡｃｔＡ。漸次トランケートされた形のＡｃｔＡの核形成活性の低下または排除はＳｋｏｂｌｅにより示されている（Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７）。アミノ酸−１０１でトランケートされたＡｃｔＡ，およびアミノ酸−１３５でトランケートされたＡｃｔＡは，核形成活性をほとんどまたは全く有しないが，アミノ酸１６５，２０１，および２６３でトランケートされたＡｃｔＡは，Ａｒｐ２／３複合体の核形成において全長ＡｃｔＡと同等の効力を有することが示されている。
（４）ＡｃｔＡが，およそアミノ酸−４０；およそアミノ酸−４５でトランケートされた；およそアミノ酸−５０でトランケートされた；およそアミノ酸−５５でトランケートされた；およそアミノ酸−６０でトランケートされた；およそアミノ酸−６５でトランケートされた；およそアミノ酸−７０でトランケートされた；およそアミノ酸−７５でトランケートされた；およそアミノ酸−８０でトランケートされた；およそアミノ酸−８５でトランケートされた；およそアミノ酸−９０でトランケートされた；およそアミノ酸−９５でトランケートされた；およそアミノ酸−１００でトランケートされた；およそアミノ酸−１０５でトランケートされた；およそアミノ酸−１１０でトランケートされた；およそアミノ酸−１１５でトランケートされた；およそアミノ酸−１２０でトランケートされた；およそアミノ酸−１２５でトランケートされた；およそアミノ酸−１３０でトランケートされた；およそアミノ酸−１３５でトランケートされた；およそアミノ酸−１４０でトランケートされた；およそアミノ酸−１４５でトランケートされた；およそアミノ酸−１５０でトランケートされた；およそアミノ酸−１５０；およそアミノ酸−１５５でトランケートされた；およびおよそアミノ酸−１６０でトランケートされたものである，トランケート型ＡｃｔＡ。この文脈において“およそ”との用語は，プラスマイナス１アミノ酸，プラスマイナス２アミノ酸，プラスマイナス３アミノ酸，プラスマイナス４アミノ酸，またはプラスマイナス５アミノ酸を意味する。
（５）ＡｃｔＡ分泌配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−２９）。
（６）ＡｃｔＡ分泌配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−２９）を含まない。
（７）ＡｃｔＡ分泌配列および成熟Ｎ末端ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−２６３）。
（８）分泌配列を含まない成熟Ｎ末端ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０−２６３）。
（９）アクチン重棒を直接刺激する能力が低下しているＡｃｔＡ配列。低下した能力は，例えば，普通は多くとも最大値の９０％，多くとも最大値の８０％，最も普通には多くとも最大値の７０％，通常は多くとも最大値の６０％，より通常には多くとも最大値の５０％，最も通常には多くとも最大値の４０％，頻繁には多くとも最大値の３０％，より頻繁には多くとも最大値の２０％，最も頻繁には多くとも最大値の１０％，および典型的には多くとも最大値の５％でありうる。
（１０）Ｅｎａ／ＶＡＳＰファミリーの蛋白質（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｎａｂｌｅｄ（Ｍｅｎａ）；Ｅｎａ／ＶＡＳＰ様蛋白質（Ｅｖｌ）；血管拡張剤により刺激されるリン蛋白質（ＶＡＳＰ）のメンバーに結合する能力が低下しているＡｃｔＡ配列（例えば，Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３を参照）。低下した能力は，例えば，普通は多くとも最大値の９０％，より普通には多くとも最大値の８０％，最も普通には多くとも最大値の７０％，通常は多くとも最大値の６０％，より通常には多くとも最大値の５０％，最も通常には多くとも最大値の４０％，頻繁には多くとも最大値の３０％，より頻繁には多くとも最大値の２０％，最も頻繁には多くとも最大値の１０％，および典型的には多くとも最大値の５％でありうる。
（１１）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸９３−９８（ＬＫＥＫＡＥ（配列番号１２４））（カルデスモンのアクチン結合ドメインと相同）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ１１３：３２７７−３２８７；Ｌａｓａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１５３１−１５４０を参照）。
（１２）ＡｃｔＡのダイマー形成に重要なＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３のアミノ酸１２６−１５５（ＰＡＩＱ等）または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列においてでトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｍｏｕｒｒａｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１００３４−１００３９を参照）。
（１３）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２１−１７０（最小ＡＲＰ２／３活性化ドメイン）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｚａｌｅｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３４６８−３４７５を参照）。
（１４）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１４６−１５０ＫＫＲＲＫ（配列番号３０））（Ａｒｐ２／３複合体のリクルーティングに必須の領域）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（Ｌａｓａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１５３１−１５４０；Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３：３２７７−３２８７）。
（１５）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸４１−４６ＤＥＷＥＥＥ（配列番号３１）（Ａｒｐ２／３複合体結合に関与する領域）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｂｏｕｊｅｍａａ−Ｐａｔｅｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ４０：１１３９０−１１４０４を参照）。
（１６）ビンクリンホモロジー領域であるアミノ酸４８１−４９２（ＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧ（配列番号３２））でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ。ビンクリンはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの細胞から細胞への拡散を媒介する（例えば，Ｋｏｃｋｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：５２１−５３１を参照）。
（１７）コフィリンホモロジードメイン（ＩＫＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤ（配列番号３３））（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１４５−１５６）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７を参照）。
（１８）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸５０−１２５（フィラメント延長領域の連続性）でトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｌａｓａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１５３１−１５４０を参照）。
（１６）１番目のＦＰ４モチーフ（アミノ酸２６５−２６９または２６４−２６９等），２番目のＦＰ４モチーフ（アミノ酸３００−３０４または２９９−３０４等），３番目のＦＰ４モチーフ（アミノ酸３３５−３３９または３３４−３３９等），４番目のＦＰ４モチーフ（アミノ酸３８０−３８４または３７９−３８４等），４つすべてのＦＰ４モチーフまたは上述の任意の組み合わせでトランケートされているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ，ここで，アミノ酸はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列で表される（例えば，Ｍａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３を参照）。ＦＰ４モチーフは，ＡｃｔＡおよびＡｒｐ２／３複合体のＮ末端領域でモチーフ間の相互作用により核形成されたフィラメントの延長を促進する焦点接着蛋白質およびプロフィリンをリクルートすることによりアクチン重合および細菌の運動性を増強する（例えば，ＶＡＳＰおよびＭｅｎａ）（例えば，Ｗｅｌｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１０５−１０８；Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７）；Ｐｉｓｔｏｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３：３２７７−３２８７を参照）。
（１７）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１３６−１６５（コフィリンホモロジー領域，Ａｒｐ２／３複合体を刺激する領域）の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７を参照）。
（１８）“酸性ストレッチ”，すなわちＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３１−５８（ＴＤＳＥＤ（配列番号３４），ｅｔｃ．）の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ。酸性ストレッチは，アクチン重合，宿主細胞細胞質内でのＬｉｓｔｅｒｉａの運動，細胞から細胞への拡散，およびプラークサイズに寄与する（例えば，Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５０：５２７−５３７；Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７を参照）。
（１９）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸６０−１０１（ＡＢ領域，アクチン結合ドメイン）の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７を参照）。
（２０）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列の変異体３４（運動なし；プラークなし）のアミノ酸１１７−１２１（ＫＫＲＲＫ（配列番号３０））の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異を含むＡｃｔＡ（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７）。
（２１）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３，または類似のまたは相同のＡｃｔＡ配列の変異体３４（運動なし；プラークなし）のアミノ酸２４４−２４９（ＤＫＳＡＧＬＩＤ（配列番号１２３））の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異を含むＡｃｔＡ。変異は，例えば，Ｄ，Ｋ，およびＤのアラニンによる置換でありうる（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７）。
（２２）変異体３９，４７−５２，５４および／または４８（運動減少）の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異を含むＡｃｔＡ（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７）。
（２３）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５９７２３または類似または相同のＡｃｔＡ配列のアミノ酸２６４−３９０（中心反復領域）の点でトランケートしているか，欠失しているか，変異しているＡｃｔＡ（例えば，Ｌａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７；Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７；Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５５：８９−１００を参照）。
本発明は，上述の態様のいずれか１つまたはその任意の組み合わせを含むことができるＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーを提供する。“からなる”態様もまた利用可能であり，この場合，ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーは上述の態様の１またはそれ以上からなることができる。
本発明の開示が与えられれば，当業者は，保存的改変，または１またはそれ以上のアミノ酸が欠失しているか１またはそれ以上のアミノ酸がアラニンで置き換えられている改変等を含む態様を想定し製造することができる。
本発明の文脈においては，“融合蛋白質パートナー”は，限定されないが，異種抗原との融合蛋白質として生ずるポリペプチドをコードする核酸，またはポリペプチドそれ自体を包含し，ここで，融合蛋白質パートナーは，例えば，転写，翻訳，安定性，抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるプロセシング，ＡＰＣによる提示，免疫提示，細胞毒性Ｔ細胞応答，ＣＤ８＋Ｔ細胞応答，ＣＤ４＋Ｔ細胞応答，腫瘍サイズ，数，または転移の減少，腫瘍または感染性因子に対する生存の増加等を増強する。
本発明は，ＡｃｔＡ−Ｎ１００の核酸およびポリペプチド，およびその融合蛋白質，例え少なくとも１つの抗原を含む融合蛋白質を提供する。本発明について何らの限定を示唆するものではないが，少なくとも１つの抗原は，メソセリン，Ｈ−ｒａｓ，メソセリン誘導体，Ｈ−ｒａｓ誘導体，またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。少なくとも１つの抗原をコードする核酸は，ＡｃｔＡ系融合蛋白質パートナーのＮ末端と動作可能なようにかつインフレームで連結されていてもよい。あるいは，少なくとも１つの抗原をコードする核酸は，ＡｃｔＡ融合蛋白質パートナーのＣ末端と動作可能なようにかつインフレームで連結されていてもよい。あるいは，少なくとも１つの抗原をコードする核酸は，ＡｃｔＡ系融合蛋白質パートナーをコードする核酸と動作可能なように連結され，かつその中に存在していてもよい。
実施例ＩＶ．ＡｃｔＡ融合蛋白質をコードする核酸を組み立てるために用いた構築ブロック
以下に，ＡｃｔＡ−Ｎ１００を融合蛋白質パートナーとして含むコンストラクトを作成するために用いた核酸およびポリペプチドを説明する。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現用の配列コドン最適化およびコドン非最適化配列を示す。
実施例Ｖ．リステリオリシン（ＬＬＯ；ｈｌｙ遺伝子）融合蛋白質を組み立てるために用いた構築ブロック
実施例ＶＩ．ｐ６０融合蛋白質およびＳｅｃＡ２依存性分泌を媒介する他のポリペプチドの融合蛋白質を組み立てるために用いた構築ブロック
本発明は，ＳｅｃＡ２依存性経路により分泌される蛋白質をコードする第１の核酸および異種抗原をコードする第２の核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。オートリシン，例えばｐ６０およびＮａｍＡ（Ｎ−アセチル−ムラミダーゼ）は，ＬｉｓｔｅｒｉａからＳｅｃＡ２依存性経路により分泌される蛋白質である（Ｌｅｎｚ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：１２４３２−１２４３７）。１つの態様においては，融合蛋白質パートナー（例えば，ｐ６０またはＮａｍＡ）はその酵素的または構造的活性を保持する。別の態様においては，融合蛋白質パートナーはその酵素的または構造的活性を欠失している。さらに別の態様においては，異種蛋白質をコードする核酸は，シグナル配列（ＳＳ）と細胞壁結合ドメイン（ＬｙｓＳＭ）および触媒ドメインＬｙｚ−２（ＮａｍＡ）およびｐ６０−ｄｏｍ（ｐ６０）をコードする核酸との間に配置または挿入される。
以下は，非限定的例として，ｐ６０およびヒトメソセリン（ｈＭｅｓｏ）を含む融合蛋白質をコードする核酸を開示する。メソセリンは，以下のようにして，Ｌｉｓｔｅｒｉａのｐ６０蛋白質中に挿入した。メソセリンをコードする核酸をｐ６０をコードする核酸中に挿入して，発現されたときにメソセリンがｐ６０中のアミノ酸７０に挿入されるようにする。得られる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは，Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌による発現において用いるために調製した。
別の態様においては，蛋白質キメラは，ｐ６０アミノ酸１−７０ならびに全メソセリンコーディング配列中にＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現用の最適コドンを含む。さらに別の態様においては，ｐ６０−ヒトメソセリン蛋白質キメラをＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｈｌｙプロモーターに機能的に連結させ，ｐＰＬ２ベクター中に組み込み，次にこれを用いて，ヒトメソセリンを発現し分泌する組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株を作成した。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，１０４０３Ｓ株のｐ６０の最初の７０アミノ酸の配列が開示される。
M N M K K A T I A A T A G I A V T A F A A P T I A S A S T V V V E A G D T L W G I A Q S K G T T V D A I K K A N N L T T D K I V P G Q K L Q (配列番号61)
ｈｌｙプロモーター−７０Ｎ末端ｐ６０アミノ酸に対応する合成ＤＮＡ配列は下記に示される。ｐ６０アミノ酸残基６９（Ｌ）および７０（Ｑ）をコードするコドンを，ユニークなＰｓｔＩ酵素認識配列を含むよう改変して，異種配列の機能的挿入を容易にする（例えば，メソセリンをコードする核酸）。さらに，合成したサブフラグメントの５’末端は，ユニークなＫｐｎＩ酵素認識配列を含む。
ベクター合成の注釈のこの点において，核酸配列は以下に対応する。
ｈｌｙプロモーター−ｐ６０（ｐ６０の７０Ｎ末端アミノ酸）
ユニークＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ）が３’末端に見られる。
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAG (配列番号62)
ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化した４４７ｂｐのサブフラグメントを，ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ酵素で消化し，ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で消化したｐＰＬ２ベクターの対応するＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ部位にライゲーションする。このプラスミドは，ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐとして知られる。次に，天然のｐ６０遺伝子の残部をｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐプラスミドの，ユニークＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐ６０遺伝子の残部は，熱安定性ポリメラーゼを含むプルーフリーディングおよび以下のプライマー対を用いてＰＣＲによりクローニングした。
フォワードプライマー：
5'- CGC CTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTG (配列番号63)
リバースプライマー:
5'-CGCGGATCCTTAATTATACGCGACCGAAG (配列番号64)
１２４１ｂｐのアンプリコンをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し，精製した１２３５ｂｐを，ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し，ＣＩＡＰで処理したｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐプラスミドにライゲーションした。得られたプラスミドは，アミノ酸１−７７に対応する最適コドンおよびアミノ酸７８−４７８に対応する天然のコドンを有する全長ｐ６０遺伝子を含む。全長ｐ６０遺伝子をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｈｌｙプロモーターに機能的に連結させる。
ベクター合成の注釈のこの時点で，核酸配列は以下に対応する：
ｈｌｙプロモーター−ｐ６０−［ｐ６０の７０Ｎ末端アミノ酸１−７７（コドン最適化）］−［ＰｓｔＩ］−［ｐ６０のＣ末端アミノ酸７８−４７８（非コドン最適化）］
この時点で，コンストラクトには異種抗原をコードする核酸はまだ導入されていない。この後，異種抗原（メソセリン）をコードする核酸をユニークなＰｓｔＩ部位に導入する。このプラスミドは，Ｎ末端領域はコドン最適化されており，Ｃ末端領域はコドン最適化されていない全長ｐ６０を含み，ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）として知られる。ｐ６０コーディング配列に機能的に連結されたｈｌｙＰを含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブラグメントの配列は下記に示される（配列番号６５）。ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）プラスミドの予測される配列はシークエンシングにより確認した。
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC (配列番号65)
構築の次の工程は，異種蛋白質をコードする配列をプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）のユニークＰｓｔＩ部位に機能的に挿入することである。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける最適な発現用にコドン最適化されたヒトメソセリンをコードする核酸をプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）のユニークＰｓｔＩ部位に挿入した。詳細には，全長メソセリン，またはシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメインを欠失したメソセリン（メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩ）を，プルーフリーディング活性を有する熱安定性ポリメラーゼおよび下記に示すプライマーを用いて，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現用の最適コドンを含む全長ヒトメソセリンを含むプラスミドからクローニングした。本発明は，本明細書のプロトコルにおいて使用するための，メソセリン以外のまたはメソセリンに加えて抗原をコードする他の核酸を提供する。さらに，本発明は，抗原をコードする核酸のコドン最適化，融合蛋白質パートナーをコードする核酸のコドン最適化，および／または融合蛋白質パートナーをコードする核酸のコドン最適化を提供する。
当業者は，“抗原をポリペプチド中に挿入した”と記載する表現，またはその趣旨の表現は，“抗原をコードする第１の核酸をポリペプチドをコードする第２の核酸中に挿入した”等を包含しうることを理解するであろう。
全長ヒトメソセリンを増幅するために用いたＰＣＲプライマー：
フォワードプライマー (huMeso 3F):
5'-AAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCC (配列番号66)
リバースプライマー (hMeso 1935R):
5'-AAACTGCAGAGCTAATGTACTGGCTAATAATAATGCTAAC (配列番号67)
ヒト メソセリン (ΔSSΔGPI アンカー)を増幅するために用いたPCR プライマー
フォワードプライマー (huMeso 133F):
5'- CGCCTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGG (配列番号68)
リバースプライマー (huMeso 1770R):
5'-CGCCTGCAGGCCTTGTAAACCTAAACCTAATGTATC (配列番号69)
メソセリンの以下の態様に関して，当業者は，開示されるメソセリンの核酸およびポリペプチドを種々のポリペプチドコンストラクト，例えば，融合蛋白質，融合蛋白質をコードする核酸等，多シストロン性コンストラクト，プラスミド，ベクター，融合蛋白質，細菌性ワクチン等に挿入または使用しうることを理解するであろう。
１９３２ｂｐｓ（全長メソセリン）および１６３７ｂｐｓ（メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩ）のＰＣＲアンプリコンを精製し，ＰｓｔＩで消化し，精製し，ＰｓｔＩで消化しＣＩＡＰで処理したプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）のユニークＰｓｔＩ部位にライゲーションした。制限エンドヌクレアーゼマッピングにより，ｐ６０とメソセリンドメインとのアミノ末端からカルボキシ末端への向きが一致することを確認した。これらのプラスミドは，ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンおよびｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩとして知られ，これらを選択されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入した。
ｐ６０−ヒトメソセリン蛋白質キメラをコードする遺伝子に機能的に連結されたｈｌｙプロモーターを含むプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメントの配列は下記の配列を有する。
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCCATTACTAGGTAGTTGCGGTACACCAGCACTAGGTTCTTTATTATTTTTGTTATTTTCTCTAGGTTGGGTTCAACCAAGTCGTACATTAGCAGGTGAAACAGGTCAAGAAGCAGCACCACTTGACGGTGTATTAACGAATCCACCAAATATATCAAGTTTAAGTCCACGTCAATTATTAGGTTTTCCATGTGCAGAAGTTTCAGGTTTAAGTACAGAACGTGTCCGTGAGTTAGCAGTTGCATTAGCACAAAAAAACGTTAAATTATCTACAGAACAGTTACGTTGTTTAGCCCATAGATTAAGCGAACCACCAGAAGACTTAGATGCACTTCCTTTAGACCTTCTTTTATTCTTAAATCCAGATGCATTTTCAGGACCACAAGCATGTACACGTTTTTTTAGTCGAATTACAAAAGCCAATGTTGATTTATTACCTCGTGGGGCTCCTGAAAGACAACGTTTATTACCTGCTGCATTAGCATGCTGGGGTGTTCGCGGTAGCTTATTAAGTGAAGCCGATGTTCGTGCTTTAGGGGGTTTAGCATGTGATTTACCTGGTCGTTTCGTTGCAGAATCAGCAGAAGTGTTATTACCGAGATTAGTTTCATGCCCAGGACCTTTAGATCAAGATCAACAAGAGGCAGCTAGAGCAGCTCTTCAAGGAGGAGGCCCACCATATGGCCCACCAAGTACATGGAGTGTTTCTACAATGGATGCGTTAAGAGGTTTATTACCGGTTTTAGGACAACCAATTATTCGTAGTATTCCACAAGGCATTGTAGCAGCATGGCGTCAACGTAGTTCTCGTGATCCGTCTTGGCGACAACCAGAACGTACAATTCTACGTCCAAGATTTCGTAGAGAAGTAGAAAAAACGGCGTGTCCTAGTGGCAAAAAAGCACGTGAAATTGATGAAAGTTTAATTTTTTATAAAAAATGGGAATTAGAAGCATGTGTCGATGCAGCATTACTAGCTACACAAATGGATCGTGTTAATGCTATTCCATTCACATATGAACAATTAGATGTTTTAAAGCATAAATTAGACGAATTATATCCACAAGGTTATCCAGAATCAGTTATTCAACATTTAGGTTACTTATTTTTAAAAATGAGTCCAGAAGACATACGCAAATGGAATGTTACAAGTTTAGAAACATTAAAAGCGCTTTTAGAAGTTAACAAAGGTCATGAAATGAGTCCACAAGTTGCTACGTTAATTGATAGATTCGTTAAAGGCCGTGGTCAATTAGATAAAGATACTTTAGATACATTAACAGCATTTTATCCTGGCTACTTATGCAGTTTATCACCAGAAGAATTAAGTTCCGTTCCACCGAGTAGTATCTGGGCAGTTCGTCCGCAAGATTTAGATACATGCGACCCACGTCAATTAGATGTTTTATATCCAAAAGCAAGATTAGCTTTCCAAAATATGAACGGTAGTGAATATTTCGTAAAAATTCAATCCTTTTTAGGTGGTGCACCAACTGAAGATCTAAAAGCATTAAGCCAACAAAATGTAAGTATGGATTTAGCTACGTTTATGAAATTACGTACAGATGCAGTTCTACCATTAACAGTTGCAGAAGTTCAAAAATTATTAGGTCCACACGTAGAAGGATTAAAAGCAGAAGAACGTCACCGTCCAGTTCGCGATTGGATTTTACGTCAACGTCAAGATGATTTAGATACATTAGGTTTAGGTTTACAAGGCGGTATTCCGAATGGATATTTAGTGTTAGATTTATCTGTTCAAGAAGCATTAAGTGGTACACCGTGTTTATTAGGTCCAGGTCCAGTTTTAACAGTGTTAGCATTATTATTAGCCAGTACATTAGCTCTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC (配列番号136)
ｐ６０−ヒトメソセリンΔＳＳ／ΔＧＰＩ蛋白質キメラをコードする遺伝子に機能的に連結されたｈｌｙプロモーターを含むプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＳ／ΔＧＰＩのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメントの配列は下記の配列を有する。
GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCTACGATTGCAGCTACAGCCGGCATTGCCGTAACAGCTTTTGCAGCACCAACTATTGCCTCAGCCTCTACAGTTGTTGTCGAAGCAGGAGACACATTATGGGGAATCGCACAATCAAAAGGTACAACGGTTGATGCTATTAAAAAAGCGAATAATTTAACAACAGATAAAATCGTGCCAGGTCAAAAACTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGGTCAAGAAGCAGCACCACTTGACGGTGTATTAACGAATCCACCAAATATATCAAGTTTAAGTCCACGTCAATTATTAGGTTTTCCATGTGCAGAAGTTTCAGGTTTAAGTACAGAACGTGTCCGTGAGTTAGCAGTTGCATTAGCACAAAAAAACGTTAAATTATCTACAGAACAGTTACGTTGTTTAGCCCATAGATTAAGCGAACCACCAGAAGACTTAGATGCACTTCCTTTAGACCTTCTTTTATTCTTAAATCCAGATGCATTTTCAGGACCACAAGCATGTACACGTTTTTTTAGTCGAATTACAAAAGCCAATGTTGATTTATTACCTCGTGGGGCTCCTGAAAGACAACGTTTATTACCTGCTGCATTAGCATGCTGGGGTGTTCGCGGTAGCTTATTAAGTGAAGCCGATGTTCGTGCTTTAGGGGGTTTAGCATGTGATTTACCTGGTCGTTTCGTTGCAGAATCAGCAGAAGTGTTATTACCGAGATTAGTTTCATGCCCAGGACCTTTAGATCAAGATCAACAAGAGGCAGCTAGAGCAGCTCTTCAAGGAGGAGGCCCACCATATGGCCCACCAAGTACATGGAGTGTTTCTACAATGGATGCGTTAAGAGGTTTATTACCGGTTTTAGGACAACCAATTATTCGTAGTATTCCACAAGGCATTGTAGCAGCATGGCGTCAACGTAGTTCTCGTGATCCGTCTTGGCGACAACCAGAACGTACAATTCTACGTCCAAGATTTCGTAGAGAAGTAGAAAAAACGGCGTGTCCTAGTGGCAAAAAAGCACGTGAAATTGATGAAAGTTTAATTTTTTATAAAAAATGGGAATTAGAAGCATGTGTCGATGCAGCATTACTAGCTACACAAATGGATCGTGTTAATGCTATTCCATTCACATATGAACAATTAGATGTTTTAAAGCATAAATTAGACGAATTATATCCACAAGGTTATCCAGAATCAGTTATTCAACATTTAGGTTACTTATTTTTAAAAATGAGTCCAGAAGACATACGCAAATGGAATGTTACAAGTTTAGAAACATTAAAAGCGCTTTTAGAAGTTAACAAAGGTCATGAAATGAGTCCACAAGTTGCTACGTTAATTGATAGATTCGTTAAAGGCCGTGGTCAATTAGATAAAGATACTTTAGATACATTAACAGCATTTTATCCTGGCTACTTATGCAGTTTATCACCAGAAGAATTAAGTTCCGTTCCACCGAGTAGTATCTGGGCAGTTCGTCCGCAAGATTTAGATACATGCGACCCACGTCAATTAGATGTTTTATATCCAAAAGCAAGATTAGCTTTCCAAAATATGAACGGTAGTGAATATTTCGTAAAAATTCAATCCTTTTTAGGTGGTGCACCAACTGAAGATCTAAAAGCATTAAGCCAACAAAATGTAAGTATGGATTTAGCTACGTTTATGAAATTACGTACAGATGCAGTTCTACCATTAACAGTTGCAGAAGTTCAAAAATTATTAGGTCCACACGTAGAAGGATTAAAAGCAGAAGAACGTCACCGTCCAGTTCGCGATTGGATTTTACGTCAACGTCAAGATGATTTAGATACATTAGGTTTAGGTTTACAAGGCCTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTACTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGTTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAATAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTCAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCCAAAAGCAGAAGTGAAAACGGAAGCTCCAGCAGCTGAAAAACAAGCAGCTCCAGTAGTTAAAGAAAATACTAACACAAATACTGCTACTACAGAGAAAAAAGAAACAGCAACGCAACAACAAACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCTACAAACACAAATGCTAATAAAACGAATACAAATACAAATACAAACAATACTAATACACCATCTAAAAATACTAATACAAACTCAAATACTAATACGAATACAAACTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATATGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACATTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATAAGGATCC. (配列番号76)
実施例ＶＩＩ．ＡｃｔＡ−Ｎ１００に基づく融合蛋白質；ＬＬＯに基づく融合蛋白質（合成；ワクチン接種；免疫原性）
表１１は，調製した細菌株のいくつかを示す。細菌は腫瘍担持マウスへのワクチン接種に用いた。示される場合，ワクチン接種の結果，抗腫瘍免疫応答，腫瘍数およびサイズの減少，および生存の増加が生じた。
対照コンストラクトとして適した下記のＬｉｓｔｅｒｉａΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢコンストラクトは検出可能なように発現しなかったことがわかった。（１）ｈＭｅｓｏデルタＳＳデルタＧＰＩｒａｓ（ｒａｓはＧ１２Ｄ変異を有していた）。このコンストラクトはＡｃｔＡプロモーター，ＢａＰＡシグナル配列を有し，インテグレーションはＡｃｔＡ座であった。（２）Ａ３０ＲＡｃｔＡ−Ｎ１００ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩｒａｓ（ｒａｓはＧ１２Ｄ変異を有していた）。このコンストラクトは，ＡｃｔＡプロモーター，ＢａＰＡシグナル配列を有し，インテグレーションはＡｃｔＡ座であった。（３）Ａ３０ＬＡｃｔＡ−Ｎ１００ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩｒａｓ（ｒａｓはＧ１２Ｄ変異を有していた）。この特定のコンストラクトは，ＡｃｔＡプロモーター，ＡｃｔＡシグナル配列を有し，インテグレーションはＡｃｔＡ座であった。
本発明のプロモーターは，抗原：ｈｌｙ，ＡｃｔＡ，ｐ６０，ｐＨｙｐｅｒ等をコードする核酸と動作可能なように連結された，以下の１またはそれ以上を含むことができる。ｐＨｙｐｅｒは開示されている（例えば，米国特許出願２００５／０１４７６２１，Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．を参照）。本発明は，シグナル配列，例えば，ＬＬＯ，ＡｃｔＡ，ＢａＰＡ，ＢｓＰｈｏＤ，ｐ６０等のシグナル配列の１またはそれ以上を提供する。本発明の融合蛋白質パートナーは，ＬＬＯ1-62，ＬＬＯ1-441，ＡｃｔＡ−Ｎ１００，ｐ６０，ＰＦＯ1-390，ＢａＰＡ1-82等の１またはそれ以上を含むことができる。
ＡｃｔＡに基づく融合蛋白質パートナーまたはＬＬＯに基づく融合蛋白質パートナーを含むコンストラクトは，以下のようにして合成した。合成が完了したとき，コンストラクトをＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのゲノム中にインテグレートさせた。インテグレーションはｐＫＳＶ７，ｐＰＬ２，およびｐＩＮＴ等のベクターにより媒介されたが，本発明はいかなる特定のインテグレーションベクターまたはインテグレーションのメカニズムにも限定されない。種々のポリヌクレオチドは，モジュール方式で，すなわち，ｐＫＳＶ７スキャフォールド上に一緒にあらかじめ作成された核酸をライゲーションすることにより組み立てた。これらのあらかじめ作成された核酸は以下のとおりである。
ＡｃｔＡプロモーター／ＡｃｔＡ−Ｎ１００／ヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩコンストラクトは，以下の成分を用いて組み立てた。ＡｃｔＡ−Ｎ１００をコードする第２の核酸（第１のポリヌクレオチドは５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’−ＢａｍＨＩ部位を有する）と直接連結された，天然のリステリアＡｃｔＡプロモーター配列（シャインダルガノ部位を含む）をコードする第１の核酸から構成される第１のポリヌクレオチド。第２のポリヌクレオチドはヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩ（５’−ＢａｍＨＩ部位および３’−ＳａｃＩ部位）から構成される。ｐＫＳＶ７に第２のポリヌクレオチドに直接連結された第１のポリヌクレオチドから構成される挿入物を導入した。このコンストラクトの変種においては，第２のポリヌクレオチドは，１２ｒａｓをコードする第２の核酸（５’−ＢａｍＨＩ部位および３’−ＳａｃＩ部位）と直接連結された，ヒトメソセリンΔｓｓΔＧＰＩをコードする第１の核酸から構成される。ヒトメソセリンは非限定的例として企図されるものである。
