DE60105647T2

DE60105647T2 - Pegylation von linker verbessert die antitumor-aktivität und verringert die toxizität von immunkonjugaten

Info

Publication number: DE60105647T2
Application number: DE60105647T
Authority: DE
Inventors: H. Ira PASTAN; Yasuo Tsutsumi; Masanori Onda; Satoshi Nagata; Byungkook Lee
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Government
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: EP1351709B8; ATE275979T1; WO2001095942A2; EP1351709A2; DK1351709T3; DE60105647D1; EP1351709B1; JP2004503512A; WO2001095942A3; CA2411967A1; AU2001269762C1; AU2001269762B2; AU6976201A; ES2228903T3

Description

QUERVERWEISE ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Anmeldungen 60/211331, die am 9. Juli 2000 eingereicht wurde, und 60/212804, die am 22. Juli 2000 eingereicht wurde. Die Inhalte beider Anmeldungen werden hier durch Bezugnahme für alle Zwecke einbezogen.
HINWEIS IN BEZUG AUF RECHTE BEZÜGLICH ERFINDUNGEN, DIE MIT STAATLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG GEMACHT WURDEN
Nicht anwendbar
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Rekombinante Immunokonjugate sind chimäre Moleküle, in denen ein Molekül mit einer gewünschten Funktion, "Effektormolekül" genannt, an ein Targeting-Molekül gekoppelt ist, das das Konjugat lenkt, typischerweise zu einer Zelle, die einen bestimmten Rezeptor oder ein Antigen exprimiert, das von dem Targeting-Molekül erkannt wird. Immunotoxine sind eine Form von Immunokonjugaten, in denen ein Toxin, das üblicherweise trunkiert ist, als Effektormolekül dient, und an einen Fv-Bereich eines Antikörpers oder eines Liganden gebunden ist, der als Target-Abschnitt dient. Viele verschiedene rekombinante Immunotoxine, in denen der Fv-Bereich eines Antikörpers gegen ein Tumor-spezifisches Antigen an die mutante 38-kDa-Form von Pseudomonas Exotoxin A (PE), die eine Deletion in ihrer Zellbindenden Domäne aufweist, gebunden ist, wurden hergestellt (Pastan (1997) Biochim. Biophys. Acta. 24: 1333; Kreitman et al. (1994) Blood 83: 426–434; Kreitman et al. (1999) Int. J. Cancer 81: 148–155; Brinkmann et al. (1991) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88: 8616–8620; Reiter et al. (1994) CancerRes. 54: 2714–2718; Reiter et al. (1994) J. Biol.Chem. 269: 18327–18331). Fünf dieser rekombinanten Immunotoxine (anti-Tac (Fv)-PE38, B3 (Fv)-PE38, B3 (dsFv)-PE38, RFB4 (dsFv)-PE38, und e23 (dsFv)-PE38) wurden jüngst in Phase-1-Tests an Patienten mit Krebs evaluiert (Kreitman et al. (1999) Blood 94: 3340–3348; Pai-Scherf et al. (1999) Clin. CancerRes. 5: 2311–2315). All diese Immunotoxine haben eine komplette Regression von menschlichen Krebs-Heterotransplantaten in Nacktmäusen bewirkt und werden relativ gut von Mäusen und Affen toleriert.
Anti-Tac(Fv)-PE38 (auch bekannt als "LMB-2"), das den Fv-Bereich des monoklonalen anti-human-Tac Antikörpers aufweist, der an die IL-2 Rezeptor-α-Untereinheit gekoppelt ist (auch als Tac, p55, oder CD25 bezeichnet) hat starke klinische Antworten bei bösartigen hämatologischen Erkrankungen gezeigt (Kreitman et al. (1999) Blood 94: 3340–3348). LMB-2 wurde 35 Patienten mit CD25+ Leukämie verabreicht, bei denen Standardtherapien und Zweitlinientherapien versagt hatten. Ein Patient mit Haarzell-Leukämie (HCL) erfuhr eine komplette Remission, die auch nach 20 Monaten noch anhielt, und sieben partielle Antworten wurden bei HCL, kutanem T-Zell Lymphom, chronischer lymphatischer Leukämie, Morbus Hodgkin, und adulter T-Zell Leukämie beobachtet. Siehe Kreitman et al., (2000) J. Clin Oncol 18(8): 1622–36.
LMB-2 zeigte jedoch Nebenwirkungen, die die Dosis des Immunotoxins, die Patienten verabreicht werden kann, limitierte. Diese toxischen Nebeneffekte werden zumindest teilweise durch die unspezifische Bindung von LMB-2 an normales Gewebe verursacht, weil eine der Dosis-limitierenden Toxizitäten eine Beschädigung von Leberzellen, die keine IL-2-Rezeptoren exprimieren, war (Kreitman und Pastan (1995) Semin.CancerBiol. 5: 297–306). Nebenwirkungen, die durch spezifische Bindung an normale CD25+ Zellen verursacht wurden, können ebenso aufgetreten sein. Zusätzlich wurden in einigen Patienten, die mit LMB-2 behandelt wurden, humane anti-PE-Antikörper und gelegentlich auch anti-Maus-Fv-Antikörper gebildet. Diese Immunogenität rekombinanter Immunotoxine mindert deren therapeutische Nützlichkeit. Wenn Nebeneffekte und Immunogenität verhindert werden können, sollte man in der Lage sein, mehr Immunotoxin zu verabreichen und bessere Ergebnisse bei bösartigen Erkrankungen des Menschen zu erzielen. Eine neue Strategie, die darauf abzielt, die Nebenwirkungen von LMB-2 zu reduzieren, in dem Mutationen in den Rückgrat-Abschnitt des Fv eingefügt werden, um seinen isoelektrischen Punkt zu erniedrigen, wurde kürzlich beschrieben (Onda et al. (1999) J. Immunol. 163: 6072–6077). Diese mutanten Immunotoxine sind weniger toxisch gegenüber Mäusen, was es erlaubt, höhere Dosen mit einem wesentlichen Anstieg der Antitumor-Aktivität zu verabreichen. Jedoch war Leberschaden immer noch die Dosis-limitierende Toxizität, und dieser Ansatz zielt nicht darauf ab, die Immunogenität zu reduzieren.
Diese rekombinanten Immunotoxine (MG: 63000) haben ein geringeres Molekulargewicht als konventionelle Antikörper-Toxin-Konjugate (MG: 190000). Während Moleküle mit einem geringeren Molekulargewicht eine erhöhte Verteilung in den Tumoren erfahren (wie auch in verschiedenen normalen Geweben, wie Niere oder Leber), werden sie auch schneller aus den Kreislauf entfernt als größere Moleküle. Vorklinische Studien haben gezeigtF die Antitumor-Aktivität verstärkt wird, wenn rekombinante Immunotoxine länger im Kreislauf verweilen (Pai et al. (1991) Cancer Res. 51: 2808–2812). Daher sollte bei leichtgewichtigen Immunotoxinen eine Erhöhung der Verweildauer im Blut zu einer Erhöhung ihrer Antitumor-Aktivität führen. Das Netto-Ergebnis würde eine Erhöhung ihrer therapeutischen Potenz sein.
Ein Weg, die Verweildauer von Proteinen im Blut zu erhöhen, ist es, sie mit Polyethylenglycol (PEG) zu modifizieren. Die chemische Modifikation von Proteinen mit PEG (PEGylierung) erhöht ihre Molekülgröße und ihre sterische Behinderung, die beide von dem an das Protein gebundenen PEG abhängig sind. Dies resultiert in einer Verbesserung der Plasma-Halbwertszeit und der proteolytischen Stabilität, und in einer Verminderung der Immunogenität und der Aufnahme durch die Leber (Chaffee et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 1643–1651; Pyatak et al.(1980) Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113–127). Es wurde berichtet, dass die PEGylierung von Interleukin-2 deren Antitumor-Wirksamkeit in vivo erhöht (Katre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487–1491), und PEGylierung eines aus dem monoklonalen Antikörper A7 abgeleiteten F(ab')2 hat dessen Konzentration im Tumor verbessert (Kitamura et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387–1394).
Wir haben bereits berichtet, dass ein PEGyliertes chimäres Toxin, das aus dem transformierenden Wachstumsfaktor α und PE zusammensetzt ist, eine Verbesserung seiner Verweildauer im Blut und eine Verminderung seiner Immunogenität zeigt, was in einer verstärkten in vivo-Antitumor-Wirkung und einer reduzieren in vivo-Toxizität resultiert (Wang et al. (1993) Cancer Res. 53: 4588-4594). Wir fanden jedoch auch, dass die PEGylierung mit einer unerwünschten erheblichen Einbuße der cytotoxischen Aktivität gegenüber den Targetzellen einherging. Anders als die PEGylierung von Enzymen, die gegenüber kleinen Substraten wirken, kann die PEGylierung von rekombinanten Immunotoxinen eine Verminderung ihrer Aktivität verursachen, und zwar auf Grund des Verlusts der Antigenbindung, der Translokation ins Cytosol, oder der ADP-Ribosylierungs-Aktivität, weil diese Schritte auf makromolekularen Interaktionen basieren, die durch das gebundene PEG leicht sterisch behindert werden. In den meisten Fällen ist die PEGylierung von Proteinen unspezifisch und gegen alle Lysinreste im Protein gerichtet, von denen einige in oder in der Nähe der aktiven Stelle sein können. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurde eine ortsspezifische PEGylierung von mutanten PE-Molekülen, die so verändert worden waren, dass sie ein oder zwei Cysteinreste auf der Oberfläche des PE aufwiesen, versucht (Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 13398–13404; Kuan et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7610–7616). Für die Bindung des PEG an diese Reste wurde freie Thiol-Chemie verwendet. Dieser Ansatz stellte sich als nicht erfolgreich heraus, da er nur eine geringe Ausbeute an PEGyliertem Immunotoxin lieferte und einen signifikanten Verlust der Aktivität brachte.
Aus diesem Grund gibt es in der Technik einen Bedarf für Immunotoxine und andere Immunokonjugate mit reduzierter Toxizität bei gleichzeitigem Erhalt der Antitumor-Aktivität
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die ortsgerichtete PEGylierung von Immunokonjugaten, einschließlich Immunotoxinen. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung einen neuen Ansatz zur Modifikation eines Connectormoleküls, das den Toxin-Abschnitt an den Target-Abschnitt eines Immunotoxins bindet, mit Polyethylenglycol (PEG). In einigen Aspekten der Erfindung wird eine Mutante des interessierenden Immunotoxins hergestellt, in der ein oder mehrere Cysteine in einen Peptid-Connector eingbaut werden, der den Antikörper an das Toxin bindet, und die Mutante wird dann mit PEG-Maleimid modifiziert. Das PEGylierte Immunotoxin hat eine vergleichbare spezifische in vitro-Cytotoxizität gegen Tumorzellen, aber andere Eigenschaften einschließlich Stabilität, Plasma-Halbwertszeit, Antitumor-Aktivität, Immunogenität und unspezifischer Toxizität sind stark verbessert.
In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen gerichtet, die einen Antikörper oder ein Fragment desselben, der die Fähigkeit, Antigene zu erkennen, beibehält, enthalten, und die über ein Connectormolekül mit einem Toxin verbunden sind, wobei das Connectormolekül ein oder mehrere Polyethylenglycol-Moleküle aufweist. In einer Ausführungsform ist das Connectormolekül ein Peptid. In einer anderen Ausführungsform ist das Toxin das Pseudomonas Exotoxin (PE). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Toxin ein Abschnitt des Pseudomonas Exotoxins, der ADP-ribosylierende Aktivität beibehält, vorzugsweise ein 38 kDA-Fragment (PE38). In einer weiteren anderen Ausführungsform ist der Antikörper-Bereich des Immunotoxins ein einkettiges FV-Fragment des monoklonalen anti-human Tac Antikörpers. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Immunotoxin anti-Tac (Fv)- PE38 (d.h. LMB-2).
Die vorliegende Erfindung stellt überdies ein Verfahren zur Erhöhung der Antitumor-Aktivität eines Immunotoxins mit einem Target-Abschnitt und einem Toxin-Abschnitt, die durch ein Connectormolekül miteinander verbunden sind, bereit, wobei besagte Methode die kovalente Bindung eines Polyethylenglycol-Moleküls an das besagte Connectormolekül umfasst. Der Toxin- Abschnitt kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Pseudomonas Exotoxin (PE) oder einem Fragment oder einer Mutante davon mit erhaltener cytatoxischer Aktivität, Diphtherietoxin oder einem Fragment oder einer Mutante davon mit erhaltener cytotoxischer Aktivität, Rizin, Saponin, Gelonin, Ribosom-Inaktivierendem Protein, Abrin und Botulinum A-F besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Toxin ein Pseudomonas Exotoxin (PE). In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Toxin ein 38 kDa-Fragment des Pseudomonas Exotoxin (PE38). In noch einer anderen Ausführungsform ist der Antikörper-Bereich des Immunotoxins ein einkettiges FV- Fragment des monoklonalen anti-human Tac Antikörpers. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Immunotoxin anti-Tac (Fv) PE38 (d.h. LMB-2).
Insbesondere stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die ein Targeting-Molekül aufweisen, das über ein Connectormolekül an ein Effektormolekül gekoppelt ist, wobei das Connectormolekül ein oder mehrere Polyethylenglycol-Moleküle (PEG) aufweist. Das Targeting-Molekül kann aus einem Liganden, einem Antikörper und einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment die Fähigkeit, Antigene zu erkennen, beibehält, ausgewählt werden. Der Antikörper oder dessen Fragment, welches die Fähigkeit, Antigene zu erkennen, beibehält, kann die IL-2-Rezeptor-α-Untereinheit spezifisch erkennen. In einigen Ausführungsformen ist das Effektormolekül ein Toxin, und in bevorzugten Ausführugsformen Pseudomonas Exotoxin oder ein Bereich desselben, der die ADP-ribosylierende Aktivität beibehält ("PE"). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das PE PE38.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Connectormolekül ein Peptid. Während das Peptid 4 – 100 Aminosäuren lang sein kann und bevorzugt kürzer als ungefähr 50 Aminosäuren ist, kann in bevorzugten Ausführungsformen das Connectormolekül ASGGPE (SEQ ID NO: 1) sein, das durch ortsspezifische Mutagenese so modifiziert wurde, dass es ein Cystein enthält, wie in ASGCGPE (SEQ ID NO: 2) und ASGCCGPE (SEQ ID NO: 3), oder es kann z.B. ASCGSGCPE (SEQ ID NO: 4), KASGKKYGCKKGPE (SEQ ID NO: 5), ASCGTTGCPE (SEQ ID NO: 8), oder KGGGCAGGPE (SEQ ID NO: 6) sein.
Das PEG-Molekül wird an Stelle einer reaktiven Gruppe an einen Aminosäurerest des Connectormoleküls substituiert. Das PEG-Molekül kann ein Molekulargewicht zwischen 1 und 100 kD haben, bevorzugt hat es ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 3 kD und 50 kD, und noch bevorzugter hat es einen Molekulargewicht zwischen ungefähr 5 kD und ungefähr 20 kD. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting-Molekül ein Antikörper gegen die IL-2-Rezeptor-α-Untereinheit, der als anti-Tac bekannt ist, wobei das besagte Effektormolekül PE38 und das besagte Connectormolekül ASGCGPE (SEQ ID NO: 2) ist.
In einer Gruppe von Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die die oben genannten Zusammensetzungen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger aufweisen.
In einer anderen Gruppe von Ausführungsformen stellt die Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Antitumor-Aktivität eines Immunotoxins mit einem Target-Abschnitt und einem Toxin-Abschnitt, die über ein Connectormolekül verbunden sind, bereit, wobei besagte Methode die kovalente Bindung eines Polyethylenglycol-Moleküls an das besagte Connectormolekül umfasst. Zwei oder mehr Reste des besagten Connectormoleküls können mit PEG-Molekülen verbunden sein (das bedeutet, dass jeder Rest eigenständig mit einem PEG-Molekül verbunden ist, das sich von dem PEG-Molekül unterscheidet, mit welchem der andere Reste verbunden ist). Das Targeting-Molekül kann ausgewählt werden aus einem Liganden, einem Antikörper, und einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment die Fähigkeit, Antigene zu erkennen, beibehält. In einigen bevorzugten Ausführungsformen erkennt der Antikörper oder dessen Fragment spezifisch die IL-2-Rezeptor-α-Untereinheit. Das Effektormolekül kann ein Toxin sein; insbesondere kann der Efftektor ein Pseudomonas Exotoxin (PE) oder ein Abschnitt desselben sein, der die ADP-ribosylierende Aktivität beibehält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das PE PE38.
Das Connectormolekül kann ein Peptid sein. Insbesondere kann das Connectormolekül eines der folgenden Peptide sein, obwohl die Position des Cysteins auf Wunsch verändert werden kann: ASGCGPE (SEQ ID NO: 2), ASGCCGPE (SEQ ID NO: 3), ASCGSGCPE (SEQ ID NO: 4), KASGKKYGCKKGPE (SEQ ID NO: 5), ASCGTTGCPE (SEQ ID NO: 8), und KGGGCAGGPE (SEQ ID NO: 6).
Die Immunokonjugate der Erfindung werden durch Substitution einer reaktiven Gruppe eines oder mehrerer Aminosäurereste des Connectormoleküls durch ein PEG-Molekül PEGyliert. Das PEG-Molekül kann ein Molekulargewicht (MG) zwischen 1 und 100 kD haben, hat typischerweise ein MG zwischen ungefähr 3 kD und ungefähr 50 kD, und hat bevorzugterweise ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 5 kD und ungefähr 20 kD.
