ES2532942T3

ES2532942T3 - Listeria obtenida por ingeniería genética y métodos de uso de la misma

Info

Publication number: ES2532942T3
Application number: ES07752174.8T
Authority: ES
Inventors: Thomas W. Dubensky, Jr.; Justin Skoble; Peter M. Lauer; David N. Cook
Original assignee: Aduro Biotech Inc
Current assignee: Chinook Therapeutics Inc
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2015-04-06
Anticipated expiration: 2027-03-01
Also published as: EP1991263B1; GB2451014B; PT1991263E; GB2451014A; DK1991263T3; WO2007103225A2; EP2860253A2; EP1991263A2; HK1203557A1; SI1991263T1; EP2860253A3; GB0817892D0; JP2009528065A; JP5347135B2; EP2860253B1; WO2007103225A3; EP1991263B8

Abstract

Un polinucleótido que comprende: (a) un promotor; y (b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende: (i) un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152, y menos de los primeros 380 aminoácidos de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152; y (ii) un antígeno heterólogo.

Description

Listeria obtenida por ingeniería genética y métodos de uso de la misma

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO FEDERALMENTE PATROCINADOS

Esta invención se hizo, en parte, con apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo el Instituto Nacional de Cáncer NHI 1 K23CA 104160-01. El gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona bacterias Listeria diseñadas, útiles para estimular el sistema inmune y tratar cánceres e infecciones. También se proporcionan polinucleótidos, socios de proteínas de fusión, y vectores deintegración útiles para modificar la Listeria y otras especies bacterianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los cánceres y las infecciones pueden ser tratados al administrar reactivos que modulan el sistema inmune. Estos reactivos incluyen vacunas, citosinas, anticuerpos, y moléculas pequeñas, tales como oligodesoxinucleótidos CpG e imidazoquinolinas (véase, e.g., Becker (2005) Virus Genes 30:251-266; Schetter y Vollmer (2004) Curr. Opin:Drug Devel. 7:204-210; Majewski, et al. (2005) Int. J. Dermatol. 44:14-19), Hofmann, et al. (2005) J. Clin. Virol. 32:8691; Huber, et al. (2005) Infection 33:25-29; Carter (2001) Nature Revs. Cancer 1:118-129; Dechant y Valaerius (2001) Crit. Revs. Oncol. 39:69-77; O'Connor, et al. (2004) Neurology 62:2038-2043). Las vacunas, incluyendo las vacunas clásicas (organismos completos inactivados, extractos, o antígenos), vacunas de célula dendrítica (DC), y vacunas basadas en ácido nucleico, también son útiles para tratar los cánceres y las infecciones (véase, e.g., Robinson yAmara (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S25-S32; Plotkin (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S5-S11; Pashine, et al. (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S63-S68; Larche y Wraith (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S69-S76). Otro reactivo útil para modular el sistema inmune es Listeria monocytogenes (L. monocytogenes), y este reactivo ha probado ser útil en el tratamiento de cánceres y tumores (véase, e.g., Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:13832-13837; Brockstedt, et al (2005) Nat. Med. 11:853-860); Starks, et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427; Shen, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3987-3991).

Las cepas Listeria recombinantes se han desarrollado como vacunas contra los virus y tumores (véase, e.g. Starks, et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427; Gunn, et al. (2001) J. Immunol. 167:6471-6479; Ikonomidis, et al. (1994)

J. Exp. Med. 180:2209-2218; Mata, et al. (2001) Vaccine 19:1435-1445; Mata y Paterson (1999) J. Immunol. 163:14491456; Mata, et al. (1998) J. Immunol. 161:2985-2993; Friedman, et al. (2000) J. Virol. 74:9987-9993; Soussi, et al. (2002) Vaccine 20:2702-2712; Saklani-Jusforgues, et al. (2003) Infect. Immun. 71:1083-1090; Soussi, et al. (2000) Infect. Immunity 68:1498-1506; Tvinnereim, et al. (2002) Infect. Immunity 70:153-162; Rayevskaya, et al. (2002) J. Virol. 76:918-922; Frankel, et al. (l995) J. Immunol. 55:4775-4782; Jensen; et al. (1997) J. Virol. 71:8467-8474; Jensen, et al. (1997) Immunol. Rev. 158:147-157; Lin, et al. (2002) Int. J Cancer 102:629-637; Peters, et al. (2003) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:243-253; Peters, et al. (2003) J. Immunol. 170:5176-5187; Paterson (2003) Immunol. Res. 27:451-462; Paterson y Johnson (2004) Expert Rev. Vaccines 3:S119-S134; Ochsenbein, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9293-9298; Hess, et al. (2000) Adv. Immunol. 75:1-88).

La L. monocytogenes tiene un tropismo natural para el hígado y bazo y, en cierto grado, otros tejidos tales como los intestinos delgados (véase, e.g., Dussurget, et al. (2004) Ann. Rev. Microbiol. 58:587-610; Gouin, et al. (2005) Curr. Opin. Microbiol. 8:35-45; Cossart (2002) Int. J. Med. Microbiol. 291:401-409; Vazquez-Boland, et al. (2001) Clin. Microbiol. Rev. 14:584-640; Schluter, et al. (1999) Immunobiol. 201:188-195). Cuando la bacteria reside en los intestinos, el paso al flujo sanguíneo se media por las proteínas listeriales, tales como ActA e internalina A (véase, e.g., Manohar, et al. (2001) Infection Immunity 69:3542-3549; Lecuit, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6152-6157; Lecuit y Cossart (2002) Trends Mol. Med. 8:537-542). Una vez que la bacteria entra a una célula huésped, el ciclo de vida de L. monocytogenes incluye el escape desde el fagolisosoma y hacia el citosol. Este ciclo de vida contrasta con el de Mycobacterium, que permanece dentro del fagolisosoma (véase, e.g., Clemens, et al. (2002) Infection Immunity 70:5800-5807; Schluter, et al. (1998) Infect. Immunity 66:5930-5938; Gutierrez, et al. (2004) Cell 119:753-766). El escape de L. monocytogenes del fagolisosoma se media por las proteínas listeriales, tales como listeriolisina (LLO), PI-PLC, y PC-PLC (véase Portnoy, et al. (2002) J. Cell Biol. 158:409-414). WO 2004/110481 y WO 2005/071088 se refieren a las vacunas contra el cáncer en base a las cepas de Listeria atenuadas.

Las vacunas para tratar los cánceres o las infecciones frecuentemente son ineficaces debido a la falta de reactivos adecuados. La presente invención cumple esta necesidad al proporcionar polinucleótidos, socios de proteína

de fusión, plásmidos y vacunas bacterianas, útiles para mejorar la expresión o procesamiento inmune de antígenos, y para incrementar la supervivencia a los cánceres e infecciones.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que la administración de Listeria atenuada a un mamífero que tiene un tumor da como resultado la supervivencia mejorada, en donde la Listeria se diseña para contener un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión basada en ActA unida a un antígeno tumoral.

La presente invención de esta manera proporciona un polinucleótido que comprende: (a) un promotor; y (b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende: (i) un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos aminoácidos de SEQ ID NO: 38

o SEQ ID NO: 152; y (ii) un antígeno heterólogo. La invención además se define por las reivindicaciones acompañantes. En algunas modalidades, el promotor es un promotor bacteriano (e.g., un promotor Listerial). En algunas modalidades, el promotor es un promotor ActA. El ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, y menos de los primeros 380 aminoácidos de ActA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ActA modificado comprende al menos aproximadamente los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En otras modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, y menos de los primeros 380 aminoácidos de ActA. En las modalidades todavía adicionales, el ActA modificado comprende al menos los primeros 85 aminoácidos de ActA y menos de los primeros 125 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de aminoácidos 1-100 de ActA. El antígeno heterólogo puede ser no-Listerial. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es un antígenotumoral o se deriva de un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo). En algunas modalidades, el antígeno heterólogo no comprende un péptido antigénico EphA2. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se optimiza por codón para la expresión en Listeria. La invención proporciona plásmidos y células que comprenden el polinucleótido. La invención además proporciona una bacteria Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) que comprende el polinucleótido, así como las vacunas quecomprenden la Listeria. La bacteria Listeria puede atenuarse (e.g., un mutante de supresión actA o un mutante de inserción actA). En ciertas modalidades, la bacteria puede comprender una mutación en atenuación en actA y/o en inlB. En algunas modalidades, la Listeria comprende el polinucleótido en su genoma. En algunas modalidades, el polinucleótido se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma Listerial. En algunas modalidades, un polinucleótido (o ácido nucleico) se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma de la Listeria, en donde la integración del polinucleótido (a) interrumpe la expresión del gen de virulencia y/o (b) interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, el gen de virulencia es dependiente de prfA. En otras modalidades, el gen de virulencia es independiente de prfA. En algunas modalidades, el ácido nucleico o el polinucleótido se ha integrado en el genoma de la Listeria en el sitio actA y/o sitio inlB. En algunas modalidades, la Listeria comprende un plásmido que comprende el polinucleótido. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas e inmunogénicas que comprenden la Listeria, y su uso en los métodos para estimular las respuestas inmunes al antígeno heterólogo en un mamífero (e.g., un humano), que comprenden administrar una cantidad eficaz de la Listeria (o una cantidad eficaz de una composición que comprende la Listeria) al mamífero. Por ejemplo, la invención también se refiere a los métodos para estimular las respuestas inmunes al antígeno de, o derivado de, un agente infeccioso o cancerígeno, que comprenden administrar una cantidad eficaz de la Listeria (o una composición que comprende la Listeria) a un mamífero que tiene el agente infeccioso o cancerígeno, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope con o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, agente infeccioso o cancerígeno. En algunas modalidades, la inclusión de la secuencia de ActA modificado en la proteína de fusión mejora la inmunogenicidad de la Listeria que comprende el polinucleótido (e.g., en relación a la inmunogenicidad de Listeria que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende el antígeno heterólogo y una secuencia líder y/ secuencia de señal de no ActA, en lugar del ActA modificado). En algunas modalidades, la inclusión de la secuencia de ActA modificado en la proteína de fusión mejora la expresión y/o secreción del antígeno heterólogo en Listeria (e.g., en relación a la expresión y/o secreción en Listeria del antígeno heterólogo fusionado a una secuencia líder y/o secuencia de señal de no ActA en lugar de ActA modificado).

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA modificado (e.g., actA-N-100), unido operativamente y en estructura con, un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende al menos los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico codifica los aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el polinucleótido es genómico. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser integrado en el gen actA o inlB. En algunas modalidades alternativas, el polinucleótido se basa en plásmido. En algunas modalidades, el polinucleótido se une operativamente con uno o más de los siguientes:

(a) un promotor actA; o (b) un promotor bacteriano que es un promotor no actA. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina (e.g., mesotelina humana). La invención además proporciona una bacteria Listeria e.g., Listeria monocytogenes) que comprende el polinucleótido, así como las vacunas que comprenden la Listeria. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo). La invención también se refiere a los métodos para estimular las respuestas inmunes a un antígeno de, o derivado de, un agente cancerígeno (e.g., una célula precancerígena o tumoral) o infeccioso (e.g., un virus, bacteria patogénica, u organismo parasitario), que comprende administrar la Listeria a un mamífero que tiene el agente infeccioso o cancerígeno, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, agente infeccioso o cancerígeno. En algunas modalidades de los métodos, la estimulación es en relación a la respuesta inmune sin administrar la Listeria. En algunas modalidades de los métodos, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, la célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un actA modificado, en donde el actA modificado comprende (a) aminoácidos 1-59 de actA, (b) una mutación en inactivación en, supresión de, o truncación previo a, al menos un dominio para la regulación mediada por actA del citoesqueleto de célula huésped, en donde el primer ácido nucleico se une operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el domino es la región de homología de cofilina (KKRR (SEQ ID NO:23)). En algunas modalidades, el dominio es el dominio de unión de núcleo de fosfolípido (KVFKKIKDAGKWVRDKI (SEQ ID NO:20)). En algunas modalidades, el al menos un dominio comprende todos los cuatro dominios ricos en prolina (FPPPP (SEQ ID NO:21), FPPPP (SEQ ID NO:21), FPPPP (SEQ ID NO:2l), FPPIP (SEQ ID NO:22)) de ActA. En algunas modalidades, el actA modificado es actA-N100. En algunas modalidades, el polinucleótido es genómico. En algunas modalidades, el polinucleótido es no genómico. En algunas modalidades, el polinucleótido se une operativamente con uno o más de los siguientes: (a) un promotor actA; o (b) un promotor bacteriano (e.g., listerial) que es un promotor no actA. La invención además proporciona una bacteria Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) que comprende el polinucleótido, así como las vacunas que comprenden la Listeria. En algunas modalidades, la Listeria comprende una mutación en atenuación en actA y/o inlB. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo). La invención también proporciona estas Listerias para su uso en los métodos para estimular las respuestas inmunes a un antígeno de, o derivado de, un agente infeccioso o cancerígeno, que comprende administrar la Listeria a un mamífero que tiene el agente infeccioso o cancerígeno, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope con o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, agente infeccioso o cancerígeno. En algunas modalidades, la estimulación es en relación a la respuesta inmune sin administrar la Listeria. En algunas modalidades, el cáncer comprende un tumor o célula pre-cancerígena. En algunas modalidades, el agente infeccioso comprende un virus, bacteria patogénica, u organismo parasitario. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana. En algunas modalidades, la inclusión de la secuencia de ActA modificado en el polinucleótido mejora la expresión y/o secreción del antígeno heterólogo en Listeria. En algunas modalidades, la inclusión de la secuencia de ActA modificado en el polinucleótido mejora la

En todavía otro aspecto, esta descripción proporciona un plásmido que comprende un primer ácido nucleico que codifica una integrasa fago, un segundo ácido nucleico que codifica un sitio de unión de fago (sitio attPP’), y un tercer ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo o ácido nucleico regulador, en donde el plásmido es útil para mediar la integración específica por sitio del ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo en un sitio de unión

bacteriana (sitio attBB’) en un genoma bacteriano que es compatible con el sitio attPP’ del plásmido. En algunas modalidades, cada uno de los ácidos nucleicos es derivable de L. innocua 0071, cada uno de los ácidos nucleicos es derivable de L. innocua 1765, cada uno de los ácidos nucleicos es derivable de L. innocua 2601, o cada uno de los ácidos nucleicos es derivable de L. monocytogenes f6854_2703. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico codifica una integrasa phiC31. En algunas modalidades, el plásmido es la secuencia de polinucleótidos de pINT; o un polinucleótido hibridizable bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que codifica pINT, en donde el polinucleótido que es hibridizable es capaz de mediar la integración específica de sitio en el mismo sitio de unión bacteriana (attBB’) en un genoma bacteriano como aquel utilizado por pINT. En algunas modalidades, el genoma bacteriano es de una Listeria, Bacillus anthracis, o Francisella tularensis. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el ácido nucleico regulador es un sitio de unión bacteriana (attBB’). En algunas modalidades, el plásmido además comprende un cuarto ácido nucleico que codifica un primer sitio lox, un quinto ácido nucleico que codifica un segundo sitio lox, y un sexto ácido nucleico que codifica un marcador de selección, en donde el primer sitio lox y el segundo sitio lox se unen operativamente con el sexto ácido nucleico, y en donde los sitios lox operativamente unidos son útiles para mediar la excisión catalizada por recombinasa Cre del sexto ácido nucleico. En algunas modalidades, el primer sitio lox es un sitio loxP y el segundo sitio lox es un sitio loxP. En algunas modalidades, el plásmido además comprende un sitio de unión bacteriana no compatible (attBB’), en donde el sitio attBB’ no compatible no es compatible con el sitio de unión de fago (attPP’). En algunas modalidades, el plásmido además comprende un primer promotor operativamente unido con el primer ácido nucleico, y un segundo promotor operativamente unido con el tercer ácido nucleico. Esta descripción además proporciona un método para modificar un genoma bacteriano, que comprende transfectar la bacteria con el plásmido, y permitir la integración catalizada por integrasa del tercer ácido nucleico en el genoma bacteriano bajo condiciones adecuadas para la integración. En algunas modalidades del método, la bacteria es Listeria, Bacillus anthracis, o Francisella tularensis.

Esta descripción además proporciona un plásmido que comprende: (a) un primer ácido nucleico que codifica una primera región de homología a un genoma bacteriano, (b) un segundo ácido nucleico que codifica una segunda región de homología al genoma bacteriana, y (c) un tercer ácido nucleico que comprende un sitio de unión bacteriana (attBB’), en donde el tercer ácido nucleico se flanquea por los ácidos nucleicos, primero y segundo, en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico se unen operativamente entre sí y son capaces de mediar la integración homóloga del tercer ácido nucleico en el genoma bacteriano. En algunas modalidades, el sitio de unión bacteriana (attBB’) comprende el attBB’ de: tARN Arg-attBB’ listerial; comK attBB’ listerial; Listeria innocua 0071; Listeria innocua 1231; Listeria innocua 1765; Listeria innocua 2610; o Listeria monocytogenes f6854_2703; o phiC31. En algunas modalidades, el genoma es de un Listeria, Bacillus anthracis,o Francisella tularensis. En algunas modalidades, el tercer ácido nucleico codifica un marcador de selección flanqueado por un primer sitio lox y un segundo sitio lox, en donde los sitios lox se reconocen como sustratos por recombinasa Cre y permiten la excisión catalizada por recombinasa Cre del tercer ácido nucleico, y en donde el marcador de selección es útil para detectar la integración del tercer ácido nucleico en el genoma bacteriano. En algunas modalidades, el primer sitio lox es un sitio loxP, y el segundo sitio lox es un sitio loxP. En algunas modalidades, el tercer ácido nucleico comprende un gen de resistencia antibiótica. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico es homólogo a una primera región de un gen de factor de virulencia y el segundo ácido nucleico es homólogo a una segunda región del gen de factor de virulencia, en donde las regiones, primera y segunda, del gen de factor de virulencia son distintas entre sí y no se superponen entre sí. En algunas modalidades, la primera región del gen de factor de virulencia colinda o contacta de manera covalente la segunda región del gen de factor de virulencia. En otras modalidades, la primera región del gen de factor de virulencia no se encuentra en contacto covalente con, y no colinda de manera covalente, la segunda región del gen de factor de virulencia. Esta descripción además proporciona la bacteria modificada por la integración del plásmido. En algunas modalidades, la integración se encuentra en una región del genoma que es necesaria para mediar el crecimiento o dispersión. En otras modalidades, la integración se encuentra en una región del genoma que no es necesaria para mediar el crecimiento o dispersión.

Todavía en otro aspecto, esta descripción proporciona una bacteria en donde el genoma comprende un polinucleótido que contiene dos sitios de unión de recombinasa heteróloga operativamente unidos que flanquean un primer ácido nucleico, en donde los dos sitios son: (a) dos sitios lox; o (b) dos sitios Frt, y en donde el ácido nucleico flanqueado por los dos sitios lox es extraíble por la recombinasa Cre, y en donde el ácido nucleico flanqueado por los dos sitios Frt es extraíble por la recombinasa FLP. En algunas modalidades, los dos sitios lox son ambos sitios loxP. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico codifica un marcador de selección o un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico codifica un gen de resistencia antibiótica. En algunas modalidades, la bacteria es Listeria, Bacillus anthracis, o Francisella tularensis. En algunas modalidades, el polinucleótido además comprende un segundo ácido nucleico, en donde el segundo ácido nucleico no se flanquea por, y no se une

operativamente con, el primer y segundo sitio de unión de recombinasa heteróloga. En algunas modalidades, el segundo ácido nucleico codifica uno o ambos de: antígeno heterólogo; o un sitio de unión bacteriana (attBB’). En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. Esta descripción además proporciona un método para extraer el primer ácido nucleico del genoma bacteriano, quecomprende contactar el genoma con recombinasa Cre o recombinasa FLP, y permitir que la recombinasa catalice la excisión del primer ácido nucleico, bajo condiciones que permiten o facilitan la excisión: (a) en donde el primer ácido nucleico se flanquea por los sitios lox y la recombinasa es recombinasa Cre; o (b) en donde el primer ácido nucleico se flanquea por sitios Frt y la recombinasa es recombinasa FLP. En algunas modalidades, la recombinasa se expresa transitoriamente en la bacteria.

En otro aspecto, esta descripción proporciona Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) en la cual el genoma comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el genoma mediante recombinación específica por sitio o recombinación heteróloga. En algunas modalidades, el sitio de integración en el genoma es el sitio tARNArg. En algunas modalidades, la presencia del ácido nucleico en el genoma atenúa la Listeria. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el sitio de un gen de virulencia. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el sitio actA. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el sitio inlB. En algunas modalidades, el genoma de la Listeria comprende un primer ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo que se ha integrado en un primer sitio (e.g., el sitio actA) y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno heterólogo que se ha integrado en un segundo sitio (e.g., el sitio inlB). Los antígenos heterólogos,primero y segundo, pueden ser idénticos entre sí o diferentes. En algunas modalidades, los antígenos heterólogos, primero y segundo, difieren entre sí, pero se derivan del mismo antígeno tumoral o antígeno de agente infeccioso. En algunas modalidades, los antígenos heterólogos, primero y segundo, son cada uno un fragmento diferente de un antígeno derivado de una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el ácido nucleico integrado codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. En algunas modalidades, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, o al menos siete secuencias de ácido nucleico que codifican los antígenos heterólogos se han integrado en el genoma Listerial.

En otro aspecto, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que comprende un genoma, en donde el genoma comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, en donde el ácido nucleico se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma. En algunas modalidades, la Listeria se atenúa por la interrupción de la expresión del gen de virulencia o la interrupción de una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, la integración del polinucleótido interrumpe la expresión del gen de virulencia o interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, todo o parte del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, nada del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, la integración atenúa la Listeria. En algunas modalidades, el gen de virulencia es dependiente de prfA. En otras modalidades, el gen de virulencia es independiente de prfA. En algunas modalidades, el gen de virulencia es necesario para la dispersión o crecimiento mediado de la bacteria. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. En algunas modalidades, la bacteria Listeria es Listeria monocytogenes. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es mesotelina (e.g., mesotelina humana), o derivado de mesotelina. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. En algunas modalidades, la bacteria comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno heterólogo que se ha integrado en un segundo gen de virulencia. Esta descripción proporciona vacunas que comprenden la bacteria Listeria. Esta descripción además proporciona un método para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de la bacteria Listeria,

o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, al mamífero.

En todavía otro aspecto, esta descripción proporciona un método para producir una bacteria Listeria (e.g., una bacteria atenuada), que comprende integrar un polinucleótido en un gen de virulencia en el genoma de la bacteria Listeria, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, la Listeria se atenúa por la interrupción de expresión del gen de virulencia o la interrupción de la secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, la integración del polinucleótido interrumpe la expresión del gen de virulencia o interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, la integración del polinucleótido da como resultado tanto (a) como (b). En algunas modalidades, el método produce una bacteria Listeria para uso en una vacuna. En algunas modalidades, el polinucleótido se integra en el gen de virulencia mediante recombinación homóloga. En algunas modalidades, el polinucleótido se integra mediante recombinación específica de sitio. En algunas modalidades, todo o parte del gen de virulencia se suprime

durante la integración del polinucleótido. En otras modalidades, nada del gen de virulencia se suprime durante la integración. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es mesotelina (e.g., mesotelina humana), o derivado de mesotelina. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. Esta descripción además proporciona una bacteria Listeria producida por el método, y las composiciones de vacuna que comprenden la bacteria. Esta descripción también proporciona una bacteria Listeria que tiene las propiedades de una bacteria Listeria producida por el método, así como las vacunas que comprenden la bacteria. Los métodos para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprenden administrar una cantidad eficaz de la bacteria Listeria, o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, también se proporcionan.

En un aspecto adicional, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que comprende un genoma, en donde el genoma comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo,en donde el ácido nucleico se ha integrado en un gen necesario para mediar el crecimiento o dispersión. En algunas modalidades, la integración del polinucleótido atenúa la Listeria para el crecimiento o dispersión. En algunas modalidades, parte o todo el gen se ha suprimido. En algunas modalidades, nada del gen se ha suprimido. En algunas modalidades, el gen es actA. En algunas modalidades, la bacteria Listeria es Listeria monocytogenes. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es mesotelina (e.g., mesotelina humana), o derivado de mesotelina. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. Esta descripción proporciona vacunas que comprenden la bacteria Listeria. Esta descripción además proporciona un método para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de la bacteria Listeria, o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, al mamífero.

En todavía otro aspecto, esta descripción proporciona un método para producir una bacteria Listeria (e.g., una bacteria atenuada), que comprende integrar un polinucleótido en un gen en el genoma de la bacteria Listeria que es necesario para medir el crecimiento o dispersión, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, la integración del polinucleótido atenúa la Listeria para el crecimiento o dispersión. En algunas modalidades, el método produce una bacteria Listeria para uso en una vacuna. En algunas modalidades, el polinucleótido se integra en el gen mediante recombinación homóloga. En algunas modalidades, el polinucleótido se integra mediante recombinación específica de sitio. En algunas modalidades, todo o parte del gen necesario para mediar el crecimiento o dispersión se suprime durante la integración. En algunas modalidades, el gen necesario para mediar el crecimiento o dispersión es actA. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es mesotelina (e.g., mesotelina humana), o se deriva de mesotelina. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. Esta descripción además proporciona una bacteria Listeria producida por el método, y las composiciones de vacuna que comprenden la bacteria. Esta descripción también proporciona una bacteria Listeria que tiene las propiedades de una bacteria Listeria producida por el método, así como las vacunas que comprenden la bacteria. Los métodos para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprenden administrar una cantidad eficaz de la bacteria Listeria, o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, también se proporcionan.

En un aspecto adicional, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que comprende un genoma, en donde el genoma comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo,en donde el ácido nucleico se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma y la bacteria se atenúa por interrupción de expresión del gen de virulencia o interrupción de una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, todo o parte del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, nada del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. En algunas modalidades, la Listeria es Listeria monocytogenes. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, la bacteria además comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno heterólogo que se ha integrado en un segundo gen de virulencia. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. Las vacunas que comprenden la bacteria Listeria además se proporcionan, así como los métodos para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprende administrar unacantidad eficaz de la bacteria Listeria o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, al mamífero.

En todavía otro aspecto, esta descripción proporciona un método para producir una bacteria Listeria para uso en una vacuna, que comprende: integrar un polinucleótido en un gen de virulencia en el genoma de la bacteria Listeria, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo y en donde la bacteria se atenúa por interrupción de la expresión del gen de virulencia o la interrupción de una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, el polinucleótido se integra en el gen de virulencia mediante recombinación homóloga. En algunas modalidades, todo o parte del gen de virulencia se suprime durante la integración del polinucleótido en el gen de virulencia. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. Esta descripción además proporciona una bacteria Listeria producida por el método.

En otro aspecto, esta descripción proporciona un método para producir una bacteria Listeria para uso en una vacuna, que comprende integrar un polinucleótido en un gen de virulencia en el genoma de la bacteria Listeria, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo y en donde la bacteria Listeria es o se ha atenuado por mutación del gen de virulencia. Esta descripción además proporciona una bacteria Listeria producida por este método.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, la Listeria se atenúa con respecto a la dispersión de célula a célula y/o entrada en las células no fagocíticas. Por ejemplo, en algunas modalidades, la Listeria comprende una mutación en atenuación en actA y/o inlB.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, el polinucleótido y/o el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende el antígeno heterólogo se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, el antígeno heterólogo es antígeno de célula germinal de próstata (PSCA) (e.g., PSCA humano), o un antígeno derivado de PSCA.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, el antígeno heterólogo es mesotelina, o un antígeno derivado de mesotelina.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, el polinucleótido comprende dos secuencias de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica una proteína de fusión que comprende un antígeno heterólogo. En las modalidades adicionales, el polinucleótido comprende tres ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica una proteína de fusión que comprende un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende cuatro o más ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica una proteína de fusión que comprende un antígeno heterólogo.

En otro aspecto, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que comprende un genoma, en donde el genoma comprende: (a) un primer polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno heterólogo, en donde el primer polinucleótido se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma y en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo; y (b) un segundo polinucleótido que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno heterólogo, en donde el segundo polinucleótido se ha integrado en el genoma. En algunas modalidades, la bacteria se atenúa por la interrupción de la expresión del gen de virulencia o por la interrupción de una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, la integración del primer polinucleótido interrumpe la expresión del gen de virulencia o interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, todo o parte del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, nada del gen de virulencia se ha suprimido. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. En algunas modalidades, la Listeria es Listeria monocytogenes. En algunas modalidades, los antígenos heterólogos, primero y segundo, son de o se derivan de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el primer y/o segundo antígeno heterólogo es mesotelina, y el antígeno derivado de mesotelina, PSCA, o un antígeno derivado de PSCA (e.g., el primer antígeno heterólogo puede ser mesotelina, y el segundo heterólogo puede ser PSCA). En algunas modalidades, el segundo polinucleótido se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma y la Listeria puede atenuarse por la interrupción de la expresión del gen de virulencia o la interrupción de una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido se ha integrado en actA o inlB. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido se ha integrado en una región del genoma que no comprende un gen de virulencia. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido se ha integrado en un sitio tARNArg. En algunas modalidades, el primer y/o segundo ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado (e.g., ActA-N100) y el primer o segundo antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el primer y/o segundo ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal y el primer o segundo antígeno heterólogo, en donde la secuencia de señal es una

secuencia de señal ActA, secuencia de señal p60, una secuencia de señal LLO, una secuencia de señal BaPa, una secuencia de señal Llusp45, o una secuencia de señal PhoD. Las vacunas que comprenden la bacteria Listeria, además se proporcionan. Los métodos para estimular una respuesta inmune al antígeno heterólogo en un mamífero, que comprenden administrar una cantidad eficaz de la bacteria Listeria, o una cantidad eficaz de una composición que comprende la bacteria Listeria, al mamífero, también se proporcionan. En algunas modalidades, el genoma de la Listeria además comprende un tercer polinucleótido que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un tercer antígeno heterólogo, en donde el tercer polinucleótido también se ha integrado en el genoma.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, los polinucleótidos que comprenden el (los) ácido (s) nucleico (s) que codifica (n) un (os) antígeno (s) heterólogo (s) o la (s) proteína (s) de fusión que comprende (n) un antígeno heterólogo que se integran en una región del genoma además comprenden un promotor y/u otras secuencias reguladoras necesarias para la expresión de los ácidos nucleicos una vez integrados. En algunas modalidades alternativas, los polinucleótidos que comprenden los ácidos nucleicos que codifican el antígeno heterólogo o la proteína de fusión que comprende elantígeno heterólogo se integran en una región del genoma de manera que el ácido nucleico se une operativamente a un promotor y/o señal secretora ya presente en el genoma Listeria. En algunas modalidades, los polinucleótidos que se insertan en los genes de virulencia se insertan en las regiones codificadoras. En algunas otras modalidades, los polinucleótidos se insertan en regiones no codificadoras de los genes de virulencia.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados, así como otros aspectos descritos en la presente, los polinucleótidos integrados en el genoma Listeria se integran por medio de la recombinación homóloga. En algunas modalidades alternativas, los polinucleótidos se integran en el genoma Listeria por medio de la integración específica de sitio.

En algunas modalidades, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que contiene un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica una pareja de proteína de fusión, unido operativamente y en marco con y un segundo ácido nucleico que codifica mesotelina humana, o un derivado de la misma. El primer ácido nucleico puede codificar, e.g., LLO62 (no codón optimizado); LLO26 (codón optimizado); LLO441 (no codón optimizado); LLO441 (codón optimizado); LLO de longitud completa (no codón optimizado); LLO de longitud completa (codón optimizado); secuencia secretora BaPA; secuencia secretora B. subtilis phoD (Bs phoD SS); p60 (no codón optimizado); p60 (codón optimizado); actA (no codón optimizado); actA (codón optimizado); actA-N100 (no codón optimizado); actA-N100 (codón optimizado); actA (A30R). El segundo ácido nucleico puede codificar la mesotelina humana de longitud completa; la mesotelina humana suprimida en su secuencia de señal; la mesotelina humana suprimida en su anclaje GPI; o mesotelina humana suprimida tanto en la secuencia de señal como en el anclaje GPI, en donde se proporcionan las versiones de codón optimizado y no codón optimizado de mesotelina. En otro aspecto,la presente invención proporciona el polinucleótido anterior integrado en la posición del gen inlB, gen actA, gen hly, en donde la integración puede ser mediada por recombinación homóloga, y en donde la integración puede estar opcionalmente con unión operable con el promotor del gen inlB, actA, o hly. En todavía otro aspecto, esta descripción proporciona modalidades listeriales en donde el polinucleótido anterior se integra en el genoma listerial a manera de integración específica de sitio, e.g., en el sitio tARNArg. Cada una de las modalidades individuales descritas en la presente, opcionalmente, comprende una Listeria que comprende un gen pfrA constitutivamente activo (prfA*). Las construcciones listeriales no se limitan a los polinucleótidos unidos operativamente con un promotor actA o promotor hly. Lo que también se comprende son los enlaces operables con otros promotores bacterianos, promotores sintéticos, promotores bacteriovirus, y combinaciones de dos o más promotores.

En algunas modalidades, el antígeno heterólogo codificado por un ácido nucleico en los polinucleótidos, bacteria Listeria, y/o vacunas descritas anteriormente, o en cualquier parte en la presente, no comprende un péptido antigénico EphA2. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo codificado por un ácido nucleico en los polinucleótidos, bacteria Listeria, y/o vacunas, no comprende el fragmento antigénico o EphA2 de longitud completa, análogo o derivado del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 describe pINT, un plásmido 6055 bp. Una vez que pINT se integra en un genoma listerial, la Listeria puede aislarse por resistencia de eritromicina (ErmC), seguido por el tratamiento con recombinasa Cre para remover una región del plásmido que codifica los genes de resistencia antibiótica (CAT y ErmC).

La Figura 2 muestra pKS7, un plásmido 7096 que media la recombinación homóloga.

La Figura 3 muestra las etapas, o intermediarios, que se originan con la recombinación homóloga mediada por pKSV7 en un genoma bacteriano.

La Figura 4 describe un método para preparar un inserto que lleva brazos homólogos, en donde el inserto que lleva los brazos homólogos se coloca en pKSV7. La región flanqueada por loxP se pone entre paréntesis por los brazos homólogos. Después de la integración en un genoma bacteriano, la exposición transitoria a la recombinasa Cre cataliza la remoción del gen de resistencia antibiótica. La integración ocurre con la supresión de parte del genoma, correspondiente a la región entre las áreas que nivelan los brazos heterólogos.

La Figura 5 muestra un método alternativo para preparar un inserto que lleva los brazos homólogos, en donde el inserto que lleva los brazos homólogos se coloca en pKSV7. La región flanqueada por loxP reside fuera de los brazos homólogos. Después de la integración en un genoma bacteriano, la exposición transitoria a la recombinasa Cre cataliza la remoción del gen de resistencia antibiótica (u otro marcador de selección). La integración ocurre con la supresión de parte el genoma, correspondiente a la región entre las áreas que nivelan los brazos homólogos.

La Figura 6 describe la preparación de un inserto que lleva los brazos homólogos, en donde el inserto que lleva los brazos homólogos se coloca en pKSV7. La región flanqueada por loxP reside entre los brazos heterólogos. En los vectores preparados de acuerdo con esta figura, la integración no se sigue por la supresión de cualquier región correspondiente del genoma.

La Figura 7 es un esquema que describe algunas de las construcciones de mesotelina de la presente invención, incluyendo, e.g., cualquiera de los promotores, secuencias secretoras, socios de proteína de fusión, y así sucesivamente.

La Figura 8 es gel que muestra la expresión de mesotelina de varias construcciones listeriales.

La Figura 9 es un gel que muestra la exposición de mesotelina de un número de construcciones listeriales.

Las Figuras 10-12 muestran la expresión de la interferona gamma (IFNgamma) de los ensayos de la célula formadora de manchas (SFC), y comparan las respuestas inmunes en donde los ratones habían sido vacunados con varios números (unidades formadoras de colonia; c.f.u.) de L. monocytogenes diseñados.

La Figura 13 describe los números de metástasis tumoral en las superficies de los hígados, después de tratar los ratones que llevan el tumor con diversas preparaciones de L. monocytogenes recombinante. La Figura 13 revela los datos puros (fotografías de los hígados fijos).

La Figura 14 también descibe los números de metástasis tumoral en las superficies de los hígados, después del tratamiento de ratones que llevan el tumor con varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

Las Figuras 15 A-G además describen los números de metástasis tumoral en las superficies de los hígados, después de tratar los ratones que llevan el tumor con L. monocytogenes recombinante.

La Figura 16 demuestra la supervivencia incrementada a los tumores por los ratones que llevan el tumor con el tratamiento con varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 17 ilustra las construcciones de mesotelina y secreción de mesotelina por varias preparaciones de

L. monocytogenes recombinante.

La Figura 18 describe la secreción de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 19 muestra la secreción de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 20 revela además la expresión de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 21 ilustra adicionalmente la secreción de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 22 demuestra la expresión de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 23 describe las respuestas inmunes estimuladas por vacunación con varias preparaciones de Listeria recombinante.

La Figura 24 además describe la secreción de mesotelina y respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 25 revela las respuestas inmunes estimuladas después de la vacunación con un número de preparaciones de Listeria recombinante.

La Figura 26 adicionalmente describe la secreción de mesotelina y las respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante. hMeso6: L. monocytogenes actAinlB que codifica el promotor actA; actA-N100-hMeso SSGPI; integrado en sitio actA. hMeso25: L. monocytogenes actAinlB que codifica el promotor actA; actA-N100-hMeso SSGPI; integrado en sitio inlB.

La Figura 27 además demuestra la secreción de mesotelina y las respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 28 muestra las fotografías de los pulmones fijos.

La Figura 29 muestra un histograma de datos de las fotografías de pulmón fijo.

La Figura 30 revela la efectividad de varias preparaciones de Listeria recombinante en la mejora de la supervivencia de los ratones que llevan el tumor.

La Figura 31 describe la secreción de mesotelina y las respuestas inmunes estimuladas por varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante.

La Figura 32 compara la expresión de mesotelina de varias preparaciones de Listeria recombinante.

La Figura 33 representa la secreción de mesotelina y las respuestas inmunes estimuladas después de la vacunación con L. monocytogenes recombinante.

La Figura 34 demuestra la respuesta inmune estimulada después de la vacunación con las preparaciones y las dosis de Listeria recombinante.

Las Figura 35A y 35B describen los números de metástasis tumoral en hígados, después del tratamiento de ratones que llevan el tumor con varias preparaciones de L. monocytogenes recombinante. La Figura 35A ilustra los datos puros (fotografías de hígados fijos).

La Figura 36 demuestra la efectividad de varias preparaciones de Listeria recombinante en la mejora de la supervivencia de los ratones que llevan el tumor.

La Figura 37 describe la respuesta inmune después de la vacunación con varias preparaciones de Listeria recombinante, y compara la célula CD4+T y las respuestas de células CD8+T.

La Figura 38 revela la supervivencia de los ratones portadores del tumor a los tumores después de la vacunación con varias preparaciones de Listeria recombinante.

La Figura 39 además ilustra la supervivencia de los ratones portadores del tumor a los tumores después de la vacunación con varias preparaciones de Listeria recombinante.

La Figura 40 describe la alineación de una integrasa de fago de la presente invención con otra integrasa de fago (U153 int: SEQ ID NO: 1; lin 1231: SEQ ID NO:2).

La Figura 41 describe la alineación de todavía otra integrasa de fago de la presente invención otra integrasa de fago (PSA int: SEQ ID NO:3, lin 0071: SEQ ID NO:4).

La Figura 42 muestra la alineación de todavía otra integrasa de fago de la presente invención con una diferente integrasa de fago (PSA int: SEQ ID NO:5; lin 1765: SEQ ID NO:6).

La Figura 43 describe la alineación de una integrasa de fago adicional de la presente invención con otra integrasa de fago (PSA int: SEQ ID NO:7; lin 2601: SEQ ID NO:8).

La Figura 44 proporciona una alineación de una integrasa de fago adicional de la presente invención con un ácido nucleico que codifica otra integrasa de fago (PSA int: SEQ ID NO:119; lmof6854_2703: SEQ ID NO:120).

La Figura 45A y 45B describe pINT-ActAN100-BamHI-SpeI-MfeI-SIINFEKL, un plásmido 6594 bp en pINT (Fig. 1) y que contiene un promotor ActA, actA-N100 y una secuencia SIINFEKL. La Figura 45B muestra la región de clonación de pINT-ActAN100-BamHI-SpeI-MfeI-SIINFEKL. (La secuencia de ácido nucleico es SEQ ID NO:150, la secuencia de péptidos es SEQ ID NO:151).

La Figura 46 describe la configuración esquemática de construcciones moleculares PSCA con una capa Kyte

Doolittle.

La Figura 47A muestra los resultados de la presentación de célula dendrítica de péptidos a la línea de célula reportera B3Z. La Figura 47B es un análisis Western blot de expresión y secreción de proteínas de fusión ActA-N100-PSCA en células J774.

La Figura 48 demuestra la respuesta inmune estimulada después de la vacunación con Listeria monocytogenes recombinante que expresa las proteínas de fusión ActA-N100-PSCA.

Las Figura 49A y 49B describen las cepas de vacuna bivalente que expresan dos diferentes antígenos tumorales humanos. La Figura 49A describe las moléculas de fusión codificadas por construcciones integradas. La Figura 49B describe la expresión y secreción de proteínas de fusión ActA que siguen a la infección de células J774 con vacunas Listeria monocytogenes monovalente o bivalente.

La Figura 50 demuestra la respuesta inmune estimulada después de la vacunación con vacunas Listeria monocytogenes recombinante monovalente o divalente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Como se utiliza en la presente, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas en singular de las palabras tales como “un”, “una”, y “el”, incluyen sus referencias en plural correspondientes al menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera.

I. DEFINICIONES

Las abreviaturas utilizadas para indicar una mutación en un gen, o una mutación en una bacteria que comprende el gen, son como sigue. A manera de ejemplo, la abreviatura “L. monocytogenes ActA” significa que parte, o todo, del gen ActA se suprimió. El símbolo delta () significa supresión. Una abreviatura que incluye un signo de menos con superíndice (Listeria ActA) significa que el gen ActA se mutó, e.g., a manera de una supresión, mutación por puntos, o mutación por cambio de marco de lectura, pero sin limitarse a estos tipos de mutaciones. Se abrevian los exponenciales, donde, por ejemplo, “3e7” significa 3 x 107.

La “administración” como se aplica a un humano, mamífero, sujeto mamífero, animal, sujeto veterinario, sujeto placebo, sujeto de investigación, sujeto experimental, célula, tejido, órgano, o fluido biológico, se refiere sin limitación al contacto de un ligando exógeno, reactivo, placebo, molécula pequeña, agente farmacéutico, agente terapéutico, agente de diagnóstico, o composición al sujeto, célula, tejido, órgano, o fluido biológico, y lo similar. La “administración” puede referirse, e.g., a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de investigación, de placebo y experimentales. El tratamiento de una célula comprende el contacto de un reactivo a la célula, así como el contacto de un reactivo a un fluido, en donde el fluido se encuentra en contacto con la célula. La “administración” también comprende los tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, diagnóstico, composición de unión, o por otra célula.

Un “agonista”, como se refiere a un ligando y receptor, comprende una molécula, combinación de moléculas, un complejo, o una combinación de reactivos, que estimula el receptor. Por ejemplo, un combatiente del factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) puede comprender un GM-CSF, una muteína o derivado de GM-CSF, un mimético peptídico de GM-CSF, una molécula pequeña que imita la función biológica de GM-CSF, o un anticuerpo que estimula el receptor GM-CSF. Un antagonista, como se refiere a un ligando y receptor, comprende una molécula, combinación de moléculas, o un complejo, que inhibe, contrarresta, disminuye, y/o desensibiliza el receptor. El “antagonista” comprende cualquier reactivo que inhibe una actividad constitutiva del receptor. Una actividad constitutiva es una que se manifiesta en la ausencia de una interacción de ligando/receptor. El “antagonista” también comprende cualquier reactivo que inhibe o previene una actividad estimulada (o regulada) de un receptor. A manera de ejemplo, un antagonista de receptor GM-CSF incluye, sin implicar ninguna limitación, un anticuerpo que se une al ligando (GM-CSF) e impide que se una al receptor, o un anticuerpo que se une al receptor e impide que el ligando se una al receptor, o en donde el anticuerpo bloquea al receptor en una configuración inactiva.

Como se utiliza en la presente, un “análogo” en el contexto de un polipéptido EphA2 (o un fragmento de un polipéptido EphA2) se refiere a un reactivo proteínico (e.g, un péptido, polipéptido o proteína) que posee una función similar o idéntica como el polipéptido EphA2 (o fragmento de un polipéptido EphA2), pero no necesariamente comprende una estructura o secuencia de aminoácidos similar o idéntica del polipéptido EphA2 (o fragmento). Un análogo de un polipéptido EphA2 que tiene una secuencia de aminoácidos similar a un polipéptido EphA2, se refiere a un agente proteínico que cumple al menos uno de los siguientes: (a) un agente proteínico que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al

menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido EphA2; (b) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones rigurosas a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido EphA2 de al menos 20 residuos de aminoácidos, al menos 20 residuos de 5 aminoácidos, al menos 30 residuos de aminoácidos, al menos 40 residuos de aminoácidos, al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 60 residuos de aminoácidos, al menos 70 residuos de aminoácidos, al menos 80 residuos de aminoácidos, al menos 90 residuos de aminoácidos, al menos 100 residuos de aminoácidos, al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos; y (c) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al

10 menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido EphA2. Un agente proteínicocon estructura similar a un polipéptido EphA2 se refiere a un agente proteínico que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar, del polipéptido EphA2.

Las “células que presentan antígeno” (APCs) son células del sistema inmune utilizado para presentar el 15 antígeno a las células T. Las APCs incluyen las células dendríticas, monocitos, macrófagos, células Kupffer de zona . marginal, microglia, células Langerhans, células T y células B (véase, e.g., Rodriguez-Pinto y Moreno (2005) Eur. J. Immunol. 35:1097-1105). Las células dendríticas se originan en al menos dos linajes. El primer linaje comprende pre-C1, mieloide DC1, y DC1 maduro. El segundo linaje comprende células multipotentes progenitoras tempranas CD34++CD45RA-; células CD34++CD45RA+, células CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++ pro-DC2, células CD4+CD11c

20 plasmacitoide pre-DC2, DC2s derivados por plasmacitoide de DC2 humano linfoide, y DC2s maduros (véase, e.g., Gilliet y Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704; Bauer, et al. (2001) J. Immunol 166:5000-5007; Arpinati, et al. (2000) Blood 95:2484-2490; Kadowaki, et al·(2001) J. Exp. Med. 194:863-869; Liu (2002) Human Immunology 63:1067-1071; McKenna, et al. (2005) J. Virol. 79:17-27; O'Neill, et al. (2004) Blood 104:2235-2246; Rossi y Young (2005) J. Immunol. 175:1373-1381; Banchereau y Palucka (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:296-306).

25 La “atenuación” y “atenuado” comprende una bacteria, virus, parásito, organismo infeccioso, prión, célula tumoral, gen en el organismo infeccioso, y lo similar, que se modifica para reducirla toxicidad a un huésped. El huésped puede ser un huésped animal o humano, o un órgano, tejido, o célula. La bacteria, para dar un ejemplo no limitante, puede ser atenuada para reducir el crecimiento extracelular, o para reducir el crecimiento intracelular en una célula huésped. La atenuación puede ser valorada al medir, e.g., un indicio o indicios de toxicidad, el LD50, la tasa de

30 eliminación de un órgano, o el índice competitivo (véase, e.g., Auerbuch, et al. (2001) Infect. Immunity 69:5953-5957). En lo general, una atenuación da como resultado un incremento en el LD50 y/o un incremento en la tasa de eliminación por al menos 25%; más generalmente por al menos 50%; más generalmente por al menos 100% (2 veces); normalmente por al menos 5 veces; más normalmente por al menos 10 veces; más normalmente por al menos 50 veces; frecuentemente por al menos 100 veces; más frecuentemente por al menos 500 veces; y más frecuentemente

35 por al menos 1000 veces; normalmente por al menos 5000 veces; más normalmente por al menos 10,000 veces; y más normalmente por al menos 50,000 veces; y más frecuentemente por al menos 100,000 veces.

El “gen atenuado” comprende un gen que media la toxicidad, patología, o virulencia, a un huésped, crecimiento dentro del huésped, o supervivencia dentro del huésped, en donde el gen se muta en una manera que mitiga, reduce, o elimina la toxicidad, patología, o virulencia. La reducción o eliminación puede ser valorada al

40 comparar la virulencia o toxicidad mediada por el gen mutado con aquella mediada por el gen no mutado (o progenitor). El “gen mutado” comprende supresiones, mutaciones por puntos, y mutaciones por cambio de marco de lectura en regiones reguladoras del gen, regiones codificadores del gen, regiones no codificadoras del gen, o cualquier combinación de las mismas.

La “condición cancerosa” y “trastorno canceroso” comprenden, sin implicar ninguna limitación, un cáncer, un 45 tumor, metástasis, angiogénesis de un tumor, y trastornos pre-cancerosos tales como displasias.

Las “variantes conservativamente modificadas” aplican tanto a secuencias de ácido nucleico como de aminoácidos. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico en particular, una variante conservativamente modificada se refiere a ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos idénticas, o secuencias de aminoácidos que tienen una o más sustituciones conservativas. Un ejemplo de una sustitución conservativa es el

50 intercambio de un aminoácido en uno de los siguientes grupos para otro aminoácido del mismo grupo (Patente de Estados Unidos No. 5,767,063 expedida a Lee, et al.; Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132).

(1): Hidrofóbico: Norleucina, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, Met;

(2): Hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr;

(3): Acído: Asp, Glu;

(4): Básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5): Residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro;

(6): Aromático: Trp, Tyr, Phe; y

(7): Aminoácidos pequeños: Gly, Ala, Ser.

Un “derivado” en el contexto de un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 se refiere a un agente proteínico que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 que se ha alterado por la introducción de sustituciones, supresiones o adiciones de residuo de aminoácido (es decir, mutaciones). El término “derivado” en el contexto de agentes proteínicos EphA2 también se refiere a un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 puede modificarse, e.g., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos bloqueadores/protectores conocidos, desdoblamiento protelítico, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Un derivado de un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 puede modificarse mediante modificaciones químicas que utilizan las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia, incluyendo pero no limitándose a, desdoblamiento químico específico, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos. En una modalidad, un derivado de polipéptido posee una función similar o idéntica como un polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 descrito en la presente. En otra modalidad, un derivado de polipéptido EphA2 o un fragmento de un polipéptido EphA2 tiene una actividad alterada cuando se compara a un polipéptido no alterado. Por ejemplo, un derivado de un polipéptido EphA2

o fragmento del mismo puede diferir en la fosforilación en relación a un polipéptido EphA2 o fragmento del mismo.

La “cantidad eficaz” comprende, sin limitación, una cantidad que puede aminorar, revocar, mitigar, impedir, o diagnosticar un síntoma o signo de un trastorno o condición médica. Al menos que se indique de otra manera, explícitamente o por contexto, una “cantidad eficaz” no se limita a una cantidad mínima suficiente para aminorar una condición.

Los “péptidos antigénicos EphA2” (algunas veces referidos como “polipéptidos antigénicos EphA2”), se definen y describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2005/0281783 A1. El EphA2 es una cinasa detirosina de receptor 130 kDa expresada en epitelio adulto (Zantek et al. (1999) Cell Growth & Differentiation 10:629; Lindberg et al. (1990) Molecular & Cellular Biology 10:6316). Un “péptido antigénico EphA2” o un “polipéptido antigénico EphA2” se refiere a un polipéptido EphA2, o un fragmento, análogo o derivado del mismo que comprende uno o más epítopes de célula B o epítopes de célula T de EphA2. El polipéptido EphA2 puede ser de cualquier especie. Por ejemplo, el polipéptido EphA2 puede ser un polipéptido EphA2 humano. El término “polipéptido EphA2” incluye la forma madura, procesada de EphA2, así como las formas inmaduras de EphA2. En algunas modalidades, el polipéptido EphA2 es la secuencia mostrada como la SEQ ID NO:2 de la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2005/0281783 A1. Los ejemplos de la secuencia de nucleótidos de EphA2 humano pueden encontrarse en la base de datos del GenBank (véase, e.g., Nos. de Acceso BC037166, M59371 y M36395). Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de EphA2 humano también pueden encontrarse en la base de datos del GenBank (véase, e.g., Nos. de Acceso NP_004422, AAH37166, y AAA53375). Los ejemplos adicionales de las secuencias de aminoácidos de EphA2 incluyen aquellos enlistados en GenBank Nos. de Acceso NP_034269 (ratón), AAH06954 (ratón), XP_345597 (rata), y BAB63910 (pollo).

Un “fluido extracelular” comprende, por ejemplo, suero, plasma, sangre, fluido intersticial, fluido cerebroespinal, fluidos secretados, linfático, bilis, sudoración, materia fecal, y orina. Un “fluido extracelular” puede comprender un coloide o una suspensión, e.g., sangre completa o sangre coagulada.

El término “fragmentos” en el contexto de polipéptidos EphA2 incluyen un polipéptido o péptido antigénico EphA2 que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de

aminoácido contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido EphA2.

El “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido u oligopéptido. El oligopéptido o polipéptido puede ser biológicamente activo, antigénicamente activo, biológicamente inactivo, o antigénicamente inactivo, y lo similar. El término gen comprende, e.g., la suma de las estructuras de lectura abierta (ORFs) que codifica un polipéptido u oligopéptido específico; la suma de las ORFs más los ácidos nucleicos que codifican los intrones; la suma de las ORFs y el (los) promotor (es) operativamente unido (s); la suma de las ORFs y el(los) promotor (es) operativamente unido (s) y cualquiera de los intrones; la suma de las ORFs y el (los) promotor (es) operativamente unido (s), intron (es), y promotor (es), y otros elementos reguladores, tales como reforzador (es). En ciertas modalidades, el “gen” comprende cualquiera de las secuencias requeridas en cis para regular la expresión del gen. El término gen también puede referirse a un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende un antígeno o un fragmento antigénicamente activo de un péptido, oligopéptido, polipéptido, o proteína. El término gen no necesariamente implica que el péptido codificado o la proteína tiene alguna actividad biológica, o incluso que el péptido o la proteína es antigénicamente activa (o). Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia no expresable se considera en lo general un pseudogen. El término gen también comprende las secuencias de ácido nucleico que codifica un ácido ribonucleico tal como rARN, tARN, o un ribozima.