ｈｌｙプロモーター／ＬＬＯ６２／ヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩ／１２ｒａｓコンストラクトは以下の成分を用いて組み立てた。ＬＬＯ６２は，リステリオリシン（ＬＬＯ）のアミノ酸１−６２をコードする核酸を意味する。第１のポリヌクレオチドは，ＬＬＯ６２（第１のポリヌクレオチドは５’−ＫｐｎＩ部位および３’−ＢａｍＨＩ部位を有する）をコードする第２の核酸と直接連結された，天然のリステリアｈｌｙプロモーター配列（シャインダルガノ部位を含む）をコードする第１の核酸から構成されるように製造した。第２のポリヌクレオチドは，１２ｒａｓ（第２のポリヌクレオチドは５’−ＢａｍＨＩ部位および３’−ＳａｃＩ部位を有する）をコードする第２の核酸と直接連結された，ヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩをコードする第１の核酸から構成されるように製造した。ｐＫＳＶ７に，第２のポリヌクレオチドと直接連結された第１のポリヌクレオチドから構成される挿入物を導入した。このコンストラクトの変種はＬＬＯ６２の代わりにＬＬＯ６０（コドン最適化）を用いた。
図７は，本発明の多くの態様，例えば，ＬＬＯに基づく融合蛋白質およびａｃｔＡ−Ｎ１００に基づく融合蛋白質を示す。
図８は，光学処理されたＬｉｓｔｅｒｉａの細胞培養物からの種々のコンストラクトの発現を示す。この文脈において，発現とは，蛋白質の生合成および培地への分泌を意味し，ここで，示されるコンストラクトはリステリアのゲノム中にインテグレートされている。発現は，酵母エキスを含みグルコースを含まない培地で，ＯＤ600＝０．８に対応する細菌密度で行った。ｐＰＬ２との用語はコンストラクトがベクターｐＰＬ２を用いて部位特異的組換えにより挿入されたことを示し，ｐＫＳＶ７とは，コンストラクトがベクターｐＫＳＶ７を用いて相同組換えにより挿入されたことを意味する（表１３を参照）。
メソセリン発現を検出するための抗体は，ウサギをヒトメソセリンからの３つのペプチドで免疫することにより生成されたポリクローナル抗体であり，抗体は，マウスとヒトメソセリンとの間で完全に保存された単一のペプチド（ＳＥＡＤＶＲＡＬＧＧＬＡＣ（配列番号８６））により精製した。
ゲルからの結果（図８）は，上清中の蛋白質（分泌された蛋白質）を示す。
レーンＰ，親Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる対照実験は明白な染色バンドを示さない。
レーン１−４はバンドをほとんどまたは全く示さない。
レーン５は，ＬＬＯoptｈｍｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ−１２−ｒａｓのある程度の分泌を示すが，ここでは，インテグレーションはリステリアｔＲＮＡArg遺伝子中へのｐＰＬ２媒介性インテグレーションによるものであった。
レーン６は，マウスメソセリンを分泌させる試みを表すが，明確な染色バンドを示さない。
レーン７はＡｃｔＡ−Ｎ１００ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ−１２−ｒａｓの著しい分泌を示し，ここで，インテグレーションは，ｐＫＳＶ７により媒介され，リステリアのゲノムのＡｃｔＡ部位である。
レーン８はさらに高い分泌を示し，ここで，コンストラクトはＡｃｔＡＮ１００ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩであり，インテグレーションはｐＫＳＶ７により媒介され，リステリアのゲノムのＡｃｔＡ部位である（図７）。
レーン９はほとんどまたは全くバンドを示さない。
図９は，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢからの蛋白質分泌を示し，ここで，ＬｉｓｔｅｒｉａはヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩを含む種々の融合蛋白質を発現した。すべてのメソセリンコンストラクトは，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓについてコドン最適化した核酸によりＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓから発現させた。分泌実験のために種々のコンストラクトを調製した（表１４を参照）。また，これらの実験では，メソセリン発現を検出するための抗体は，ヒトメソセリンからの３つのペプチドでウサギを免疫して生成したウサギポリクローナル抗体であり，抗体は，マウスとヒトメソセリンとの間で完全に保存されている単一のペプチド（ＳＥＡＤＶＲＡＬＧＧＬＡＣ（配列番号８６））により精製した。
レーン１で用いたコンストラクトは，分泌配列の起源としてＬＬＯ４４１を用いており，ここで，ＬＬＯ４４１の核酸はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現用にコドン最適化されており，異種抗原はヒトメソセリンΔＳＳΔＧＰＩである（レーン１）。このコンストラクトは，この特定の実験において最も高いレベルの分泌を生じた（レーン１）。ウエスタンブロットで示される高分子量の物質はメソセリンに融合したＬＬＯ441を表し，より低い分子量の物質は分解生成物を表すようである。
レーン２および４について用いたコンストラクトはＡｃｔＡ−Ｎ１００に基づくものであるが，ＡｃｔＡのシグナル配列が欠失しており，ＢａＰＡのシグナル配列で置き換えられている。これらのコンストラクトからの発現は比較的低かった（レーン２および４）（図９）。
残りのコンストラクトはすべて全長ＡｃｔＡ−Ｎ１００を分泌配列の起源として含むものであったが，ただし，ＡｃｔＡ−Ｎ１００はＡ３０Ｒ変異を含み（レーン５）；ＡｃｔＡ−Ｎ１００は変異を含まず（レーン７）；ＡｃｔＡ−Ｎ１００はＡ３０Ｒ変異を含み（レーン９）；ＡｃｔＡ−Ｎ１００は４つの変異（“Ｎｄｅｇｃｏｎ”と称される）を含む（レーン１１）。“Ｎｄｅｇｃｏｎ”と名付けられたＡｃｔＡ−Ｎ１００中の４つの変異は，Ａｒｇ−２９，Ｌｙｓ−３２，Ｌｙｓ−３７，およびＬｙｓ−４４であった。ＮｄｅｇｃｏｎはＡｃｔＡ−Ｎ１００とメソセリンとの間に置かれた（または挿入された）。分泌された蛋白質は，グルコースを含まない酵母エキス中で培養して指数増殖の中期に，トリクロロ酢酸を用いる沈殿により回収した。
図１０は，示されるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢコンストラクトを用いる１回のワクチン接種の後に測定した免疫刺激を示す。ここでは，ワクチン接種の７日後に脾臓を摘出して，脾臓細胞の起源として用いた。４つのコンストラクトのそれぞれでワクチン接種した後にメソセリン特異的免疫応答が認められた：（１）ｈｌｙプロモーターはＢａＰＡシグナル配列およびｈＭｅｓｏ（ｔＲＮＡArg座にインテグレートされている）と動作可能なように連結されていた；（２）ｈｌｙプロモーターはＢａＰＡシグナル配列およびｈＭｅｓｏ（ｉｎｌＢ座にインテグレートされている）と動作可能なように連結されていた；（３）ＡｃｔＡプロモーターはＡｃｔＡ−Ｎ１００およびｈＭｅｓｏ（ＡｃｔＡにインテグレートされていた）と動作可能なように連結されていた；（４）ｈｌｙプロモーターはｐ６０およびｈＭｅｓｏ（ｔＲＮＡArg座にインテグレートされていた）と動作可能なように連結されていた。
その結果，免疫応答の刺激におけるＡｃｔＡプロモーターの役割；免疫応答の増強におけるＡｃｔＡ−Ｎ１００融合パートナーの役割；ならびに，免疫応答の増加におけるＡｃｔＡ座におけるインテグレーションの役割が示され，ＡｃｔＡプロモーターがＡｃｔＡ−Ｎ１００融合蛋白質パートナーと動作可能なように連結され，かつインテグレーションがＡｃｔＡ座である場合に，免疫応答を刺激する能力が増強されることが示された（図１０）。
以下に上述の実験についてさらに詳細に説明する。マウスにＬｉｓｔｅｒｉａを注入した後，一定期間（７日）おいて，Ｌｉｓｔｅｒｉａが取り込まれ，抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によりプロセシングされるようにした。Ｌｉｓｔｅｒｉａの取り込みの後，ＡＰＣはＬｉｓｔｅｒｉａによりコードされる抗原をＴ細胞に提示し，Ｔ細胞の活性化およびクローン拡大が生じた。脾臓を摘出し，脾臓細胞（Ｔ細胞およびＡＰＣを含む）を単離した。単離した脾臓細胞に，バッファまたはヒトメソセリンペプチドのプール（０．００２ｍｇ／ｍｌ最終濃度のプール）のいずれかを加えた。ペプチドを加えた後，脾臓細胞調製物中の樹状細胞（ＤＣｓ）が活性化Ｔ細胞に対してペプチドを提示できるようにした。スポット形成アッセイ（スポット形成細胞；ＳＦＣ）におけるシグナルにより反映されるように，提示が成功したため，Ｔ細胞はインターフェロンガンマを分泌した（図１０）。
メソセリンペプチドプール（１５ｘ１１プールとしても知られる）は１５３種の異なるペプチドから構成され，これらはすべて１５ｍｅｒであり，ヒトメソセリンの全配列にわたり，ここで，連続するペプチドは１１アミノ酸ずつ重複している。その結果，ペプチドプールを脾臓細胞に加えた場合に，ペプチドプールを用いない場合よりインターフェロンガンマ（ＩＦＧｇａｍｍａ）発現が高いことが示された。図１０−１２はマウスに１ｘ１０7ＣＦＵまたは３ｘ１０7ＣＦＵ（図１０）；１ｘ１０6ＣＦＵまたは１ｘ１０7ＣＦＵ（図１１）；または１ｘ１０6ＣＦＵまたは１ｘ１０7ＣＦＵ（図１２）のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓをワクチン接種したときの免疫応答の比較を示す。ここに開示されるほとんどの場合で，マウスにより多くの細菌を注入したときに，免疫応答はより高かった。
図１１および１２はスポット形成細胞アッセイを用いた同様の実験を示す。
図１１からの生データ（スポット形成細胞アッセイの写真）を図１２でグラフで示す。図１２はＩＦＮガンマシグナル（スポット形成細胞；ＳＰＣ）を生成した細胞の数を脾臓細胞の数あたりで示す。データは同程度のメソセリン特異的免疫応答を示しており，ここで，コンストラクトは，ＢａＰＡシグナル配列およびｈＭｅｓｏ（ｉｎｌＢ座）と動作可能なように連結されているｈｌｙプロモーターを有するか，またはコンストラクトはＡｃｔＡシグナル配列およびＡｃｔＡ−Ｎ１００およびｈＭｅｓｏ（ＡｃｔＡ座）と動作可能なように連結されているＡｃｔＡプロモーターを有するものであった。
図１３−１４は，腫瘍転移データを示す。この実験では，ＣＴ−２６ヒトメソセリンを発現する細胞の肺への転移を測定した。ｔ＝０日において，ＣＤ−２６腫瘍細胞を静脈内注入した（２ｅ５細胞）。ｔ＝３日において，マウスに示されるＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを投与した。ｔ＝１８日において，肺を回収した。“２ｅ５細胞”とは２ｘ１０5個の細胞を意味する。
腫瘍細胞を摂取したマウスを次のように処置した：（１）塩水のみ（ＨＢＳＳ）；（２）異種抗原をコードしていないＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ（陰性対照）；（３）ｇｐ７０腫瘍抗原（メソセリンとは異なる抗原−−陽性対照）に由来するＡＨ１−Ａ５ペプチドをコードするＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ；および（４）−（７）種々のメソセリンコンストラクトをコードするＬｉｓｔｅｒｉａΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ。ＡＨ１−Ａ５ペプチドはｇｐ７０腫瘍抗原に由来する。この実験では，ＡＨ１−Ａ５を陽性対照として用いる（例えば，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１３８３２−１３８３７；Ｓｌａｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９−５３８を参照）。
図１４は，４種のメソセリン発現Ｌｉｓｔｅｒｉａコンストラクトが腫瘍転移を排除するのに同等の効果を有することを示す。
図１５は，種々のメソセリン発現Ｌｉｓｔｅｒｉａが肺腫瘍を減少させるのに有効であることを示す。ここでは，３つの異なる用量の各メソセリン発現Ｌｉｓｔｅｒｉａを試験した。ｈＭｅｓｏ６は，肺転移を阻止するのに，例えばｈＭｅｓｏ２またはｈＭｅｓｏ４より有効である（図１５）。
図１６は，種々のリステリアワクチンを用いた，腫瘍に対する生存を示す。陰性対照処置（ＨＢＳＳ；親Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の場合には，２２日を超えて生存したマウスはなかった。陽性対照Ｌｉｓｔｅｒｉａは，ｇｐ７０に由来する抗原を発現するものであった。抗原（ＡＨ１−Ａ５）はＣＴ２６細胞からの免疫優勢抗原に由来するものであった（Ｓｌａｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９−５３８）。陽性対照ワクチンで処置したマウスは６０日までまたはこれを超えて生存した（図１６）。
図１７は，分泌されたメソセリン（上のブロット）および総発現メソセリン（下のブロット）を検出するためのゲルおよびウエスタンブロット分析を示す。示される分泌配列および抗原をコードするポリヌクレオチドを含むよう遺伝子工学操作されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢを培養し，総メソセリンまたは分泌メソセリンを測定した。分泌配列は，示されるように，ＢａＰＡまたはＢｓｐｈｏＤであった。抗原は，示されるように，全長（ＦＬ）ヒトメソセリンまたは分泌配列およびＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリン（ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ）であった。その結果，総発現はＢｓｐｈｏＤ（レーン４−５；下のゲル）の方がＢａＰＡ（レーン２−３；下のゲル）より幾分高かった。この結果はまた，少なくともＢｓｐｈｏＤ含有コンストラクトについては，分泌はｈＭｅｓｏ（ΔＳＳΔＧＰＩ）（レーン４−５；上のゲル）の方が全長ｈＭｅｓｏ（レーン８−９；上のゲル）より高いことを示した。
図１８は，ｈＭｅｓｏ１，ｈＭｅｓｏ２，ｈＭｅｓｏ３，およびｈＭｅｓｏ４を用いたワクチン接種に対するメソセリン特異的免疫応答の比較である。ｈＭｅｓｏ１およびｈＭｅｓｏ２を並べて比較すると，構成的に活性なＰｒｆＡ（ｐｒｆＡ＊）をコードする核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａコンストラクトは，その核酸を含まないＬｉｓｔｅｒｉａコンストラクトと比較して，免疫応答が増加することが明らかである。ｈＭｅｓｏ１とｈＭｅｓｏ４とを並べて比較すると，ゲノムインテグレーションがｔＲＮＡArg座における場合（ｈＭｅｓｏ１）の免疫応答と比較して，ｉｎｌＢ座におけるゲノムインテグレーション（ｈＭｅｓｏ４）の場合に免疫応答が増加することが明らかである。ｈＭｅｓｏ３およびｈＭｅｓｏ４に対する免疫応答の比較から，ＡｃｔＡプロモーターを用いた場合の免疫応答と比較して，ｈｌｙプロモーターを用いることにより免疫応答を増強させることができることが示唆される。Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を用いて，免疫応答を評価した。ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾臓細胞（メソセリンペプチドのプールによる脾臓細胞の刺激ありまたはなし），ここでｅｌｉｓｐｏｔアッセイはＩＦＮガンマの発現を測定する。
図１８のゲルは，メソセリンの総発現またはメソセリンの分泌に対して反応するウエスタンブロットを示す。ｈＭｅｓｏ２は最も高いレベルの分泌を生じ，このことは，分泌を増加させるために以下の組み合わせが有用であることを示す：（１）ｐｒｆＡ＊核酸；（２）ｔＲＮＡ Ａｒｇ座におけるインテグレーション；（３）ｈｌｙプロモーター；および（４）ＢａＰａ分泌配列。この場合にも，ｐｒｆＡ＊核酸の有用性が示されている。
図１９は，ｈＭｅｓｏ１２およびｈＭｅｓｏ１に対する免疫応答の比較である。メソセリン特異的免疫応答は，生データ（ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ），および２ｘ１０5個の脾臓細胞あたりのスポット形成脾臓細胞の数を示すヒストグラムにより示される。これらの結果は，ｈＭｅｓｏΔＳＳΔＧＰＩ（ｈＭｅｓｏ１２）の融合蛋白質中にｒａｓ配列が存在することにより，融合蛋白質がｒａｓを含まない場合（ｈＭｅｓｏ１）と比較して，より低い免疫応答（ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）およびより低い発現（ウエスタンブロット）が得られたことを示す（図１９）。
マウスに２つの株（ｈＭｅｓｏ１２またはｈＭｅｓｏ１）をワクチン接種し，脾臓細胞を取り出して，ｅｌｉｓｐｏｔアッセイに用いた。ここで，アッセイ混合物は，標準的なｈＭｅｓｏプールのペプチドでパルスした。上述したように，ｈＭｅｓｏ１（ＢａＰＡ分泌配列は野生型である）は，ｈＭｅｓｏ１２（ＢａＰＡ分泌配列はＥ３０Ｒである）より高いメソセリン特異的免疫応答を刺激した。
図２０は，ｈＭｅｓｏ１，ｈＭｅｓｏ５，ｈＭｅｓｏ１９，およびｈＭｅｓｏ２０に対する免疫応答の比較である。結果は，最も高いメソセリン特異的免疫応答はｈＭｅｓｏ１に対するものであることを示すが，ｈＭｅｓｏ５に対する検出可能なメソセリン特異的応答もある程度あった。これらの結果は，ＢａＰＡ分泌配列により，ｐ６０分泌配列，またはｐ６０分泌配列の誘導体と比較して，より高い免疫応答が得られたことを示す。ゲルは，ｐ６０分泌配列がメソセリンの分泌を支持することを示す。ｈＭｅｓｏ５またはｈＭｅｓｏ２０のレーンを参照（図２０）。
図２１は，ｈＭｅｓｏ１１，ｈＭｅｓｏ６，ｈＭｅｓｏ１０，およびｈＭｅｓｏ１８に対する免疫応答の比較である。これらのワクチンのそれぞれについてメソセリン特異的免疫応答が生じたが，最も高い応答はｈＭｅｓｏ１０およびｈＭｅｓｏ１８により引き起こされた。ｈＭｅｓｏ６とｈＭｅｓｏ１０とを比較すると，ｒａｓ（ｈＭｅｓｏ１０）がメソセリン特異的免疫応答を増強しうることがわかる。ここでは，両方のＬｉｓｔｅｒｉａ株ＡｃｔＡ分泌配列を用い，ＡｃｔＡプロモーターを用い，ＡｃｔＡ座のインテグレーションを用いた。ｈＭｅｓｏ１８に対する高い免疫応答は，ＡｃｔＡ（Ａ３０Ｒ）分泌配列の使用によるものでありうる。本発明は，ＡｃｔＡ（Ａ３０Ｒ）をコードし，異種抗原，例えば，メソセリン抗原等の腫瘍に由来する抗原，または感染性因子に由来する抗原をコードする第２の核酸と，動作可能なようにかつインフレームで連結されている第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含有するＬｉｓｔｅｒｉａを提供する。ゲルは，ｈＭｅｓｏ１８Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が，ｈＭｅｓｏ１０およびｈＭｅｓｏ６による分泌と比較して比較的低い量のメソセリンを分泌したことを示す（図２１）。
図２２は，ｈＭｅｓｏ１，ｈＭｅｓｏ１４，ｈＭｅｓｏ１５，およびｈＭｅｓｏ２２に対する免疫応答の比較である。ｈＭｅｓｏ１，ｈＭｅｓｏ１４，およびｈＭｅｓｏ２２に対するメソセリン特異的免疫応答は同等であったが，ｈＭｅｓｏ１５に対する応答はより高かった。これらの４つのワクチン株のそれぞれの分泌配列（ＳＳ）は異なる。ｈＭｅｓｏ１の分泌配列（ＳＳ）はＢａＰＡであり；ｈＭｅｓｏ１４（ＬＬＯ６２）；ｈＭｅｓｏ１５（ＬＬＯｏｐｔ６２）；ｈＭｅｓｏ２２（ＬＬＯ４４１）である。
図２３は，健康なヒトボランティアにおける，リステリオリシン（ＬＬＯ）およびメソセリンに対する免疫応答を示す。試験した３名すべての被験者において，ＬＬＯのエピトープおよびメソセリンに対する免疫応答が認められた。
図２４は，ＢＨＩ肉汁培地およびＪ７７４マクロファージにおけるｈＭｅｓｏ６またはｈＭｅｓｏ５によるヒトメソセリンの発現を示し，ここで，発現はゲル分離およびウエスタンブロット法による検出により評価した。結果は，肉汁培地中でｈＭｅｓｏ６による比較的低い発現（および肉汁培地中でｈＭｅｓｏ５による高い発現），および哺乳動物細胞の内部においてｈＭｅｓｏ６による比較的高い発現（および哺乳動物細胞の内部においてｈＭｅｓｏ５による低い発現）を示す。このグラフは，ｈＭｅｓｏ６でワクチン接種した後の比較的高い免疫応答（ｍｅｓｏ特異的応答；ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）およびｈＭｅｓｏ５でワクチン接種した後の低い免疫応答（図２４）を示す。
図２５はメソセリン特異的免疫応答を示す。ここでは，マウスは，示されるように，ｐ６０，ＢａＰＡ，ＬＬＯ４４１，ＡｃｔＡ−Ｎ１００をコードする第１の核酸，およびｈＭｅｓｏをコードする第２の核酸を含むポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種した。インテグレーションは，示されるように，リステリアのゲノムのｔＲＮＡArg座，ＡｃｔＡ座，またはｉｎｌＢ座で生じた。
図２６は，抗メソセリン抗体を用いるウエスタンブロットにより検出した，Ｊ７７４マクロファージからのメソセリンのインビボ発現を示す。Ｊ７４４マクロファージをｈＭｅｓｏ６またはｈＭｅｓｏ２６で感染させた場合も同様のインビボ発現が生じた。
図２６ならびに図２７は，種々の遺伝子工学操作されたＬｉｓｔｅｒｉａを用いるワクチン接種後にメソセリン特異的に付与された抗体は，ｈＭｅｓｏ２６株を用いた場合，試験した他の株より高かったことを示す。
図２８（肺の写真），２９（肺データのヒストグラム），および３０（マウス生存）は，ｈＭｅｓｏ６およびｈＭｅｓｏ２６を投与することにより肺腫瘍の治療が成功したことを示す。マウスを，陰性対照（ＨＢＳＳ）；陽性対照（ＡＨ１−Ａ５を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ）；または示された数のｈＭｅｓｏ６またはｈＭｅｓｏ２６で処置した。腫瘍はＣＴ２６細胞を注入することにより誘導した。結果は，ｈＭｅｓｏ６およびｈＭｅｓｏ２６の両方とも腫瘍転移を減少させるのに有効であることを示し，ｈＭｅｓｏ２６はｈＭｅｓｏ６より有効であった（図３０）。