Das Effektormolekül kann ein Cytotoxin, ein Marker, ein Radionuklid, ein detektierbarer Marker, ein Arzneistoff, ein Liposom, eine Nucleinsäure, ein rekombinantes Virus, ein Glycoprotein, ein Ligand und/oder ein Antikörper sein. Das Cytotoxin kann Pseudomonas Exotoxin (PE) oder ein Fragment oder eine Mutante davon mit erhaltener cytotoxischer Aktivität, Diphtherietoxin oder ein Fragment oder eine Mutante davon mit erhaltener cytotoxischer Aktivität, Rizin, Saponin, Gelonin, Ribosom-Inaktivierendes Protein Abrin oder ein Botulinum Toxin A-F sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Target-Bereich ein anti-CD35 Antikörper, der als anti-Tac bekannt ist, das Effektormolekül ist PE 38, und das Connectormolekül ist ASGCGPE (SEQ ID NO: 2).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1(A) Schematische Darstellung des mutanten LMB-2 (anti-Tac (Fv) PE38) mit einem Cystein im Connector. Die Positionen der Aminosäuren, die sich in die PE-Sequenzen erstrecken, sind nummeriert. Die Aminosäuresequenz des Connectors (C) des mutanten LMB-2 (cysl-LMB-2) wurde von ASGGPE (SEQ ID NO:1) nach ASGCGPE (SEQ ID NO: 2) geändert. VH bezieht sich auf das schwere Fragment des anti-Tac Antikörpers; L repräsentiert den Peptid-Linker (GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 7); VL bezieht sich auf das leichte Fragment; C repräsentiert den Connector; II ist die PE-Domäne II; Ib ist die PE-Domäne Ib; und III ist die PE-Domäne III.
(B) ortsspezifische PEGylierung eines Cysteinrestes im Connector der LMB-2-Mutante. Cys 1-LMB-2 wird ortsspezifisch über die Ausbildung einer Thioether-Bindung zwischen einer freien Thiolgruppe im Connector der LMB-2 -Mutante und dem Maleimid an einem Ende der PEG-Kette mit PEG verbunden.
2 Eigenschaften der LMB-2 -Moleküle
(A) SDS-PAGE-Analyse PEGylierten LMB-2 s. SDS-PAGE wurde under nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Bahn M zeigt die Molekulargewichts-Standards, die, von oben nach unten gesehen, die Molekulargewichte 111000, 73000, 47500, 33900, 28800, und 20500 darstellen; Bahnen 1, 2, 3 und 4 entsprechen LMB-2 , cysl-LMB-2 , PEG5K-LMB-2 bzw. PEG20K-LMB-2.
(B) Spezifische in vitro-Cytotoxizität verschiedener Formen des LMB-2 gegenüber ATac4-Zellen. Verschiedene LMB-2 wurden mit 0.2% BSA in DPBS verdünnt. ATac-4-Zellen wurden 24 h vor Hinzufügung von LMB-2
cysl LMB-2
PEG5K-LMB-2
PEG20K-LMB-2
mit 2.0 × 10⁴ Zellen/Well in 96-Well-Platten ausgesät, und bei 37° C 24 h damit inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Messung der Inhibition der ³H-Leucin-Aufnahme getestet.
3 Stabilität von PEGylierten LMB-2 in Mausserum. Die Stabilität von LMB-2
cysl-LMB-2
PEG5K-LMB-2
und PEG20K-LMB-2
wurde durch Inkubation bei 10pg/ml und 37° C in Mausserum weiblicher BALB/c-Mäuse (50 μl des Immunotoxins (40μg/ml) + 150 μl Mausserum) bestimmt. In einem Cytotoxizitäts-Assay wurde die Menge des verbliebenen aktiven Immunotoxins nach verschiedenen Inkubationszeiten bestimmt
4 Antitumor-Effekte PEGylierter LMB-2 auf solide ATac-4-Tumoren. ATac-4-Zellen (2 × 10⁶) wurden an Tag 0 subkutan in Nacktmäuse eingeimpft. Beginnend an Tag 4 wurden die Mäuse mit intravenösen Immunotoxin-Injektionen an den Tagen 4, 6 und 8 behandelt. Gruppen von fünf Mäusen wurden mit jeder Dosis QOD × 3 (jeden zweiten Tag, insgesamt drei Dosen) bei jedem Dosis-Niveau behandelt. (A) LMB-2 , (B) cysl-LMB-2 , (C) PEG5K-LMB-2 , (D) PEG20K-LMB-2 . Die folgenden Symbole wurden verwendet:
nur Lösungsmittel;
0.100 mg/kg;
0.050 mg/kg; Δ 0.025 mg/kg;
0.013 mg/kg; ♦ 0.006 mg/kg;
PEGSK 0.5 mg/kg; ♢ PEG20K 0.5 mg/kg;
5 Pharmakokinetik PEGylierter LMB-2 in Mäusen. Normalen weiblichen BALB/c-Mäuse wurde intravenös 2μg LMB-2
cysl-LMB-2
PEG5K-LMB-2
bzw. PEG20K-LMB-2
injiziert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Blutproben genommen. Der Immunotoxin-Titer wurde mit einem Bioassay gemessen, in welchem verdünnte Serumproben mit Atac-4-Zellen inkubiert wurden, wobei der Fähigkeit der Serumproben zur Inhibition der Proteinsynthese gemessen wurde. Für jedes Immunotoxin wurde eine Standard-Kurve erstellt. Gruppen zu jeweils vier Mäusen wurden verwendet. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.
6 IgG-Antworten von Mäusen auf PEGylierte LMB-2 s. Mäusen in Fünfergruppen wurde LMB-2
cysl-LMB-2
PEG5K-LMB-2
und PEG20K-LMB-2
in Dosen von 4μg/Maus oder 40μg/Maus in PBS mit 0.2% Mausserum-Albumin (MSA) intraperitoneal injiziert. Zwei Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die Mäuse erneut mit dem jeweiligen Antigen immunisiert. Die spezifischen IgG-Titer wurden mittels ELISA an Tag 21 bestimmt.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. EINLEITUNG
Überraschenderweise wurde entdeckt, dass die PEGylierung des Linker- oder Connectorbereichs eines Immunotoxinss die Antitumor-Aktivität des Immunotoxins erhöht, während es gleichzeitig seine Toxizität und Immunogenität erniedrigt. Die Erfindung stellt daher einen signifikanten Fortschritt in diesem Bereich dar, in dem sie ein Mittel zur Vergrößerung des therapeutischen Fensters von Immunotoxinen liefert. Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar, weil nicht gewusst werden konnte, ob die PEGylierung des Linkers mit der Faltung oder der Aktivität des Immunotoxins und, insbesondere, mit der Funktion des Target- oder des Toxin-Abschnitts interferieren würde.
Noch überraschender war es, dass entdeckt wurde, dass Polyethylenglycol-Moleküle sowohl kleinen als auch großen Molekulargewichts (MG) ohne schädlichen Einfluss auf die Aktivität an den Linker-Bereich eines Immunotoxins gebunden werden können. Bis jetzt war die Lehre aus dem Stand der Technik die, dass die Aktivität PEGylierter Proteine mit zunehmendem Molekulargewicht des gebundenen PEG abnimmt, da die sterische Behinderung durch das gebundene PEG mit zunehmender Länge der PEG-Kette zunimmt (Tsutsumi et al. (1996) Br. J. Cancer74:1090–1095). Unsere Studien zeigten jedoch, dass ein Immunotoxin, das mit einer 20 kD-Form des PEG PEGyliert wurde, fast die identische Aktivität hatte wie dasselbe Immunotoxin, das mit einer 5 kD-Form PEGyliert wurde. Die PEGylierung des Linkers erlaubt es so, dass das Immunotoxin mit einem PEG desjenigen Molekulargewichts PEGyliert wird, das dem Konstrukt das von dem jeweiligen Arzt gewünschte Ausmaß an Stabilität und Serum-Zirkulationszeit verleiht, ohne den Verlust an Aktivität, von dem bislang gedacht wurde, dass er mit höherer molekulargewichtigen Formen des PEG einhergeht.
Basierend auf den mit diesem Immunotoxin erhaltenen Ergebnissen wird erwartet, dass Targetmoleküle, die an Effektormoleküle gebunden sind, bei denen es sich nicht um Toxine handelt, wie z.B. Arzneistoffe und Metallchelate, in ähnlicher Weise verbesserte therapeutische Wirkungen zeigen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Linker, an den das PEG gebunden ist, ein Peptid, bevorzugt mit einer Länge von ungefähr 3 bis ungefähr 50 Aminosäuren, wobei ungefähr 6 bis ungefähr 20 Aminosäuren besonders bevorzugt sind. Eine Anzahl solcher Linker-Peptide sind aus dem Stand der Technik bekannt und für die Verwendung in der Erfindung geeignet. Der Linker kann auf einfache Weise mit PEG verbunden werden, in dem ein Cystein an einer gewünschten Stelle in den Linker eigefügt wird, was die Bindung eines PEG-Derivats wie z.B. PEG-Maleimid mittels Thiol-Chemie ermöglicht. Es können jedoch auch reaktive Stellen anderer Aminosäuren verwendet werden, um geeignete PEG-Derivate an den Linker zu binden, so wie es weiter unten beschrieben wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird PEG an einen einzelnen Aminosäurerest im Linker gebunden; jedoch können, wenn gewünscht, zwei oder mehr Reste des Linkers PEGyliert werden. Solche Konstrukte sollten z.B. mit Hilfe der Assays, die in den Beispielen dargelegt sind, getestet werden, um sicherzustellen, dass solche multiplen PEGylierungen das Aktivitätsprofil des Immunotoxins (d. h. seine Serum-Zirkulationszeit, die Fähigkeit, Targetzellen zu binden und zu töten, u. ä.) nicht nachteilig beeinflussen.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung auf Verbindungen gerichtet, in denen ein Linker, der das Effektormolekül und die Target-Abschnitte eines Immunokonjugats verbindet, PEGyliert ist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen mit Immunotoxinen bereit, in welchen der Connector, der den Target-Abschnitt an das Toxin bindet, auf ortsspezifische Weise PEGyliert ist. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf Verfahren zur Erhöhung der Antitumor-Aktivität eines Immunotoxins gerichtet, die die Bindung eines oder mehrerer Polyethylenglycol-Moleküle an den Connector, der das Toxin an den Target-Abschnitt bindet, umfassen
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einfügung einer Mutation in den Connector-Bereich, der den Antikörper oder das Antikörperfragment mit dem interessierenden Toxin verbindet, zur Verfügung, typischerweise zur Einfügung eines Cysteinrestes. Der Cysteinrest oder andere eingefügte Reste können dann für die ortsspezifische PEGylierung des Connector-Bereichs verwendet werden. Im Fall der Einfügung eines Cysteinrestes kann die PEGylierung auf einfache Weise durch Thiol-Chemie bewerkstelligt werden. Die Chemismen für die Bewerkstelligung der PEGylierung werden hier ausführlicher diskutiert.
In einer Reihe von Ausführungsformen ist das Toxin, welches in Immunotoxinen der Erfindung verwendet wird, Pseudomonas Exotoxin A (PE). Typischerweise wurden PE-Moleküle, die in solchen Immunotoxinen verwendet werden, modifiziert, um die unspezifische Bindung und Toxizität zu reduzieren oder zu eliminieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Toxin ein 38kDa großes, cytotoxisches, trunkiertes Fragment des Pseudomonas Exotoxin, das als PE38 bekannt ist. In einer anderen Reihe von Ausführungsformen ist der Antikörper-Bereich des Immunotoxins ein einkettiges FV-Fragment eines monoklonalen antihuman Tac Antikörpers gegen die IL-2 Rezeptor-α-Untereinheit (auch als Tac bekannt). In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Immunotoxin anti-Tac (Fv) PE38, auch als LMB-2 bekannt.
Obwohl dies besonders bevorzugte Ausführungsformen sind, sind zahlreiche von Krebszellen exprimierte Antigene aus dem Stand der Technik bekannt, wie auch Antikörper, die spezifisch an solche Krebs-Antigene binden. Weiterhin sind Immunokonjugate und Immunotoxine, die diese Antikörper verwenden, ebenso aus dem Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung zieht insbesondere in Erwägung, dass die Stabilität und die Serum-Zirkulationszeit dieser Immunokonjugate und Immunotoxine durch PEGylierung der Linker-Abschnitte verbessert werden können.
II. DEFINITIONEN
Einheiten, Präfixe und Symbole sind in der vom Systeme International de Unites (SI) akzeptierten Form wiedergegeben. Numerische Bereiche schließen die Zahlen, die den Bereich definieren, ein. Wenn nicht anders angegeben, sind Nucleinsäuren von links nach rechts in 5' – 3' – Richtung dargestellt, Aminosäuresequenzen sind von links nach rechts in Richtung vom Aminoende zum Carboxyende dargestellt. Die hier verwendeten Überschriften sind keine Beschränkungen auf die verschiedenen Aspekte oder Ausführungsformen der Erfindung, die durch Bezugnahme auf die Beschreibung in ihrer Gesamtheit erhalten werden können. Entsprechend werden die Begriffe, die unmittelbar im Anschluss hieran definiert werden, ausführlicher durch Bezugnahme auf die Beschreibung in ihrer Gesamtheit definiert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, bezieht sich der Begriff "Antikörper" oder "Antikörper Fragment(e)" auf polyklonale und monoklonale Antikörper, ein vollständiges Immunglobulin oder einen vollständigen Antikörper oder jedes funktionelle Fragment eines Immunglobulin-Moleküls, das an dass Target-Antigen bindet, und wird weiter unten definiert. Beispiele für solch funktionelle Entitäten schließen komplette Antikörper-Moleküle, Antikörperfragmente, wie z.B. Fv, einkettige Fv, die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), VL (variable Domäne der leichten Kette), VH (variable Domäne der schweren Kette), Fab, F(ab)2' und alle Kombinationen dieser oder anderer. funktioneller Bereiche eines Immunglobulin-Peptids, die in der Lage sind, ein Target-Antigen zu binden, ein, sind aber nicht darauf limitiert (siehe z.B. Pierce Catalog und Handbook, 1994–1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Kuby, Immunology, 3rdEd., W. N. Freeman & Co., New York (1997)).
Ein gegenüber einem bestimmten Antigen immunologisch aktiver Antikörper kann mittels rekombinanter Methoden, wie z.B. der Selektion aus Libraries mit rekombinanten Antikörpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren, siehe z.B. Huse et al., Science 246: 1275–1281(1989); Ward et al., Nature 341: 544–546(1989); und Vaughan et al., Nature Biotech.14: 309–314 (1996), oder durch Immunisierung eines Tieres mit dem Antigen oder mit der DNA, die für das Antigen codiert, hergestellt werden.
Typischerweise hat ein Immunglobulin eine schwere und eine leichte Kette. Jede schwere und leichte Kette enthält eine konstante und eine variable Region (die Regionen werden auch als "Domänen" bekannt). Die leichten und schweren variablen Domänen enthalten eine "Rückgrat"-Region, die durch drei hypervariable Regionen unterbrochen ist, auch als "kamplementaritätsbestimmende Regionen" oder "CDR" bekannt. Das Ausmaß der "Rückgrat"-Region und der CDR wurde bereits bestimmt (siehe Kabat, E., etal., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Department of Health und Human Services, (1987). Die Sequenzen der "Rückgrat"-Regionen verschiedener leichter oder schwerer Ketten sind innerhalb einer Spezies relativ konserviert. Die "Rückgrat"-Region eines Antikörpers, d. h. die Kombination der "Rückgrat"-Regionen der einzelnen leichten und schweren Ketten, dient dazu, die CDR im dreidimensionalen Raum anzuordnen und auszurichten.
Antikörper existieren z.B. als intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von charakterisierten Fragmenten, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen produziert werden. So verdaut Pepsin z.B. einen Antikörper unterhalb der Disulfidbrücken im Gelenkbereich, und bildet so F (ab)'2, ein Dimer aus Fab, wobei es sich um eine leichte Kette handelt, die über eine Disulfidbrücke an V_H-C_H1 gebunden ist. F(ab)'2 kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbrücke im Gelenkbereich aufzubrechen, und so das F (ab)'2 Dimer in ein Fab' Monomer umzuwandeln. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil des Gelenkbereichs (siehe Fundamental Immunology, 3rd Ed., W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)). Während verschiedene Antikörperfragmente in Bezug auf die Verdauung eines intakten Antikörpers definiert werden, wird der Fachmann wissen, dass solche Fragmente de novo synthetisiert werden können, entweder chemisch oder durch Verwendung rekombinanter DNA-Methoden. Daher schließt der Begriff Antikörper, so wie er hier verwendet wird, auch Antikörperfragmente ein, die entweder durch die Modifikation ganzer Antikörper erzeugt werden, oder solche, die de novo mit Hilfe rekombinanter DNA-Methoden synthetisiert werden. Überdies schließt im Kontext der vorliegenden Erfindung der Begriff "Antikörper" auch gentechnologisch hergestellte Formen wie z.B. chimäre Antikörper (zum Beispiel humanisierte murine Antikörper), heterokonjugate Antikörper (d. h. bispezifische Antikörper) und rekombinante einkettige Fv-Fragmente (scFv), disulfid-stabilisierte (dsFv) Fv-Fragmente (siehe US-Patentanmeldung 08/077252) oder pFv-Fragmente (siehe vorläufige US-Anmeldungen 60/042350 und 60/048848) ein.
Der Begriff "einkettiger Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper dessen genetische Informationen, die für die funktionalen Fragmente des Antikörpers codieren, auf einem einzelnen zusammenhängenden DNA-Abschnitt angeordnet sind. Für eine gründliche Beschreibung von einkettigen Antikörpern siehe z.B. Bire et al., (1988) Science 242: 423; und Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879.
"Tac" bezieht sich auf die IL-2 Rezeptor α-Untereinheit. Antikörper, die spezifisch an diese Untereinheit binden, werden als "anti-Tac"-Antikörper bezeichnet.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "chimäre Proteine" auf Proteine, in denen zwei oder mehr Moleküle, die in ihrem nativen Status getrennt voneinander existieren, miteinander verbunden sind, um ein einzelnes Molekül mit der gewünschten Funktionalität all seiner einzelnen Moleküle zu bilden.
Der Begriff "Immunokonjugat" beinhaltet eine Bezugnahme auf eine kovalente Verbindung eines Effektormoleküls mit einem Targetmolekül, entweder direkt oder durch ein Connector- oder Linkermolekül. In vielen der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Effektormolekül ein Toxin; Immunokonjugate, die ein Toxinmolekül beinhalten, werden genauer durch den Begriff "Immunotoxin" bezeichnet.