El “crecimiento” de una bacteria Listeria comprende, sin limitación, las funciones de la fisiología bacteriana y genes que se refieren a la colonización, reproducción, incremento en contenido de proteína listerial, incremento en contenido de lípido listerial. Al menos que se especifique de otra forma explícitamente o por contexto, el crecimiento de Listeria comprende el crecimiento de la bacteria fuera de una célula huésped, y también crecimiento dentro de una célula huésped. Los genes relacionados de crecimiento incluyen, sin implicar ninguna limitación, aquellos que median la producción de energía (e.g., glicolisis, ciclo Krebs, citocromas), anabolismo y/o catabolismo de aminoácidos, azúcares, lípidos, minerales, purinas, y pirimidinas, transporte de nutrientes, transcripción, translación, y/oreproducción. En algunas modalidades, el “crecimiento” de una bacteria Listeria se refiere a crecimiento intracelular de la bacteria Listeria, es decir, el crecimiento dentro de una célula huésped tal como una célula de mamífero. Mientras que el crecimiento intracelular de una bacteria de Listeria puede ser medido por microscopía de luz o ensayos de unidad formadora de colonia (CFU), el crecimiento no se limitará por ninguna técnica de medición. Los parámetros bioquímicos tales como la cantidad de un antígeno listerial, la secuencia de ácido nucleico listerial, o específica de lípido a la bacteria Listeria, pueden utilizarse para valorar el crecimiento. En algunas modalidades, un gen que media el crecimiento es uno que media específicamente el crecimiento intracelular. En algunas modalidades, un gen que media específicamente el crecimiento intracelular comprende, pero no se limita a, un gen en donde la inactivación del gen reduce la tasa de crecimiento intracelular pero no de manera detectable, sustancialmente, o apreciablemente, reduce la tasa de crecimiento extracelular (e.g., crecimiento en brote), o un gen en donde la inactivación del gen reduce la tasa de crecimiento intracelular a un mayor grado que lo que reduce la tasa de crecimiento extracelular. Para proporcionar un ejemplo no limitante, en algunas modalidades, un gen en donde la inactivación reduce la tasa de crecimiento intracelular a un grado mayor que el crecimiento extracelular comprende la situación en donde la inactivación reduce el crecimiento intracelular a menos del 50% del valor normal o máximo, pero reduce el crecimiento extracelular a sólo 1-5%, 5-10%, o 10-15% del valor máximo. Esta descripción, en ciertos aspectos, comprende una Listeria atenuada en crecimiento intracelular pero no atenuado en crecimiento extracelular, una Listeria no atenuada en el crecimiento intracelular y no atenuada en crecimiento extracelular, así como una Listeria no atenuada en crecimiento intracelular pero atenuada en crecimiento extracelular.

La “condición inmune” o “trastorno inmune” comprende un trastorno, condición, síndrome, o enfermedad que se da como resultado de la respuesta ineficaz, inadecuada, o patológica del sistema inmune, e.g., a una infección persistente o a un cáncer persistente (véase, e.g., Jacobson, et al. (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 84:223-243). La “condición inmune” o “trastorno inmune” comprende, e.g., inflamación patológica, un trastorno inflamatorio, y una enfermedad o trastorno autoinmune. La “condición inmune” o “trastorno inmune” también puede referirse a infecciones, infecciones persistentes, cáncer, tumores, trastornos pre-cancerosos, cánceres que resisten la irradicación por el sistema inmune, y angiogénesis de tumores. La “condición inmune” o “trastorno inmune” también comprende cánceres inducidos por un agente infectivo, incluyendo los ejemplos no limitantes de cánceres inducidos por virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de simio 40 (SV40), virus Epstein-Barr, papilomavirus, poliomavirus, virus de herpes, sarcoma de Kaposi, virus de leucemia de célula T humana, y Helicobacter pylori (véase, e.g., Young y Rickinson (2004) Nat. Rev. Cancer 4:757-768; Pagano et al. (2004) Semin. Cancer Biol. 14:453-471; Li, et al. (2005) Cell Res. 15:262-271).

Una composición que se “etiqueta” es detectable, ya sea directa o indirectamente, por métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, isotópicos, o químicos. Por ejemplo, las etiquetas

útiles incluyen 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, isótopos estables, etiquetas de epítope, tintes fluorescentes, reactivos electrónicos-densos, sustratos, o enzimas, e.g., como se utiliza en los inmunoensayos unidos por enzima, o fluoretes (véase, e.g., Rozinov y Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728).

El “ligando” se refiere a una molécula pequeña, péptido, polipéptido, o membrana asociada o molécula unida por membrana, que es un combatiente o antagonista de un receptor. El “ligando” también comprende un agente de unión que no es un combatiente o antagonista, y no tiene propiedades antagonistas o combatientes. Por convenio, en donde un ligando se une por membrana en una primera célula, el receptor normalmente se origina en una segunda célula. La segunda célula puede tener la misma identidad (el mismo nombre), o puede tener una identidad diferente (un nombre diferente), como la primera célula. Un ligando o receptor puede ser totalmente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, núcleo, o en algún otro compartimiento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su ubicación, e.g., de un compartimiento intracelular al lado externo de la membrana de plasma. El complejo de un ligando y receptor se denomina un “complejo de receptor de ligando”. En donde un ligando y receptor se incluyen en una trayectoria de señalización, el ligando ocurre en una posición corriente arriba y el receptor se origina en una posición corriente abajo de la trayectoria de señalización.

El “ácido nucleico” se refiere a desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de filamento único, doble filamento, o forma de múltiples filamentos. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico son, e.g., un cADN, mARN, oligonucleótido, y polinucleótido. Una secuencia de ácido nucleico particular también puede comprender implícitamente “variantes alélicas” y “variantes de empalme”.

“Operativamente unido” en el contexto de un promotor y un ácido nucleico que codifica un mARN significa que el promotor puede utilizarse para iniciar la transcripción de aquel ácido nucleico.

Los términos “por ciento de identidad de secuencia” y “% de identidad de secuencia” se refieren al porcentaje de similitud de secuencia encontrada por una comparación o alineación de dos o más de secuencias de ácido nucleico

o aminoácidos. El por ciento de identidad puede determinarse por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, contando el número exacto de combinaciones entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Un algoritmo para calcular el por ciento de identidad es el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman (véase, e.g., Kann y Golstein (2002) Proteins 48:367-376; Arslan, et al. (2001) Bioinformatics 17:327-337).

La “condición pre-cancerosa” comprende, sin limitación, displasias, nódulos pre-neoplásicos; nódulos macroregenerativos (MRN); nódulos displásicos de bajo grado (LG-DN); nódulos displásicos de grado alto (HG-DN); displasia epitelial biliar; enfoque de hepatocitos alterados (FAH); nódulos de hepatocitos alterados (NAH); desequilibrios cromosómicos; activación aberrante de telomerasa; re-expresión de la subunidad catalítica de telomerasa; expresión de marcadores de célula endotelial tal como CD31, CD34 y BNH9 (véase, e.g., Terracciano y Tornillo (2003) Pathologica 95:71-82; Su y Bannasch (2003) Toxicol. Pathol. 31:126-133; Rocken y Carl-McGrath (2001) Dig. Dis. 19:269-278; Kotoula, et al. (2002) Liver 22:57-69; Frachon, et al. (2001) J. Hepatol. 34:850-857; Shimonishi, et al. (2000) J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 7:542-550; Nakanuma, et al. (2003) J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 10:265-281). Los métodos para diagnosticar cáncer y displasia se describen (véase, e.g., Riegler (1996) Semin. Gastrointest. Dis. 7:74-87; Benvegnu, et al. (1992) Liver 12:80-83; Giannini, et al. (1987) Hepatogastroenterol. 34:95-97; Anthony (1976) Cancer Res. 36:2579-2583).

Por “purificado” e “aislado” se entiende, cuando se refiere a un polipéptido, que el polipéptido se presenta en la ausencia sustancial de las otras macromoléculas biológicas con las cuales se asocia en naturaleza. El término “purificado” como se utiliza en la presente significa que un polipéptido identificado frecuentemente responde por al menos 50%, más frecuentemente responde por al menos 60%, normalmente responde por al menos 70%, más típicamente responde por al menos 75%, más típicamente responde por al menos 80%, normalmente responde por al menos 85%, más normalmente responde por al menos 90%, más normalmente responde por al menos 95%, y convencionalmente responde por al menos 98% en peso, o más, de los polipéptidos presentes. Los pesos de agua, reguladores, sales, detergentes, reductores, inhibidores de proteasa, estabilizadores (incluyendo una proteína agregada tal como albumina), y excipientes, y moléculas que tienen un peso molecular de menos de 1000, no se utilizan en lo general en la determinación de la pureza de polipéptido. Véase, e.g, la discusión de pureza en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 6,090,611 expedida a Covacci, et al.

El “péptido” se refiere a una secuencia corta de aminoácidos, en donde los aminoácidos se conectan entre sí por enlaces de péptido. Un péptido puede ocurrir libre o unido a otra porción, tal como una macromolécula, lípido, oligo-o polisacárido, y/o un polipéptido. En donde un péptido se incorpora en una cadena de polipéptidos, el término “péptido” todavía puede utilizarse para referirse explícitamente a la secuencia corta de aminoácidos. Un “péptido” puede conectarse a otra porción a manera de un enlace de péptido u otro tipo de enlace. Un péptido es al menos dos

aminoácidos en longitud y en lo general menos de aproximadamente 25 aminoácidos en longitud, en donde la longitud máxima es una función de costumbre o contexto. Los términos “péptido” y “oligopéptido” pueden utilizarse intercambiablemente.

La “proteína” en lo general se refiere a la secuencia de aminoácidos que comprende una cadena de polipéptido. La proteína también puede referirse a una estructura tridimensional del polipéptido. La “proteína desnaturalizada” se refiere a un polipéptido parcialmente desnaturalizado, que tiene cierta estructura tridimensional residual o, alternativamente, a una estructura tridimensional esencialmente aleatoria, es decir, totalmente desnaturalizada. Esta descripción comprende reactivos de, y métodos que utilizan, variantes de polipéptido, e.g., incluyendo glicosilación, fosforilación, sulfatación, formación de enlace de disulfuro, desamidación, isomerización, puntos de desdoblamiento en procesamiento de secuencia líder o señal, cofactores covalentes y no covalentemente unidos, variantes oxidados, y lo similar. La formación de proteínas unidas por disulfuro se describe (véase, e.g, Woycechowsky y Raines (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533-539; Creighton, et al. (1995) Trends Biotechnol. 13:1823).

“Recombinante” cuando se utiliza con referencia, e.g., a un ácido nucleico, célula, animal, virus, plásmido, vector, o lo similar, indica la modificación por la introducción de un ácido nucleico no nativo, exógeno, alteración de un ácido nucleico nativo, o por derivación en total o en parte de un ácido nucleico recombinante, célula, virus, plásmido, o vector. La proteína recombinante se refiere a una proteína derivada, e.g., de un ácido nucleico recombinante, virus, plásmido, vector, o lo similar. La “bacteria recombinante” comprende una bacteria en donde el genoma se diseña por métodos recombinantes, e.g., a manera de una mutación, supresión, inserción, y/o un reajuste. La “bacteria recombinante” también comprende una bacteria modificada para incluir un ácido nucleico extra-genómica recombinante, e.g, un plásmido o un segundo cromosoma, o una bacteria donde un ácido nucleico extra-genómico existente se altera.

La “muestra” se refiere a una muestra de un humano, animal, placebo, o muestra de investigación, e.g., una célula, tejido, órgano, fluido, gas, aerosol, mezcla, coloide, o material coagulado. La “muestra” puede probarse in vivo, e.g., sin remoción del humano o animal, o puede probarse in vitro. La muestra puede probarse después de procesamiento, e.g., mediante métodos histológicos. La “muestra” también se refiere, e.g., a una célula que comprende un fluido o muestra de tejido o una célula separada de un fluido o muestra de tejido. La “muestra” también puede referirse a una célula, tejido, órgano, o fluido que se toma de modo frasco de un humano o animal, o a una célula, tejido, órgano, o fluido que se procesa o almacena.

Un “marcador elegible” comprende un ácido nucleico que permite a uno elegir o combatir una célula que contiene el marcador elegible. Los ejemplos de marcadores elegibles incluyen, sin limitación, e.g.: (1) Un ácido nucleico que codifica un producto que proporciona resistencia a un compuesto de otra manera tóxico (e.g., un antibiótico), o que codifica la susceptibilidad a un compuesto de otra manera inocuo (e.g., sacarosa); (2) Un ácido nucleico que codifica un producto que de otra manera se encuentra faltante en la célula receptora (e.g., genes tARN, marcador (es) auxotrófico (s); (3) Un ácido nucleico que codifica un producto que suprime una actividad de un producto de gen; (4) Un ácido nucleico que codifica un producto que puede identificarse fácilmente (e.g., marcadores fenotípicos tales como beta-galactosidasa, proteína de verde fluorescente (GFP), proteínas de superficie celular, una etiqueta de epítope, una etiqueta FLAG); (5) Un ácido nucleico que puede identificarse por técnicas de hibridización, por ejemplo, PCR o modelos moleculares.

Se une “específicamente” o “selectivamente”, cuando se refiere a un ligando/receptor, ácido nucleico/ácido nucleico complementario, anticuerpo/antígeno, u otro par de enlace (e.g., una citosina a un receptor de citosina) indica una reacción de enlace que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterógena de proteínas y otras biológicas. De esta manera, bajo condiciones designadas, un ligando específico se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico también puede significar, e.g., que el compuesto de enlace, ligando de ácido nucleico, anticuerpo, o composición de unión derivada del sitio de enlace por antígeno de un anticuerpo, del método contemplado se une a su objetivo con una afinidad que frecuentemente es al menos 25% más, más frecuentemente al menos 50% más, más frecuentemente al menos 100% (2 veces) más, normalmente al menos diez veces más, más normalmente al menos 20 veces más, y más normalmente al menos 100 veces más que la afinidad con cualquier compuesto de enlace.

En una modalidad típica, un anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor a aproximadamente 109 litros/mol, como se determina, e.g., por análisis Scatchard (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). Se reconoce por el experto que ciertos compuestos de enlace pueden unirse específicamente a más de un objetivo, e.g., un anticuerpo se une específicamente a su antígeno, a lectinas a manera del oligosacárido de anticuerpo, y/o a un receptor Fc a manera de la región Fc del anticuerpo.

La “dispersión” de una bacteria comprende “dispersión de célula a célula”, es decir, la transmisión de la bacteria de una primera célula huésped a una segunda célula huésped, como se media, por ejemplo, por una vesícula. Las funciones en relación a la dispersión incluyen, pero no se limitan a, e.g., la formación de una cola de actina, la formación de una extensión tipo pseudopod, y la formación de una vacuola con membrana doble.

El “sitio objetivo” de una recombinasa es la región o secuencia de ácido nucleico que se reconoce, une, y/o actúa tras la recombinasa (véase, e.g., Patente de Estados Unidos No. 6,379,943 expedida a Graham, et al.; Smith y Thorpe (2002) Mol. Microbiol. 44:299-307; Groth y Calos (2004) J. Mol. Biol. 335:667-678; Nunes-Duby, et al. (1998) Nucleic Acids Res.26:391-406).

La “cantidad terapéuticamente eficaz” se define como una cantidad de un reactivo o composición farmacéutica que es suficiente para mostrar un beneficio de paciente, es decir, para originar una reducción, prevención, o mejora de los síntomas de la condición que se está tratando. Cuando el agente o composición farmacéutica comprende un agente de diagnóstico, una “cantidad diagnósticamente eficaz” se define como una cantidad que es suficiente para producir una señal, imagen, u otro parámetro de diagnóstico. Las cantidades eficaces de la formulación farmacéutica variará de acuerdo con los factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, el género, y el peso del individuo, y las respuestas idiosincráticas del individuo (véase, e.g., Patente de Estados Unidos No. 5,888,530 expedida a Netti, et al.).

El “tratamiento” o “tratar” (con respecto a una condición o una enfermedad) es un procedimiento para obtener resultados benéficos o deseados incluyendo y preferentemente resultados clínicos. Para propósitos de esta invención, los resultados deseados o benéficos con respecto a una enfermedad incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejorar una condición asociada con una enfermedad, curar una enfermedad, disminución de severidad de una enfermedad, retrasar el avance de una enfermedad, aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, incrementando la calidad de vida de uno que padece de una enfermedad, y/o prolongar la supervivencia. De igual forma, para propósitos de esta invención, los resultados benéficos o deseados con respecto a una condición incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejorar una condición, curar una condición, disminuir la severidad de una condición, retrasar el avance de una condición, aliviar uno o más síntomas asociados con una condición, incrementando la calidad de vida de uno que padece de una condición, y/o prolongar la supervivencia. Por ejemplo, en algunas modalidades en donde las composiciones descritas en la presente se utilizan para el tratamiento de cáncer, los resultados benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) las células cancerígenas o neoplásicas, reducir la metástasis de las células neoplásicas encontradas en cánceres, reducir el tamaño de un tumor, reducir los síntomas que se dan como resultado del cáncer, incrementar la calidad de vida de aquellos que padecen del cáncer, reducir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, retrasar el avance del cáncer, y/o prolongar la supervivencia de pacientes que tienen cáncer. Dependiendo del contexto, el “tratamiento” de un sujeto puede implicar que el sujeto en necesidad de tratamiento, e.g., en la situación donde el sujeto comprende un trastorno que se espera se mejore mediante la administración de un reactivo.

La “vacuna” comprende las vacunas preventivas. La vacuna también comprende vacunas terapéuticas, e.g., una vacuna administrada a un mamífero que comprende una condición o trastorno asociado con el antígeno o epítope provisto por la vacuna.

II. GENERAL

La presente invención proporciona reactivos y métodos útiles para el tratamiento y diagnóstico de cáncer, tumores, trastornos precancerosos, e infecciones. Se proporcionan ácidos nucleicos, bacteria Listeria, y vacunas que comprenden una bacteria Listeria. Esta descripción comprende las células listeriales que se han modificado in vitro, incluyendo durante el almacenamiento, o in vivo, incluyendo los productos de división de célula bacteriana y productos de deterioro bacteriano.

Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican al menos un antígeno heterólogo (heterólogo a la bacteria Listeria). El antígeno heterólogo puede derivarse de un tumor, célula cancerígena, o y/o agente infectivo, e.g., un virus, bacteria, o protozoario. El antígeno heterólogo también puede ser un antígeno listerial, por ejemplo, en donde el antígeno se expresa en cantidades mayores que aquel que ocurre naturalmente dentro de la bacteria Listeria, donde el antígeno listerial se une operativamente con una secuencia reguladora no nativa, o donde el antígeno listerial se modifica para ser atenuado o para incrementar su antigenicidad.

Donde una Listeria contiene un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, el término “heterólogo” comprende, pero no se limita necesariamente a, un antígeno de, o se deriva de: (1) Un organismo no listerial; (2) Un antígeno de origen sintético; (3) Un antígeno de origen listerial donde el ácido nucleico se integra en una posición en el

genoma listerial que es diferente de aquel encontrado en el tipo silvestre; y (4) Un antígeno de origen listerial, pero donde el ácido nucleico se une operativamente con una secuencia reguladora no utilizada normalmente en una Listeria tipo silvestre. El comentario precedente también aplica al término “antígeno heterólogo”, cuando se utiliza, por ejemplo, en el contexto de un vector viral. Aquí, el antígeno heterólogo comprende antígenos que no son de, y no se derivan de, aquel vector viral, así como, por ejemplo, los antígenos del vector viral que se controlan por una secuencia reguladora de ácido nucleico no nativo.

Se proporcionan reactivos y métodos para estimular el sistema inmune de mamífero, para reducir el número y/o tamaño de tumores, para reducir la metástasis, y para reducir la concentración de un organismo infeccioso. La presente invención también proporciona reactivos y métodos para mejorar la supervivencia de una célula, tejido, órgano, o mamífero, a un cáncer o infección. La presente invención también proporciona reactivos y métodos para mejorar la supervivencia de una célula (in vivo o in vitro), un tejido (in vivo o in vitro), un órgano (in vivo o in vitro), un organismo, un mamífero, un sujeto veterinario, un sujeto de investigación, o un sujeto humano, a un cáncer, tumor, o infección. Lo que se comprende es la administración que es in vivo o in vitro, supervivencia de la célula, tejido, u órgano in vitro o in vivo, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier combinación incluye, e.g., la administración que es in vivo donde la supervivencia es in vitro, o la administración que es in vitro y donde la supervivencia subsecuente es in vivo.

Se proporciona una Listeria que comprende un polinucleótido que codifica al menos un antígeno heterólogo en donde el polinucleótido es genómico. También se encuentra comprendida una Listeria que comprende un polinucleótido que codifica al menos un antígeno heterólogo, en donde el polinucleótido es genómico y no residente en un plásmido dentro de la Listeria. Además, se encuentra comprendida una Listeria que comprende un polinucleótido que codifica al menos un antígeno heterólogo, en donde el polinucleótido reside en un plásmido dentro de la Listeria. Además, lo que se proporciona es una Listeria que comprende un polinucleótido que codifica al menos un antígeno heterólogo, donde el polinucleótido reside en un plásmido y no ocurre integrado en el genoma. En otro aspecto, la presente descripción proporciona una Listeria que comprende un polinucleótido que codifica al menos un antígeno heterólogo, donde el polinucleótido se integra en el genoma y también reside por separado en un plásmido.

El ratón es un modelo aceptado para la respuesta inmune humana. A detalle, las células T de ratón son un modelo para las células T humanas, las células dendríticas de ratón (DCs) son un modelo para DCs humanas, las células NK de ratón son un modelo para células NK humanas, las células NKT de ratón son un modelo para las células NKT humanas, la respuesta innata de ratón es un modelo aceptado para la respuesta innata humana, y así sucesivamente. Se describen estudios de modelo, por ejemplo, para las células CD8T, las células T de memoria central, y células T de memoria efectora (véase, e.g., Walzer, et al. (2002) J. Immunol. 168:2704-2711); los dos subgrupos de células NK (véase, e.g., Chakir, et al. (2000) J. Immunol. 165:4985-4993; Smith, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1341-1354; Ehrlich, et al. (2005) J. Immunol. 174:1922-1931; Peritt, et al. (1998) J. Immunol. 161:58215824); las células NKT (véase, e.g., Couedel, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:4391-4397; Sakamoto, et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 103:S445-S451; Saikh, et al. (2003) J. Infect. Dis. 188:1562-1570; Emoto, et al. (1997) Infection Immunity 65:5003-5009; Taniguchi, et al. (2003) Annu. Rev. Immunol. 21:483-513; Sidobre, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:12254-12259); monocitos/macrófagos (Sunderkotter, et al. (2004) J. Immunol. 172:4410-4417); los dos linajes de DCs (Boonstra, et al. (2003) J. Exp. Med. 197:101-109; Donnenberg, et al. (2001) Transplantation 72:19461951; Becker (2003) Virus Genes 26:119-130; Carine, et al. (2003) J. Immunol. 171:6466-6477; Penna, et al. (2002) J. Immunol. 169:6673-6676; Alferink, et al. (2003) J. Exp. Med. 197:585-599).

La respuesta innata de ratón, que incluye los receptores tipo Toll (TLRs), es un modelo para la respuesta inmune innata humana, como se describe (véase, e.g. Janssens y Beyaert (2003) Clinical Microb. Revs. 16:637-646). Los neutrófilos de ratón son un modelo aceptado para los neutrófilos humanos (véase, e.g., Kobayashi, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10948-10953; Torres, et al. (2004) 72:2131-2139; Sibelius, et al. (1999) Infection lmmunity 67:1125-1130; Tvinnereim, et al. (2004) J. lmmunol. 173:1994-2002). La respuesta inmune murino a Listeria es un modelo aceptado para la respuesta humana a Listeria (véase, e.g., Kolb-Maurer, et al. (2000) Infection Immunity 68:3680-3688; Brzoza, et al. (2004) J. Immunol. 173:2641-2651; Esplugues, et al. (2005) Blood Feb. 3 (pub-e antes de la impresión); Paschen, et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:3447-3456; WayyWilson (2004) J. Immunol. 173:5918-5922; Ouadrhiri, et. al. (1999) J. Infectious Diseases 180:1195-1204; Neighbors, et al. (2001) J. Exp. Med. 194:343-354; Calorini, et al. (2002) Clin. Exp. Metastasis 19:259-264; Andersson, et al. (1998) J. Immunol. 161:5600-5606; Flo, et al. (2000) J. Immunol. 164:2064-2069; Calorini, et al. (2002) Clin. Exp. Metastasis 19:259-264; Brzoza, et al. (2004) J. Immunol. 173:2641-2651; Brzoza, et al. (2004) J. Immunol. 173:2641-2651; Cleveland, et al. (1996) Infection Immunity

64: 1906-1912; Andersson, et al. (1998) J. Immunol. 161:5600-5606).

Las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 2004/0228877 y 2004/0197343, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad, describen Listeria útil en algunas

modalidades de la presente invención. La Publicación de Estados Unidos No. 2005/0249748, incorporada en la presente mediante la referencia en su totalidad, describe además Listeria y polinucleótidos útiles en algunas modalidades de la presente invención.

(a). Secuencias de señal o secretoras.

5 La presente invención acepta un ácido nucleico que codifica una secuencia secretora, o que codifica una proteína listerial, o un fragmento de la misma, adecuada para uso como una pareja de proteína de fusión. Lo que se comprende es un ácido nucleico que codifica:

i. una secuencia secretora,

ii. una secuencia de señal,

10 iii. un polipéptido listerial que contiene su secuencia secretora nativa,

iv.: una proteína listerial con su secuencia secretora nativa reemplazada con aquella de otra proteína listerial,

v.: una proteína listerial con su secuencia secretora nativa reemplazada con la secuencia secretora de una proteína bacteriana no listerial,

15 vi. una proteína listerial no secretada, o fragmento de la misma, que no contiene ninguna secuencia secretora; y

vii. una secuencia secretora bacteriana no listerial fusionada con, y en estructura con, una proteína listerial no secretada, o fragmento de la misma.

Estas modalidades pueden comprender las siguientes proteínas listeriales, y fragmentos o dominios de las 20 mismas.

i. Listeriolisina (LLO). La secuencia de señal secretora de listeriolisina O (gen hly) se ha identificado (véase, e.g., Lety, et al. (2003) Microbiol. 149:1249-1255).

ii. ActA. El sitio de enlace ribosómico, promotor, y secuencia de señal se han identificado para ActA

listerial. El sitio de enlace ribosómico origina 6 bp corriente arriba del codón de inicio del gen ActA (Vazquez-Roland, 25 et al. (1992) Infect. Immunity 60:219-230).

iii. Internalinas. Todas las proteínas de internalina (Inl) contienen una secuencia de terminal N de 30-35 aminoácidos con características de péptidos de señal bacteriana (véase, e.g., Dramsi, et al. (1997) Infect. Immunity 65:1615-1625).

iv. p60 (gen iap). Una región de 27 aminoácidos entre el codón de inicio y el nucleótido 524 funciona

30 como una secuencia de señal, y dirige el transporte de p60 a través de la membrana de célula Listeria (Kohler, et al. (1990) Infect. Immunity 58:1943-1950). Kohler, et al. supra, también describen un sitio de enlace de ribosoma rico en purina (16S ARN) del p60 mARN de L. monocytogenes.

La Tabla 1 describe un número de ejemplos no limitantes de los péptidos de señal para uso en la fusión con una secuencia de pareja de proteína de fusión tal como un antígeno heterólogo. El algoritmo de SeñalP puede 35 utilizarse para determinar las secuencias de señal en bacterias de Gram positivo. Este programa se encuentra disponible en la red a nivel mundial en: cbs.dtu.dk/services/SignalP/. Los péptidos de señal tienden a contener tres dominios: una terminal N positivamente cargada (1-5 residuos de largo); un dominio hidrofóbico central (7-15 residuos de largo); y un dominio de terminal C neutral pero polar (véase, e.g, Lety, et al. (2003) Microbiology 149:1249-1255; Paetzel, et al. (2000) Pharmacol. Ther. 87:27-49). Como los péptidos de señal y las secuencias secretoras codificadas 40 por un genoma Listeria, o por un genoma o plásmido de otra bacteria, no son optimizadas necesariamente por codón para la expresión óptima en Listeria, la presente descripción también proporciona ácidos nucleicos que se originan del genoma Listeria, o de un genoma o plásmido de otra bacteria, que se alteran por codón optimizado para expresión por un L. monocytogenes. La presente descripción no se limitará a antígenos de péptido y polipéptido que se secretan, pero también abarca polipéptidos y péptidos que no se secretan o no pueden secretarse de una Listeria u otra

45 bacteria.

Tabla 1. Trayectoria de señal bacteriana. Los péptidos de señal se identifican por el sitio de peptidasa de señal.

Sitio de peptidasa de señal (sitio de desdoblamiento representado por ‘) Gen Género/Especie

trayectoria secA1

TEA'KD (SEQ ID NO:126): hly (LLO) Listeria monocytogenes

VYA'DT (SEQ ID N0:127): Usp45 Lactococcus lactis (véase, e.g., Steidler, et al. (2003) Nat. Biotech. 21:785-789; Schotte, et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 27:761-765).

IQA'EV (SEQ ID NO:128): pag (antígeno protector) Bacillus anthracis

trayectoria secA2

ASA'ST (SEQ ID NO:129): iap (proteína asociada por invasión) p60 Listeria monocytogenes

VGA'FG (SEC ID N0:130): NamA lmo2691 (autolisina) Listeria monocytogenes

AFA'ED (SEC ID N0:13l): * BA_0281 (Familia NLP/P60) Bacillus anthracis

VQA'AE (SEQ ID NO:132): * atl (autolisina) Staphylococcus aureus

trayectoria Tat

DKA'LT (SEQ ID NO: 133): lmo0367 Listeria monocytogenes

VGA'FG (SEQ ID NO: 134): PhoD (fosfatasa alcalina) Bacillus subtillis

* Las autolisinas bacterianas secretadas por la trayectoria sec (no determinada si secA1 o secA2).Las secuencias secretoras se encuentran comprendidas por los ácidos nucleicos indicados codificados por el genoma Listeria EGD (No. de Acceso de GenBank NC_003210) at, e.g., nucleótidos 45434-456936 (inlA); nucleótidos 457021-457125 (inlB); nucleótidos 1860200-1860295 (inlC); nucleótidos 286219-287718 (inlE); nucleótidos 205819-205893 (gen hly; LLO) (véase también No. de Acceso de GenBank Pl3128); nucleótidos 209470-209556 (ActA) (véase también No. de Acceso de GenBank S20887).

En algunas modalidades, el polipéptido que comprende el antígeno heterólogo que se expresa por la Listeria comprende una secuencia de señal que es una secuencia de señal no listerial. En algunas modalidades, la secuencia de señal es un péptido de señal secA1. En algunas otras modalidades, la secuencia de señal es un péptido de señal Tat o secA2. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal actA. En algunas modalidades, el péptido de señal utilizado para efectuar la secreción del antígeno heterólogo se selecciona de secuencia de señal p60, una señal de secuencia LLO Listeria monocytogenes, una secuencia de señal de Antígeno Protector Bacillus anthracis

(BaPa), una secuencia de señal usp45 Lactococcus lactis, y una secuencia de señal PhoD Bacillus subtilis. Los péptidos de señal que pueden utilizarse para la expresión y secreción de antígenos heterólogos se describen en, e.g., Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2005/0249748.

(b). Optimización por codón.

La presente descripción, en ciertas modalidades, proporciona la optimización por codón de un ácido nucleico heterólogo a Listeria, o de un ácido nucleico endógeno a Listeria. Los codones óptimos utilizados por L. monocytogenes para cada aminoácido se muestran (Tabla 2). Un ácido nucleico se optimiza por codón si al menos un codón en el ácido nucleico se reemplaza con codón que se utiliza más frecuentemente por L. monocytogenes para aquel aminoácido que el codón en la secuencia original.

Normalmente, al menos un por ciento de cualquiera de los codones no óptimos se cambian para proporcionar codones óptimos, normalmente al menos cinco por ciento se cambian, más normalmente al menos diez por ciento se cambian, frecuentemente al menos 20% se cambian, más frecuentemente al menos 30% se cambian, más frecuentemente al menos 40%, normalmente al menos 50% se cambian, más normalmente al menos 60% se cambian, más normalmente al menos 70% se cambian, óptimamente al menos 80% se cambian, más óptimamente al menos 90% se cambian, más óptimamente al menos 95% se cambian, y convencionalmente 100% de cualquiera de los codones no óptimos se optimizan por codón para la expresión Listeria (Tabla 2).

Tabla 2. Codones óptimos para la expresión en Listeria.

Aminoácido: A R N D C Q E G H I

Codón Listeria óptimo: GCA CGU AAU GAU UGU CAA GAA GGU CAU AUU

Aminoácido: L K M F P S T W Y V

Codón Listeria óptimo: UUA AAA AUG UUU CCA AGU ACA UGG UAU GUU

En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se optimiza por codón para expresión en Listeria monocytogenes. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión que comprende el ActA modificado o una secuencia de péptido de señal alternativa y el antígeno heterólogo se optimiza por codón.

La información adicional con respecto a la optimización por codón de las secuencias de nucleótidos para la expresión en Listeria monocytogenes puede encontrarse en la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2005/0249748.

(c). Atenuación y factores de virulencia.

L. monocytogenes expresa varios genes y productos de gen que contribuyen a la invasión, crecimiento, o colonización del huésped (Tabla 3). Algunos de estos se clasifican como “factores de virulencia”. Estos factores de virulencia incluyen ActA, listeriolisina (LLO), proteína 60 (p60), internalina A (inlA), internalina B (inlB), fosfatidilcolina fosfolipasa C (PC-PLC), fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC; gen plcA). Se han caracterizado un número de otras internalinas, e.g., InlC2, InlD, InlE, e InlF (Dramsi, et al. (1997) Infect. Immunity 65:1615-1625). Mpl, una metaloproteasa que procesa proPL-PLC para activar PL-PLC, también es un factor de virulencia (Chakraborty, et al. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290:167-174; Williams, et al. (2000) J. Bact. 182:837-841). En algunas modalidades, un gen de virulencia es un gen que codifica un factor de virulencia. Sin limitarse la presente descripción a los genes atenuados descritos en la presente, la presente descripción suministra una Listeria que se altera, muta, o atenúa en una o más de las secuencias de la Tabla 3.

En algunas modalidades, el gen de virulencia es un gen dependiente de prf-A. En otras modalidades, el gen

de virulencia es gen independiente de prf-A.

En algunas modalidades, la Listeria comprende una mutación en atenuación en actA y/o inlB. En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica un antígeno heterólogo se ha integrado en el gen actA y/o inlB.

Los genes de reparación de ADN también pueden ser el objetivo de una mutación en atenuación. La

mutación o supresión de un gen de reparación de ADN puede dar como resultado una bacteria atenuada (véase, e.g.,

Darwin y Nathan (2005) Infection Immunity 73:4581-4587).

Tabla 3. Secuencias de proteínas y ácidos nucleicos L. monocytogenes.

Proteína/Gen: Nucleótidos No. de Acceso de GenBank

Ensamble de actina incluyendo precursor de proteína (gen ActA): 209470-211389 (secuencia codificadora) 209456-211389 (gen) NC_003210

ActA en varios subtipos de L. monocytogenes: -- AF497169; AF497170; AF497171; AF497172; AF497173; AF497174; AF497175; AF497176; AF497177; AF497178; AF497179; AF497180; AF497181; AF497182; AF497183 (Lasa, et al. (1995) Mol. Microbiol.-18:425-436).

Precursor de listeriolisina O (LLO) (gen hly): 205819-207408 NC_003210

Internalina A (InlA): 454534-456936 NC_003210

Internalina B (InlB): 457021-458913 NC_003210

SvpA: --- Bierne, et al. (2004) J. Bacteriol. 186:1972-1982; Borezee, et al. (2000) Microbiology 147:2913-2923.

p104 (a.k.a.LAP): --- Pandiripally, et al. (1999) J. Med. Microbiol. 48:117-124; Jaradat, et al. (2003) Med. Microbiol. Immunol. 192:85-91.

Fosfolipasa C específica de fosfatidilinosiltol (PI-PLC) (gen plcA): 204624-205577 NC_003210

Fosfolipasa C específica de fosfatidilcolina (PC-PLC) (gen plcB): 1-3031 X59723

Precursor de metaloproteasa de Zinc (Mpl): 207739-209271 NC_003210

p60 (proteína 60; proteína asociada por invasión (iap)).: 618932-620380 NC_003210 (Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437).

Sortasa: 966245-966913 NC_003210

Proteína reguladora positiva de listeriolisina (gen PrfA): 203607-203642 NC_003210

Proteína reguladora positiva de listeriolisina (gen PrfA): 1-801 AY318750

Gen PrfB: 2586114-2587097 NC 003210

Gen FbpA: 570 aminoácidos Dramsi, et al. (2004) Mol. Microbiol. 53:639649.

Auto gen: -- Cabanes, et al. (2004) Mol. Microbiol. 51:1601-1614

Ami (amidasa que media la adhesión): -- Dussurget, et al. (2004) Annu. Rev. Microbiol. 58:587-610.

Operona dlt (dltA; dltB; dltC; dltD).: 487-2034 (dltA) No. de Acceso de GenBank: AJ012255 (Abachin, et al. dltD). (2002) Mol. Mic43:114.)

Recuadros de prfA: -- Dussurget, et al. (2002) Mol. Microbiol. 45:1095-1106.

Htp (transportador de azúcar P): 1-1386 No. de Acceso de GenBank AJ315765 (véase, e.g., Milohanic, et al. (2003) Mol. Microbiol. 47:1613-1625).

La biología de Listeriolisina (LLO) se describe (véase, e.g., Glomski, et al. (2003) Infect. Immun. 71:67546765; Gedde, et al. (2000) Infect. Immun. 68:999-1003; Glomski, et al. (2002) J. Cell Biol. 156:1029-1038; Dubail, et al. (2001) Microbiol. 147:2679-2688; Dramsi y Cosssart (2002) J. Cell Biol. 156:943-946). La fisiología y bioquímica de ActA se describe (véase, e.g., Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103; Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42: 1163-1177; Portnoy, et al. (2002) J. Cell Biol. 158:409-414). La fisiología y bioquímica de internalina se encuentra disponible (véase, e.g., Bierne y Cossart (2000) J. Cell Sci. 115:3357-3367; Schluter, et al. (1998) Infect. Immun. 66:5930-5938; Dormann, et al. (1997) Infect. Immun. 65:101-109). Las proteínas de sortasa se describen (véase, e.g., Bierne, et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:869-881). Dos fosfolipasas, PI-PLC (codificada por gen plcA) y

PC-PLC (codificada por gen plcB) se describen (véase, e.g., Camilli, et al. (1993) Mol. Microbiol. 8: 143-157; Schulter, et al. (1998) Infect. Immun. 66:5930-5938). La proteína p60 se describe (Pilgrim, et al. (2003) Infect. Immun. 71:34733484).

Esta descripción también contempla una Listeria atenuada en al menos un factor regulador, e.g., un promotor

o un factor de transcripción. Lo siguiente se refiere a promotores. La expresión de ActA se regula por dos diferentes promotores (Lauer, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4177-4186). Juntas, inlA e inlB se regulan por cinco promotores (Lingnau, et al. (1995) Infect. Immun. 63:3896-3903). El factor de transcripción prfA se requiere para la transcripción de un número de genes L. monocytogenes, e.g., hly, plcA, ActA, mpl, prfA, e iap. Las propiedades reguladoras por PrfA se encuentran mediadas por, e.g., el promotor dependiente de PrfA (PinlC) y el recuadro de PrfA. La presente descripción, en ciertas modalidades, proporciona una codificación de ácido nucleico inactivada, mutada, o suprimida en al menos un promotor de ActA, promotor de inlB, PrfA, PinlC, recuadro de PrfA, y lo similar (véase, e.g., Lalic-Mullthaler, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42: 111-120; Shetron-Rama, et al. (2003) Mol. Microbiol. 48: 1537-1551; Luo, et al. (2004) Mol. Microbiol. 52:39-52). La PrfA puede hacerse constitutivamente activo por una mutación Gly145Ser, mutación Gly155Ser, o mutación Glu77Lys (véase, e.g., Mueller y Freitag (2005) Infect. Immun. 73:1917-1926; Wong yFreitag (2004) J. Bacteriol. 186:6265-6276; Ripio, et al. (1997) J. Bacteriol. 179:1533-1540).

La atenuación puede efectuarse por, e.g., tratamiento térmico o modificación química. La atenuación también puede efectuarse por modificación genética de un ácido nucleico que modula, e.g, el metabolismo, el crecimiento extracelular, o el crecimiento intracelular, la modificación genética de un ácido nucleico que codifica un factor de virulencia, tal como prfA listerial, ActA, listeriolisina (LLO), un factor mediador de adhesión (e.g., una internalina tal como inlA o inlB), mpl, fosfolipasa C de fosfatidilcolina (PC-PLC), fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC; gen plcA), cualquier combinación de las anteriores, y lo similar. La atenuación puede ser valorada al comparar una función biológica de una Listeria atenuada con la función biológica correspondiente mostrada por una Listeria genitora adecuada.

La presente descripción, en otras modalidades, proporciona una Listeria que se atenúa al tratarse con un agente que tiene como objetivo el ácido nucleico, tal como un agente reticulante, un psoralen, un nitrógeno mostaza, cis-platina, un aducto voluminoso, luz ultravioleta, irradiación gamma, cualquier combinación de los mismos, y lo similar. Típicamente, la lesión producida por una molécula de agente reticulante incluye la degradación de ambos filamentos de la doble hélice. La Listeria de esta descripción también puede atenuarse al mutar al menos un gen de reparación de ácido nucleico, e.g., uvrA, uvrB, uvrC, uvrD, uvrAB, phrA, y/o un gen que media la reparación derecombinación, e.g., recA. Además, esta descripción proporciona una Listeria atenuada tanto por un agente que tiene como objetivo un ácido nucleico como por mutación de un gen de reparación de ácido nucleico. Adicionalmente, esta descripción comprende el tratamiento con un agente que tiene como objetivo un ácido nucleico sensible a la luz, tal como un psoralen, y/o un agente reticulante de ácido nucleico sensible a la luz, tal como psoralen, seguido por la exposición a luz ultravioleta.

En algunas modalidades, la Listeria de esta descripción se atenúan. Las Listeria atenuadas útiles en la presente invención se describen en, e.g., las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 2004/022887 y 2004/0197343. Se proporcionan varios ensayos para valorar si una cepa particular de Listeria tiene la atenuación deseada, e.g., en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 2004/0228877, 2004/0197343, y 2005/0249748.

(d). Cepas de Listeria.

Esta descripción suministra un número de especies listeriales y cepas para elaborar o diseñar una Listeria atenuada de la presente invención (Tabla 4). La Listeria de la presente invención no se limitará por las especies y las cepas descritas en esta tabla.

Tabla 4. Cepas de Listeria adecuadas para uso en la presente invención, e.g., como una vacuna o como una fuente de ácidos nucleicos.

L. monocytogenes 10403S tipo silvestre: Bishop y Hinrichs (1987) J. Immunol. 139:2005-2009; Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186.

L. monocytogenes DP-L4056 (fago curado). La cepa 10403S curada por profago se designa DP-L4056.: Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186.

L. monocytogenes DP-L4027, que es DP-L2161, fago curado, suprimido en gen hly.: Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186; Jones y Portnoy (1994) Infect. Immunity 65:5608-5613.

L. monocytogenes DP-L4029, que es DP-L3078, fago curado, suprimido en ActA.: Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186; Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-538.

L. monocytogenes DP-L4042 (delta PEST): Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4097 (LLO-S44A).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4364 (delta IplA; ligasa de roteína de lipoato): Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4405 (delta inlA).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4406 (delta inlB).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes CS-L000l (delta ActA-delta inlB).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes CS-L0002 (delta ActA-delta lplA).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes CS-L0003 (L461T-delta lplA).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4038 (delta ActA-LLO L461T).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes DP-L4384 (S44A-LLO L461T).: Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1383213837; información de apoyo.

L. monocytogenes. Mutación en ligasa de proteína de lipoato (LoIA 1).: O'Riordan, et al. (2003) Science 302:462-464.

L. monocytogenes DP-L4017 (10403S hly (L461T) mutación por puntos en gen de hemolisina.: Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. de Serie 60/490,089 presentada el 24 de Julio de 2003.

L. monocytogenes EGD.: No. de Acceso de GenBank AL591824.

L. monocytogenes EGD-e.: No. de Acceso de GenBank NC_003210. ATCC Acc. No. BAA679.

L. monocytogenes cepa EGD, genoma completo, segmento 3/12: No. de Acceso de GenBank AL591975

L. monocytogenes.: ATCC Nos. 13932; 15313; 19111-19120; 43248-43251; 5177251782.

L. monocytogenes DP-L4029: Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. de Serie

suprimida en uvrAB.: 60/541,515 presentada el 2 de Febrero de 2004; Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. de Serie 60/490,080 presentada el 24 de Julio de 2003.

L. monocytogenes DP-L4029 suprimida en uvrAB tratada con Psoralen.: Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. de Serie 60/541,515 presentada el 2 de Febrero de 2004.

L. monocytogenes ActA-/inlB-doble mutante: Depositado con ATCC el 3 de Octubre de 2003. No. Acceso PTA5562.

L. monocytogenes mutante lplA o mutante hly: Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20040013690 de Portnoy, et al.

L. monocytogenes DAL/DAT doble mutante: Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20050048081 de Frankel y Portnoy.

L. monocvtogenes str. 4b F2365: No. de Acceso de GenBank 002973

Listeria ivanovii: No. ATCC 49954

Listeria innocua Clip11262.: No. de Acceso de GenBank NC_003212; AL592022.

Listeria innocua, una cepa hemolítica que ocurre naturalmente que contiene la aglomeración de gen de virulencia regulada por PrfA: Johnson, et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:4256-4266.

Listeria seeligeri.: Howard et al. (1992) Appl. Eviron. Microbiol. 58:709-712.

Listeria innocua con genes de isla de patogenicidad: Johnson, et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:4256-4266.

Listeria innocua con L. monocytogenes gen de internalina A, como un plásmido o como un ácido nucleico genómico: Véase, e.g., Lingnau, et al. (1995) Infection Immunity 63:3896-3903; Gaillard, et al. (1991) Cell 65:1127-1141).

La presente invención comprende reactivos y métodos que comprenden las cepas listeriales anteriores, así como estas cepas que se modifican, e.g., por un plásmido y/o por integración genómica, para contener un ácido nucleico que codifica uno de, o cualquier combinación de, los siguientes gentes: hly (LLO; listeriolisina); iap (p60); inlA; inlB; inlC; dal (alanina racemasa); daaA (dat; aminotransferasa de aminoácido D); plcA; plcB; ActA; o cualquier ácido nucleico que media el crecimiento, dispersión, ruptura de una vesícula con pared única, ruptura de una vesícula con pared doble, uniéndose a una célula huésped, toma por una célula huésped. La presente invención no se limitará por las cepas particulares anteriormente descritas.

(e). Antígenos

La presente descripción, en ciertas modalidades, proporciona un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, un antígeno con uno o más cambios conservadores, uno o más epítopes de un antígeno específico, o un péptido o polipéptido que es inmunológicamente de reactividad cruzada con un antígeno (Tabla 5). Los ácidos nucleicos y antígenos de esta descripción no se limitarán a aquellos descritos en la tabla.

Tabla 5. Antígenos.

Antígeno: Referencia

Antígenos de Tumor

Mesotelina: No. de Acceso de GenBank NM_005823; 040434; NM_O l3404; BC003512 (véase también, e.g., Hassan, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:39373942; Muminova, et al. (2004) BMC Cancer 4: 19; Iacobuzio-Donahue, et al. (2003) Cancer Res. 63:8614-8622).

Proteína asociada 1 – tumor Wilms (Wt-1) incluyendo isoforma A; isoforma B; isoforma C; isoforma D.: WT-1 isoforma A (Nos. de Acceso de GenBank NM-000378; NP-000369). WT-1 isoforma B (Nos. de Acceso de GenBank. NM-024424; NP-077742). WT-1 isoforma C (Nos. de Acceso de GenBank NM_024425; NP_077743). WT-1; isoforma D (Nos. de Acceso de GenBank NM-024426; NP-077744).

Enzima quimotríptica de del estrato córneo (SCCE), y variantes de la misma.: No. de Acceso de GenBank NM_005046; NM_l39277; AF332583. Véase también, e.g., Bondurant, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:3446-3454; Santin, et al. (2004) Gynecol. Oncol. 94:283-288; Shigemasa, et al. (2001) Int. J. Gynecol. Cancer 11:454-461; Sepehr, et al. (2001) Oncogene 20:7368-7374.

Proteína A relacionada a cadena de clase I MHC (MICA); proteína A relacionada a cadena clase I MHC (MICB).: Véase, e.g., Groh, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:6461-6466; Nos. de Acceso de GenBank NM_000247; BC_016929; AY750850; NM_005931.

Gastrina y péptidos derivados de gastrina; receptor de: Harris, et al. (2004) Cancer Res. 64:5624-5631;

gastrina/CCK-2 (también conocido como CCK-B).: Gilliam, et al. (2004) Eur. J. Surg. Oncol. 30:536543; Laheru and Jaffee (2005) Nature Reviews Cancer 5:459-467.

Glipican-3 (un antígeno de, e.g., melanoma y carcinoma hepatocelular): No. de Acceso de GenBank NM_004484. Nakatsura, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 16-25; Capurro, et al. (2003) Gasteroenterol. 125:8997; Nakatsura, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:6612-6621).

Proteína tipo coactosina: Nakatsura, et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:826836; Laheru y Jaffee (2005) Nature Reviews Cancer 5:459-467.

Antígeno de célula germinal de próstata (PSCA).: No. de Acceso de GenBank AF043498; AR026974; AR302232 (véase también, e.g., Argani, et al. (2001) Cancer Res. 61:4320-4324; Christiansen, et al. (2003) Prostate 55:9-19; Fuessel, et al. (2003) 23:221-228).

Fosfatasa de ácido de próstata (PAP); antígeno específico de próstata (PSA); PSM; PSMA.: Small et al. (2000) J. Clin. Oncol. 18:3894-3903; Altwein y Luboldt (1999) Urol. Int. 63:62-71; Chan et al., (1999) Prostate 41:99-109; Ito, et al. (2005) Cancer 103:242-250; Schmittgen, et al. (2003) Int. J. Cancer 107:323-329; Millon, et al. (1999) Eur. Urol. 36:278-285.

Antígeno epitelial de seis transmembranas de próstata (STEAP).: Véase, e.g., Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; No. de Acceso de GenBank NM_018234; NM_001008410; NM_182915; NM_024636; NM_012449; BC011802.

Antígeno 1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1): Véase, e.g., Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; No. de Acceso de GenBank L78132.

Gen-1 inductor de tumor de próstata (PTI-1): Véase, e.g., Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442

Gen específico de próstata con homología a receptor acoplado por proteína G: Véase, e.g., Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442

Prostasa (una serina proteasa regulada por antrógeno): Véase, e.g., Machlenkin, et al. (2005) Cancer Res. 65:6435-6442; No. de Acceso de GenBank BC096178; BC096176; BC096175.

Proteinasa 3.: No. de Acceso de GenBank X55668.

Antígenos de testículo con cáncer, e.g., NY-ESO-1; SCP-1; SSX-1;: No. de Acceso de GenBank NM_001327 (NY-ESO1) (véase también, e.g., Li, et al. (2005) Clin. Cancer Res

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MAGE-A9; MAGE-A10; MAGE-A12; GAGE-3/6; NT-SAR-35;: al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2651-2656;

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Ras, e.g., ras tipo silvestre, ras con mutacoines en codón 12, 13, 59 o 61, e.g., mutaciones G12C; G12D; G12R; G12S; G12V; G13D; A59T; Q61H. K-RAS; H-RAS; N-RAS.: Nos. de Acceso de GenBank P01112; P01116; M54969; M54968; P01111; P01112; K00654. Véase también, e.g., Nos. de Acceso de GenBank M26261; M34904; K01519; K0l520; BC006499; NM_006270; NM_002890; NM.:_004985; NM_033360; NM_176795; NM_005343.

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Antígenos de melanoma, incluyendo antígenos de célula melanoma HST-2.: No. de Acceso de GenBank NM_206956; NM_206955; NM_206954; NM_206953; NM_0061 lS; NM_005367; NM_004988; AY l48486; Ul0340; Ul0339; M7748l. Véase, e g., Suzuki, et al. (1999) J. Immunol. 163:2783-2791.

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Cinesina 2; factor modulador 1 de elemento TATA; proteína de tumor D53; NY: Scanlan, et al. (2001) Cancer lmmun. 30:1-4;

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Antígeno carcinoembriónico (CEA), péptido de combatiente reforzador CAP1-6D: No. de Acceso de GenBank M29540; E03352; X983l1; M17303 (véase también, e.g., Zaremba (1997) Cancer Res. 57:4570-4577; Sarobe, et al. (2004) Curr. Cancer Drug Targets 4:443-454; Tsang, et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:2439-2449; Fong, et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814).

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Telomerasa (TERT).: Nair, et al. (2000) Nat. Med. 6:1O11-1O17.

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Anexia, e.g., Anexina II.: Zimrnerman, et al. (2004) Virchows Arch. 445:368374.

BCR/ABL; BCR/ABL-p210; BCR/ABL p190; CML-66; CML28.: Cobaldda, et al. (2000) Blood 95:1007-1013; Hakansson, et al. (2004) Leukemia 18:538-547; Schwartz, et al. (2003) Semin. Hematol. 40:87-96; Lim, et al. (1999) Int. J. Mol. Med. 4:665-667.

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Proteína 17 de esperma (SP17); 14-3-3-zeta; MEMD; KIAA0471; TC21: Arora, et al. (2005) Mol. Catcinog. 42:97-108

Proteínas 1 y 2 relacionadas a tirosinasa (TRP-1 y TRP-2): No. de Acceso de GenBank N_001922. (véase también, e.g., Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).

gp100/pmel-17: Nos. de Acceso de GenBank AH003567; U31798; U31799; U31807; U31799 (véase también, e.g., Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).

TARP.: Véase, e.g., Clifton, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:10166-10171; Virok, et al. (2005) Infection Immunity 73:1939-1946

Proteínas 1 y 2 relacionadas a tirosinasa (TRP-1 y TRP-2): No. de Acceso de GenBank NM_001922. (véase también, e.g., Bronte, et al. (2000) Cancer Res. 60:253-258).

Receptor de melanocortina 1 (MC1R); MAGE-3; gp100; tirosinasa; dopacromo tautomerasa (TRP-2); MART-1: Salazar-Onfray, et al. (1997) Cancer Res. 57:43484355; Reynolds, et al. (1998) J. Immunol. 161:69706976; Chang, et al. (2002) Clin. Cancer Res. 8:10211032.

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Antígenos Francisella tularensis

Francisella tularensis A Y B.: Genoma completo de subespecie Schu S4 (No. de Acceso de GenBank AJ749949); de subespecie Schu 4 (No. de Acceso de GenBank NC_006570). Outer membrane protein (43 kDa) Bevanger, et al. (1988) J. Clin. Microbiol. 27:922-926; Porsch-Ozcurumez, et al. (2004) Clin. Diagnostic. Lab. Immunol. 11:1008-1015). Los componentes antigénicos de F. tularensis incluyen, e.g., 80 antígenos, incluyendo 1O kDa and 60 kDa chaperoninas (Havlasova, et al. (2002) Proteomics 2:857-86), cinasa de difosfato de nucleósido, deshidrogenasa de isocitrato, proteína de enlace de

ARN Hfq, la chaperona C1pB (Havlasova, et al. (2005) Proteomics 5:2090-2103). Véase también, e.g., Oyston y Quarry (2005) Antonie Van Leeuwenhoek 87:277-281; Isherwood, et al. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev. 57:1403-1414; Biagini, et al. (2005) Anal. Bioanal. Chem. 382:1027-1034.

Antígenos Malarios

Proteína circumsporozoito (CSP); SSP2; HEP17; ortólogos Exp-1 encontrados en P. falciparum; y LSA-1.: Véase, e.g., Haddad, et al. (2004) Infection Immunity 72:1594-1602; Hoffinan, et al. (1997) Vaccine 15:842-845; Oliveira-Ferreira y Daniel-Ribeiro (2001) Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Río de Janeiro 96:221227. CSP (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank ABI21024). SSP2 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AF249739). LSA-1 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank Z30319).

Proteína survace de eritrocio infectado anular (RESA); proteína 2 de superficie de merozoito (MSP2); Spf66; proteína 1 de superficie de merozoito (MSP1); 195A; BVp42.: Véase, e.g., Stimadel, et al. (2000) lnt. J. Epidemial. 29:579-586; Krzych, et al. {1995) J. Immunol. 155:4072-4077. Véase también, Good, et al. (2004) lmmunol. Rev. 201:254-267; Good, et al. (2004) Ann. Rev. Immunol. 23:69-99. MSP2 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank X96399; X96397). MSPl (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank X03371). RESA (véase, e.g., GenBank. Acc. No. X05181; X05182).