図３１は発現，およびリステリアのゲノム中の異なる点にインテグレートされた発現カセットを含むよう遺伝子工学操作された種々のＬｉｓｔｅｒｉａ株を用いたワクチン接種に対する免疫応答を比較したものである。対照細菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ）は発現カセットを含まず，ｈＭｅｓｏ２６は１つのインテグレートした発現カセットのみを含む。ｈＭｅｓｏ４０，ｈＭｅｓｏ４１，ｈＭｅｓｏ４２，およびｈＭｅｓｏ４３の株は，それぞれ２つの異なる発現カセットを含み（ゲノム中の２つの異なる点にインテグレートされている），これらのＬｉｓｔｅｒｉａ株からの発現およびこれらのＬｉｓｔｅｒｉａ株に対する免疫応答を示す（図３１）。
図３２は，全長ヒトメソセリンをコードし，ｔＲＮＡArg座にインテグレートされている発現カセットを有する，（１）ｈＭｅｓｏ６；（２）ｈＭｅｓｏ２６；または（３）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ（３つの同一のコンストラクト）で感染させた後の，メソセリンのインビボ発現，すなわち，Ｊ７４４マクロファージ中でのインビボの発現を示す。３つの同一のコンストラクト，または同胞種は，１−１，７−１，および８−１のラベルがつけられている。
図３３は，Ｊ７７４ネズミマクロファージ中のｈＭｅｓｏ６，ｈＭｅｓｏ２６，およびｈＭｅｓｏ３８によるメソセリンのインビボ発現を示す（ゲルおよびウエスタンブロット）。対照細菌はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢであった。また，メソセリン特異的免疫応答（ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）も示される。この結果は，ｈＭｅｓｏ６，ｈＭｅｓｏ２６，およびｈＭｅｓｏ３８がマクロファージ中に位置する場合，同程度のメソセリンが発現されたこと，およびｈＭｅｓｏ２６およびｈＭｅｓｏ３８に対して同程度の免疫応答が得られたことを示す。
図３４は，ｈＭｅｓｏ２６またはｈＭｅｓｏ３８を示された用量で単回注入した７日後に生成したメソセリン特異的免疫応答を示す。用量応答曲線は１００万個の細菌から１０００万個の細菌への顕著な増加を示す。２つの株について見いだされる用量応答曲線は互いに類似する（図３４）。本発明は，ｈＭｅｓｏ２６；ｈＭｅｓｏ３８；ｈＭｅｓｏ２６および／またはｈＭｅｓｏ３８を含むワクチン；ｈＭｅｓｏ２６および／またはｈＭｅｓｏ３８を哺乳動物被験体に投与する方法；ｈＭｅｓｏ２６および／またはｈＭｅｓｏ３８を投与することを含む，癌または腫瘍に対するメソセリン特異的免疫応答を刺激する方法；ｈＭｅｓｏ２６および／またはｈＭｅｓｏ２８を投与することを含む，癌または腫瘍に対する生存を増加する方法等を提供する（図３４）。
図３５Ａおよび３５ＢはｈＭｅｓｏ２６およびｈＭｅｓｏ３８についての物語（ｎａｒｒａｔｉｖｅ）の続きであり，固定した肺の写真を示す。ｔ＝０日に腫瘍細胞を注射した。Ｔ＝３日にＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを注射した（ｉ．ｖ．）。ｔ＝１９日に肺を採取し，肺の写真（図３５Ａ，Ｂ）により示される転移の結果をヒストグラムにより定量した。示される数の細菌でマウスを評定した結果，両方のリステリア株，すなわちｈＭｅｓｏ２６およびｈＭｅｓｏ３８について同様の応答が示された。
図３６もまた，Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ｈＭｅｓｏ２６およびｈＭｅｓｏ３８についての物語の続きである。結果は，両方の株について，接種したＣＴ２６腫瘍細胞に対する生存が同様に増加したことを示す。
図３７は，Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ｈＭｅｓｏ２６およびｈＭｅｓｏ３８に対するメソセリン特異的免疫応答をＣＤ４+Ｔ細胞応答とＣＤ８+Ｔ細胞応答とに分けて分析したものである。免疫応答は細胞内染色アッセイ（ＩＣＳ）によりモニターした。Ｂａｌｂ／ｃマウスではＬｉｓｔｅｒｉａの両方の株を試験したが，ＣＤ−１マウスではｈＭｅｓｏ２６Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のみを試験した。結果は，ＣＤ４+Ｔ細胞応答またはＣＤ８+Ｔ細胞応答である免疫応答の比率が，マウスの異なる株で異なりうることを示す。
図３８は，ｈＭｅｓｏ３８が腫瘍に対する生存を増加させることを示し，ＣＤ４＋，ＣＤ８＋である細胞，およびＮＫ細胞による生存への寄与を分析したものである。ＣＤ４＋細胞，ＣＤ８＋細胞，またはＮＫ細胞の１つを枯渇させた抗体でマウスを処理した。抗ＣＤ８抗体で処理すると，ｈＭｅｓｏ３８媒介性の生存の増加はわずかしか低下しなかった。抗ＮＫ細胞抗体で処理すると，ｈＭｅｓｏ３８媒介性のせ生存の増加は中程度に低下した。抗ＣＤ４抗体で処理すると，ｈＭｅｓｏ３８媒介性の生存の増加は大きく低下した（図３８）。マウス細胞の抗体媒介性枯渇は，抗体をｔ＝マイナス８日，マイナス４日，およびマイナス１日に投与することにより行った。ｔ＝０日において，マウスに腫瘍細胞を注入した（ｉ．ｖ．）。ｔ＝３日において，マウスにＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを注入した（ｉ．ｖ．）。毎週の抗体ブーストを投与して，マウス細胞の枯渇を誘発した。図３９は，同様の実験を示すが，ここでは，抗体のみを投与するか，ｈＭｅｓｏ３８のみを投与するか，またはｈＭｅｓｏ３８と示された抗体の両方を投与した。
上述のデータは，本発明をヒトメソセリンをコードする核酸を含むＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢを含む態様に限定することを意図するものではない。本発明は，別の減弱化リステリアワクチンプラットフォーム，例えば，ＫＢＭＡＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔｉｎｌＢ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔｈｌｙ；ＫＢＭＡＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔｉｎｌＢ；ＫＢＭＡＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡ；ＫＢＭＡＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔＡｃｔＡΔｉｎｌＢ；ＫＢＭＡＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔｈｌｙを提供する。さらに，ヒトメソセリン以外の，またはこれに加えて抗原をコードするコンストラクトも提供される。
実施例ＶＩＩＩ．ファージインテグラーゼ，ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’），および細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）をコードする核酸
ポリヌクレオチド中への第１の核酸の部位特異的インテグレーションは，ファージインテグラーゼ，第１の核酸中に存在するａｔｔＰＰ’部位，およびポリヌクレオチド中に存在する対応するかまたは適合するａｔｔＢＢ’部位により媒介することができる。本発明は，第１の核酸のポリヌクレオチド中へのインテグレーションを媒介するのに有用な，ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，およびａｔｔＢＢ’部位をコードする多数の核酸を提供し，ここで，ポリヌクレオチドはプラスミドであっても細菌のゲノムであってもよく，そしていくつかの非限定的例を提供する。
図４０，図４１，図４２，図４３，および図４４は，本発明のファージインテグラーゼのいくつかのアミノ酸配列を開示する。包含されるものは，これらのファージインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド，ストリンジェントな条件下でこれらのポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸であり，ここで，核酸は，機能的ファージインテグラーゼをコードする。また包含されるものは，１対のＰＣＲプライマーによりひとまとめにされる他のポリヌクレオチドであり，ここで，１対のＰＣＲプライマーは，本発明のファージインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドの２つの位置に正確に対応する。
以下のファージインテグラーゼをコードする核酸，ファージインテグラーゼポリペプチド，関連するファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）をコードする核酸および対応する細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）をコードする核酸が提供される。本発明は，以下のインテグラーゼを包含する：（１）Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ ００７１インテグラーゼ；（２）Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ １２３１インテグラーゼ；（３）Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ １７６５インテグラーゼ；（４）Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ ２６１０インテグラーゼ；および（５）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｆ６８５４＿２７０３インテグラーゼ。
インテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，およびａｔｔＢＢ’部位をコードする核酸の同定は，以下の多段階法にしたがって行った。最初に候補核酸配列を取得し，例えばウエブページｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖの蛋白質またはヌクレオチドＢＬＡＳＴ特性を用いて，およびウエブページｔｉｇｒ．ｏｒｇ．の完成した微生物ゲノム特性を用いて，相同性を識別することができる。
工程１．新規ファージインテグラーゼ配列は以下のようにして同定した。既知のファージインテグラーゼの核酸を用いて，リステリアのゲノム中で類似の配列を検索した。ここで，リステリアのゲノムはプロファージを有する。研究のこの段階で用いられた既知のファージインテグラーは，ＰＳＡインテグラーゼおよびＵ１５３インテグラーゼをコードするものであった。
工程２．新規ファージインテグラーゼをコードする核酸を同定した後，インテグラーゼをコードする核酸の３’側のＤＮＡを，付着部位の出現について調べた。付着部位は，典型的には，ファージ付着部位と細菌付着部位（ａｔｔＰＢ’）とのハイブリッドの形をとる。ファージはそれ自身をリステリアのゲノム中にインテグレートしているため，付着部位はこのハイブリッドの形をとる。
工程３．リステリアのゲノムの推定ａｔｔＰＢ’部位を含む領域を，別のリステリア株またはリステリア種の対応する領域と比較した。この別のリステリア株または種は，インテグレートしたファージを含まないと予測される。交差点（ａｔｔＰＢ’中のファージ配列と細菌配列との間の交差点）な不連続の形をとる。交差点は，オープンリーディングフレーム中に生ずる場合も遺伝子間領域中に生ずる場合もある。
工程４．インテグラーゼ遺伝子のすぐ下流（そのすぐ３’末端側）かつ交差点の上流に存在するヌクレオチドの配列は，ファージ由来配列であると識別され，ファージ付着部位の“一番目の半分”を構成する。
工程５．ファージ付着部位の“２番目の半分”は，インテグラーゼ遺伝子の上流（５’側）に存在する核酸配列を調べて，インテグレートしたファージを含まない（目的とするゲノム領域中にインテグレートしたファージを有しない）と予測されるリステリア株または種の対応する領域と比較し，不連続の領域を識別することにより同定することができる。ファージ付着部位の最初の半分とファージ付着部位の２番目の半分との組み合わせがａｔｔＰＰ’である。
工程６．ファージ付着部位および細菌付着部位は，典型的には，例えば，３から１０，２０，３０，またはそれ以上のヌクレオチドで同一である領域を含む。同一の領域は，ファージ付着部位および細菌付着部位の一般的な位置を見いだすことを助けることができる。
工程７．目的とするリステリア種がＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ以外の種，例えばＬ．ｉｎｎｏｃｕａである場合には，Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａゲノム中の同定された細菌付着部位をコンピュータプローブとして用いて，相同の配列についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムを探索することができる。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムのこの探索の結果，プローブの結果が細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）であろう。
工程８．同一の領域が比較的長い，例えば４０−５０ヌクレオチドである場合には，この同一の領域は全ファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）および全細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）を構成することができる。
ほとんどの部位特異的インテグラーゼは，チロシンリコンビナーゼファミリーまたはセリンリコンビナーゼファミリーのものである。約１００種のファージによりコードされるインテグラーゼ遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は，ファージゲノムによりコードされており，ファージゲノム中で，および／または，ファージが細菌のゲノム中にインテグレーションした後に細菌のゲノム中で見いだすことができる。
セリンリコンビナーゼはＮ末端に触媒ドメインを有しており，これは，Ａｒｇ−８，Ｓｅｒ−１０，およびＡｒｇ−６８を含む多数の不変の残基を含む。Ｎ末端触媒ドメインの後には約２２０アミノ酸の領域があり，これは少なくとも１０個の保存残基（３個のシステインを含む）を含む。この領域の後に非保存残基の約１２５アミノ酸，次にＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，および／またはＭｅｔが豊富な３０−アミノ酸の領域，および最後に４−２００アミノ酸の長さのＣ末端テイルがある（例えば，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；Ｎｕｎｅｓ−Ｄａｒｂｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ａｎｄ Ｓｃｏｃｃａ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３６０５−３６１４を参照）。
チロシンリコンビナーゼファミリーのファージインテグラーゼは，保存されたＲ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフにより識別することができる。Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフはインテグラーゼファミリーのリコンビナーゼの顕著な特徴である。ヒスチジン（Ｈ）は，アルギニン，リジン，アスパラギン，またはチロシンで置き換えられていてもよい。例えば，ファージラムダインテグラーゼにおいては，Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフのアミノ酸がアミノ酸Ｒ２１２，Ｈ３０８，Ｒ３１１，およびＹ３４２に存在する（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０３７００を参照）（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．，上掲）。ファージインテグラーゼはさらに，ＢｏｘＩ（例えば，ファージラムダインテグラーゼのＡ２０２−Ｇ２２５を参照），ＢｏｘＩＩ（例えば，ファージラムダインテグラーゼのＴ３０６−Ｄ３４４を参照），およびＢｏｘＩとＢｏｘＩＩの前または間に存在するある種のモチーフにより識別される。ＢｏｘＩＩはコンセンサス配列ＬＬＧＨを含むことができ，ここで，グリシン（Ｇ）はＡ，Ｓ，またはＴで置き換えられていてもよい（配列番号１３７）（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．，上掲）。ＢｏｘＩモチーフおよびＢｏｘＩＩモチーフに加えて，原核生物インテグラーゼ，例えばファージインテグラーゼ中には保存配列の３つの“パッチ”がある。パッチＩはＢｏｘＩの上流にあり，コンセンサス配列ＬＴ−ＥＥＶ−−ＬＬ（配列番号８８）を有する。ファージラムダインテグラーゼにおいては，パッチＩは配列ＬＴＡＤＥＹＬＫＩＹ（配列番号８７）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０３７００のアミノ酸１８０−１８９）を有する。パッチＩＩは両方をセリン，トレオニン，グリシンまたはメチオニンで挟まれたリジン（ファージラムダインテグラーゼのＫ２３５）である。ファージラムダインテグラーゼにおいては，パッチＩＩはＳＫＴとして生じ，ＣｒｅリコンビナーゼにおいてはパッチＩＩはＴＫＴとして生じ，ＸｅｒＤリコンビナーゼにおいてはＧＫＧとして生ずる。パッチＩＩＩは，ＢｏｘＩとＢｏｘＩＩとの間に存在し，これは［Ｄ，Ｅ］−［Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ａ］3-6［Ｓ，Ｔ］（配列番号８９，１３８，１３９，１４０）である。ファージラムダインテグラーゼにおいては，パッチＩＩＩはアミノ酸２６９−２７４に生ずる（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．，上掲）。確立されたファージインテグラーゼ配列との比較のために候補ファージインテグラーゼ配列をクエリー配列として使用する場合には，ＢｏｘＩおよびＢｏｘＩＩをアラインメントさせるためにギャップおよび伸張を導入することが有用であろう。
本発明のファージインテグラーゼには保存Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフ（表１６）が存在する。この位置は手動検査により決定した。ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａは，ＢｏｘＩ（別名ＢｏｘＡ）およびＢｏｘＩＩ（別名ＢｏｘＢ）中に追加の保存配列を提供している（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ａｎｄ Ｓｃｏｃｃａ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３６０５−３６１４）。ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａは，アルギニン（Ｒ−Ｈ−Ｒ−ＹモチーフのＢｏｘＩ（ＢｏｘＡ）中）は次の前後関係で存在し：ＴＧＬＲＸＴＥＬ（配列番号９１），ヒスチジンおよび２番目のアルギニン（Ｒ−Ｈ−Ｒ−ＹモチーフのＢｏｘＩＩ（ＢｏｘＢ）中）は次の前後関係で存在する：ＨＸＬＲＨＡＸＡＴＸＬＸＸＸＧ（配列番号９０）ことを開示する。Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフのヒスチジン（Ｈ）および２番目のアルギニン（Ｒ）は太字で下線で示される。これらの２つの前後関係に対応する配列は，Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ ００７１のＢｏｘＩおよびＢｏｘＩＩ中に手動検査により容易に見いだすことができる。ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａは，Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｙモチーフのチロシン（Ｙ）をＢｏｘＣとして識別されるモチーフ中に配置し，ここで，ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｏｃａのＢｏｘＣは次のとおりである：ＶＸＸＸＬＧＨＸＸＸＸＸＴＸＸＹＸＨ（配列番号９２）。Ｒ−Ｈ−Ｒ−ＹモチーフのＹは太字および下線で示される。Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ ００７１インテグラーゼ配列を調べると，本発明のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ ００７１インテグラーゼにＢｏｘＣコンセンサス配列が存在することが示された。