Der Begriff "Abschnitt" wird verwendet, um sich auf einen Bereiche eines Moleküls zu beziehen, der eine gewünschte Funktionalität aufweist. So kann in einem Immunokonjugat der Target-Bereich als Target-Abschnitt bezeichnet werden, und in einem Immunotoxin kann das aufgenommene Toxinmolekül als ein Toxin-Abschnitt bezeichnet werden.
Ein "therapeutischer Abschnitt" ist der Bereich eines Immunokonjugats, der als therapeutisches Agens dienen soll.
Der Begriff "therapeutisches Agens" schließt jegliche Anzahl von derzeit bekannten oder später entwickelten Verbindungen, die als anti-neoplastische Wirkstoffe, entzündungshemmende Wirkstoffe, Cytokine, Desinfektionsmittel, Enzymaktivatoren- oder Inhibitoren, Allosterische Modifikatoren, Antibiotika oder andere Agenzien agieren und verabreicht werden, um eine gewünschte therapeutische Wirkung in einem Patienten zu erzeugen. Das therapeutische Agens kann auch ein Toxin sein, wobei die gewünschte therapeutische Wirkung zum Beispiel das Abtöten einer Krebszelle ist. Es kann ferner z.B. ein Radioisotop sein, häufig ein Metallchelat, welches über eine Standard-Bindung aus dem Stand der Technik mit dem Linker verbunden ist.
Ein "detektierbar Marker" bezeichnet im Hinblick auf ein Immunokonjugat einen Bereich des Immunokonjugats, der die Eigenschaft hat, seine Anwesenheit detektierbar zumachen. Zum Beispiel kann das Immunokonjugat mit einem radioaktiven Isotop markiert sein, was es erlaubt, dass Zellen, in denen das Immunokonjugat vorliegt, in immunohistochemischen Assays detektiert werden.
Die Begriffe "Effektor-Abschnitt" oder "Effektormolekül" bezeichnen den Bereich eines Immunokonjugats, der eine Wirkung auf eine Zelle, die durch den Target-Abschnitt gebunden wurde, haben soll, oder die Anwesenheit des Immunokonjugats identifizieren soll. Daher kann der Effektor-Abschnitt z.B. ein therapeutischer Abschnitt, ein Toxin, ein Radiomarker oder ein fluoreszierernder Marker sein.
"Immunotoxine" sind chimäre Proteine in denen typischerweise ein "Toxin" direkt oder über einen Linker an einen "Target-Abschnitt" gekoppelt ist, um wirksame Zelltyp-spezifische abtötende Reagenzien herzustellen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Target-Abschnitt" auf einen Bereich eines Immunotoxins, der in der Lage ist, das Toxin oder den Toxin-Abschnitt zu einer interessierenden Zelle oder einem interessierenden Gewebe zu leiten, üblicherweise durch spezifische Bindung an sein korrespondierendes Target (z.B. ein Rezeptor auf einer Zelloberfläche). Beispiele von "Target-Abschnitten" schließen Rezeptorbindende Liganden und Antikörper oder Antikörperfragmente, die die Fähigkeit, Antigene zu erkennen, beibehalten, ein, wie z.B. ein scFv, ein dsFv, ein Fab, oder ein F(ab')2. Daher wird dort, wo der "Target-Abschnitt" z.B. einen Antikörper ist, das Immunotoxin spezifisch an Zellen binden, die das Epitop tragen, gegen welches der Antikörper gerichtet ist. In dieser Schrift werden die Begriffe "Target-Abschnitt" und "Targetmolekül" austauschbar verwendet.
"Toxine" sind typischerweise cytotoxische Enzyme, üblicherweise aus Pflanzen und Bakterien, und schließen Abrin, Ricin, Pseudomonas Exotoxin A (PE), Diphtherietoxin (DT), Botulinum Toxin, und modifizierte und mutierte Formen dieser Toxine, die cytotoxische Eigenschaften beibehalten, wenn sie gegen interessierende Zellen gerichtet werden, ein. Zum Beispiel sind PE und DT höchst toxische Wirkstoffe, die üblicherweise durch Lebervergiftung zum Tode führen. PE und DT können jedoch zu einer Form für die Verwendung in Immunotoxinen modifiziert werden, in dem die native Target-Komponente des Toxins (zum Beispiel die Domäne la des PE oder die B-Kette des DT) entfernt und durch einen anderen Target-Abschnitt ersetzt wird, wie z.B. einen Antikörper. Ein "toxischer Abschnitt" ist der Bereich eines Immunotoxin, der für die Cytotoxizität des gesamten Molekül verantwortlich ist.
Immunotoxine dienen als starke, zellabtötende Agenzien, in dem sie das Toxin spezifisch zu Zellen leiten, die ein bestimmtes Targeting-Molekül tragen, das durch den Target-Abschnitt erkannt wird. Es gibt umfangreiche Literatur über Immunotoxine, einschließlich z.B. Pastan et al., (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 331-354; Youle et al., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. US8A 77: 5483; Gilliand et al., (1980) Proc. Natl Acad Sci. USA 77:4539; Krolick et al., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:5419; Griffin et al., (1988) "Immunotoxins" p 433, Boston/Dordrecht/Lancaster, Kluwer Academic Publishers; Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098; und Fitzgerald et al., (1989) J. Natl. Cancer Inst. 81: 1455.
Der Target-Abschnitt und die Toxin-Bereiche von erfindungsgemäßen Immunotoxinen sind durch ein Molekül verbunden, das als "Connector" oder "Linker" bezeichnet wird. In dieser Schrift werden die Begriffe "Connector" und "Linker" austauschbar verwendet. Typischerweise hat ein Connector keine andere spezifische biologische Aktivität als die, die Proteine zu verbinden, oder einen gewissen Mindestabstand oder andere räumliche Beziehungen zwischen ihnen aufrecht zu erhalten. Die einzelnen Aminosäuren eines Connectors können jedoch so ausgewählt werden, dass sie einige Eigenschaften des Moleküls beeinflussen, wie z.B. die Faltung, die Nettoladung, oder die Hydrophobizität des Moleküls. Der Linker ist in der Lage, kovalente Bindungen sowohl zum Antikörper als auch zu dem Toxinmolekül auszubilden.
Die Begriffe "rekombinante DNA", "rekombinante Nucleinsäure" oder "rekombinant hergestellte DNA" beziehen sich auf DNA, die aus ihrer nativen oder endogenen Quelle isoliert und entweder chemisch oder enzymatisch durch Addition, Deletion oder Veränderung natürlich vorkommender flankierender oder interner Nucleotide modifiziert wurde. Flankierende Nucleotide sind solche Nucleotide, die entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der beschriebenen Sequenz oder Untersequenz angeordnet sind, während interne Nucleotide solche Nucleotide sind, die innerhalb der beschriebenen Sequenz oder Untersequenz vorkommen.
Der Begriff "rekombinante Mittel" bezieht sich auf Techniken, bei denen Proteine isoliert werden, und bei denen die für das Protein codierende cDNA-Sequenz identifiziert und in einen Expressionsvektor eingefügt wird. Der Vektor wird dann in eine Zelle eingeführt und die Zelle exprimiert das Protein. Rekombinante Mittel umfassen auch die Ligation von codierender oder Promotor-DNA aus verschiedenen Quellen in einen Vektor für die Expression eines chimären Proteins, die konstituive Expression eines Proteins, oder die induzierbare Expression eines Proteins.
Die Begriffe "rekombinantes Protein", "rekombinant hergestelltes Protein" oder "rekombinant hergestelltes Immunotoxin", beziehen sich auf ein Peptid oder Protein, das unter Verwendung von nicht-nativen Zellen hergestellt wurde, die keine endogene Kopie der DNA, die das Protein exprimieren kann, besitzen. Die Zellen produzieren das Protein, weil sie durch Einführung einer geeigneten Nucleinsäuresequenz genetisch verändert wurden. Das rekombinante Protein wird nicht in Verbindung mit Proteinen und anderen subzellularen Bestandteilen, die normalerweise zu den Zellen gehören, die das Protein produzieren, gefunden werden.
In dieser Schrift werden die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" austauschbar verwendet, und enthalten eine Bezugnahme auf ein Polymer aus Aminosäureresten. Die Begriffe beziehen sich sowohl auf Aminosäure-Polymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon zu einer korrespondierenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, als auch auf natürlich vorkommende Aminosäure-Polymere. Die Begriffe beziehen sich auch auf Polymere, die konservative Aminosäure-Substitutionen enthalten, so dass das Protein funktional bleibt.
Der Begriff "Rest" oder "Aminosäurerest" enthält eine Bezugnahme auf eine Aminosäure, die in ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid (Sammelbezeichnung "Peptid") eingebaut ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und, wenn nicht andersartig eingeschränkt, bekannte Analoga natürlicher Aminosäuren, die auf ähnliche Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren fungieren, umfassen.
Die Aminosäuren und Analoga, auf die vorliegend Bezug genommen wird, sind durch abgekürzte Bezeichnungen wie folgt in Tabelle A beschrieben:
Tabelle A
Eine "konservative Substitution" bezieht sich bei Beschreibung eines Proteins auf eine Veränderung in der Aminosäure-Zusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert. Daher bezieht sich der Begriff "konservativ modifizierte Varianten" einer bestimmten Aminosäuresequenz auf solche Aminosäure-Substitutionen, die in Bezug auf die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder auf Substitutionen von Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (zum Beispiel sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder unpolar, etc.), so dass die Substitution selbst kritischer Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich verändert. Tabellen zur konservativen Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren zeigen, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die folgenden sechs Gruppen in Tabelle B enthalten jeweils Aminosäuren, die füreinander konservative Substitutionen darstellen:
Tabelle B
Siehe auch, Creighton, PROTEINS, W. H. Freeman und Company, New York (1984).
Die Begriffe "im Wesentlichen ähnlich" im Zusammenhang mit einem Peptid zeigen, dass ein Peptid über ein Vergleichsfenster von 10–20 Aminosäuren eine Sequenz mit mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität zur Referenzsequenz aufweist. Der Prozentsatz der Sequenzidentität wird bestimmt, in dem zwei optimal aneinander ausgerichtete Sequenzen über ein Vergleichsfenster verglichen werden, wobei der Bereich der Polynucleotidsequenz in dem Vergleichsfenster im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen aufweist) Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) für die optimale Ausrichtung der beiden Sequenzen aufweisen kann. Der Prozentsatz wird berechnet durch Bestimmung der Anzahl der Positionen, an welchen die identische Nucleinsäure-Base oder der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, um so die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu liefern, Division der Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl der Positionen in dem Vergleichsfenster, und Multiplikation des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu liefern.
Der Begriff "Disulfidbrücke" oder "Cystein-Cystein-Disulfidbrücke" bezieht sich auf eine kovalente Interaktion zwischen zwei Cysteinen, bei der Schwefelatome der Cysteine oxidiert sind und eine Disulfidbrücke ausbilden. Die durchschnittliche Bindungsenergie einer Disulfidbrücke beträgt ungefähr 60 kcal/mol, im Vergleich zu 1–2 kcal/mol für eine Wasserstoff-Brückenbindung. Im Kontext dieser Erfindung liegen die Cysteine, die die Disulfidbrücke ausbilden, in den Rückgrat-Bereichen der einkettigen Antikörper und dienen dazu, die Konformation des Antikörpers zu stabilisieren.
Die Begriffe "konjugieren", "verbinden" oder "binden" beziehen sich darauf, aus zwei Polypeptiden ein zusammenhängendes Polypeptid-Molekül zu machen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Begriffe auf die Bindung eines Antikörper-Abschnitts an ein Toxinmolekül. Die Verbindung kann entweder durch chemische oder rekombinante Mittel erfolgen. "Chemische Mittel" bezieht sich auf eine Reaktion zwischen dem Antikörper-Abschnitt und dem Toxin-Abschnitt, so dass eine kovalente Bindung zwischen den beiden Molekülen entsteht und ein Molekül gebildet wird. Genauer bezieht sich der Begriff "chemische Mittel" im Zusammenhang mit der Erfindung auf Reaktionen, in denen ein Linkermolekül, normalerweise ein kurzes Peptid, an einem Ende kovalent an ein Targeting-Molekül und einem anderen Ende kovalent an ein Toxinmolekül gebunden wird.
III. LINKERMOLEKÜLE
Die Immunotoxine der Erfindung weisen einen Target-Abschnitt und einen Toxin-Abschnitt auf, die durch einen Linker verbunden sind. Verschiedene Linker sind aus dem Stand der Technik bekannt, und sie teilen die Eigenschaft, dass sie unter physiologischen Bedingungen unreaktiv sind und nicht mit der Aktivität der Target- oder der Toxin-Abschnitte interferieren. Wenn die Antikörper und das Toxinmolekül Polypeptide sind, können die Linker mit den einzelnen Aminosäuren über deren Seitengruppen (zum Beispiel durch eine Disulfidbrücke zu Cystein) verbunden werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Linker an die alpha-carbon-Amino- und Carboxylgruppen der terminalen Aminosäuren gebunden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Linker ein Peptid, und er hat bevorzugt eine Länge von 1 bis 150 Resten, besonders bevorzugt eine Länge von 3 bis 100 Resten, und ganz besonders bevorzugt eine Länge von ungefähr 3 bis 50 oder weniger Resten. In noch bevorzugteren Ausführungsformen hat der Linker eine Länge von ungefähr 4 bis ungefähr 20 Aminosäureresten, und in einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen eine Länge von ungefähr 6 bis ungefähr 17 Resten, und in anderen eine Länge von ungefähr 6 bis 10 Resten. Moleküle mit einem größeren Molekulargewicht haben tendenziell eine verminderte Eindringtiefe in einen Tumor, und der Linker-Bereich sollte so lang sein, dass er die Fähigkeit des Immunotoxins, in den Tumor einzudringen, verglichen mit einem Immunotoxin, das dieselben Target-und Toxin-Abschnitte aufweist, aber einen Linker mit 10 oder weniger Aminosäure Resten, mehr als 50 %, bevorzugt mehr als 25 %, reduziert. Assays für die Bestimmung der Eindringtiefe von Immunotoxinen in einen Tumor sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt, und können beispielsweise durchgeführt werden, in dem das Immunotoxin mit einem Radiomarker markiert wird, das Immunotoxin einem Tier mit einem soliden Tumor (wie z.B. einer Nacktmaus, die mit Zellen eines soliden menschlichen Tumors geimpft wurde) verabreicht wird, und der Tumor dann geschnitten und einer Autoradiographie unterzogen wird, um zu bestimmen, wie weit das Immunotoxin in den Tumor eingedrungen ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Linker Peptide mit einer Länge von ungefähr 4 bis ungefähr 20 Aminosäureresten. Grundsätzlich kann jedes Peptid dieser Länge verwendet werden, solange es nicht mit der richtigen Faltung oder Aktivität des Target-Abschnitts oder des Toxin-Abschnitts des Immunotoxins interferiert. Die Wirkung des Linkers auf die Aktivität dieser Abschnitte kann durch Untersuchung der Bindung des Target-Abschnitts an sein Target und durch Untersuchung der Cytotoxizität des Toxin-Abschnitts auf Zellen, die durch den Target-Abschnitt gebunden wurden, leicht bestimmt werden. Eine Abnahme der Bindungs-Affinität des Target-Abschnitts um mehr als 25 % oder eine Abnahme der Cytotoxizität des Toxin-Abschnitts um mehr als 25 %, oder beides, zeigt an, dass das jeweils getestete Linkerpeptid nicht geeignet ist. Assays für die Bestimmung der Bindungseigenschaften verschiedenster Antikörper und Liganden sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann die Bindungs-Affinität eines Liganden, der als Targeting-Molekül des Immunotoxins Verwendung findet, durch Messung der Fähigkeit des Targetmoleküls, einen nativen Liganden von seinem Target-Substrat zu verdrängen, untersucht werden. Dies kann bewerkstelligt werden, in dem der native Ligand markiert wird, und dann Zellen, die den Target-Rezeptor tragen, mit einer bestimmten Menge des markierten Liganden und verschiedenen Konzentrationen des einen Liganden enthaltenden Immunotoxins inkubiert werden.
Die Menge des gebundenen nativen Liganden kann bestimmt werden, in dem die Menge an Marker, der an die Target-Zelle gebunden ist, detektiert wird. Unmarkierte native Liganden können als Kontrolle mitlaufen.
Der Fachmann wird wissen, dass die Auswahl der Target-Zelle durch den jeweiligen Liganden bestimmt wird. Der jeweilige Marker wird so ausgewählt, dass er möglichst wenig mit der Bindung des markierten nativen Liganden interferiert. Die geeigneten Marker sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen radioaktive Marker (z.B. ¹²⁵I, ³²P), fluoreszierende Marker (z.B. Fluorescin oder Rhodamin), und enzymatische Marker (z.B. Meerrettich-Peroxidase) ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die Cytotoxizität kann mittels Standard-Assays, wie z.B. den in den Beispielen unten geschilderten, bestimmt werden. Für die Bindung des PEG an eine gewünschte Stelle im Linker kann das Peptid durch ortsspezifische Mutagenese mutiert werden, um einen Rest mit einer geeigneten funktionellen Gruppe einzufügen, oder um einen der Aminosäurereste, die bereits im Linker vorliegen, durch einen Rest mit einer solchen funktionellen Gruppe zu substituieren. Der Chemismus funktioneller Gruppen für die Bindung von PEG an Aminosäurereste ist wohlbekannt und wird zum Beispiel in solchen Literaturstellen wie Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996), Kapitel 15 und in Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol," in Dunn und Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991) gelehrt.
Cysteine werden für die Einfügung oder die Substitution in einen Linker besonders bevorzugt, da Cysteine eine einfache Bindung eines PEG-Derivats durch Thiol-Chemie erlauben, so wie es in den Beispielen ausgeführt ist. Wenn gewünscht können zwei oder mehr Cysteine in die Linker eingefügt werden. Die Thiol-Chemie ist wohlbekannt und wird in solchen Literaturstellen wie Hermanson (siehe oben) und Zalipsky (siehe oben) gelehrt.