Antígeno 1 de membrana apical (AMA1).: Véase, e.g., Gupta, et al. (2005) Protein Expr. Purif. 41: 186-198. AMA1 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank A' 13; AJ494905; AJ490565).

Virus y antígenos virales

Hepatitis A: GenBank Acc. Nos., e.g., NC_001489; AY644670; X83302; K02990; M14707.

Hepatitis B: Genoma completo (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AB214516; NC_003977; AB205192; AB205191; AB205190; AJ748098; AB198079; AB198078; AB198076; AB074756).

Hepatitis C: Genoma completo (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_004102; AJ238800; AJ238799; AJ132997; AJ132996; AJ000009; D84263).

Hepatitis D: Nos. de Acceso de GenBank, e.g. NC_001653; ABl18847; AY261457.

Virus de papiloma humano incluyendo: Véase, e.g., Trimble, et al. (2003) Vaccine 21:4036-4042; Kim, et al.

todos los subtipos 200+ (clasificados en: (2004) Gene Ther. 11:1011-1018; Simon, et al. (2003) Eur. J. Obstet.

16 grupos), tales como los subtipos de: Gynecol. Reprod, Biol. 109:219-223; Jung, et al. (2004) J. Microbio J.

alto riesgo 16, 18, 30, 31, 33, 45.: 42:255-266; Damasus-Awatai y Freeman-Wang (2003) Curr. Opin.

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Virus linfotrópico de célula T humana: Véase, e.g., Capdepont, et al. (2005) AIDS Res. Hum. Retrovirus 21:28

(HTLV) tipos I y II, incluyendo los tipo I: 42; Bhigjee, et al. (1999) AIDS Res. Hum. Restrovirus 15:1229-1233;

HTLV subtipos Cosmpolita, Africa: Vandamme, et al. (1998) J. Virol. 72:4327-4340; (1996) J. Acquir.

Central, y Austro-Melanesio, y los HTLV: Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 13:384-391. HTLV tipo I (véase,

tipo II subtipos IIa, IIb, IIc, y IId.: e.g., Nos. de acceso de GenBank AY563954; AY563953. HTLV tipo II

(véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank L03561; Y13051;

AF139382).

Coronaviridae, incluyendo Coronavirus,: Véase, e.g., Brian y Baric (2005) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 287:1

tales como coronavirus SARS (SARS: 30; Gonzalez, et al. (2003) Arch. Virol. 148:2207-2235; Smits, eta/.

CoV), y Torovirus: (2003) J. Virol. 77:9567-9577; Jamieson, et al. (1998) 1.lnfect. Dis.

178:1263-1269 (Nos. de Acceso de GenBank AY348314; NC_004718;

AY394850).

Virus de rubeola: Nos. de Acceso de GenBank NC_00154S; AF435866

Virus de paperas, incluyendo los genotipos A, C, D, G, H e I.: Véase, e.g., Orvell, et al. (2002) J. Gen. Virol. 83:2489-2496. Véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AY681495; NC_002200; AY685921; AF201473.

Virus de Coxsackie A incluyendo los serotipos 1, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20,: Véase, e.g., Brown, et al. (2003) J. Virol. 77:8973-8984. Nos. de Acceso de GenBank AY421768; AY790926: X67706.

21, 22 y 24 (también conocidos como enterovirus humano C; HEV-C).

Virus de Coxsackie B, incluyendo los subtipos 1-6.: Véase, e.g., Ahn, et al. (2005) J. Med. Virol. 75:290-294; Patel, et al. (2004) J. Virol. Methods 120:167-172; Rezig, et al. (2004) J. Med. Viral. 72:268-274. No. de Acceso de GenBank X05690.

Enterovirus humano incluyendo, e.g.,: Véase, e.g., Oberste, et al. (2004) J. Viral. 78:855-867. Enterovirus A

enterovirus humano A (HEV-A, CAV2 a: humano (Nos. de Acceso de GenBank NC_0016l2); enterovirus B

CAV8, CAV10, CAV12, CAV14, CAV16,: humano (NC_001472); enterovirus C humano (NC_001428);

y EV71) y también incluyendo HEV-B: enterovirus D humano (NC_001430). Enterovirus A de simio (No. de

(CAV9, CBV1 a CBV6, E1 a E7, E9, E11: Acceso de GenBank NC_003988).

a E21, E24 a E27, E29 a E33 y EV69 y

E73), así como HEV.

Poliovirus incluyendo PV1, PV2 y PV3.: Véase, e.g., He, et al. (2003) J. Virol. 77:4827-4835; Hahsido, et al. (1999) Microbiol. Immunol. 43:73-77. No. de Acceso de GenBank AJl 32961 (type 1); AY278550 (tipo 2); X04468 (tipo 3).

Encefalitidos virales, virus, incluyendo: Véase, e.g., Hoke (2005) Mil. Med. 170:92-105; Estrada-Franco, et al.

encefalitis de equino, encefalitis de: (2004) Emerg. Infect. Dis. 10:2113-2121; Das, et al. (2004) Antiviral

equino venezolano (VEE) (incluyendo los: Res. 64:85-92; Aguilar, et al. (2004) Emerg. Infect. Dis. 10:880-888;

subtipos IA, IB, IC, ID, IIIC, IIID),: Weaver, et al. (2004) Arch. Virol. Suppl. 18:43-64; Weaver, et al. (2004)

encefalitis de equino oriental (EEE),: Annu. Rev. Entorno. 49:141-174. Encefalitis de equino Oriental (No. de

encefelatis de equino occidental (WEE),: Acceso de GenBank NC_003899; AY722102); Encefalitis de equino

encefalitis de San Luis, encefelatis de: Occidental (NC_003908).

Valle Murray (Australia), encefalitis

japonesa y encefalitis nacido por

garrapata

Virus de herpes humano, incluyendo citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus de herpes: Véase, e.g., Sttidahl, et al. (2000) Scand. J. Infect. Dis. 32:237-248; Padilla, et al. (2003) J. Med. Virol. 70 (Suppl. 1) 8103-Sl 10; Jainkittivong y Langlais

humano 1, (HHV-1), HHV-2, HHV-3,: (1998) Oral Surg. Oral Med. 85:399-403. Nos. de GenBank

HHV-4, HHV-5, HHV-6, HHV-7, HHV-8,: NC_001806 (virus de herpes 1); NC:001798 (virus de herpes 2);

virus de herpes B, virus simple de herpes: X04370 y NC_001348 (virus de herpes 3); NC_OO I345 (virus de

tipos 1 y 2 (HSV-1, HSV-2), y virus de: herpes 4); NC_001347 (virus de herpes 5); X83413 y NC_000898 (virus

varicela zoster (VZV).: de herpes 6); NC_001716 (virus de herpes 7). Virus de herpes humano

tipos 6 y 7 (HHV-6; IIlIV-7) se describen por, e.g., Padilla, et al. (2003)

J. Med. Virol. 70 (Suppl. 1)S103-S110. Virus de herpes humano 8

(HHV-8), incluyendo los subtipos A-E, se describen en, e.g., Treumicht,

et al. (2002) J. Med. Virul. 66:235-240.

VIH-1 incluyendo grupo M (incluyendo subtipos A a J) y grupo O (incluyendo cualquiera: Véase, e.g., Smith, et al. (1998) J. Med. Virol. 56:264-268. Véase también, e.g., Nos. de Acceso de GenBank DQ054367; NC_001802; AY9683

de los subtipos distinguibles) (VIH-2, incluyendo supbtipos A-E).: I 2; DQ0I1180; DQ0I1179; DQ0I1178; DQ0l1177; AY588971; AY588970; AY781127; AY781126; AY970950; AY970949; AY970948; X61240; AJ006287; AJ508597; y AJ508596.

Virus de Epstein-Barr (EBV), incluyendo los subtipos A y B.: Véase, e.g., Peh, et al. (2002) Pathology 34:446-450. Virus de Epstein-Barr cepa B95-8 (No. de Acceso de GenBank V01555).

Reovirus, incluyendo los serotipos y cepas 1, 2, y 3, tipo 1 Lang, tipo 2 Jones, y tipo 3 Dearing.: Véase, e.g., Barthold, et al. (1993) Lab. Anim. Sci. 43:425-430; Roner, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12362-12366; Kedl, et al. (1995) J. Virol. 69:552-559. No. de Acceso de GenBank K02739

(proteína de superficie de gen sigma-3).

Citomegalovirus (CMV) subtipos que incluyen CMV subtipos I-VII.: Véase, e.g., Chern, et al. (1998) J. lnfect. Dis. 178:1149-1153; Vilas Boas, et al. (2003) J. Med. Virol. 71:404-407; Trincado, et al. (2000) J. Med. Virol. 61:481-487. No. de Acceso de GenBank X17403.

Rinovirus incluyendo todos los serotipos.: Rinovirus humano 2 (No. de Acceso de GenBank X02316); Rinovirus

humano B (No. de Acceso de GenBank NC_OOI490); Rinovirus

humano 89 (No. de Acceso de GenBank NC 001617); Rinovirus

humano 39 (No. de Acceso de GenBank AY751783).

Adenovirus, incluyendo todos los: AY803294; NC_004001; AC_000019; AC_000018; AC_000017;

serotipos: AC_OOOOlS; AC_000008; AC_000007; AC_OOOQ06; AC_OOOOOS;

AY737798; AY737797; NC_003266; NC_002067; AY594256;

AYS94254; AY875648; AJ854486; AY163756; AY594255; AY594253;

NC_001460 NC_001405; AYS98970; AY458656; AY487947;

NC_001454; AF534906; AY45969; AY128640; L19443; AY339865;

AF532578.

Virus de varicela zoster incluyendo las cepas y genotipos Oka, Dumas, Europea, Japonesa, y Mosaico.: Véase, e.g., Loparev, et al. (2004) J. Virol. 78:8349-8358; Carr, et al. (2004) J. Med. Virol. 73:131-136; Takayama and Takayama (2004) J. Clin. Virol. 29:113-119.

Filovirus, incluyendo virus de Marburg y: Véase, e.g., Geisbert y Jahrling (1995) Virus Res. 39:129-150;

virus de Ebola, y cepas tales como: Hutchinson, et al. (2001) J. Med. Virol. 65:561-566. Virus de Marburg

Ebola-Sudán (EBO-S), Ebola-Zaire: (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank NC_001608). Virus de Ebola

(EBO-Z), y Ebola-Reston (EBO-R).: (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_006432; AY769362; NC_002549; AF272001; AF086833).

Arenavirus, incluyendo virus: Virus de Jinus, segmento S (No. de Acceso de GenBank NC_005081);

coriomeningitis linfocítico (LCM), virus de: virus de Junin virus, segmento L (No. de Acceso de GenBank

Lassa, virus de Junin, y virus de: NC_005080).

Machupo

Virus de Rabia: Véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_001542; AY956319; AY705373; AF499686; AB 128149; AB085828; AB009663.

Arbovirus, incluyendo virus de Nilo Oeste, Virus de Dengue 1 a 4, virus de fiebre por: Virus de Dengue tipo 1 (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AB 195673; AY762084). Virus de Dengue tipo 2 (véase, e.g.,

garrapata de Colorado, virus de Sindbis,: Nos. de Acceso de GenBank NC_001474; AY702040; AY702039;

Togaviraidae, Flaviviridae, Bunyaviridae,: AY702037). Virus de Dengue tipo 3 (véase, e.g., Nos. de Acceso de

Reoviridae, Rhabdoviridae,: GenBank AY923865; AT858043). Virus de Dengue tipo 4 (véase, e.g.,

Orthomyxoviridae, y lo similar.: Nos. de Acceso de GenBank AY947539; AY947539; AF326573). Virus

de Sindbis (véase e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_001547;

AF429428; J02363; AF103728). Virus de Nilo Oeste (véase, e.g., Nos.

de Acceso de GenBank NC_001563; AY603654).

Poxvirus incluyendo orthopoxvirus (virus: Virus de viruela (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_001611;

de viruela, virus de viruela de los simios,: Y16780; X72086; X69198).

virus de vacuna, virus del ganado),

yatapoxvirus (virus tanapox, virus de

tumor de mono Yaba), parapoxvirus, y

molluscipoxvirus.

Fiebre amarilla: Véase, e.g., No. de Acceso de GenBank NC_00203l; AY640589; X03700.

Hantavirus, incluyendo serotipos Hantaan (HTN), Seul (SEO), Dobrava: Véase, e.g., Elgh, et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1122-1130; Sjolander, et al. (2002) Epidemiol. Infect. 128:99-103; Zeier, et al.

(DOB), Sin Nombre (SN), Puumala (PUU) y Saaremaa tipo Dobrava (SAAV).: (2005) Virus Genes 30:157-180. No. de Acceso de GenBank NC_005222 y NC_005219 (Hantavirus). Véase también, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_005218; NC_005222; NC_005219.

Flavivirus, incluyendo virus de Dengue, virus de encefalitis Japonesa, virus de Nilo Oeste, y virus de Fiebre amarilla.: Véase, e.g., Mukhopadhyay, et al. (2005) Nature Rev. Microbiol. 3:1322. Nos. de Acceso de GenBank NC_001474 y AY702040 (Dengue). Nos. de Acceso de GenBank NC_001563 y AY603654.

Virus de sarampión: Véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AB040874 y AY486084.

Virus de parainfluenza humana (HPV), incluyendo HPV tipos 1-56.: Virus de parainfluenza humana 2 (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AB 176531; NC003443). Virus de parainfluenza humana 3

(véase, e.g., No. de Acceso de GenBank NC_001796).

Virus de influenza, incluyendo virus de influenza tipos A, B, y C.: Nucleocápsida de influenza (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY626145). Hemaglutinina de influenza (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AY627885; AY555153). Neuraminidasa de influenza (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AY555151; AY577316). Proteína de matriz de influenza 2 (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AY626l44. Proteína básica de influenza 1 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY627897). Proteína de ácido de polimerasa de influenza (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY627896). Nucloproteína de influenza (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY627895).

Virus de influenza A, subtipos, e.g., virus de cerdo (SIV):: Hemaglutinina de H1N1 (No. de Acceso de GenBank 867220). Proteína de matriz de virus de influenza A (No. de Acceso de

influenza A H1N1 y virus de influenza de: GenBank AY700216). Nucleoproteína H5H1 de virus de influenza A

cerdo: (No. de Acceso de GenBank AY646426). Hemaglutinina H1N1 (No. de

Acceso de GenBank 000837). Véase también, Nos. de Acceso de

GenBank BD006058; 80006055; 80006052. Véase también, e.g.,

Wentworth, et al. (1994) J. Virol. 68:2051-2058; Wells, et al. (1991)

J.A.M.A. 265:418-481.

Virus sincitial respiratorio (RSV), incluyendo subgrupo A y subgrupo B.: Virus sincitial respiratorio (RSV) (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AY353550; NC 001803; NC001781).

Rotavirus, incluyendo rotavirus humano: Rotavirus humano C segmento 8 (No. de Acceso de GenBank

A a E, rotavirus de bovino, rotavirus de: AJ549087); rotavirus humano proteína cápsida exterior cepa G9

mono Rhesus, y reordenamientos de: (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank DQ056300); rotavirus humano

RVV humano.: proteína no estructural cepa 4 (véase, e.g., No. de

Acceso de GenBank AY548957); rotavirus humano proteína cápsida interior mayor cepa A (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY601554).

Poliomavirus, incluyendo virus de simio: Véase, e.g., Engels, et al. (2004) J. Infect. Dis. 190:2065-2069; Vilchez

40 (SV40), virus JC (JCV) y virus BK: y Butel (2004) Clin. Microbiol. Rev. 17:495-508; Shivapurkar, et al.

(BKV).: (2004) Cancer Res. 64:3757-3760; Carbone, et al. (2003) Oncogene

2:5173-5180; Barbanti-Brodano, et al. (2004) Virology 318: 1-9) (SV40

genoma completo en, e.g., Nos. de Acceso de GenBank NC_001669;

AF168994; AY271817; AY271816; AY120890; AF3453M; AF332562).

Coltivirus, incluyendo virus de fiebre por: Attoui, et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:2481-2489. Segmentos de virus

garrapata de Colorado, virus Eyach: Eyach (véase, e.g., Nos. de Acceso de GenBank AF282475;

AF282472; AF282473; AF282478; AF282476; NC_003707;

NC_003702;

NC_003703; NC_003704; NC_003705; NC_003696; NC_003697; NC_003698; NC_003699; NC_003701; NC_003706; NC_003700; AF282471; AF282477).

Calcirus, inclyendo los genogrupos Norovirus, grupo de Montaña Rocosa (SMA), y Saaporo.: Virus de Montaña Rocosa (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AY134748).

Parvoviridae, incluyendo dependovirus,: Véase, e.g., Brown (2004) Dev. Biol. (Basel) 118:71-77; Alvarez

parvovirus (incluyendo parvovirus B19) y: Lafuente, et al. (2005) Ann. Rheum. Dis. 64:780-782; Ziyaeyan, et al.

eritrovirus.: (2005) Jpn. J. Infect. Dis. 58:95-97; Kaufman, et al. (2005) Virology

332:189-198.

La presente descripción proporciona, pero no se limita por, una Listeria atenuada que comprende un ácido nucleico que codifica al menos uno de los antígenos anteriormente exhibidos, o al menos un antígeno codificado por uno de los genomas completos anteriormente exhibidos. La presente descripción comprende ácidos nucleicos que codifican los mutantes, las muteínas, variantes de empalme, fragmentos, variantes truncadas,

variantes solubles, dominios extracelulares, dominios intracelulares, secuencias maduras, y lo similar, de los antígenos exhibidos. Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los epítopes, oligo-y polipéptidos de estos antígenos. También se proporcionan las modalidades optimizadas por codón, es decir, optimizadas para la expresión en Listeria.

En algunas modalidades, el antígeno es no Listerial. En algunas modalidades, el antígeno es de una célula

cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno se deriva de un antígeno de una célula

cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, un antígeno que se “deriva de” otro antígeno es un

5 fragmento u otro derivado del antígeno. En algunas modalidades, el antígeno derivado comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos, al menos 12 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 75 aminoácidos, al menos 100 aminooácidos, o al menos 200 aminoácidos. En algunas modalidades, el derivado del antígeno tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 85% deidentidad de secuencia, al menos 90% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 95% de identidad de

10 secuencia, o al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia al antígeno del cual se deriva, o un fragmento del mismo. En algunas modalidades, un antígeno derivado comprende un antígeno suprimido de su secuencia de señal y/o membrana sujetadora. En algunas modalidades, un antígeno derivado de otro antígeno comprende al menos un epítope MHC clase I y/o al menos un epítope MHC clase II del antígeno original (longitud completa). En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno tumoral. Los ensayos para probar la

15 inmunogenicidad de antígenos se describen en la presente y son muy conocidos en la materia.

En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es un antígeno tumoral humano o un antígeno derivado de

un antígeno tumoral humano. En algunas modalidades, el antígeno derivado de un antígeno tumoral consiste de una

secuencia de aminoácidos que describe al menos aproximadamente 65% de identidad de secuencia al antígeno

tumoral, al menos 70% de identidad de secuencia al antígeno tumoral, o al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia al antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno derivado consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos 85% de identidad de secuencia al antígeno tumoral, al menos 90% de identidad de secuencia al antígeno tumoral, o al menos 95% de identidad de secuencia al antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno derivado del antígeno tumoral comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos del antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno derivado del antígeno tumoral consiste de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, o 200 aminoácidos contiguos del antígeno tumoral.

En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o derivado de mesotelina. En algunas modalidades, la mesotelina es humana. En algunas modalidades, la mesotelina es de longitud completa (e.g., mesotelina humana de longitud completa). En algunas modalidades, el antígeno derivado de mesotelina comprende mesotelina (e.g., mesotelina humana) suprimida en su secuencia de señal, suprimida en su GPI de anclaje o suprimida tanto en la secuencia de señal como GPI de anclaje. El polinucleótido que codifica la mesotelina puede ooptimizarse por codón u optimizarse por no codón para expresión en Listeria.

En algunas modalidades, el antígeno derivado de mesotelina consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos aproximadamente 65% de identidad de secuencia a mesotelina humana, al menos 70% de identidad de secuencia a mesotelina humana, o al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia a mesotelina humana. En algunas modalidades, la secuencia de polipéptido de mesotelina consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos 85% de identidad de secuencia a mesotelina humana, al menos 90% de identidad de secuencia a mesotelina humana, o al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno derivado de mesotelina comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos de un polipéptido de mesotelina, tal como mesotelina humana o mesotelina humana suprimida de su secuencia de péptido de señal y/o GPI de anclaje. En algunas modalidades, el antígeno derivado de mesotelina consiste de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos contiguos de un polipéptido de mesotelina, tal como mesotelina humana o mesotelina humana suprimida de su secuencia de péptido de señal y/o GPI de anclaje.

En ciertas modalidades, el antígeno es antígeno de célula germinal de próstata (PSCA), o es un antígeno derivado de PSCA. En algunas modalidades, el PSCA es un PSCA humano. En algunas modalidades, el PSCA es de longitud completa (e.g., PSCA humano de longitud completa). En algunas modalidades, el antígeno derivado de PSCA comprende PSCA (e.g., PSCA humano) suprimido de (a) parte o toda su región de péptido de señal, (b) su región de GPI de anclaje, o (c) su región de GPI de anclaje y parte o toda su región de péptido de señal. El polinucleótido que codifica el PSCA puede optimizarse por codón u optimizarse por no codón para la expresión en Listeria.

Varios ensayos para valorar si un derivado de antígeno en particular puede estimular la inmunogenicidad deseada cuando se expresa en Listeria, se conocen por aquellos expertos en la materia. Los ejemplos específicos se proporcionan en los Ejemplos de abajo. Varios ensayos también se proporcionan, e.g, Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 2004/0228877, 2004/0197343, y 2005/0249748.

En algunas modalidades, el antígeno derivado de PSCA consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos 65% de similitud de secuencia a PSCA humano, al menos 70% de similitud de secuencia a PSCA humano, o al menos aproximadamente 75% de similitud de secuencia a PSCA humano. En algunas modalidades, la secuencia de polipéptido de PSCA consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos 85% de similitud de secuencia a PSCA humano, al menos 90% de similitud de secuencia a PSCA humano, o al menos aproximadamente 95% de similitud de secuencia a PSCA humano. En algunas modalidades, el antígeno derivado de PSCA comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, o 200 aminoácidos de un polipéptido PSCA, tal como PSCA humano o PSCA humano suprimido de su secuencia de péptido de señal y/o GPI de anclaje. En algunas modalidades, el antígeno derivado de PSCA consiste de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos contiguos de un polipéptido PSCA, tal como PSCA humano o PSCA humano suprimido de su secuencia de péptido de señal y/o GPI de anclaje.

En algunas modalidades, el antígeno (e.g., antígeno heterólogo) no comprende un péptido antigénico EphA2 (algunas veces referido como un “polipéptido antigénico EphA2”), como se define y se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2005/0281783 A1. En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 excluido del uso en los métodos y composiciones descritas en la presente puede ser cualquier péptido antigénico EphA2 que sea capaz de producir una respuesta inmune contra las células que expresan EphA2 incluidas en un trastorno hiperproliferativo. De esta manera, en algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 excluido puede ser un polipéptido EphA2 (e.g., el polipéptido EphA2 de SEQ ID NO:2 en la Publicación de Patente de Estados Unidos No.

2005/0281783 A1, o un fragmento o derivado de un polipéptido EphA2 que (1) despliega la habilidad para unir o competir con EphA2 para enlace a un anticuerpo anti-EphA2, (2) despliega la habilidad para generar el anticuerpo que se une a EphA2, y/o (3) contiene uno o más epítopes de célula T de EphA2. En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 es una secuencia codificada por una de las siguientes secuencias de nucleótidos o un fragmento o derivado de las mismas: No. de Acceso de GenBank NM_004431 (Humano); No. de Acceso de GenBank NM_010139 (Ratón); o No. de Acceso de GenBank AB038986 (Chicken, secuencia parcial). En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 es EphA2 humano de longitud completa (e.g., SEQ ID NO:2 de la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2005/0281783 A1). En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 comprende el dominio extracelular de EphA2 o el dominio intracelular de EphA2. En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 consiste de EphA2 de longitud completa o un fragmento del mismo con una sustitución de lisina a metionina en el residuo de aminoácido 646 de EphA2. En algunas modalidades, la secuencia de péptido antigénico EphA2 consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos aproximadamente 65% de similitud de secuencia a EphA2 humano, al menos 70% de similitud de secuencia a EphA2 humano, o al menos aproximadamente 75% de similitud de secuencia a EphA2 humano. En algunas modalidades, la secuencia de polipéptido EphA2 consiste de una secuencia de aminoácidos que describe al menos 85% de similitud de secuencia a EphA2 humano, al menos 90% de similitud de secuencia a EphA2 humano, o al menos aproximadamente 95% de similitud de secuencia a EphA2 humano. En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 excluido consiste de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, o 200 aminoácidos de un polipéptido EphA2. En algunas modalidades, el péptido antigénico EphA2 consiste de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos contiguos de un polipéptido EphA2.

Esta descripción suministra los métodos y los reactivos para estimular la respuesta inmune a infecciones, e.g., infecciones del hígado. Estas incluyen las infecciones de virus hepatotrópicos y virus que median la hepatitis, e.g., virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, y citomegalovirus. Esta descripción contempla los métodos para tratar otros virus hepatotrópicos, tales como virus simple de herpes, virus de Epstein-Barr, y virus de dengue (véase, e.g., Ahlenstiel y Rehermann (2005) Hepatology 41:675-677; Chen, et al. (2005) J. Viral Hepat. 12:38-45; Sun y Gao (2004) Gasteroenterol. 127:1525-1539; Li, et al. (2004) J. Leukoc. Biol. 76: 1171-1179; Ahmad y Alvarez (2004) J. Leukoc. Biol. 76:743-759; Cook (1997) Eur. J. Gasteroenterol. Hepatol. 9:1239-1247; Williams y Riordan (2000) J. Gasteroenterol. Hepatol. 15 (Suppl.)Gl 7-G25; Varani y Landini (2002) Clin. Lab. 48:39-44; Rubín (1997) Clin. Liver Dis. 1:439-452; Loh, et al. (2005) J. Virol. 79:661-667; Shresta, et al. (2004) Virology 319:262-273; Fjaer, et al. (2005) Pediatr. Transplant 9:68-73; Li, et al. (2004) World J. Gasteroenterol. 10:3409-3413; Collin, et al. (2004) J. Hepatol. 41: 174-175; Ohga, et al. (2002) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 44:203-215).

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos y reactivos para el tratamiento y/o prevención de infecciones parasitarias, e.g., infecciones parasitarias del hígado. Estas incluyen, sin limitación, duelas hepáticas (e.g., Clonorchis, Fasciola hepatica, Opisthorchis), Leishmania, Ascaris lumbricoides, Schistosoma, y platelmintos. Los platelmintos incluyen, e.g., nematodos (ascárides), cestodos (solitarias), y trematodos (platelmintos o aletas) (véase, e.g., Tliba, et al. (2002) Vet. Res. 33:327-332; Keiser y Utzinger (2004) Expert Opin. Pharmacother. 5: 1711-1726; Kaewkes (2003) ActA Trop. 88: 177-186; Srivatanakul, et al. (2004) Asian Pac. J. Cancer Prev. 5: 118-125; Stuaffer, et al. (2004) J. Travel Med. 11:157-159; Nylen, et al. (2003) Clin. Exp. Immunol. 131:457-467; Bukte, et al. (2004) Abdom. Imaging 29:82-84; Singh y Sivakumar (2003) 49:55-60; Wyler (1992) Parisitol. Today 8:277-279; Wynn, et al. (2004) Immunol. Rev. 201:156-167; Asseman, et al. (1996) Immunol. Lett. 54:11-20; Becker, et al. (2003) Mol. Biochem. Parasitol. 130:65-74; Pockros y Capozza (2005) Curr. lnfect. Dis. Rep. 7:61-70; Hsieh, et al. (2004) J. Immunol. 173:2699-2704; Korten, et al. (2002) J. Immunol. 168:5199-5206; Pockros y Capozza (2004) Curr. Gastroenterol. Rep. 6:287-296).

Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona los métodos y reactivos para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas, e.g., por bacteria hepatotrópica. Se proporcionan los métodos y reactivos para tratar, e.g., Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, y Salmonella spp (véase, e.g., Cook (1997) Eur. J. Gasteroenterol. Hepatol. 9:1239-1247; Vankayalapati, et al. (2004) J. Immunol. 172:130-137; Sellati, et al. (2001) J. Imrnunol. 166:4131-4140; Jason, et al. (2000) J. Infectious Dis. 182:474-481; Kirby, et al. (2002) J. lmmunol. 169:44504459; Johansson y Wick (2004) J. Immunol. 172:2496-2503; Hayashi, et al. (2004) Intem. Med. 43:521-523; Akcay, et al. (2004) lnt. J. Clin. Pract. 58:625-627; de la Barrera, et al. (2004) Clin. Exp. Immunol. 135:105-113).

En una modalidad adicional, lo heterólogo de la presente invención se deriva de Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), e.g., gp120; gp160; gp41; antígenos gag tales como p24gag o p55 gag, así como la proteína derivada de poI, env, tat, vir, rev, nef, vpr, vpu y regiones LTR de VIH. Los antígenos heterólogos contemplados incluyen aquellos de virus simple de herpes (HSV) tipos 1 y 2, de citomegalovirus, de virus Epstein-Barr, o Virus de Varicela Zoster. También se comprenden los antígenos derivados de un virus de hepatitis, e.g., hepatitis A, B, C, delta, E, o G.Además, los antígenos también comprenden los antígenos de Picornaviridae (poliovirus; rinovirus); Caliciviridae;

Togaviridae (rubeola; dengue); Flaviviridiae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabdoviridae; Orthomyxoviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae (paperas; sarampión); Bunyviridae; Arenaviridae; Retroviradae (HTLV-1; VIH-1); Papilovirus, virus de encefalitis nacido por garrapata, y lo similar.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona reactivos y métodos para la prevención y tratamiento de infecciones parasitarias y bacterianas, e.g., Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, plasmodio, Toxoplasma, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Difteria, Pertussis, Tétanos, neumonía bacteriana o fúngica, Otitis Media, Gonorrea, Colera, Tifoidea, Meningitis, Mononucleosis, Plag, Shigellosis, Salmonelosis, Enfermedad de Legionario, enfermedad de Lyme, Lepra, Malaria, Helminto, Onchocerciasis, Schistosomiasis, Trypanosomas, Leshmania, Giardia Amoebiasis, Filariasis, Borelia y Triquinosis (véase, e.g., Despommier, et al. (2000) Parasitic Diseases, 4ª ed., Apple Trees Productions, New York, NY; Gobierno de Estados Unidos (2002) Centros de Colección Siglo 21 para Control de Enfermedad (CDC) Que Surgen De Las Enfermedades Infecciosas (EID) – Colección Comprensiva de 1995 a 2002 con Información Exacta y Detallada en Docenas de Varias Enfermedades Serias por Bacteria y Virus – Hantavirus, Influenza, SIDA, Malaria, TB, Plaga, Bioterrorismo, Viruela, Antrax, Vacunas, Enfermedad de Lyme, Rabia, Virus de Nilo Oeste, Fiebres Hemorrágicas, Ébola, Encefalitis (Serie de Información de Núcleo Federal).

La presente invención, al menos en algunas modalidades, proporciona reactivos y métodos para tratar un trastorno o condición, o estimular una respuesta inmune a un trastorno o condición, que comprende tanto un cáncer como infección. En algunas infecciones virales, por ejemplo, un antígeno puede ser tanto un antígeno tumoral como un antígeno viral (véase, e.g. Montesano, et al. (1990) Cell 62:435-445; Ichaso y Dilworth (2001) Oncogene 20:79087916; Wilson, et al. (1999) J. Immunol. 162:3933-3941; Daemen, et al. (2004) Antivir. Ther. 9:733-742; Boudewijn, et al. (2004) J. Natl. Cancer Inst. 96:998-1006; Liu, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:14567-14571).

En algunas modalidades, el antígeno heterólogo comparte al menos un péptido con, o es inmunológicamente de reactividad cruzada con, un antígeno de, o derivado de, un cáncer o agente infeccioso.

(f). Mutantes de reparación de ADN y agentes que tienen como objetivo ácido nucleico.

La presente descripción, en otras modalidades, proporciona mutantes Listeria, en donde el mutante es defectuoso en reparación del daño de ADN, incluyendo, por ejemplo, la reparación de daño de ADN inducido por luz UV, daño inducido por radiación, degradaciones interfilamentos, degradaciones intrafilamentos, aductos covalentes, ADN modificado por aducto voluminoso, bases desamidadas, aductos de platina cis, combinaciones de los anteriores, y lo similar (Mu y Sanear (1997) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 56:63-81; Sanear (1994) Science 266: 1954-1956; Lin y Sanear (1992) Mol. Microbiol, 6:2219-2224; Selby y Sanear (1990) 236:203-211; Grossman (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 726:252-265). Se proporciona una Listeria mutada en, e.g., uvrA, urvB, uvrAB, uvrC, cualquier combinación de los anteriores, y lo similar.

Además, lo que se proporciona es una Listeria que comprende al menos una degradación interfilamento en su ADN genómico, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, o más, degradaciones en su ADN genómico.

Una modalidad de la presente descripción comprende Listeria uvrAB diseñada para expresar un antígeno heterólogo, en donde la bacteria diseñada se trata con un agente reticulante de ácido nucleico, un compuesto de psoralen, un compuesto de nitrógeno mostaza, 4’-(4-amino-2-oxa)butil-4,5’,8-trimetilpsoralen, o beta-alanina, N(acridina-9-il),2-[bis(2-cloroetil)amino]etil éster (véase, e.g., Solicitud de Patente de Publicación de Estados Unidos No. 2004/0197343 de Dubensky; Brockstedt, et al. (2005) Nat. Med. 11:853-860).

(g). Hibridización bajo condiciones rigurosas.

La hibridización de un polinucleótido tal como un plásmido a una variante de aquel polinucleótido que lleva al menos una mutación, puede lograrse bajo las siguientes condiciones rigurosas. El plásmido puede ser entre 2-3 kb, 34 kb, 4-5 kb, 5-6 kb, 6-7 kb, y así sucesivamente. La mutación puede consistir de 1-10 nucleótidos (nt), 10-20 nt, 2030 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, y lo similar.

Las condiciones rigurosas para la hibridización en formamida puede utilizar la siguiente solución de hibridización: 48 ml de formamida; 24 ml 20 veces de SSC; 1.0 ml de 2 M Tris Cl, pH 7.6; 1.0 ml 100 veces de solución de Denhardt; 5.0 ml de agua; 20 ml de 50% de sulfato de dextrano, 1.0 ml de 10% de dodecilsulfato de sodio (volumen total 100 ml). La hibridización puede ser durante la noche a 42°C (véase, e.g., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 23, páginas 6.3.3-6.3.4). Las condiciones de hibridización más rigurosas comprenden uso del regulador anterior pero a la temperatura de 43°, 44°, 45°, 46°, 47°, 48°, 49°, 50°, 51°, 52°, 53°, 54°, y lo similar.

La hibridización rigurosa bajo condiciones acuosas son 1% de albumina de suero de bovino; 1 mM de EDTA;

0.5 M de NaHPO4, pH 7.2, 7% de sulfato de dodecilo de sodio), con incubación durante la noche a 65°C. Las condiciones de hibridización acuosa más rigurosas comprenden el uso del regulador anterior, pero a una temperatura de 66°, 67°, 68°, 69°, 70°, 71°, 72°, 73°, 74°, 75°, y así sucesivamente (véase, e.g., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 23, páginas 6.3.3-6.3.4).

El incremento de la concentración de formamida incrementa la rigurosidad de hibridización. Las incompatibilidades entre el ADN de sonda y ADN objetivo disminuyen la tasa de hibridización por aproximadamente 2 veces, por cada 10% de incompatibilidad. De igual forma, la temperatura de fusión de dúplex de ADN incompatible se reduce por aproximadamente un grado centígrado por cada 1.7% de incompatibilidad (Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag, New York, N.Y., pp, 70-72; Tijssen (1993) Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Publ. Co., Burlington, MA; Ross (ed.) (1998) Nucleic Acid Hybridization:Essential Techniques, John Wiley ySons, Hoboken, NJ; No. de Patente de Estados Unidos 6,551,784 expedida a Fodor, et al.).

Esta descripción comprende un primer plásmido variante que se hibridiza bajo condiciones rigurosas a un segundo plásmido de la presente descripción, en donde ambos plásmidos son funcionalmente equivalentes, y en donde la hibridización es determinable al hibridizar el primer plásmido directamente al segundo plásmido, o al hibridizar las sondas de oligonucleótido que giran la longitud completa (individualmente o como una colección de sondas) del primer plásmido variante al segundo plásmido, y así sucesivamente.

El experto en la materia será capaz de ajustar, o elevar, la temperatura de hibridización para permitir ladistinción entre un ácido nucleico de sonda y un ácido nucleico objetivo donde las secuencias de la sonda y objetivo difieren por 5-10 nucleótidos, 10-15 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 20-25 nucleótidos, 25-30 nucleótidos, 30-35 nucleótidos, 35-40 nucleótidos, 40-45 nucleótidos, 45-50 nucleótidos, 50-55 nucleótidos, 55-60 nucleótidos, 60-65 nucleótidos, 65-70 nucleótidos, 70-80 nucleótidos, y lo similar.

Esta descripción proporciona los polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones rigurosas a cada uno de los polinucleótidos descritos en la presente o sus complementos.

III. ALGUNAS MODALIDADES DETALLADAS DE ESTA DESCRIPCIÓN

(a) Integración por recombinación específica de sitio y por recombinación homóloga.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos, polinucleótidos, genomas bacterianos que incluyen genomas listeriales, y bacterias que incluyen Listeria y Bacillus anthracis, de la presente descripción se modifican por recombinación específica de sitio y/o por recombinación homóloga. Las recombinasas específicas de sitio se describen (Landy (1993) Curr. Op. Biotechnol. 3:699-707; Smith y Thorpe (2002) Mol. Microbiol. 44:299-307; Groth y Calos (2004) J. Mol. Biol. 335:667-678; Nunes-Duby, et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406; Sauer (1993) Methods Enzymol. 225:890-900). La transposición se distingue de la recombinación específica de sitio (véase, e.g., Hallett y Sherratt (1997) FEMS Microbiol. Rev. 21: 157-178; Grindley (1997) Curr. Biol. 7:R608-R612).

A. Recombinación específica de sitio

La presente descripción proporciona sistema para mediar la integración específica de sitio en un ácido nucleico, vector, o genoma. Por “sistema” se entiende, un primer ácido nucleico que codifica una integrasa, así como el polipéptido de integrasa expresada, un segundo ácido nucleico que codifica un sitio de unión de fago (attPP’), y un tercer ácido nucleico que codifica un sitio de unión bacteriana correspondiente (attBB’). En lo general, cualquier sitio attPP’ corresponde a, o es compatible con, un sitio attBB’ particular. La disponibilidad de los sistemas de integración de la presente descripción se permite para la integración de uno o más ácidos nucleicos en cualquier polinucleótido o genoma dado.

El sitio de integración de la presente descripción puede implantarse en una posición pre-determinada en un genoma listerial a manera de integración específica de sitio en un sitio existente (e.g., en el sitio e integración tARNArg

o el sitio de integración comK). Además, o en la alternativa, el sitio de sistema de integración puede implantarse en una ubicación pre-determinada a manera de integración homóloga.

La recombinación homóloga puede dar como resultado la supresión del material del sitio de integración, o la no supresión de material, dependiendo del diseño de las regiones de homología (los “brazos homólogos”). Cualquier supresión que ocurre, durante la recombinación homóloga corresponde a la región del ADN objetivo que reside entre las regiones del ADN objetivo que pueden hibridizarse con los “brazos homólogos”. La recombinación homóloga puede utilizarse para implantar un sitio de integración (attBB’) dentro de un genoma bacteriano, para uso futuro en recombinación específica de sitio.

La Figura 1 describe una estrategia para preparar el plásmido, pINT, para uso en integración dirigida por sitio en un genoma bacteriano. El pINT contiene un gen de resistencia de cloranfenicol y un gen de resistencia deeritromicina (véase, e.g., Roberts, et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:269-270). Cuando pINT media la integración específica de sitio de un ácido nucleico en el genoma listerial, los genes de resistencia antibiótica pueden

5 eliminarse subsecuentemente por exposición transitoria a recombinasa Cre. Como se muestra en la Figura 1, los genes de resistencia antibiótica residen entre un primer sitio loxP y un segundo sitio loxP. La recombinasa Cre puede catalizar la remoción de material que reside entre los dos sitios loxP. La expresión transitoria de recombinasa Cre puede efectuarse por electroporación por un plásmido que codifica la recombinasa Cre, o por cualquier número de otras técnicas.

10 El genoma Listeria o cromosoma de la presente descripción se modifica utilizando los plásmidos pPL1, pPL2, y/o pINT1 (Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186). El plásmido pPL1 (No. de Acceso de GenBank AJ417488) comprende un ácido nucleico que codifica la integrasa U153, en donde esta integrasa cataliza la integración en la ubicación de comK-attBB’ del genoma listerial (Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186). La estructura de comK se encuentra disponible (nucleótidos 542-1114 de No. de Acceso de GenBank AF174588). pPL1 contiene un número de

15 sitios de restricción adecuados para insertar un casete. Por ejemplo, en algunas modalidades, un casete de la presente descripción codifica al menos un antígeno heterólogo y una región flanqueada por loxP, en donde la región flanqueada por loxP comprende: un primer ácido nucleico que codifica una integrasa y un segundo ácido nucleico que codifica un factor de resistencia antibiótica. Algunos de los sitios de restricción se describen en la Tabla 6. Los sitios de restricción también pueden introducirse de novo mediante métodos estándares.

20 Tabla 6. Sitios de restricción en pPL1 y pPL2.

pPL1: pPL2

Sitio: Posición de Corte Sitio Posición de Corte

HindII: 56 HindII 56

SmaI: 95 SmaI 95

BamHI: 99 BamHI 99

HindIII: 69 ClaI 64

NotI: 118 NotI 118

Sall: 54 SalI 54

KpnI: 37 SpeI 105

PstI: 91 KpnI 37

SacI: 139 PstI 91

AatI1: 5 y 175 SacI 139

BaII: 490 (en gen de resistencia de cloranfenicol) AatII 5 y 175

ScaI: 340 (en gen de resistencia de cloranfenicol) AvaI 48 y 93

BaeI: 3942 y 3975 (en gen integrasa U153) BalI 490 (en gen de resistencia de cloranfenicol)

BseP1: 3753 (en gen integrasa U153) ScaI 340 (en gen de resistencia de cloranfenicol)

Mlu1: 4074 (en gen integrasa U153) AflIII 3259 y 4328 (en gen integrasa PSA)

-: -- SnaBI 4077 y 4177 (en gen integrasa PSA)

-: -- Eam11051 3263 (en gen integrasa PSA)

-: -- BseYI 4357 (en gen integrasa PSA)

-: -- SwaI 3353 (en gen integrasa PSA)

-: -- BglII --4150 (en gen integrasa PSA)

El experto en la materia apreciará que las técnicas utilizadas para preparar pPL1 y pPL2, y para utilizar pPL1 y pPL2 para mediar la integración específica de sitio, pueden aplicarse a las integrasas, sitios de unión de fago (attPP’) y sitios de unión bacteriana (attBB’), de la presente descripción.

pPL2 (No. de Acceso de GenBank AJ417499) comprende un ácido nucleico que codifica la integrasa PSA, en donde esta integrasa cataliza la integración en el gen de tARNArg del genoma L. monocytogenes (Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186). El gen de tARNArg de 74 nucleótidos se encuentra en el nucleótido 1,266,675 a 1,266,748 de L. monocytogenes genoma cepa EGD (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank NC_003210), y en los nucleótidos 1,243,907 a 1,243,980 de L. monocytogens cepa 4bF265 (véase, e.g, No. de Acceso de GenBank NC_002973). pPL2 contiene un número de sitios de restricción adecuados para insertar un casete. La presente descripción proporciona un casete que codifica, e.g., un antígeno heterólogo y región flanqueada por loxP, en donde la región flanqueada por loxP comprende: un prime ácido nucleico que codifica una integrasa y un segundo ácido nucleico que codifica un factor de resistencia antibiótica. Algunos de los sitios de restricción se describen en la Tabla 6. Los métodos estándares pueden utilizarse para introducir otros sitios de restricción de novo.

Una primera modalidad de la recombinación específica de sitio incluye la integración específica de sitio catalizada por integrasa de un ácido nucleico en un sitio de integración ubicado en una región de tARNArg específica del genoma Listeria.

Una segunda modalidad utiliza la integración de un ácido nucleico en la región ComK del genoma Listeria.

Las modalidades adicionales comprenden los sitios de unión de profago en donde el objetivo se encuentra en, e.g., tARN-Thr4 of L. monocytogenes F6854  F6854.3 (nucleótidos 277,661-277710 de L. monocytogenes EGD No. de Acceso de GenBank AL591983.l), tARN-Lys4 de L. innocua 11262  11262.1 (nucleótidos 115,501-115,548 de No. de Acceso de GenBank AL596163. l); similar a L. monocytogenes 1262 de L. innocua 11262 phi11262.3; intergénico de L. innocua 11262  ll262.4 (nucleótidos 162,123-162,143 de No. de Acceso de GenBank AL596169.l); y tARN-Arg4 de L. innocua 11262  11262.6 (nucleótidos 15908-15922 de No. de Acceso de GenBank AL596173.l de L. innocua o nucleótidos 145,229-145,243 de No. de Acceso de GenBank AL591983.l de L. monocytogenes EGD) (véase, e.g., Nelson, et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32:2386-2395).

Una modalidad adicional de la recombinación específica de sitio comprende la inserción de un sitio loxP (o sitio Frt) por integración específica de sitio en la región tARNArg o región ComK, en donde la inserción de los sitios loxP se sigue por inserción mediada por recombinasa Cre de un ácido nucleico en el genoma Listeria.

pPL1 integra en la ubicación cromosómica comK-attBB’ (6,101 bp; No. de Acceso de GenBank AJ417488). Esta integración se cataliza por integrasa U153. El gen comK L. monocytogenes se describe (nucleótidos 542-1114 de No. de Acceso de GenBank AF174588). El sitio de integración de pPL1 comprende nucleótidos 2694-2696 de la secuencia de plásmido AJ417488. Los siguientes dos cebadores de PCR encierran en corchete el sitio de unión comK-attBB' del genoma Listeria: Cebador PL60 es 5'-TGA AGT AAA CCC GCA CAC GATC-3' (SEQ ID NO:9); Cebador PL61 es 5'-TGT AAC ATG GAG GTT CTG GCA ATC-3' (SEQ ID NO: 10). El cebador par PL60 y PL61 amplifica comK-attBB’ que da como resultado un producto 417 bp en cepas no lisogénicas, e.g., DP-L4056.

pPL2 integra en la ubicación cromosómica de tARNArg-attBB’ (6,123 bp; No. de Acceso de GenBank AJ417449). Esta integración se cataliza por integrasa PSA. pPL2 es similar a pPL1, a excepción de que el sitio de unión de fago de PSA e integrasa U153 de pPL1 se suprimió y reemplazaron con integrasa PSA y el sitio de unión de fago de PSA. El sitio de integración pPL2 comprende una región 17 bp que reside en los nucleótidos 2852-2868 del plásmido pPL2 (AJ417449), con la región bacteriana correspondiente que reside en los nucleótidos 1,266,7331,266,749 de L. monocytogenes cepa genoma EGD (No. de Acceso de GenBank NC_003210).

Para listeriofago A118, un fago detenidamente relacionado a listeriofago U153, la posición attB reside en los nucleótidos 187-189 de 573 bp comK ORF (Loessner, et al. (2000) Mol. Microbiol. 35:324-340). Este 573 bp ORG (nucleótido 542-1114 de No. de Acceso de GenBank AF 174588) y el sitio attB (nucleótido 701-757 de No. de Acceso de GenBank AF 174588) ambos se describen en No. de Acceso de GenBank AF174588. El sitio attP reside en el listeriofago genoma A118 en los nucleótidos 23500-23444 (No. de Acceso de GenBank AJ242593).

La presente descripción proporciona reactivos y métodos para catalizar la integración de un ácido nucleico, e.g, un plásmido, en un sitio de integración en un genoma Listeria. El genoma L. monocytogenes se describe (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank NC_003210; No. de Acceso de GenBank NC_003198, He y Luchansky (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:3480-3487, Nelson, et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32:2386-2395; Buchrieser, et al. (2003) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:207-213; Doumith, et al. (2004) Infect. Immun. 72:1072-1083; Glaser, et al. (2001) Science 294:849-852).

Las enzimas adecuadas para catalizar la integración de un ácido nucleico en un genoma Listeria incluyen, e.g., integrasa U153 (véase, e.g., complemento de nucleótidos 2741-4099 de No. de Acceso de GenBank AJ417488; Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186)) e integrasa PSA (véase, e.g., complemento de nucleótidos 19,413-20,567 de genoma de fago PSA (genoma 37,618 bp) (No. de Acceso de GenBank NC_003291)).

Una secuencia de nucleótidos idéntica o similar para gen tARNArg, y para el sitio de integración central que se encuentra dentro de este gen, se ha descrito para un número de cepas de L. monocytogenes. El genoma completo EGD de cepa L. monocytogenes (2,944,528 bp total) (No. de Acceso de GenBank NC_003210) contiene un sitio de integración en el gen tARNArg. El gen tARNArg de 74 nucleótidos se encuentra en nucleótido 1,266,675 a 1,266,748 de No. de Acceso de GenBAnk NC_003210. De igual forma, el gen tARNArg ocurre en cepa L. monocytogenes 4bF265 (No. de Acceso de GenBank NC_002973) en nucleótidos 1,243,907 a 1,243,980. La secuencia de gen tARNArg para la cepa L. monocytogenes WSLC 1042 se describe en Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186.· Lauer, et al., supra, describen el sitio de integración central bacteriana y el sitio de integración central de fago correspondiente.

La residencia en un grupo funcional establece la fusión de ácidos nucleicos que se dan como resultado de ese grupo. La función de un gen bacteriano, o gen bacteriófago, puede identificarse de acuerdo con su agrupación en un grupo funcional con otros genes de función conocida, su dirección transcripcional como relativa a otros genes de función similar, y ocurrencia en una operona con otros genes de función similar (véase, e.g., Bowers, et al. (2004) Genome Biology 5:R35.1-R35.13). Por ejemplo, el gen que codifica la integrasa de fago se ha identificado en los genomas de un número de fagos (o fagos integrados en genomas bacterianos), en donde el gen de integrasa de fago reside en un grupo de control lisogénico, en donde este grupo contiene un número de genes muy limitado (tres genes a nueve genes) (véase, e.g., Loessner, et al. (2000) Mol. Microbiol. 35:324-340; Zimmer, et al. (2003) Mol. Microbiol. 50:303-317; Zimmer et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4359-4368).

El sitio de unión de fago (attPP’) reside esencialmente de manera inmediata adyacente al gen de integrasa de fago. De acuerdo con Zhao y Williams, el gen de integrasa (int) y attP son típicamente adyacentes, facilitando su coevolución (Zhao y Williams (2002) J. Bacteriol. 184:859-860). Por ejemplo, en el fago phiC31, la integrasa de fago se codifica por nucleótido (nt): 38,447 a 40,264, mientras que el sitio attP reside cerca en nt 38,346 a 38,429. La integrasa de fago PhiC31 no requiere los co-factores para catalizar la reacción de integración, y puede funcionar en ambientes celulares ajenos, tales como las células de mamífero (véase, e.g., Thorpe y Smith (1998) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95:5505-5510; Groth, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5995-6000; No. de Acceso de GenBAnk AJ006589). Además, para fago SMI, fago HP1, fago phi3626, para varios bacteriófagos de actinomiceto (gen intM), fago lambda, y para fago Aa phi23, el gen de integrasa y sitio attP se ubican inmediatamente enseguida entre sí. El gen de integrasa y el sitio de attP pueden ocurrir juntos en grupo pequeño de genes conocidos como un “grupo decontrol lisogénico”. Los métodos para determinar la ubicación genómica, el tamaño aproximado, el tamaño máximamente activo, y/o el tamaño mínimo de un sitio attPP’ (o sitio attP) se encuentran disponibles (véase, e.g., Zimmer, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4359-4368; Siboo, et al. (2003) J. Bacteriol. 185:6968-6975; Mayer, et al. (1999) Infection Immunity 67:1227-1237; Alexander, et al. (2003) Microbiology 149:2443-2453; Hoess y Landy (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5437-5441; Resch (2005) Sequence and analysis of the DNA genome of the temperate bacteriophage Aaphi23, Inauguraldissertation, Univ. Basel; Campbell (1994) Ann. Rev. Microbiol. 48: 193-222).

La presente descripción proporciona un vector para uso en la modificación de un genoma listerial, en donde el vector codifica la integrasa de fago phiC31, sitio attPP’ phiC31, y en donde el genoma listerial se modificó para incluir el sitio attBB’ phiC31. Un genoma bacteriano, e.g., de Listeria o B. anthracis, puede modificarse para incluir un sitio attBB’ por recombinación homóloga. El sitio attBB’ phiC31 se describe por Thorpe y Smith (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5505-5510. La secuencia de aminoácidos de integrasa phiC31 se describe abajo (No. de Acceso de GenBank AJ414670):

La presente descripción proporciona los siguientes sitios de attBB’ objetivo phiC31 relevantes y variantes 10 funcionales de los mismos:

Además, esta descripción proporciona los siguientes sitios de attPP’ phiC31 relevantes, y variantes funcionales de los mismos:

La presente descripción comprende un vector que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y sitio attPP’ de pPL1. También se comprende un vector que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y el sitio attPP’ de pPL2. Además, la presente descripción comprende un vector que codifica una integrasa de fago y un

30 sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y sitio attPP’ de pPL1 o de pPL2.

La presente descripción comprende un vector útil para integrar un ácido nucleico heterólogo en un genoma bacteriano que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y sitio attPP’ de fago U153. También se comprende un vector, útil para integrar un ácido nucleico heterólogo en un genoma bacteriano, que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la

35 integrasa de fago y sitio attPP’ de fago PSA. Además, la presente descripción comprende un vector, útil para integrar un ácido nucleico heterólogo en un genoma bacteriano, que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y sitio attPP’ de cualquier fago U153 y fago PSA. En otro aspecto, la presente descripción comprende un vector, útil para integrar un ácido nucleico heterólogo en un genoma bacteriano, que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de

40 fago y sitio attPP’ de fago A118. Además esta descripción se encuentra comprendida por un vector, útil para integrar un ácido nucleico heterólogo en un genoma bacteriano, que codifica una integrasa de fago y un sitio attPP’ funcionalmente activo, pero no codifica la integrasa de fago y sitio attPP’ de cualquier fago A118, fago U153, o fago PSA.

B. Recombinación homóloga.

El sitio objetivo para la recombinación homóloga puede ser una estructura de lectura abierta, un gen de virulencia, un gen de función desconocida, un pseudogen, una región de ADN mostrada por no tener función, un gen que media el crecimiento, un gen que media la dispersión, una región reguladora, una región del genoma que media la supervivencia o crecimiento listerial, un gen en donde la interrupción conduce a la atenuación, una región intergénica, y lo similar.

Para dar un primer ejemplo, una vez que un ácido nucleico que codifica un antígeno (unido operativamente con un promotor) se implanta en un gen de virulencia, el resultado se da dos veces, principalmente la inactivación del gen de virulencia, más la creación de un antígeno expresable.