調べたところ，ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａのＢｏｘＢおよびＢｏｘＣが本発明のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １７６５インテグラーゼに存在することがわかった。さらに，調べたところ，ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａのＢｏｘＡが本発明のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ ２６０１インテグラーゼに存在することがわかった。さらに，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｆ６８５４＿２７０３インテグラーゼ配列を調べたところ，ＢｏｘＡ，Ｂ，およびＣが存在することが示された。これらのことを合わせると，Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら（上掲）およびＥｓｐｏｓｉｔｏ ａｎｄ Ｓｃｏｃｃａ（上掲）のコンセンサス配列から，同定された配列がファージインテグラーゼであることが確認された。ＰＳＡファージインテグラーゼ配列を調べたところ，ＥｓｐｏｓｉｔｏおよびＳｃｏｃｃａのＢｏｘＡ，Ｂ，およびＣと類似するモチーフが明らかとなった。
本発明のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １２３１インテグラーゼは，セリンリコンビナーゼとして識別することができる。ＹａｎｇおよびＳｔｅｉｔｚは，セリンリコンビナーゼファミリーの多数の不変モチーフ及び保存的に置換されたモチーフを開示している（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ（１９９５）Ｃｅｌｌ ８２：１９３−２０７）。ＹａｎｇおよびＳｔｅｉｔｚのＹｘＲＶＳＴｘｘＱ（配列番号９３）モチーフはＬ．ｉｎｎｏｃｕａ１２３１インテグラーゼに存在する。また，ＹａｎｇおよびＳｔｅｉｔｚのＶＬＶｘｘＬＤＲＬｘＲ（配列番号１４１）モチーフもＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １２３１インテグラーゼに見いだすことができる。さらに，ＹａｎｇおよびＳｔｅｉｔｚのＶＡＱＡＥＲｘｘｘｘＥＲｘｘｘＧ（配列番号９４）モチーフが本発明のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ １２３１インテグラーゼに見いだされる。
本発明のファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）または細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）は，部位特異的組換え，相同組換え，制限部位の利用の方法により，合成有機化学法により，または他の方法により，ポリヌクレオチド中に移植することができる。特に，相同組換えを用いる場合には，ａｔｔＢＢ’部位を病原性遺伝子中に移植することができ，ここで，インテグレーションの結果，単純な挿入が生ずるか，あるいは，病原性遺伝子の対応する領域の欠失を伴う挿入が生ずる。
すなわち，本発明は，プラスミド中にファージ付着部位（ａｔｔＰＰ’）を移植する方法を提供する。細菌付着部位（ａｔｔＢＢ’）をプラスミド中に移植する方法，ならびに，その後プラスミドを用いてａｔｔＢＢ’を細菌のゲノム中に移すことができる下流の方法が提供される。１つの観点においては，プラスミドは，ａｔｔＰＰ’部位をコードする第１の核酸および異種抗原をコードする第２の核酸を含む。この場合，本発明は，標的ポリヌクレオチド中に存在するａｔｔＢＢ’部位中に第２の核酸を取り込ませる方法を企図しており，ここで，標的ポリヌクレオチドは細菌のゲノムであってもよい。
部位特異的組換え，相同組換え，または制限部位を用いる遺伝子操作の標的ポリヌクレオチドは，病原性遺伝子に限られず，限定されないが，任意のポリヌクレオチド，プラスミド，エピソーム，染色体外エレメント，細菌のゲノム，リステリアのゲノム，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノムまたはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムを包含する。
本発明は，ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ’部位をコードする核酸を包含し，ここで，核酸は，ストリンジェントな条件下で，本発明の一部である核酸の１つ，すなわち，ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ部位をコードする核酸の１つにハイブリダイズすることができ，ここで，イブリダイズするポリヌクレオチドは，機能的ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ’部位をコードすることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に由来する核酸も包含され，ここで，ＰＣＲプライマー対は，本明細書に開示される，ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ部位をコードする本発明の核酸の１つの機能領域と正確にマッチし，これらをひとまとめにする。ＰＣＲ反応は，インシリコで行うことができる。本発明は，ＰＣＲ反応に由来する核酸を包含し，ここで，核酸は，機能的ファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ’部位をコードする。ＰＣＲプライマーは，本明細書に記載されるファージインテグラーゼ，ａｔｔＰＰ’部位，またはａｔｔＢＢ’部位をコードする全核酸をひとまとめにするよう設計することができ，または，より短い，機能的に活性な，核酸の一部をひとまとめにするよう設計してもよい。
実施例ＩＸ．実施例ＸおよびＸＩにおいて用いる試薬および方法
あるいは，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株における異種抗原は，ＡｃｔＡＮ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質のカルボキシル末端にインフレームで位置する８アミノ酸のＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１４２）ペプチド（ＳＬ８およびオバルブミン257-264としても知られる）をコードするヌクレオチド配列を含むよう構築してもよい。ＳＬ８エピトープ等の組成物は，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株が抗原提示細胞により取り込まれることができ，次にインビトロ抗原提示アッセイを用いて，ＭＨＣクラスＩ経路を介して抗原を提示するようプログラムされていることを示すための代理物として働く。
この提示アッセイは，クローニングしたＣ５７ＢＬ／６由来樹状細胞株ＤＣ２．４をＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ細胞株と一緒に用いて実施することができる。ＤＣ２．４株は，骨髄由来ＤＣから生成し，次にオンコジンｍｙｃおよびｒａｆでトランスフォームした。ＤＣ２．４細胞は，外的に加えられた抗原をＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ経路の両方で提示することが先に示されている。Ｂ３Ｚ細胞とともにインキュベーションした後に，ＤＣ２．４細胞によるクラスＩ分子上へのペプチドの提示，および続く組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの食作用を測定した。Ｂ３Ｚは，ネズミＫbクラスＩ分子上に提示されたＳＬ８エピトープに特異的なｌａｃＺ誘導性ＣＤ８+Ｔ−細胞ハイブリドーマである。ＳＬ８のＢ３Ｚ細胞に対するクラスＩ拘束性提示により，Ｂ３Ｚによるベータ−ガラクトシダーゼ合成が誘導される。産生されたベータ−ガラクトシダーゼの量は，発色性基質であるＣＰＲＧの加水分解により測定することができ，これは抗原提示細胞の表面に提示されたＳＬ８／Ｋb複合体の量を示す。すなわち，インビトロ抗原提示アッセイは，いずれかのあらかじめ決定されたＡｃｔＡＮ１００−異種抗原融合蛋白質を利用した組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株が感染宿主細胞中で抗原融合蛋白質を発現し分泌し，適切なプロセシングおよびＭＨＣ分子上での提示，および抗原特異的Ｔリンパ球の刺激につなげる能力の直接の尺度である（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＵＳ ２００４／０２２８８７７）。
あるいは，いずれかの選択されたＡｃｔＡＮ１００−異種抗原組成物を利用した組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株が感染宿主細胞中で抗原融合蛋白質を発現し分泌する能力は，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染した宿主細胞の溶解物を，ＡｃｔＡＮ１００のＮ末端領域融合パートナーに特異的な抗体を用いてウエスタンブロット分析することにより測定することができる。この実施例で用いた抗ＡｃｔＡ抗体は，ＡｃｔＡの成熟Ｎ末端１８アミノ酸に対応する合成ペプチド（ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫ（配列番号１４３））に対して生じさせたウサギポリクローナル抗体であった（Ｍｏｕｒｒａｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１００３４−１００３９）。
下記の溶解バッファを用いて，哺乳動物宿主細胞中で発現され，例えば哺乳動物宿主細胞の細胞質に分泌された，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによりコードされる蛋白質を抽出した。溶解バッファは総容量５０ｍｌで調製し，２．５ｍｌの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ６．８；１０ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム；５ｍｌのグリセロール；０．１ｇのブロモフェノールブルー；および５ｍｌの１Ｍジチオスレイトールを含むものであった。抽出は１００℃で５分間加熱することにより行った。
組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株をワクチン接種したマウスにおける免疫応答は，次のようにして評価した。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンコンストラクトを接種したマウスで生成した免疫応答を評価した。簡単には，Ｂａｌｂ／ｃマウスに示されるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（５ｘ１０6ｃｆｕ）を接種した。１週間後，脾臓を摘出し，単離した脾臓細胞（２ｘ１０5個の脾臓細胞）を示されるペプチドとともにまたはペプチドなしで一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーションは，固定化した抗インターフェロン−γ抗体で被覆したウエルで行った。固定化した抗体は，分泌されたＩＦＮ−γを捕捉するよう作用し，したがって，続いて分泌されたＩＦＮ−γを測定し，ワクチンに対する免疫応答を評価することを可能とする。全体図を見るために，マウスにおいて生成した免疫応答を，インビトロ脾臓細胞ＩＦＮ−γ発現アッセイにおいて可視化した。図４８においては，ペプチドプールはヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列の全体にわたっている。図５０においては，加えたペプチドは，ＰＳＣＡプール，メソセリンプール，またはリステリア蛋白質ｐ６０のエピトープに対応する単一のペプチドのいずれかであった。ｐ６０ペプチドはｐ６０217-225（ＫＹＧＶＳＶＱＤＩ（配列番号１４４））であった。
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいては，ＰＳＣＡペプチドプールは，２８種のペプチドのプールであり，ここで，２８のペプチドはヒトＰＳＣＡの全長にわたる。各ペプチドは１５−ｍｅｒであり，隣接するペプチドは互いに１１アミノ酸で重複している。各ペプチドの濃度は１μｇ／ｍｌであった。
メソセリンペプチドプールは，ヒトメソセリンの全配列にわたる１５３種の異なるペプチドのプールであり，ここで，隣接するペプチドは１１アミノ酸で重複している。各ペプチドの濃度は１μｇ／ｍｌであった。各ペプチドは１５−ｍｅｒであった。
実施例Ｘ．前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）をコードする組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の構築および免疫原性
ＡｃｔＡＮ１００−前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に基づく融合蛋白質をコードする発現カセットを含む組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの構築および免疫原性は，本発明に記載される組成物および方法の用途のさらに別の非限定的例である。この実施例は，感染した哺乳動物宿主細胞における，抗原に特異的な細胞性免疫応答につながる，組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの異種抗原の発現および分泌を示す。
前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）は，ヒト癌に関連する細胞表面抗原である。多数のＰＳＣＡ配列およびＰＳＣＡ由来配列が下記に示される。開示されるものは以下のとおりである。ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列；コドン最適化ＰＳＣＡの核酸配列（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現について最適化されたコドン）であり，ここで，ＰＳＣＡはそのシグナル配列およびＧＰＩ−アンカー配列を欠失している；このコドン最適化核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；および標準的な免疫原性ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号：１４２））を含むよう改変されているＡｃｔＡＮ１００−ヒトＰＳＣＡ融合蛋白質のアミノ酸配列。ＧＰＩ−アンカー配列は，ＰＳＣＡのＣ末端に存在するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）による翻訳後修飾用のアミノ酸の配列を表す。
ヒトＰＳＣＡアミノ酸配列（ＳＳ＆ＧＰＩは斜体（下線）で示す）：
MKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL-（配列番号:145）
コドン最適化ＰＳＣＡ，ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩデルタＳＳ，デルタＧＰＩ（アミノ酸１８−１０１）：
ggatccGGTACAGCACTTTTATGTTATTCCTGTAAAGCACAAGTATCAAATGAAGACTGTTTACAAGTAGAAAATTGTACACAATTGGGAGAACAATGTTGGACTGCGAGAATTCGAGCCGTAGGTTTATTAACTGTAATTAGTAAAGGATGTTCGTTAAACTGTGTAGATGACTCACAAGATTATTACGTTGGCAAAAAAAATATTACATGCTGTGACACTGATTTATGCAATGCAAGTGGCGCTCACGCTCTTCAAactagt（配列番号:146）
コドン最適化ＰＳＣＡ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩデルタＳＳ，デルタＧＰＩの翻訳（ＧＳおよびＴＳはそれぞれＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ制限部位である）：
GSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTS（配列番号:147）
ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL （核酸配列に基づく推定配列，最初のアミノ酸はバリンである）（ＰＳＣＡ配列は下線で示す）：
VGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGGSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTSQLADLVLAKVLQLESIINFEKLADLVA（配列番号:148）
ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL （最初のアミノ酸はメチオニンである，最初のアミノ酸がアミノ末端アミノ酸である場合にＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで発現される実際の配列，ＰＳＣＡ配列は下線で示す）：
MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGGSGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQTSQLADLVLAKVLQLESIINFEKLADLVA (配列番号:149)
図４５はベクター，ｐＩＮＴ−ＡｃｔＡＮ１００−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬプラスミドＤＮＡの概略図を示す。このベクターは，ａｔｔＰＰ’部位を含み，これは，対応するａｔｔＢＢ’部位を含む核酸への部位特異的インテグレーションを媒介する。ベクターはまた，ａｃｔＡプロモーター，ａｃｔＡ−Ｎ１００，多数の制限部位を含むクローニング部位，およびＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１４２）配列を含む。ベクターはまた，抗生物質耐性遺伝子（ＥｒｍＣおよびＣＡＴ）をコードしており，これらはｌｏｘＰ部位により挟まれており，ここで，ｌｏｘＰ部位はＣｒｅ−リコンビナーゼにより触媒される抗生物質耐性遺伝子の排除を容易にする。例えば，ベクターが細菌のゲノム中にインテグレートされた後，および首尾よくインテグレーションした細菌を単離した後にこれらの遺伝子を排除することは有用である。
図４６は，ＰＳＣＡ分子コンストラクトの概略図をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅと重ねて表示したものである。図表は以下のドメインを含む：ａｃｔＡシグナル配列（ａｃｔＡＳＳ）；ａｃｔＡ−Ｎ１００；ＰＳＣＡシグナル配列；ＰＳＣＡ；ＰＳＣＡ ＧＰＩアンカー領域，およびＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１４２，“ＳＬ８”と略す）。図面に示されるように，“ｄｅｌｔａ ｈａｌｆ ＳＳ，ｄｅｌｔａ ｈａｌｆ ＧＰＩ”とは，この配列の半分が欠失しているＰＳＣＡＳＳおよびこの配列の半分が欠失しているＰＳＣＡＧＰＩアンカーを示す。シグナル配列のアミノ酸１−９は欠失しており，一方，ＧＰＩアンカーのアミノ酸１１２−１２３は欠失している。
以下は図４６における用語に関する。この図表では，ＡｃｔＡＳＳおよびＡｃｔＡ−Ｎ１００は別々に識別される。ＡｃｔＡ−Ｎ１００は，その中に，ＡｃｔＡシグナル配列を含む。しかし，ＡｃｔＡシグナル配列のアミノ酸配列はコンストラクト中では重複しておらず，ＡｃｔＡＳＳとＡｃｔＡ−Ｎ１００とを別々に識別しているのは便宜のためのみである。この図表においては，ＰＳＣＡとの表記法は，ＰＳＣＡ ＳＳがなく，ＰＳＣＡ ＧＰＩアンカーがない全長ＰＳＣＡを意味する。すなわち，図表においてコンストラクトが“ＳＳ”および“ＰＳＣＡ”の両方を含むと示されている場合，コンストラクト中には１つのＰＳＣＡシグナル配列のみが存在する。
図４７Ａは，樹状細胞により提示されたペプチドに対するレポーターＴ細胞株（Ｂ３Ｚ細胞）の応答を示す。左側の棒グラフは，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにコードされる異種ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質が感染した宿主樹状細胞中で発現および分泌され，次に樹状細胞によりプロセシングされてＭＨＣ分子上に提示されたことを示す。図面に示されるように，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを用いてＤＣ２．４細胞を感染させた。感染すると，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはＤＣ２．４細胞中でポリペプチドを発現し分泌した。ＤＣ２．４細胞はペプチドを提示し，ここで，提示されたペプチドはレポーターＴ細胞ハイブリドーマ株（Ｂ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ）により検出した。ＣＲＳ−１００はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方に欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である（ＬｍΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）。ＣＲＳ−１００株は異種抗原を発現するよう遺伝子工学操作されていないが，これはさらに別の変異を含むようにまたは異種抗原を発現するように改変することができる。