Ein bevorzugtes Linkermolekül, das durch Mutagenese ein Cystein aufnehmen kann, ist ASGGPE (SEQ ID NO:1). In bevorzugten Ausführungsformen wird das Linkerpeptid ausgewählt aus den folgenden Peptiden, die in Form des standardisierten Single Letter Codes dargestellt sind: ASGCGPE (SEQ ID NO: 2), ASGCCGPE (SEQ ID NO: 3), ASCGSGCPE (SEQ ID NO: 4), ASCGTTGCPE (SEQ ID NO: 8), KASGKKYGCKKGPE (SEQ ID NO: 5), und KGGGCAGGPE (SEQ ID NO: 6), wobei die ersten drei in der Liste besonders bevorzugt sind und das erste in der Liste ganz besonders bevorzugt ist. Während die jeweiligen genannten Peptide bevorzugt sind, können die Cysteine auch an anderen Stellen im Linker platziert werden. Z.B. könnte das bevorzugte Peptid ASGGPE (SEQ ID NO:1) Cysteine aufweisen, die wie folgt platziert sind: CASGGPE (SEQ ID NO: 9), ACSGGPE (SEQ ID NO: 10), ASCGGPE (SEQ ID NO: 11), ASGGCPE (SEQ ID NO: 12), ASGGPCE (SEQ ID NO: 13), und ASGGPEC (SEQ ID NO: 14). Es kann mehr als ein Cystein in den Linker eingefügt werden, so dass mehr als ein Rest des Linkers PEGyliert werden kann. Konstrukte, die diese Linker verwenden, können mittels Standard-Assays, so wie sie in den Beispielen dargelegt sind, auf ihre Aktivität getestet werden, um zu bestätigen, dass die PEGylierung nicht mit der gewünschten Aktivität des Immunokonjugats interferiert.
IV. PEGYLIERUNG DES LINKERMOLEKÜLS
In den Immunokonjugaten der Erfindung ist das Linkermolekül PEGyliert. Generell kann jeder Rest des Linkers PEGyliert werden, obwohl es allgemein bevorzugt wird, dass die PEGylierung einen Rest betrifft, der nicht der erste und der letzte Rest des Linkers ist (d.h. diejenigen Reste, die kovalent direkt an den Target- und den Effektor-Abschnitt gebunden sind), da die PEGylierung dieser Reste mit höherer Wahrscheinlichkeit mit der Faltung oder die Aktivität der Target- oder Effektor-Abschnitte interferiert. Wenn gewünscht, können diese Reste jedoch PEGyliert und die resultierenden Immunokonjugate auf ihre Target- und Effektor-Aktivität getestet werden, z.B. mit den Toxizitäts-Assays für Immunotoxine aus den Beispielen.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Prozeduren für die PEGylierung von Molekülen bekannt. Typischerweise verwenden solche Prozeduren derivatisierte PEGs, die die Kopplung von PEG an Proteine unter dem gewünschten Reaktionsbedingungen erlauben. Es sind einige solche derivatisierten PEG bekannt, wie z.B.: N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester mit PEG-Carboxylsäure, Monomethoxy-PEG2-NHS, Succinimidylester des Carboxymethylierten PEG (SCM-PEG), Benzotriazol-Carbonat-Derivate des PEG, PEG-Glycidylether, PEG-p-Nitrophenylcarbonate (PEG-NPC, wie z.B. Methoxy-PEG-NPC), PEG- Aldehyde, PEG-Orthopyridyldisulfid und Carbonyldimidazol-aktivierte PEGs. Eines der geeignetsten PEG-Derivate ist PEG-Thiol. PEG-Maleimid wird besonders bevorzugt für die Verwendung zur Bindung von PEG an Peptidlinker in den Immunotoxinen der Erfindung. All die genannten PEG-Derivate sind in verschiedenen Molekulargewichten kommerziell erhältlich. Siehe z.B. den Katalog Polyethylene Glycol und Derivatives, 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.). Dieser Katalog enthält auch eine Beschreibung des Bindungschemismus für jedes Derivat und Verweise auf die Literatur betreffend Protokolle für solche Verbindungen. Wenn gewünscht sind viele der oben genannten Derivate in einer monofunktionalen MonomethoxyPEG (mPEG)-Form erhältlich. Die PEGylierung von Molekülen wie den Peptidlinkern der hier beschriebenen Immunokonjugate wird genauer diskutiert in Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996), Kapitel 15, und in Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol," in Dunn und Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991).
Zweckmäßigerweise kann PEG durch ortsspezifische Mutagenese an eine gewünschte Stelle im Linker gebunden werden. Z.B. kann der Linker so konstruiert werden, dass er einen Cysteinrest an der gewünschten Position aufweist, um die Anbindung des PEG zu erleichtern. Ein beispielhaftes Verfahren für die Bindung von PEG an einen Linker mittels Thiol-Chemie an ein Cystein, das in den Linker eingebaut wurde, ist in den Beispielen dargelegt. Es kann jedoch auch ein anderer Bindungs-Chemismus verwendet werden. Obwohl PEG-Maleimid in den Beispielen verwendet wurde, handelt es sich z.B. bei PEG-Vinylsulfon oder PEG-Orthopyridyl-Disulfid um aktivierte PEGs, die an Cysteinreste binden können, das erste über eine Thioether-Bindung und das zweite über eine Disulfid-Bindung.
Während die Bindung ein Cysteinreste eine einfache Methode ist, um Linker zu PEGylieren, können auch andere Reste verwendet werden, wenn dies gewünscht ist. Die Reaktivität der Seitenketten der Aminosäurereste ist wohlbekannt, siehe z.B Feeney et al., "Chemical Modification of Proteins: An Overview," in Feeney und Whitaker, eds. Modification of Proteins, American Chemical Society, Washington, D.C. (1982), in Tabelle 1. Es kann z.B. Essigsäureanhydrid verwendet werden, um mit NH₂- und SH-Gruppen zu reagieren, aber nicht mit COOH-, S-S, oder SCH₃-Gruppen, während Wasserstoffperoxid verwendet werden kann, um mit SH- und SCH₃-Gruppen zu reagieren, aber nicht mit NH₂. Die Reaktionen können unter Bedingungen durchgeführt werden, die für die Bindung an einen gewünschten Rest geeignet sind, wobei Chemismen verwendet werden, die gut etablierten Reaktivitäten ausnutzen.
Wo der Linker mittels synthetischer Chemie an Stelle von rekombinanten Mitteln hergestellt wird, können zusätzliche Chemismen ausgenutzt werden. Z.B. kann ein Lysinrest an den Linker gebunden werden, in dem die Peptidbindung über dessen Epsilon-Aminogruppe ausgebildet wird und nicht über die übliche α-Aminogruppe. Die freie α-Aminogruppe eines solchen Lysins deprotoniert bei einem niedrigeren pH als die der freien Epsilon-Aminogruppe von Lysinen in Immunotoxinen, die über die α-Aminogruppe gebunden sind. Durch Kontrolle des pH der Reaktionsbedingungen kann das Lysin mit der freien α-Aminogruppe mit dem PEG reagieren, ohne dass andere Lysine im Linker, oder, wenn die PEGylierung durchgeführt werden, nachdem der Linker in das Immunotoxin integriert worden ist, andere Lysine im Immunotoxin, auch PEGyliert werden.
Grundsätzlich sollten die PEG, die an den Linker gebunden werden, sich von einem Molekulargewicht (MG) von mehreren hundert Dalton bis ungefähr 100 kD bewegen. Es können höher molekulargewichtige PEG verwendet werden, aber dies kann zu einem gewissen Verlust in der Ausbeute des PEGylierten Proteins führen. Außerdem sollte die Reinheit größerer PEG-Moleküle überwacht werden, da es schwierig sein kann, höher molekulargewichtige PEG mit einer Reinheit, die so hoch ist wie die, die für geringer molekulargewichtige PEG erhältlich ist, zu erhalten. Es wird bevorzugt, PEG mit einer Reinheit von mindestens 85 % zu verwenden, besonders bevorzugt mit einer Reinheit von mindestens 90 %, 95 %, oder höher. Höher molekulargewichtige PEG können außerdem unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf die Bindung der Target-Zelle, die Translokation (wo das Effektormolekül aufgenommen werden soll) und, im Falle eines PE-basierenden Immunotoxins, im Bezug auf die ADP-Ribosylierung durch das Toxin aufweisen. Diese Eigenschaften können für verschiedene Tumortypen (Tumore bzw. Karzinome) variieren, sie können leicht mittels Standard-Assays getestet werden, wie z.B. denen, die in den Beispielen beschrieben sind.
Bevorzugt sollte das Molekulargewicht (MG) des PEG sich von ungefähr 1 kD bis ungefähr 30 kD bewegen, besonders bevorzugt von ungefähr 3 kD oder mehr bis ungefähr 30 kD. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sollte sich das Molekulargewicht von ungefähr 5 kD bis ungefähr 20 kD bewegen. Verschiedene Derivate des PEG sind in diesem Molekulargewichten kommerziell erhältlich. Z.B. ist PEG-Monomethylether bei Shearwater Polymers, Inc. in MG von 1 kD, 2 kD, 3 kD, 5 kD, 10 kD, 12 kD und 20 kD erhältlich, während verschiedene Formen des PEG-Succinimidylpropionate in 2 kD, 3400 D, 5 kD, und 20 kD MG erhältlich sind.
Wie oben angemerkt, können auch höher molekulargewichtige PEGs verwendet werden, aber PEGs bis 30 kD werden einfach deswegen bevorzugt, weil sie leichter kommerziell erhältlich sind. Wie ebenfalls angemerkt, ist es möglich, dass PEGs mit erheblich höheren Molekulargewichten, z.B. PEGs mit Molekulargewichten von über 100 kD, so groß sein können, dass sie zu einem bestimmten Ausmaß mit der Tumor-Eindringtiefe oder anderen Gesichtspunkten der Antitumor-Aktivität, der Pharmakokinetik, oder anderen Eigenschaften der Moleküle interferieren. Diese Bedenken könnten jedoch durch eine längere Verweildauer der PEGylierten Immunokonjugate im Zielgewebe ausgeglichen werden. Jedes einzelne PEG kann mit den Assays, die in den Beispielen dargelegt sind, und anderen aus dem Stand der Technik bekannten Assays getestet werden, um zu bestimmen, ob ein Immunokonjugat, das das PEG enthält, ein weniger wünschenswertes Aktivitätsprofil hat als dasselbe Immunokonjugat, das mit einem geringer molekulargewichtigen PEG verbunden ist.
Wie aus der obigen Beschreibung klar hervorgehen sollte, wird PEG als Substituent an einer reaktiven Seitenkette eines Aminosäurerestes des Linkers gebunden; PEG wird nicht als interner Bestandteil in das Linkerpolymers eingebaut. PEG-Moleküle können an mehr als einen Aminosäurerest des Linkers gebunden werden, besonders an Linker mit 20 Aminosäuren oder mehr. Es ist grundsätzlich wünschenswert, in Längsrichtung des Linkermoleküls einen bestimmten Abstand zwischen den Resten, an welche PEG gebunden ist, einzuhalten; ein Abstand von fünf Resten ist üblicherweise akzeptierbar. Üblicherweise ist es nicht wünschenswert, mehr als vier Reste auf einem einzelnen Linker zu PEGylieren.
Immunokonjugate, bei denen PEG an mehr als zwei Reste gebunden ist, sollten getestet werden (z.B. mit den unteren dargelegten Assays), um zu bestätigen, dass sie eine befriedigende Aktivität beibehalten. Grundsätzlich sollte, wenn das Immunokonjugat im Vergleich zu einem ähnlichen Immunokonjugat, bei dem nur ein Linkerrest mit einem PEG-Molekül verbunden ist, mehr als 25 % seiner Aktivität verliert (wenn zum Beispiel ein Immunotoxin mehr als 25% seiner Antitumor-Aktivität verliert), die Anzahl der Reste des Immunokonjugats, die mit PEG verbunden sind, reduziert werden.
V. HERSTELLUNG VON IMMUNOKONJUGATEN
Immunokonjugate schließen Moleküle, in denen eine kovalente Bindung eines therapeutischen Agens an einen Antikörper vorliegt, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Ein therapeutisches Agens ist ein Agens mit einer bestimmten biologischen Aktivität, die gegen einen bestimmtes Targeting-Molekül oder eine Zelle, die ein Targeting-Molekül trägt, gerichtet ist. Ein Fachmann wird wissen, dass therapeutische Agenzien verschiedene Arzneistoffe einschließen können, wie z.B. Vinblastin, Daunomycin und ähnliches, Cytotoxine wie z.B. natives oder modifiziertes Pseudomonas Exotoxin oder Diphtherietoxin, verkapselnde Agenzien (z.B. Liposomen), die ihrerseits pharmakologische Verbindungen enthalten, radioaktive Agenzien wie z.B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C, ³H und ³⁵S und andere Marker, Target-Abschnitte und Liganden.
Die Auswahl eines bestimmten therapeutischen Agens hängt von dem jeweiligen Targeting-Molekül oder der Zelle und dem gewünschten biologischen Effekt ab. Daher kann das therapeutische Agens ein Cytotoxin sein, das verwendet wird, um eine bestimmte Targetzelle abzutöten. Umgekehrt kann, wenn es eher gewünscht wird, eine nicht-lethale biologische Antwort hervorzurufen, das therapeutische Agens an ein nicht-lethales pharmakologisches Agens oder ein Liposom mit einem nicht-lethalen pharmakologischen Agens gebunden werden.
Mit den hier vorgestellten therapeutischen Agenzien und Antikörpern kann ein Fachmann auf einfache Weise eine Vielzahl von Klonen konstruieren, die funktionell äquivalente Nucleinsäuren enthalten, wie z.B. Nucleinsäuren, die sich in ihrer Sequenz unterscheiden, aber die für dasselbe Effektormolekül (EM) oder dieselbe Antikörpersequenz codieren. Daher stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren bereit, die für Antikörper und Konjugate und deren Fusionsproteine codieren.
A. Rekombinante Verfahren
NNucleineinsäuresequenzen, die für Immunokonjugate der vorliegenden Erfindung codieren, können mit jeder geeigneten Methode hergestelt werden, einschließlich beispielsweise dem Klonieren von geeigneten Sequenzen, oder durch direkte chemische Synthese durch Verfahren wie z.B. die Phosphotriester-Methode von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979); die Phosphodiester-Methode von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979); die Diethylphosphoramidit-Methode von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859–1862 (1981); die Festphasen-Phosphoramidittriester-Methode, die von Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859–1862 (1981) beschrieben wurde, zum Beispiel durch Verwendung eines automatischen Synthesizers, wie z.B. von Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12: 6159–6168 (1984) beschrieben; und die Festsubstrat-Methode aus dem US-Patent 4458066. Die chemische Synthese erzeugt ein einzelsträngiges Oligonucleotid. Dieses kann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase, bei der der Einzelstrang als Matritze dient, in doppelsträngige DNA überführt werden. Ein Fachmann wird wissen, dass, während die chemische Synthese von DNA auf Sequenzen mit ungefähr 100 Basen begrenzt ist, längere Sequenzen durch Ligation kürzerer Sequenzen erhalten werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nucleinsäuresequenzen, die für Immunokonjugate codieren, durch Klonierungstechniken hergestellt. Beispiele für geeignete Klonierungs- und Sequenzierungstechniken sowie Anweisungen, die ausreichen, um Fachleute durch viele Klonierungsschritte zu leiten, findet man in in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger und Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego Calif. (1987)), oder Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987). Produktinformationen von Herstellern biologischer Reagenzien und experimenteller Ausrüstung liefern ebenfalls nützliche Informationen. Solche Hersteller sind z.B. SIGMA chemical company (Saint Louis, Mo.), R&D Systems (Minneapolis, Minn.), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, N.J.), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company Milwaukee, Wis.), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, Md.), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen, San Diego, Calif., und Applied Biosystems (Foster City, Calif.), wie auch viele andere dem Fachmann bekannte kommerzielle Quellen.
Nucleinsäuren, die für das native Protein EM, Linkerpeptide oder Antikörper codieren, können modifiziert werden, um EM, Linkerpeptide, Antikörper oder Immunokonjugate zu bilden, in denen der Target-Abschnitt über den Linker mit dem EM verbunden ist. Modifikation durch ortsgerichtete Mutagenese ist im Stand der Technik wohlbekannt. Nucleinsäuren, die für das Protein EM oder Antikörper codieren, können mittels in vitro-Methoden amplifiziert werden. Amplifikationsmethoden sind z.B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), das Transkriptions-basierende Amplifikationssystem (TAS) oder das Self-sustained Sequence Replication System (3SR). Fachleuten ist große Vielzahl von Klonierungsmethoden, Wirtszellen und in vitro-Amplifikationsmethoden wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Immunokonjugate durch Inserierung der cDNA, die für einen anti-Tac scFV-Antikörper codiert, in einen Vektor, der die für das EM codierende cDNA und die für einen Linker codierende cDNA enthält, hergestellt. Die Insertion erfolgt so, dass das scFV, der Linker und das EM in einem Raster gelesen werden, d.h. in einem durchgehenden Polypeptid, das eine funktionelle Fv-Region, den Linker und eine funktionelle EM-Region enthält.