Esta descripción proporciona una bacteria Listeria que comprende un casete de expresión, integrado por medio de recombinación homóloga (o por intercambio alélico, y lo similar), en un gen de virulencia Listeria. La integración puede ser con o sin supresión de un ácido nucleico correspondiente del genoma listerial.

El casete de expresión puede estar operativamente unido con uno o más promotores del gen de virulencia (promotores ya presentes en la Listeria tipo silvestre o genitora). Alternativamente, el casete de expresión puede estar operativamente unido tanto con: (1) Uno o más promotores suministrados por el casete de expresión; como (2) Uno o más promotores suministrados por la Listeria tipo silvestre o genitora.

En algunas modalidades, el casete de expresión puede estar operativamente unido con uno o más promotores suministrados por el casete de expresión, y no del todo operativamente unido con cualquier promotor de la Listeria.

Sin implicar ninguna limitación, el gen de factor de virulencia puede ser uno o más de actA, inlB, ambos actA e inlB, así como uno o más de los genes descritos en la Tabla 3. En otro aspecto, la recombinación homóloga puede ser en el sitio de uno o más genes que median el crecimiento, dispersión, o tanto crecimiento como dispersión.

En otro aspecto, esta descripción proporciona una bacteria Listeria que tiene un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico (que codifica un antígeno heterólogo) integrado en el sitio de un factor de virulencia. En algunas modalidades, la integración es por recombinación homóloga. En algunas modalidades, esta descripción proporciona la integración en una región reguladora del gen de factor de virulencia, en una estructura de lectura abierta (ORF) del gen de factor de virulencia, o tanto en una región reguladora como la ORF del factor de virulencia. La integración puede ser con supresión o sin supresión de todo o parte del gen de factor de virulencia.

La expresión del ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo puede ser mediada por el promotor del factor de virulencia, en donde este promotor se une operativamente y con el ácido nucleico. Por ejemplo, un ácido nucleico integrado en el gen actA puede estar unido operativamente con el promotor actA. También, un ácido nucleico integrado en el sitio del gen inlB puede estar unido operativamente con el promotor actA. También, un ácido nucleico integrado en el sitio del gen inlB puede estar operativamente unido y en estructua con el promotor inlB. Además, o como una alternativa la regulación de expresión de la estructura de lectura abierta puede mediarse completamente por un promotor suministrado por el ácido nucleico.

El casete de expresión y el ácido nucleico anteriormente identificado puede proporcionar uno o más promotores listeriales, uno o más promotores bacterianos que no son listeriales un promotor actA, un promotor inlB, y cualquier combinación de los mismos. El promotor media la expresión del casete de expresión. También, el promotormedia la expresión del ácido nucleico anteriormente identificado. Además, el promotor se une operativamente con la ORF.

En algunas modalidades, la integración en el gen de virulencia, o la integración en el sitio del gen de virulencia, da como resultado la supresión de todo o parte del gen de virulencia, y/o interrupción de regulación del gen de virulencia. En algunas modalidades, la integración da como resultado una atenuación del gen de virulencia o en inactivación del gen de virulencia. Además, esta descripción proporciona un promotor que es dependiente de prfA, un promotor que es independiente de prfA, un promotor de origen sintético, un promotor de origen parcialmente sintético, y así sucesivamente.

Se proporciona un método para manufacturar la Listeria anteriormente descrita. También se proporcionan los métodos para utilizar la Listeria anteriormente exhibida para expresar el casete de expresión o para expresar el ácido nucleico anteriormente identificado. Además, en algunas modalidades, lo que se proporciona son métodos para estimular un sistema inmune de mamífero, que comprende administrar la Listeria anteriormente exhibida a un mamífero.

Para dar otro ejemplo, una vez que un sitio de unión bacteriana (attBB’) se implanta en un gen de virulencia, el resultado se da dos veces, principalmente la inactivación de ese gen, más la creación de una herramienta que permite la eficiente integración de un ácido nucleico en ese sitio attBB’.

En la dirección de la integración homóloga del plásmido pKSV7, u otro plásmido adecuado, en el genoma listerial, la presente descripción proporciona una región de homología que es normalmente al menos 0.01 kb, más normalmente al menos 0.02 kb, más normalmente al menos 0.04 kb, frecuentemente al menos 0.08 kb, más frecuentemente al menos 0.1 kb, más frecuentemente al menos 0.2 kb, normalmente al menos 0.4 kb, más normalmente al menos 0.8 kb, generalmente al menos 1.0 kb, más generalmente al menos 1.5 kb, y más generalmente al menos 2.0 kb.

La Figura 2 demuestra una estructura que utiliza pKSV7 en recombinación homóloga en un genoma bacteriano. En la Etapa 1, el plásmido se intercambia con una región de homología en el genoma. En la Etapa 2, el plásmido se integra en el genoma, produciendo un intermediario merodiploide. WXYZ representa cualquier secuencia en el pKSV7, tal como un gen codificador de resistencia antibiótica. La Etapa 3 describe una segunda transferencia, mientras que la Etapa 4 describe la eliminación del “cuerpo” del plásmido pKSV7 y eliminación de WXYZ. El tratamiento subsecuente con recombinasa Cre, e.g., por expresión transitoria de recombinación Cre, cataliza la remoción de material entre los sitios loxP.

La Figura 3 muestra un método para preparar un inserto en donde el inserto se coloca en pKSV7. El inserto media la recombinación homóloga en un genoma listerial, que da como resultado la integración de varios elementos en el genoma listerial (ácidos nucleicos que codifican un antígeno, sitios loxP, y un gen de resistencia antibiótica). El tratamiento subsecuente con recombinasa Cre cataliza la remoción de material entre los sitios loxP.

La Figura 4 muestra un método para preparar un inserto, en donde el inserto se coloca en pKSV7. El inserto media la recombinación homóloga en un genoma listerial, que da como resultado la integración de varios elementos en el genoma listerial (ácido nucleico que codifica un antígeno). Los ácidos nucleicos que codifican los sitios loxP y un gen de resistencia antibiótica se codifican por un pKSV7 modificado. El tratamiento subsecuente con recombinasa Cre, e.g, por expresión transitoria de recombinación Cre, cataliza la remoción de material entre los sitios loxP.

La Figura 5 describe una modalidad que da como resultado sólo la integración con no supresión. El tratamiento subsecuente con recombinasa Cre, e.g., por expresión transitoria de recombinación Cre, cataliza la remoción de material entre los sitios loxP.

Los reactivos y los métodos de la presente descripción, preparados por recombinación homóloga, no se limitan al uso de pKSV7, o a derivados de los mismos. Otros vectores adecuados para la recombinación homóloga se encuentran disponibles (véase, e.g., Merlin, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4573-4581; Yu, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5978-5983; Smith (1988) Microbiol. Revs. 52:1-28; Biswas, et al. (1993) J. Bact. 175:3628-3635; Yu, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5978-5983; Datsenko y Wannter (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645; Zhang, et al. (1998) Nature Genetics 20: 123-128).

Para integrar un ácido nucleico a manera de recombinación homóloga, las bacterias se electroporizan con un pKSV7, en donde el pKSV7 codifica una proteína heteróloga o donde el pKSV7 contiene un casete de expresión. Las bacterias se seleccionan al laminarse en medios de ágar BHI (o medios no basados en proteínas de animal) que contiene un antibiótico adecuado, e.g., cloranfenicol (0.01 mg/ml), y se incuban a la temperatura permisiva de 30°C. La integración por transferencia única en el cromosoma bacteriano se selecciona al pasar varias colonias individuales para múltiples generaciones a la temperatura no permisiva de 41°C en medio que contiene el antibiótico. Finalmente, la curación y excisión de plásmido (transferencia doble) se logra al pasar varias colonias individuales para múltiples generaciones a la temperatura permisiva de 30°C en medios BHI que no contienen el antibiótico.

La recombinación homóloga puede utilizarse para insertar un ácido nucleico en un ADN objetivo, con o sin supresión de material del ADN objetivo. Un vector que media la recombinación homóloga incluye un primer brazo homólogo (primer ácido nucleico), un segundo brazo homólogo (segundo ácido nucleico), y un tercer ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo que reside entre los dos brazos homólogos. Con respecto a la correspondencia de los brazos homólogos y el ADN genómico objetivo, las regiones objetivo pueden empalmarse entre sí o las regiones objetivo pueden separarse una de la otra. En donde las regiones objetivo se empalman entre sí, el caso de recombinación homóloga meramente da como resultado la inserción del tercer ácido nucleico. Pero en donde las regiones objetivo se separan una de la otra, el evento de recombinación homóloga da como resultado la inserción del tercer ácido nucleico y también la supresión del ADN que reside entre las dos regiones objetivo.

La recombinación homóloga en el gen inlB puede mediarse por pKSV7, en donde el pKSV7 contiene la

siguiente estructura central. La siguiente estructura central consiste esencialmente de un primer brazo homólogo (corriente arriba de gen inlB en un genoma L. monocytogenes), una región que contiene los sitios KpnI y BamHI (subrayados), y un segundo brazo homólogo (corriente abajo del gen inlB en L. monocytogenes). La región que contiene los sitios KpnI y BamHI es adecuada para recibir un inserto, en donde el inserto también contiene los sitios KpnI y BamII en el extremo cebador 5’ y cebador 3’ (o extremo 3’ y extremo 5’):

La siguiente es la región de la “región central” que contiene los sitios KpnI y BamHI para insertar un casete de 30 expresión: GGTACCTTGGTGAGCTC (SEQ ID NO:121).

El brazo homólogo corriente arriba se muestra abajo (corriente arriba en gen inlB). Las presentes secuencias son de L. monocytogenes 10403S. Lo siguiente proporciona la comparación con otra cepa listerial, L. monocytogenes 4bF2365. En esta cepa, el gen inlB reside en nt 196, 241-198, 133 (GenBank AE017323; segmento 2 de 10 segmentos). El brazo homólogo corriente arriba, aquí descrito para L. monocytogenes 10403S, tiene una secuencia

35 correspondiente en L. monocytogenes 4bF2365 en nt 194,932 a 196,240 (GenBank AE017323; segmento 2 de 10 segmentos). El brazo homólogo corriente abajo, aquí descrito para L. monocytogenes 10403S, tiene una secuencia correspondiente (pero no totalmente idéntica) en L. monocytogenes 4bF2365 en nt 198,134 a 199,269 (GenBank AE017323; segmento 2 de 10 segmentos).

(brazo homólogo corriente arriba)

20 El brazo homólogo corriente abajo se muestra abajo (corriente abajo de gen inlB): (brazo homólogo corriente abajo)

Con respecto a la inserción del gen ActA en un genoma listerial, lo siguiente describe los brazos homólogos corriente arriba y corriente abajo adecuados para mediar la integración por recombinación homóloga en el sitio ActA de 25 L. monocytogenes 10403S:

(brazo homólogo corriente arriba)

Lo siguiente describe un brazo homólogo corriente abajo adecuado, para mediar la inserción del gen ActA

listerial: (brazo homólogo corriente abajo)

(b). Genes de resistencia antibiótica flanqueada por LoxP.

La presente descripción, en algunas modalidades, proporcionas los reactivos y métodos para mediar la rápida

o eficiente excisión de un primer ácido nucleico de un genoma bacteriano. El método depende de la excisión mediada

20 por recombinasa, en donde la recombinasa reconoce los sitios de enlace de recombinasa heteróloga que flanquean el primer ácido nucleico. Los sitios de enlace de recombinasa heteróloga pueden ser, por ejemplo, un par de sitios loxP

o un par de sitios frt. Para proporcionar un ejemplo no limitante, el primer ácido nucleico puede codificar un marcadorde selección tal como un gen de resistencia antibiótica.

Los reactivos de esta modalidad incluyen los plásmidos que comprenden dos sitios de enlace de recombinasa

25 heteróloga que flanquean el primer ácido nucleico; un genoma bacteriano que comprende dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga que flanquean el primer ácido nucleico; y una bacteria que contiene un genoma que comprende dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga que flanquean el primer ácido nucleico.

El método de esta modalidad se establece en las siguientes etapas:

i. Transfectar una bacteria con un plásmido, en donde el plásmido puede mediar la integración de un 30 primer ácido nucleico (flanqueado por un par de sitios de enlace de recombinasa heteróloga) en el genoma bacteriano;

ii. Permitir la integración del primer ácido nucleico (flanqueado por dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga) en el genoma bacteriano. Sin implicar ninguna limitación como el mecanismo, la integración puede ser a manera de recombinación específica de sitio o recombinación homóloga;

iii. Elegir la bacteria que contiene el primer ácido nucleico integrado. En donde el primer ácido nucleico

35 codifica un gen de resistencia antibiótica, la selección puede incluir el cultivo de la bacteria en un medio que contiene el antibiótico. La etapa de selección puede dar como resultado una bacteria genotípicamente pura;

iv. Tratar la bacteria genotípicamente pura con condiciones que facilitan la excisión catalizada por recombinasa del primer ácido nucleico del genoma bacteriano. En donde el par de sitios de enlace de recombinasa heteróloga son los sitios loxP, la recombinasa puede ser recombinasa Cre. La recombinasa Cre puede ser introducida

40 en la bacteria al transfectarse con un plásmido que codifica esta enzima. En una modalidad, la expresión de recombinasa Cre es transitoria. La recombinasa Cre y la recombinasa FLP utilizan el mismo mecanismo de reacción enzimática, y median la excisión específica de sitio precisa entre un par de sus secuencias objetivo específicas;

v. Después de permitirse la excisión catalizada por recombinasa Cre del primer nucleico la bacteria puede cultivarse hasta que el plásmido se pierda por dilución o acción de nucleasa;

vi. La bacteria resultante puede identificarse por la presencia del primer ácido nucleico en el genoma. También, la bacteria resultante puede identificarse por la pérdida de uno de los dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga del genoma, es decir, sólo uno de los dos sitios se dejará.

La descripción anterior no se pretenderá que limite el método a las etapas citadas, no se pretenderá que limite el método al orden de las etapas exhibidas, y no se pretenderá para entenderse que todas estas etapas deben ocurrir. Esta descripción no se limita necesariamente a los dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga. Los polinucleótidos que contienen dos sitios loxP y dos sitios Frt pueden utilizarse, por ejemplo, en donde los dos sitios loxP flanquean un primer ácido nucleico, y los dos sitios Frt flanquean un segundo ácido nucleico, y en donde la expresión transitoria de la recombinasa Cre permite la excisión del primer ácido nucleico, y en donde la expresión transitoria de la recombinasa FLP (quizás en diferente momento) da como resultado la excisión del segundo ácido nucleico.

El sitio objetivo de ADN canónico para las recombinasas específicas de sitio consiste de dos sitios de enlace de recombinasa, en donde los dos sitios de enlace de recombinasa flanquean una región central (región separadora). La presente descripción proporciona dos sitios objetivo de ADN canónico (un par de sitios objetivo de ADN canónico), en donde los sitios flanquean un primer ácido nucleico. LoxP es un tipo de sitio objetivo de ADN canónico. LoxP tiene dos sitios de enlace de recombinasa de 13bp (repeticiones invertidas de 13bp) que flanquean un separador o región central de 8bp. De esta manera, cada sitio loxP es una secuencia de 34 nucleótidos continuos (34bp).

La recombinasa Cre y la recombinasa FLP son miembros de la familia de integrasa de las recombinasas específicas de sitio. La recombinasa FLP y Cre utilizan un residuo de tirosina para catalizar el desdoblamiento de ADN. La recombinasa Cre reconoce los sitios lox, mientras que la recombinasa FLP reconoce los sitios Ftr.

La guía para designar los sitios Frt y sitios Lox variantes y alternativos, se encuentra disponible. En donde se desea una región separadora alternativa, el experto en la materia reconocerá que la excisión mediada por recombinasa Cre probablemente se requiere para las regiones separadoras idénticas en el primer sitio lox y el segundo sitio lox (véase, e.g., Araki, et al. (2000) Nucleic Acids Res. 30:e103; Nagy (2000) Genetics 26:99-109; Gua, et al. (1997) Nature 389:40-46; Sauer (1993) Methods Enzymol. 225:890-900; Langer, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:3067-3077; Lath, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:e115; Baer y Bode (2001) Curr. Opinion Biotechnol. 12:473480; Nakano, et al. (2001) Microbiol. Immunol. 45:657-665).

La presente descripción contempla un polinucleótido que comprende un primer sitio lox y un segundo sitio lox, en donde el par de sitios lox flanquea un primer ácido nucleico, y en donde el primer ácido nucleico puede codificar,e.g., un marcador de selección, gen de resistencia antibiótica, región reguladora, o antígeno. También se contempla un polinucleótido que comprende un primer sitio lox y un segundo sitio lox, en donde el par de sitios lox flanquea un primer ácido nucleico, y en donde el primer ácido nucleico puede codificar, e.g., un marcador de selección, gen de resistencia antibiótica, región reguladora, o antígeno.

El experto en la materia apreciará fácilmente que los sitios de Lox variantes en donde el sitio de enlace de recombinasa es bajo 13bp, se encuentran disponibles a la luz de los reportes de que la recombinasa Cre puede funcionar con un sitio de enlace de recombinasa tan corto como 8-10 bp.

Un sitio lox alternativo, loxY se encuentra disponible, para proporcionar un ejemplo no limitante. La presente descripción contempla un polinucleótido que comprende un primer sitio loxY y un segundo sitio loxY, en donde el par de sitios loxY flanquea un primer ácido nucleico, y en donde el primer ácido nucleico puede codificar, e.g., un marcador de selección, un gen de resistencia antibiótica, una región reguladora, o un antígeno, y así sucesivamente. Nótese también, que la región central de loxP tiene bases de pirimidina y purina alternativas. Sin embargo, este modelo alternativo es necesario para el reconocimiento por recombinasa Cre, y la presente descripción comprende variantes de sitio LoxP con regiones centrales mutadas (véase, e.g., Sauer (1996) Nucleic Acids Res. 24:4608-4613; Hoess, et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:2287-2300).

El sitio Frt contiene tres elementos de simetría 13bp y una región central 8bp (48pb juntas). La recombinasa FLP reconoce Frt como un sustrato, así como los sitios Frt variantes, incluyendo los sitios Frt tan cortos como 34bp, y sitio Frt con regiones centrales variantes (véase, e.g., Schweizer (2003) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 5:67-77; Bode, et al. (2000) Biol. Chem. 381 :801-813).

La presente descripción proporciona un polinucleótido que contiene un primer sitio loxP y un segundo sitio loxP operativamente unido, en donde los sitios loxP primero y segundo, flanquean un primer ácido nucleico, para proporcionar un ejemplo no limitante. Se apreciará que esta descripción comprende otros sitios de enlace de recombinasa heteróloga, tales como las variantes de loxP, así como los sitios frt y las variantes de sitio frt.

El término “unido operativamente”, como se aplica a un primer sitio loxP y un segundo sitio loxP, en donde los dos sitios loxP flanquean un primer ácido nucleico, comprende lo siguiente. Aquí, “unido operativamente” significa que la recombinasa Cre es capaz de reconocer el primer sitio loxP y el segundo sitio loxP como sustratos, y es capaz de catalizar la excisión del primer ácido nucleico del genoma bacteriano. El término “unido operativamente” no se limitará

5 a los sitios loxP, a medida que comprende cualquiera de los “sitios de enlace de recombinasa heteróloga” tal como otros sitios lox, o sitios frt. También, el término “unido operativamente” no se limitará a la excisión catalizada por recombinasa, el término también comprende la integración catalizada por recombinasa. Además, el término “unido operativamente” no se limitará a ácidos nucleicos en un genoma –también se comprenden los ácidos nucleicos que residen en plásmidos, intermediarios utilizados en diseño genético, y lo similar.

10 Los ácidos nucleicos que codifican las recombinasas se describen en la Tabla 7A, y los sitios objetivo de ácido nucleico reconocidos por estas recombinaciones aparecen en la Tabla 7B.

Tabla 7A. Recombinasas

Recombinasa: Ubicación y No. de Acceso de GenBank

Recombinasa Cre: Nucleótidos 5347-6195 (exón 1) y 6262-6465 (exón 1) de No. de Acceso de GenBank AJ627603

Recombinasa FLP: Complemento de nucleótidos 4426-5697 de No. de Acceso de GenBank AF048702

Recombinasa FLP: Complemento de nucleótidos 6054-7325 de No. de Acceso de GenBank AY597273

Recombinasa FLP: Nucleótidos 5570-6318, 1-523 de No. de Acceso de GenBank J01347. La región corriente arriba de la secuencia codificadora comienza en el nucleótido 5570, mientras que la región corriente abajo de la secuencia codificadora termina en el nucleótido 523

Tabla 7B. Sitios de Unión para recombinasas.

Sitio objetivo: Ubicación y No. de Acceso de GenBank

Sitios Objetivo de recombinasa FLP

Frt: Nucleótidos 260-307 de No. de Acceso de GenBank AY562545

Frt: Nucleótidos 464-511 de No. de Acceso de GenBank A6597272

Frt: Nucleótidos 3599-3646 de No. de Acceso de GenBank AY423864

Sitios Objetivo de recombinasa Cre

LoxP: Nucleótidos 415-448 de No. de Acceso de GenBank AF143506

LoxP: Nucleótidos 118-151 de No. de Acceso de GenBank U51223

LoxP: Nucleótidos 1050-1083 de No. de Acceso de GenBank AY093430

LoxP: Nucleótidos 759-792 de No. de Acceso de GenBank AJ401047

Las secuencias de ácido nucleico que codifican varios factores de resistencia antibiótica se describen (Tabla

8). Las secuencias típicas son aquellas que codifican la resistencia a un antibiótico que es tóxico a Listeria, e.g.,

acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) (Tabla 8).

Un primer ácido nucleico que codifica el factor de resistencia antibiótica se une operativamente a un sitio de enlace de ribosoma, un promotor, y contiene un sitio de inicio de traslación, y/o un sitio de detección de traslación, y se

flanquea por dos sitios de enlace de recombinasa heteróloga.

Esta descripción proporciona un polinucleótido que contiene un par de sitios loxP unidos operativamente que flanquean un primer ácido nucleico, y un segundo ácido nucleico (no flanqueado por los sitios loxP), en donde el polinucleótido consiste de un primer filamento y un segundo filamento, y en donde el primer ácido nucleico tiene una

5 primera estructura de lectura abierta (ORF) y el segundo ácido nucleico tiene una segunda estructura del lectura abierta (ORF). En un aspecto, la primera ORF se encuentra en el primer filamento, y la segunda ORF también se encuentra en el primer filamento. En otro aspecto, la primera ORF se encuentra en el primer filamento y la segunda ORF se encuentra en el segundo filamento. Todavía otro aspecto proporciona una primera ORF en el segundo filamento y la segunda ORF en el primer filamento. Además, ambas ORFs pueden residir en el segundo filamento. La

10 presente descripción, en un aspecto, proporciona un plásmido que comprende el polinucleótido anteriormente exhibido. También se proporciona una Listeria que contiene el polinucleótido anteriormente exhibido, en donde el polinucleótido puede encontrarse en un plásmido y/o integrarse en el genoma. Cada una de las modalidades anteriormente exhibidas puede comprender los sitios de enlace de recombinasa heteróloga a diferencia de loxP. Por ejemplo, las variantes lox, los sitios Frt, las variantes Frt, y los sitios de enlace de recombinasa no relacionados a lox o

15 Frt, se encuentran disponibles.

Tabla 8. Genes de resistencia antibiótica.

Gen de resistencia antibiótica: No. de Acceso de GenBank

Cloranfenicol (cloranfenicol acetiltransferasa; CAT): Complemento de nucleótidos 312-971 de No. de Acceso de GenBank AJ417488 (pPL1 de Lauer, et al.)

Cloranfenicol (CAT): Complemento de nucleótidos 4898-5548 de No. de Acceso de GenBank AJ417488 (pPL1 de Lauer, et al.)

Cloranfenicol (CAT): Complemento de nucleótidos 312-971 de No. de Acceso de GenBank AJ417449 (pPL2 de Lauer, et al.)

Cloranfenicol (CAT): Complemento de nucleótidos 4920-5570 de No. de Acceso de GenBank AJ417449 (pPL2 de Lauer, et al.)

Penicilina (proteína de unión 2 de penicilina): Nucleótidos 25-1770 de No. de Acceso de GenBank X59629

Eritromicina (determinante de resistencia de eritromicina): Nucleótidos 864-1601 de No. de Acceso de GenBank AY680862

Ampicilina (penicilina beta-1ActAmasa): Complemento de nucleótidos 3381-4311 de No. de Acceso de GenBank AJ401049

Tetraciclina (proteína de resistencia de tetraciclina): Complemento de nucleótidos 4180-5454 de No. de Acceso de GenBank AY608912

Gentamicina (aminoglicosido acetiltransferasa): Complemento de nucleótidos 1326-1859 de No. de Acceso de GenBank EVE414668

(c). Socios de proteína de fusión ActA, y derivados de las mismas.

20 A. Los socios de proteína de fusión ActA modificada, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión que comprenden ActA modificada, y Listeria que comprende los polinucleótidos.

i. GENERAL.

La presente invención, en ciertos aspectos, proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica ActA modificado, unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que 25 codifica un antígeno heterólogo como se define además en las reivindicaciones. La invención también proporciona

una Listeria que contiene el polinucleótido, en donde la expresión del polinucleótido genera una proteína de fusión que comprende el ActA modificado y el antígeno heterólogo. El ActA modificado puede incluir la secuencia secretora natural de ActA, una secuencia secretora derivada de otra proteína listerial, una secuencia secretora derivada de una proteína bacteriana no listerial, o el ActA modificado puede evitarse de cualquier secuencia secretora.

La pareja de proteína de fusión derivada de ActA encuentra uso en la expresión creciente, la estabilidad creciente, secreción creciente, presentación inmune de mejora, respuesta inmune estimuladora, supervivencia de mejora a un tumor, supervivencia de mejora a un cáncer, supervivencia creciente a un agente infeccioso, y lo similar.

En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende (a) ActA modificado y (b) un antígeno heterólogo como se define además en las reivindicaciones. En algunas modalidades, el promotor es promotor ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado es un fragmento de ActA que comprende la secuencia de señal de ActA (o se deriva de un fragmento de ActA que comprende la secuencia de señal de ActA). En algunas modalidades, el ActA modificado comprende al menos los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En otras palabras, en algunas modalidades, la secuencia de ActA modificado corresponde a un fragmento de terminal N de ActA (incluyendo la secuencia de señal de ActA) que se trunca de cierta manera entre el aminoácido 59 y aproximadamente el aminoácido 265 de la secuencia de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los primeros 59 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 59 a 150 aminoácidos de ActA, los primeros 59 a 125 aminoácidos de ActA, o los primeros 59 a 110 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de los primeros 59 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 59 a 150 aminoácidos de ActA,los primeros 59 a 125 aminoácidos de ActA, o los primeros 59 a 110 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende aproximadamente los primeros 65 a 200 aminoácidos de ActA, aproximadamente los primeros 65 a 150 aminoácidos de ActA, aproximadamente los primeros 65 a 125 aminoácidos de ActA, o aproximadamente los primeros 65 a 110 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de aproximadamente los primeros 65 a 200 aminoácidos de ActA, aproximadamente los primeros 65 a 150 aminoácidos de ActA, aproximadamente los primeros 65 a 125 aminoácidos de ActA, o aproximadamente los primeros 65 a 110 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los primeros 70 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 80 a 150 aminoácidos de ActA, los primeros 85 a 125 aminoácidos de ActA, los primeros 90 a 110 aminoácidos de ActA, los primeros 95 a 105 aminoácidos de ActA, o aproximadamente los primeros 100 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de los primeros 70 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 80 a 150 aminoácidos de ActA, los primeros 85 a 125 aminoácidos de ActA, los primeros 90 a 110 aminoácidos de ActA, los primeros 95 a 105 aminoácidos de ActA, o aproximadamente los primeros 100 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es un antígeno tumoral o se deriva de un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se optimiza por codón para la expresión en Listeria. La invención proporciona los plásmidos y las células que comprenden el polinucleótido. La invención además proporciona una bacteria Listeria e.g., Listeria monocytogenes que comprende el polinucleótido, así como las vacunas que comprenden la Listeria. En algunas modalidades, el ADN genómico de la Listeria comprende el polinucleótido. En algunas modalidades, el polinucleótido se coloca en el ADN genómico en el sitio del gen actA o el sitio del gen inlB. En algunas modalidades, la Listeria comprende un plásmido que comprende el polinucleótido. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas e inmunogénicas que comprenden la Listeria. La invención también proporciona dicha composición para uso en los métodos para estimular las respuestas inmunes al antígeno heterólogo en un mamífero (e.g., un humano), que comprende administrar unacantidad eficaz de la Listeria (o una cantidad eficaz de una composición que comprende la Listeria) al mamífero. Por ejemplo, la invención también proporciona dicha composición para uso en los métodos para estimular las respuestas inmunes a un antígeno de, o derivado de, un cáncer o agente infeccioso, que comprende administrar una cantidad eficaz de la Listeria (o una composición que comprende la Listeria) a un mamífero que tiene el cáncer o agente infeccioso, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope con o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, el cáncer o agente infeccioso.

Las modalidades preferidas de los casetes de expresión de antígeno que utilizan las configuraciones de

pareja de fusión de antígeno heterólogo ActA-N-100 enlazan funcionalmente dicha construcción de fusión de antígeno con el promotor actA nativo y el ARN de la región no trasladada 5’ (UTR). La transcripción dependiente de PrfA del promotor actA da como resultado la síntesis de un ARN 5’ UTR de 150 nucleótidos antes del sitio de iniciación de traslación GUG de proteína ActA. Los mutantes L. monocytogenes suprimidos del promotor actA 5’ UTR expresan bajos niveles de ActA, dando como resultado un fenotipo caracterizado por la ausencia de reclutamiento de actina intracelular, inhabilidad para dispersarse de célula a célula, y atenuarse, como se compara a la bacteria genitora tipo silvestre (Wong et al. defective Cellular Microbiology 6:155-166).

En algunas modalidades, el promotor utilizado para expresar la proteína de fusión que comprende el ActA modificado y un antígeno heterólogo es un promotor hly. En otras modalidades, el promotor es un promotor actA. Estos promotores listeriales, por ejemplo, pueden derivarse de cualquier cepa de Listeria monocytogenes. Por ejemplo, el promotor actA o hly puede derivarse de la cepa EGD L. monocytogenes. La secuencia de genoma de cepa EGD se encuentra públicamente disponible en el No. de Acceso de GenBank AL591974 (segmento de genoma completo 2/12) (promotor hly:nts 5581-5818; gen actA:nts 9456-11389). Alternativamente, las secuencias utilizadas pueden ser de otra cepa tal como la cepa 10403S de L. monocytogenes.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA modificado, unido operativamente y en estructura con, un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo como se define en las reivindicaciones. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende al menos los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los primeros 59 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 59 a 150 aminoácidos de ActA, los primeros 59 a 125 aminoácidos de ActA, o los primeros 59 a 110 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los primeros 70 a 200 aminoácidos de ActA, los primeros 80 a 150 aminoácidos de ActA, los primeros 85 a 125 aminoácidos de ActA, los primeros 90 a 110 aminoácidos de ActA, los primeros 95 a 105 aminoácidos de ActA, o aproximadamente los primeros 100 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico codifica los aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el polinucleótido es genómico. En algunas modalidades alternativas, el polinucleótido se basa en plásmido. En algunas modalidades, el polinucleótido se une operativamente con un promotor. Por ejemplo, el polinucleótido puede unirse operativamente con uno o más de los siguientes: (a) promotor actA; o (b) un promotor bacteriano que no es un promotor actA. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana. La invención además proporciona una bacteria Listeria e.g., Listeria monocytogenes que comprende el polinucleótido, así como las vacunas que comprenden la Listeria. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo). La invención también proporciona los métodos para estimular las respuestas inmunes a un antígeno de, o derivado de, un cáncer o agente infeccioso, que comprende administrar la Listeria a un mamífero que tiene el cáncer o agente infeccioso, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope con o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, cáncer o agente infeccioso.

En algunas modalidades, la secuencia nativa L. monocytogenes que codifica los primeros 100 aminoácidos de ActA se une funcionalmente en estructura con una secuencia de antígeno heterólogo deseado. En algunas modalidades, la secuencia de antígeno heterólogo se sintetiza de acuerdo con el uso de codón óptimo de L. monocytogenes, un organismo de bajo porcentaje en GC. En algunas modalidades, las composiciones que utilizan el promotor actA junto con las secuencias no trasladadas 5’, se desean.

En algunas modalidades, el actA modificado comprende (a) aminoácidos 1-59 de actA, (b) una mutación en inactivación en, supresión de, o truncación previo a, al menos un dominio para regulación mediada por actA del citoesqueleto de célula huésped, en donde el primer ácido nucleico se une operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el dominio es la región de homología de cofilina (KKRR (SEQ ID NO:23)). En algunas modalidades, el dominio es el domino de enlace central de fosfolípido (KVFKKIKDAGKWVRDKI (SEQ ID NO:20)). En algunas modalidades, al menos un dominio comprende todos los cuatro dominios ricos en prolina (FPPPP (SEQ ID NO:21), FPPPP (SEQ ID NO:21), FPPPP (SEQ ID NO:21), FPPIP (SEQ ID NO:22)) de ActA. En algunas modalidades, el actA modificado es actA-N100. En algunas modalidades, el polinucleótido es genómico. En algunas modalidades, el polinucleótido no es genómico. En algunas modalidades, el polinucleótido se une operativamente con uno o más de los siguientes: (a) promotor actA, o (b) un promotor bacteriano (e.g., listerial) que no es un promotor actA. La invención además proporciona una bacteria Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) que comprende el polinucleótido, así como las vacunas que comprenden la Listeria. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase la Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo).

La invención también proporciona métodos para estimular respuestas inmunes a un antígeno de, o derivado de, un cáncer o agente infeccioso, que comprende administrar la Listeria a un mamífero que tiene el cáncer o agente infeccioso, en donde el antígeno heterólogo comparte al menos un epítope con o es inmunológicamente de reactividad cruzada con el antígeno de, o derivado de, cáncer o agente infeccioso. En algunas modalidades, la estimulación es relativa a la respuesta inmune sin administrar la Listeria. En algunas modalidades, el cáncer comprende un tumor o célula pre-cancerígena. En algunas modalidades, el agente infeccioso comprende un virus, bacteria patogénica, u organismo parasitario. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o compare al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana.

En algunas modalidades, lo que se proporciona es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA modificado que comprende al menos aminoácidos 1-59 de ActA, comprendiendo además al menos una modificación en una secuencia de ActA tipo silvestre, en donde la al menos una modificación es una mutación en inactivación en, supresión de, o truncación en o previo a, un dominio específicamente utilizado para la regulación mediada por ActA del citoesqueleto de célula huésped, en donde el primer ácido nucleico se une operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo.

También se encuentra comprendido un polinucleótido anterior, en donde la al menos una modificación es una mutación en activación en, supresión de, o terminación en, que comprende la región de homología de cofilina KKRR (SEQ ID NO:23). Además, lo que se encuentra comprendido es el polinucleótido anterior en donde la al menos una modificación es una mutación en inactivación en, supresión de, o terminación en, que comprende el dominio de enlace central de fosfolípido (KVFKKIKDAGKWVRDKI (SEQ ID NO:20)).

Todavía en otro aspecto, lo que se contempla es el polinucleótido anterior, en donde la al menos una modificación comprende una mutación en inactivación en, o supresión de, en cada uno del primer dominio rico en prolina (FPPPP (SEQ ID NO:21)), el segundo dominio rico en prolina FPPPP (SEQ ID NO:21)), el tercer dominio ricoen prolina FPPPP (SEQ ID NO:21)), y el cuarto dominio rico en prolina FPPIP (SEQ ID NO:22)), o una terminación en el primer dominio rico en prolina. En otro aspecto, lo que se proporciona es el polinucleótido anterior, en donde el actA modificado es ActA-N100.

Todavía otra modalidad proporciona una bacteria Listeria que comprende uno o más de los polinucleótidos anteriores. El polinucleótido puede ser genómico, puede ser a base de plásmido, o puede residir tanto en un plásmido como en el genoma listerial. También se proporciona la Listeria anterior en donde el polinucleótido no es genómico, así como la Listeria anterior en donde polinucleótido no es plasmídico. La Listeria puede ser Listeria monocytogenes,

L. innocua, u otra especie listerial.

Además, lo que se suministra por todavía otra modalidad, es un método para estimular la respuesta inmune a un antígeno de, o derivado de, un tumor, una célula cancerígena, o agente infeccioso, que comprende administrar a un mamífero la Listeria anteriormente exhibida y en donde el antígeno heterólogo se encuentra compartiendo un epítope con el antígeno derivado del tumor, célula cancerígena o agente infeccioso. Lo que también se suministra es el método anterior, en donde la estimulación es relativa a la respuesta inmune específica de antígeno en ausencia de la administración de la Listeria (específico al antígeno codificado por el segundo ácido nucleico).

Opcionalmente, el antígeno heterólogo puede ser idéntico al antígeno de (o derivado de) el tumor, célula cancerígena, o agente infeccioso.

ActA-N100 comprende un ácido nucleico que codifica aminoácidos 1-100 de ActA, así como el polipéptido expresado de este ácido nucleico. (Esta numeración incluye toda la secuencia secretora de ActA). Lo que se proporciona es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica ActA-N100 unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo.

Todavía otra modalidad proporciona una bacteria Listeria que comprende uno o más de los polinucleótidos anteriores. El polinucleótido puede ser genómico, puede ser a base de plásmido, o puede residir tanto en un plásmido como en el genoma listerial. También se proporciona la Listeria anterior en donde el polinucleótido no es genómico, así como la Listeria anterior en donde el polinucleótido no es genómico, así como la Listeria anterior en donde polinucleótido no es plasmídico. La Listeria puede ser Listeria monocytogenes, L. innocua, u otra especie listerial.

Los métodos para utilizar ActA-N100, también se encuentran disponibles. Se proporciona un método para estimular la respuesta inmune a un antígeno de, o derivado de, un tumor, célula cancerígena, o agente infeccioso, que comprende administrar a un mamífero la Listeria arriba exhibida, y en donde el antígeno heterólogo se encuentra compartiendo un epítope con el antígeno derivado del tumor, célula cancerígena, o agente infeccioso. Lo que también se proporciona es el método anterior, en donde la estimulación es relativa a la respuesta inmune específica deantígeno en ausencia de la administración de la Listeria (específico al antígeno codificado por el segundo ácido nucleico). Alternativamente, el antígeno heterólogo puede ser idéntico al antígeno de, o derivado de, el tumor, célula cancerígena, o agente infeccioso.

En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de un fragmento de ActA u otro derivado de ActA en el cual la secuencia de señal ActA se ha suprimido. En algunas modalidades, los polinucleótidos que comprenden los ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión que comprende tal ActA modificado y el antígeno heterólogo, además comprenden una secuencia de señal que no es la secuencia de señal ActA. La secuencia de señal ActA es MGLNRFMRAMMVVFITANCITINDIIFA (SEQ ID NO:125). En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de aminoácidos 31-100 de ActA (es decir, ActA-N100 suprimido de la secuencia de señal).

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA modificado, unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo como se define en las reivindicaciones. El ActA contiene un número de dominios, cada uno de los cuales participa en parte en el enlace a un componente del citoesqueleto de mamífero, en donde la presente invención contempla la remoción de uno o más de estos dominios.

El ActA contiene un número de dominios, que incluyen un dominio de terminal N (aminoácidos 1-234), dominio rico en prolina (aminoácidos 235-393), y un dominio de terminal C (aminoácidos 394-610). Los primeros dosdominios tienen distintos efectos sobre el citoesqueleto (Cicchetti, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:33616-33626). El dominio rico en prolina contiene cuatro motivos ricos en prolina. Los motivos ricos en prolina son sitios de atraque para la familia Ena/VASP de proteínas. La supresión de los dominios ricos en prolina de ActA reduce fuertemente el ensamble de filamento de actina (Cicchetti, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:33616-33626). Machner, et al., proporciona la guía para diseñar los motivos ricos en prolina mutada que no pueden atracarse más, en donde esta guía puede colocarse para uso para modalidades de la presente invención (Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103). Por ejemplo, la fenilalanina de los motivos ricos en prolina, es crítica. La presente invención, en una modalidad alternativa, proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica ActA, en donde los codones para la fenilalanina en cada motivo rico en prolina se cambia a un codón de alanina, unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno heterólogo. En otro aspecto, el primer ácido nucleico que codifica ActA comprende una mutación de prolina a alanina en sólo el primer motivo rico en prolina, en sólo el segundo motivo rico en prolina, en sólo el tercer motivo rico en prolina en sólo el cuarto motivo rico en prolina, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, un ácido nucleico que codifica un ActA alterado puede comprender una mutación en un codón para uno o más motivos ricos en prolina en combinación con una mutación o supresión en, por ejemplo, región de homología de cofilina y/o la secuencia de unión central para interacción de fosfolípidos.

Lo que también se contempla, es una mutación de prolina a otro aminoácido, e.g., serina. La guía anterior en el diseño de mutaciones no se limitará al cambio de los motivos ricos en prolina, sino aplica así también a la región de homología de cofilina, la secuencia de enlace central para la interacción de fosfolípidos, y cualquiera de los otros motivos o dominios que contribuyen a las interacciones de ActA con el citoesqueleto de mamífero.

El ActA contiene un dominio que es una “secuencia de enlace central para interacción de fosfolípidos” en aminoácidos 185-201 de ActA, en donde la función en el enlace de fosfolípidos se demostró por los estudios de enlace (CiCchetti, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:33616-33626). De conformidad con Cicchetti, et al., supra, el enlace de fosfolípidos regula las actividades de las proteínas de enlace por actina.

ActA contiene una región de homología de cofilina KKRR (SEQ ID NO:23). Las mutaciones de la región KKRR (SEQ ID NO:23) abole la habilidad de ActA de estimular la polimerización de actina (véase, e.g., Baoujemaa-Paterski, et al. (2001) Biochemistry 40:11390-11404; Skoble, et al. (2000) J. Cell. Biol. 150:527-537; Pistor, et al. (2000) J. Cell Sci. 113:3277-3287).

Lo siguiente se refiere a la expresión, por L. monocytogenes, de derivados de ActA truncados por debajo de aminoácido 263 a aminoácido 59. A diferencia de otros derivados truncados, el actA N59 no se expresó mientras que todos los más largos se expresaron (Skoble, J. (sin publicar)). El siguiente derivado más largo probado fue actA-N101. Las construcciones de proteína de fusión expresadas del promotor actA, que consisten en una primer pareja de proteína de fusión que es secuencia secretora actA, y una segunda pareja de proteína de fusión, dieron como resultado mucho menos secreción de proteína que en donde la primera pareja de proteína de fusión era actA-N100. Con respecto a las construcciones de supresión, también se encontró buena expresión en donde la primera pareja de proteína de fusión era actA soluble con aminoácidos 31-59 suprimidos. Además, se encontró buena expresión en donde la primera pareja de proteína de fusión era actA soluble con aminoácidos 31-165 suprimidos (Skoble, J. (sin publicar)).

La presente descripción, en ciertas modalidades, proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA modificado, que comprende al menos una modificación, en donde la al menos una modificación es una mutación en inactivación en, supresión de, o terminación de la secuencia de polipéptido ActA en o previo a, un dominio requerido para la regulación mediada por ActA del citoesqueleto de célula huésped, y un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. El ActA modificado puede ser uno que se da como resultado de lamotilidad deteriorada y/ tamaño de placa reducida, e incluye un ácido nucleico que codifica uno de los mutantes 34, 39, 48 y 56 (Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177). La presente invención también contempla un ácido nucleico que codifica uno de los mutantes de ActA 49, 50, 51, 52 y 54. También se proporciona un ácido nucleico que codifica uno de los mutantes de ActA 40, 41, 42, 43, 44, 45, y 47. Se proporcionan los mutantes en la región AB deenlace por monómero de actina, es decir, mutantes 41, 42, 43 y 44 (Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177).

En otro aspecto, el ActA modificado de la presente invención puede consistir de un mutante de supresión, puede comprender un mutante de supresión, o puede derivarse de un ActA de mutante de supresión que es incapaz de polimerizar la actina en las células e/o incapaz de soportar la formación de plaquetas, o soportar sólo la formación de plaquetas submáxima. Estos mutantes de supresión ActA incluyen los ácidos nucleicos que codifican 31-165; 136-200; 60-165; 136-165; 146-150, 31-58; 60-101; y 202-263 y lo similar (Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537). Se encuentran comprendidos los ácidos nucleicos que codifican los mutantes de supresión de ActA que tienen supresiones más estrechas y supresiones más amplias. El siguiente grupo de ejemplos, que describe las supresiones en la región de homología de cofilina, pueden opcionalmente para cada una de las supresiones de ActA establecerse en la presente. La presente invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican estas supresiones en la región de homología de cofilina: 146-150; 145-150; 144-150; 143-150; 142-150; 141-150; 140-150; 139-150; 138-150; 137-150; 136-150, y lo similar. También se encuentran comprendidos los ácidos nucleicos que codifican ActA con las supresiones: 146-150; 146-151; 146-152; 146-153; 146-154; 146-155; 146-156; 146-157; 146-158; 146-159; 146-160; y así sucesivamente. Además, también se contemplan los ácidos nucleicos que codifican los mutantes de supresión: 146-150; 145-151; 144-152; 143-153; 142-154; 141-155; 140-156; 139-157; 138-158; 137-159; 136-160, y lo similar. En donde existe una supresión tanto en el extremo de terminal N de la región en cuestión, como en el extremo de terminal C, los tamaños de estas dos supresiones no necesitan ser iguales entre sí.

Las modalidades de supresión también se proporcionan, incluyendo pero no limitándose a lo siguiente. Lo que se proporciona es un ácido nucleico que codifica el actA de longitud completa, un actA faltante de la transmembrana de anclaje, u otra variante de actA, en donde el actA se suprime en un segmento que comprende los aminoácidos (o en la alternativa, que consisten de los aminoácidos): 31-59, 31-60, 31-61, 31-62, 31-63, 31-64, 31-65, 31-66, 31-67, 31-68, 31-69, 31-70, 31-71, 31-72, 31-73, 3174, 31-75, 31-76, 31-77, 31-78, 31-79, 31-80, 31-81, 31-82, 31-83, 31-84, 31-85, 31-86, 31-87, 31-88, 31-89, 31-90, 31-91, 31-92, 31-93, 31-94, 31-95, 31-96, 31-97, 31-98, 31-99, 31-100, 31-101, 31-102, 31-103, 31-104, 31-105, 31-106, 31-107, 31-108, 31-109, 31-110, 31-111, 31-112, 31-113, 31114, 31-115, 3I-116, 31-117, 31-118, 31-119, 31-120, 31-121, 31-122, 31-123, 31-124, 31-125, 31-126, 31-127, 31128, 31-129, 31-130, 31-131, 31-132, 31-133, 31-134, 31-135, 31-136, 31-137, 31-138, 31-139, 31-140, 31-141, 31142, 31-143, 31-144, 31-145, 31-146, 31-147, 31-148, 31-149, 31-150, 31-151, 31-152, 31-153, 31-154, 31-155, 31156, 31-157, 31-158, 31-159, 31-160, 31-161, 31-162, 31-163, 31-164, 31-165, y lo similar.

Todavía en otro aspecto, lo que se suministra es un polipéptido que contiene un primer ácido nucleico que codifica un derivado actA, y n segundo ácido nucleico que codifica un ácido nucleico heterólogo, en donde el derivado actA es actA soluble que comprende una mutación de aminoácidos conservadora o de supresión, y en donde la mutación de aminoácido conservadora o de supresión comprende (o en otra modalidad, en donde la supresión consiste de) aminoácido: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169; 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, y así sucesivamente.

Lo que también se proporciona, en otras modalidades, es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica un ActA alterado, unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico, que codifica un antígeno heterólogo, en donde el primer ácido nucleico se deriva de, por ejemplo, ActA3 (aminoácidos 129-153 suprimidos); ActA9 (aminoácidos 142-153 suprimidos); ActA6 (aminoácidos 68-153 suprimidos); ActA7 (aminoácidos 90-153 suprimidos); o ActA8 (aminoácidos 110-153 suprimidos), y así sucesivamente (véase, e.g., Pistor, et al. (2000) J. Cell Science 113:3277-3287).

Un número de derivados de ActA, que comprenden la metionina de inicio (terminal N) y prematuramente terminada, dan como resultado una nueva terminal C. Algunos de estos derivados se reportan en Skoble, et al. (2000)

J. Cell Biol. 150:527-537). Los ácidos nucleicos que codifican estos derivados se introdujeron en L. monocytogenes, para probar la expresión. El derivado ActA que termina en el aminoácido 59 (ActA-N59) no se expresó por L. monocytogenes. En contraste, ActA-N101, y los derivados más largos de ActA, se expresaron. Las proteínas de fusión (expresadas del promotor ActA) que consisten de sólo la secuencia de señal ActA y una pareja de proteína de fusión, mostraron mucho menos secreción que las proteínas de fusión que consisten en ActA-N100 y una pareja de proteína de fusión.

La truncación, la supresión, o mutación en inactivación, puede reducir o eliminar la función de uno o más de los cuatro dominios FP4 de ActA ((E/D)FPPPX(D/E)) (SEQ ID NO:135). Los dominios FP4 de ActA median el enlace a las siguientes proteínas: mamífero autorizado (Mena); proteína tipo Ena/VASP (Evl); y fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP) (Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103). Aquí, el ácido nucleico de la presente invención codifica un ActA truncado, suprimido o mutado en uno o más de sus dominios FP4, reduciendo o impidiendo de ese modo el enlace a Mena, Evl, y/o VASP. Se proporciona un ácido nucleico que codifica un ActA truncado, parcialmente suprimido o mutado y un antígeno heterólogo, en donde la truncación, la supresión parcial, o mutación, ocurre en los aminoácidos 236-240; aminoácidos 270-274; aminoácidos 306-310; y/o aminoácidos 351-355 de ActA (numeración de Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103).

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica una variante de ActA, y un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno heterólogo, en donde la variante de ActA es ActA suprimido en o mutado en una “repetición larga”, dos repeticiones largas, o todas las tres repeticiones largas de ActA. Las repeticiones largas de ActA son secuencias de 24 aminoácidos ubicadas entre los dominios FP4 (véase, e.g., Smith, et al. (1996) J. Cell. Biol. 135:647-660). Las repeticiones largas ayudan a transformar la polimerización de actina en un mecanismo generador de fuerza.

Como un ejemplo alternativo, lo que se proporciona es un ácido nucleico que codifica la siguiente pareja de proteína de fusión basada en ActA, que utiliza el lenguaje consistente: Lo que se proporciona es un ácido nucleico que codifica una pareja de proteína de fusión que consiste de aminoácidos 1-50 de actA humano (por ejemplo, No. de Acceso de GenBank AY512476 o su equivalente, en donde la numeración comienza con el aminoácido de inicio), aminoácidos 1-60; 1-61; 1-62; 1-63; 1;64; 1-65; 1-66; 1-67; 1-68; 1-69; 1-70; 1-72; 1-73; 1-74; 1-75; 1-76; 1-77; 1-78; l79; 1-80; 1-81; 1-82; 1-83; 1-84; 1-85; 1-86; 1-87; 1-88; 1-89; 1-90; 1-91; 1-92; 1-93; 1-94; 1-95; 1-96; 1-97; 1-98; 1-99; 1-100; 1-101; 1-102; 1-103; 1-104; 1-105; 1-106; 1-107; 1-108; 1-109; 1-110; 1-111; 1-112; 1-113; 1-114; 1-115; 1-116; 1-117; 1-118; 1-119; 1-120; 1-121; 1-122; 1-123; 1-124; 1-125; 1-126; 1-127; 1-128; 1-129; 1-130; 1-131; 1-132; 1-133; 1-134; 1-135; 1-136; 1-137; 1-138; 1-139; 1-140; 1-141; 1-142; 1-143; 1-144; 1-145; 1-146; 1-147; 1-148; 1-149; 1-150; 1-151; 1-152 1-153; 1-154; 1-155; 1-156; 1-157; 1-158; 1-159; 1-160, y así sucesivamente.

Como todavía otro ejemplo alternativo, lo que se proporciona es un ácido nucleico que codifica la siguiente pareja de proteína de fusión basada en ActA, que utiliza el lenguaje consistente: lo que se proporciona es un ácido nucleico que codifica una pareja de proteína de fusión que comprende aminoácidos 1-50 de actA humano (por ejemplo, No. de Acceso de GenBank AY512476 o su equivalente, en donde la numeración comienza con el aminoácido de inicio), aminoácidos 1-60; 1-61; 1-62; 1-63; 1-64; 1-65; 1-66; 1-67; 1-68; 1-69; 1-70; 1-72; 1-73; 1-74; 175; 1-76; 1-77; 1-78; 1-79; 1-80; 1-81; 1-82; 1-83; 1-84; 1-85; 1-86; 1-87; 1-88; 1-89; 1-90; 1-91; 1-92; 1-93; 1-94; 1-95; 1-96; 1-97; 1-98; 1-99; 1-100; 1-101; 1-102; 1-103; 1-104; 1-105; 1-106; 1-107; 1-108; 1-109; 1-110; 1-111; 1-112; 1113; 1-114; 1-115; 1-116; 1-117; 1-118; 1-119; 1-120; 1-121; 1-122; 1-123; 1-124; 1-125; 1-126; 1-127; 1-128; 1-129; 1-130; 1-131; 1-132; 1-133; 1-134; 1-135; 1-136; 1-137; 1-138; 1-139; 1-140; 1-141; 1-142; l-143; 1-144; 1-145; l-146; 1-147; 1-148; 1-149; 1-150; 1-151; 1-152; 1-153; 1-154; 1-155; 1-156; 1-157; 1-158; 1-159; 1-160, y así sucesivamente.

Los ácidos nucleicos contemplados que codifican una pareja de proteína de fusión basada en actA incluyen ácidos nucleicos que codifican la pareja de proteína de fusión basada en actA, en donde uno o más nucleótidos se altera para proporcionar uno o más cambios de aminoácido conservador. Lo que se contempla es un cambio de aminoácido conservador, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, o más, cambios de aminoácido conservador. Además, lo que se contempla es un ácido nucleico que codifica la pareja de proteína de fusión basada en actA, que comprende al menos una mutación que codifica al menos una supresión corta, o al menos una inserción corta, o cualquiera combinación de las mismas.

Con respecto a la identidad del ácido nucleico que codifica ActA, y derivados del mismo, el codón para la metionina de inicio puede ser un codón de inicio de valina. En otras palabras, la Listeria utiliza un codón de inicio de valina para codificar la metionina.

La invención contemplada comprende ActA, y ActA suprimido en uno o más dominios de unión de citoesqueleto, socios de proteína de fusión ActA-N100, de todas las especies listeriales, incluyendo L. monocytogenes y L. ivanovii (Gerstel, et al. (1996) Infection Immunity 64:1929-1936; No. de Acceso de GenBank X81135; No. de Acceso de GenBank AY510073).

En algunas modalidades, al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a un fragmento de ActA que comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA y menos de los primeros 380 aminoácidos de ActA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ActA modificado consiste de una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a ActA-N100. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica el ActA modificado hibridiza bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia ActA-N100,

o su complemento.

La presente invención, en algunas modalidades, comprende un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica actA-N100 unido operativamente y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, tal como una mesotelina humana, o un derivado del mismo. La mesotelina humana se expresó de un número de construcciones, donde estas construcciones se crearon mediante integración dirigida por sitio o integración homóloga en el genoma Listeria. Algunas de estas construcciones se muestran en la Figura 6. La Figura 6 describe la mesotelina humana que ocurre naturalmente, la cual contiene una secuencia de señal y una secuencia GPI. La secuencia de señal y la secuencia de GPI se suprimió en los siguientes ejemplos, en donde la secuencia de señal que ocurre naturalmente se reemplazó con la secuencia secretora de Antígeno Protector Bacillus anthracis (BaPA), con LLO-62, con LLO-60codón optimizado (LLO-60opt), o con ActA-N100 (Figura 6). La secuencia de ActA-N100 incluye la secuencia secretora que ocurre naturalmente de ActA.

ii. FISIOLOGÍA DE CÉLULA ANORMAL PRODUCIDA POR ActA TIPO SILVESTRE.