図４７Ａは，Ｂ３ＺＴ細胞アッセイの結果を示す。種々のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（２ｘ１０7ｃｆｕ）を１００，０００個のＤＣ２．４細胞とともに３７℃で１時間インキュベーションして，ＤＣ２．４細胞を感染させた。１時間のインキュベーションの後，１００，０００個のＢ３Ｚ細胞を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに加えた。最終容量は０．２ｍｌ／ウエルであった。混合物を一晩インキュベーションした後，遠心分離によりすべての細胞を回収し，細胞を溶解し，レポーターＢ３ＺＴ細胞株により発現されたベータ−ガラクトシダーゼをアッセイした。結果は，工程の数，例えば，細菌による発現および分泌，およびＤＣ２．４細胞によるＳＬ８ペプチドのＭＨＣクラスＩとしての提示の関数であった。ＳＬ８エピトープをコードする示されたすべての組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓについて同様の結果が認められた。
ウエスタンブロット（図４７Ｂ）は，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染したＪ７７４マクロファージ細胞がコードされる異種ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を発現し分泌することを示す。ウエスタンブロットは，Ｊ７７４細胞を組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで感染させた結果を示す。Ｊ７７４マクロファージに組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを感染させた。図面では，それぞれの組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株が識別される。Ｊ７７４細胞（１ｘ１０6細胞）をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（５０ｘ１０6ｃｆｕ）で感染多重度５０で感染させた。混合物を３０分間インキュベーションし，洗浄し，次にゲンタマイシンを補充し，３７℃で５−７時間インキュベーションした。このインキュベーションの後，発現され分泌されたＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を放出させ，かつ細菌を無傷のまま残すために，溶解バッファを用いてＪ７７４細胞を溶解した。
ウエスタンブロットは，デルタＳＳ，デルタＧＰＩコンストラクトが最も高い効率で発現され分泌されたことを示す（レーン６）。ＳＳおよびＧＰＩアンカードメインは，分泌を困難にするかもしれない疎水性の領域を含む。本発明は，ＳＳおよびＧＰＩドメインが欠失した抗原コンストラクトを提供する。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＢＨ４１９（ａｃｔＡ−Ｎ１００−全長ＰＳＣＡ−ＳＬ８）から発現されるポリペプチドの予測分子量は２４ｋＤａである。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＢＨ４７６（ａｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ１６−１００−ＳＬ８）から発現されるポリペプチドの予測分子量は２０．３ｋＤａである。
ゲルにより示されるように，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＢＨ４７６は最も高いレベルの発現および分泌を生じ，ゲルは，１９ｋＤａ分子量マーカーの近傍の分子量範囲でポリペプチドの濃い染色を示した。
図４８は，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を発現する種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株でワクチン接種されたマウスにおけるワクチン誘発性ＰＳＣＡ特異的Ｔ細胞免疫応答を示す。
示される組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株をＢａｌｂ／ｃマウスに接種した。１週間後，脾臓を摘出し，単離した脾臓細胞をＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて，示されるペプチドとともにまたはペプチドなしで，一晩インキュベーションした。インキュベーションは，ＰＳＣＡペプチドプールの存在下または非存在下で行った。その結果，全長ＰＳＣＡをコードする組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは，最も低い免疫応答を誘発したが，Ｌｍ−ＰＳＣＡ−ΔＳＳ−ΔＧＰＩ（Ｌｍ−ＰＳＣＡ−１６−１００）は最も高い免疫応答を誘発したことが示された（図４８）。これらの結果は，感染宿主細胞における組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによるＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質の発現および分泌の程度は，ワクチン接種した動物における免疫原性と直接相関することを示す。この相関は，ウエスタンブロットとＥｌｉｓｐｏｔの結果を比較することにより観察することができる。
実施例ＸＩ．ＡｃｔＡ−Ｎ１００−前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）およびＡｃｔＡ−Ｎ１００−メソセリンをコードする組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の構築および免疫原性
当該技術分野においては，特定の腫瘍は腫瘍に関連するいくつかの抗原を発現すること，およびこれらの腫瘍関連抗原の２以上に対する細胞性免疫応答を誘導することにより特定の癌ワクチンの効力を増強しうることがよく知られている。本発明は，２以上の異種抗原を発現し分泌する組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株の組成物および方法を提供し，ここで，ワクチン接種は，ワクチン接種した動物における，発現した異種抗原のそれぞれに対する細胞性免疫の誘導につながる。実施例ＸＩは，非限定的例として，２つの異なるＡｃｔＡＮ１００−異種抗原融合蛋白質をコードする組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の組成物および方法の有用性を示す。
図４９Ａおよび４９Ｂは，２つの異なるヒト癌抗原，すなわちメソセリンおよびＰＳＣＡを発現し，各抗原はＡｃｔＡ−Ｎ１００融合蛋白質の形である，組換え二価（二価）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株を示す。誘導されたＴ細胞免疫により有用性が示され，ここで，二価ワクチンでワクチン接種した動物において，それぞれの発現し分泌された抗原に対するＴ細胞免疫が誘導された。
図４９Ａの概略図は，ａｃｔＡ−Ｎ１００およびメソセリンΔＳＳΔＧＰＩの第１の融合蛋白質およびａｃｔＡ−Ｎ１００およびＰＳＣＡΔＳＳΔＧＰＩの第２の融合蛋白質を示す。図表は，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓインターナリンＢ遺伝子（ｉｎｌＢ遺伝子）を第１の融合蛋白質をコードする第１の核酸のインテグレーションの部位として同定し，Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｔＲＮＡArg座を第２の融合蛋白質をコードする第２の核酸のインテグレーションの部位として同定する。
ウエスタンブロット（図４９Ｂ）は，感染したＪ７７４マクロファージ細胞における，組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株による，両方の融合蛋白質，すなわち，ａｃｔＡ−Ｎ１００−メソセリンΔＳＳΔＧＰＩおよびａｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡΔＳＳΔＧＰＩの発現および分泌を示す。ウエスタンブロットに示されるように，組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株（Ｌｍ株ＢＨ６４８）は，感染したＪ７７４マクロファージにおいてＰＳＣＡおよびメソセリンＡｃｔＡ−Ｎ１００融合蛋白質の両方を発現し分泌した。ＡｃｔＡＮ１００−ＰＳＣＡの発現は，ａｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡΔＳＳΔＧＰＩ（レーン２）のみをコードする組換え一価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株について認められたものと類似しており，一方，ａｃｔＡＮ１００−メソセリンの発現は，ａｃｔＡ−Ｎ１００−メソセリンΔＳＳΔＧＰＩ（レーン４）のみをコードする組換え一価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株について認められたものと類似していた。
図５０は，ＡｃｔＡＮ１００−ＰＳＣＡ（ＢＨ４７６）のみをコードする組換え一価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＰＳＣＡおよびメソセリンＡｃｔＡ−Ｎ１００融合蛋白質（ＢＨ６４８）の両方をコードする組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを用いるマウスの免疫を示す。これらのコンストラクト中のＰＳＣＡおよびメソセリン配列は，デルタＳＳおよびデルタＧＰＩである。
示される組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（５ｘ１０6ｃｆｕ）ワクチン株でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。１週間後，脾臓を摘出し，単離した脾臓細胞をＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて，示されたペプチドとともにまたはペプチドなしで一晩インキュベーションした。
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイは，２つの異なるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株の一方で免疫した結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを，１つのヒト癌抗原（ＰＳＣＡ）のみをコードする組換え一価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＢＨ４７６で，または２つのヒト癌抗原（ＰＳＣＡおよびメソセリン）をコードする組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＢＨ６４８で免疫した。その結果，組換え一価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株はＰＳＣＡに対する免疫応答を刺激したが，組換え二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株はＰＳＣＡおよびメソセリンの両方に対する免疫応答を刺激したことが示された。この結果は，ＡｃｔＡＮ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を発現する組換え一価または二価Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のいずれかで免疫したマウスにより引き出されたＰＳＣＡ特異的細胞性免疫の程度は同じであることを示し，したがって，任意の所望の選択された異種抗原について適用しうるように，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−異種抗原融合蛋白質をコードする２またはそれ以上の抗原発現カセットを含む組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株の有用性が示された。
当業者には明らかなように，本発明の目的，精神および範囲を失うことなく，特定の状況，材料，組成物，プロセス，プロセスの工程に適合するよう本発明に多くの改変および変更を加えることができる。このような改変はすべて，本発明の精神および範囲から逸脱することなく，特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書に記載される特定の態様は，例示のためにのみ提供され，本発明は添付の特許請求の範囲，ならびにそのような特許請求の範囲の均等物の全範囲により限定されるべきであり，本発明は，本明細書において例示される特定の態様により限定されるものではない。
図１は６０５５ｂｐのプラスミドであるｐＩＮＴを示す。 図２は，相同組換えを媒介する７０９６プラスミドであるｐＫＳＶ７を示す。 図３は，細菌のゲノム中へのｐＫＳＶ７媒介性相同組換えの工程ないし中間体を示す。 図４は，相同アームを有する挿入物を製造する方法を示す。 図５は相同アームを有する挿入物を製造する別の方法を示す。 図６は，相同アームを有する挿入物の製造を示す。 図７は，本発明のいくつかのメソセリンコンストラクトの概要である。 図８は，種々のリステリアコンストラクトからのメソセリンの発現を示すゲルである。 図９は，多数のリステリアコンストラクトからのメソセリンの発現を示すゲルである。 図１０−１２は，スポット形成細胞（ＳＦＣ）アッセイからのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ ｇａｍｍａ）の発現を示す。 図１０−１２は，スポット形成細胞（ＳＦＣ）アッセイからのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ ｇａｍｍａ）の発現を示す。 図１０−１２は，スポット形成細胞（ＳＦＣ）アッセイからのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ ｇａｍｍａ）の発現を示す。 図１３は，腫瘍担持マウスを種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物で処置した後の肝臓の表面における腫瘍転移の数を示す。 図１４は，腫瘍担持マウスを種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物で処置した後の肝臓の表面における腫瘍転移の数を示す。 図１５は，腫瘍担持マウスを組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで処置した後の，肝臓表面上の腫瘍転移の数を示す。 図１６は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物で処理した腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存の増加を示す。 図１７は、メソセリンコンストラクトおよび種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物によるメソセリンの分泌を示す。 図１８は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。 図１９は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。 図２０は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの発現および免疫応答を示す。 図２１は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。 図２２は、種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの発現および免疫応答を示す。 図２３は、種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物でワクチン接種することにより刺激された免疫応答を示す。 図２４は，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。 図２５は、多数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物でワクチン接種した後に刺激された免疫応答を示す。 図２６は，種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの調製物により刺激されたメソセリンの分泌および免疫応答を示す。 図２７は，メソセリンの分泌および種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激された免疫応答を示す。 図２８は固定した肺の写真を示す。 図２９は固定した肺の写真からのデータのヒストグラムを示す。 図３０は腫瘍担持マウスの生存の改良における種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物の効力を示す。 図３１はメソセリンの分泌および種々の組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ調製物により刺激された免疫応答を示す。 図３２は種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ調製物からのメソセリン発現の比較を示す。 図３３は，組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種した後のメソセリン分泌および刺激された免疫応答を示す。 図３４は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの調製物で種々の用量でワクチン接種した後に刺激された免疫応答を示す。 図３５Ａは，腫瘍担持マウスを組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの種々の調製物で処置した後の，肝臓上の腫瘍転移の数を示す。 図３５Ｂは，腫瘍担持マウスを組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの種々の調製物で処置した後の，肝臓上の腫瘍転移の数を示す。 図３６は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物が腫瘍担持マウスの生存を改善する有効性を示す。 図３７は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の免疫応答を示す。 図３８は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存を示す。 図３９は，組換えＬｉｓｔｅｒｉａの種々の調製物でワクチン接種した後の腫瘍担持マウスの腫瘍に対する生存を示す。 図４０は，本発明のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す。 図４１は，本発明の別のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す。 図４２は，本発明の別のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す。 図４３は，本発明のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼとのアラインメントを示す。 図４４は，本発明の追加のファージインテグラーゼと別のファージインテグラーゼをコードする核酸とのアラインメントを示す。 図４５Ａは，プラスミドｐＩＮＴ−ＡｃｔＡＮ１００−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬを示す。 図４５Ｂは，ｐＩＮＴ−ＡｃｔＡＮ１００−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのクローニング領域を示す。 図４６は，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ重層を有するＰＳＣＡ分子コンストラクトの概略図を示す。 図４７Ａは，樹状細胞によるレポーター細胞株Ｂ３Ｚに対するペプチドの提示の結果を示す。 図４７Ｂは，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質のＪ７７４細胞における発現および分泌のウエスタンブロット分析である。 図４８は，ＡｃｔＡ−Ｎ１００−ＰＳＣＡ融合蛋白質を発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種後に刺激された免疫応答を示す。 図４９Ａは，インテグレートされたコンストラクトによりコードされる融合分子を示す。 図４９Ｂは，１価または２価のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンでＪ７７４細胞を感染させた後のＡｃｔＡ融合蛋白質の発現および分泌を示す。 図５０は，１価または２価の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンでワクチン接種後に刺激された免疫応答を示す。