Wenn die Nucleinsäuren, die für ein EM, einen Antikörper oder ein Immunokonjugat der vorliegenden Erfindung codieren, einmal isoliert und kloniert sind, kann man das gewünschte Protein in einer rekombinant hergestellten Zelle wie z.B. einer Bakterien-, Pflanzen-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzelle, exprimieren. Es wird erwartet, dass Fachleute bezüglich der zahlreichen Expressionssysteme, die für die Expression vn Proteinen erhältlich sind, einschließlich E. coli, anderer bakterieller Wirte, Hefe, und zahlreicher höherer eukaryotischer Zellen wie z.B. der COS-, CHO-, HeLa- und Myeloma-Zelllinien, gut unterrichtet sind. Kurz, die Expression natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuren, die für die isolierten Proteine der Erfindung codieren, wird typischerweise durch die technisch mögliche Bindung der DNA oder cDNA an einem Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist) erreicht, gefolgt durch Aufnahme in eine Expressionskassette. Die Kassetten können für die Replikation und die Integration entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten geeignet sein. Typische Expressionskassetten enthalten Terminatoren für die Transkription und die Translation, Startsequenzen und Promotoren, die für die Regulation der Expression der DNA, die für das Protein codiert, geeignet sind. Um ein hohes Expressionniveau eines klonierten Gens zu erreichen, ist es empfehlenswert, Expressionskassetten zu konstruieren, die mindestens einen starken Promotor zur Steuerung der Transkription, eine Ribosom-Bindungsstelle für die Initiation der Translation, und einen Terminator für die Transkription und Translation enthalten. Bei E. coli beinhaltet dies einen Promotor, wie z.B. den T7-, trp-, lac-, oder lambda-Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und vorzugsweise ein Signal für die Termination der Transkription. Bei eukaryotischen Zellen können die Kontrollsequenzen einen Pomotor und vorzugsweise einen Enhancer, der aus Immunglobulin-Genen, SV40 oder dem Cytomegalievirus abgeleitet worden ist, und eine Polyadenylierungssequenz beinhalten, und können Splice-Donor- und Splice-Akzeptorsequenzen beinhalten. Die erfindungsgemäßen Kassetten können mittels wohlbekannter Methoden, wie z.B. Calciumchlorid-Transformation oder Electroporation bei E. coli, und Calciumphosphat-Behandlung, Electroporation oder Lipofektion bei Säugetierzellen, in die ausgewählte Wirtszelle transferiert werden. Zellen, die durch die Kassetten transformiert wurden, können durch Antibiotika-Resistenz, die durch Gene verliehen wird, die in den Kassetten enthalten sind, wie z.B. das amp-, gpt-, neo-oder hyg-Gen, selektiert werden.
Der Fachmann wird wissen, dass eine Nucleinsäure, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert (z.B. anti-Tac Antikörper, PE, oder ein Immunokonjugat, das durch deren Kombination gebildet wird) Modifikationen unterzogen werden kann, ohne dessen biologische Aktivität zu vermindern. Einige Modifikationen können gemacht werden, um die Klonierung, Expression oder die Aufnahme des Targetmoleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Solche Modifikationen sind Fachleuten wohlbekannt und beinhalten z.B. Terminations-Codons, ein am Aminoterminus angefügtes Methionin, um eine Initiationsstelle bereitzustellen, zusätzliche Aminosäuren, die an beiden Enden angeordnet sind, um geeignet platzierte Restriktionsstellen zu schaffen, oder zusätzliche Aminosäuren, (wie z.B. polyHis), um in Reinigungsschritten hilfreich zu sein.
Zusätzlich zu rekombinanten Methoden können EM, Antikörper oder andere Liganden auch als Ganzes oder in Teilen mittels Standard-Peptidsynthese konstruiert werden. Festphasensynthese der Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren kann bewerkstelligt werden, in dem die C-terminale Aminosäure der Sequenz an einen nicht-löslichen Träger gebunden wird, gefolgt von der sequenziellen Addition der verbleibenden Aminosäuren der Sequenz. Techniken für die Festphasensynthese werden beschrieben von Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156 (1963), und Stewart et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Proteine grösserer Länge können durch Kondensation der Amino- und der Carboxytermini kürzerer Fragmente synthetisiert werden. Methoden zur Bildung von Peptidbindungen durch Aktivierung eines Carboxyterminus (z.B. durch Verwendung des Kopplungsreagenz N,N'-Dicycylohexylcarbodiimid) sind den Fachleuten bekannt.
B. Reinigung
Nachdem sie einmal exprimiert worden sind, können die rekombinanten Immunokonjugate, Antikörper, Effektormoleküle und Linker-Moleküle der vorliegenden Erfindung gemäß Standardverfahren aus dem Stand der Technik gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat-Fällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie und ähnlichem (siehe grundsätzlich R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Im Wesentlichen reine Verbindungen mit einer Homogenität von mindestens ungefähr 90 bis 95 % werden bevorzugt, und 98 bis 99 % oder mehr Homogenität werden für pharmazeutische Zecke besonders bevorzugt. Wenn sie gereinigt sind, d.h. teilweise oder, wenn sie therapeutisch verwendet werden sollen, bis zur gewünschten Homogenität, sollten die Polypeptide praktisch frei von Endotoxin sein.
Verfahren für die Expression von einkettigen Antikörpern und/oder für die Faltung in eine geeignete aktive Form, einschließlich einkettiger Antikörper aus Bakterien wie z.B. E. coli, wurden bereits beschrieben, sind wohlbekannt und auf die Antikörper dieser Erfindung anwendbar. Siehe Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263–270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9: 545 (1991); Huse et al., Science 246: 1275 (1989) und Ward et al., Nature 341: 544 (1989), die sämtlich durch Querverweis in diese Offenbarung aufgenommen werden.
Häufig werden funktionell heterologe Proteine aus E. coli oder anderen Bakterien aus Inklusionskörpern isoliert, und erfordern eine Solubilisierung mit starken denaturierenden Agenzien und eine anschließende Faltung. Während des Solubilisierungs-Schrittes muss, wie aus dem Stand der Technik wohlbekannt ist, ein reduzierendes Agens anwesend sein, um die Disulfidbrücken aufzuspalten. Ein beispielhafter Puffer mit einem reduzierenden Agens ist: 0.1 M Tris pH 8,6 M Guanidin, 2 mM EDTA, 0.3 M DITE (Dithioerythritol). Die Reoxidation der Disulfidbrücken kann in Gegenwart von niedermolekularen Thiol-Reagenzien in reduzierter und oxidierter Form stattfinden, wie z.B. in Saxena et al., Biochemistry 9: 5015–5021 (1970), beschrieben wird, die durch Querverweis in diese Offenbarung aufgenommen wird, und wie besonders durch Buchner (siehe oben) beschrieben wird.
Die Renaturierung wird typischerweise durch Verdünnung (z.B. 100-fach) denaturierten und reduzierten Proteins in Faltungspuffer bewerkstelligt. Ein beispielhafter Puffer ist 0.1 M Tris, pH 8.0, 0.5 M L-Arginin, 8 mM oxidiertes Glutathion (GSSG), und 2 mM EDTA.
Als Modifikation für das Reinigungsprotokoll für zweikettige Antikörper werden schwere und leichte Ketten-Abschnitte getrennt voneinander solubilisiert und reduziert und dann in der Faltungslösung kombiniert. Eine bevorzugte Ausbeute wird dann erhalten, wenn diese zwei Proteine in einem molaren Verhältnis gemischt werden, bei dem ein 5-facher molarer Überschuss des einen Proteins gegenüber dem anderen nicht überschritten wird. Es ist wünschenswert, der Faltungslösung im Überschuss oxidiertes Glutathion oder andere oxidierende niedermolekulare Verbindungen hinzuzufügen, nachdem der Redox-Shuffling-Prozesses vollendet ist.
VI. IMMUNOTOXINE
In einem Aspekt der Erfindung sind die Immunokonjugate Immunotoxine. Beispielhafte Toxine schließen Ricin, Abrin, Diphtherietoxin und dessen Untereinheiten, Saponin, Gelonin, Ribosom-Inaktivierendes Protein, und die Botulinum Toxine A bis F ein. Diese Toxine sind bei kommerziellen Quellen leicht erhältlich (z.B. Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). Diphtherietoxin wird aus Corynebacterium diphtheriae isoliert. Ricin ist das Lektin RCA60 aus Ricinus communis (Rizinussamen). Der Begriff bezieht sich auch auf dessen toxische Varianten, wie sie z.B. in den US-Patenten 5079163 und 4689401 gelehrt werden. Ricinus communis agglutinin (RCA) tritt in zwei Formen auf, die entsprechend ihres Molekulargewichts von ungefähr 65 bzw.120 kD (Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266: 543 (1972)) RCA60 und RCA120 genannt werden. Die A-Kette ist verantwortlich für die Inaktivierung der Proteinsynthese und das Töten von Zellen. Die B-Kette bindet Ricin an Galaktosereste der Zelloberfläche und erleichtert den Transport der A-Kette in das Cytosol (Olsnes et al., Nature 249: 627–631 (1974), und US Patent 3060165).
Abrin enthält toxische Lektine aus Abrus precatorius. Die toxischen Bestandteile Abrin a, b, c, und d, haben ein Molekulargewicht von ungefähr 63 bis 67 kD, und sind aus zwei über Disulfidbrücken verbundenen Polypeptidketten A und B zusammengesetzt. Die A-Kette inhibiert die Proteinsynthese, die B-Kette (Abrin-b) bindet an D-Galactosereste (siehe, Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095 (1988); und Olsnes, Methods Enzymol. 50:330–335 (1978)).
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Toxin Pseudomonas Exotoxin (PE). Der Begriff "Pseudomonas Exotoxin", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein natives (natürlich vorkommendes) PE voller Länge oder auf ein PE, das modifiziert worden ist. Solche Modifikationen können die Elimination der Domäne Ia, verschiedene Aminosäure-Deletionen in den Domänen Ib, II und III, Substitutionen einzelner Aminosäuren und die Addition einer oder mehrerer Sequenzen, wie z.B. KDEL (SEQ ID NO:17) und REDL (SEQ ID NO:16), an den Carboxyterminus einschließen, sind aber nicht darauf limitiert. Siehe z.B. Siegall et al., J. Biol, Chem. 264: 14256–14261 (1989). In einer bevorzugten Ausführungsform behält das cytotoxische Fragment des PE mindestens 50 %, bevorzugt 75 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und am meisten bevorzugt 95 % der Cytotoxizität des nativen PE bei. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das cytotoxische Fragment toxischer als natives PE.
Natives Pseudomonas Exotoxin A (PE) ist ein extrem aktives monomeres Protein (Molekulargewicht 66 kD), das durch Pseudomonas aeruginosa abgesondert wird und die Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen inhibiert. Die native PE-Sequenz ist in dem allgemein übertragenen US-Patent 5602095 beschrieben, das durch Querverweis in diese Offenbarung aufgenommen wird. Die Wirkungsmethode ist die Inaktivierung der ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 (EF-2). Das Exotoxin enthält drei strukturelle Domänen, die bei der Verursachung der Cytotoxizität zusammen wirken. Die Domäne Ia (Aminosäuren 1-252) vermittelt die Zellbindung. Die Domäne II (Aminosäuren 253–364) ist verantwortlich für die Translokation in das Cytosol, und die Domäne III (Aminosäuren 400–613) vermittelt die ADP-Riboyslierung des Elongationsfaktors 2. Die Funktion der Domäne Ib (Aminosäuren 365–399) bleibt unklar, obwohl ein großer Teil, nämlich die Aminosäuren 365–380, ohne Verlust der Cytotoxizität entfernt werden kann. Siehe oben bei Siegall et al., (1989).
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete PE schließt die native Sequenz, cytotoxische Fragmente der nativen Sequenz und konservativ modifizierte Varianten des nativen PE und seiner cytotoxischen Fragmente ein. Cytotoxische Fragmente des PE umfassen solche, die mit oder ohne anschließende proteolytische oder sonstige Prozessierung in der Target-Zelle (z.B. als Protein oder Vorläuferprotein) cytotoxisch sind. Cytotoxische Fragmente des PE schließen PE40, PE38, und PE35 ein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das PE so modifiziert worden, dass unspezifische Zellbindungen reduziert oder eliminiert werden, häufig durch die Deletion der Domäne Ia, wie in dem US-Patent 4892827 gelehrt, obwohl dies z.B. auch durch Mutation bestimmter Reste der Domäne Ia erreicht werden kann. Das US-Patent 5512658 offenbart z.B., dass ein mutiertes PE, in dem die Domäne Ia anwesend ist, aber in dem die basischen Reste der Domäne Ia an den Positionen 57, 246, 247, und 249 durch saure Reste (Glutamat oder "E") ersetzt worden sind, stark verminderte unspezifische Cytotoxizität aufweist. Diese mutante Form des PE wird manchmal als PE4E bezeichnet.
PE40 ist ein trunkiertes Derivat des PE, das bereits im Stand der Technik beschrieben ist. Siehe Pai et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 88: 3358–62 (1991); und Kondo et al., J. Biol. Chem. 263: 9470–9475 (1988). PE35 ist ein 35 kD carboxyterminales Fragment des PE, in dem die Aminosäurereste 1–279 deletiert worden sind und das Molekül mit einem Methionin an Position 280 beginnt, gefolgt von den Aminosäuren 281–364 und 381–613 des nativen PE. PE35 und PE40 sind zum Beispiel in den US-Patenten 5602095 und 4892827 offenbart.
In den am stärksten bevorzugten Ausführungsformen ist das cytotoxische Fragment PE38. PE38 ist ein trunkiertes PE pro-Protein, das aus den Aminosäuren 253–364 und 381–613 zusammengesetzt ist, und durch Prozessierung in einer Zelle zu seiner cytotoxischen Form aktiviert wird (siehe z.B. das US-Patent 5608039, und Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333: C1-C6 (1997)).
Wie oben angemerkt, kann ein Teil oder die gesamte Domäne Ib deletiert werden, und die verbleibenden Bereiche über einen Linker oder direkt über eine Peptidbindung verbunden werden. Ein Teil des Aminobereichs der Domäne II kann deletiert werden. Überdies kann das C-terminale Ende die native Sequenz der Reste 609–613 (REDLK) (SEQ ID NO:15) oder eine Variante, von der festgestellt wurde, dass sie die Fähigkeit des Konstrukts, in das Cytosol überzutreten, bewahrt hat, wie z.B. REDL (SEQ ID NO:16) oder KDEL (SEQ ID NO:17), sowie Wiederholungen dieser Sequenzen enthalten. Siehe z.B. die US-Patente. 5854044; 5821238; und 5602095 und die WO 99/51643. Während in bevorzugten Ausführungsformen das PE PE4E, PE40 oder PE38 ist, kann jede Form des PE, in der die unspezifische Cytotoxizität eliminiert oder auf ein Ausmaß reduziert worden ist, bei dem eine Toxizität gegenüber nicht-Targetzellen nicht auftritt, in den Immunotoxinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange diese die Fähigkeit der Translokation und der EF-2-Ribosylierung der Targetzelle beibehalten.
A. Konservativ modifizierte Varianten des PE
Konservativ modifizierte Varianten des PE oder dessen cytotoxischer Fragmente haben auf Aminosäure-Level eine Sequenz-ähnlichkeit von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 % Sequenz-ähnlichkeit, noch bevorzugter mindestens 90 % Sequenz-ähnlichkeit und besonders bevorzugt mindestens 95 Sequenz-ähnlichkeit mit dem interessierenden PE, wie z.B. PE38.
Der Begriff "konservativ modifizierte Varianten" ist sowohl auf Aminosäuresequenzen als auch auf Nucleinsäuresequenzen anwendbar. Im Hinblick auf bestimmte Nucleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf solche Nucleinsäuresequenzen, die für identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder, wenn die Nucleinsäure nicht für eine Aminosäuresequenz codiert, auf im wesentlichen identische Nucleinsäuresequenzen. Auf Grund der Degeneration des genetischen Codes wird ein gegebenes Polypeptid durch eine große Anzahl von funktionell identischen Nucleinsäuren codiert. Zum Beispiel codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle für die Aminosäure Alanin. Daher kann an jeder Position, wo ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon in jedes andere der beschriebenen korrespondierenden Codons verändert werden, ohne das codierte Polypeptid zu verändern. Solche Veränderungen der Nucleinsäure sind "stille Variationen", die eine Unterart der konservativ modifizierten Variationen sind. Jede Nucleinsäuresequenz in dieser Schrift, die für ein Polypeptid codiert, beschreibt auch jede mögliche stille Variation der Nucleinsäure. Der Fachmann wird wissen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (mit Ausnahme von AUG, welches gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist) verändert werden kann und ein funktionell identisches Molekül liefert. Demgemäß wird mit jeder beschriebenen Sequenz jede stille Variation einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, impliziert.
Bezüglich Aminosäuresequenzen wird der Fachmann wissen, dass individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen einer Nucleinsäure, einem Peptid, Polypeptid oder einer Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren in der codierten Sequenz verändern, hinzufügen oder entfernen, konservativ modifizierte Varianten sind, bei denen die Veränderung in der Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure resultiert.
B. Testen der Cytotoxizität von PE
Die in der Erfindung verwendeten Pseudomonas Exotoxine können mit Assays, die Fachleuten wohlbekannt sind, auf das gewünschte Niveau der Cytotoxizität getestet werden. Beispielhafte Toxizitäts-Assays sind im Stand der Technik wohlbekannt. Daher können cytotoxische Fragmente des PE und konservativ modifizierte Varianten solcher Fragmente in einfacher Weise auf Cytotoxizität getestet werden. Eine große Anzahl von PE-Kandidatenmolekülen kann mittels aus dem Stand der Technik wohlbekannter Methoden zeitgleich auf Cytotoxizität getestet werden. Zum Beispiel können Untergruppen der Kandidatenmoleküle auf Cytotoxizität getestet werden. Positiv reagierende Untergruppen der Kandidatenmoleküle können wiederum unterteilt und erneut getestet werden, bis das oder die gewünschte(n) cytotoxische(n) Fragmente) identifiziert ist (sind). Solche Methoden ermöglichen ein schnelles Screening großer Mengen cytotoxischer Fragmente oder konservativer Varianten des PE.
C. Verbinden von Target-Abschnitten und Toxinen
Der toxische Abschnitt und der Antikörper können mit chemischen oder rekombinanten Mitteln verbunden werden (siehe Rybak et al., (1995) Tumor Targeting 1: 141). In den Immunotoxinen der Erfindung werden die Target- und die Toxin-Abschnitte über ein Linkermolekül verbunden, bei dem es sich üblicherweise um ein kurzes Peptid handelt. Chemische Modifikationen schießen beispielsweise die Derivatisierung zum Zweck der Bindung der Abschnitte an den Linker mittels Methoden, die im Stand der Proteinchemie-Technik wohlbekannt sind, ein. Geeignete Mittel zur Bindung des toxischen Abschnitts und des Erkennungs- Abschnitts an den Linker umfassen ein heterobifunktionales Kopplungsreagenz, das letztlich zur Bildung einer intermolekularen Disulfidbrücke zwischen den Abschnitten und dem Linker beiträgt. Andere Arten von Kopplungsreagenzien, die in dieser Eigenschaft für die vorliegende Erfindung nützlich sind, sind beispielsweise in dem US-Patent 4545985 beschrieben. Alternativ kann zweckmäßigerweise zwischen Cysteinen in beiden Abschnitten, die dort natürlich vorkommen oder durch Gentechnologie eingefügt worden sind, ein intermolekulares Disulfid ausgebildet werden. Die Mittel zur Bindung von Abschnitten können auch Thioether-Bindungen zwischen heterobifunktionalen quervernetzenden Reagenzien oder spezifische, bei niedrigem pH spaltbare Quervernetzer, spezifische durch Proteasen spaltbare Linker, oder andere spaltbare oder nicht spaltbare chemische Bindungen verwenden. Die Mittel zur Bindung von Abschnitten der Immunotoxine können auch eine Peptidbindung, die zwischen Abschnitten, die mit Standard-Peptidsynthese-Chemie oder rekombinanten Mitteln separat synthetisiert wurden, ausgebildet wird, umfassen.
Mögliche gentechnologische Modifikationen der verschiedenen Proteine oder Bereiche der Immunotoxine schließen die Kombination der jeweiligen maßgeblichen funktionellen Domänen in einem einkettigen, multifunktionellen biosysnthetischen Protein, das aus einem einzelnen durch rekombinante DNA-Techniken abgeleiteten Gen exprimiert worden ist, ein (siehe z.B. die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO/88/09344). Darüber hinaus können rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um das rekombinante Toxin und den Antikörper an den Linker zu binden. Dementsprechend kann das Immunotoxin ein fusioniertes Protein umfassen, das an einem Ende mit dem Toxin beginnt, und an dem anderen mit dem Antikörper endet.
Verfahren für Herstellung von rekombinanten Fusionsproteinen sind Fachleuten wohlbekannt. So beschreiben zum Beispiel Chaudhary et al., (1989) Nature 339: 394; Batra et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 15198; Batra et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8545; und Chaudhary et al., (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 1066 die Herstellung verschiedener einkettiger Antikörper-Toxin-Fusionsproteine.
Grundsätzlich umfasst die Herstellung von Immunotoxin-Fusionsproteinen das separate Herstellen der DNA, die für den Antikörper, das Antikörperfragment (z.B. die schweren und leichten Ketten des Fv), oder den Liganden codiert, der DNA, die für den Linker codiert, und der DNA, die für das zu verwendende Toxin codiert. Die Sequenzen werden dann in einem Plasmid oder einem anderen Vektor kombiniert, um ein Konstrukt zu bilden, das für das jeweils gewünschte chimäre Protein codiert. Ein einfacherer Ansatz umfasst die Insertion der DNA, die für das jeweilige Antikörperfragment (z.B. die Fv-Region) oder den Liganden codiert, in ein Konstrukt, das bereits für das gewünschte Toxin und den Linker codiert.
Daher wird zum Beispiel DNA, die für anti-Tac Antikörper/Toxinlimmunotoxine codiert, am einfachsten hergestellt, in dem die DNA, die für die VH- und VL-Ketten des Antikörpers (Fv-Region) codiert, in Konstrukte inseriert wird, die bereits DNA enthält, die für das gewünschte Toxin und den Linker codieren, oder umgekehrt. Die DNA-Sequenz, die für die Fv-Region codiert, wird in das Konstrukt mittels Techniken, die den Fachleuten wohlbekannt sind, inseriert.
Säugetierzellen wurden verwendet, um Hybridmoleküle, wie z.B. Antikörper-Cytokine (Hoogenboom et al., (1991) Biochem. Biophys. Acta 1096: 345; Hoogenboom et al., (1991) Mol. Immunol. 28: 1027) und Antikörper-Enzyme (Casadei et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2047; Williams et al., (1986) Gene 43: 319) zu exprimieren und sezernieren. Zum Teil wird die Immunogenität fremder Proteine durch fehlerhafte Glycosylierungsmuster auf rekombinanten Proteinen verursacht. Daher werden eukaryotische Zelllinien gegenüber prokaryotischen Zellen bevorzugt, da die exprimierten Proteine glycosyliert sind. Vom Menschen abgeleitete Zelllinien werden besonders bevorzugt, da diese Zellen Sialinsäure als terminales Glycosid enthalten. Zelllinien, wie z.B. die Hamster CHO und BHK, und auch die menschliche HEK-293 Fibroblastenlinie wurden verwendet, um rekombinante menschliche Proteine zu exprimieren.
Andere gentechnologische Modifikationen der Protein-Abschnitte der Immunotoxine dieser Erfindung schließen Deletionen funktionell nicht notwendiger Domänen zur Reduktion der Größe des Proteins oder zur Modifikationen anderer Parameter, die die Herstellung oder Verwendung erleichtern, ein, wie z.B.
Sequenzänderungen zur Beeinflussung der Löslichkeit (z.B. Cystein gegen Serin) oder Glycosylierungsstellen. Ein Fachmann wird wissen, dass viele andere bekannte chemische und genetische Modifikationen der Proteine vorteilhaft für jedes Protein angewendet werden können.
Bevorzugte Immunotoxine der vorliegenden Erfindung sind chimäre Proteine, die als toxischen Abschnitt ein Pseudomonas Exotoxin (PE) enthalten, das modifiziert worden ist, um unspezifische Zellbindungen zu reduzieren oder zu eliminieren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der toxische Abschnitt eine trunkierte Form des PE mit einem MG von 38 kD (PE38), das eine Deletion in seiner zellbindenden Domäne aufweist, und über ein kurzes Peptid mit einem Fv-Fragment des monoklonalen anti-human Tac-Antikörpers, der an die IL-2 Rezeptor α-Untereinheit bindet, verbunden ist. Die Konstruktion dieser einmaligen Verbindung des Fusionsproteins zwischen dem Toxin und dem Antikörper eliminiert die Heterogenität chemisch verbundener Antikörper/Toxin-Proteinkonjugate. Dies, so wird angenommen, kann zu der erhöhten Wirksamkeit und der verminderten Immunogenität des Immunotoxins beitragen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Fv-Bereich des anti-Tac-Antikörpers mit PE38 über einen Peptidconnector mit der Sequenz ASGGPE verbunden.
Die Erfindung schließt Nucleinsäure-Konstrukte, die für die neuen, hier beschriebenen Proteine codieren, ein. Ein Nucleinsäure-Konstrukt ist etwas, das, wenn es in einen geeigneten Vektor eingebaut wird, in der Lage ist, sich in einem Wirt zu replizieren. Die Konstrukte können mit anderen Sequenzen, die die Expression des Konstrukts beeinflussen können, verbunden werden, wie z.B. mit Promotoren und Enhancern.
D. Verwendungen der Immunotoxine
Die Immunotoxine der vorliegenden Erfindung können für die selektive Inhibition oder Abtötung von Zellen, gegen die die Immunotoxine über den Target-Abschnitt gerichtet sind, verwendet werden, und zwar durch Kontaktierung der Zellen mit dem Immunotoxin. Dieses Verfahren basiert auf der geeigneten Auswahl eines Antikörpers oder Liganden, der an Merker auf der Zelloberfläche bindet, die spezifisch oder überwiegend bei dem Zelltyp gefunden werden, der selektiv abgetötet werden soll. Z.B. schließen die Immunotoxine dieser Erfindung solche ein, die einem Antikörper enthalten, der an die IL-2 Rezeptor α-Untereinheit (CD25) bindet. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Immunotoxine der Erfindung verwendet, um das Wachstum von Zellen hämatologisch bösartiger CD25+ Erkrankungen einschließlich Haarzell-Leukämie (HCL), kutanem T-Zell Lymphom, chronischer lymphatischer Leukämie, Morbus Hodgkin, und adulter T-Zell Leukämie, zu inhibieren bzw. diese zu töten. Die Immunotoxine können z.B. zu Zellkulturen hinzugefügt werden, um die Kultur von Zellen bösartiger CD25+ Erkrankungen zu befreien, oder das Wachstum solcher Zellen in der Kultur zu inhibieren. Die Immunotoxine können weiterhin in vivo verwendet werden, um das Wachstum bösartiger Zellen in einem Organismus zu inhibieren.
VII. Immunokonjugate, bei denen es sich nicht um Immunotoxine handelt
Zusätzlich zu Immunotoxinen stellt die vorliegende Erfindung andere Immunokonjugate mit größerer Stabilität und reduzierter Immunogenität als bei solchen, die bereits erhältlich sind, bereit. So kann ein Antikörper über einen Linker an ein therapeutisches Agens gebunden werden, oder an einem Marker, der direkt zu Zellen gebracht werden soll, die ein Antigen tragen, das spezifisch durch den Antikörper erkannt wird. Therapeutische Agenzien schließen solche Verbindungen wie Nucleinsäuren, Proteine, Peptide, Aminosäuren oder Derivate, Glycoproteine, Radioisotope, Lipide, Kohlenhydrate oder rekombinante Viren ein. Therapeutische und diagnostische Nucleinsäure-Abschnitte umfassen Antisense-Nucleinsäuren, derivatisierte Oligonucleotide für die kovalente Quervernetzung mit einzel- oder doppelsträngiger DNA, und triplex-bildende Oligonucleotide.
Alternativ kann das Molekül, das mit einem Antikörper oder einem anderen Target-Abschnitt verbunden ist, ein Verkapselungssystem sein, wie z.B. ein Liposom oder eine Micelle, das oder die eine therapeutische Verbindung enthält, wie zum Beispiel einen Arzneistoff, eine Nucleinsäure (zum Beispiel eine Antisense-Nucleinsäure) oder einen anderen therapeutischen Abschnitt, der vorzugsweise vom direkten Kontakt mit dem Kreislaufsystem abgeschirmt wird. Mittel zur Herstellung von Liposomen, die an Antikörper gebunden sind, sind den Fachleuten wohlbekannt.
Siehe z.B. das US-Patent 4957735; und Connor et al., Pharm. Ther. 28: 341–365 (1985).
A. Detektierbare Marker
Antikörper oder andere Liganden können wahlweise kovalent oder nicht kovalent an einen detektierbaren Marker gebunden sein. Detektierbare Marker, die für diese Verwendungen geeignet sind, schließen jede durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunachemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbare Verbindung ein. Für die vorliegende Erfindung nützliche Marker schließen magnetische Beads (z.B. DYNABEADS), Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas Red, Rhodamin, Grün fluoreszierendes Protein, und ähnliches), Radiomarker (z.B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, oder ³²P), Enzyme (z.B. Meerrettischperoxidase, alkalische Phosphatase und andere häufig in einem ELISA verwendete Enzyme), und colorimetrische Marker, wie z.B. kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastikbeads (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.), ein. Metallchelate können mit Antikörpern oder anderen Target-Abschnitten mit im Stand der Technik wohlbekannten Methoden verbunden werden. Siehe z.B. Robert, B. et al., Cancer Res., 56: 47584765 (1996). Zum Beispiel wurden bispezifische Antikörper entwickelt, die an Tumoren und an Metallchelate binden können (Stickney, D. et al., Cancer Res. 51(24): 6650-5 (1991); Rouvier, E. et al., Horm. Res. 47(6): 163–167 (1997)). Diese Chelate können für Abbildungszwecke oder zum Töten von Zellen Radioisotope wie z.B. ¹¹¹Indium enthalten. Die Techniken aus dem Stand der Technik können auf die vorliegende Erfindung angewendet werden, in dem z.B. ein Antikörper, der bispezifisch für das Chelat und den Target-Abschnitt des Immunokonjugats ist, als Linkermolekül verwendet wird. In diesem Fall kann der bispezifische Antikörper für die PEGylierung verändert werden, z.B. in dem ein Cystein exponiert auf der Oberfläche des Rückgrat-Bereichs des Antikörpers eingebaut wird.
Fachleuten sind Mittel zur Detektion solcher Marker wohlbekannt. So können z.B. Radiomarker mit fotografischem Film oder Scintillationszählern detektiert werden, fluoreszierende Marker können mit einem Fotodetektor detektiert werden, der das emittierte Licht detektiert. Enzymatische Marker werden typischerweise detektiert, in dem dem Enzym ein Substrat zur Verfügung gestellt wird und das Reaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat erzeugt wird, detektiert wird, und colorimetrische Marker werden durch einfache Visualisierung des gefärbten Markers detektiert
B. Bindung an den Antikörper oder ein anderes Targetmolekül
In einer nicht-rekombinanten Ausführungsform der Erfindung werden Effektormoleküle, z.B. therapeutische, diagnostische oder Detektions-Abschnitte, über ein Linkermolekül mit dem Targeting-Molekül verbunden, wobei jegliche Mittel, die den Fachleuten bekannt sind, verwendet werden. Es können Mittel sowohl für die kovalente als auch für die nicht-kovalente Bindung verwendet werden.
Das Verfahren für die Bindung eines Effektormoleküls an einen Linker variiert entsprechend der chemischen Struktur des EM. Polypeptide enthalten typischerweise eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, z.B. Carboxylgruppen (COOH), freie Aminogruppen (-NH2) oder Sulfhydrylgruppen (-SH), die für die Reaktion mit einer funktionellen Gruppe eines Peptids verwendet werden können.
Alternativ wird der Antikörper derivatisiert, um zusätzliche reaktive funktionelle Gruppen aufzuweisen oder zu binden. Die Derivatisierung kann die Bindung jeglichen Moleküls aus einer Auswahl einbeziehen, wie sie z.B. bei Pierce Chemical Company, Rockford, III., erhältlich sind, um solche Konjugate zu ermöglichen.
Unter einigen Umständen ist es wünschenswert, das Effektormolekül von dem Targeting-Molekül zu lösen, wenn das Immunokonjugat seinen Zielort erreicht hat. Daher werden unter diesen Umständen Immunokonjugate Bindungen aufweisen, die in der Nähe des Zielortes aufgespalten werden können. Die Spaltung der Linker zur Lösung des Effektormoleküls vom Linkermolekül kann durch enzymatische Aktivität oder durch Bedingungen, welchen das Immunokonjugat entweder in der Targetzelle oder in der Nähe des Zielorts ausgesetzt ist, gefördert werden. Wenn der Zielort ein Tumor ist, kann ein Linker verwendet werden, der unter Bedingungen, die am Tumorort herrschen (z.B. wenn dieser tumor-zugehörigen Enzymen oder saurem pH ausgesetzt ist), gespalten werden kann.
Im Hinblick auf die große Anzahl von Methoden, die für die Bindung einer Vielzahl von radiodiagnostischen Verbindungen, radiotherapeutischen Verbindungen, Arzneistoffen, Toxinen und anderen Agenzien an Antikörper beschrieben worden sind, wird der Fachmann in der Lage sein, eine geeignete Methode für die Bindung eines gegebenen Agens an einen Antikörper oder ein anderes Polypeptid zu bestimmen.
VIII. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Zusammensetzungen, die die Immunokonjugate der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger aufnehmen. Bei therapeutischen Anwendungen werden einem Patienten, der unter einer Krankheit leidet, Zusammensetzungen in einer Menge verabreicht, die ausreicht, den Fortschritt der Krankheit und ihrer Komplikationen zu verlangsamen, oder die Krankheit und ihre Komplikationen teilweise oder vollständig anzuhalten. Die Menge, die ausreicht, um eines oder mehrere dieser Ziele zu erreichen, wird als therapeutisch wirksame Dosis definiert. Die für diese Zwecke wirksamen Mengen hängen von der Schwere der Krankheit und dem gesundheitlichen Gesamtzustand des Patienten ab.
Die Immunokonjugate der vorliegenden Erfindung können mit verschiedenen Mitteln, die für verschiedene Zwecke geeignet sind, verabreicht werden. Zum Beispiel können Immunotoxine der Erfindung verwendet werden, um an Tumoren in verschiedenen Bereichen des Körpers zu binden, und zwar gemäß Methoden, die aus dem Stand der Technik für andere Immunotoxine bekannt sind (siehe z.B. Rybak et al, (1990) Human Cancer Immunology, in "Immunology und Allergy Clinics of America," W. B. Saunders, und die dort zitierten Literaturverweise). Die Immunotoxine können systemisch per Injektion verabreicht werden, besonders bevorzugt durch intravenöse Injektion, aber auch durch intramuskuläre, subkutane, intrathekale, oder intraperitoneale Injektion, oder durch Injektion in Vaskulärräume oder in Gelenke, z.B. durch intraartikulare Injektion.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Immunokonjugat und einem pharmazeutisch aktivierbaren Träger aufweisen, besonders auf solche Zusammensetzungen, die sich für die oben genannten Verabreichungsmittel eignen. Die Dosis wird von den Eigenschaften des verwendeten Immunokonjugats, z.B. seiner Aktivität und seiner biologischen Halbwertszeit, der Konzentration des Immunokonjugats in der Zusammensetzung, dem Ort und der Häufigkeit der Dosierung, der klinischen Toleranz des betreffenden Patienten und ähnlichenm abhängen, und hängt außerdem vom Wissen und Können des Arztes ab.
Abhängig von der Dosierung und der Häufigkeit, die erforderlich ist und vom Patienten toleriert wird, können die Zusammensetzungen einfach oder mehrfach verabreicht werden. Zum Beispiel sollte die Zusammensetzung im Hinblick auf die Verabreichung von Immunotoxinen eine ausreichende Menge des erfindungsgemäßen Immunotoxins aufweisen, um den Fortschritt der Krankheit oder ihrer Komplikationen zu verlangsamen oder zu stoppen.
Die Zusammensetzung für die Verabreichung kann eine Lösung des Immunokonjugats, wie z.B. eines Immunotoxins, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger aufweisen. Es kann eine Vielzahl von wässrigen Trägern verwendet werden, wie z.B. gepufferte Salzlösung oder ähnliches. Diese Lösungen sind steril und grundsätzlich frei von unerwünschten Stoffen. Diese Zusammensetzungen können mittels konventioneller, wohlbekannter Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzung kann pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, die erforderlich sind, um physiologische Bedingungen zu erreichen, wie z.B. pH-anpassende und puffernde Agenzien, Agenzien zur Anpassung der Toxizität und ähnlichem, wie z.B. Natriumazetat, Natriumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumlaktat und ähnliches. Der pH der Lösung liegt vorzugsweise im Bereich zwischen pH 5 und 9.5, und ist bevorzugt pH 6.5 bis 7.5. Typischerweise liegen die Immunokonjugate oder ihre Derivate in einer Lösung vor, die einen geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Puffer wie z.B. Phosphat, Tris (hydroxymethyl) Aminomethan-HCl, Citrat oder ähnliches aufweist. Die Pufferkonzentrationen sollten sich im Bereich zwischen 1 und 100 mM bewegen. Die Lösung der Immunokonjugate kann auch ein Salz enthalten, wie z.B.
Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in einer Konzentration von 50 bis 150 mM. Eine wirksame Menge eines stabilisierenden Agens, wie z.B. Albumin, eines Globulins, eines Detergenz, eines Gelatins, eines Protamines oder seines Salzes des Protamins kann ebenfalls enthalten sein und einer Lösung mit dem Immunokonjugat bzw. der Zusammensetzung, aus der die Lösung hergestellt wird, beigefügt werden. Die systemische Verabreichung des Immunokonjugats wird typischerweise jeden zweiten oder dritten Tag oder einmal pro Woche durchgeführt. Alternativ ist die tägliche Verabreichung nützlich. Die übliche Verabreichung ist entweder intramuskuläre Injektion oder intravaskuläre Infusion.
Typische pharmazeutische Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung liegen zwischen ungefähr 0.01 bis 100 mg pro Patient und Tag. Dosierungen von 0.1 bis ungefähr 1000 mg pro Patient pro Tag können verwendet werden, insbesondere wenn der Arzneistoff an einer abgelegen Stelle und nicht in den Blutstrom verabreicht wird, wie z.B. in einen Tumor oder ein Organ, in dem sich ein Tumor befindet. Aktuelle Methoden für die Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind Fachleuten bekannt oder naheliegend und werden genauer in solchen Publikationen wie Remingtons Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., (1980), beschrieben.
Die Verabreichung kann auch intranasal oder über andere nicht parenterale Wege erfolgen. Das Immunokonjugat kann auch mittels Microspheres, Liposomen oder anderen mikropartikulären Dosiersystemen, die in bestimmten Geweben einschließlich Blut angeordnet sind, verabreicht werden.
Das Immunokonjugat kann auch über ein Aerosol verabreicht werden, um eine lokalisierte Abgabe an die Lungen zu erreichen. Dies wird durch Zubereitung eines wässrigen Aerosols, das eine Liposomen-Zubereitung, feste Partikel oder deren Derivate enthält, bewerkstelligt. Eine nicht wässrige Suspension (z.B. Fluorkohlenstoff-Treibgas) könnte verwendet werden. Für die Herstellung von Aerosolen werden bevorzugt Ultraschall-Vernebler verwendet. Ultraschall-Vernebler minimieren die Beeinträchtigung der Antikörper oder deren Derivate durch Scherkräfte, was zu einem Abbau des Immunokonjugats führen kann.
Gewöhnlich wird ein wässriges Aerosol hergestellt, in dem eine wässrige Lösung oder Suspension des Immunokonjugats mit konventionellen pharmazeutisch verträglichen Trägern und Stabilisatoren kombiniert wird. Die Träger und Stabilisatoren variieren in Abhängigkeit von den Erfordernissen für das jeweilige Immunokonjugat, enthalten aber typischerweise nichtionische Tenside (TWEEN-20 oder –80, PLURONIC-F128 –67(R), oder Polyethylenglycol), unschädliche Proteinen wie Serumalbumin, oder Sorbitanester, Ölsäure, Lecithin, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Puffer, Salze, Zucker oder Zuckeralkohole. Die Zusammensetzungen sollen steril sein. Aerosole werden grundsätzlich aus isotonischen Lösungen hergestellt.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur selektiven Tötung von Zellen mit einem selektiven Immunotoxin der vorliegenden Erfindung, das eine Liganden oder einen Antikörper aufweist, der unter Bedingungen, die die Bindung des Liganden oder Antikörpers erlauben, spezifisch für ein Target auf der Oberfläche der zu tötenden Zellen ist. Die Bindung des Liganden oder Antikörpers an den Oberflächenmarker bewirkt, dass das Toxin (z.B. PE oder PE38) die Zelle selektiv tötet. Dieses Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für die in vitro-Separation von Zellen verwendet werden, in dem unerwünschte Zelltypen selektiv getötet werden, z.B. in Knochenmark vor dessen Transplantation in einen Patienten, der unter Konchenmarksschwund aufgrund von Bestrahlung leidet.
IX. BEISPIELE
A. Material und Methoden
1. Reagenzien
Methoxy-Polyethylenglycol-Maleimid (PEG-Maleimid, MG: 5,000 oder 20,000) wurde über Fluka oder Shearwater Polymer bezogen. Andere Reagenzien wurden über Standardquellen bezogen.
2. Bakterienlinien und Plasmids
E. coli DH5 α (MAX Wirksamkeit) von Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, Md.) wurde für die Vermehrung der Plasmide verwendet. E. coli CJ236 (Bio-Rad) wird für die Herstellung einzelsträngiger Uracil-enthaltender Phagen-DNA verwendet, die als Matritze für die Oligodeoxynucleotid-gerichtete Mutagenese diente. E. coli BL21 (λDE3), das auf einem λ-Prophagen T7 das RNA-Polymerase-Gen unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors trägt, wurde als Wirt für die Expression der rekombinanten Immunotoxine verwendet. Das Plasmid pRK79 codiert für anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2) (Kreitman et al. (1994), siehe oben).
3. Mutagenese des LMB-2
Die Mutagenese des LMB-2 wurde mit Kunkels Methode (Kunkel et al. (1991) Methods Enzymol. 204: 125–139) durchgeführt, und zwar mit einigen schon früher beschriebenen Modifikationen (Onda et al. (1999), siehe oben). Mutationen im Plasmid wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
4. Expression und Reinigung der rekombinanten Immunotoxine
Die Bestandteile des LMB-2 (natives LMB-2) und cys1-LMB-2 wurden in E. coli BL21 (λDE3), das die entsprechenden Expressionsplasmide (pRK79 oder mutantes pRK79) enthält, wie bereits beschrieben wurde (Onda et al. (1999), siehe oben), hergestellt.
5. PEGylierung von cys1-LMB-2 mit einem Cystein
Eine typische Prozedur für die Herstellung von PEGylierte LMB-2 verläuft folgendermaßen: LMB-2 mit einer freien Thiolgruppe wurde in einer Phosphatgepufferten Salzlösung mit einem 30-fachen molaren Überschuss an 5-kDa oder 20-kDa PEG-Maleimid (PEGSK oder PEG20K) bei 25° C 12 h inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 20 Volumenanteilen von Puffer A (20 mM Tris-HCL 1 mM EDTA, pH 7.5) verdünnt, und dann direkt auf eine Q-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) gegeben, die zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Die Säule wurde mit fünfzig Volumenanteilen von Puffer A gewaschen, um ungebundenes PEG5K oder PEG20K zu entfernen, und dann mit Puffer B (1 M NaCl in Puffer A) eluiert. Die betreffenden Q-Sepharose-Fraktionen mit PEGylierten LMB-2 wurden gesammelt und mit 5 Volumenanteilen Puffer A verdünnt, und dann auf eine Mono-Q-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) geladen, die zuvor mit Puffer A equilibriert worden war, um PEGyliertes LMB-2 grob von nicht modifizierten cys1-LMB-2 zu trennen. Die Säule wurde mit zehn Volumenanteilen Puffer A gewaschen und dann mit einem NaCl-Gradienten (0–1 M) in Puffer A eluiert. Nach Konzentration der betreffenden Mono-Q-Fraktionen mit dem Centricon YM-10 (AMCON, Beverly, Mass.), wurden die rohen PEGylierten LMB-2 auf TSK G3000SW getrennt, die mit Phosphat-gepufferter Salzlösung equilibriert und eluiert wurde. Die erhaltenen PEGylierten LMB-2 waren gemäß der SDS-PAGE-Analyse extrem rein.
Der Gehalt an freien Sulfhydrylgruppen wurde mit der DTNB-Methode (Riddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75–81) bestimmt.
Der PEG-Gehalt wurde mit Hilfe einer Modifikation der Methode von Childs (Childs (1975) Microchem. J. 20:190–192) getestet. Als Standard wurde PEGSK oder PEG20K verwendet.
6. Cytotoxizitäts-Assay
Die spezifische Cytotoxizität von nativen cys1-LMB-2 und PEGylierten LMB-2 wurde mit Hilfe eines Proteinsynthese-Inhibitionsassay mit ATac-4 Zellen (Kreitman et al. (1994), siehe oben) bewertet.
7. Stabilitäts-Assay
Die Stabilität von LMB-2 , cys1-LMB-2 und PEGyliertem LMB-2 wurde durch Inkubation bei einer finalen Konzentration von 10 μg/ml in Mausserum bei 37° C bestimmt. Die Menge des aktiven, nach verschiedenen Inkubationszeiten verbliebenen Immunotoxins wurde mit einem ATac4 Cytotoxizität-Assay bestimmt.
B. Assay auf unspezifische Toxizität
Gruppen von 4, 5 oder 7 weiblichen BALB/c-Mäusen (6–7 Wochen alt, ungefähr 20 g) wurde in ansteigenden Dosen intravenös 200 μl LMB-2, cys1-LMB-2 und PEGyliertes LMB-2 injiziert. PBS mit 0.2 % BSA wurde als Lösungsmittel verwendet. Der LD50 bezeichnet die berechnete Dosis an rekombinanten Immunotoxin, die 50 % der Tiere tötet.
9. Antitumor-Studie
Antitumor-Aktivitäten der Immunotoxine wurden an Mäusen, die ATac-4-Tumoren trugen, bestimmt. ATac-4 Zellen (2 × 10⁶) wurden Nacktmäusen (Athymische Ncr nu/nu; 7 Wochen alt; ungefähr 20 g) an Tag 0 subkutan eingeimpft. Beginnend mit Tag 4 wurden die Mäuse mit intravenösen Immunotoxin-Injektionen behandelt. PBS mit 0.2 % BSA wurde als Lösungsmittel verwendet, und 10 μg PEG5K oder PEG20K pro Maus wurden als Kontrollen verwendet. Die Therapie wurde an den Tagen 4, 6 und 8 verabreicht. Jede Behandlungsgruppe bestand aus fünf Mäusen. Die Tumoren wurden alle zwei Tage mit einer Schieblehre vermessen, und das Volumen des Tumors wurde mit Hilfe der folgenden Formel berechnet: Tumorvolumen (in mm3) = Länge × Breite2 × 0.4.
10. Pharmakokinetischer Assay
Normalen weiblichen BALB/c-Mäusen (6–7 Wochen alt; ungefähr 20 g) wurden 2 μg der verschiedenen Immunotoxine intravenös injiziert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Blutproben gezogen. Der Titer des rekombinanten Immunotoxins wurde in einem Bioassay gemessen, in dem verdünnte Serumproben mit ATac-4-Zellen inkubiert wurden, und es wurde die Fähigkeit der Serumproben gemessen, die Proteinsynthese zu inhibieren. Die Daten wurden mit dem Programm RSTRIP (Version 5, MicroMath Scientific Software) zum Fitten von exponentiellen Kurven analysiert.
11. Immunogenicitäts-Assays
Weibliche BALB/c-Mäuse (6–7 Wochen alt; ungefähr 20 g) wurden in Fünfergruppen i.p. mit LMB-2 , cys1-LMB-2 bzw. PEGyliertem LMB-2 in PBS mit 0.2% Mausserumalbumin (MSA) in Dosen von 4 μg/Maus oder 40 μg/Maus immunisiert. Zwei Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die Mäuse erneut mit dem jeweiligen Antigen immunisiert. Nach der ersten Immunisierung wurden alle sieben Tage Blutproben gesammelt. Die spezifischen IgG-Titer im Serum wurden mittels Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) bestimmt, wobei ein anti-Maus IgG-Antikörper der Ziege, der an alkalische Phosphatase (ALP) gebunden war, und p-Nitrophenylphosphat als Substrat verwendet wurden. Die Platten waren mit LMB-2 beschichtet.
B. Ergebnisse
1. Herstellung und Charakterisierung des PEGylierten LMB-2
In LMB-2 ist der Fv-Bereich des anti-Tac-Antikörpers über einen Peptidconnector (ASGGPE (SEQ ID NO:1)) mit PE38 verbunden. Um den Verlust der Antigen-bindenden Funktionen, der Translokations-Funktionen und der ADP-ribosylierenden Funktionen des LMB-2 zu verhindern, die für dessen spezifische cytotoxische Aktivität gegen CD25+ Tumorzellen notwendig sind, wurde eine mutante Form des LMB-2 mit einem Cystein im Peptid (ASGCGPE (SEQ ID NO:2)), das Fv mit PE38, verbindet, hergestellt (1A). Das Cystein wurde für die ortsspezifische PEGylierung mittels freier Thiol-Chemie verwendet. Wie in 2 gezeigt, liefen die PEGylierten LMB-2 -Moleküle als einzelne Bande auf der SDS PAGE, wenn sie aus einer TSK-Größenausschlußsäule als einzelner Peak eluiert worden waren. 2 und Tabelle 1 zeigen, dass die spezifische in vitro-Cytotoxizität von cys1-LMB-2 gegen die ATac-4-Zelle (CD25+ Zellline) ähnlich der des nativen LMB-2 war. Wie erwartet enthielt jedes cys1-LMB-2 -Molekül eine freie Thiolgruppe, während natives LMB-2 dies nicht tat. Die Ausbeute an hochgereinigtem cys1-LMB-2 , das aus Inklusionskörpern aufbereitet worden war, betrug 7.0 %, was der des nativen LMB-2 (7.3%) entspricht.
Gereinigtes cys1-LMB-2 mit einer freien Thiolgruppe wurde durch Bildung einer Thioether-Bindung ortsspezifisch mitPEG5K- oder PEG20K-Maleimid modifiziert (1B). Nach der Reinigung hatten beide Typen des PEGylierten LMB-2 ähnliche cytotoxische Aktivitäten, wobei diese identisch mit denen des nicht modifizierten nativen und mutanten LMB-2 waren (2 und Tabelle 1). Nach ortsspezifischer PEGylierung des cys1-LMB-2 , hatte das PEGylierte LMB-2 keine freie Thiolgruppe mehr und enthielt stattdessen ungefähr 1 Mol PEG/Mol Protein.
2. Stabilität des PEGvlierten LMB-2 in Mausserum
Die Stabilitäten verschiedener LMB-2 Moleküle wurden gemessen, in dem diese in Mausserum bei 37° C für verschiedene Zeiträume inkubiert wurden (3). Sowohl native als auch mutante LMB-2 waren eine Stunde lang relativ stabil, und dann ging ihre cytotoxische Wirksamkeit in Abhängigkeit von der Zeit zurück. Im Gegensatz dazu waren beide PEGyliertens LB-2s stabil. Nach 24 h wiesen PEG5K- und PEG20K-LMB-2 zwischen 40 % und 50 % ihrer ursprünglichen Aktivität auf.
3. Toxizität des PEGvlierten LMB-2
Für Toxizitätsstudien wurden mehrere verschiedene Dosen jedes Immunotoxin-Typs intravenös in BALB/c-Mäuse injiziert. Fast alle Todesfälle traten innerhalb von vier Tagen nach der Behandlung auf. Tabelle 2 zeigt die Anzahl der toten Mäuse und die Gesamtanzahl der indizierten Mäuse, die 14 Tage nach der Behandlung aufgezeichnet wurde. Es wurde festgestellt, dass der LD50 des nativen und mutanten LMB-2 , wie in Tabelle 1 gezeigt, ungefähr 0.5 mg/kg betrug. Im Gegensatz dazu wurden die PEGylierten LMB-2 gut vertragen; die LD50-Werte von PEG5K-LMB-2 und PEG20K-LMB-2 betrugen ungefähr 3.0 mg/kg.
4. Antitumor-Aktivität des PEGvlierten LMB-2
Um die Antitumor-Aktivität zu ermitteln, wurden ATac-4-Zellen an Tag 0 subkutan in Nacktmäuse eingeimpft. Die Behandlung begann an Tag vier, wenn an diesem Tag die Tumoren bereits ungefähr 100 mm³ groß waren. Die Tiere wurden intravenös mit 3 Dosen behandelt, die an den Tagen 4, 6 und 8 verabreicht wurden. Die Kontrollgruppen erhielten Puffer (PBS mit 0.2 % BSA) oder 10μg PEG5K oder PEG20K. Native und mutante LMB-2 inhibierten das Tumorwachstum dosisabhängig (4). Die Antitumor-Aktivitäten beider nicht-PEGylierter LMB-2 waren ähnlich. Die Dosis, die erforderlich war, um das durchschnittliche Tumor-Volumen sechs Tage lang auf dem die Niveau der ersten Injektion zu halten, betrug 0.025 mg/kg × 3 bei LMB-2 und cys1-LMB-2 , und 0.006 mg/kg × 3 bei PEG5K-LMB-2 und PEG20K-LMB-2 . Vollständige Regressionen, die definiert waren als Verschwinden des Tumors ohne erneutes Wachstum nach mehr als 50 Tagen, wurden bei einer Dosis von 0.1 mg/kg × 3 des nativen oder mutanten LMB-2 bei 2 von 5 Mäusen bzw. 1 von 5 Mäusen beobachtet. Bei einer Dosis von 0.2 mg/kg × 3 starb jeweils eine von fünf Mäusen, denen entweder natives oder mutantes LMB-2 verabreicht worden war, während der Therapiephase aufgrund der Toxizität, aber in allen vier verbleibenden Mäusen wurden vollständige Regressionen beobachtet. Antitumor-Aktivitäten beider PEGylierter LMB-2 waren wesentlich verbessert. Vollständige Regressionen wurden bei einer Dosis von 0.025 mg/kg × 3 des PEG5K- bzw. PEG20K-LMB-2 in 1 von 5 Mäusen bzw. 2 von 5 Mäusen beobachtet. Bei einer Dosis von 0.05 mg/kg × 3 verursachte das PEGylierte LMB-2 vollständige Regressionen, die länger als 50 Tage anhielten. Bei gesonderter Verabreichung hatten PEG5K und PEG20K (10 μg/Maus) keine Antitumor-Aktivität. Insgesamt war, wenn eines der PEGylierte LMB-2 verwendet wurde, ungefähr die vierfache Dosis erforderlich, um vergleichbare Veränderungen im Tumorvolumen zu verursachen.
5. Pharmakokinetik des PEGylierten LMB-2
BALB/c-Mäusen wurde eine einfache Dosis mit 2 μg jeder Form des LM-2 intravenös injiziert. Zu Verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurden Proben gezogen und gegenüber ATac-4-Zellen auf ihre Immunotoxin-Titer getestet. Wie in 5 gezeigt, zeigten die Serumkonzentrations-Profile des nativen und Mutanten LMB-2 eine biexponentielle Eliminationskurve. Plasma-Halbwertszeiten der nicht modifizierten LMB-2 betrugen ungefähr 13 min (Tabelle 3). Im Gegensatz dazu zeigten die Serumkonzentrations-Profile beider PEGylierter LMB-2 monoexponentielle Eliminationskurven. Die Plasma-Halbwertszeit des PEG5K-LMB-2 war ungefähr fünffach erhöht und die des PEG20K-LMB-2 ungefähr achtfach. Die Fläche unter der Kurve und die mittlere Verweildauer beider PEGylierter LMB-2 war ebenfalls wesentlich erhöht.
6. Immunogenität des PEGylierten LMB-2
Um die Immunogenität zu beurteilen, wurden BALB/c Mäuse i.p. mit jeder Form des LMB-2 bei einer Dosis von 4 μg/Maus oder 40 μg/Maus an Tag 0 und 14 immunisiert.
An Tag 21 nach der ersten Immunisierung Serumproben entnommen wurden, und der Maus-anti-LMB-2 IgG-Antikörpertiter wurde mit ELISA unter Verwendung von nativem LMB-2 als Beschichtungs-Antigen bestimmt. Wie in 6 gezeigt, induzierte natives LMB-2 und mutantes LMB-2 in einer Dosis von 4 μg/Maus × 2 deutlich die Bildung von anti-LMB-2 IgG-Antikörpern in Mäusen. Höhere Dosen des nativen LMB-2 und mutanten LMB-2 konnten wegen der Toxizität gegenüber den Mäusen nicht verabreicht werden. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass die Immunogenität der beiden PEGylierten LMB-2 viel niedriger war. In dieser Studie wurde natives LMB-2 für die Detektion der Antikörper-Antwort verwendet, aber sehr ähnliche Resultate wurden erzielt, wenn mutantes LMB-2 oder PEGyliertes LMB-2 für die Beschichtung der Platten verwendet wurde.
C. Diskussion
Die ortsspezifische PEGylierung des rekombinanten Immunotoxins LMB-2 erhöht dessen Stabilität, Verweildauer im Blut und die Antitumor-Aktivität, während seine unspezifische Toxizität und Immunogenität reduziert werden. Alles in allem wird das therapeutische Fenster um mehr als das Zwanzigfache vergrößert. Diese Resultate haben wichtige klinische Auswirkungen für die Verwendung von Immunotoxinen bei Patienten.
In einer kürzlich beendeten klinischen Studie wurde LMB-2 35 Patienten gegeben und zeigte bei einer Vielzahl von bösartigen Erkrankungen eine Antitumor-Aktivität. Eine vollständige Antwort, die länger als zwei 20 Monate andauerte, wurde bei Haarzell-Leukämie beobachtet. Mehrere unterschiedliche Toxizitäten wurden in diesem Versuch beobachtet. Diese schließen Erhöhungen des Transaminase-Titers aufgrund von Leberschäden, Gewichtszunahme, Hypotonie und Fieber ein. Die toxischen Nebenwirkungen von rekombinanten Immunotoxinen sind zweierlei Typs.
Ein Typ geht auf die spezifische Bindung an normale Zellen, welche dasselbe Antigen wie die Tumorzellen exprimieren, zurück. Um diese Toxizität zu überwinden, kann es notwendig sein, ein Target-Antigen zu entdecken, das in normalen Zellen nicht exprimiert wird. Die Identifikation von neuen Tumor-spezifischen Antigenen erfolgt aktuell durch Analyse der Expressed Sequence Tag-Datenbanken (Vasmatzis et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 6: 300–304). Der andere Typ der Toxizität entsteht auf Grund undefinierter unspezifischer Adsorption und Aufnahme durch CD25-negative normale Zellen. Im Phase 1-Versuch mit LMB-2 und in Toxizitätsstudien des LMB-2 mit Mäusen, deren CD25 nicht mit LMB-2 reagiert, oder Affen, deren CD25 sehr wohl reagiert, wurden häufig Leberschäden festgestellt, die durch Erhöhung der Transaminase-Titer im Blut angezeigt wurden (Kreitman et al. (1999), siehe oben; Kreitman und Pastan (1995), siehe oben). Wenn diese Art der Toxizität reduziert werden kann, sollte es möglich sein, die Dosis des Immunotoxins, die verwendet wird, um Patienten zu behandeln, zu erhöhen und häufigere und stärkere klinische Antworten zu erhalten. Ein Ansatz zur Reduktion der unspezifischen Toxizität ist es, die Verteilung des Immunotoxins aus dem Blut in normale Gewebe zu reduzieren, in dem ihre Blut-Verweildauer erhöht wird. Zusätzlich könnte die Verlängerung der Plasma-Halbwertszeit zu verstärkter Antitumor-Wirksamkeit führen (Onda et al. (1999), siehe oben). PEGylierung ist ein Mittel, die Blut-Verweildauer von LMB-2 zu erhöhen und seine therapeutische Wirkung zu verstärken.
PEGylierung von Proteinen erhöht deren Plasma-Halbwertszeit, in dem die Proteolyse reduziert und die Verteilung ins Gewebe, wie z.B. die glomerulare Filtration durch die Niere und die Aufnahme durch die Leber, reduziert wird (Pai et al. (1991) Cancer Res. 51: 2808–2812; Chaffee et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 1643-1651; Yabe et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 289: 1176–1184; Pyatak et al. (1980) Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113–127; Katre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487–1491; Kitamura et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387–1394; Wang et al. (1993) Cancer Res. 53: 4588-4594; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398–13404; Kuan et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7610–7616). Dieser Effekt wird der erhöhten Molekülgröße und der sterischen Behinderung zugeschrieben, die durch die Bindung von PEG an Proteine hervorgerufen wird. In den meisten Fällen war die Verwendung der PEGylierung auf Enzyme beschränkt, deren Substrate sehr kleine Moleküle sind, wie z.B. Adenosin-Deaminase (ADA) und Superoxiddisumutase (SOD), weil die gebundene PEG-Kette die Ligand-Rezeptor-Bindung und die Antigen-Antikörper-Bindung, die auf makromolekularen Interaktionen basieren, sterisch behindern kann (Benhar et al. (1994), siehe oben; Kuan et al. (1994), siehe oben). Zusätzlich erfolgt die PEGylierung üblicherweise an Lysinresten, von denen sich einige in oder in der Nähe der aktiven Stelle des Proteins befinden, und diese Lysin-Modifikation durch PEG ist zufällig und schwer zu kontrollieren (Tsutsumi et al. (1995) Br. J. Cancer. 71: 963-968). Rekombinante Immunotoxine haben drei wichtige Funktionen (Pastan (1997), siehe oben; Kreitman et al. (1994), siehe oben; Kreitman et al. (1999), siehe oben; Brinkmann et al. (1991), siehe oben; Reiter et al. (1994), siehe oben; Reiter et al. (1994), siehe oben). Dies sind die Antigenbildung, die Translokation und die ADP-Ribosylierung des EF2. Alle drei beinhalten auch makromolekulare Interaktionen. Sowohl die Antigen-bindende Domäne als auch die ADP-Ribosylierungsdomäne enthaltenen Lysinreste. Um Interferenzen mit makromolekularen Interaktionen zu umgehen, wurde ein mutantes LMB-2 mit einem Cysteinrest im nicht funktionalen Connector zwischen den Fv- und PE-Abschnitte des LMB-2 hergestellt und der Thiolrest des Cysteins für eine ortsspezifische PEGylierung verwendet (1).
Die spezifische in vitro-Cytotoxizität von cys1-LMB-2, das den zusätzlichen Cysteinrest trägt, gegen CD25+ Tumorzellen (ATac4) ist ungefähr derselbe wie der von parentalem LMB-2 (2 und Tabelle 1). Cys1-LMB-2 wurde durch Bildung einer Thioether-Bildung zwischen einer freien Thiolgruppe im Connectorbereich und einer terminalen Maleimid-Gruppe des PEG PEGyliert. Die hergestellten PEG5K- und PEG20K-LMB-2 behielten im Vergleich mit nicht modifizierten nativen und mutanten LMB-2 volle cytotoxische Aktivität (2 und Tabelle 1). Dies liegt zum Teil daran, dass LMB-2 innerhalb der Zelle durch proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren 279 und 280 PE in zwei Fragmente prozessiert wird. Das PEG verbleibt bei dem Fv, während der größte Teil des Toxins (Aminosäuren 280–613) in das Endoplasmatische Retikulum transportiert wird, wo es ins Cytosol übertritt und die Zelle tötet. Üblicherweise nimmt die Aktivität PEGylierter Proteine mit zunehmendem Molekulargewicht des gebundenen PEG ab, weil die sterische Behinderung durch das gebundene PEG mit zunehmender Länge der PEG-Kette zunimmt (Tsutsumi et al. (1996) Br. J. Cancer 74:1090–1095). In diesem Fall jedoch hatte PEG20K-LMB-2 fast dieselbe Aktivität wie PEG5K-LMB-2. Dies mag an dem relativ langen Abstand zwischen PEG-Bindungsstelle im Connector und den aktiven Stellen des LMB-2 liegen. Im Vergleich zu dem nicht modifizierten nativen und mutanten LMB-2 war die Stabilität des PEGylierten LMB-2 bei 37° C in Mausserum, das Proteasen und andere inaktivierende Aktivität enthält, verbessert (3). PEG kann LMB-2 durch sterische Behinderung vor proteolytischen Angriffen oder Dissoziation der VH- und VL Ketten schützen, was zur Aggregation führt und dazu, dass PEG20K wirksamer ist als PEG5K.
Beide Typen des PEGylierten LMB-2 zeigten eine 3 bis 4-fach höhere Antitumor-Aktivität als nicht modifiziertes natives und mutantes LMB-2 . Zusätzlich war ihre Toxizität gegenüber Mäusen ungefähr um das 6-fache reduziert (4, Tabellen 1 und 2). Folglich führte die PEGylierung zu einer 20-fachen Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit. Die PEGylierung von LMB-2 erhöhte dessen Blut-Verweildauer und AUC (Fläche unter der Kurve) erheblich, was auf eine Erhöhung der Molekülgröße und eine verstärkte Stabilität zurückgeht (5). Die Plasma-Halbwertszeiten waren 5-fach länger bei PEG5K-LMB-2 und 8-fach länger bei PEG20K-LMB-2 als bei nicht modifizierten LMB-2. Die Zunahme der Antitumor-Aktivitäten geht vermutlich auf die Zunahme der Plasma-Halbwertszeit zurück, was es ermöglicht, dass im Laufe der Zeit durch die undichten Kapillaren, die man in Tumoren häufig findet, mehr Immunotoxin in den Tumor gelangt. Es ist wohlbekannt, dass der Transport von PEGylierten Proteinen aus dem Blut in normale Gewebe eingeschränkt ist, und dass die unspezifische zelluläre Absorption und Aufnahme PEGylierter Moleküle vermindert ist (Chaffee et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 1643-1651; Illum et al. (1987) Biomaterials 8: 113–117; Woodle und Lasic (1992) Biochim. Biophys. Acta. 14: 171–199). Daher kann die Abnahme der Toxizität des LMB-2 wegen seiner erhöhten Molekülgröße zumindest zum Teil durch seine verminderte Verteilung aus dem Blut in normale Gewebe wie die Leber verursacht sein (Chaffee et al. (1992), siehe oben). Darüber hinaus könnte die unspezifische Bindung und Aufnahme von LMB-2 in normale Zellen durch die PEGylierung, die ionische Interaktionen abschirmt, unterdrückt werden. Es wurde außerdem festgestellt, dass PEGylierte LMB-2 eine verminderte Immunogenität haben, was durch den verminderten Abbau durch Antigen-präsentiernde Zellen wie Makrophagen, die Abschirmung einiger Epitope der Peptide nach Degradation (Wang et al. (1993) Cancer Res. 53: 4588-4594) oder die Verhinderung der Bindung an Rezeptoren auf B-Zellen verursacht werden könnte. Außerdem könnte, wie bereits oben erwähnt, der Transport von PEGyliertem LMB-2 aus dem Blut in Immungewebe wie Milz, Knochenmark und lymphoides Gewebe beschränkt und die unspezifische Bindung und Aufnahme von PEGylierten Proteinen durch Antigen-präsentierende Zellen reduziert sein. Detaillierte Studien über die Verteilung im Gewebe und die Zell-Bindung werden hilfreich sein, um diese Punkte zu klären.
Zusammengefasst verbessert die ortsspezifische PEGylierung von LMB-2 dessen therapeutische Wirksamkeit als Antitumor-Agens bei Mäusen, in dem es seine Plasma-Halbwertszeit erhöht und seine unspezifische Toxizität erniedrigt. Der mit LMB-2 verfolgte Ansatz sollte auf andere rekombinante Immunotoxine und andere Immunokonjugate anwendbar sein und deren Aktivität im Patienten erhöhen.
Tabelle I
Tabelle II
Tabelle III

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Targeting-Molekül, das durch ein Connectormolekül mit einem Effektormolekül verknüpft ist, und ein oder mehrere Polyethylenglycol (PEG) Moleküle, die mit dem Connectormolekül konjugiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Targeting-Molekül ausgewählt ist aus einem Liganden, einem Antikörper und einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment Antigen-Erkennungsvermögen behält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Antikörper oder das Fragment davon Tac spezifisch erkennt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Effektormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cytotoxin, einem Marker, einem Radionuclid, einem nachweisbaren Marker, einem Arzneistoff, einem Liposom, einer Nucleinsäure, einem rekombinanten Virus, einem Glycoprotein, einem Liganden und einem Antikörper.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Cytotoxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas Exotoxin (PE) oder einem Fragment oder Mutanten davon, das cytotoxische Aktivität behält, Diphtherietoxin oder einem Fragment oder Mutanten davon, das cytotoxische Aktivität behält, Ricin, Saponin, Gelonin, Ribosom inaktivierendes Protein, Abrin und Botulinum A-F.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das PE PE38 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Connectormolekül ein Peptid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Connectormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ASGCGPE (SEQ ID NR:2), ASGCCGPE (SEQ ID NR:3), ASCGSGCPE (SEQ ID NR:4), KASGKKYGCKKGPE (SEQ ID NR:5), ASCGTTGCPE (SEQ ID NR:8) und KGGGCAGGPE (SEQ ID NR:6).
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eine reaktive Gruppe auf einem Aminosäurerest des Connectormoleküls durch das PEG-Molekül substituiert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen 1 und 100 kD aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen etwa 3 kD und etwa 50 kD aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen etwa 5 kD und etwa 20 kD aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Targeting-Molekül ein Anti-IL-2-Rezeptor-á-Untereinheit-Antikörper bekannt als Anti-Tac ist, wobei das Effektormolekül PE38 ist und das Connectormolekül ASGCGPE (SEQ ID NR:2) ist.
Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung nach Anspruch 13 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zum Erhöhen der Anti-Tumor-Aktivität eines Immunotoxins, das eine Targetinggruppe und eine Toxingruppe aufweist, die durch ein Connectormolekül verbunden sind, wobei das Verfahren umfasst, dass ein Polyethylenglycol ("PEG") Molekül an das Connectormolekül kovalent gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei zwei oder mehrere Aminosäurereste des Connectormoleküls mit PEG konjugiert sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Targeting-Molekül ausgewählt ist aus einem Liganden, einem Antikörper und einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment Antigen-Erkennungsvermögen behält.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Antikörper Tac spezifisch erkennt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Effektormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Cytotoxin, einem Marker, einem Radionuclid, einem nachweisbaren Marker, einem Arzneistoff, einem Liposom, einer Nucleinsäure, einem rekombinanten Virus, einem Glycoprotein, einem Liganden und einem Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Cytotoxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas Exotoxin (PE) oder einem Fragment oder Mutanten davon, das cytotoxische Aktivität behält, Diphtherietoxin oder einem Fragment oder Mutanten davon, das cytotoxische Aktivität behält, Ricin, Saponin, Gelonin, Ribosom inaktivierendes Protein, Abrin und Botulinum A-F.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das PE PE38 ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Connectormolekül ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Connectormolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ASGCGPE (SEQ ID NR:2), ASGCCGPE (SEQ ID NR:3), ASCGSGCPE (SEQ ID NR:4), KASGKKYGCKKGPE (SEQ ID NR:5), ASCGTTGCPE (SEQ ID NR:8) und KGGGCAGGPE (SEQ ID NR:6).
Verfahren nach Anspruch 18, wobei eine reaktive Gruppe auf einem Aminosäurerest des Connectormoleküls durch das PEG-Molekül substituiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen 1 und 100 kD aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen etwa 3 kD und etwa 50 kD aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen etwa 5 kD und etwa 20 kD aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Targeting-Molekül ein Antikörper ist, der eine IL-2-Rezeptor-α-Untereinheit spezifisch erkennt, das Effektormolekül PE38 ist und das Connectormolekul ASGCGPE (SEQ ID NR:2) ist.