El ActA modificado, de al menos algunas modalidades de la invención, se cambia para reducir o eliminar su interacción con el citoesqueleto de mamífero. Mientras que la función fisiológica de ActA es unirse al citoesqueleto de mamífero y permitir el movimiento mediado por actina de la bacteria Listeria a través del citoplasma, este enlace se reduce o elimina en el componente de ActA de la proteína de fusión.

La expresión de ActA soluble en citoplasma de mamífero, a manera de vectores de expresión eucariótica, da como resultado las anormalidades del citoesqueleto, e.g., “redistribución de actina-F”, y secuestro del ActA recombinante en la ubicación de “protrusiones de membrana”. En otras palabras, la ubicación normal de F-actina se cambió, en donde su nueva ubicación era en protrusiones de membrana. Además, la “cepa ActA se co-distribuyó con aquella de la F-actina en protrusiones de membrana”. Otras anormalidades en las células de mamífero incluyeron “pérdida de fibras de tensión”. Se observó que la “parte de terminal amino de ActA se incluye en la nucleación de filamentos de actina mientras que el segmento que incluye la región de repetición rica en prolina promueve o controla la polimerización” (Friederich, et al. (1995) EMBO J. 14:2731-2744). Además, de acuerdo con Olazabal y Machesky, la sobreexpresión de una proteína demostró que era similar a ActA, la proteína WASP, origina “defectos en la organización de actina que conducen a los malos funcionamientos de las células” (Olazabal y Machesky (2001) J. Cell Biol. 154:679-682). El título de una publicación (“Proteína Listeria ActA imita a las proteínas de la familia WASP”) indica esta similitud (Boujernaa-Paterski, et al. (2001) Biochemistry 40:11390-11404).

La introducción de ciertos dominios de ActA en una célula de mamífero interrumpe el citoplasma de la célula huésped. A detalle, la microinyección de la secuencia de oligoprolina de repetición de Act induce a la “pérdida de fibras de tensión”, “retracción dramática de membranas periféricas” y “acumulación de actina filamentosa cerca de la membrana periférica retractora” (Southwick y Purich (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5168-5172). ActA., una proteína expresada por Listeria, secuestra o “piratea” o utiliza varias proteínas relacionadas al citoesqueleto, incluyendo el complejo Arp2/3 y actina (Olazabal, et al. (2002) Curr. Biol. 12:1413-1418; Zalevsky, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:3468-3475; Brieher, et al. (2004) J. Cell Biol. 165:233-242).

La pareja de proteína de fusión basada en ActA de la presente invención, tiene una longitud de polipéptido reducida cuando se compara a ActA que carece del dominio de transmembrana. La pareja de proteína de fusión basada en ActA proporciona interrupción reducida de la actividad dependiente de actina tal como presentación inmune, proliferación de célula huésped, polaridad de célula, migración de célula, endocitosis, sellado de vesículas desunidas, movimiento de vesículas endocitóticas, secreción, polaridad de célula, y respuesta a heridas (cicatrización de heridas) (véase, e.g., Setterblad, et al. (2004) J. Immunol., 173:1876-1886; Tskvitaria-Fuller, et al. (2003) J. Immunol. 171:2287-2295). Sin implicar ninguna limitación en la invención, la interrupción reducida en este contexto es en relación a aquella encontrada con ActA de longitud completa, con ActA suprimido sólo en el dominio de transmembrana, o con ActA truncado en el dominio de transmembrana. El ActA que carece de la secuencia demembrana de anclaje produce una “redistribución distinguible de actina” en células de mamífero (véase, e.g., Pistor, et al. (1994) EMBO J. 13:758-763).

Las actividades dependientes de actina de la célula incluyen las funciones de célula inmunes, cicatrización de heridas, cubierta, internalización de receptor, fagocitosis, agrupación de receptor Fc y fagocitosis mediada por receptor Fc, utilizan actina (véase, e.g., Kwiatkowska, et al. (2002) J. Cell Biol. 116:537-550; Ma, et al. (2001) J. Immunol. 166:1507-1516; Fukatsu, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:48976-48982; Botelho, et al. (2002) J. Immunol. 19:44234429; Krishnan, et al. (2003) J. Immunol. 170:4189-4195; Gomez-Garcia y Komberg (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15876-15880; Kusner, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:50683-50692; Roonov-Jessen y Peterson (1996) J. Cell Biol. 134:67-80; Choma, et al. (2004) J. Cell Science 117:3947-3959; Miki, et al. (2000) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278:L13-L18; Fujimoto, et al. (2000) Traffic 1:161-171; Zualmann, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:F111-Fl16; Olazabal, et al. (2002) Curr. Biol. 12:1413-1418; Magdalena, et al. (2003) Molecular Biology of the Cell 14:670-684).

El ActA se degrada (en el citoplasma de mamífero) a manera de la “trayectoria de regla de extremo N” (véase, e.g., Moors, et al. (1999) Cellular Microbiol. 1:249-257; Varshavsky (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1214212149).

B. Codones raros de ActA; inmunogenicidad de ActA.

El ActA que codifica la región contiene un número de codones que no son óptimos para L. monocytogenes. De estos, se origina un número en el genoma listerial a una frecuencia de 25% o menos de aquella del codón más comúnmente utilizado. Lo siguiente proporciona un análisis de codón para L. monocytogenes 10403S ActA. En los codones que codifican los aminoácidos 101-400, los codones raros para glutamato (GAG) se originan 12 veces; los codones raros para lisina (AAG) se origina tres veces; los codones raros para isoleucina (ATA) se origina tres veces; los codones ratos para arginina (CGG) se origina una vez; los codones raros para glutamina (CAG) se origina una vez; y los codones raros para leucina (CTG; CTC) ocurre tres veces. El siguiente comentario se refiere a codones no óptimos, no sólo codones raros. Además, en los codones que codifican los aminoácidos 101-400 (300 codones), codones no óptimos (esto además de los codones raros) se originan 152 veces (fuera del total de 300 codones).

El ActA es un objetivo principal para la respuesta inmune por los humanos expuestos a L. monocytogenes (véase, e.g., Grenningloh, et al. (1997) lnfect. Immun. 65:3976-3980). En algunas modalidades, la presente invención proporciona una pareja de proteína de fusión basada en ActA, en donde la pareja de proteína de fusión basada en ActA tiene inmunogenicidad reducida, e.g., contiene menos epítopes que el ActA de longitud completa o se modifica para proporcionar epítopes de inmunogenicidad reducida.

Los reactivos y los métodos de la presente invención proporcionan un ácido nucleico que codifica un ActA, un ActA truncado, y/o un ActA mutado (e.g., una mutación por puntos o una supresión), que tiene un número reducido de epítopes antigénicos, o que carece de una o más regiones de antigenicidad incrementada. Las regiones de antigenicidad incrementada, como se determina por un diagrama Welling, incluyen aminoácidos 85-90; 140-150; 160190; 220-230; 250-260; 270-280; 305-315; 350-370; 435-445; 450-460; 490-520; 545-555; y 595-610, No. de Acceso de GenBank X59723. El ActA se ha identificado como una proteína inmunogénica (véase, e.g., Grenningloh, et al. (1997) Infection Immunity 65:3976-3980; Darji, et al. (1998) J. lmmunol. 161:2414-2420; Niebuhr, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2793-2802; Lingnau, et al. (1995) lnfect. Immun. 63:3896-3903). Las propiedades inmunogénicas de ActA incrementan con la expresión de formas solubles de actina, e.g., actina que carece de o parte de su región de terminal C (aminoácidos 394-610 que utilizan la numeración de Mourrain, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1003410039) (véase también, e.g., Darji, et al. (1998) J. Immunol. 161:2414-2420; Cicchetti, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:33616: 33626). Aquí, en donde un ActA truncado, parcialmente suprimido, o mutado de la presente invención carece (o funcionalmente carece) de un dominio utilizado para el enlace por membrana, dando como resultado de ese modo una inmunogenicidad incrementada, la presente invención proporciona mutaciones o truncaciones adicionales a fin de reducir la inmunogenicidad del ActA truncado.

C. Ensayos para medir el enlace de derivados de ActA, a proteínas citoesqueléticas, y movimiento dependiente de ActA de Listeria.

Los ensayos para determinar el reclutamiento de actina, u otras proteínas, a ActA, o a variantes de ActA, se encuentran disponibles. El reclutamiento razonablemente puede valorarse por ensayos de movimiento bacteriano, es decir, ensayos que miden la tasa dependiente de actina del movimiento de Listeria en extractos de célula eucariótica o dentro de una célula eucariótica (véase, e.g., Marchand, et al. (1995) J. Cell Biol. 130:331-343). Los ensayos de movimiento bacteriano pueden distinguir entre Listeria que expresa ActA tipo silvestre, y Listeria que expresa las versiones mutantes de ActA, por ejemplo, ActA mutante que carece de los dominios FP4 (Smith, et al. (1996) J. Cell. Biol. 135:647-660).

El reclutamiento también puede valorarse al medir la concentración de actina local en la superficie de perlas revestidas con ActA o en la superficie de las bacterias que expresan ActA. Los ensayos basados en perla, se describen (véase, e.g., Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103; Fradelizi, et al. (2001) Nature Cell Biol. 3:699-707; Theriot, et al. (1994) Cell 76:505-517; Smith, et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:945-951; Cameron, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4908-4913). La ultracentrifugación puede valorar el número de proteínas citoesqueléticas unidas a ActA (véase, e.g., Machner, et al., supra).

Los ensayos disponibles para el experto en la materia incluyen, e.g., el ensayo de polimerización de actina; el alargamiento del ensayo con extremo de púas; y el alargamiento del extremo con puntos (véase, e.g., Zalevsky, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:3468-3475). Los métodos también se encuentran disponibles para valorar la polaridad de polimerización de actina inducida por ActA (véase, e.g., Mogilner y Oster (2003) Biophys. J. 84:1591-1605; Noireauz, et al. (2000) Biophys. J. 78: 1643-1654).

(d). Proteínas secretadas con SecA2 para uso como pareja de proteína de fusión.

La presente descripción proporciona una familia de proteínas secretoras listeriales de SecA2 útiles como socios de proteína de fusión con un antígeno heterólogo. La pareja de proteína de fusión derivada por proteínasecretora encuentra uso en el incremento de expresión, incremento de estabilidad, incremento de secreción, mejora de presentación inmune, estimulación de respuesta inmune, mejora de supervivencia a un tumor, mejora de supervivencia a un cáncer, incremento de supervivencia a un agente infeccioso, y lo similar.

Las proteínas secretoras listeriales contempladas incluyen autolisina p60; N-acetil-muramidasa (NamA); proteína de enlace por penicilina 2B (PBP-2B) (No. de Acceso de GenBank NC_003210); transportador de feromona (OppA) (complemento a nt 184,539-186,215 de No. de Acceso de GenBank AL591982); maltosa/maltodextrina transportador ABC (complemento a nt 104,857-105,708 de No. de Acceso de GenBank No. AL591982); lipoproteína antigénica (Csa) (nt 3646-4719 de No. de Acceso de GenBank No. AL591982); y lipoproteína conservada, e.g., de L. monocytogenes EGD (véase, e.g., Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437; Lenz y Portnoy (2002) Mol. Microbiol. 45:1043-1056).

p60 se codifica por una estructura de lectura abierta de 1,452 bp, tiene una secuencia de señal de terminal N, un dominio SH3 en la región de terminal N, una región central que contiene repeticiones de treonina-asparagina, y unaregión de terminal C que comprende el sitio catalítico de autolisina (véase, e.g., Pilgrim, et al. (2003) Infect. Immun. 71:3473-3484). p60 también se conoce como la proteína asociada por invasión (iap) (No. de Acceso de GenBank X52268; NC_003210).

La presente descripción proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica p60, o un derivado p60, y un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. El p60 o los derivados p60 comprenden una proteína p60 de longitud completa (e.g., de L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. murrayi, y/o L. grayi), proteínas p60 truncadas que consisten esencialmente de los 70 aminoácidos de terminal N; una proteína p60 truncada suprimida en la región que cataliza la hidrólisis; las secuencias de señal de una proteína p60; o una proteína p60 con su secuencia de señal reemplazada con una secuencia de señal diferente (e.g., la secuencia de señal de ActA, LLO, PFO, o BaPA), y un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. La secuencia de señal p60 (27 aminoácidos) es: MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASA (SEQ ID NO:24) (Bubert, et al. (1992) J. Bacteriol. 174:8166-8171; Bubert, et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2625-2632; J. Bacteriol. 173:46684674). La secuencia de señal de N-acetil-muramidasa (52 aminoácidos) es: MDRKFIKPGIILLIVAFLVVSINVGAETGGSRTAQVNLTTSQQAFIDEILPA (SEQ ID NO:25) (nt 2679599 a 2681125 de No. de Acceso de GenBank NC_003210; No. de Acceso de GenBank AY542872; nt 2765101 a 2766627 de No. de Acceso de GenBank NC_003212; Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437).

La presente descripción proporciona una variante p60, por ejemplo, en donde los codones para los aminoácidos 69(L) y 70 (Q) se cambian para proporcionar un sitio de restricción PstI único, en donde el sitio PstI encuentra uso en inserción de un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo.

Se contempla un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína secretada de trayectoria SecA2 y un antígeno heterólogo. También se contempla un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una versión truncada o derivada de proteína secretada de trayectoria SecA2 y un antígeno heterólogo. Además, lo que se contempla es una bacteria Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína secretada de trayectoria SecA2 y un antígeno heterólogo, o que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una versión derivada o truncada de una proteína secretada por trayectoria SecA2 y un antígeno heterólogo.

(e) Mesotelina.

El cADN de mesotelina humana es 2138 bp, contiene una estructura de lectura abierta de 1884 bp, y codifica una proteína 69 kD. La proteína de precursor de mesotelina contiene 628 aminoácidos, y un sitio de desdoblamiento de furina (RPFRR en aminoácidos 288-293). El desdoblamiento de la proteína 69 kd genera una proteína unida por membrana 40 kD (denominada “mesotelina”) más una proteína soluble 31 kD llamada factor de potencia de megacariocito (MPF). La mesotelina tiene una secuencia lipofílica en su terminal C, que se remueve y reemplaza por inositol fosfatidilo, que origina que la mesotelina se una por membrana. La mesotelina contiene una secuencia de señal de glicosilfosfatidil inositol de anclaje cerca de la terminal C. Los dominios de mesotelina, la expresión de mesoteina por células tumorales y cancerígenas, y propiedades antigénicas de mesotelina, se describen (véase, e.g., Hassan, et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:3937-3942; Ryu, et al. (2002) Cancer Res. 62:819-826; Thomas, et al. (2003) J. Exp. Med. 200:297-306; Argani, et al. (2001) Clin. Cancer Res. 7:3862-3868; Chowdhury, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:669-674; Chang and Pastan (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:136-140; Muminova, et al. (2004) BMC Cancer 4:19; GenBank Acc. Nos. NM_005823 y NM_013404; Patente de Estados Unidos No. 5,723,318 expedida a Yamaguchi, et al.).

La mesotelina humana, suprimida en secuencia de señal de mesotelina, se muestra abajo:

La mesotelina humana, suprimida en secuencia de señal de mesotelina y también suprimida en GPI de mesotelina de anclaje, se describe abajo:

(f) Sitio de Integración

La presente descripción proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que media el crecimiento o dispersión en una Listeria genitora o tipo silvestre, en donde el primer ácido nucleico se modifica por integración de un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno. En un aspecto, la integración da como resultado la atenuación de la Listeria. En otro aspecto, la integración no da como resultado la atenuación de la Listeria. Todavía en otro aspecto, la Listeria genitora se atenúa, y la integración da como resultado una atenuación adicional. Además, como otro ejemplo no limitante, la Listeria genitora se atenúa, en donde la integración no da como resultado una atenuación medible adicional.

Las modalidades comprendiendo además la modificación mediante integración en el primer ácido nucleico, un tercer ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, un cuarto ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, un quinto ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, o lo similar, también se proporcionan.

Sin implicar ninguna limitación, el antígeno puede ser un antígeno heterólogo (heterólogo a la Listeria), un antígeno tumoral o un antígeno derivado de un antígeno tumoral, un antígeno de agente infeccioso o un antígeno derivado de un antígeno de agente infeccioso, y lo similar.

El primer ácido nucleico puede ser el gen actA o gen inlB. La integración puede ser en un promotor o región reguladora de actA o inlB, y/o en la estructura de lectura abierta de actA o inlB, en donde la integración atenúa la Listeria, como determinable bajo condiciones adecuadas. La integración puede acompañarse por supresión de una parte o de todo el promotor o la región reguladora de actA o inlB, o con supresión de parte o toda la estructura de lectura abierta de actA o inlB, o con supresión tanto del promotor como de la región reguladora más parte o toda la estructura de lectura abierta de actA o inlB, en donde la integración atenúa la Listeria, como determinable bajo condiciones adecuadas.

Para cada una de las modalidades anteriormente exhibidas, la presente descripción proporciona una bacteria Listeria que contiene el polinucleótido. El polinucleótido puede ser genómico.

En algunas modalidades, el primer ácido nucleico que se modifica por integración de un segundo ácidonucleico que codifica al menos un antígeno media el crecimiento o dispersión en una Listeria genitora o tipo silvestre. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico que se modifica media la célula a la dispersión de célula. En algunas modalidades, el primer ácido nucleico es actA.

En algunas modalidades, el primer ácido nucleico que se modifica por integración de un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, comprende un gen identificado como uno de los siguientes: gen hly (codifica listeriolisina O; LLO); internalina A; internalina B; actA; SvpA; p104 (a.k.a. LAP); lplA; fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) (gen plcA); fosfolipasa C específica de fosfatidilcolina (PC-PLC) (gen plcB); precursor de metaloproteasa de zinc (gen Mpl); p60 (proteína 60; proteína asociada por invasión (iap); sortasa; proteína reguladora positiva de listeriolisina (gen PrfA); gen PrfB; gen FbpA; gen Auto; Amida (amidasa que media la adhesión); operona dlt (dltA; dltB; dltC; dltD); cualquier recuadro de prfA; o Htp (transportador de azúcar P).

Además, lo que se contempla es una Listeria que comprende el polinucleótido anterior. El polinucleótido puede ser genómico. En un aspecto, la Listeria puede ser Listeria monocytogenes. Se proporciona cada una de lasmodalidades anteriormente exhibidas, en donde la integración da como resultado la atenuación de la Listeria, como determinable bajo condiciones adecuadas. También se proporciona cada una de las modalidades anteriormente exhibidas, en donde la integración no da como resultado la atenuación de la Listeria, como determinable bajo condiciones adecuadas. Todavía en otro aspecto, la Listeria genitora se atenúa, y la integración da como resultado la atenuación adicional. Además, como otro ejemplo, la Listeria genitora se atenúa, en donde la integración no da como resultado una atenuación medible adicional.

En otro aspecto, el primer ácido nucleico puede ser genómico. En otro aspecto, la integración puede mediarse por recombinación homóloga, en donde la integración no da como resultado ninguna supresión del primer ácido nucleico, en donde la integración da como resultado la supresión de todo o parte del primer ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico contiene un promotor u otra región reguladora y en donde el segundo ácido nucleico se une operativamente y/o en estructura con el promotor u otra región reguladora, y en donde el primer ácido nucleico contiene un promotor u otra región reguladora y en donde el segundo ácido nucleico no se encuentra del todo unido operativamente y/o en estructura con el promotor u otra región reguladora.

El término “gen modificado por integración” comprende, pero no se limita a, “un lugar de integración que es el gen.”

Lo que también se adopta por la presente descripción es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que media el crecimiento o extensión en una Listeria de origen o de tipo silvestre, donde el primer ácido nucleico comprende toda o parte de una isla de patogenicidad o grupo de gen de virulencia, en donde toda o parte de la isla de patogenicidad o grupo de gen de virulencia se modifica por integración de un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, en donde la integración resulta en atenuación de la Listeria, como se determina bajo condiciones apropiadas. Se describen las islas de patogenicidad y grupos de gen de virulencia (ver, e.g., Chakraborty, et al. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290:167-174; Vazquez-Boland, et al. (2001) Clin. Microbiol. Revs. 14:584-640). El gen que media el crecimiento y extensión no se limita a un gen que media específicamente la virulencia, pero comprende los genes que median el crecimiento tales como aquellos que median la producción de energía (e.g., glucólisis, ciclo Krebs, citocromos), anabolismo y/o catabolismo de aminoácidos, azúcares, lípidos, minerales, purinas, y pirimidinas, y genes que median el transporte, transcripción, traducción, y/o réplica de nutriente, y lo similar.

En otro aspecto, lo que se proporciona es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que media el crecimiento o extensión en una Listeria de origen o de tipo silvestre, en donde el ácido nucleico se modifica por integración de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican un antígeno o antígenos.

La integración puede ser dentro del segundo ácido nucleico sin ninguna eliminación correspondiente del segundo ácido nucleico. Alternativamente, la integración puede ser dentro del segundo ácido nucleico con una eliminación correspondiente del segundo ácido nucleico, o una porción del mismo. Donde el primer ácido nucleico en la Listeria de origen o de tipo silvestre comprende un promotor y/u otro sitio regulador, la integración puede estar en el promotor y/o sitio regulador.

En donde el primer ácido nucleico comprende un promotor y/u otro sitio regulador, la presente descripción proporciona un segundo ácido nucleico integrado, donde el segundo ácido nucleico comprende una región de codificación que se enlaza operativamente y en estructura con el promotor y/o sitio regulador. Como una alternativa, la presente descripción proporciona un segundo ácido nucleico integrado, donde el segundo ácido nucleico comprende una región de codificación que no se enlaza operativamente y en estructura con el promotor y/o sitio regulador. Se proporciona cada una de las modalidades anteriores, donde el ácido nucleico integrado (segundo ácido nucleico) comprende un promotor y/o sitio regulador, donde el promotor y/o sitio regulador puede tomar el lugar de, o alternativamente puede operar en adición a, un promotor y/u otro sitio regulador presente en el primer ácido nucleico.

En un aspecto, el primer ácido nucleico comprende (o en la alternativa, consiste de) un promotor u otro elemento regulador, y el segundo ácido nucleico se enlaza operativamente con el promotor y/u otro elemento regulador. En otro aspecto, el segundo nucleico que codifica un antígeno comprende además un promotor y/u otro elemento regulador.

El primer ácido nucleico no necesita codificar ningún polipéptido, ya que el primer ácido nucleico puede ser una caja o región reguladora. Lo siguiente se refiere a la integración como se media mediante, por ejemplo, integración homóloga. Esta descripción proporciona el polinucleótido de arriba, en donde el segundo ácido nucleico se integra sin eliminación de cualquiera del primer ácido nucleico.

En una modalidad, el primer ácido nucleico media el crecimiento pero no la extensión. En otra modalidad, el primer ácido nucleico media la extensión pero no el crecimiento. En todavía otra modalidad, el primer ácido nucleico media tanto el crecimiento como la extensión. En un aspecto, la integración reduce o elimina el crecimiento, reduce o elimina la extensión, o reduce o elimina tanto el crecimiento como la extensión.

Además, en una modalidad el primer ácido nucleico tiene la propiedad que su inactivación resulta en almenos 10% de reducción de crecimiento, algunas veces en al menos 20% de reducción de crecimiento, típicamente en al menos 30% de reducción de crecimiento, más típicamente en al menos 40% de reducción de crecimiento, más típicamente en al menos 50% de reducción en crecimiento, con frecuencia en al menos 60% de reducción en crecimiento, con más frecuencia en al menos 70% de reducción en crecimiento, con mayor frecuencia en al menos 80% de reducción en crecimiento, convencionalmente al menos 85% de reducción en crecimiento, más convencionalmente al menos 90% de reducción en crecimiento, y a lo máximo convencionalmente en al menos 95% de reducción en crecimiento, y algunas veces en al menos 99% de reducción en crecimiento. En un aspecto, el crecimiento puede medirse en un medio definido, en un medio de caldo, en agar, dentro de una célula huésped, en el citoplasma de una célula huésped, y lo similar.

Además, en una modalidad el primer ácido nucleico tiene la propiedad que su inactivación resulta en al menos 10% de reducción de extensión de célula a célula, algunas veces en al menos 20% de reducción de extensión, típicamente en al menos 30% de reducción de extensión, más típicamente en al menos 40% de reducción de extensión, a lo máximo típicamente en al menos 50% de reducción en extensión, con frecuencia en al menos 60% de reducción en extensión, con más frecuencia en al menos 70% de reducción en extensión, con mayor frecuencia en al menos 80% de reducción en extensión, convencionalmente al menos 85% de reducción en extensión, más convencionalmente al menos 90% de reducción en extensión, y a lo máximo convencionalmente en al menos 95% de reducción en extensión, y algunas veces en al menos 99% de reducción en extensión. En un aspecto, el crecimiento puede medirse en un medio definido, en un medio de caldo, en agar, dentro de una célula huésped, en el citoplasma de una célula huésped, y lo similar.

Se proporciona una bacteria Listeria que comprende cada uno de los polinucleótidos arriba descritos. En un aspecto, la Listeria es Listeria monocytogenes. Sin implicar ninguna limitación, la presente descripción contempla cada uno de los polinucleótido de arriba que es genómico, a base de plásmido, o que está presente tanto en forma genómica como a base de plásmido.

En cada una de las modalidades descritas arriba, la integración puede mediarse por integración específica de sitio. La integración específica de sitio incluye un sitio attPP’ plasmídico, que reconoce un sitio attBB' genómico. En ciertas modalidades, el sitio attBB' puede estar naturalmente presente en un gen que media el crecimiento o extensión. En otras modalidades, el sitio attBB' puede integrarse, e.g., por integración homóloga, en el gen que media el crecimiento o extensión, seguido por integración específica de sitio del segundo ácido nucleico descrito arriba.

La presente descripción proporciona una Listeria que contiene un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que, en la Listeria de tipo silvestre o Listeria de origen, media el crecimiento o extensión, o tanto el crecimiento como la extensión, en donde el ácido nucleico se modifica por integración de un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno. Todavía un ejemplo adicional de cada una de las modalidades descritas en la presente proporciona una integración que reduce o elimina el crecimiento, reduce o elimina la extensión, o reduce o elimina tanto el crecimiento como la extensión.

Lo que también se adopta es un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que media elcrecimiento o extensión de una Listeria de origen o de tipo silvestre, y donde el primer ácido nucleico comprende una secuencia de señal o secuencia secretora, en donde el primer ácido nucleico se modifica por integración de un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, y en donde la integración resulta en atenuación de la Listeria, y donde la integración enlaza operativamente la secuencia secretora o de señal (codificada por el primer ácido nucleico) con un marco abierto de lectura que se codifica por el segundo ácido nucleico. En un aspecto, la integración anterior resulta en la eliminación de todo el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico, excepto por la secuencia secretora o de señal codificada por el primer ácido nucleico (donde la secuencia secretora o de señal permanece intacta).

Se contemplan además los genomas que comprenden cada una de las modalidades de polinucleótido descritas en la presente. Además, lo que se proporciona es un genoma listerial que comprende cada una de las modalidades anteriores. Además, esta descripción suministra una bacteria Listeria que comprende cada una de las modalidades de polinucleótido descritas en la presente.

En una modalidad, esta descripción proporciona Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) en la cual el genoma comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el genoma por recombinación específica de sitio o recombinación homóloga. En algunas modalidades, la presencia del ácido nucleico en el genoma atenúa la Listeria. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el lugar de un gen de virulencia. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el lugar actA. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica el antígeno heterólogo se ha integrado en el lugar inlB. En algunas modalidades, el genoma de la Listeria comprende un primer ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo que se ha integrado en un primer lugar (e.g., el lugar actA) y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno heterólogo que se ha integrado en un segundo lugar (e.g., el lugar inlB). Los antígenos heterólogos, primero y segundo, pueden ser idénticos entre sí o diferentes. En algunas modalidades, los antígenos heterólogos, primero y segundo, difieren entre sí, pero se derivan del mismo antígeno de tumor o antígeno de agente infeccioso. En algunas modalidades, los antígenos heterólogos, primero y segundo, son cada uno, un fragmento diferente de un antígeno derivado de una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el ácido nucleico integrado codifica una proteína de fusión que comprende un ActA modificado y el antígeno heterólogo. En algunas modalidades, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, o al menos siete secuencias de ácido nucleico que codifica antígenos heterólogos se han integrado en el genoma Listerial.

En algunas modalidades, un polinucleótido (o ácido nucleico) descrito en la presente se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma de la Listeria, en donde la integración del polinucleótido (a) interrumpe la expresión del gen de virulencia; y/o (b) interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia. En algunas modalidades, la Listeria se atenúa por la interrupción de la expresión del gen de virulencia y/o la interrupción de la secuencia codificadora del gen de virulencia atenúa la Listeria. En algunas modalidades, el gen de virulencia es necesario para mediar crecimiento o extensión. En otras modalidades, el gen de virulencia no es necesario para mediar el crecimiento o extensión. En algunas modalidades, el gen de virulencia es un gen dependiente de prfA. En algunas modalidades, el gen de virulencia no es un gen dependiente de prfA. En algunas modalidades, el gen de virulencia es actA o inlB. En algunas modalidades, la expresión del gen de virulencia, en el cual el polinucleótido/ácido nucleico se integra, se interrumpe al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 90%, o aproximadamente 100% (relativo a la expresión del gen de virulencia en la ausencia del polinucleótido/ácido nucleico integrado, como se determina al medir los niveles de expresión. La interrupción de la secuencia codificadora del gen de virulencia comprende alteraciones de la secuencia codificadora de cualquier clase incluyendo mutaciones de cambio de marco, truncaciones, inserciones, eliminaciones, o reemplazos/sustituciones. En algunas modalidades, toda o parte del gen de virulencia se elimina durante la integración del polinucleótido en el gen de virulencia. En otras modalidades, ningún gen de virulencia se elimina durante la integración del polinucleótido. En algunas modalidades, parte o toda de la secuencia codificadora del gen de virulencia se reemplaza por el polinucleótido integrado.

En algunas modalidades, múltiples polinucleótidos descritos en la presente se han integrado en el genoma de Listeria en uno o más sitios diferentes. Los múltiples polinucleótidos pueden ser los mismos o diferentes. En algunas modalidades, un primer polinucleótido descrito en la presente se ha integrado en el lugar actA y/o un segundo polinucleótido descrito en la presente se ha integrado en el lugar inlB. En algunas modalidades, un primer polinucleótido descrito en la presente se ha integrado en el lugar actA y un segundo polinucleótido descrito en la presente se ha integrado en el lugar inlB. El antígeno heterólogo codificado por el primer polinucleótido puede ser el mismo o diferente como aquel codificado por el segundo polinucleótido. En algunas modalidades, los dos antígenos heterólogos codificados por los antígenos integrados difieren, pero se derivan del mismo antígeno.

IV. COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS Y USOS.

(a). Composiciones terapéuticas.

La Listeria atenuada, vacunas, moléculas pequeñas, reactivos biológicos, y adyuvantes que se proporcionan en la presente pueden administrarse a un huésped, ya sea solos o en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune apropiada a un trastorno inmune, cáncer, tumor, o infección. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, respuesta inmune específica, respuesta inmune no específica, tanto respuesta específica como no específica, respuesta innata, respuesta inmune primaria, inmunidad adaptiva, respuesta inmune secundaria, respuesta inmune de memoria, activación de célula inmune, proliferación de célula inmune, diferenciación de célula inmune, y expresión de citosina.

“Excipiente farmacéuticamente aceptable” o “excipiente aceptable en modo de diagnóstico” incluyen pero no se limita a, agua destilada estéril, salina, solución de tampón de fosfato, tampones a base de aminoácido, o soluciones de tampón de bicarbonato. Un excipiente seleccionado y la cantidad de excipiente utilizado dependerán del modo de administración. La administración puede ser oral, intravenosa, subcutánea, dermal, intradermal, intramuscular, mucosal, parenteral, intraórgano, intralesional, intranasal, inhalación, intraocular, intramuscular, intravascular, intranodal, por escarificación, rectal, intraperitoneal, o cualquiera o combinación de una variedad de vías de administración bien conocidas. La administración puede comprender una inyección, infusión, o una combinación de las mismas. La administración de la Listeria de la presente descripción por una vía no oral puede evitar tolerancia (ver, e.g., Lecuit, et al. (2001) Science 292:1722-1725; Kirk, et al. (2005) Transgenic Res. 14:449-462; Faria y Weiner (2005) Immunol. Rev. 206:232-259; Kraus, et al. (2005) J. Clin. Invest. 115:2234-2243; Mucida, et al. (2005) J. Clin. Invest. 115:1923-1933). Los métodos están disponibles para administración de Listeria, e.g., intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, oralmente, mucosal, por vía del tracto urinario, por vía de un tracto genital, por vía del tracto gastrointestinal, o por inhalación (Dustoor, et al. (1977) Infection Immunity 15:916924; Gregory y Wing (2002) J. Leukoc. Biol. 72:239-248; Hof, et al. (1997) Clin. Microbiol. Revs. 10:345-357; Schluter, et al. (1999) Immunobiol. 201:188-195; Hof (2004) Expert Opin. Pharmacother. 5:1727-1735; Heymer, et al. (1988) Infection 16 (Suppl. 2):S1O6-S111; Yin, et al. (2003) Environ. Health Perspectives 111:524-530).

Esta descripción proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden cualquier Listeria descrita en la presente. La descripción proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden cualquier Listeria descrita en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas o composiciones farmacéuticas son vacunas. En algunas modalidades, la composición que comprende Listeria es una vacuna que comprende además un adyuvante.

Lo siguiente aplica, opcionalmente, a cada una de las modalidades descritas en la presente. Se proporciona un reactivo administrado que es puro o purificado, por ejemplo donde el reactivo administrado puede administrarse a un mamífero en una forma pura o purificada, es decir, solo, como una composición farmacéuticamente aceptable, o en un excipiente. Además, lo siguiente también puede aplicarse, opcionalmente, a cada una de las modalidades descritas en la presente. Se proporciona un reactivo administrado que es puro o purificado, donde el reactivo administrado puede administrarse en una forma pura o purificada, es decir, solo, como una composición farmacéuticamente aceptable, o en un excipiente, y donde el reactivo no se genera después de la administración (no generado en el mamífero). En una modalidad, que puede aplicarse opcionalmente a cada uno de los reactivos descritos en la presente, se encuentra un reactivo de polipéptido que se administra como un polipéptido puro o purificado (e.g., solo, como una composición farmacéuticamente aceptable, o en un excipiente), donde el reactivo de polipéptido administrado no se administra en la forma de un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, y como una consecuencia, no se administra ácido nucleico que puede generar el polipéptido dentro del mamífero.

La Listeria de la presente invención puede almacenarse, e.g., congelarse, liofilizarse, como una suspensión, como una pasta celular, o componerse con una matriz sólida o matriz de gel.

Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición que se trata, la salud general del paciente, la vía y dosis de administración y la severidad de efectos secundarios. Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición que se trata, la salud general del paciente, la vía y dosis de administración y la severidad de los efectos secundarios. La guía para los métodos de tratamiento y diagnóstico está disponible (ver, e.g., Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, UK).

La Listeria de la presente invención puede administrarse en una dosis, o dosificaciones, donde cada dosis comprende al menos 1000 células Listeria/peso corporal en kg; normalmente al menos 10,000 células; más normalmente al menos 100,000 células; a lo máximo normalmente al menos 1 millón de células; con frecuencia al menos 10 millones de células; con más frecuencia al menos 100 millones de células; típicamente al menos 1 billón de células; usualmente al menos 10 billones de células; convencionalmente al menos 100 billones de células; y algunas veces al menos 1 trillón de células Listeria/peso corporal en kg. La presente invención proporciona las dosis de arriba donde las unidades de administración de Listeria son unidades que forman colonias (CFU), lo equivalente de CFU antes del tratamiento con psoraleno, o donde las unidades son números de células de Listeria.

La Listeria de la presente invención puede administrarse en una dosis, o dosificaciones, donde cada dosis comprende entre 107 y 108 Listeria por 70 kg de peso corporal (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados; o por

1.5 kg de peso del hígado); 2 x 107 y 2 x 108 Listeria per 70 kg de peso corporal (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados; o por 1.5 kg de peso del hígado); 5 x 107 y 5 x 108 Listeria por 70 kg de peso corporal (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados; o por 1.5 kg de peso del hígado); 108 y 109 Listeria por 70 kg de peso corporal (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados; o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 2.0 x 108 y 2.0 x 109 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 5.0 x 108 a 5.0 x 109 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 109 y 1010 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 2 x 109y 2 x 1010 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 5 x 109 y 5 x 1010 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 1011 y 1012 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 2 x 1011 y 2 x 1012 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 5 x 1011 y 5 x 1012 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 1012 y 1013 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados); entre 2 x 1012 y 2 x 1013 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 5 x 1012 y 5 x 1013 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 1013 y 1014 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 2 x 1013 y 2 x 1014 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); 5 x 1013 y 5 x 1014 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados,

o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 1014 y 1015 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); entre 2 x 1014 y 2 x 1015 Listeria por 70 kg (o por área de superficie de 1.7 metros cuadrados, o por 1.5 kg de peso del hígado); y así sucesivamente, peso en húmedo.

El hígado de ratón, al momento de administrar la Listeria de la presente invención, pesa aproximadamente 1.5 gramos. El hígado de humano pesa aproximadamente 1.5 kilogramos.

También se proporciona una o más de las dosis de arriba, donde la dosis se administra por vía de una inyección cada día, una inyección cada dos días, una inyección cada tres días, una inyección cada cuatro días, una inyección cada cinco días, una inyección cada seis días, o una inyección cada siete días, donde el programa de inyección se mantiene por, e.g., un día solamente, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, o más tiempo. Esta descripción también abarcacombinaciones de las dosis de arriba y programas, e.g., una dosis inicial relativamente grande de Listeria, seguida por dosis subsiguientes relativamente pequeñas de Listeria, o una dosis inicial relativamente pequeña seguida por una dosis grande.

Un programa de dosificación de, por ejemplo, una vez/semana, dos veces/semana, tres veces/semana, cuatro veces/semana, cinco veces/semana, seis veces/semana, siete veces/semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, y lo similar, está disponible para esta descripción. Los programas de dosificación abarcan la dosificación por un periodo total de tiempo de, por ejemplo, una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, y doce meses.

Se proporcionan ciclos de los programas de dosificación anteriores. El ciclo puede repetirse aproximadamente, e.g., cada siete días; cada 14 días; cada 21 días; cada 28 días; cada 35 días; 42 días; cada 49 días; cada 56 días; cada 63 días; cada 70 días; y lo similar. Un intervalo sin dosificación puede ocurrir entre un ciclo, donde el intervalo puede ser aproximadamente, e.g., siete días; 14 días; 21 días; 28 días; 35 días; 42 días; 49 días; 56 días; 63 días; 70 días; y lo similar. En este contexto, el término “aproximadamente” significa más o menos un día, más

o menos dos días, más o menos tres días, más o menos cuatro días, más o menos cinco días, más o menos seis días, por más o menos siete días.

La presente invención comprende un método para administrar Listeria que es oral. También se proporciona un método para administrar Listeria que es intravenosa. Además, lo que se proporciona es un método para administrar Listeria que es intramuscular. Esta descripción suministra una bacteria Listeria, o cultivo o suspensión de bacteria Listeria, preparada al crecer en un medio a base de carne, o que contiene polipéptidos derivados de un producto animal o carne. También se suministra por la presente invención una bacteria Listeria, o cultivo o suspensión de bacteria Listeria, preparada al crecer en un medio que no contiene productos animales o carne, preparada al crecer en un medio que contiene polipéptidos vegetales, preparada al crecer en un medio que no se basa en productos de levadura, o preparada al crecer en un medio que contiene polipéptidos de levadura.

La presente invención comprende un método para administrar Listeria que no es oral. También se proporciona un método para administrar Listeria que no es intravenosa. Además, lo que se proporciona es un método para administrar Listeria que no es intramuscular. Esta descripción suministra una bacteria Listeria, o cultivo o suspensión de bacteria Listeria, preparada al crecer en un medio que no es a base de carne, o que no contiene polipéptidos derivados de un producto animal o carne. También se suministra por la presente invención una bacteria Listeria, o cultivo o suspensión de bacteria Listeria, preparada al crecer en un medio a base de productos vegetales, que contiene polipéptidos vegetales, que se basa en productos de levadura, o que contiene polipéptidos de levadura.

Los métodos para la co-administración con un agente terapéutico adicional, e.g., una molécula pequeña, antibiótico, agente moduladora de inmunidad innato, agente modulador de la tolerancia, citosina, agentequimioterapéutico, o radiación, se conocen bien en la materia (Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

La presente invención proporciona reactivos para administrar junto con una Listeria atenuada. Estos reactivos incluyen reactivos biológicos tales como: (1) Citosinas, anticuerpos, células dendríticas, células tumorales atenuadas; (2) Reactivos de molécula pequeña tales como 5-fluorouracil, metotrexato, paclitaxel, docetaxel, cis-platina, gemcitabina; (3) Reactivos que modulan las células T reguladoras, tales como ciclofosfamida, anticuerpo anti-CTLA4,anticuerpo anti-CD25 (ver, e.g., Hawryfar, et al. (2005) J. Immunol. 174:344-3351); y (4) Vacunas (que incluyen vacunas de polipéptido, vacunas de ácido nucleico, vacunas de célula tumoral atenuada, y vacunas de célula dendrítica). Los reactivos pueden administrarse con la Listeria o independientemente (antes o después) de la Listeria. Por ejemplo, el reactivo puede administrarse inmediatamente antes (o después) de Listeria, o el mismo día que, un día antes (o después), una semana antes (o después), un mes antes (o después), o dos meses antes (o después) de Listeria, y lo similar.

Los reactivos biológicos o macromoléculas de la presente invención abarcan un agonista o antagonista de una citosina, un ácido nucleico que codifica un agonista o antagonista de una citosina, una célula que expresa una citosina, o un anticuerpo antagonístico o agonístico. Los reactivos biológicos incluyen, sin limitación, una citosina TH1, una citosina TH-2, IL-2, IL-12, FLT3-ligando, GM-CSF, IFNgamma, un receptor de citosina, un receptor de citosina soluble, una quimiocina, factor de necrosis de tumor (TNF), ligando CD40, o un reactivo que estimula el reemplazo de una unidad de proteasoma con una subunidad de inmunoproteasoma.

La presente descripción comprende reactivos biológicos, tales células diseñadas para expresar al menos uno de los siguientes: GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-18, factor de necrosis de tumor-alfa (TNF-alfa), o proteína-10 de inducción. Otros reactivos contemplados incluyen agonistas de B7-1, B7-2, CD28, ligando CD40, o ligando OX40 (OX40L), y nuevas formas diseñadas para ser solubles o diseñadas para unirse a membrana (ver, e.g., Karnbach. et al. (2001) J. Immunol. 167:2569-2576; Greenfield, et al. (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:389-418; Parney y Chang (2003)

J. Biomed. Sci. 10:37-43; Gri, et al. (2003) J. Immunol. 170:99-106; Chiodoni, et al. (1999) J. Exp. Med. 190:125-133; Enzler, et al. (2003) J. Exp. Med. 197:1213-1219; Soo Hoo, et al. (1999) J. Immunol 162:7343-7349; Mihalyo, et al. (2004) J. Immunol. 172:5338-5345; Chapoval, et al. (1998) J. Immunol. 161:6977-6984).

Sin implicar ninguna limitación, la presente descripción proporciona los siguientes biológicos. MCP-1, MIP1alpha, TNF-alfa, e interleucina-2, por ejemplo, son efectivos para tratar una variedad de tumores (ver, e.g., Nakamoto, et al. (2000) Anticancer Res. 20(6A):4087-4096; Kamada, et al. (2000) Cancer Res. 60:6416-6420; Li, et al. (2002) Cancer Res. 62:4023-4028; Yang, et al (2002) Zhonghua Wai Ke Za Zhi 40:789-791; Hoving, et al. (2005) Cancer Res.65:4300-4308; Tsuchiyama, et al. (2003) Cancer Gene Ther. 10:260-269; Sakai, et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8:695-704).

La presente descripción proporciona reactivos y métodos que comprenden un agonista de ligando Flt3, y un agonista de ligando Flt3 en combinación con Listeria. Ligando Flt3 (ligando 3 cinasa de tirosina similar a Fms) es una citosina que puede generar una respuesta inmune antitumor (ver, e.g., Dranoff (2002) Immunol. Revs. 188:147-154;Mach, et al. (2000) Cancer Res. 60:3239-3246; Furumoto, et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:774-783; Freedman, et al. (2003) Clin. Cancer Res.9:5228-5237; Mach, et al. (2000) Cancer Res. 60:3239-3246).

En otra modalidad, la presente descripción contempla la administración de una célula dendrítica (DC) que expresa al menos un antígeno de tumor, o antígeno de enfermedad infecciosa. La expresión por la DC de un antígeno puede mediarse por medio de, e.g., carga de péptido, extractos de célula tumoral, fusión con células tumorales, transducción con ARNm, o transfectado por un vector (ver, e.g., Klein, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1699-1708; Conrad y Nestle (2003) Curr. Opin. Mol. Ther. 5:405-412; Gilboa y Vieweg (2004) Immunol. Rev. 199:251-263; Paczesny, et al. (2003) Semin. Cancer Biol. 13:439-447; Westermann, et al. (1998) Gene Ther. 5:264-271).

Los métodos y reactivos de la presente descripción también abarcan reactivos de molécula pequeña, tales como 5-fluorouracil, metotrexato, irinotecan, doxorubicina, prednisona, dolostatin-10 (D10), combretastatina A-4, mitomicina C (MMC), vincristina, colchicinas, vinblastina, ciclofosfamida, beta-glucanos fúngicos y derivados de los mismos, y lo similar (ver, e.g., Hurwitz, et al. (2004) New Engl. J. Med. 350:2335-2342; Pelaez, et al. (2001) J. Immunol. 166:6608-6615; Havas, et al. (1990) J. Biol. Response Modifiers 9:194-204; Turk, et al. (2004) J. Exp. Med.200:771-782; Ghiringhelli, et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:336-344; Andrade-Mena (1994) Int. J. Tissue React. 16:95-103; Chrischilles, et al. (2003) Cancer Control 10:396-403). También se comprenden composiciones que no son moléculas, e.g., sales e iones.

Se proporcionan análogos de ciclofosfamida (ver, e.g., Jain, et al. (2004) J. Med. Chem. 47:3843-3852; Andersson, et al. (1994) Cancer Res. 54:5394-5400; Borch y Canute (1991) J. Med. Chem. 34:3044-3052; Ludeman, et al. (1979) J. Med. Chem. 22:151-158; Zon (1982) Prog. Med. Chem. 19:205-246).

También se abarcan por esta descripción los reactivos de molécula pequeña que estimulan la respuesta inmune innata, e.g., oligonucleótidos CpG, imiquimod, y alphaGalCer. Los oligonucleótidos CpG median la respuesta inmune a través de TLR9 (ver, e.g., Chagnon, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1302-1311; Speiser, et al. (2005) J. Clin. Invest. Feb.3 (epub adelantada a impresión); Mason, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:361-369; Suzuki, et al. (2004) Cancer Res. 64:8754-8760; Taniguchi, et al. (2003) Annu. Rev. Immunol. 21:483-513; Takeda, et al. (2003) Annu. Rev. Immunol.21:335-376; Metelitsa, et al. (2001) J. Immunol. 167:3114-3122).

Otros reactivos de molécula pequeña útiles incluyen aquellos derivados de peptidoglicano bacterial, tales como ciertos ligandos NOD2 (McCaffrey, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11386-11391).

Esta descripción incluye reactivos y métodos para modular la actividad de células reguladoras T (Tregs; células T supresoras). La atenuación o inhibición de la actividad de célula Treg puede mejorar la muerte del sistema inmune de células tumorales. Se ha identificado un número de reactivos que inhiben la actividad de la célula Treg. Estos reactivos incluyen, e.g., ciclofosfamida (a.k.a. Cytoxan®; CTX), anticuerpo anti-CD25, moduladores de GITR-L o GITR, un modulador de factor de transcripción de caja de cabeza de Tenedor (Fox), un modulador de LAG-3, anti-IL2R, y anti-CTLA4 (ver, e.g., Pardoll (2003) Annu. Rev. Immunol. 21:807-839; Ercolini, et al. (2005) J. Exp. Med. 201:1591-1602; Haeryfar, et al. (2005) J. Immunol. 174:3344-3351; Mihalyo, et al. (2004) J. Immunol. 172:5338-5345; Stephens, et al. (2004) J. Immunol. 173:5008-5020; Schiavoni, et al. (2000) Blood 95:2024-2030; Calmels, et al. (2004)Cancer Gene Ther. Oct. 08 (epub adelantada a impresión); Mincheff, et al. (2004) Cancer Gene Ther. Sept.17 [epub adelantada a impresión]; Muriglan, et al. (2004) J. Exp. Med. 200:149-157; Stephens, et al. (2004) J. Immunol. 173:5008-5020; Coffer y Burgering (2004) Nat. Rev. Immunol. 4:889-899; Kalinichenko, et al. (2004) Genes Dev. 18:830-850; Cobbold, et al. (2004) J. Immunol. 172:6003-6010; Huang, et al. (2004) Immunity 21:503-513). CTX muestra un efecto bimodal en el sistema inmune, donde bajas dosis de CTX inhiben Tregs (ver, e.g., Lutsiak, et al. (2005) Blood 105:2862-2868).

Los agentes de bloqueo CTLA4, tales como anticuerpos de bloqueo anti-CTLA4, pueden mejorar la respuesta inmune a cánceres, tumores, trastornos pre-cancerosos, infecciones, y lo similar (ver, e.g., Zubairi, et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:1433-1440; Espenschied, et al. (2003) J. Immunol. 170:3401-3407; Davila, et al. (2003) Cancer Res. 63:3281-3288; Hodi, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4712-4717). Donde la presente descripción utiliza anticuerpos anti-CTLA4, y lo similar, esta descripción no se limita necesariamente al uso para inhibir Tregs, y también no necesariamente comprende la inhibición de Tregs.

Los agentes de bloqueo del gen-3 de activación de linfocito (LAG-3), tales como anticuerpos anti-LAG-3 anticuerpos o LAG-3 soluble (e.g., LAG-3 Ig), pueden mejorar la respuesta inmune a cánceres o infecciones. Los anticuerpos anti-LAG-3 reducen la actividad de Tregs (ver, e.g., Huang, et al. (2004) Immunity 21:503-513; Triebel (2003) Trends Immunol. 24:619-622; Workman y Vignali (2003) Eur. J. Immunol. 33:970-979; Cappello, et al (2003) Cancer Res. 63:2518-2525; Workman, et al. (2004) J. Immunol. 172:5450-5455; Macon-Lemaitre y Triebel (2005) Immunology 115:170-178).

Las vacunas que comprenden un antígeno de tumor, un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor, una célula que comprende un antígeno de tumor, una célula de tumor, o una célula de tumor atenuada, se comprenden por esta descripción. Se proporcionan los reactivos derivados de un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor, e.g., un ácido nucleico optimizado de codón, o un ácido nucleico que codifica dos o más antígenos de tumor diferentes, o un ácido nucleico que expresa epítopes reordenados de un antígeno de tumor, e.g., donde el orden natural de epítopes es ABCD y el orden diseñado es ADBC, o un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos dos antígenos de tumor diferentes.

En donde un anticuerpo administrado, compuesto de unión derivado de un anticuerpo, citosina, u otro agente terapéutico produce toxicidad, una dosis apropiada puede ser una donde el efecto terapéutico sopesa el efecto tóxico. Generalmente, una dosificación óptica de la presente invención es una que maximiza el efecto terapéutico, mientras limita cualquier efecto tóxico a un nivel que no amenaza la vida del paciente o reduce la eficacia del agente terapéutico. Las señales de efecto tóxico, o efecto anti-terapéutico incluyen, sin limitación, e.g., respuesta antiidiotípica, respuesta inmune a un anticuerpo terapéutico, reacción alérgica, toxicidad de plaqueta y hematológica, elevaciones de aminotransferasas, fosfatasa alcalina, creatina quinasa, neurotoxicidad, nausea, y vómito (ver, e.g., Huang, et al. (1990) Clin. Chem. 36:431-434).

Una cantidad efectiva de un agente terapéutico es una que disminuirá o mejorará los síntomas normalmente por al menos 10%, más normalmente por al menos 20%, a lo máximo normalmente por al menos 30%, típicamente por al menos 40%, more típicamente por al menos 50%, a lo máximo típicamente por al menos 60%, con frecuencia por al menos 70%, con más frecuencia por al menos 80%, y a lo máximo con frecuencia por al menos 90%, convencionalmente por al menos 95%, más convencionalmente por al menos 99%, y a lo máximo convencionalmente por al menos 99.9%.

Los reactivos y métodos de la presente invención proporcionan una vacuna que comprende solamente una vacunación, o que comprende una primer vacunación; o que comprende al menos una revacunación; al menos dos revacunaciones; o al menos tres revacunaciones. Está disponible la guía en parámetros para revacunaciones (ver, e.g., Marth (1997) Biologicals 25:199-203; Ramsay, et al. (1997) Immunol. Cell Biol. 75:382-388; Gherardi, et al. (2001) Histol. Histopathol. 16:655-667; Leroux-Roels, et al. (2001) ActA Clin. BeIg. 56:209-219; Greiner, et al. (2002) Cancer Res. 62:6944-6951; Smith, et al. (2003) J. Med. Virol. 70:SuppU:S38-S41; Sepulveda-Amor, et al. (2002) Vaccine 20:2790-2795).

Se proporciona un primer reactivo que comprende una bacteria Listeria (o vacuna Listeria), y un segundo reactivo que comprende, e.g., una citosina, una molécula pequeña tal como ciclofosfamida o metotrexato, o una vacuna, tal como una célula de tumor atenuada o célula de tumor atenuada que expresa una citosina. Se proporcionan los siguientes métodos de administración del primer reactivo y el segundo reactivo.

La Listeria y el segundo reactivo pueden administrarse de manera concurrente, es decir, donde la administración para cada uno de estos reactivos puede ocurrir en intervalos de tiempo que se sobreponen parcial o completamente entre sí. La Listeria y el segundo reactivo pueden administrarse durante intervalos de tiempo que no se sobreponen entre sí. Por ejemplo, el primer reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 0 a 1 hora, mientras el segundo reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 1 a 2 horas. También, el primer reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 0 a 1 hora, mientras el segundo reactivo puede administrarse en algún lugar dentro del margen de tiempo de t = 2-3 horas, t = 3-4 horas, t = 4-5 horas, t = 5-6 horas, t = 6-7 horas, t = 7-8 horas, t = 8-9 horas, t = 9-10 horas, y lo similar. Además, el segundo reactivo puede administrarse en algún lugar en el margen de tiempo de t = menos 2-3 horas, t = menos 3-4 horas, t = menos 4-5 horas, t = 5-6 menos horas, t = menos 6-7 horas, t = menos 7-8 horas, t = menos 8-9 horas, t = menos 9-10 horas, y lo similar.

Para proporcionar otro ejemplo, el primer reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 0 a 1 días, mientras el segundo reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 1 a 2 días. También, el primer reactivo puede administrarse dentro del margen de tiempo de t = 0 a 1 día, mientras el segundo reactivo puede administrarse en algún lugar dentro del margen de tiempo de t = 2-3 días, t = 3-4 días, t = 4-5 días, t = 5-6 días, t = 6-7 días, t = 7-8 días, t = 8-9 días, t = 9-10 días, y lo similar. Además, el segundo reactivo puede administrarse en algún lugar en el tiempo de t = menos 2-3 días, t = menos 3-4 días, t = menos 4-5 días, t = menos 5-6 días, t = menos 6-7 días, t = menos 7-8 días, t = menos 8-9 días, t = menos 9-10 días, y lo similar.