Claims (17)

  1. （ａ）ａｃｔＡプロモーター；および
    （ｂ）ａｃｔＡプロモーターと動作可能なように連結されている核酸
    を含むポリヌクレオチドであって，ここで核酸は，
    （ｉ）配列番号３８の少なくとも最初の５９アミノ酸残基を含み，配列番号３８の最初の３８０アミノ酸より短く，ここで、配列番号３８の最初のアミノ酸残基はメチオニンで置換されていてもよいトランケート型ＡｃｔＡ；および
    （ｉｉ）異種抗原
    を含む融合蛋白質をコードする，
    ことを特徴とするポリヌクレオチド。
  2. トランケート型ＡｃｔＡは，配列番号３８のアミノ酸１−１００を含み，ここで，配列番号３８の最初のアミノ酸残基はメチオニンで置換されていてもよい，請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. トランケート型ＡｃｔＡは，コフィリンホモロジー領域（ＫＫＲＲ）（配列番号２３），およびリン脂質コア結合ドメイン（ＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩ）（配列番号２０）からなる群より選択される少なくとも１つのドメインの、ドメイン中の不活性化変異，ドメインの欠失，またはドメインの前でのトランケーションを含む，請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. トランケート型ＡｃｔＡは，配列ＦＰＰＰＰ（配列番号２１）を有する３つのプロリンリッチドメインの欠失，またはドメインの前でのトランケーションを含む，請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 異種抗原は，癌細胞，腫瘍，または感染性因子からのものであるかまたはそれに由来する，請求項１−４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 異種抗原はヒトメソセリンである，請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 異種抗原は，そのシグナルペプチド領域，そのＧＰＩアンカー領域，またはそのシグナルペプチドとＧＰＩアンカー領域との両方を欠失したヒトメソセリンの誘導体である，請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  8. 異種抗原はヒトＰＳＣＡである，請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  9. 異種抗原は，
    （ａ） そのシグナルペプチド領域の一部または全部；
    （ｂ） そのＧＰＩアンカー領域；または
    （ｃ） そのＧＰＩアンカー領域およびそのシグナルペプチド領域の一部または全部，
    を欠失しているヒトＰＳＣＡの誘導体である，請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  10. 請求項１−９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
  11. 請求項１−９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  12. Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである，請求項１１に記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  13. 細胞から細胞への拡散，および／または非食細胞中への侵入について減弱化されている，請求項１２に記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  14. Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はそのゲノム中に請求項１−９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む，請求項１１−１３のいずれかに記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  15. 該ポリヌクレオチドはゲノム中の病原性遺伝子中にインテグレートされており，ここで，ポリヌクレオチドのインテグレーションは：
    （ａ） 病原性遺伝子の発現を中断させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）か；または
    （ｂ） 病原性遺伝子のコーディング配列を中断させる（ｄｉｓｒｕｐｔ），
    ことを特徴とする，請求項１４に記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  16. 病原性遺伝子はｐｒｆＡ依存性遺伝子ａｃｔＡまたはｉｎｌＢである，請求項１５に記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
  17. 請求項１１−１６のいずれかに記載のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチン。
JP2008557419A 2006-03-01 2007-03-01 遺伝子工学操作されたｌｉｓｔｅｒｉａおよびその使用方法 Expired - Fee Related JP5347135B2 (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77847106P 2006-03-01 2006-03-01
US60/778,471 2006-03-01
US78457606P 2006-03-21 2006-03-21
US60/784,576 2006-03-21
US11/395,197 US7935804B2 (en) 2006-03-01 2006-03-30 Engineered Listeria and methods of use thereof
US11/395,197 2006-03-30
US11/396,216 US20070207171A1 (en) 2006-03-01 2006-03-30 Engineered listeria and methods of use thereof
US11/396,216 2006-03-30
PCT/US2007/005457 WO2007103225A2 (en) 2006-03-01 2007-03-01 Engineered listeria and methods of use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2009528065A JP2009528065A (ja) 2009-08-06
JP2009528065A5 JP2009528065A5 (ja) 2010-04-15
JP5347135B2 true JP5347135B2 (ja) 2013-11-20