En otro aspecto, la administración de la Listeria puede comenzar en t = 0 horas, donde la administración resulta en un valor máximo (o nivel máximo) en concentración de plasma de la Listeria, y donde la administración del segundo reactivo se inicia a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma alcanza dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 95% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 90% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 85% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 80% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 75% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 70% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 65% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 60% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 55% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 50% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 45% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 40% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 35% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 30% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 25% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 20% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 15% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 10% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 5% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 2.0% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 0.5% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 0.2% dicha concentración máxima, por a aproximadamente el tiempo que la concentración de Listeria en plasma es 0.1%, o menos de, dicha concentración máxima.

En otro aspecto, la administración del segundo reactivo puede comenzar en t = 0 horas, donde la administración resulta en un valor máximo (o nivel máximo) en concentración de plasma del segundo reactivo y donde la administración de la Listeria se inicia a aproximadamente el tiempo que la concentración de nivel de plasma del segundo reactivo alcanza dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 95% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 90% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 85% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 80% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 75% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 70% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 65% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 60% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 55% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 50% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 45% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 40% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 35% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 30% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 25% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 20% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 15% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 10% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 5% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración de reactivo e plasma es 2.0% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 0.5% dicha concentración máxima, a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 0.2% dicha concentración máxima, o a aproximadamente el tiempo que la concentración del segundo reactivo en plasma es 0.1%, o menos de, dicha concentración máxima. Ya que se reconoce que la alteración de la Listeria o segundo reactivo puede ocurrir in vivo, las concentraciones anteriores pueden valorarse después de la medición del reactivo intacto, o después de la medición de un producto de degradación identificable del reactivo intacto.

Las formulaciones de los agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse para almacenamiento al mezclar con portadores, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptables en la forma de, e.g., polvos liofilizados, pastas, soluciones acuosas o suspensiones (ver, e.g., Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

Esta descripción también proporciona un kit que comprende una célula Listeria, un cultivo celular listerial, o una preparación de célula liofilizada, y un compartimiento. Además, la presente invención proporciona un kit que comprende una célula Listeria, cultivo celular listerial, o una preparación de célula liofilizada y un reactivo. También se proporciona un kit que comprende una célula Listeria, un cultivo celular listerial, o una preparación de célula liofilizada e instrucciones para uso o desecho. Además, la presente invención proporciona un kit que comprende una célula Listeria, un cultivo celular listerial, o preparación de célula liofilizada, y compartimiento y un reactivo. Se proporciona un kit que comprende bacteria Listeria, e instrucciones para utilizar la bacteria Listeria con un agente anti-cáncer de molécula pequeña, y/o agente de inmunomodulación de molécula pequeña (e.g., ciclofosfamida), y/o un agente antiinfección de molécula pequeña, y lo similar. También se proporciona un kit que comprende bacteria Listeria, y/o instrucciones para administrar la Listeria, y/o instrucciones para monitorear la respuesta inmune a la Listeria administrada, y/o instrucciones para monitorear la respuesta inmune a un antígeno heterólogo codificado por la Listeria administrada.

(b). Usos.

Esta descripción proporciona, en ciertas modalidades, una bacteria Listeria modificada, e.g., L. monocytogenes, diseñada para expresar al menos un antígeno heterólogo. Esta descripción es útil para mejorar la respuesta inmune, estimular la respuesta inmune, mejorar la presentación inmune, incrementar la estabilidad de un ARNm expresado o polipéptido, incrementar el procesamiento proteolítico de un polipéptido expresado, incrementar la respuesta inmune a un autoantígeno mutado, incrementar la supervivencia a un cáncer o infección, y/o para tratar un cáncer o infección. Esta descripción también es útil para expresión mejorada de un antígeno heterólogo, e.g., para industria, agricultura, o medicina.

Para métodos para estimular, mejorar, o incrementar la respuesta inmune a un cáncer, tumor, o agente infeccioso; y para métodos para estimular, mejorar, o incrementar la supervivencia a un cáncer, tumor, o agente infeccioso; puede ocurrir un incremento con administración de una Listeria que contiene un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. Para propósitos de proporcionar un control experimental, el incremento puede ser relativo una respuesta con administración de una Listeria que no contiene un ácido nucleico que codifica ese antígeno heterólogo particular. Como otra alternativa, el incremento puede ser relativo a una respuesta con la administración de una Listeria que no contiene ningún ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, e.g., una Listeria tipo silvestre o genitora. Como aún otra alternativa, el incremento puede ser relativo a una respuesta sin administrar ninguna Listeria.

Para métodos para estimular, mejorar, o incrementar la respuesta inmune a un cáncer, tumor, o agente infeccioso; y para métodos para estimular, mejorar, o incrementar la supervivencia a un cáncer, tumor, o agente infeccioso; puede ocurrir un incremento con administración de una Listeria (que contiene o que no contiene un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo) con un modulador inmune, tal como un anticuerpo agonista, una citosina, o un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno del cáncer, tumor, o agente infeccioso. Para propósitos de proporcionar un control experimental, el incremento puede ser relativo a una respuesta con administración de una Listeria pero sin administrar el modulador inmune. Como una alternativa, el incremento puede ser relativo a cualquier respuesta con la administración del modulador inmune, pero sin administrar ninguna Listeria. Como aún otra alternativa, el incremento puede ser relativo a una respuesta sin administrar ninguna Listeria y sin administrar el modulador inmune.

En algunas modalidades, esta descripción proporciona métodos para estimular una respuesta inmune a un antígeno en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de una bacteria Listeria descrita en la presente, o una cantidad efectiva de una composición que comprende la Listeria, al mamífero. En algunas modalidades, esta descripción proporciona métodos para estimular una respuesta inmune a un antígeno de, o derivado de, un cáncer o agente infeccioso, que comprende administrar una cantidad efectiva de una bacteria Listeria descrita en la presente, o una cantidad efectiva de una composición que comprende la Listeria, al mamífero. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo expresado por la Listeria comparte al menos un epítope con, o inmunológicamente se reactiva de manera cruzada con, el antígeno de, o derivado de, cáncer o agente infeccioso. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta inmune de la célula T CD8+. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta inmune de la célula T CD4+.

Esta descripción proporciona una bacteria Listeria, o una cepa Listeria, que está muerta pero es metabólicamente activa (KBMA) (ver, e.g., Brockstedt, et al (2005) Nat. Med. 11:853-860). Una bacteria Listeria KBMA es metabólicamente activa, pero no puede formar una colonia, e.g., en agar. Una mutación de inactivación en al menos un gen de reparación del ADN, e.g., ΔuvrAB, permite la muerte de Listeria utilizando concentraciones de un agente reticulante de ácido nucleico (e.g., psoraleno) a bajas concentraciones, donde estas concentraciones son suficientes para prevenir la formación de colonia pero no suficientes para afectar sustancialmente el metabolismo, o afectar de manera detectable el metabolismo. El resultado de tratamiento limitado con psoraleno/luz UVA, y/o de tratamiento con un agente reticulante de ácido nucleico que es altamente específico para hacer enlaces transversales genómicos interfilamento, es que las células bacteriales se matan pero permanecen metabólicamente activas.

En algunas modalidades, la presente invención resulta en la reducción del número de células que se proliferan anormalmente, la reducción en el número de células cancerígenas, la reducción en el número de células tumorales, la reducción en el volumen de tumor, la reducción del número de patógenos u organismos infecciosos por unidad de tejido o fluido biológico (e.g., suero), la reducción en concentración viral (e.g., suero), donde normalmente se reduce por al menos 5%, más normalmente se reduce por al menos 10%, a lo máximo normalmente se reduce por al menos 15%, típicamente se reduce por al menos 20%, more típicamente se reduce por al menos 25%, a lo máximo típicamente se reduce por al menos 30%, usualmente se reduce por al menos 40%, más usualmente se reduce por al menos 50%, a lo máximo usualmente se reduce por al menos 60%, convencionalmente se reduce por al menos 70%, más convencionalmente se reduce por al menos 80%, a lo máximo convencionalmente se reduce por al menos 90%, y aún a lo máximo convencionalmente se reduce por al menos 99%. La unidad de reducción puede ser, sin limitación, el número de células tumorales/sujeto mamífero; número de células tumorales/hígado; número de células tumorales/bazo; masa de células tumorales/sujeto mamífero; masa de células tumorales/hígado; masa de células tumorales/bazo; número de partículas virales o virus o concentración por gramo de hígado; número de partículas virales o virus o concentración por célula; número de partículas virales o virus o concentración per ml de sangre; y lo similar.

El medio de crecimiento utilizado para preparar una Listeria puede caracterizarse por análisis químico, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), espectroscopia de masa, cromatografía de gas, métodos espectroscópicos, y lo similar. El medio de crecimiento también puede caracterizarse por medio de anticuerpos específicos para componentes de ese medio, donde el componente ocurre como un contaminante con la Listeria, e.g., un contaminante en el polvo listerial, preparación congelada, o pasta celular. Los anticuerpos, específicos para los antígenos de proteína o péptido, o glicolípido, glicopéptido, o antígenos de lipopéotido, pueden utilizarse en ensayos ELISA formulados para detectar contaminantes de origen animal. Los anticuerpos para utilizarse en la detección deantígenos, o fragmentos antigénicos, de origen animal están disponibles (ver, e.g., Fukuta, et al. (1977) Jpn. Heart J.

18:696-704; DeVay y Adler (1976) Ann. Rev. Microbiol. 30:147-168; Cunningham, et al. (1984) Infection Immunity 46:34-41; Kawakita, et al. (1979) Jpn. Cir. J. 43:452-457; Hanly, et al. (1994) Lupus 3:193-199; Huppi, et al. (1987) Neurochem. Res. 12:659-665; Quackenbush, et al. (1985) Biochem. J. 225:291-299). Esta descripción suministra kits y métodos de diagnóstico que facilita la prueba de la influencia de la Listeria en el sistema inmune. La prueba puede incluir comparar una cepa de Listeria con otra cepa de Listeria, una cepa de Listeria de origen con una cepa de Listeria mutada. Los métodos de prueba comprenden, e.g., fagocitosis, difusión, presentación de antígeno, estimulación de la célula T, respuesta de citosina, toxicidad de huésped, LD50, y eficacia para mejorar una condición patológica.

La presente descripción proporciona métodos para incrementar la supervivencia de un sujeto, huésped, paciente, sujeto prueba, sujeto experimental, sujeto veterinario, y lo similar, a un cáncer, un tumor, un trastorno precanceroso, un trastorno inmune, y/o un agente infeccioso. El agente infeccioso puede ser un virus, bacteria, o parásito, o cualquier combinación de los mismos. El método comprende administrar una Listeria atenuada, por ejemplo, como una suspensión, bolo, gel, matriz, inyección, o infusión, y lo similar. La Listeria administrada aumenta la supervivencia, en comparación con un control apropiado (e.g., nada administrado o un placebo administrado, y losimilar) por usualmente al menos un día; más usualmente al menos cuatro días; a lo máximo usualmente al menos ocho días, normalmente al menos 12 días; más normalmente al menos 16 días; a lo máximo normalmente al menos 20 días, con frecuencia al menos 24 días; con más frecuencia al menos 28 días; a lo máximo con frecuencia al menos 32 días, convencionalmente al menos 40 días, más convencionalmente al menos 48 días; a lo máximo convencionalmente al menos 56 días; típicamente por al menos 64 días; más típicamente por al menos 72 días; a lo máximo típicamente al menos 80 días; generalmente al menos seis meses; más generalmente al menos ocho meses; a lo máximo generalmente al menos diez meses; comúnmente al menos 12 meses; más comúnmente al menos 16 meses; y a lo máximo comúnmente al menos 20 meses, o más.

En algunas modalidades, el sujeto/huésped/paciente al cual se administra Listeria es un mamífero. En algunas modalidades, el mamífero es un primate. En algunas modalidades, el primate es un humano.

Cada uno de los métodos descritos arriba contempla administrar una composición que comprende una Listeria y un excipiente, una Listeria y un vehículo, una Listeria y tampón, una Listeria y un reactivo, una Listeria y un vehículo farmacéuticamente aceptable, una Listeria y un vehículo agrícolamente aceptable, una Listeria y un vehículo veterinariamente aceptable, una Listeria y un estabilizador, una Listeria y un conservador, y lo similar.

La presente invención proporciona reactivos y métodos para tratar condiciones que son tanto cancerosas (neoplasmas, malignidades, cánceres, tumores, y/o trastornos precancerosos, displasias, y lo similar) como infecciosas (infecciones). Se proporcionan reactivos y métodos para tratar trastornos que son tanto cancerosos (neoplasmas, malignidades, cánceres, tumores, y/o trastornos precancerosos, displasias, y lo similar) como infecciosos. Con infección con ciertos virus, tales como virus de papiloma y virus polioma, el resultado puede ser una condición cancerosa, y aquí la condición es tanto cancerosa como infecciosa. Puede detectarse una condición que es tanto cancerosa como infecciosa, como un ejemplo no limitante, donde una infección viral resulta en una célula cancerosa, y donde la célula cancerosa expresa un antígeno codificado viral. Como otro ejemplo no limitante, una condición que es tanto cancerosa como infecciosa es una donde la respuesta inmune contra una célula de tumor incluye reconocimiento específico contra un antígeno codificado viral (Ver, e.g., Montesano, et al. (1990) Cell 62:435445; Ichaso y Dilworth (2001) Oncogene 20:7908-7916; Wilson, et al. (1999) J. Immunol. 162:3933-3941 ; Daemen, et al. (2004) Antivir. Ther. 9:733-742; Boudewijn, et al. (2004) J. Natl. Cancer Inst. 96:998-1006; Liu, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:14567-14571).

En algunas modalidades, las Listeria descritas en la presente que expresan un antígeno heterólogo (o composiciones que comprenden la Listeria) se utilizan para inducir las respuestas inmunes contra células en un sujetoque expresan el antígeno. En algunas modalidades, la Listeria, vacunas, y otras composiciones descritas en la presente se utilizan para tratar trastornos cancerosos, trastornos precancerosos, tumores, infecciones, y/oangiogénesis de tumores y cánceres. En algunas modalidades, Listeria, vacunas, y otras composiciones descritas en la presente se utilizan para tratar cáncer en un sujeto.

Las siguientes modalidades se refieren a las modalidades individuales descritas en la presente.

La presente invención, en ciertas modalidades, comprende un método para estimular el sistema inmune contra un trastorno infeccioso, donde el trastorno infeccioso es una infección por Listeria. También se comprende un método para estimular el sistema inmune contra un trastorno infeccioso, donde el trastorno infeccioso no es una infección por Listeria, es decir, excluye las infecciones por Listeria.

Cada una de las modalidades comprende, como un reactivo adicional o alterno, una Listeria que no se atenúa. También, cada una de las modalidades comprende, como un reactivo adicional o alterno, una Listeria que se atenúa. Cada una de las modalidades comprende, como un método adicional o alterno, utilizando una Listeria que no se atenúa. También, cada una de las modalidades comprende, como un método adicional o alterno, utilizando una Listeria que se atenúa.

Cada una de las modalidades descritas en la presente comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de tumor, una Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de cáncer, una Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno heterólogo, así como una Listeria que expresa al menos un antígeno de tumor, antígeno de cáncer, y/o antígeno heterólogo.

Cada una de las modalidades descritas en la presente comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que no comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de tumor, una Listeria que no comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de cáncer, una Listeria que no comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, así como una Listeria que no expresa un antígeno de tumor, antígeno de cáncer, y/o un antígeno heterólogo.

Cada una de las modalidades descritas en la presente comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de un organismo infeccioso no listerial. Cada una de las modalidades descritas arriba comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de un virus, parásito, bacteria, tumor, autoantígeno derivado de un tumor, no autoantígeno derivado de un tumor.

Cada una de las modalidades descritas en la presente comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que no comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de un organismo infeccioso no listerial. Cada una de las modalidades descritas arriba comprende métodos y reactivos que utilizan una Listeria que no comprende un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de un virus, parásito, bacteria, tumor, autoantígeno derivado de un tumor, no autoantígeno derivado de un tumor.

Cada una de las modalidades descritas en la presente también comprende una Listeria que no se prepara al crecer en un medio a base de proteína animal, pero se prepara al desarrollar en un tipo diferente de medio. Cada una de las modalidades descritas arriba también comprende una Listeria que no se prepara al crecer en un medio que contiene péptidos derivados de proteína animal, pero se prepara al desarrollar en un tipo diferente de medio. Además, cada una de las modalidades descritas arriba comprende la administración de una Listeria por una vía que no es oral y que no es entérica. Adicionalmente, cada una de las modalidades descritas arriba incluye la administración de una Listeria por una vía que no requiere movimiento del lúmen del intestino a los linfáticos o torrente sanguíneo.

Cada una de las modalidades descritas en la presente comprende además un método en donde las Listeria no se inyectan directamente en el tumor o no se inyectan directamente en un sitio que se afecta por el cáncer, trastorno precanceroso, tumor, o infección.

Adicionalmente, cada una de las modalidades descritas en la presente comprende administrar la Listeria por inyección directa en un tumor, por inyección directa en una lesión cancerosa, y/o por inyección directa en una lesión de infección. También, esta descripción incluye cada una de las modalidades anteriores, donde la administración no es por inyección directa en un tumor, ni por inyección directa en una lesión cancerosa, y/o ni por inyección directa en una lesión de infección.

Se proporciona una vacuna donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de tumor o se deriva de un antígeno de tumor. También se proporciona una vacuna donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de cáncer, o se deriva de un antígeno de cáncer. Además, lo que se proporciona es una vacuna donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de un organismo infeccioso, o se deriva de un antígeno de un organismo infeccioso, e.g., un virus, bacteria, u organismo multicelular.

Una modalidad adicional proporciona un ácido nucleico donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de tumor o derivado de un antígeno de tumor. También se proporciona un ácido nucleico donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de cáncer, o se deriva de un antígeno de cáncer. Además, lo que se proporciona es un ácido nucleico, donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de un organismo infeccioso, o se deriva de un antígeno de un organismo infeccioso, e.g., un virus, bacteria, u organismo multicelular.

En otra modalidad, lo que se proporciona es una Listeria donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un antígeno de tumor o derivado de un antígeno de tumor. También se proporciona una Listeria donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de los ejemplos descritos en la presente, es un antígeno de cáncer, o se deriva de un antígeno de cáncer. Además, lo que se proporciona es una Listeria, donde el antígeno heterólogo, como en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, es un

5 antígeno de un organismo infeccioso o derivado de un antígeno de un organismo infeccioso, e.g., un virus, bacteria, parásito, u organismo multicelular.

Cada una de las modalidades descritas arriba también comprende una Listeria atenuada que no se prepara al

crecer en un medio a base de proteína de carne o animal, pero se prepara al desarrollar en un tipo diferente de medio.

Se proporciona una Listeria atenuada no preparada al crecer en un medio a base de proteína animal o carne, pero se

10 prepara al crecer en un medio a base de proteína derivada de vegetal y/o levadura.

Al menos que se especifique de otra manera, cada una de las modalidades descritas en la presente comprende una bacteria que no contiene un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. También, al menos que se especifique de otra manera, cada una de las modalidades descritas en la presente comprende una bacteria que no contiene un ácido nucleico que codifica una secuencia reguladora heteróloga. Opcionalmente, cada una de las

15 modalidades descritas en la presente comprende una bacteria que contiene un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo y/o que codifica una secuencia reguladora heteróloga.

Lo siguiente concierne a modalidades bacteriales, e.g., de Listeria, Bacillus anthracis, u otras bacterias, que

codifican los antígenos secretados, antígenos no secretados, antígenos secretados que se liberan de las bacterias por

un mecanismo diferente a secreción, y antígenos no secretados que se liberan por un mecanismo diferente a

20 secreción. Lo que se incluye es una bacteria que contiene un polinucleótido que comprende un ácido nucleico, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que contiene una secuencia secretora y se secreta bajo condiciones apropiadas; donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que no contiene una secuencia secretora; donde el ácido nucleico contiene una secuencia secretora y donde el polipéptido se libera por algún otro mecanismo tal como perforación o daño enzimático a la membrana celular o pared celular; y donde el ácido nucleico codifica un polipéptido

25 que no contiene ninguna secuencia secretora pero donde el polipéptido se libera por algún otro mecanismo, tal como perforación o daño enzimático a la membrana celular y/o pared celular.

Sin implicar ninguna limitación, en cuanto a estrechez o amplitud, de la presente invención, esta descripción

puede modificarse por el experto para comprender cualquiera de las siguientes modalidades, o consistir de cualquiera

de las siguientes modalidades (Tabla 10).

Tabla 10. Dispersión de la bacteria de la presente invención, es decir, la transmisión de una bacteria de una primera célula huésped a una segunda célula huésped

Sin implicar ninguna limitación a la bacteria de la presente invención, e.g., con respecto a su habilidad para dispersarse de célula a célula, la dispersión de la bacteria de la presente invención puede comprender uno o más de los siguientes. Sin implicar alguna falta de limitación a la bacteria de la presente invención, e.g., con respecto a su habilidad para dispersarse de célula a célula, la dispersión de la bacteria de la presente invención puede comprender uno o más de los siguientes.

La dispersión de la bacteria de la: como máximo 1%; como se compara a la dispersión de un control

presente invención puede ser: como máximo 5%; como máximo 10%; como máximo 20%; adecuado o bacteria genitora.

como máximo 30%; como máximo 40; como máximo 50; como máximo 60%; como máximo 70%; como máximo 80%; como máximo 90%; como máximo 95%; como máximo 100%;

como máximo 200%; como máximo 300%; como máximo 400%; como máximo 500%

presente invención puede ser: como máximo 5%; como máximo 10%; como máximo 20%; como máximo 30%; como máximo 40; como máximo 50; como máximo 60%; como máximo 70%; como máximo 80%; como máximo 90%; como máximo 95%; adecuado o bacteria genitora.

como máximo 100%; como máximo 200%; como máximo 300%; como máximo 400%; como máximo 500%

La dispersión de la bacteria de la: 0 a 1% a 5%; 5% a como se compara a la dispersión de un control

presente invención puede ser: 10%; 10% a 20%; adecuado o bacteria genitora.

20% a 30%; 30% a

40%; 40% a 50%;

50% a 60%; 60% a

70%; 70% a 80%;

80% a 90%; 90% a

95%; 90% a 100%;

100% a 200%; 200% a

300%; 300% a 400%;

400% a 500%, o más

de 500%,

Tabla 10. (Continuación). Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención. Sin implicar alguna limitación a la presente invención, e.g., en cuanto a estrechez y amplitud, la presente invención puede comprender cualquiera,

o cualquier combinación, de las siguientes modalidades. Sin implicar alguna limitación a la presente invención, la presente invención puede comprender cualquiera, o cualquier combinación, de las siguientes modalidades.

Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención es al menos: 0.1%; 0.5%; 1.0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 10%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 99%; 99.5%; 99.5%, 2-veces; 5-veces; 10-veces; o más de 10-veces, como se compara con la Listeria genitora o con una Listerial de control adecuado.

Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención es al menos: no detectable, 0.1%; 0.5%; 1.0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; como se compara con la Listeria genitora o con una Listerial de control adecuado.

55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 99%; 99.5%; 99.5%, 2-veces; 5:-veces; 10-veces; o más de 10-veces,

Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención es al menos: 0.1%; 0.5%; 1.0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 10%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 99%; 99.5%; o 99.5%, 2-veces; 5-veces; 10veces; o más de 10-veces, como se compara con la Listeria genitora o con una Listerial de control adecuado.

Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención es al menos: 0.1%; 0.5%; 1.0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; como se compara con la Listeria genitora o con una Listerial de control adecuado.

65%; 10%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 99%; 99.5%; 99.5%, 2-veces; 5-veces; 10-veces; o más de 10-veces,

Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención es al menos: 0-0.1%; 0.1-0.5%; 0.5-1.0%; L05%; 5-10%; 10-15%; 1520%;·20-25%; 25-30%; 30-35%; 35-40%; 40-45%; 45-50%; 5055%; 55-60%;60-65%; 65-70%; 70-75%; 75-80%; 80-85%; 8590%; 90-95%; 95-99%; 9999.5%; 99.5-99.5%, 99.5%-más, 100% a 2-veces; 2-veces a 10veces; 10-veces a más de 10veces, como se compara con la Listeria genitora o con una Listerial de control adecuado.

Tabla 10. (Continuación). Crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención.

Crecimiento extracelular de la cepa Listeria de la presente: 0.1%; 0.5%; 1.0%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; como se compara con el crecimiento intracelular de la misma cepa Listeria

invención es al menos: 40%; 45%; 50%; 55%; 60%;

65%; 70%; 75%; 80%; 85%;

90%; 95%; 99%; 99.5%; o más

de 99.5%, 100%, 2-veces más;

5-veces más; o 10-veces más,

Crecimiento extracelular de la: 0-0.1%; 0.1-05%; 0.5-1.0%; como se compara con el crecimiento

cepa Listeria de la presente: 1.0-5%; 5-10%; 10-15%; 15 intracelular de la misma cepa Listeria

invención es al menos: 20%; 20-25%; 25-30%; 30

35%; 35-40%; 40-45%; 45

50%; 50-55%; 55-60%;60-65%;

65-70%; 70-75%; 75-80%; 80

85%;

85-90%; 90-95%; 95-99%; 9999.5%; 99.5-100%, 100-200%; 200-500%; 500-1000%; o más de 1000%,

Genes relacionados al crecimiento. Un gen relacionado al crecimiento de la presente invención puede incluir, pero no se limita necesariamente en estrechez y amplitud, por los siguientes.

Un crecimiento relacionado al gen contempla uno que estimula la tasa de crecimiento intracelular por: La misma cantidad, por al menos 10% más; por al menos 20% más; por al menos 30% más; por al menos 40% más; por al menos 50% más; por al menos 60% más; por al menos 70% más; por al menos 80% más; por al menos 90% más; por al que la tasa del gen que estimula el crecimiento extracelular

menos 100% (2-veces) más; por al menos 3-veces más; por al menos 4-veces más; por al menos 10-veces más; por al menos 20-veces más; por al menos 40-veces más,

El crecimiento de la cepa Listeria de la presente invención puede compararse con una cepa Listeria de control, adecuada o genitora, en donde sólo se compara el crecimiento intracelular. El crecimiento de una cepa Listeria de la presente invención puede compararse con una cepa Listeria de control, adecuada o genitora, en donde sólo se compara el crecimiento extracelular. El crecimiento de una cepa Listeria de la presente invención puede compararse con una cepa Listeria de control, adecuada o genitora, en donde el crecimiento intracelular de la cepa de la presente invención se compara con el crecimiento extracelular de una cepa de control adecuado o genitora.

El crecimiento de una cepa Listeria de la presente invención puede compararse con una cepa Listeria de control, adecuada o genitora, en donde el crecimiento extracelular de la cepa de la presente invención se compara con el crecimiento intracelular de una cepa de control adecuado o genitora.

Tabla 10. (Continuación). Bacteria Metabólicamente activa. Sin implicar alguna limitación a la presente invención,

e.g., en cuanto a estrechez y amplitud, la presente invención puede comprender cualquiera, o cualquier combinación, de las siguientes modalidades. Sin implicar alguna carencia de limitación a la presente invención, e.g., en cuanto a estrechez y amplitud, la presente invención puede comprender cualquiera, o cualquier combinación, de las siguientes modalidades.

Una bacteria Listeria metabólicamente activa pero formación de colonia deteriorada (y/o división celular o: y en donde el metabolismo es mayor a 10-veces; 10-veces a 5-veces; 5-veces a 4-veces; 4veces a 2-veces; 2-veces a 100%; que de la bacteria Listeria genitora o de control.

duplicación deteriorada) de la: esencialmente 100%; 100% a

presente invención comprende: 95%; 95% a 90%; 90% a 80%;

una bacteria Listeria en donde: 80% a 70%; 70% a 60%, 60% a

la tasa de formación de colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 40% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: 50%; 50% a 40%,

Una bacteria Listeria metabólicamente activa pero formación de colonia deteriorada (y/o división celular o: y en donde el metabolismo es mayor a 10-veces, 10-veces a 5-veces; 5-veces a 4-veces; 4veces a 2–veces; 2-veces a 100%; que de la bacteria Listeria genitora o de control.

duplicación deteriorada) de la: esencialmente 100%; 100% a

presente invención comprende: 95%; 95% % 90%; 90% a 80%;

una bacteria Listeria en donde: 80% a 70%; 70% a 60%, 60% a

la tasa de formación de colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 30% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: 50%, 50% a 40%; o 40% a 30,

duplicación deteriorada) de la: esencialmente 100%; 100% a

presente invención comprende: 95%; 95% a 90%; 90% a 80%;

una bacteria Listeria en donde: 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a

la tasa de formación de: 50%; 50% a 40%; 40% a 30; o

colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 20% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: 30 a 20%,

Una bacteria Listeria metabólicamente activa pero: y en donde el metabolismo es mayor a 10-veces; 10-veces a que de la bacteria Listeria genitora o de control.

formación de colonia deteriorada (y/o división celular o: 5-veces; 5-veces a 4-veces; 4veces a 2-veces; 2-veces a 100%;

duplicación deteriorada) de la: esencialmente 100%; 100% a

presente invención comprende: 95%; 95% a 90%, 90% a 80%;

una bacteria Listeria en donde: 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a

la tasa de formación de: 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30

colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 10% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: a 20%; o 20 a 10%.

Una bacteria Listeria metabólicamente activa pero formación de colonia deteriorada (y/o división celular o: y en donde el metabolismo es mayor a 10-veces; 10-veces a 50-veces; 5-veces a 4-veces; 4veces a 2-veces; 2-veces a 100%; que de la bacteria Listeria genitora o de control.

duplicación deteriorada) de la: esencialmente 100%; 100% a

presente invención comprende: 95%; 95% a 90%; 90% a 80%;

una bacteria Listeria en donde: 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a

la tasa de formación de: 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30

colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 5% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: a 20%; 20 a 10%; o 10 a 5%,

Tabla 10 (continuación). Bacteria metabólicamente activa

Una bacteria Listeria metabólicamente activa pero formación de colonia deteriorada (y/o división celular o: y en donde el metabolismo es mayor a 10-veces; 10-veces a 5veces; 5-veces a 4-veces; 4veces a 2-veces; 2-veces a 100%; que de la bacteria Listeria genitora o de control.

duplicación deteriorada) de la presente invención comprende una bacteria Listeria en donde la tasa de formación de colonia, división celular, y/o duplicación se encuentra bajo el 5% que de una bacteria Listeria de control o genitora,: esencialmente 100%; 100% a 95%; 95% a 90%; 90% a 80%; 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30 a 20%; 20-10%; 10-5%; o 5% a 1%,

Una bacteria “muerta pero metabólicamente activa” (KMBA), es una bacteria Listeria que es incapaz de formar colonias y en donde el metabolismo es, e.g., 10-veces a 5-veces (un indicador de metabolismo que ocurre a un nivel más alto que el normalmente encontrado); 5-veces a 4-veces; 4-veces a 2-veces; 2-veces a 100%; esencialmente 100%; 100% a 95%; 95% a 90%; 90% a 80%; 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30 a 20%; 20-10%; o 10-5%; que de una bacteria Listeria genitora o de control. En otro aspecto,

la bacteria KBMA es una bacteria Listeria en donde la tasa de formación de colonias se encuentra por debajo del 1% que de una bacteria Listeria genitora o de control, y en donde el metabolismo es, e.g., 10-veces a 5-veces; 5

veces a 4-veces; 4-veces a 2-veces; 2-veces a 100%; esencialmente 100%; 100% a 95%; 95% a 90%; 90% a 80%; 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30 a 20%; 20-10%; o 10-5%; que de una bacteria Listeria genitora o de control. Todavía en otro aspecto, la bacteria KBMA es una bacteria Listeria en donde la tasa de formación de colonias se encuentra por debajo del 2% que de una bacteria Listeria genitora o de control, y en donde el metabolismo es, e.g., 10-veces a 5-veces; 5-veces a 4-veces; 4-veces a 2-veces; 2-veces a 100%; esencialmente 100%; 100% a 95%; 95% a 90%; 90% a 80%; 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30 a 20%; 20-10%; o 10-5%; que de una bacteria Listeria genitora o de control. En otra modalidad, una bacteria KBMA es una bacteria Listeria en donde la tasa de formación de colonias se encuentra por debajo del 5% que de una bacteria Listeria genitora o de control, y en donde el metabolismo es, e.g., 10-veces a 5-veces; 5-veces a 4-veces; 4-veces a 2-veces; 2-veces a 100%; esencialmente 100%; 100% a 95%; 95% a 90%; 90% a 80%; 80% a 70%; 70% a 60%; 60% a 50%; 50% a 40%; 40% a 30; 30 a 20%; 20-10%; o 10-5%; que de una bacteria Listeria genitora o de control.

La tasa de metabolismo puede medirse por varios indicios, e.g., traducción, respiración, secreción, transporte, fermentación, glucolisis, metabolismo de aminoácido, o el ciclo Krebs. Se describen varios indicios de metabolismo 5 para L. monocytogenes (ver, e.g., Karlin, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6182-6187; Gilbreth, et al. (2004) Curr. Microbiol.49:95-98). Con frecuencia, el metabolismo se valora con bacterias intactas por medio de metabolitos marcados fluorescentes, de isótopo pesado o radioactivos. El experto puede elegir un gen adecuado para medir la traducción, o una enzima adecuada para medir la glucolisis, metabolismo de aminoácido, o el ciclo Krebs. Una batería que muere por calor generalmente es esencial o totalmente inactiva metabólicamente. La actividad metabólica

10 aparente residual de una bacteria esencial o totalmente inactive metabólicamente puede deberse, e.g., a oxidación de lípidos, oxidación de sulfhidrilos, reacciones catalizadas por metales pesados, o a enzimas que son estables a tratamiento con calor.

(c) Métodos para valorar la respuesta inmune; métodos de diagnóstico.

Están disponibles los reactivos y métodos útiles para determinar, valorar, monitorear, y/o diagnosticar la

15 respuesta inmune. La presente invención, en algunas situaciones, proporciona los siguientes métodos para diagnosticar a un sujeto mamífero a quien se le administran las composiciones de la presente invención. En otros aspectos, lo que se proporciona son los siguientes métodos para valorar la respuesta inmune a una o más de las composiciones administradas de la presente invención. Estos métodos, que pueden aplicarse, e.g., in vivo, in vitro, ex vivo, in utero; a animales muertos o vivos; a células; a células recombinantes, quiméricas, o híbridas; a fluidos

20 biológicos, a ácidos nucleicos aislados, y lo similar, incluyen:

i. Métodos para medir parámetros celulares. Lo que puede medirse incluye células T efectoras; células T de memoria central (TCM); células T de memoria efectora (TEM), y constituyentes de las mismas. Lo que puede medirse son funciones biológicas de estas células que incluyen función citotóxica, expresión de marcadores, afinidad para antígeno, número de células en un compartimiento biológico tal como suero, ubicación preferida en el cuerpo tal como

25 un nodo linfático o bazo, y tasa de respuesta cuando se expone a vuelve a exponer al antígeno.

ii. Métodos para medir anticuerpos. Lo que puede medirse es maduración de afinidad de anticuerpos (ver, e.g., McHeyzer-Williams y McHeyzer-Williams (2005) Ann. Rev. Immunol. 23:487-513), isotipo o concentración de anticuerpo, que incluye IgG (IgG1, IgG2; IgG3; IgG4); IgA (IgA1; IgA2); IgM; IgD; IgE; cambio de isotipo de anticuerpos, por ejemplo, disminuciones en IgM e incrementos en IgG (ver, e.g., Hasbold, et al. (2004) Nature Immunol. 5:55-63;

30 Ryffel, et al. (1997) J. Immunol. 158:2126-2133; Lund, et al. (2002) J. Immunol. 169:5236-5243; Palladino, et al. (1995)

J. Virol. 69:2075-2081; Karrer, et al. (2000) J. Immunol. 164:768-778); cambio de isotipo que es una función de la respuesta de tipo Th32 o tipo Th1 (Delale, et al. (2005) J. Immunol. 175:6723-6732; McKenzie, et al. (1999) J. Exp. Med. 189:1565-1572; Fayette, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1909-1918).

iii. Parámetros de células B. Lo que puede medirse incluye células B simples (ricas en IgD de membrana y bajas

35 en CD27), células B de memoria (bajas en IgD y ricas en CD27), y constituyentes de estas células (ver, e.g., Fecteau y Neron (2003) J. Immunol. 171:4621-4629). Lo que puede medirse es la formación de células B de memoria dentro de centros germinales (ver, e.g., Ohkubo, et al. (2005) J. Immunol. 174:7703-7710). Lo que puede medirse incluye células B terminantemente diferenciadas, por ejemplo, la habilidad de la célula para responder a CXCL12 (ver, e.g., Roy, et al.

(2002) J. Immunol. 169:1676-1682). Lo que puede medirse incluye células que secretan el anticuerpo de compromiso (ASCs) (ver, e.g., Hasbold, et al. (2004) Nature Immunol. 5:55-63).

iv.: Parámetros de células T. Lo que puede medirse es afinidad de un péptido para receptor de célula T, maduración por afinidad de un péptido para el receptor de célula T, maduración por afinidad del receptor de célula T (ver, e.g., Rees, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9781-9786; McKinney, et al. (2004) J. Immunol. 173:19411950). Lo que puede medirse es afinidad de una célula T citotóxica para una célula dirigida (ver, e.g., Montoya y Del Val (1999) J. Immunol. 163:1914-1922). Lo que puede medirse incluye marcadores, por ejemplo, las células T de memoria efectora (TEM) pueden identificarse como CD62LBAJA y CCR7BAJA, donde estas células muestran función efectora inmediata con re-encontrador de antígeno. Las células T de memoria central (TCM) pueden identificarse por expresión relativamente alta de CD62L y CCR7, donde las células muestran una cinética de activación relativamente lenta. Otros marcadores disponibles incluyen, e.g., CCL4, CCL5, XCLl, granulisina, granzima A, granzima B, y así sucesivamente (ver, e.g., Chtanova, et al. (2005) J. Immunol. 175:7837-7847; Kondrack, et al. (2003) J. Exp. Med. 198:1797-1806; Huster, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5610-5615; Ahmadzadeh, et al. (2001) J. Immunol. 166:926-935; Goldrath, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16885-16890; Wherry, et al. (2003) Nature Immunol. 4:225-234; Sallusto, et al. (2004) Ann. Rev. Immunol. 22:745-763). Diferentes tipos de células inmunes, así como diferentes etapas de maduración de una célula particular, o diferentes etapas de activación de una célula, pueden distinguirse al concentrar con un reactivo específico para cualquier marcador dado (ver, e.g., Ahmadzah, et al. (2001) J. Immunol. 166:926-935).

v.: Parámetros de células que presentan antígeno (APCs), que incluyen células dendríticas (DCs). Lo que puede medirse es mmoles de péptido presentado (o unido) por mmoles MHC Clase I. Además, lo que puede medirse es péptido en mmoles presentados o unidos por mmol de MHC Clase II. También, lo que puede medirse es la secuenciade aminoácidos de los péptidos unidos (ver, e.g., Velazquez, et al. (2001) J. Immunol. 166:5488-5494). Además, lo que puede medirse es la habilidad relativa a la APC para presentar epítopes derivados de péptidos contra epítopes derivados de proteínas, así como la habilidad para presentar epítopes adquiridos de bajos niveles de péptidos contra altos niveles de péptidos y, en otros aspectos, la identidad de la APC adecuada para presentación (ver, e.g., Constant, et al. (1995) J. Immunol. 154:4915-4923).

Un número de ejemplos específicos de métodos generalmente aplicables para valorar la expresión, secreción, presentación, inmunogenicidad, y/o eficacia terapéutica de construcción de expresión candidato y vacunas a base de Listeria candidato se ejemplifican en los Ejemplos de abajo. Ver, e.g., Ejemplo IX, abajo. Se proporcionan además ensayos para valorar inmunogenicidad de una vacuna a base de Listeria candidato particular, e.g., en Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. 2005/0249748, 2005/0281783, y 2004/0228877.

La guía está disponible para el experto para diseñar controles apropiados de diagnóstico (ver, e.g., Wilson (1991) An Introduction to Scientific Research, Dover Publications, Mineola, NY).

El alcance amplio de esta invención se entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no se proponen limitar la invención a ninguna modalidad específica.

EJEMPLOS

I. Métodos Generales.

Se describen los métodos estándar de bioquímica y biología molecular (ver, e.g., Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA; Innis, et al. (eds.) (1990) PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y. Los métodos estándar también se encuentran en Ausbel, et al. (2001) Curr. Protocols in Mol. Biol., Vols.1-4, John Wiley y Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonación en células bacteriales y mutagénesis de ADN (Vol. 1), clonación en células de mamífero y levadura (Vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteína (Vol. 3), y bioinformáticas (Vol. 4)). Se describen los métodos para producir proteínas de fusión (ver, e.g., Invitrogen (2005) Catalogue, Carlsbad, CA; Amersham Pharmacia Biotech. (2005) Catalogue, Piscataway, NJ; Liu, et al. (2001) Curr. Protein Pept. Sci. 2:107-121; Graddis, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:285-297).

Se describen PCR de extensión de superposición por unión, y otros métodos, para crear mutaciones, sitios de restricción, sitios loxP, y lo similar (ver, e.g., Horton, et al. (1990) Biotechniques 8:528-535; Horton, et al. (1989) Gene 77:61-68; Horton (1995) Mol Biotechnol. 3:93-99; Cutrone y Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140-17148; Cox, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:e108; Warrens, et al. (1997) Gene 186:29-35; Guo y Bi (2002) Methods Mol. Biol. 192: 111-119; Johnson (2000) J. Microbiol. Methods 41:201-209; Lantz, et al. (2000) Biotechnol. Annu. Rev. 5:87-130; Gustin y Burk (2000) Methods Mol. Biol. 130:85-90; QuikChange® Mutagenesis Kit, Stratagene, La Jolla, CA). Se describen las preferencias de codón de diseño de péptidos de señal, proteínas secretoras, y antígenos heterólogos, para ajustar los codones óptimos de un huésped (Sharp, et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:1281-1295; Uchijima, et al. (1998) J. Immunol. 161:5594-5599). Se describen las preferencias de codón de diseño de péptidos de señal, proteínas secretoras, y antígenos heterólogos, para ajustar los codones óptimos de un huésped (Sharp, et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:1281-1295; Uchijima, et al. (1998) J. Immunol. 161:5594-5599). Los polinucleótidos y ácidos nucleicos están disponibles, e.g., de Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA).

Están disponibles los métodos para efectuar recombinación homóloga en, e.g., bacterias, fagos, y plásmidos, (ver, e.g., Kuzminov (1999) Microb. Mol. Biol. Rev. 63:751-813; Camerini-Otero y Hsieh (1995) Annu. Rev. Genet. 29:509-552; Amundsen y Smith (2003) Cell 112:741-744; Cox (2001) Annu. Rev. Genet. 35:53-82; Quiberoni, et al. (2001) Res. Microbiol. 152:131-139; Fernandez, et al. (2000) Res. Microbiol. 151:481-486; Wedland (2003) Curr. Genet.44:115-123; Muttucumaru y Parish (2004) Curr. Issues Mol. Biol. 6:145-157; Bhattacharyya, et al. (2004) Infect. Genet. Evol.4:91-98).

Está disponible un número de listeriófagos de transducción, así como técnicas para infectar L. monocytogenes con listeriófagos. Estos listeriófagos incluyen, e.g., P35, U153, y derivados de los mismos (ver, e.g., Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186; Hodgson (2000) Mol. Microbiol. 35:312-323; Mee-Marquet, et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:3374-3377; Zink y Loessner (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:296-302; Loessner, et al. (1994) Intervirol. 37:31-35; Loessner, et al. (1994) J. Gen. Virol. 75:701-710; Loessner, et al. (2000) Mol. Microbiol. 35:324-340).

Se describen los métodos para utilizar electroporación y configuración mediada por E. coli para introducir ácidos nucleicos en Listeria. Los plásmidos adecuados para introducir un ácido nucleico en una bacteria incluyen, e.g., pPLl (no. de valoración de GenBank:AJ417488), pPL2 (Ace. No. AJ417449), pLUCH80, pLUCH88, y derivados de los mismos (ver, e.g., Lauer, et al. (2002) J. Bact. 184:4177-4186; Wilson, et al. (2001) Infect. Immunity 69:5016-5024; Chesneau, et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 177:93-100; Park y Stewart (1990) Gene 94:129-132; Luchansky, et al. (1988) Mol. Microbiol. 2:537-646; He y Luchansky (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:3480-3487).

Se describen los métodos para purificación de proteína tales como inmunoprecipitación, cromatografía en columna, electroforesis, enfoque isoeléctrico, centrifugación, y cristalización, (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Se describen los análisis químicos, modificación química, modificación post-translacional, y glucosilación de proteínas. Ver, e.g., Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Walker (ed.) (2002) Protein Protocols Handbook, Humana Press, Towota, NJ; Lundblad (1995) Techniques in Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, FL. Se describen técnicas para caracterizar las interacciones de unión (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley and Sons, Inc., New York; Parker, et al. (2000) J. Biomol. Screen. 5: 77-88; Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Methods 145:229-240; Neri, et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:1271-1275; Jonsson, et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Friguet, et al. (1985) J. Immunol. Methods 77: 305-319; Hubble (1997) Immunol. Today 18:305-306; Shen, et al. (2001) J. Biol. Chem.276:47311-47319).

Están disponibles los paquetes de software para determinar, e.g., fragmentos antigénicos, secuencias líder, doblado de proteína, dominios funcionales, sitios de glicosilación, y alineaciones de secuencia (ver, e.g., Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690). Están disponibles métodos para determinar las secuencias de codificación (CDS) (Furono, et al. (2003) Genome Res. 13:1478-1487).

Están disponibles los algoritmos de computadora (e.g., BIMAS; SYFPEITHI) para identificar péptidos que se unen a MHC Clase I y/o MHC Clase II (Thomas, et al. (2004) J. Exp. Med. 200:297-306). Estos algoritmos pueden proporcionar ácidos nucleicos de la presente invención que codifican proteínas que comprenden los péptidos identificados.

Las secuencias de proteínas listeriales y ácidos nucleicos pueden encontrarse en la red en: (1) ncbi.nlm.nih.gov; (2) genolist.Pasteur.fr (con sonido en “listilist”); y (3) tigr.org (con click en “databases,” (base de datos) después en “comprehensive microbial resource” (recurso microbiano comprensivo)).

Están disponibles métodos para valorar la internalización de una Listeria por APC, y para valorar la presentación de antígenos codificados listeriales por APC. También están disponibles los métodos para la presentación de estos antígenos a la célula T, y para valorar el cebado dependiente de antígeno de la célula T. Una APC adecuada es línea celular DC 2.4 de murino, mientras la célula T adecuada es el hibridoma de célula T B3Z (ver, e.g., Sol. De Pat. Provisional de EE.UU. No. 60/490,089 presentada el 4 de Julio de 2003; Shen, et al. (1997) J. Immunol. 158:2723-2730; Kawamura, et al (2002 J. Immunol. 168:5709-5715; Geginat, et al (2001) J. Immunol. 166:1877-1884; Skoberne, et al (2001) J. Immunol. 167:2209-2218; Wang, et al. (1998) J. Immunol. 160:1091-1097; Bullock, et al. (2000) J. Immunol. 164:2354-2361; Lippolis, et al. (2002) J. Immunol. 169:5089-5097). Están disponibles los métodos para preparar células dendríticas (DCs), modificación ex vivo de DCs, y la administración de las DCs modificadas, e.g., para el tratamiento de un cáncer, patógeno, o agente infectivo (ver, e.g., Ribas, et al. (2004) J. Immunother. 27:354-367; Gilboa y Vieweg (2004) Immunol. Rev. 199:251-263; Dees, et al. (2004) Cancer Immunol. Immunother. 53:777-785; Eriksson, et al (2004) Eur. J. Immunol. 34:1272-1281; Goldszmid, et al (2003) J. Immunol. 171:5940-5947; Coughlin y Vonderheide (2003) Cancer Biol. Ther. 2:466-470; Colino y Snapper (2003) Microbes Infect. 5:311-319).

Se describen los ensayos para tamaño de placa Listeria, LD50, y motilidad. El diámetro de placa es una función de una habilidad de la bacteria para desarrollarse, para moverse de célula a célula, y escapar de una vesícula secundaria formada en una célula adyacente (ver, e.g., Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177; Theriot, et al. (1994) Cell 76:505-517; Theriot, et al (1998) Meth. Enzymol. 298:114-122; Portnoy, et al (1988) J. Exp. Med. 167:14591471).

Están disponibles los ensayos Elispot y coloración de citosina intracelular (ICS) para caracterizar las células inmunes (ver, e.g., Lalvani, et al. (1997) J. Exp. Med. 186:859-865; Waldrop, et al (1997) J. Clin. Invest. 99:1739-1750; Hudgens, et al. (2004) J. Immunol. Methods 288:19-34; Goulder, et al. (2001) J. Virol. 75:1339-1347; Goulder, et al (2000) J. Exp. Med. 192:1819-1831; Anthony y Lehman (2003) Methods 29:260-269; Badovinac y Hatty (2000) J. Immunol. Methods 238:107-117). El método de “coloración de tetrámero” también está disponible (ver, e.g., Serbina y Pamer (2003) Curr. Opin. Immunol. 15:436-442; Skinner y Haase (2002) J. Immunol. Methods 268:29-34; Pittet, et al (2001) Int. Immunopharmacol. 1:1235-1237).

Están disponibles los métodos para determinar si un antígeno o epítope se presenta a través de presentación directa o por presentación cruzada. Estos métodos incluyen el uso de ratones deficientes en TAP con administración de células (de otra fuente) que contienen un antígeno de interés. Otro método incluye preparar un ratón genéticamente deficiente en una molécula MHC Clase I o Clase II que se requiere para presentar un epítope específico, e.g., MHC Clase I H-2b, y administrar células que presentan el antígeno que expresa H-2b (APCs) (de otra fuente) que contienen el antígeno de interés (o que se impulsarían con un epítope de interés) (ver, e.g., van Mierlo, et al. (2004) J. Immunol. 173:6753-6759; Pozzi, et al (2005) J. Immunol. 175:2071-2081).

Están disponibles métodos para determinar afinidades de unión, especificidades de unión, y maduración por afinidad. La presente descripción proporciona métodos para estimular y/o diagnosticar la maduración por afinidad, como se aplica a, e.g., maduración de anticuerpos y/o de células T (ver, e.g., Chen, et al. (2004) J. Immunol. 173:5021-5027; Rees, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9781-9786; Busch y Pamer (1999) J. Exp. Med. 189:701-709; PIoss, et al (2005) J. Immunol. 175:5998-6005; Brams, et al. (1998) J. Immunol. 160:2051-2058; Choi, et al. (2003) J. Immunol. 171:5116-5123).

Están disponibles los métodos para utilizar animales en el estudio de cáncer, metástasis, y angiogénesis, y para utilizar datos de tumor animal para extrapolar los tratamientos de humano (ver, e.g., Hirst y Balmain (2004) Eur J Cancer 40:1974-1980; Griswold, et al. (1991) Cancer Metastasis Rev. 10:255-261; Hoffman (1999) Invest. New Drugs 17:343-359; Boone, et al. (1990) Cancer Res. 50:2-9; Moulder, et al. (1988) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14:913927; Tuveson y Jacks (2002) Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 105-110; Jackson-Grusby (2002) Oncogene 21:5504-5514; Teicher, B.A. (2001) Tumor Models in Cancer Research, Humana Press, Totowa, NJ; Hasan, et al. (2004) Angiogenesis 7:1-16; Radovanovic, et al. (2004) Cancer Treat. Res. 117:97-114; Khanna y Hunter (2004) Carcinogenesis Sept.9 [epub adelantada a impresión]; Crnic y Christofori (2004) Int. J. Dev. Biol. 48:573-581).

La metástasis hepática de cáncer colorectal puede generarse utilizando inyección hepática primaria, inyección de vena portal, o inyección del bazo completo de células tumorales (ver, e.g., Suh, et al. (1999) J. Surgical Oncology 72:218-224; Dent y Finley-Jones (1985) Br. J. Cancer 51:533-541; Young, et al. (1986) J. Natl. Cancer Inst. 76:745750; Watson, et al. (1991) J. Leukoc. Biol. 49:126-138).

EJEMPLO II. Vectores para utilizar en mediar la recombinación específica del sitio y recombinación homóloga

Se describen las cepas de Listeria monocytogenes utilizadas en el presente trabajo (ver, Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:13832-13837). L. monocytogenes ActAinlB (también conocido como DP-L4029inlB) se depositó con la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de Octubre de 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-5562. L. monocytogenes ActAuvrAB (también conocido como DP-L4029uvrAB) se depositó con la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de Octubre de 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-5563. El medio de lavadura sin glucosa contuvo 25 gramos/L de extracto de levadura (extracto de levadyra Bacto®) (BD Biosciences, Sparks, MD); 9 gramos/L de fosfato de potasio monobásico, pH 7.2.

La recombinación homóloga puede mediarse por pKSV7 (SEQ ID NO:3) (ver también, Smith y Youngman (1992) Biochimie 74:705-711; Camilli, et al. (1993) Mol. Microbiol. 8:143-157; Camilli (1992) Genetic analysis of Listeria monocytogenes Determinants of Pathogenesis, Univ. of Pennsylvania, Tesis Doctoral).

(SEQ ID NO:28, pKSV7)

La integración específica de sitio puede mediarse por pPLl, pPL2, pHMT, o variantes de los mismos (ver, e.g., Lauer, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4177-4186; Sol. Int. No. PCT/US03/13492 (Sol. Int. No. WO 03/092600) de Portnoy, Calendar, y Lauer).

El plásmido pTNT tiene sitios loxP que permiten el retiro específico de la mayoría del plásmido del cromosoma listerial, dejando atrás attP y MCS (sitio de clonación múltiple), y los contenidos del sitio multi-clonación (MCS) (e.g., un casete de antígeno). pINT puede trabajar de manera diferente de pPL2 como sigue. Hasta una alícuota de 100 microlitros de una dilución 10:1 de una conjugación puede colocarse en placas de selección dobles. La colocación en las placas de hasta una alícuota de 100 microlitros de una dilución 10:1 de una conjugación pPL2 generalmente resulta en 50-100 colonias. La colocación en placa de más de 100 microlitros de una dilución 10:1 de conjugación pPL2 da poco o nada de las colonias debido a un crecimiento antecedente del donador de E. coli. pINT, por el otro lado, puede colocarse en placa sin diluir y aún concentrar la mezcla de conjugación debido a que eritromicina (Erm) es más selectiva que cloranfenicol contra E. coli. El uso de pINT amplía el rango dinámico para integración exitosa por aproximadamente 2 logs.

vector pINT

EJEMPLO III. Socios de proteína de fusión a base de ActA, que incluyen derivados de ActA que se truncan o eliminan en uno o más motivos.

La presente invención, en algunas modalidades, proporciona reactivos y métodos que comprenden un primer ácido nucleico que codifica una pareja de proteína de fusión a base de ActA operativamente avanzado a y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica al menos un antígeno heterólogo. Se proporciona un ácido nucleico que puede hibridarse bajo condiciones severas a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos.

Lo que se comprende es un primer ácido nucleico y segundo ácido nucleico que se enlazan operativamente entre sí, y en estructura entre sí. En este contexto, “operativamente enlazados entre sí” significa que cualquier construcción que comprende los ácidos nucleicos, primero y segundo, codifican una proteína de fusión. En otra modalidad, el segundo ácido nucleico puede incluirse en el primer ácido nucleico.

La pareja de proteína de fusión a base de ActA puede comprender uno o más de los siguientes. También están disponibles las modalidades “que consisten de”, y aquí la pareja de proteína de fusión a base de ActA puede consistir de una o más de las siguientes modalidades:

(1): ActA-N100 (aminoácidos 1-100 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar).

(2): ActA de longitud completa, donde un ácido nucleico que codifica al menos un antígeno heterólogo se conecta a (y en estructura con) el término C de ActA de longitud completa, que reside en una posición interna de ActA,

: o se conecta tanto al término C de ActA de longitud completa como también que reside en una posición interna de ActA.

(3): Un ActA truncado que normalmente soporta menos de 90% de la actividad de nucleación del complejo Arp2/3, como se compara con la actividad de ActA de longitud completa; convencionalmente soporta menos de 80% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; soporta de manera característica menos de 70% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; típicamente soporta menos de 60% de la actividad de

nucleación de ActA de longitud completa; más típicamente soporta menos de 50% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; a lo máximo típicamente soporta menos de 40% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; con frecuencia soporta menos de 30% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; con más frecuencia soporta menos de 20% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; a lo máximo con frecuencia soporta menos de 10% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; usualmente soporta menos de 5% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; más usualmente soporta menos de 2% de la actividad de nucleación de ActA de longitud completa; y a lo máximo usualmente no es detectable en ninguna habilidad para nuclear el complejo Arp2/3. La actividad de nucleación reducida, o eliminada de ActA progresivamente truncado se demostró por Skoble (Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537). Se demostró que ActA truncado en aminoácido 101, y ActA trucando en aminoácido 135, tienen poca o nada de actividad de nucleación, mientras ActA truncado en los aminoácidos 165, 201, y 263, son tan potentes como ActA de longitud completa en la nucleación delcomplejo Arp2/3.

(4): Un ActA truncado, en donde el ActA se trunca en aproximadamente el aminoácido 40; trunca en aproximadamente el aminoácido 45; trunca en aproximadamente el aminoácido 50; trunca en aproximadamente el aminoácido 55; trunca en aproximadamente el aminoácido 60; trunca en aproximadamente el aminoácido 65; trunca en aproximadamente el aminoácido 70; trunca en aproximadamente el aminoácido 75; trunca en aproximadamente el aminoácido 80; trunca en aproximadamente el aminoácido 85; trunca en aproximadamente el aminoácido 90; trunca en aproximadamente el aminoácido 95; trunca en aproximadamente el aminoácido 100; trunca en aproximadamente el aminoácido 105; trunca en aproximadamente el aminoácido 110; trunca en aproximadamente el aminoácido 115; trunca en aproximadamente el aminoácido 120; trunca en aproximadamente el aminoácido 125; trunca en aproximadamente el aminoácido 130; trunca en aproximadamente el aminoácido 135; trunca en aproximadamente el aminoácido 140; trunca en aproximadamente el aminoácido 145; trunca en aproximadamente el aminoácido 150; trunca en aproximadamente el aminoácido 150; trunca en aproximadamente el aminoácido 155; y trunca en aproximadamente el aminoácido160. El término “aproximadamente” en este contexto significa más o menos un aminoácido, más o menos dos aminoácidos, más o menos tres aminoácidos, más o menos cuatro aminoácidos, o más

: o menos cinco aminoácidos.

(5): secuencia secretora ActA (aminoácidos 1-29 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar).

(6): No comprende una secuencia secretora ActA (aminoácidos 1-29 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar).

(7): secuencia secretora ActA y el dominio N-terminal maduro (aminoácidos 1-263 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar).

(5): Dominio N-terminal maduro sin la secuencia secretora (aminoácidos 30-263 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar).

(9): Secuencia ActA con habilidad reducida para estimular directamente la polimerización de actina. La habilidad reducida puede estar, e.g., normalmente a lo mucho 90% máximo, más normalmente a lo mucho 80% máximo, a lo máximo normalmente a lo mucho 70% máximo, usualmente a lo mucho 60% máximo, más usualmente a lo mucho 50% máximo, a lo máximo usualmente a lo mucho 40% máximo, con frecuencia a lo mucho 30% máximo, con más frecuencia a lo mucho 20% máximo, a lo máximo con frecuencia a lo mucho 10% máximo, y típicamente a lo mucho 5% máximo.

(10): Secuencia ActA con una habilidad reducida para unirse a un miembro de la familia Ena/VASP de proteínas (mamífero Permitido (Mena); proteína similar a Ena/VASP (EvI); fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP) (ver, e.g., Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103). La habilidad reducida puede ser, e.g., normalmente a lo mucho 90% máximo, más normalmente a lo mucho 80% máximo, a lo máximo normalmente a lo mucho 70% máximo, usualmente a lo mucho 60% máximo, más usualmente a lo mucho 50% máximo, a lo máximo usualmente a lo mucho 40% máximo, con frecuencia a lo mucho 30% máximo, con más frecuencia a lo mucho 20% máximo, con frecuencia a lo mucho 10% máximo, y típicamente a lo mucho 5% máximo.

(11): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en aminoácidos 93-98 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (LKEKAE (SEQ ID NO: 124)) (homóloga a dominio de unión a actina de caldesmon (ver, e.g., Pistor, et al. (2000) J. Cell Science 113:3277-3287; Lasa, et al. (1997) EMBO J. 16:1531-1540).

(12) ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 126-155 (PAlQ, etc.) del No.

de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar, que son críticos para formación de dímero ActA (ver, e.g., Mourrain, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10034-10039).

(13): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 121-170 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (dominio de activación ARP2/3 mínimo) (ver, e.g., Zalevsky, et al. (2001) J. Biol. Chem.276:3468-3475).

(14): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 146-150 KKRRK (SEQ ID NO:30)) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (una región esencial para reclutar el complejo Arp2/3) (Lasa, et al. (1997) EMBO J. 16:1531-1540; Pistor, et al. (2000) J. Cell Science 113:3277-3287).

(15): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 41-46 DEWEEE (SEQ ID NO:31) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (una región incluida en la unión del complejo Arp2/3) (ver, e.g., Boujemaa-Paterski, et al. (2001) Biochemisty 40: 11390-11404).

(16): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 481-492 (DRLADLRDRGTG (SEQ ID NO:32)), que es una región de homología de vinculina. La vinculina media la extensión de célula a célula de S.flexneri (ver, e.g., Kocks, et al. (1992) Cell 68:521-531).

(17): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, el dominio de homología de cofilina (IKKKRRKAIASSD (SEQ ID NO:33)) (aminoácidos 145-156 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar) (ver, e.g., Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537).

(18): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 50-125 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (continuidad de región de elongación de filamento) (ver, e.g., Lasa, et al. (1997) EMBO J. 16:1531-1540).

(19): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, el primer motivo FP4 (aminoácidos 265269, o 264-269, y lo similar), segundo motivo FP4 (aminoácidos 300-304, o 299-304, y lo similar), tercer motivo FP4 (aminoácidos 335-339, o 334-339, y lo similar), cuarto motivo FP4 (aminoácidos 380-384, o 379-384, y lo similar), todos los cuatro motivos FP4, o cualquier combinación de lo anterior, donde los aminoácidos se refieren al No. de Acceso de GenBank X59723, o una secuencia ActA homóloga o similar (ver, e.g., Machner, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:40096-40103). Los motivos FP4 mejoran la polimerización de actina y movilidad bacterial al reclutar las proteínas de contacto focal (e.g., VASP y Mena) y profilina, que promueven la elongación de los filamentos nucleados porinteracciones entre motivos en la región N-terminal del complejo ActA y Arp2/3 (ver, e.g., Welch, et al. (1998) Science 281:105-108; Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537); Pistor, et al. (2000) J. Cell Science 113:3277-3287).

(20): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 136-165 del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (región de homología de cofilina, una región que estimula el complejo Arp2/3) (ver, e.g., Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177).

(21): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, el “estiramiento ácido,” es decir, aminoácidos 31-58 (TDSED (SEQ ID NO:34), etc.) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar. El estiramiento ácido contribuye a la polimerización de actina, movimiento de Listeria en el citoplasma de célula huésped, extensión de célula a célula, y a tamaño de placa (ver, e.g., Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537; Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177).

(22): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 60-101 (región AB, un dominio de unión a actina) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (ver, e.g., Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1 177).

(23): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o que contiene la mutación de mutante 34 (sinmovimiento; sin placa) aminoácidos 117-121 (KKRRK (SEQ ID NO:30)) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177.

(24): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o que contiene la mutación de mutante 34 (sin movimiento; sin placa) aminoácidos 244-249 (DKSAGLID (SEQ ID NO: 123)) del No. de Acceso de GenBank X59723,

: o de una secuencia ActA homóloga o similar. La mutación puede ser, e.g., reemplazo de D, K, y D por alaninas (Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177).

(25): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o que contiene la mutación de mutantes 39, 47-52, 54 y/o 48 (movimiento reducido) (Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177).

(26): ActA que se trunca en el punto de, elimina en, o muta en, aminoácidos 264-390 (región de repetición central) del No. de Acceso de GenBank X59723, o de una secuencia ActA homóloga o similar (ver, e.g., Lauer, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:1163-1177; Skoble, et al. (2000) J. Cell Biol. 150:527-537; Skoble, et al. (2001) J. Cell Biol. 155:89-100).

5 La presente descripción proporciona una pareja de proteína de fusión a base de ActA que puede comprender cualquiera, o cualquier combinación de, las modalidades descritas arriba. Modalidades “que consisten de” también están disponibles, y aquí la pareja de proteína de fusión a base de ActA puede consistir de una o más de las modalidads descritas arriba.

Cuando se proporciona con la presente descripción, el experto puede contemplar y preparar modalidades que 10 contienen modificaciones conservadoras, o modificaciones donde se eliminan uno o más aminoácidos, o donde uno o más aminoácidos se reemplazan con alanina, y lo similar.

En el presente contexto, “pareja de proteína de fusión” comprende, pero no se limita a, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, o el polipéptido por sí mismo, que ocurre como una proteína de fusión con un antígeno heterólogo, donde la pareja de proteína de fusión mejora, e.g., la transcripción, traducción, estabilidad, procesamiento

15 por una célula que presenta antígeno (APC), presentación por una APC, presentación inmune, respuesta de célula T citotóxica, respuesta de célula T CD8+, respuesta de célula T CD4+, reducción en tamaño de tumor, número, o metástasis, incremento en supervivencia a un tumor o agente infeccioso, y lo similar.

La presente descripción proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos de ActA-N100, y proteínas de fusión de los mismos, incluyendo proteínas de fusión que comprenden al menos un antígeno. Sin implicar ninguna alimentación 20 en la invención, el al menos un antígeno puede comprender mesotelina, H-ras, un derivado de mesotelina, un derivado de H-ras, o cualquier combinación de los mismos. El ácido nucleico que codifica al menos un antígeno puede avanzarse operativamente a, y en estructura con, el término N de una pareja de proteína de fusión a base de ActA. Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el al menos un antígeno puede avanzarse operativamente a, y en estructura con, el término C de la pareja de proteína de fusión ActA. O el ácido nucleico que codifica el al menos un

25 antígeno puede enlazarse operativamente con, y reside dentro de un ácido nucleico que codifica una pareja de proteína de fusión a base de ActA.

EJEMPLO IV. Bloques de formación utilizados para ensamblar ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión ActA

Lo siguiente describe ácidos nucleicos y polipéptidos utilizados para hacer construcciones que contienen 30 ActA-N100 como una pareja de proteína de fusión. Se identifican el codón de secuencias optimizadas para expresión en L. monocytogenes, y secuencias optimizadas sin codón.

Ácido nucleico que codifica secuencia nativa ActA-N100 (codón no optimizado), incluyendo la secuencia Shine-Dalgarno (SEQ ID NO:122)

Promotor ActA L. monocytogenes 10403S. (SEQ ID NO:35)

Promotor actA nativo junto con el 5’ UTR (incluyendo la secuencia Shine Dalgarno), y sitio de translación GUG SEQ ID NO:157) Lo subrayado y en minúscula es un sitio Kpn1 agregado para clonación. El recuadro PrfA se encuentra en cursiva y en negritas 1+ para la transcripción se muestra como “T” La secuencia de Shine-Dalgarno cerca del extremo se subraya.

La minúscula “gtg” en extremo es el sitio de inicio para ActA en Listeria

Secuencia nativa ActA-N100 (codón no optimizado), incluyendo secuencia de Shine-Dalgarno con mesotelina humana (codónoptimizado) con SS suprimido yGPI suprimido. Los sitios BamHI (GGATCC) y SacI (GAGCTC) se muestran en NEGRITAS. (SEQ ID NO:36)

Ácido nucleico que codifica L. monocytogenes de ActA de longitud

completa 10403S. (SEQ ID NO:37)

Polipéptido ActA de L. monocytogenes 10403S. (SEQ ID NO:38) (secuencia de aminoácidos pronostica si no está en terminal N cuando se expresa en Listeria).

Polipéptido ActA de L. monocytogenes 10403S. (SEQ ID NO:152)

(Secuencia de aminoácidos actual cuando se expresa en Listeria. A pesar de que la secuencia codificadora contiene un codón de valina en la terminal N, la Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que inicia con metionina, no valina).

Ácido nucleico que codifica fragmento ActA-N100 utilizado en nuestras construcciones, incluyendo los sitios de enzima de restricción y promotor (sitio KpnI y sitio BamHI subrayados, secuencia promotor en minúsculas, secuencia N100 ORF en MAYÚSCULAS). (SEQ ID NO:39)

Secuencia de aminoácidos de ActA-N100. (SEQ ID NO:40) (secuencia de aminoácidos pronosticada si no está en la terminal N cuando se expresa en Listeria)

Secuencia de aminoácidos de ActA-N100. (SEQ ID NO:153) (secuencia de aminoácidos cuando se expresa en Listeria. El ácido nucleico que codifica ActA-N100 contiene un codón de valina en la terminal N, pero la Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que comienza con metionina, no valina).

Secuencia de aminoácidos de proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (ss suprimido; GPI suprimido). El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS). (SEQ ID NO:41)

Secuencia de aminoácidos de proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (ss suprimido; GPI suprimido). (SEQ ID NO:154: (Secuencia de aminoácidos actual cuando se expresa en Listeria. El ácido nucleico que codifica ActA-N100, o una proteína de fusión del mismo, contiene un codón válido en la terminal N, pero la Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que comienza con metionina, no valina). El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS).

Secuencia de ácido nucleico de 12ras. (SEQ ID NO:42)

Secuencia de aminoácidos de 12ras (SEQ ID NO:43)

Ácido nucleico de proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana optimizada por codón (SS suprimida; GPI suprimida) y 12ras. se fusiona al extremo 3’ de mesotelina (suprimida en SS; suprimida en GPI). La construcción de fusión mesotelina-ras se optimiza por codón y se clona (como un fragmento Bam-HI-SacI) corriente abajo de la pareja de proteína de fusión ActA-N100. Los nucleótidos EN NEGRITAS indican los sitios de restricción. BamHI es GGATCC. SacI es GAGCTG. (SEQ ID NO:44)

Proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (SS suprimida; GPI suprimida) y 12ras. El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS). (SEQ ID NO:45)

Proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (SS suprimida; GPI suprimida) y 12ras. (SEQ ID NO:155) (Secuencia de aminoácidos actual cuando se expresa en Listeria. El ácido nucleico que codifica ActA-N100, o una proteína de fusión del mismo, contiene un codón de valina en la terminal N, pero la Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que comienza con la metionina, no valina). El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS).

Promotor ActA y secuencia codificadora ActA-N100:N100 es nativa. Los antígenos de tumor se insertan en el sitio BamHI (GGATCC). (SEQ ID NO:46)

Secuencia de aminoácidos de ActAN100:el sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS). (SEQ ID NO:47) (Secuencia de aminoácidos pronosticada si no está en la terminal N cuando se expresa en Listeria).

La secuencia de aminoácidos de ActAN100:el sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS). (SEQ ID NO:156) (Secuencia de aminoácidos actual cuando se expresa en Listeria, ya que la Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que inicia con metionina, no valina.)

Secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (codón optimizado, SS suprimido). El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS). (SEQ ID NO:158)

Secuencia de aminoácidos de proteína de fusión de ActA-N100 con mesotelina humana (codón optimizado, SS suprimida). El sitio BamHI agrega dos aminoácidos (GS): (SEQ ID NO:159) (Secuencia de aminoácidos actual cuando se expresa en Listeria, ya que Listeria actualmente biosintetiza un polipéptido que inicia con metionina, no valina.)

EJEMPLO V. Bloques de construcción utilizados para ensamblar las proteínas de fusión de listeriolisina (LLO; gen hly).

Ácido nucleico de Estructura de Lectura abierta LLO (ORF) de Listeria tipo silvestre 10403S. (SEQ ID NO:48)

Codón optimizado LLO (GGATCC es un sitio BamHI agregado en el extremo 3’ para fusiones en estructura). (SEQ ID NO:49)

Una variación de mutante en codón optimizado LLO (a medida que una fusión translacional – GGATCC es un sitio BamHI agregado en el extremo 3’ para fusiones en estructura; variación de mutante es en CAPS, cambia TGGTGG a TTTTTT, aminoácido cambia WW a FF). (SEQ ID NO:50)

Ácido nucleico de LLO59 (codón no optimizado). (SEQ ID NO:51)

Ácido nucleico de LLO59, codón optimizado para la expresión en Listeria. (SEQ ID NO:52)

Aminoácidos de LLO59. (SEQ ID NO:53)

Ácido nucleico de LLO59, codón optimizado para la expresión en Listeria, mesotelina humana con codón optimizado (SS suprimido; GPI suprimido), clonado en estructura con LLO como un fragmento BamHI/SacI. Los sitios de BamHI (GGATCC) y SacI (GAGCTC) se indican en NEGRITAS. Esta construcción puede denominarse: fusión LLOopt59hMesotelina (SS suprimido; gpi suprimido). (SEQ ID NO:54)

Aminoácidos de proteína e fusión de LLO59, codón optimizado, con mesotelina humana con codón optimizado (SS suprimido; GPI suprimido). (SEQ ID NO:55)

Ácido nucleico de proteína de fusión de LLO59 (codón no optimizado) con mesotelina humana (codón optimizado) con SS suprimido y GPI suprimido, como fragmento BamHI-SacI. El sitio BamHI(GGATCC) y el sitio SacI (GAGCTC) se muestran en NEGRITAS. Esta secuencia puede llamarse: fusión LLOnat59 hMesotelina (SSsuprimido; gpi suprimido). “nat” significa natural, codón no optimizado. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, el aminoácido codificado por esta secuencia es la misma que aquella codificada por la secuencia correspondiente en donde mesotelina es codón optimizado (SEQ ID NO:56)

Promotor hly (SEQ ID NO:57)

Ácido nucleico para péptido de señal de BaPA optimizado por codón (SEQ ID NO:58)

Aminoácidos de péptido de señal de BaPa (SEQ ID NO:59)

El promotor hly y el péptido de señal BaPa se fusionan juntas de manera constante. El promotor hly y el péptido de señal BaPA se fusionan juntas (sin sitios de restricción) y el ensamble de péptido de señal de promotor se inserta en plásmidos como un fragmento KpnI(GGTACC)-BamHI (GGATCC). El antígeno de tumor se inserta en el sitio BamHI (SEQ ID NO:60)

EJEMPLO VI. Bloques de construcción utilizados para ensamblar proteínas de fusión p60 y proteínas de fusión de otros polipéptidos que median la secreción dependiente de SecA2.

La presente descripción proporciona un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica

5 una proteína secretada por una trayectoria dependiente de SecA2 y un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. Las autolisinas, tales como p60 y NamA (N-acetil-muramidasa), son proteínas secretadas de Listeria por la trayectoria dependiente de SecA2 (Lenz, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12432-12437). En una modalidad, la pareja de proteína de fusión (e.g., p60 o NamA) retiene su actividad enzimática o estructural. En otra modalidad, la pareja de proteína de fusión carece de su actividad estructural o enzimática. Todavía otra

10 modalidad coloca o inserta un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga entre la secuencia de señal (SS) y ácidos nucleicos que codifican los dominios de enlace por pared celular (LysSM) y dominios catalíticos Lyz-2 (NamA) y p60-dom (p60).

Lo siguiente describe, como un ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión que comprenden p60 y mesotelina humana (hMeso). La mesotelina se insertó la proteína p60 de Listeria como

15 sigue. Un ácido nucleico que codifica la mesotelina se insertó en un ácido nucleico que codifica p60, de modo que cuando se expresa, la mesoteína se insertaría en p60 en aminoácido 70. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión resultante se preparó para uso en expresión por una bacteria Listeria.

En otra modalidad, la quimera de proteína contuvo codones óptimos para la expresión en Listeria en los aminoácidos 1-70 p60 así como en la secuencia codificadora de mesotelina completa. Todavía en otra modalidad, la 20 quimera de proteína de mesotelina humana p60 se enlaza funcionalmente al promotor hly L. monocytogenes, en el

vector pPL2, el cual se utilizó subsecuentemente para generar las cepas L. monocytogenes recombinantes que expresan y secretan la mesotelina humana.

La secuencia de los primeros 70 aminoácidos de p60 de L. monocytogenes, la cepa 10403S se describe.

La secuencia de ADN sintetizado correspondiente a los 70 aminoácidos p60 de terminal N promotor hly, se muestra abajo. Los codones que codifican los residuos de aminoácido 69 p60 (L) y 70 (Q), se modificaron para contener una secuencia de reconocimiento de enzima PstI única, para facilitar la inserción funcional de una secuencia heteróloga (e.g., un ácido nucleico que codifica mesotelina). Además, el extremo 5’ del sub-fragmento sintetizado contiene una secuencia de reconocimiento de enzima KpnI única.

En este punto en el comentario sobre la síntesis de vector, la secuencia de ácido nucleico corresponde a lo siguiente:

promotor hly-p60 (70 aminoácidos de terminal N de p60).

El sitio PstI único (CTGCAG) es visible en el extremo 3’.

El sub-fragmento digerido KpnI y PstI 447 bp se liga en los sitios de KpnI y PstI correspondientes del vector pPL2, tratado por digestión con las enzimas KpnI y PstI y digestión con fosfatasa alcalina intestinal de becerro (CIAP). Este plásmido se conoce como pPL2-hlyP-Np60 CodOp. En consecuencia, el resto del gen p60 nativo se clonó en elplásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp, entre los sitios PstI y BamHI únicos. El resto del gen p60 se clonó por PCR, utilizando una lectura de prueba que contiene polimerasa termoestable, y el siguiente par de cebador:

Cebador delantero:

5’-CGC CTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTG (SEQ ID NO:63)

Cebador inverso:

5’-CGCGGATCCTTAATTATACGCGACCGAAG (SEQ ID NO:64)

El amplicon 1241 bp se digiere con PstI y BamHI, y 1235 bp purificado se liga en el plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp, digerido con PstI y BamHI, y se trató con CIAP. El plásmido resultante contiene el gen p60 completo con codones óptimos correspondientes a aminoácidos 1-77, y codones nativos correspondientes a aminoácidos 78478. El gen p60 completo se enlaza funcional al promotor hly L. monocytogenes.

promotor hly p60-[70 aminoácidos de terminal N 1-77 de p60 (codón optimizado)-[PstI]-[aminoácidos 78-478 de terminal C de p60 (no codón optimizado)].

En este punto, la construcción todavía no ha recibido un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En comentario a seguir, el sitio PstI único recibirá un ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo (mesotelina). Este plásmido, que contiene p60 de longitud completa, pero con el codón de región de terminal N optimizado, y el no codón de región de terminal C optimizado, se conoce como: pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77). La secuencia del subfragmento KpnI-BamHI que contiene el hlyP enlazado funcionalmente a la secuencia codificadora p60 se muestra abajo (SEQ ID NO:65). La secuencia esperada del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) se confirmó por la secuenciación.

La siguiente etapa en la construcción es la inserción funcional de una secuencia codificadora de proteína heteróloga en el sitio PstI único de plásmido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77).

Un ácido nucleico que codifica mesotelina humana que se optimizó por codón para expresión óptima en L. monocytogenes se insertó en el sitio PstI único de plásmido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77). Específicamente, la mesotelina de longitud completa, o mesotelina que se suprimió del péptido de señal y dominios de enlazador GPI (mesotelina SP/GPI) se clonó de un plásmido que contiene la mesotelina humana de longitud completa, que contiene codones óptimos para la expresión en L. monocytogenes, utilizando una polimerasa termoestable con actividad de lectura por prueba, y el par de cebador abajo mostrado. La presente invención se proporciona para otros ácidos nucleicos que codifican antígenos diferentes a mesotelina o además de mesotelina, para uso en el protocolo actual. Además, la presente invención se proporciona para la optimización por codón de ácidos nucleicos que codifican un antígeno, optimización por codón de ácidos nucleicos que codifican una pareja de proteína de fusión, y/u optimización por codón de ácidos nucleicos que codifican una pareja de proteína de fusión.

El experto en la materia entenderá que las expresiones que citan “un antígeno se insertó en un polipéptido”,

o expresiones para ese efecto, pueden comprender “un primer ácido nucleico que codifica un antígeno se insertó en un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido”, y lo similar.

Los cebadores PCR utilizados para amplificar la mesotelina humana de longitud completa:

Cebador Delantero (huMeso 3F):

5’-AAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCC (SEQ ID NO:66)

Cebador Inverso (hMeso 1935R):

5’-AAACTGCAGAGCTAATGTACTGGCTAATAATAATGCTAAC (SEQ ID NO:67)

Los cebadores PCR utilizados para amplificar la mesotelina humana (SSGPI de anclaje).

Cebador Delantero (huMeso 133F):

5’-CGCCTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGG (SEQ ID NO:68)

Cebador Inverso (huMeso 1770R):

5’-CGCCTGCAGGCCTTGTAAACCTAAACCTAATGTATC (SEQ ID NO:69)

En vista de las siguientes modalidades de mesotelina, el experto en la materia reconocerá que los ácidos nucleicos descritos y los polipéptidos de mesotelina pueden insertarse o utilizarse en una variedad de construcciones de polipéptido que incluyen las proteínas de fusión, ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión y lo similar, construcciones multicistrónicas, plásmidos, vectores, proteínas de fusión, vacunas bacterianas, y lo similar.

Ácido nucleico del péptido de señal de mesotelina humana (SEQ ID NO:70)

Ácido nucleico de GPI de anclaje de mesotelina humana. (SEQ ID NO:71)

Casete de ácido nucleico de mesotelina humana, codón optimizado para expresión en Listeria, con sitios de clonación 5'-BamH’ (GGATCC) y 3’-SacI (GAGCTC). Como esta es mesotelina de longitud completa, contiene el dominio de gpi de anclaje de terminal C (SEQ ID NO:72)

Aminoácidos de mesotelina humana de longitud completa (SEQ ID NO:73) (Si la secuencia se fusiona en la terminal N a una secuencia heteróloga, la metionina inicial se suprime opcionalmente (por supresión del codón correspondiente).)

Ácido nucleico de mesotelina humana (codón optimizado), SS suprimido, GPI suprimido de anclaje. Este es un casete quecodifica la mesotelina humana, en donde el casete contiene los sitios de restricción 5’-BamHI y 3’-SacI. (SEQ ID NO:74)

Aminoácido humana, SS suprimido de NO:75): de mesotelina suprimido, GPI anclaje. (SEQ ID

Los amplicones PCR de 1932 bps (mesotelina de longitud completa) y 1637 bps (mesotelina SP/GPI) se purificaron, digirieron con PstI, se purificaron y se ligaron en el sitio PstI único de plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (177), se trató por digestión con PstI, y digestión con CIAP. La orientación consistente de terminal amino a terminal

5 carboxi del p60 y dominios de Mesotelina se confirmó por mapeo de endonucleasa de restricción. Estos plásmidos se conocen como mesotelina de pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) y SP/GPI de mesotelina de pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77), y se introdujeron en cepas de L. monocytogenes seleccionadas.

La secuencia del sub-fragmento KpnI-BamHI de plásmido mesotelina pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) que contiene el promotor hly enlazado funcionalmente al gen que codifica la quimera de proteína de mesotelina humana 10 p60 tiene la secuencia mostrada abajo.

La secuencia del sub-fragmento KpnI-BamHI de plásmido SS/GPI de mesotelina pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) que contiene el promotor hly enlazado funcionalmente al gen que codifica la quimera de proteína SS/GPI de mesotelina humana p60, tiene la secuencia mostrada abajo.

EJEMPLO VII. Proteínas de fusión basadas en ActA-N100; proteínas de fusión basadas en LLO (síntesis; 25 vacunación; inmunogenicidad).

La Tabla 11 describe algunas de las cepas bacterianas que se prepararon. Las bacterias se utilizaron para vacunación en ratones que llevan el tumor. En donde se indica, la vacunación dio como resultado respuestas inmunes anti-tumorales, la reducción en el número y tamaño de tumor, y supervivencia incrementada.

Tabla 11. Bacteria L. monocytogenes recombinante de la presente invención. “Delta” significa suprimido. La mutación E30R y la mutación E30M, en donde se indican, se originan en en la secuencia secretora (BaPA) de Antígeno Protector Bacillus. La mutación S28D y la mutación S28R, en donde se indican, se originan en p60.

Cepa (nombre sencillo): Construcción Antecedente genético Sitio de integra-ción Promotor Secuencia secretora (SS)

-: Longitud completa (FL) hMesotelina ActA inB tARN Arg Hly BaPA

hMeso1: hMeso [deltaSS ActA inB tARN Arg Hly BaPA

delta GPI]

hMeso2: HMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB prfA* tARN Arg ActA BaPA

hMeso3: hMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB ActA ActA BaPA

hMeso4: HMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB inlB Hly BaPA

hMeso5: p60-hMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB tARN Arg Hly p60

hMeso6: ActA-N100 hMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB ActA act ActA

hMeso8: hMeso [deltaSS delta GPI]rasG12D ActA inB tARN Arg hly BaPA

hMeso10: ActA-N100 hMeso [deltaSS delta GPI]-rasG12D ActA inB ActA ActA ActA

hMeso11: hMeso [deltaSS delta GPI]rasG12D ActA inB inlB Hly BaPA

hMeso12: hMeso [deltaSS delta GPI]rasG12D ActA inB tARN Arg Hly BaPA (E30R)

hMeso13: hMeso [deltaSS delta GPI]rasG12D ActA inB tARN Arg hly BaPA (E30M)

hMeso14: LLO62-hMeso [deltaSS delta GPI]-rasG12D ActA inB tARN Arg hly LLO(62)

hMeso15: LLO62hMeso[deltaSS delta GPI]rasG12D ActA inB tARN Arg Hly LLO(opt62)

hMeso18: A30R ActA-N100hMeso [deltaSS delta GPI]-12ras (el ras tiene una mutación G12D ActA inB ActA ActA ActA (A30R)

hMeso19: S28D p60hMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB tARN Arg hly p60

hMeso20: S28R deltap60hMeso [deltaSS delta GPI] ActA inB tARN Arg hly p60

hMeso22: LLO44I-hMeso [deltaSS delta GPI]-rasG12D ActA inB tARN Arg hly LLO

hMeso26: Act-A-N100 hMeso [delta SS delta GPI] ActA inB inlB ActA ActA

hMeso31: ActA-N100 (A30R en ActA-N100)hMeso [delta SS delta GPI] ActA inB ActA e inlB ActA y ActA ActA y ActA

hMeso32: ActA-N100 hMeso [delta SS delta GPI] diploide ActA inB inlB y tARNArg ActA y ActA ActA y ActA

hMeso33: ActA-N100 deltaSS (que contiene GPI) ActA inB tARNArg integra-do con pINT ActA ActA

hMeso37: ActA-N100 deltaSS (que contiene GPI) ActA inB tARNArg integrado con pINT ActA ActA

hMeso37 difiere de hMeso33 en que hMeso37 se trató con un plásmido que codifica la recombinasa Cre para efectuar la remoción de ADN flanqueado por loxP. La recombinasa Cre se proporcionó por medio del plásmido pCON2. pCON2 es sensible a la temperatura. La temperatura de cambio da como resultado la remoción de ADN flanqueado por loxP y da como resultado la pérdida de pCON2 de la célula. pCON se describe (véase, e.g., Behari, et al. (1998) J. Bacteriol. 180:6316-6324; Milenbachs, et al. (2004) Microbiology 150:321-333).

hMeso38: ActA-N100-hmeso [deltaSS] (no suprimido en GPI). (hmeso33alelo) ActA inB inlB ActA ActA

hMeso40 (véase Tabla 12): hMeso26 con su integración adicional: pINT-ActA-N100db12ras3 ActA inB inlB y tARNArg ActA y ActA ActA y ActA

hMeso41 (véase Tabla 12): hMeso26 con su integración adicional: pINT-ActA-N100db12ras4 ActA inB inlB y tARNArg ActA y ActA ActA y ActA

hMeso42 (véase Tabla 12): hMeso26 con su integración adicional: pINT-ActA-N100db12ras5 ActA inB inlB y tARNArg ActA y ActA ActA y ActA

hMeso43 (véase Tabla 12): hMeso26 con su integración adicional: pINT-ActA-N100db12ras6 ActA inB inlB y tARNArg ActA y ActA ActA y ActA

En donde un polinucleótido se integra en el sitio ActA, el gen ActA se suprime durante la recombinación homóloga, al menos que se especifique de otra forma. En donde se integra un polinucleótido en el sitio ActA, y en donde la construcción comprende una proteína de fusión que incluye ActA-N100, y en donde la secuencia secretora se enlista como la secuencia secretora ActA, la secuencia secretora ActA viene de la pareja de proteína de fusión ActA-N100 (no del gen ActA genómico, por la razón de que el gen ActA genómico se suprimió durante la recombinación homóloga), como en hMeso6, hMeso10 y hMeso18.

Tabla 12. Secuencias en casetes de expresión de hMeso40, hMeso41, hMeso42, y hMeso43. “ActA-N100” indica que la secuencia de ActA-N100 precede inmediatamente los aminoácidos indicados que siguen.

Secuencia Db112ras3 de hMeso40

Secuencia Db112ras3 de hMeso41

Secuencia Db112ras5 de hMeso42

Secuencia Db112ras6 de hMeso43

Identificación de detalles dentro de las secuencias anteriores

rasG12D (a.k.a. 12rasD)

rasG12V (a.k.a. 12rasV)

Secuencia secretora Meso (MesoSS)

Epítope MesoA2 que ocurre dentro de MesoSS

Separador

Las siguientes construcciones ActA inlB de Listeria, adecuadas como construcciones de control, se encontró que no expresaron de manera detectable: (1) hMeso deltas deltaGPI ras (la ras tuvo una mutación G12D). Esta construcción tuvo un promotor ActA, secuencia de señal BaPA, con un sitio ActA de integración; (2) A30R ActA

5 N100 hMesoSSGPI ras (la ras tuvo una mutación G12D). Esta construcción en particular tuvo un promotor ActA, secuencia de señal BaPA, con un sitio ActA de integración.

Los promotores de la presente invención pueden incluir uno o más de los siguientes unidos operativamente con un ácido nucleico que codifica un antígeno: hly, ActA, p60, pHyper, y así sucesivamente. pHyper se describe (véase, e.g., Solicitud de Patente de Estados Unidos 2005/0147621 de Higgins, et al.). La presente invención

10 proporciona secuencias de señal, tales como una o más de la secuencia de señal de LLO, ActA, BaPA, BsPhoD, p60, y así sucesivamente. Las socios de proteína de fusión de la presente descripción puede incluir una o más de LLO1-62, LLO1-441, ActA-N100, p60, PFO1-390, BaPA1-82, y lo similar.

Las construcciones que contienen una pareja de proteína de fusión basada en ActA o una pareja de proteína de fusión basada en LLO se sintetizaron como sigue. Cuando se completa la síntesis, la construcción se integró en el15 genoma de L. monocytogenes. Mientras que la integración se medió por vectores tales como pKSV7, pPL2, y pINT,

la presente descripción no se limita a ningún vector de integración particular o mecanismo de integración. Varios polinucleótidos se ensamblaron en una forma modular, es decir, al ligar los ácidos nucleicos prefabricados juntos en el andamio pKSV7. Estos ácidos nucleicos prefabricados son como sigue:

La construcción promotor ActA/ActA-N100/SSGPI de Mesotelina humana, se ensambló utilizando los

5 siguientes componentes: Un primer polinucleótido que consiste de un primer ácido nucleico que codifica la secuencia de promotor ActA listerial nativo (incluyendo el sitio Shine Dalgarno) conectada directamente a un segundo ácido nucleico que codifica ActA-N100 (el primer polinucleótido tuvo un sitio 5’-HindIII y un sitio 3’-BamHI). Un segundo polinucleótido consistió de SSGPI de Mesotelina humana (sitio 5’-BamHI y sitio 3’-SacI). El pKSV7 recibió un inserto que consiste del primer polinucleótido conectado directamente al segundo polinucleótido. En una variación de

10 esta construcción, el segundo polinucleótido consistió de un primer ácido nucleico que codifica SSGPI de Mesotelina humana conectada directamente a un segundo ácido nucleico que codifica 12 ras (sitio 5’-BamHI y sitio 3’-SacI). La mesotelina humana se pretende como un ejemplo no limitante.

La construcción promotor hly/LLO62/SSGPI de Mesotelina humana/12ras se ensambló utilizando los siguientes componentes. LLO62 significa un ácido nucleico que codifica aminoácidos 1-62 de listeriolisina (LLO). Se 15 preparó un primer polinucleótido que consistió de un primer ácido nucleico que codifica la secuencia de promotor hly listerial nativo (incluyendo el sitio Shine Dalgarno) conectada directamente a un segundo ácido nucleico que codifica LLO62 (el primer polinucleótido tuvo un sitio 5’-KpnI y un sitio 3’-BamHI). Se preparó un segundo polinucleótido que consistió de un primer ácido nucleico que codifica SSGPI de Mesotelina humana conectada directamente a un segundo ácido nucleico que codifica 12ras (el segundo polinucleótido tuvo un sitio 5’-BamHI y un sitio 3’-SacI). El

20 pKSV7 recibió un inserto que consiste del primer polinucleótido conectado directamente a un segundo polinucleótido. Una variación de esta construcción utilizó LLO60 (codón optimizado) en lugar de LLO62.

La Figura 7 describe un número de modalidades de la presente invención, incluyendo las proteínas de fusión basadas en LLO y proteínas de fusión basadas en actA-N100.

La Figura 8 describe la expresión de varias construcciones de los cultivos celulares de Listeria diseñada. En

25 este contexto, la expresión significa la secreción y biosíntesis de proteína en el medio, en donde la construcción indicada se había integrado en el genoma listerial. La expresión se condujo en un medio que contiene extracto de levadura sin glucosa a una densidad bacteriana correspondiente a OD600=0.8. El término pPL2 indica que la construcción se insertó a manera de recombinación específica de sitio que utiliza el vector pPL2, pKSV7 significa que la construcción se insertó por recombinación homóloga que utiliza el vector pKSV7 (véase Tabla 13).

30 El anticuerpo para detectar la expresión de mesotelina fue un anticuerpo policlonal de conejo, producido al inmunizar el conejo con tres péptidos de mesotelina humana, en donde el anticuerpo se purificó por un péptido único que se conserva completamente entre el ratón y la mesotelina humana (SEADVRALGGLAC (SEQ ID NO:86)).

Tabla 13. Leyenda de la Figura 8.

Construcción: Promotores Secuencias secretoras (SS) de cons-trucción: Integra-ción mediada por:

Línea P: L. monocytogenes genitor ActAinlB N.A. N.A. N.A.

Línea 1.: pPL2 LLO BaPA SS hMeso SSGPI-12ras hly LLO pPL2

Línea 2.: pPL2 LLO BaPA E30R hMeso SSGPI-12ras hly LLO y BaPA pPL2

Línea 3.: pPL2 LLO BaPA E30M hMeso SSGPI-12ras hly LLO y BaPA pPL2

Línea 4.: pPL2 LLOnatural hMeso SSGPI-12-ras hly LLO pPL2

Línea 5.: pPL2 LLOopt hMeso SSGPI-12-ras hly LLO pPL2

Línea 6.: pKSV7 ActA::ActA-N100 hmeso SSGPI ActA ActA pKSV7

Línea 7.: pKSV7 ActA::ActA-N100 hmeso SSGPI-12-ras ActA ActA pKSV7

Línea 8.: pKSV7 ActA::ActA-N100 hmeso SSGPI ActA ActA pKSV7

Línea 9.: pKSV7 inlB:BaPA hMeso SSGPI-12ras. inlB BaPA pKSV7

Línea 10: Marcadores de peso molecular N.A. N.A. N.A.

Los dos puntos dobles de “ActA::ActA-100” significa que el sitio de inserción fue el gen ActA. LLO significa listeriolisina. El gen hly codifica listeriolisina.

Los resultados del gel (Figura 8) muestran las proteínas en el sobrenadante (proteínas secretadas).

La línea P, un experimento de control que utiliza la Listeria genitora, no muestra ninguna banda con 5 color obvio.

Las líneas 1-4 muestran pocas o nada de bandas.

La línea 5 muestra algo de secreción de LLOopthmeso SSGP1-12ras, en donde la integración fue por integración medida por pPL2 en el gen de tARNArg listerial.

La línea 6, que representa un intento para secretar la mesotelina de ratón, no muestra nada de banda con 10 color obvio.

La línea 7, mostró la secreción marcada del ActA-N100 hMeso SSGP1-12ras, en donde la integración se medió por pKSV7 en el sitio ActA del genoma listerial.

La línea 8 muestra secreción aún mayor, en donde la construcción fue ActA-N100 hMeso SSGP1, y en donde la integración se medió por pKSV7 en el sitio ActA del genoma listerial (Figura 7).

15 La línea 9 muestra poca o nada de bandas.

La Figura 9 demuestra la secreción de proteína de ActAinlB L. monocytogenes, en donde la Listeria expresó varias proteínas de fusión que comprenden SSGPI de mesotelina humana. Todas las construcciones de mesotelina se expresaron de L. monocytogenes por ácidos nucleicos optimizados por codón para L. monocytogenes. Se prepararon varias construcciones para el estudio de secreción (véase Tabla 14). En estos experimentos también, 20 el anticuerpo para detectar la expresión de mesotelina fue un anticuerpo policlonal de conejo, producido al inmunizar el conejo con tres péptidos de mesotelina humana, en donde el anticuerpo se purificó por un péptido único que se

conserva completamente entre el ratón y la mesotelina humana (SEADVRALGGLAC (SEQ ID NO:86)). Tabla 14. Leyenda para la Figura 9. Análisis Western blot para la secreción de mesotelina humana (hMeso).

Línea: Construcción Promo-tores Secuencias secretoras (SS) de cons-trucción: Integra-ción mediada por:

P.: L. Monocytogenes genitor ActAinlB (no mesotelina) N.A. N.A. N.A.

1.: L. monocytogenes ActAinlB LLO441opt mesotelina humana SSGPI-12-ras ActA LLO pPL2

2.: L. monocytogenes ActAinlB ActA::BaPA ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon 2.25). ActA BaPA pKSV7 en sitio ActA

3.: L. monocytogenes ActAinlB ActA::BaPA ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon 2.69). ActA BaPA pKSV7 en sitio ActA

4.: L. monocytogenes ActAinlB ActA::BaPA ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI-ras (clon 1.1) ActA BaPA pKSV7 en sitio ActA

5.: L. monocytogenes ActAinlB ActA:ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon 1.46). A30R indica la mutación en el ActA en la que se basa ActA-N100 ActA ActA pKSV7 en sitio ActA

6.: L. monocytogenes ActAinlB ActA::ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon 2.14). A30R indica la mutación en el ActA en la que se basa ActA-N100 ActA ActA pKSV7 ActA en sitio

7.: L. monocytogenes ActAinlB inlB:::ActA-N100mesotelina humana SSGPI (clon BH77). ActA-N100 se basa en ActA tipo silvestre. inlB ActA pKSV7 inlB en sitio

8.: L. monocytogenes ActAinlB inlB::ActA-N100mesotelina humana SSGPI (clon BH78). ActA-N100 se basa en ActA tipo silvestre. inlB ActA pKSV7 inlB en sitio

9.: L. monocytogenes ActAinlB inlB::ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon BH85). A30R indica la mutación en el ActA en la que se basa ActA-N100 inlB ActA pKSV7 inlB en sitio

10.: L. monocytogenes ActAinlB inlB::ActA-N100(A30R)mesotelina humana SSGPI (clon BH85). A30R indica la mutación en el ActA en la que se basa ActA-N100 inlB ActA pKSV7 inlB en sitio

11.: L. monocytogenes ActAinlB ActA-N100 Ndegcon-mesotelina humana (clon A11-2). ActA ActA pKSV7 ActA en sitio

12.: L. monocytogenes ActAinlB ActA-N100 Ndegcon-mesotelina humana (clon A11-2). ActA ActA pKSV7 ActA en sitio

13.: L. monocytogenes ActAinlB ActA-N100 ActA ActA pKSV7 ActA en sitio

Ndegcon-mesotelina humana SSGPI-12-ras (clon 1-3).

14.: Marcadores de peso molecular N.A. N.A. N.A.

N.A. significa no aplicable. Los dos puntos dobles encontrados en “inlB::ActAN100” indica el sitio de la construcción, es decir, en el gen inlB. “Ndegcon” se refiere a las construcciones que incluyen las secuencias consenso modeladas después de las secuencias establecidas por Suzuki y Varshavsky (1999) EMBO J. 18:6017-6026.

La construcción utilizada para la Línea 1 utilizó LLO441 como la fuente de secuencia secretora, en donde el ácido nucleico para LLO441 se había optimizado por codón para la expresión en L. monocytogenes, y en donde el antígeno heterólogo fue SSGPI de mesotelina humana (Línea 1). Esta construcción produjo el nivel más alto de

5 secreción en este experimento en particular (Línea 1). El material de peso molecular alto mostrado en el western blot representa LLO441 fusionado a mesotelina en donde el material de peso molecular inferior representa probablemente los productos de degradación.

Las construcciones utilizadas para las Líneas 2 y 4 se basaron en ActA-N100, pero con la secuencia de señal de ActA suprimida y reemplazada con la secuencia de señal de BaPA. La expresión de estas construcciones fue 10 relativamente baja (Líneas 2 y 4) (Figura 9).

Todas las construcciones restantes contuvieron ActA-N100 de longitud completa como la fuente de secuencia secretora, pero en donde ActA-N100 tuvo una mutación A30R (Línea 5); en donde ActA-N100 no tuvo mutación (Línea 7); en donde ActA-N100 tuvo una mutación A30R (Línea 9); y en donde ActA-N100 tuvo cuatro mutaciones (designadas “Ndegcon”) (Línea 11). Las cuatro mutaciones en ActA-N100 designadas por “Ndegcon”

15 fueron Arg-29, Lys-32, Lys-37, y Lys-44. La Ndegcon se situó (o insertó) en entre ActA-N100 y la mesotelina. La proteína secretada se colectó por precipitación con ácido tricloroacético de cultivos medio-exponenciales crecidos en extracto de levadura sin glucosa.

La Figura 10 muestra estimulación inmune, como se determina después de una vacunación única con la construcción ActAinlB L. monocytogenes indicada, en donde se recolectaron los bazos siete días después de la 20 vacunación y se utilizaron como la fuente de esplenocitos. Las respuestas inmunes específicas de mesotelina se encontraron después de la vacunación con cada una de las cuatro construcciones: (1) el promotor hly se une operativamente con secuencia de señal BaPA y hMeso (integrado en sitio de tARNArg); (2) el promotor hly se unió operativamente con la secuencia de señal BaPA y hMeso (integrado en sitio inlB); (3) el promotor ActA se unió operativamente con ActA-N100 y hMeso (integrado en ActA); y (4) el promotor hly se unió operativamente con p60 y

25 hMeso (integrado en sitio de tARNArg).

Los resultados indican un papel del promotor ActA en la estimulación de la respuesta inmune; un papel de la pareja de fusión ActA-N100 en la mejora de la respuesta inmune; así como un papel de integración en sitio ActA en el incremento de respuesta inmune; y demuestran la habilidad mejorada para estimular la respuesta inmune en donde el promotor ActA se une operativamente con la pareja de proteína de fusión ActA-N100 e integración es en sitio ActA

30 (Figura 10).

Los detalles adicionales del estudio anterior se describen como sigue. Los ratones fueron inyectados con Listeria, seguido por un período de tiempo (7 días) para permitir a la Listeria tomarse y procesarse por células que presentan antígeno (APCs). Después de la toma de la Listeria, los antígenos codificados por Listeria presentada por APC a células T, dan como resultado la activación y expansión clonal de las células T. Se removieron los bazos, y se

35 aislaron los esplenocitos (incluyendo las células T y APCs). A los esplenocitos aislados se agregó ya sea el regulador

o un grupo de péptidos de mesotelina humana (0.002 mg/ml de concentración final del grupo). Después de agregar los péptidos, se permitió a las células dendríticas (DCs) en la preparación de esplenocito presentar el péptido a cualquiera de las células T activadas. La presentación exitosa dio como resultado la secreción de la célula T de inteferona-gamma, como se refleja por las señales en los ensayos formadores de mancha (células formadoras de

40 mancha; SFC) (Figura 10).

El grupo de péptido de mesotelina (también conocido como grupo 15 x 11) consistió de 153 diferentes péptidos, todos ellos 15 mers, girando la secuencia entera de mesotelina humana, en donde los péptidos subsiguientes se superponen por once aminoácidos. Los resultados demostraron que la expresión de interferonagamma (IFGgamma) fue mayor en donde el grupo de péptidos se había agregado a los esplenocitos, que en donde no se utilizó grupo de péptido. Las Figuras 10-12 comparan la respuesta inmune en donde los ratones fueron

5 vacunados con 1 x 107 CFU o 3 x 107 CFU (Figura 10); 1 x 106 CFU o 1 x 107 CFU (Figura 11); o 1 x 106 CFU o 1 x 107 CFU de L. monocytogenes (Figura 12). En la mayoría de los casos aquí descritos, la respuesta inmune fue mayor en donde los ratones fueron inyectados con números grandes de bacterias.

Las Figuras 11 y 12 describen los estudios similares que utilizan los ensayos de célula formadora de manchas.

10 Los datos puros (fotografías de ensayos de célula formadora de manchas) de la Figura 11 se hicieron en un gráfico en la Figura 12. La Figura 12 describe el número de células que producen una señal IFNgamma (célula formadora de manchas; SPC) por número de esplenocitos. Los datos describen las respuestas inmunes específicas de mesotelina comparables, en donde la construcción fue con promotor hly unido operativamente con la secuencia de señal BaPA y hMeso (sitio inlB), o en donde la construcción fue con promotor ActA unido operativamente con la

15 secuencia de señal ActA y ActA-N100 y hMeso (sitio ActA).

Las Figuras 13-14 describen los datos de metástasis de tumor. El estudio midió la metástasis de células que expresan mesotelina humana CT-26 a los pulmones. A t=0 días, las células tumorales CD-26 se inyectaron i.v. (células 2e5). A t=3 días, los ratones fueron administrados con vacuna Listeria indicada. A t=18 días, se recolectaron los pulmones. Las “células 2e5” significan 2 x 105 células.

20 Los ratones inoculados con célula tumoral se trataron como sigue: (1) sólo agua de sal (HBSS); (2) ActAinlB L. monocytogenes que no codifica el antígeno heterólogo (control negativo); (3) ActAinlB L. monocytogenes que codifica el péptido AH1-A5 derivado del antígeno tumoral gp70 (un antígeno diferente de mesotelina – control positivo); y (4)-(7) ActAinlB Listeria que codifica varias construcciones de mesotelina. El péptido AH1-AT se deriva del antígeno tumoral gp70. AH1-A5 se utiliza como un control positivo en los presentes

25 experimentos (véase, e.g., Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:13832-13837; Slansky, et al. (2000) Immunity 13:529-538).

La Figura 14 revela efectos equivalentes de las cuatro construcciones de Listeria que expresan mesotelina en la eliminación de metástasis tumoral.

Tabla 15. Grupos de ratones estimulados con células tumorales CT26 y tratadas con vacunas Listeria.

30 Tabla 15. Grupos de ratones desafiadas con células tumorales CT26 y tratadas con vacunas Listeria

Grupo: Vacuna Listeria Sitio de integración

1: Solución salina tamponada de Hank sólo (HBSS) (no Listeria) (control negativo). Sin Listeria

2: L. monocytogenes ActAinlB (cepa genitora) (control negativo). Ninguno

3: L. monocytogenes ActA L. monocytogenes inlB-OVAAH1-A5. El epítope AH1-A5 se insertó en estructura dentro de OVA al utilizar un sitio AvaII único (expresado del promotor hly como parte del vector pPl2) (control positivo) Sitio tARNArg

4: L. monocytogenes ActAinlB prfA* (E77K)-BaPa secuencia de señal-Mesotelina humana SSGPI (véase, e.g., Mueller y Freitag 2005) Infect. Immun. 73:19171926). Sitio ActA

5: L. monocytogenes ActAinlB-BaPa secuencia de señal- Sitio ActA

mesotelina humana SSGPI (expresada del promotor ActA)

6: L. monocytogenes ActAinlB-BaPa secuencia de señalmesotelina humana SSGPI (expresada de promotor hly) Sitio inlB

7: L. monocytogenes ActAinlB-ActA secuencia de señalActA-N100-mesotelina humana SSGPI (expresada de promotor ActA) Sitio ActA

La Figura 15 demuestra que varias Listeria que expresan mesotelina son eficaces en la reducción de tumores de pulmón, en donde se probaron tres diferentes dosis de cada Listeria que expresa mesotelina. hMeso6 es más 5 eficaz que, por ejemplo, hMeso2 o hMeso4, en la detención de la metástasis de pulmón (Figura 15).

La Figura 16 describe la supervivencia a los tumores con varias vacunas listeriales. Con tratamientos de control negativo (HBSS; Listeria genitora), ninguno de los ratones sobrevivieron más allá de 22 días. La Listeria de control positivo expresó un antígeno derivado de gp70. El antígeno (AH1-A5) se derivó del antígenoinmunodominante de células CT26 (Slansky, et al., (2000) Immunity 13:529-538). Los ratones tratados con la vacuna

10 de control positivo sobrevivieron hasta o más allá de 60 días (Figura 16).

La Figura 17 describe los geles, con análisis western blot, para detectar la mesotelina secretada (mancha superior) y mesotelina expresada total (mancha inferior). ActAinlB L. monocytogenes se diseñó para contener un polinucleótido que contiene las secuencias secretoras indicadas y se cultivaron los antígenos, y se midió la mesotelina secretada o total. Las secuencias secretoras fueron BaPA o Bs phoD, como se indica. Los antígenos fueron

15 mesotelina humana de longitud completa (FL) o mesotelina humana suprimida en su secuencia secretora y GPI de anclaje (hMesoSSGPI), como se indica. Los resultados indican que la expresión total fue de cierta manera mayor con Bs phoD (líneas 4-5; gel inferior) que con BaPA (líneas 2-3; gel inferior). Los resultados también demuestran que, al menos con las construcciones que contienen Bs phoD, la secreción fue mayor con hMeso (SSGPI) (líneas 4-5; gel superior) que con hMeso de longitud completa (líneas 8-9; gel superior).

20 La Figura 18 compara la respuesta inmune específica de mesotelina a la vacunación con hMeso1, hMeso2, hMeso3, y hMeso4. La comparación lado por lado de hMeso1 y hMeso2 revela que una construcción Listeria que comprende un ácido nucleico que codifica para PrfA constitutivamente activo (prfA*) incrementa la respuesta inmune, como se compara a una construcción Listeria que no comprende ese ácido nucleico. Las comparaciones lado por lado de hMeso1 y hMeso4 revela que la respuesta inmune incrementada se encuentra con integración genómica en el

25 sitio inlB (hMeso4), como se compara a la respuesta inmune en donde la integración genómica se encuentra en el sitio tARNArg (hMeso1). La comparación de la respuesta inmune a hMeso3 y hMeso4 sugiere que la respuesta inmune puede mejorarse al utilizar el promotor hly, como se compara a la respuesta inmune con el promotor ActA. El análisis Elispot se utilizó para valorar la respuesta inmune. Los esplenocitos (más o menos estimulación de esplenocitos con un grupo de péptidos de mesotelina) para ensayos de elispot, en donde los ensayos de elispot

30 midieron la expresión IFNgamma.

Los geles de la Figura 18 describen las western blots sensibles a la expresión total de mesotelina o a secreción de mesotelina. hMeso2 produjo los niveles más altos de secreción, indicando la utilidad de la siguiente combinación para incrementar la secreción: (1) ácido nucleico prfA*; (2) Integración en sitio tARN Arg; (3) El promotor hly; y (4) secuencia secretora BaPa. Nuevamente, la utilidad del ácido nucleico prfA*, se demuestra.

35 La Figura 19 compara la respuesta inmune a hMeso12 y hMeso1. La respuesta inmune específica de mesotelina se representa por los datos puros (ensayos de elispot) y por histogramas que muestran el número de esplenocitos formadores de manchas por 2 x 105 de esplenocitos. Los resultados indican que la secuencia ras presente en la proteína de fusión de hMeso SSGPI (hMeso12) da como resultado una respuesta inmune inferior (ensayos de elispot) y expresión inferior (western blots), como se compara a los resultados en donde la proteína de

40 fusión no comprendió ras (hMeso1) (Figura 19).

Los ratones fueron vacunados con las dos cepas (hMeso12 o hMeso1), y se removieron los esplenocitos y se utilizaron para ensayos de elispot, en donde las mezclas de ensayo se hicieron palpitar con grupo de péptidos de hMeso estándar. Como se describe anteriormente, hMeso1 (la secuencia secretora de BaPA es tipo silvestre) estimuló una respuesta inmune específica de mesotelina mayor que hMeso12 (la secuencia secretora BaPA es E30R).

La Figura 20 compara la respuesta inmune a hMeso1, hMeso5, hMeso19, y hMeso20. Los resultados demuestran que la respuesta inmune específico de mesotelina más grande fue para hMeso1, en donde también hubo algo de respuesta específica de mesotelina detectable a hMeso5. Los resultados demuestran que la secuencia secretora de BaPA da como resultado una mayor respuesta inmune, como se compara a la secuencia secretora p60,

o a derivados de secuencia secretora p60. El gel demuestra que la secuencia secretora p60 soporta la secreción de mesotelina. Véanse líneas marcadas hMeso5 o hMeso20 (Figura 20).

La Figura 21 compara las respuestas inmunes a hMeso11, hMeso6, hMeso10, y hMeso18. Las respuestas inmunes específicas de mesotelina ocurrieron con cada una de estas vacunas, en donde las respuestas más altas se provocaron por hMeso10 y hMeso18. En comparación a hMeso6 y hMeso10, puede observarse que la ras (hMeso10) puede mejorar la respuesta inmune específica de mesotelina. Aquí, se utilizaron ambas cepas Listeria de secuencia secretora ActA, se utilizó el promotor ActA, y se utilizó el sitio ActA de integración. El alto grado de respuesta inmune a hMeso18 puede deberse al uso de la secuencia secretora ActA (A30R). La presente invención proporciona una Listeria que contiene un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica ActA (A30R), unido operativamente con y en estructura con un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, e.g., un antígeno derivado de un tumor, tal como antígeno de mesotelina, o un antígeno derivado de un agente infeccioso. El gel revela que la cepa Listeria hMeso18 secretó las cantidades relativamente bajas de mesotelina, como se compara con la secreción por hMeso10 y hMeso6 (Figura 21).

La Figura 22 compara las respuestas inmunes a hMeso1, hMeso14, hMeso15,y hMeso22. Las respuestas inmunes específicas de mesotelina a hMeso1, hMeso14, y hMeso22 fueron comparables, mientras que hMeso15 fue mayor. Las secuencias secretoras (SS) de cada una de estas cuatro cepas de vacuna, son diferentes. Las secuencias secretoras (SS) de hMeso1 es BaPA; hMeso14 (LLO62); hMeso15 (LLO opt62); hMeso22 (LLO441).

La Figura 23 revela la respuesta inmune en voluntarios humanos saludables, a listeriolisina (LLO) y a mesotelina. La respuesta inmune a epítopes de LLO y a mesotelina se encontró en todos los tres sujetos probados.

La Figura 24 ilustra la expresión de mesotelina humana por hMeso6 o hMeso5, en brote BHI y en macrófagos J774, en donde la expresión se valoró por separación de gel y detección por el método western blot. Los resultados demuestran la expresión relativamente baja por hMeso6 en brote (y expresión alta por hMeso5 en brote), y expresión relativamente alta por hMeso6 dentro de las células de mamífero (y baja expresión por hMeso5 dentro de las células de mamífero). La gráfica demuestra la respuesta inmune relativamente alta (respuesta meso-específica; ensayos de elispot) después de la vacunación con hMeso6, y la baja respuesta inmune después de la vacunación con hMeso5 (Figura 24).

La Figura 25 describe la respuesta inmune específica de mesotelina, en donde los ratones se habíanvacunado con Listeria que contiene un polinucleótido que comprende un primer ácido nucleico que codifica p60, BaPA, LLO441, ActA-N100, como se indica, y un segundo ácido nucleico que codifica hMeso. La integración fue en el sitio tARNArg, sitio ActA, o sitio inlB, del genoma listerial, como se indica.

La Figura 26 ilustra la expresión in vivo de mesotelina de macrófagos J774, como se detecta por el western blotting utilizando un anticuerpo anti-mesotelina. La expresión in vivo similar ocurrió cuando los macrófagos J744 se infectaron con hMeso6 o con hMeso26.

La Figura 26, así como la Figura 27, muestra que la mesotelina específica montada después de la vacunación con varias Listeria diseñadas fueron mayores con la cepa hMeso26 que con las otras cepas probadas.

Las Figuras 28 (fotografías de pulmones), 29 (histogramas de datos de pulmones), y 30 (supervivencia de ratón) revelan el tratamiento exitoso de tumores de pulmón al administrar hMeso6 y hMeso26. Los ratones fueron tratados con un control negativo (HBSS); control positivo (Listeria que expresa AHÍ-A5); o los números indicados de hMeso6 o hMeso26. Los tumores se indujeron por una inyección con células CT26. Los resultados demuestran que tanto hMeso6 como hMeso26 fueron eficaces en la reducción de la metástasis tumoral, en donde hMeso26 fue más efectiva que hMeso6 (Figura 30).

La Figura 31 compara la expresión, y las respuestas inmunes a la vacunación, con varias cepas Listeria diseñadas para contener los casetes de expresión integrados en diferentes puntos en el genoma listerial. La bacteria de control (L. monocytogenes ActAinlB) no contuvo casete de expresión, mientras que hMeso26 contuvo sólo un casete de expresión integrado. Las cepas hMeso40, hMeso41, hMeso42, y hMeso43, cada una contuvieron dos diferentes de casetes de expresión (integrados en dos diferentes puntos en el genoma), en donde la expresión de estas cepas Listeria y respuesta inmune a estas cepas Listeria se muestran (Figura 31).

La Figura 32 muestra la expresión in vivo de mesotelina, es decir, in vivo dentro de macrófagos J744, después de la infección con (1) hMeso6; (2) hMeso26; o (3) L. monocytogenes ActAinlB (tres construcciones idénticas) que llevan un casete de expresión que codifica la mesotelina humana de longitud completa, e integrado en sitio tARNArg. Las tres construcciones idénticas, o hermanas, se etiquetan 1-1, 7-1, y 8-1.

La Figura 33 describe la expresión in vivo de mesotelina por hMeso6, hMeso26, y hMeso38 dentro de los macrófagos murino J774 (geles con western blots). La bacteria de control fue L. monocytogenes ActAinlB. También se muestran las respuestas inmunes específicas de mesotelina (ensayos de elispot). Los resultados demuestran la expresión comparable de mesotelina en donde hMeso6, hMeso26, y hMeso38 se ubican en macrófagos, y la respuesta inmune comparable a hMeso26 y hMeso38.

La Figura 34 describe la respuesta inmune específica de mesotelina generada siete días después de una inyección única de hMeso26 o hMeso38, en las dosis indicadas. Las curvas de respuesta de dosis revelan un incremento marcado en ir de un millón de bacterias a diez millones de bacterias. Las curvas de respuesta de dosis encontradas con dos cepas son similares entre sí (Figura 34). La presente invención proporciona hMeso26; hMeso38; una vacuna que comprende hMeso26 y/o hMeso38; un método para administrar hMeso26 y/o hMeso38 a un sujeto mamífero; un método para estimular la respuesta inmune específica de mesotelina contra un cáncer o tumor que comprende administrar hMeso26 y/o hMeso38; un método para incrementar la supervivencia a un cáncer o tumor que comprende administrar hMeso26 y/o hMeso28, y así sucesivamente (Figura 34).

Las Figuras 35A y 35B continúan la narrativa en hMeso26 y hMeso38; y muestra las fotografías de pulmones fijos. Las células tumorales se inyectaron a t=0 días. Las vacunas de listeria se inyectaron (i.v.) a T=3 días. Se recolectaron los pulmones en t=19 días, en donde la histografía cuantifica los resultados de metástasis representados por las fotografías de pulmón (Figura 35A,B). Con la concentración de ratones con los números indicados de bacterias, los resultados muestran respuestas similares para ambas cepas listeriales, hMeso26 y hMeso38.

La Figura 36 también continúa la narrativa de cepas Listeria hMeso26 y hMeso38. Los resultados demuestran que ambas cepas dan como resultado incrementos similares en supervivencia a células tumorales CT26 inoculadas.

La Figura 37 disecciona la respuesta inmune específico de mesotelina a cepas Listeria hMeso26 y hMeso38 en respuesta de célula T CD4+ y respuesta de célula T CD8+. La respuesta inmune se monitoreó por ensayos de tintación intracelular (ICS). Ambas cepas de Listeria se probaron con ratones Balb/c, mientras que sólo la cepa Listeria hMeso26 se probó con ratones CD-1. Los resultados demuestran que la proporción de la respuesta inmune que es respuesta de célula T CD4+, o respuesta de célula T CD8+, pueden diferir en diferentes cepas de ratones.

La Figura 38 demuestra que hMeso38 incrementa la supervivencia a tumores, y disecciona la contribución a supervivencia por células que son CD4+, CD8+, y células NK. Los ratones fueron tratados con anticuerpos que suprimieron una de las células CD4+, células CD8+, o células NK. El tratamiento con los anticuerpos anti-CD8 dio como resultado sólo un ligero deterioro de supervivencia incrementada mediada por hMeso38. El tratamiento con los anticuerpos de célula anti-NK dio como resultado los deterioros moderados de supervivencia incrementada mediada por hMeso38. El tratamiento con los anticuerpos anti-CD4 dio como resultado un gran deterioro en la supervivencia incrementada mediada por hMeso38 (Figura 38). La supresión mediada por anticuerpo de las células de ratón se efectuó al administrar anticuerpos en t=menos 8 días, menos 4 días, y menos 1 día. En t=0 días, se inyectaron los ratones (i.v.) con células tumorales. En t=3 días, los ratones fueron inyectados con vacuna Listeria (i.v.). Se dieron estímulos de anticuerpo semanalmente para provocar la supresión de las células de ratón. La Figura 39 muestra un experimento similar, pero sólo se administró un anticuerpo, en donde sólo se administró hMeso38, o en donde se administraron tanto hMeso38 como el anticuerpo indicado.

No se pretende que los datos anteriormente expuestos limiten la presente invención a las modalidades que comprenden L. monocytogenes ActAinlB que contiene un ácido nucleico que codifica mesotelina humana. La presente exposición proporciona otras plataformas de vacuna listerial atenuada, e.g., KBMA L. monocytogenes, L. monocytogenes inlB; L. monocytogenes ActA; L. monocytogenes hly; KBMA L. monocytogenes inlB; KBMA L. monocytogenes ActA; KBMA L. monocytogenes ActAinlB; KBMA L. monocytogenes hly. Además, también lo que se proporciona son las construcciones que codifican antígeno diferentes a, o además de, mesotelina humana.

EJEMPLO VIII. Ácidos nucleicos que codifican las integrasas de fago, sitios de unión de fagos (attPP’) y sitios de unión bacteriana (attBB’).

La integración específica de sitio de un primer ácido nucleico en un polinucleótido puede mediarse por una integrasa de fago, un sitio attPP’ que reside en el primer ácido nucleico, y un sitio attBB’ compatible o correspondiente que reside en el polinucleótido. La presente descripción proporciona un número de ácidos nucleicos, que codifican integrasas de fago, sitios attPP’, y sitios attBB’, útiles para mediar la integración de un primer ácido nucleico en un polinucleótido, en donde el polinucleótido puede ser un plásmido o genoma bacteriano, para proporcionar algunos ejemplos no limitantes.

La Figura 40, Figura 41, Figura 42, Figura 43 y Figura 44, describen las secuencias de aminoácido de algunas integrasas de fago de la presente descripción. Lo que se contempla son los polinucleótidos que codifican estas integrasas de fago, los ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones rigurosas a estas polinucleótidos en donde los ácidos nucleicos codifican las integrasas de fago funcional. También se contemplan otros polinucleótidos que se encierran en corchetes por un par de cebadores PCR, en donde el par de cebadores PCR corresponde exactamente a dos posiciones de un polinucleótido que codifica una integrasa de fago de la presente descripción.

Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican las siguiente integrasas de fago, los polipéptidos de integrasa de fago, ácidos nucleicos que codifican los sitios de unión de fago relevantes (attPP’) y ácidos nucleicos que codifican los sitios de unión bacterianos (attBB’). La presente descripción comprende las siguientes integrasas: (1) L. innocua 0071 integrasa; (2) L. innocua 1231 integrasa; (3) L. innocua 1765 integrasa; (4) L. innocua 2610 integrasa; y

(5) L. monocytogenes f6854_2703 integrasa.

La identificación de ácidos nucleicos que codifican integrasas, sitios attPP’, y sitios attBB’, fue de acuerdo con el siguiente procedimiento de múltiples etapas. Las secuencias de ácido nucleico candidato se adquirieron inicialmente, y las homologías pueden identificarse, utilizando, e.g., la característica BLAST de nucleótido o proteína en la red a nivel mundial en ncbi.nlm.nih.gov, y utilizando la característica de genomas microbianos completos en la red a nivel mundial a tigr.org.

Etapa 1. Se identificaron nuevas secuencias de integrasa de fago como sigue. Los ácidos nucleicos de una integrasa de fago conocida se utilizaron para buscar una secuencia similar en un genoma listerial, en donde el genoma listerial alberga un profago. Las secuencias de integrasas de fago conocidas utilizadas en esta etapa de la búsqueda, fueron aquellas que codifican la integrasa PSA e integrasa U153.

Etapa 2. Una vez que un ácido nucleico que codifica una nueva integrasa de fago se identifica, se revisa el cebador 3 ADN al ácido nucleico que codifica la integrasa para la apariencia de un sitio de unión. El sitio de unión normalmente toma la forma de un híbrido del sitio de unión de fago y el sitio de unión bacteriana (attPB’). El sitio de unión toma la forma de este híbrido debido a que el fago se ha integrado por sí mismo en el genoma listerial.

Etapa 3. Las regiones del genoma listerial que contienen un sitio attPB’ putativo se compararon con la región correspondiente de otra cepa listerial o especie listerial, en donde ésta otra especie o cepa listerial no se espera que contenga un fago integrado. El punto de cruzamiento (punto de cruzamiento entre secuencia de fago y secuencia bacteriana en attPB’) toma la forma de una discontinuidad. El punto de cruzamiento puede ocurrir en una estructura de lectura abierta o en una región intergénica.

Etapa 4. La secuencia de nucleótidos que reside inmediatamente corriente abajo del (inmediatamente extremo del cebador 3 del) gen de integrasa, y corriente arriba al punto de cruzamiento, se identifica como secuencia derivada por fago, y constituye una “primera mitad” del sitio de unión de fago.

Etapa 5. La “segunda mitad” del sitio de unión de fago puede identificarse al revisar las secuencias de ácido nucleico que residen corriente arriba al (cebador 5 al) gen de integrasa, en comparación con las regiones correspondientes de una especie o cepa listerial que no se espera que contenga algún fago integrado (fago no integrado en la región genómica de interés), y la identificación de una región de discontinuidad. La combinación de la primera mitad del sitio de unión de fago y la segunda mitad del sitio de unión de fago es attPP’.

Etapa 6. Los sitios de unión de fago y los sitios de unión bacteriana normalmente contienen una región de identidad, por ejemplo, de entre tres a 10, 20, 30 o más nucleótidos. Una región de identidad puede ayudar a encontrar la ubicación general del sitio de unión de fago y el sitio de unión bacteriana.

Etapa 7. En donde la especie listerial de interés es una especie diferente a L. monocytogenes, e.g., L. innocua, el sitio de unión bacteriana identificada en el genoma L. innocua puede utilizarse como un medidor por computadora para buscar el genoma L. monocytogenes para secuencias homólogas. El resultado de esta búsqueda del genoma L. monocytogenes en donde el resultado del medidor será el sitio de unión bacteriana (attBB’).

Etapa 8. En donde la región de identidad es relativamente larga, e.g., 40-50 nucleótidos, esta región de identidad puede constituir el sitio de unión de fago completo (attPP’) y sitio de unión bacteriana completa (attBB’).

La mayoría de las integrasas específicas de sitio son de la familia de recombinasa de tirosina o familia de recombinasa de serina. Aproximadamente 100 genes de integrasa codificados por fago, se han identificado. Estos genes, codificados por el genoma fago, pueden encontrarse en el genoma de fago y/o también con un genoma bacteriano después de la integración de fago en el genoma bacteriano.

Las recombinasas de serina tienen un dominio catalítico en la terminal N, que incluye un número de residuos invariantes, incluyendo Arg-8, Ser-10, y Arg-68. El dominio catalítico de terminal N se sigue por una región de aproximadamente 220 aminoácidos, que contiene al menos diez residuos conservados (incluyendo tres cisteínas). Esta región se sigue por aproximadamente 125 aminoácidos en residuos no conservados, por una región de 30 aminoácidos rica en Leu, Ile, Val y/o Met, y finalmente un extremo de terminal C de 4-200 aminoácidos en longitud (véase, e.g, Smith y Thorpe (2002) Mol. Microbiol. 44:299-307; Nunes-Darby, et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:391406; Esposito y Scocca (1997) Nucleic Acids Res. 25:3605-3614).

Las integrasas de fago de la familia de recombinasa de tirosina pueden identificarse por un motivo R-H-R-Y conservado. El motivo R-H-R-Y es un distintivo para la familia de integrasa de recombinasas. La histidina (H) puede sustituirse por arginina, lisina, asparagina, o tirosina. En integrasa de fago lambda, por ejemplo, los aminoácidos del motivo R-H-R-Y ocurren en aminoácidos R212, H308, R311, y Y342 (véase, e.g., No. de Acceso de GenBank P03700) (Nunes-Duby, et al., supra.). Las integrasas de fago se identifican además por el Recuadro I (véase, e.g., A202-G225 de integrasa de fago lambda), Recuadro II (véase, e.g., T306-D344 de integrasa de fago lambda), y por ciertos motivos que ocurren antes o entre Recuadro I y Recuadro II. El Recuadro II puede incluir la secuencia de consenso LLGH, en donde la glicina (G) puede reemplazarse por A, S, o T (SEQ ID NO:137) (Nunes-Duby, et al., supra). Además del motivo de Recuadro I y el motivo de Recuadro II, tres “parches” de secuencias conservadas ocurren en integrasas procarióticas, tales como integrasas de fago. El parche I se encuentra corriente arriba del Recuadro I, y tiene la secuencia de consenso LT-EEV-LL (SEQ ID NO:88). En la integrasa de fago lambda, el Parche I tiene la secuencia LTADEYLKIY (SEQ ID NO:87) (aminoácidos 180-189 de No. de Acceso de GenBank P03700). El Parche II es lisina (K235 de integrasa de fago lambda) flanqueada en ambos lados por serina, treonina, glicina, o metionina. En la integrasa de fago lambda, el Parche II ocurre como SKT, mientras que el Parche II de recombinasa Cre ocurre como TKT, y en recombinasa XerD ocurre como GKG. El Parche III, que ocurre entre Recuadros I y II, es [D,E]-[F,Y,W,V,L,I,A]3-6[S,T] (SEQ ID NO:89, 138, 139, 140). En integrasa de fago lambda, el Parche III ocurre en aminoácidos 269-274 (Nunes-Duby, et al., supra). En el uso de una secuencia de integrasa de fago candidato como una secuencia de consulta, para comparación con secuencias de integrasa de fago, podría ser útil introducir una abertura o extensión para traer al Recuadro I y Recuadro II en alineación.

El motivo R-H-R-Y conservado (Tabla 16) reside en las integrasas de fago de la presente invención. Las posiciones se determinaron por inspección manual. Esposito y Scocca proporcionan secuencias conservadas adicionales dentro del Recuadro I (a.k.a. Recuadro A) y Recuadro II (a.k.a. Recuadro B) (Esposito y Scocca (1997) Nucleic Acids Res. 25:3605-3614). Esposito y Scocca describen que la Arginina (en el Recuadro I (Recuadro A) del motivo R-H-R-Y) reside en el siguiente contexto: TGLRXTEL (SEQ ID NO:91), y que la histidina y la segunda arginina (en el Recuadro II (Recuadro B) del motivo R-H-R-Y) reside en el siguiente contexto: HXLRHAXATXLXXXG (SEQ ID NO:90). La histidina (H) y la segunda arginina (R) del motivo R-H-R-Y están en negritas y subrayada. Las secuencias correspondientes a estos dos contextos pueden encontrarse fácilmente, por inspección manual, en los Recuadros I y II de L. innocua 0071. Esposito y Scocca colocan la Tirosina (Y) del motivo R-H-R-Y en un motivo identificado como Recuadro C, en donde el Recuadro C de Esposito y Scooca es: VXXXLGHXXXXXTXXYXH (SEQ ID NO:92). La Y del motivo R-H-R-Y está en negritas y subrayada. La inspección de la secuencia de integrasa L. innocua 0071 demuestra que la secuencia de consenso de recuadro C reside en integrasa L. innocua 0071 de la presente invención.

La inspección revela que el Recuadro B y el Recuadro C de Esposito y Scocca existe en integrasa L. innocua 1765 de la presente invención. Además, la inspección demuestra que el Recuadro A de Esposito y Scocca reside en integrasa L. innocua 2601 de la presente invención. Además, la inspección de la secuencia de integrasa f6854_2703

L. monocytogenes muestra la ocurrencia de Recuadro A, B, y C. Tomadas en conjunto, las secuencias de consenso de Nunes-Duby, et al. supra, y de Esposito y Scocca, supra, confirman las secuencias identificadas como integrasas de fago. La inspección de la secuencia de integrasa de fago PSA revela los motivos similares a los Recuadros A, B, y C de Esposito y Scocca.

La integrasa L. innocua 1231 de la presente invención puede identificarse como una recombinasa de serina. Yang y Steitz expusieron un número de motivos invariantes, y motivos sustituidos de manera conservada, de la familia de recombinasa de serina (Yang y Steitz (1995) Cell 82:193-207). El motivo YxRVSTxxQ (SEQ ID N0:93) de Yang y Steitz ocurre en integrasa L. innocua 1231. También, el motivo VLVxxLDRLxR (SEQ ID N0:141) de Yang y Steitz puede encontrarse en integrasa L. innocua 1231. Además, el motivo VAQAER.xxxxERxxxG (SEQ ID N0:94) de Yang y Steitz se encuentra en integrasa L. innocua 1231 de la presente descripción.

Tabla 16. Motivos R-H-R-Y conservados en integrasas de fago.

Arginina (R): Histidina (H) Arginina (R) Tirosina (Y)

L. innocua 0071 integrasa: 382 595 598 631

L. innocua 1765 integrasa: 241 334 337 369

L. innocua 2601 integrasa (90.9% idéntica a PSA integrasa): 199 309 312 344

L. monocytogenes f6854_2703 integrasa: 204 328 331 364

Fago Lambda. No. de Acceso de GenBank P03700: 212 308 311 342

Fago PSA. No. de Acceso de GenBank CAC85582: 199 309 312 344

L. innocua 0071 integrasa. Secuencia codificadora más Shine Dalgarno y terminador. Véase, e.g., No. de Acceso de GenBank AL596163.1 (Segmento 1/12). (SEQ ID NO:95)

Secuencia codificadora sólo de integrasa. L. innocua 0071. (SEQ ID NO:96)

Secuencia de aminoácidos de L. innocua 0071 integrasa (SEQ ID NO:97)

L. innocua 0071 Sitio de Unión bacteriana (entre L. monocytogenes f2365_0095 & L. monocytogenes f2365_0096, en el gen tARN-lys (sitio de unión subrayado). (SEQ ID NO:98)

L. innocua 0071 sitio de unión por fago. (Secuencia común entre fago y cromosoma (attP y attB)). (SEQ ID NO:99)

Secuencia de ácido nucleico de L. innocua 1231 integrasa. L. innocua lip11262 genoma completo. No. de Acceso de GenBank AL596168.1 (segmento 6/12 nucleótidos 29,995 a 28,563). (SEQ ID NO:100)

Secuencia de aminoácido L. innocua 1231 integrasa (SEQ ID NO:101)

Sitio de unión por fago L. innocua 1231 attPP’. Este sitio reside en la cepa L.

monocytogenes 4bF2365 (complemento a 2495122 a 2495193), y es esencialmente el mismo como una secuencia encontrada en la cepa L. monocytogenes EGD (nt 145171 a 145423 del No. de Acceso de GenBank AL591983.1 segmento 11/12). (SEQ ID NO:102)

Sitio de unión L. innocua 1231 attBB’ dentro de L. monocytogenes 1263: (SEQ ID NO:103)

L. innocua 1765 integrasa. Véase también L. innocua Clip1162 genoma completo, segmento 7/12 (nucleótido 210,321 a 211,089). (SEQ ID NO:104)

Secuencia de aminoácidos de L. innocua 1765 integrasa. (SEQ ID NO:105)

L. innocua 1765 Sitio de unión por fago (SEQ ID NO:106)

L. innocua 1765. Sitio de unión bacteriana. Esta secuencia reside en L. monocytogenes EGDe (genoma completo) No. de Acceso de GenBank AL591824 a nt 1,705,630 a nt 1,706,203. Las secuencias similares ocurren en L. monocytogenes cepa 4bF2365 (nt 216008 a 216262 de la sección 6) y en L. innocua Clip11262 nt 77369 a 77270 (SEQ ID NO:107)

L. innocua 2610. Gen de integrasa de L. innocua. La presente invención también proporciona el ácido nucleico ypolipéptido de L. innocua Clip11262 genoma completo segmento 11/12 No. de Acceso de GenBank AL596173.1 (nucleótidos 14,676 a 15,804). (SEQ ID NO:108)

L. innocua 2610 integrasa, secuencia de aminoácidos (90.9% idéntica a PSA integrasa). (SEQ ID NO:109)

L. innocua 2610. Esta secuencia es un sitio attBB’ de L. innocua. El sitio de unión (gen tARN-Arg5 más secuencias circundantes, integra la cepa L. innocua). Sitio de unión por núcleo en negritas(atgccctcggaggga). (SEQ ID NO:110)

Sitio de unión por núcleo (ennegritas) (SEQ ID NO:111)

Esta secuencia es un sitio attBB’ de L. monocytogenes f2365. Sitio de unión de cepa no integrada (L. monocytogenes F2365; sitio de unión en gen tARN-Arg5 subrayado. Sitio de unión por núcleo se encuentra en NEGRITAS. (atgccctcggaggga). (SEQ ID NO:112)

L. monocytogenes f6854_2703 integrasa-2680803:2681963 (la mayoría de esta secuencia se encuentra disponible en tigr.org) (SEQ ID NO:113)

L. monocytogenes f6854_2703 integrasa 2,680,803: 2,681,963. (SEQ ID NO:114)

L. monocytogenes f6854_2703. Sitio de unión por fago (SEQ ID NO:115)

Sitio de unión por fago (attPP’). Sitio de unión Phi6854.3 se encuentra dentro del gen tARNThr-4. El sitio de unión por fago se destaca en negritas y subrayado, y se anota como un sitio de unión por fago en el genoma F2365 (Nelson, et al. (2004) Nucleic Acids. Res. 322:2386-2395). (SEQ ID NO:116)

Fago (attPP’) Phi6854.3 El sitio de unión (igual que el anterior) se encuentra dentro del gentARN-Thr-4, en donde el gen tARN-Thr-4 se muestra subrayado en un recuadro (SEQ ID NO:117)

Phi6854.3 bacteriano (attBB’) el sitio de unión se encuentra dentro del gen tARN-Thr-4. El sitio de unión se resalta en negritas y subrayado, y se anota como un sitio de unión por fago en el genoma F2365 (Nelson, et al. (2004) El gen tARN-Thr-4 se subraya en recuadro. (SEQ ID NO:118)

Las secuencias de ácido nucleico pueden encontrarse en la red a nivel mundial a tigr.org. y dando click: (1) Recursos microbianos comprensivos; (2) búsquedas; (3) CMR BLAST; y (4) colocar una secuencia integrasa listerial como una secuencia de consulta. Si se conoce un número de acceso, puede encontrarse una secuencia en la red a nivel mundial a tigr.org. al dar click: (1) Recursos microbianos comprensivos; (2) Genomas; (3) Listeria monocytogenes 1/2a F6854; (4) Búsquedas; (5) Sitio; (6) Mecanografíe “LMOf6854_2703” en el recuadro; y (7) Dé click en las secuencias TIGR en la barra lateral.

Un sitio de unión de fago (attPP’) o sitio de unión bacteriana (attBB’) de la presente invención puede implantarse en un polinucleótido a manera de recombinación específica de sitio, recombinación homóloga, por uso de

5 sitios de restricción, por métodos de química orgánica sintética, o por otros métodos. En particular, en donde se utiliza la recombinación homóloga, un sitio attBB’ puede implantarse en un gen de virulencia, en donde la integración da como resultado una inserción simple o, alternativamente, una inserción con supresión de una región correspondiente del gen de virulencia.

De esta manera, la presente descripción proporciona métodos para implantar un sitio de unión de fago

10 (attPP’) en un plásmido. Se proporcionan los métodos para implantar un sitio de unión bacteriana (attBB’) en un plásmido, así como métodos corriente abajo en donde el plásmido por último puede ser utilizado para transferir el attBB’ en un genoma bacteriano. En un aspecto, el plásmido contiene un primer ácido nucleico que codifica un sitio attPP’ y un segundo ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En este caso, esta descripción contempla los métodos para incorporar el segundo ácido nucleico en un sitio attBB’ que reside en un polinucleótido objetivo, en

15 donde el polinucleótido objetivo puede ser un genoma bacteriano.

El polinucleótido objetivo de la recombinación específica de sitio, recombinación homóloga, o diseño al utilizar sitios de restricción, no se limitará a genes de virulencia, pero también comprende sin limitación algún polinucleótido, plásmido, episoma, elemento extracromosomal, genoma bacteriano, genoma listerial, genoma de Bacillus anthracis, o genoma de Francisella tularensis.

La presente descripción comprende un ácido nucleico que codifica una integrasa de fago, un sitio attPP’, o un sitio attBB’, en donde el ácido nucleico puede hibridizar bajo condiciones rigurosas a uno de los ácidos nucleicos reivindicados como parte de la presente descripción, es decir, a uno de los ácidos nucleicos que codifican una integrasa de fago, sitio attPP’, o sitio attBB, y en donde el polinucleótido de hibridización puede codificar una integrasa de fago funcional, sitio attPP’, o sitio attBB’.

También se comprende un ácido nucleico derivado de una reacción de cadena de polimerasa (PCR), en donde el par de cebadores PCR combina exactamente y coloca en corchetes una región funcional de uno de los ácidos nucleicos de la presente descripción, descritos en la presente, que codifican una integrasa de fago, sitio attPP’,

: o sitio attBB. La reacción PCR puede llevarse a cabo en silicio. La presente descripción comprende un ácido nucleico derivado de la reacción PCR, en donde el ácido nucleico codifica una integrasa de fago funcional, sitio attPP’,

: o sitio attBB’. Los cebadores PCR pueden ser diseñados para colocar en corchetes el ácido nucleico completo que codifica la integrasa de fago, sitio attPP’, o sitio attBB’, expuestos en la presente, o pueden ser diseñados para colocar en corchetes una parte más corta, funcionalmente activa, del ácido nucleico.

EJEMPLO IX. Reactivos y métodos utilizados para los Ejemplos X y XI

El antígeno heterólogo en las cepas L. monocytogenes (Lm) puede construirse alternativamente para contener la secuencia de nucleótidos que codifica los ocho amino SIINFEKL (SEQ ID NO:142)péptido (también conocidos como SL8 y ovalbumina257-264), colocados en estructura en la terminal carboxi de una proteína de fusión ActAN100-PSCA. Las composiciones tales como el epítope SL8 sirven como un sustituto para demostrar la habilidad de las cepas de vacuna L. monocytogenes recombinante para ser tomadas por las células que presentan antígeno y de manera subsiguiente la presentación de programa de antígenos por medio de la trayectoria de MHC clase I, utilizando un ensayo de presentación de antígeno in vitro.

Este ensayo de presentación puede llevarse a cabo utilizando la línea de célula dendrítica derivada C57BL/6 DC2.4 junto con la línea celular de hibridoma de célula T B3Z. la línea DC2.4 se generó de DC derivado de médula ósea que se transformaron de manera subsiguiente con los oncogenes myc y raf. Previamente se ha mostrado que las células DC2.4 presentan antígeno exógenamente agregado tanto por trayectorias MHC clase I como clase II. La presentación de péptido por las células DC2.4 en las moléculas de clase I siguiendo la fagocitosis de L. monocytogenes recombinante, se midió después de la incubación con células B3Z. B3Z es un hibridoma de célula T CD8+ inducible por lacZ específico para el epítope SL8 presentado en la molécula clase I murino Kb. La presentaciónrestringida por Clase I de células SL8 a B3Z da como resultado la inducción de síntesis de beta-galactosidasa por B3Z. La cantidad de beta-galactosidasa producida puede medirse por la hidrólisis del sustrato cromogénico CPRG y es una indicación de la cantidad de complejos SL8/Kb presentados en la superficie de células que presentan antígeno. De esta manera, el ensayo de presentación de antígeno in vitro es una medición directa de la habilidad de las cepas

L. monocytogenes recombinantes que utilizan cualquier proteína de fusión de antígeno heterólogo ActAN100 predeterminado para expresar y secretar la proteína de fusión de antígeno dentro de las células huésped infectadas, conduciendo a la presentación y procesamiento adecuado en las moléculas MHC y estimulación de linfocitos T específicos de antígeno (Dubensky, et al., Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2004/0228877).

Alternativamente, la habilidad de las cepas L. monocytogenes recombinantes que utilizan cualquier composición de antígeno heterólogo ActAN100 seleccionado para expresar y secretar la proteína de fusión de antígeno dentro de las células huésped infectadas puede medirse mediante el análisis de Western Blot de los lisatos de célula huésped infectada con L. monocytogenes recombinante, utilizando un anticuerpo que es específico para la pareja de fusión de región de terminal N ActAN100. El anticuerpo anti-ActA utilizado en este Ejemplo fue un anticuerpo policlonal de conejo elevado contra un péptido sintético (ATDSEDSSLNTDEWEEEK (SEQ ID NO: 143)) correspondiente a 18 aminoácidos de terminal N maduro de ActA (Mourrain, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

94: 10034-10039).

El siguiente regulador de lisis se utilizó para extraer las proteínas codificadas por L. monocytogenes que se habían expresado y secretado dentro de una célula huésped de mamífero, e.g., en el citosol de la célula huésped de mamífero. El regulador de lisis se preparó en un volumen total de 50 ml, y contuvo 2.5 ml de 1 M de Tris HCl, pH 6.8; 10 ml de 10% de dodecilsulfato de sodio; 5 ml de glicerol; 0.1 g. de azul bromofenol; y 5 ml de 1 M de ditiotreitol. La extracción fue con calentamiento a 100° por 5 minutos.

La respuesta inmune en ratones vacunados con las cepas L. monocytogenes recombinante se valoró como sigue. Los ensayos de elispot se utilizaron para valorar las respuestas inmunes que se habían generado en ratones inoculados con las construcciones de vacuna L. monocytogenes. En corto, los ratones Balb/c se inocularon con la cepa L. monocytogenes indicada (5 x 106 cfu). Después de una semana, se recolectaron los bazos, y los esplenocitos aislados (2 x 105 de esplenocitos) se incubaron durante la noche con o sin los péptidos indicados. Las incubaciones durante la noche se condujeron en cavidades revestidas con anticuerpo anti-interferona- inmovilizado. El anticuerpo inmovilizado sirvió para capturar cualquier IFN- secretado, permitiendo de ese modo la medición subsiguiente de IFN- secretado, y valoración de la respuesta inmune a la vacuna. Para observar el cuadro en general, las respuestas inmunes generadas en el ratón se visualizaron en los ensayos de expresión de IFN- de esplenocito in vitro. En la Figura 48, el grupo de péptidos abarcó la secuencia de aminoácidos de PSCA humano. En la Figura 50, los péptidos agregados fueron ya sea el grupo PSCA, el grupo de mesotelina, o un péptido único correspondiente a un epítope de la proteína listerial, p60. El péptido p60 fue p60217-225 (KYGVSVQDl(SEQ ID N0:144)).

En los ensayos Elispot, el grupo de péptido PSCA fue un grupo de 28 péptidos, en donde los 28 péptidos abarcaron la longitud de PSCA humano. Cada péptido fue un 15-mer, en donde los péptidos adyacentes se sobrepusieron entre sí por 11 aminoácidos. La concentración de cada péptido fue 1 microgramo/ml.

El grupo de péptido de mesotelina fue un grupo de 153 diferentes péptidos que abarcan la secuencia completa de Mesotelina humana, en donde los péptidos sucesivos se sobrepusieron por 11 aminoácidos. La concentración de cada péptido fue 1 microgramo/ml. Cada péptido fue un 15-mer.

EJEMPLO X. Construcción e Inmunogenicidad de cepas L. monocytogenes recombinantes que codifican Antígeno de Célula Germinal de Próstata (PSCA)

La construcción y la inmunogenicidad de L. monocytogenes recombinantes que contienen un casete de expresión que codifica una proteína de fusión basada en Antígeno de Célula Germinal de Próstata-ActAN100 (PSCA) es todavía un ejemplo no limitante adicional de la utilidad de las composiciones y los métodos establecidos en esta invención. Los Ejemplos describen la expresión y secreción de antígenos heterólogos de Listeria recombinante dentro de células huésped de mamífero infectadas, que conducen a una respuesta inmune celular específica para el antígeno.

El antígeno de célula germinal de próstata (PSCA) es un antígeno de superficie de célula asociado con el cáncer humano. Un número de secuencias PSCA y secuencias derivadas por PSCA, se muestran abajo. Lo que se describe es la secuencia de aminoácidos de PSCA optimizado por codón (optimizado por codón para expresión en Listeria monocytogenes), en donde el PSCA se suprimió en su secuencia de señal y la secuencia de GPI de anclaje; la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de ácido nucleico optimizada por codón; y la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión PSCA humano ActAN100, modificada para contener un péptido inmunogénico estándar (SIINFEKL (SEQ ID NO:142)). La secuencia de GPI de anclaje se refiere a una secuencia de aminoácidos que ocurre en la terminal C de PSCA para la modificación post-translacional mediante glicosilfosfatidilinositol (GPI).

Secuencia de aminoácidos de PSCA humano (SS & GPI en cursiva):

PSCA optimizado por codón, BamHI-SpeI delta SS, delta GPI (aminoácidos 18-101):

Translación de PSCA optimizado por codón BamHI-SpeI delta SS, delta GPI (GS y TS son sitios de restricción BamHI y SpeI, respectivamente);

ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL (secuencia pronosticada con base a la secuencia de ácido nucleico, el primer aminoácido es Valina). (La secuencia PSCA se encuentra subrayada:

ActAN100-hPSCA 18-101-SIINFEKL, (el primer aminoácido es metionina) (Secuencia actual expresada en Listeria monocytogenes cuando el primer aminoácido es el aminoácido de terminal amino (la secuencia PSCA se encuentra subrayada):

La Figura 45 describe la configuración esquemática del vector, ADN de plásmido pINT-ActAN100-BamHI-SpeI-MfeI-SIINFEKL. Este vector contiene un sitio attPP’, que media la integración específica de sitio en un ácido nucleico que contiene un sitio attBB’ correspondiente. El vector también contiene un promotor ActA, actA-N100, un sitio de clonación que contiene un número de sitios de restricción, y una secuencia SIINFEKL (SEQ ID NO:142). El vector también codifica los genes de resistencia antibiótica (ErmC y CAT), que se flanquean por sitios loxP, en donde los sitios loxP facilitan la eliminación catalizada por recombinasa Cre de los genes de resistencia antibiótica. La eliminación de estos genes es útil, por ejemplo, después de que el vector se ha integrado en un genoma bacteriano, y después del aislamiento de la bacteria con la integración exitosa.

La Figura 46 describe la configuración esquemática de construcciones moleculares de PSCA con una sobrecapa Kyte-Doolittle. Los diagramas incluyen los siguientes dominios, principalmente, secuencia de señal actA (actA SS); actA-N100; secuencia de señal PSCA; PSCA; la región de GPI de anclaje de PSCA, y SIINFEKL ((SEQ ID NO:142) abreviad como “SL8”). Como se indica en la Figura, “delta mitad SS, delta mitad GPI” se refiere a PSCA SS con la mitad de esta secuencia suprimida, y el PSCA GPI de anclaje con mitad de su secuencia suprimida. Los aminoácidos 1-9 de la secuencia de señal se suprimieron, mientras que los aminoácidos 112-123 de la GPI de anclaje se habían suprimido.

Lo siguiente se refiere a la terminología en la Figura 46. El diagrama identifica por separado ActA SS y ActA-N100. ActA-N100 incluye, dentro de ella, una secuencia de señal ActA. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal ActA no se duplicó en las construcciones, y la identificación separada de ActA SS y ActA-N100 es sólo por conveniencia. En este diagrama, la anotación PSCA significa PSCA de longitud completa, pero sin PSCA SS y sin PSCA GPI de anclaje. De esta manera, en donde el diagrama muestra que una construcción contiene tanto “SS” como “PSCA”, existe sólo una secuencia de señal PSCA en la construcción.

La Figura 47A describe la respuesta de una línea de célula T reportera (células B3Z) a péptidos presentados por las células dendríticas. La gráfica de barras a la izquierda demuestra que las proteínas de fusión ActA-N100-PSCA heterólogas codificadas por L. monocytogenes recombinante, se expresaron y secretaron dentro de las células dendríticas huésped infectadas, y de manera subsiguiente se procesaron y presentaron en las moléculas MHC por las

5 células dendríticas. Varios L. monocytogenes recombinantes se utilizaron para identificar las células DC2.4, como se indica en la Figura. Con la infección, L. monocytogenes recombinante expresó y secretó los polipéptidos dentro de las células DC2.4. Las células DC2.4 presentaron péptidos, en donde la detección de péptidos presentados fue a manera de una línea de hibridoma de célula T reportera (hibridoma de célula T B3Z). CRS-100 es una cepa L. monocytogenes con supresiones tanto en genes actA como inlB (Lm actAinlB). La cepa CRS-100 no se diseña

10 para expresar cualquier antígeno heterólogo, a pesar de que puede ser modificada para contener más mutaciones o para expresar los antígenos heterólogos.

Tabla 17. Cepas Listeria monocytogenes que expresan proteínas de fusión ActA-N100-PSCA

Cepa: Construcción Antecedente

BH137: pPL2_ActAN100-AH1A5-OVA CRS-100

CRS-100

BH419: p221_ActAN100_PSCA-1_SL8 CRS-100

BH470: p221_ActAN100_PSCA-1-100_SL8 CRS-100

BH472: p221_ActAN100_PSCA-10-110_SL8 CRS-100

BH474: p221_ActAN100_PSCA-16-122_SL8 CRS-100

BH476: p221_ActAN100_PSCA-16-100_SL8 CRS-100

15 La Figura 47A describe los resultados de los ensayos de célula T B3Z. Varias cepas L. monocytogenes (2 x 107 cfu) se incubaron por una hora con 100,000 de células DC2.4 a 37°, para permitir la infección de las células DC2.4. Después de una hora de incubación, se agregaron 100,000 células B3Z, junto con gentamicina a una concentración final de 0.1 mg/ml. El volumen final fue 0.2 ml/cavidad. La mezcla se incubó durante la noche, seguida por la recolección de todas las células por centrifugación, lisis de células, y ensayo de la beta-galactosidasa

20 expresada por la línea de célula T B3Z reportera. Los resultados fueron una función de un número de etapas, por ejemplo, expresión y secreción bacteriana, y la presentación de célula DC2.4 del péptido SL8 a manera de MHCClase I. Los resultados similares se encontraron con todas las L. monocytogenes recombinantes indicadas que codificaron el epítope SL8.

El Western blot (Figura 47B) demuestra que las células de macrófago J774 infectadas por L. monocytogenes 25 recombinante expresan y secretan las proteínas de fusión ActA-N100-PSCA heterólogas. El Western blot describe los resultados de infecciones L. monocytogenes recombinante de células J774. Los macrófagos J774 se infectaron con

L. monocytogenes recombinante, en donde la figura identifica cada una de las cepas L. monocytogenes recombinante. Las células J774 (1 x 106 células) se infectaron con L. monocytogenes (50 x 106 cfu), a una multiplicidad de infección de 50. La mezcla se incubó por 30 minutos, se lavó, después se complementó con

30 gentamicina y se incubó por 5-7 horas a 37°. Después de esta incubación, las células J774 se usaron con lisinas, utilizando regulador de lisis, a fin de liberar la proteína de fusión ActA-N100-PSCA expresada y secretada, mientras que se deja la bacteria intacta.

La Western blot demuestra que la construcción de delta GPI, delta SS se expresó y secretó de manera más eficaz (línea 6). Los dominios SS y GPI de anclaje contienen regiones de hidrofobicidad que pueden complicar la 35 secreción. La invención proporciona construcciones de antígeno suprimidas en dominios SS y GPI.

Tabla 18. Leyenda para la Figura 47B. Análisis Western Blot para expresión y secreción de proteínas de fusión ActA-N100-PSCA

Línea: Cepa Antígeno

1: hMeso26 ActAN100-hMesoSS, GPI

2: BH419 ActAN100-PSCAf_SL8

3: BH470 ActAN100-PSCA 1-100_SL8

4: BH472 ActAN100-PSCA 10-110_SL8

5: BH474 ActAN100-PSCA 16-122_SL8

6: BH476 ActAN100-PSCA 16-100_SL8

7: CRS-100 -

5 El peso molecular esperado del polipéptido expresado de la cepa L. monocytogenes BH419 (actA-N100longitud completa PSCA-SL8) es 24 kDa. El peso molecular esperado para el polipéptido expresado de L. monocytogenes BH476 (actA-N100-PSCA 16-100-SL8) es 20.3 kDa.

La cepa L. monocytogenes BH476 produjo los niveles más grandes de expresión y secreción como se demuestra por el gel, en donde el gel reveló la tintación densa de polipéptidos en un rango de peso molecular en la 10 proximidad del marcador de peso molecular de 19 kDa.

La Figura 48 describe las respuestas inmunes de célula T específica de PSCA inducido por vacuna enratones vacunados con varias cepas L. monocytogenes recombinantes que expresan proteínas de fusión ActA-N100-PSCA.

Los ratones Balb/c se inocularon con la cepa L. monocytogenes recombinante indicado. Después de una

15 semana, se recolectaron los bazos y los esplenocitos aislados se incubaron durante la noche con o sin los péptidos indicados, en ensayos Elispot. Las incubaciones estuvieron en la presencia o ausencia del grupo de péptido PSCA. Los resultados demuestran que L. monocytogenes recombinante que codifica el PSCA de longitud completa indujo a la respuesta inmune más baja, mientras que Lm-PSCA-SS-GPI (Lm-PSCA-16-100) indujo a la respuesta inmune más alta (Figura 48). Estos resultados demuestran que el grado de expresión y secreción de la proteína de fusión

20 ActA-N100-PSCA por L. monocytogenes recombinante dentro de las células huésped infectadas se correlaciona directamente con su inmunogenicidad en animales vacunados. Esta correlación puede observarse al comparar los Western blots con los resultados de Elispot.

EJEMPLO XI. Construcción e inmunogenicidad de cepas L. monocytogenes bivalente recombinante que codifican 25 el Antígeno de Célula Germinal de ActA-N100-Próstata (PSCA) y ActA-N100-Mesotelina.

Se conoce muy bien en la materia que los tumores seleccionados expresan varios antígenos que se relacionan al tumor, y que la inducción de respuestas inmunes celulares a más de uno de estos antígenos asociados por tumor puede mejorar la potencia de una vacuna de cáncer seleccionada. Esta descripción proporciona las composiciones y métodos para las cepas de vacuna L. monocytogenes recombinante que expresan y secretan más

30 de un antígeno heterólogo, en donde la vacunación conduce a la inducción de inmunidad celular en animales vacunados a cada uno de los antígenos heterólogos expresados. El Ejemplo XI describe, como un ejemplo no limitante, la utilidad de las composiciones y los métodos de las cepas L. monocytogenes bivalente recombinante que codifican dos proteínas de fusión de antígeno heterólogo ActAN100 distintas.

Las Figuras 49A y 49B describen una cepa de vacuna L. monocytogenes bivalente recombinante que expresa dos antígenos de cáncer humano diferentes, Mesotelina y PSCA, cada antígeno tomando la forma de una proteína de fusión ActA-N100. La utilidad se demostró por la inmunidad de célula T inducida, en donde la inmunidad de célula T se indujo contra cada antígeno expresado y secretado en animales vacunados con la vacuna bivalente.

El esquema mostrado en la Figura 49A muestra una primera proteína de fusión de actA-N100 y Mesotelina SSGPI, y una segunda proteína de fusión de actA-N100 y PSCASSGPI. El diagrama identifica el gen de internalina B L. monocytogenes (gen inlB) como el sitio de integración de un primer ácido nucleico que codifica la primera proteína de fusión, y el sitio tARNArg de L. monocytogenes como el sitio de integración de un segundo ácido nucleico que codifica la segunda proteína de fusión.

El Western blot (Figura 49B) demuestra la expresión y secreción en ambas proteínas de fusión, es decir, la actA-N100-mesotelina SSGPI y actA-N100-PSCA SSGPI, mediante cepas de vacuna L. monocytogenes bivalente recombinante en células de macrófago J774 infectadas. La cepa de vacuna L. monocytogenes bivalente recombinante (Lm cepa BH648) expresó y secretó tanto las proteínas de fusión ActA-N100 PSCA como Mesotelina en los macrófagos J774 infectados, como se demuestra por el Western blot (línea 3). La expresión de ActAN100-PSCA fue similar a aquella encontrada con la cepa L. monocytogenes monovalente recombinante que codifica sólo actA-N100-PSCA SSGPI (línea 2), mientras que la expresión de actA-N100-mesotelina fue similar a aquella encontrada con la cepa L. monocytogenes monovalente recombinante que codifica sólo actA-N100-mesotelina SSGPI (línea 4).

La Figura 50 describe la inmunización de ratones con L. monocytogenes monovalente recombinante que codifica sólo ActAN100-PSCA (BH476) o con L. monocytogenes bivalente recombinante que codifica las proteínas de fusión ActA-N100 tanto PSCA como Mesotelina (BH648). Las secuencias de PSCA y Mesotelina en estas construcciones son delta SS y delta GPI.

Los ratones Balb/c fueron inmunizados con la cepa de vacuna L. monocytogenes recombinante (5 x 106 cfu). Después de una semana, se recolectaron los bazos, y los esplenocitos aislados se incubaron durante la noche con o sin los péptidos indicados, en ensayos de Elispot.

Los ensayos de Elispot describen los resultados de inmunización con una de las dos cepas de vacuna L. monocytogenes diferentes. Los ratones Balb/c fueron inmunizados con la cepa L. monocytogenes monovalente recombinante BH476, la cual codificó sólo un antígeno de cáncer humano (PSCA), o con cepa L. monocytogenes bivalente recombinante BH648, la cual codificó dos antígenos de cáncer humano (PSCA y Mesotelina). Los resultados demuestran que la cepa L. monocytogenes monovalente recombinante estimuló una respuesta inmune contra PSCA, mientras que la cepa L. monocytogenes bivalente recombinante estimuló la respuesta inmune tanto contra PSCA como Mesotelina. Los resultados demuestran que la magnitud de inmunidad celular específica de PSCA producida en ratones inmunizados ya sea con cepas L. monocytogenes monovalentes o bivalentes recombinantes que expresan la proteína de fusión ActAN100-PSCA fueron los mismos, ilustrando de ese modo la utilidad de cepas de vacunas L. monocytogenes recombinante que contienen dos o más casetes de expresión de antígeno que codifican las proteínas de fusión de antígeno ActA-N100-heterólogo, como se aplica a cualquier antígeno heterólogo seleccionado deseado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que comprende:

(a) un promotor; y

(b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende:

(i)

un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152, y menos de los primeros 380 aminoácidos de SEQ ID NO:38 o SEQ IDNO:152; y

(ii)

un antígeno heterólogo.
2.

El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende al menos los primeros 59 a 125 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152.
3.

El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende los aminoácidos 1100 de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152.
4.

El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende la mutación en inactivación en, supresión de, o truncación previa a al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste de laregión de homología de cofilina (KKRR) (SEQ ID NO:23), y el dominio de enlace central de fosfolípido (KVFKKIKDAGKWVRDKI) (SEQ ID NO:20).
5.

El polinucleótido de la reivindicación 4, en donde el ActA modificado comprende todos los cuatro dominios ricos en prolina (FPPPP, FPPPP, FPPPP, FPPIP) (SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22) de ActA.
6.

El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado consiste de una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos a ActA-N100 (residuos 1-100 de SEQ ID NO:38).
7.

El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el promotor es un promotor actA.
8. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el antígeno heterólogo es de,

o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso.
9. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es mesotelina humana.
10.

El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es un derivado de mesotelina humana que comprende una supresión de su región de péptido de señal, su región de GPI de anclaje, o tanto su péptido de señal como región de GPI de anclaje.
11. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es PSCA humano.
12.

El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es un derivado de PSCA humano que comprende una supresión de:

(a)

parte o toda su región de péptido de señal;

(b)

su región de GPI de anclaje; o

(c)

su región de GPI de anclaje y parte o toda su región de péptido de señal.
13.

Un plásmido que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14.

Una bacteria Listeria que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15.

La bacteria Listeria de la reivindicación 14, la cual es Listeria monocytogenes.
16.

La bacteria Listeria de la reivindicación 15, la cual se atenúa para dispersión de célula a célula y/o entrada en células no fagocíticas.
17.

La bacteria Listeria de la reivindicación 16, la cual es un mutante de supresión actA o un mutante de inserción actA.
18. La bacteria Listeria de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la bacteria Listeria comprende el polinucleótido en su genoma.
19. La bacteria Listeria de la reivindicación 18, en donde el polinucleótido se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma, en donde la integración del polinucleótido:

(a)

interrumpe la expresión del gen de virulencia; o

(b)

interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia.
20. La bacteria Listeria de la reivindicación 19, en donde el gen de virulencia es gen dependiente de prfA, actA o inlB.
21. Una vacuna que comprende la bacteria Listeria de cualquiera de las reivindicaciones 14-20.

. 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212