Family

ID=38475431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008557419A Expired - Fee Related JP5347135B2 (ja) 2006-03-01 2007-03-01 遺伝子工学操作されたｌｉｓｔｅｒｉａおよびその使用方法

Country Status (9)

Country Link
EP (2) EP2860253B1 (ja)
JP (1) JP5347135B2 (ja)
DK (1) DK1991263T3 (ja)
ES (1) ES2532942T3 (ja)
GB (1) GB2451014B (ja)
HK (1) HK1203557A1 (ja)
PT (1) PT1991263E (ja)
SI (1) SI1991263T1 (ja)
WO (1) WO2007103225A2 (ja)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9012141B2 (en) 2000-03-27 2015-04-21 Advaxis, Inc. Compositions and methods comprising KLK3 of FOLH1 antigen
US7935804B2 (en) 2006-03-01 2011-05-03 Aduro Biotech Engineered Listeria and methods of use thereof
EP2288379A4 (en) * 2008-05-19 2012-08-08 Advaxis DOUBLE RELEASE SYSTEM FOR HETEROLOGIST ANTIGENE
US9650639B2 (en) 2008-05-19 2017-05-16 Advaxis, Inc. Dual delivery system for heterologous antigens
US9017660B2 (en) 2009-11-11 2015-04-28 Advaxis, Inc. Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of Her2/neu over-expressing tumors
US10016617B2 (en) 2009-11-11 2018-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination immuno therapy and radiotherapy for the treatment of Her-2-positive cancers
CN102947452A (zh) * 2010-05-23 2013-02-27 艾杜罗生物科技公司 使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物
WO2012138377A2 (en) 2010-10-01 2012-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania The use of listeria vaccine vectors to reverse vaccine unresponsiveness in parasitically infected individuals
JP5998370B2 (ja) * 2010-11-17 2016-09-28 アデュロ バイオテック Ｅｇｆｒｖｉｉｉに対する免疫応答を誘発する方法および組成物
CA2829960A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 John Rothman Listeria-based adjuvants
AU2013232291B8 (en) 2012-03-12 2016-07-21 Advaxis, Inc. Suppressor cell function inhibition following listeria vaccine treatment
JP2015534822A (ja) * 2012-11-06 2015-12-07 アデュロ バイオテック，インコーポレイテッド 条件的弱毒化細菌種ならびにその調製法および使用法
JP2016503655A (ja) * 2012-12-27 2016-02-08 アデュロ バイオテック，インコーポレイテッド リステリアの抗原配列の発現を容易にするシグナルペプチド融合パートナー、ならびにその調製方法およびその使用
US10925945B2 (en) 2014-10-13 2021-02-23 Providence Health & Services-Oregon Bacterial vaccines deficient in the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway and methods of preparation and use thereof
WO2016168198A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 Aduro Biotech, Inc. Epidermal growth factor receptor variant iii-mesothelin fusions and methods of using the same
US9808516B2 (en) 2015-04-13 2017-11-07 Aduro Biotech, Inc. Immunogenic fusion proteins for the treatment of cancer
CA2990864A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Cerus Corporation Cryoprecipitate compositions and methods of preparation thereof
US10799533B2 (en) 2015-10-23 2020-10-13 Cerus Corporation Plasma compositions and methods of use thereof
KR20180107102A (ko) 2015-12-16 2018-10-01 그릿스톤 온콜로지, 인코포레이티드 신생항원 동정, 제조, 및 용도
KR102497259B1 (ko) 2016-06-23 2023-02-07 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 Ｌａｇ―３ 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 약학적 용도
US11235090B2 (en) 2017-03-03 2022-02-01 Cerus Corporation Kits and methods for preparing pathogen-inactivated platelet compositions
CN111465989A (zh) 2017-10-10 2020-07-28 磨石肿瘤生物技术公司 使用热点进行的新抗原鉴别
EP3714275A4 (en) 2017-11-22 2021-10-27 Gritstone bio, Inc. REDUCTION OF JUNCTION EPITOPIC PRESENTATION FOR NEOANTIGENS
BR112020010499A2 (pt) * 2017-12-13 2020-11-24 Inovio Pharmaceuticals, Inc. vacinas de câncer de alvo de mesotelina e usos das mesmas
WO2019133929A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Cerus Corporation Systems and methods for treating biological fluids
US11883544B2 (en) 2019-06-28 2024-01-30 Cerus Corporation System and methods for implementing a biological fluid treatment device

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5783415A (en) 1991-03-29 1998-07-21 Genentech, Inc. Method of producing an IL-8 receptor polypeptide
IT1262895B (it) 1992-03-02 1996-07-22 Proteina estratta da ceppi citotossici di helicobacter pylori, gene che la esprime, uso della proteina come vaccino o diagnostico.
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
US6379943B1 (en) 1999-03-05 2002-04-30 Merck & Co., Inc. High-efficiency Cre/loxp based system for construction of adenovirus vectors
US7662396B2 (en) * 2001-03-26 2010-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for enhancing the immunogenicity of antigens
WO1997003715A1 (en) 1995-07-21 1997-02-06 The General Hospital Corporation Method and apparatus of enhancing the delivery of a pharmaceutical formulation
DE69726404T2 (de) 1996-01-05 2004-09-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mesothelinantigen, verfahren und testsatz zur targetierung
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
CA2404164A1 (en) * 2000-03-29 2001-10-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for enhancing immunogenicity of antigens
US6855320B2 (en) * 2000-03-29 2005-02-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fusion of non-hemolytic, truncated form of listeriolysin O to antigens to enhance immunogenicity
JP2004503512A (ja) 2000-06-09 2004-02-05 アメリカ合衆国 免疫複合体の抗腫瘍活性を改善し、かつ、毒性を低減するリンカーのｐｅｇ化
US7425449B2 (en) * 2002-04-30 2008-09-16 The Regents Of The University Of California Site specific Listeria integration vectors and methods for using the same
AU2004246999B2 (en) 2003-02-06 2010-06-10 Aduro Biotech, Inc., Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the listeria, and methods of use thereof
US7833775B2 (en) 2003-02-06 2010-11-16 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
AU2004281834A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Cerus Corporation Listeria-based EphA2 vaccines
US7842289B2 (en) 2003-12-24 2010-11-30 Aduro Biotech Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
AU2004314347B2 (en) * 2003-12-24 2011-05-19 Aduro Biotech, Inc. Recombinant nucleic acid molecules encoding fusion proteins comprising antigens and bacterial secretory signal polypeptides, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
CA2577306A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines
US20060135457A1 (en) * 2004-08-13 2006-06-22 Yvonne Paterson Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
DK1991263T3 (en) 2015-03-30
EP1991263B1 (en) 2014-12-24
ES2532942T3 (es) 2015-04-06
EP1991263A2 (en) 2008-11-19
WO2007103225A3 (en) 2008-03-13
HK1203557A1 (en) 2015-10-30
EP1991263B8 (en) 2015-02-25
EP2860253A2 (en) 2015-04-15
PT1991263E (pt) 2015-03-03
EP2860253A3 (en) 2015-04-22
SI1991263T1 (sl) 2015-03-31
WO2007103225A2 (en) 2007-09-13
GB2451014B (en) 2010-12-29
GB0817892D0 (en) 2008-11-05
GB2451014A (en) 2009-01-14
JP2009528065A (ja) 2009-08-06
EP2860253B1 (en) 2018-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5347135B2 (ja) 遺伝子工学操作されたｌｉｓｔｅｒｉａおよびその使用方法
US20180280489A1 (en) Engineered listeria and methods of use thereof
US20070207171A1 (en) Engineered listeria and methods of use thereof
WO2007117371A2 (en) Engineered listeria and methods of use thereof
JP5713523B2 (ja) エンドソームエスケープ能力増強組み換えｂｃｇ株類
JP5530065B2 (ja) 抗生物質耐性欠失ワクチンの作成方法
AU2013341242B2 (en) Facultatively attenuated bacterial species and methods of preparation and use thereof
KR20190082850A (ko) 반복되는 암 돌연변이를 표적화하는 면역원 조성물 및 그것의 사용 방법
KR20180026670A (ko) 맞춤형 전달 벡터-기반의 면역 요법 및 이의 용도
US20210177955A1 (en) Immunogenic heteroclitic peptides from cancer-associated proteins and methods of use thereof
AU2013341242A1 (en) Facultatively attenuated bacterial species and methods of preparation and use thereof
WO2003102168A1 (en) Attenuated listeria spp. and methods for using the same
KR20140134695A (ko) 리스테리아 백신 치료 후 억제 세포 기능 저해
KR20180100443A (ko) 개인 맞춤형 전달 벡터-기반 면역요법 및 그 사용
US20190248856A1 (en) Listeria-Based Immunogenic Compositions Comprising Wilms Tumor Protein Antigens And Methods Of Use Thereof
Sun et al. LcrV delivered via type III secretion system of live attenuated Yersinia pseudotuberculosis enhances immunogenicity against pneumonic plague
US20120121643A1 (en) Engineered listeria and methods of use thereof
US10226521B2 (en) Genetically modified Yersinia as vaccines against Yersinia species
Yin et al. Attenuated Listeria monocytogenes, a Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigen expression and delivery vector for inducing an immune response
Roeske et al. Delivery of Chicken Egg Ovalbumin to Dendritic Cells by Listeriolysin O-Secreting Vegetative Bacillus subtilis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100223

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100223

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120605

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120904

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120911

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20121001

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20121009

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121015

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20121015

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130618

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130717

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130723

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20130726

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130726

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20130726

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5347135

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees