DE69721564T2

DE69721564T2 - Monovalente antikörperfragmente

Info

Publication number: DE69721564T2
Application number: DE69721564T
Authority: DE
Inventors: John David Camberley KING; Paul Andrew Hampton CHAPMAN
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1996-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: EP0948544B1; EP1160255A1; AU733251B2; ES2197373T3; GB9625640D0; DE69721564D1; GB2334957B; PT948544E; JP2001506990A; CA2269115C; DK0948544T3; GB9913228D0; WO1998025971A1; EP0948544A1; AU5404998A; NZ335689A; GB2334957A; JP3497175B2; ATE239040T1; CA2269115A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte monovalente Antikörperfragmente, Verfahren zu deren Herstellung, diese Fragmente enthaltende Zusammensetzungen und deren Verwendung in der Medizin.
Antikörperfragmente werden im klinischen Bereich zunehmend für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet. Das Ziel ist in jedem Fall die Verwertung der Kombination aus hoher Spezifität und Affinität der Antikörper-Antigenbindung, zur Entdeckung und/oder der Behandlung einer besonderen Läsion. Der Antikörper wird allein verwendet oder er wird mit einem anderes Atom oder Molekül, wie zum Beispiel einem radioaktiven Isotop oder einem zytotoxischen Arzneimittel beladen.
Die Pharmakokinetik und die biologische Verteilung eines Antikörpers spielt eine große Rolle bei der Bestimmung, ob dessen Verwendung klinisch erfolgreich sein wird. Der Antikörper muß somit in der Lage sein, an die Wirkungsstelle gebracht zu werden und dort während einer Zeitdauer festgehalten zu werden, die für das Erreichen des Zwecks des Antikörpers geeignet ist. Er sollte ebenfalls nur in subtoxischen Konzentrationen außerhalb des Ziels vorkommen und muß gut definiert katabolisiert werden.
Die Pharmakokinetik von Antikörpern ist für viele Verwendungen nicht ideal. Dies trifft besonders auf die Tumordiagnose und -therapie mit Antikörperradioisotopen oder Arzneimittelkonjugaten zu. Bei der Diagnose mit derartigen Konjugaten beschränken lange Halbwertszeiten das Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnis und folglich die Empfindlichkeit für die Entdeckung von Läsionen. Bei der Therapie führt eine lange Halbwertszeit zu einer langfristigen Aussetzung normaler Gewebe gegenüber dem Antikörperkonjugat und folglich zu einer die Dosis beschränkenden Toxizität.
Eine Anzahl von Verfahren ist zur Manipulation der Pharmakokinetik von Antikörpern verfügbar und normalerweise beeinflussen diese auch deren biologische Verteilung. Das einfachste und am allgemeinsten anwendbare Verfahren ist die Verwendung von Antikörperfragmenten. Diese werden schneller aus dem Kreislauf entfernt, als ganze Antikörper, und verteilen sich schneller aus dem Blut zu den Geweben, was ein besonderer Vorteil in manchen Anwendungen ist, zum Beispiel für die Tumorabbildung und -therapie.
Zur Verbesserung der Pharmakokinetik von Antikörperfragmenten haben wir weiterhin noch die Verwendung von Polymeren untersucht. Die Anlagerung polymerer Materialien, wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG) an Proteinmoleküle ist gut etabliert und es wurde gezeigt, dass die Anlagerung eines Polymers die pharmakologischen Eigenschaften eines Porteinmoleküls wesentlich verändern kann. Zum Beispiel kann die PEG-Modifikation von Proteinen die in vivo Zirkulationshalbwertszeit des Proteins, die antigene Wirkurtg, die Immunogenität, die Solubilität, die mechanische Stabilität und die Resistenz gegenüber Proteolyse verändern [Abuchowski, A. et al J. Biol. Chem (1977) 252, 3578–3581 und 3582-3586; Nucci, M. L. et al, Adv. Drug Delivery Reviews (1991) 6, 133–151; Francis, G. et al, Pharmaceutical Biotechnology Bd. 3. (Borchardt, R. T. Herausg.); und Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization (1991) Seiten 235–263 (Ahem, T. J. und Manning, M., Herausg.) Plenum, New York].
Die Anlagerung von PEG an Proteinmoleküle wurde unter Verwendung einer Anzahl verschiedener chemischer Verfahren erreicht, von denen die meisten PEG an Lysinreste oder an andere Aminosäurereste auf der Oberfläche des Proteins auf eine willkürliche Art binden [Zalipsky, S. & Lee, C. Poly(ethylene glycol)) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) Seiten 347–370 (Harris, J. M., Herausg.) Plenum, New York]. Dies führt häufig zu einer teilweisen Beeinträchtigung der Funktion des Proteins, zum Beispiel weisen Enzyme eine verringerte katalytische Aktivität auf [Nucci, M. L. et al ebd.].
Es wurde über eine ortsspezifische Modifizierung von Proteinen zur Einführung von Stellen für die PEG-Anlagerung berichtet. Zum Beispiel wurde Interleukin-2 durch Mutagenese modifiziert, um einen Threoninrest, der normalerweise glycosyliert ist, durch ein Cystein zu ersetzen, um die Anlagerung von PEG zu ermöglichen [Goodson, R. J. & Katre, N. V. Bio/Technology (1990) 8, 343–346]. Es wurde eine Stelle gewählt, die normalerweise glycosyliert ist, da von dieser angenommen wurde, dass sie in der Lage war, mit der PEG-Modifikation ohne Störung der Proteinstruktur verträglich zu sein. In einem anderen Beispiel wurde das Enzym Purinnukleosidphosphorylase zum selektiven Ersatz von Argininresten durch Lysine modifiziert, um in diesem Fall bis zu achtzehn zusätzliche potentielle PEG-Anlagerungsorte pro Enzym zu liefern [Hershfield, M. S. et al P.N.A.S. (1991), 88, 7185-7189].
Frühere Untersuchungen mit Antikörpern und Antikörperfragmenten haben eine willkürliche PEG-Anlagerung über Lysinreste [zum Beispiel Ling, T. G. I. & Mattiasson, B. J. Immunol. Methods (1983), 59, 327–337; Wilkinson, I. et al Immunol. Letters (1987) 15, 17–22; Kitamura, K. et al Cancer Res. (1991), 51, 4310–4315; Delgado, C. et al Br. J. Cancer (1996), 73, 175–182] und thiolierte Derivate [Pedley, R. B. et al Br. J. Cancer (1994), 70, 1126–1130] verwendet. Die zufällige Anlagerung hat häufig zu modifizierten Antikörpern geführt, die nur in der Lage waren, ihr Zielantigen mit verringerter Affinität, Reaktionsfähigkeit oder Spezifität zu binden. In einem Versuch zur Überwindung dieser Schwierigkeiten sind die kritischen Lysinreste in den Antigenbindungs-(CDR)-Schleifen durch Argininen ersetzt worden, um eine Modifikation mit einem geringeren Verlust in der Immurireaktivität zu gestatten [Benhar, I. et al Bioconjugate Chemistry (1994) 5, 321–326].
In den konstanten und in den Gelenkregionen von Antikörpern können spezifische Stellen konstruiert werden, um die ortsspezifische Bindung einer Reihe von Effektor- und Reportermolekülen zu gestatten [Lyons, A. et al Prot. Eng. (1990), 3, 703–709; und die Beschreibungen der Europäischen Patente mit den Nummern 348442 und 347433]. Wir haben nun festgestellt, dass die ortsspezifische Bindung von Polymeren an monovalente Antikörperfragmente dazu verwendet werden kann, den Verlust an Immunoreaktivität zu vermeiden, der vorher mit den zufälligen Anlagerungsprozessen verbunden war. Weiterhin weisen auf diese Weise modifizierte Fragmente deutlich verbesserte Bindungs- und/oder pharmakokinetische Eigenschaften im Vergleich zu Fragmenten auf, die willkürlich mit derselben Zahl und Art der Polymermoleküle modifiziert worden sind.
Entsprechend einem Aspekt der Erfindung stellen wir somit ein modifiziertes monovalentes Antikörperfragment zur Verfügung, das ein monovalentes Antikörperfragment und mindestens ein Polymermolekül in einer kovalenten Verknüpfung umfaßt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass jeder Cysteinrest, der sich in dem Antikörperfragment außerhalb der variablen Regionsdomäne des Fragments befindet, entweder über sein Schwefelatom mit einem Polymermolekül kovalent verknüpft ist oder mit einem zweiten Cysteinrest, der sich in dem Fragment befindet, über eine Disulfidbrücke verbunden ist, vorausgesetzt, das mindestens einer der Cysteinreste an ein Polymermolekül gebunden ist.
Das erfindungsgemäße modifizierte Antikörperfragment ist im wesentlichen ein monovalentes Antikörperfragment, das an ein oder mehrere, zum Beispiel an ein, zwei oder drei Polymermoleküle über einen oder mehrere, zum Beispiel einen, zwei oder drei Cysteinreste, die sich in dem Fragment außerhalb von dessen variabler Regionsdomäne befinden, kovalent gebunden ist. Das Fragment kann zusätzlich ein oder mehrere Effektoroder Reportermoleküle aufweisen, die kovalent an das Fragment gebunden sind, wie nachstehend beschrieben ist.
Das erfindungsgemäße modifizierte Antikörperfragment wird im allgemeinen in der Lage sein, selektiv an ein Antigen zubinden. Das Antigen kann jedes beliebige Zell-assoziierte Antigen sein, zum Beispiel ein Zeltoberflächen-Antigen, wie zum Beispiel eine T-Zelle, eine endotheliale Zelle oder ein Tumorzellenmarker, oder es kann ein lösliches Antigen sein. Spezielle Beispiele für Zelloberflächenantigene umfassen Adhäsionsmoleküle, zum Beispiel Integrine, wie zum Beispiel βl Integrine, zum Beispiel VLA-4, E-Selektin, P-Selektin oder L-Selektin, CD2, CD3, CD4, CDS, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, Karzinoembryonisches Antigen (CEA), menschliches Milchfettglobulin (HMFG1 und 2), MHC Klasse 1 und MHC Klasse II Antigene und VEGF und deren Rezeptoren, sofern sie geeignet sind. Lösliche Antigene umfassen Interleukine, wie zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 oder IL-12, virale Antigene, zum Beispiel respiratorische synzytiale Virus- oder Zytomegalovirusantigene, Immunglobuline, wie zum Beispiel IgE, Interferone, wie zum Beispiel Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Tumornekrosefaktorβ, Kolonie stimulierende Faktoren, wie zum Beispiel G-CSF oder GM-CSF und von Plättchen stammende Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel PDGF-α und PDGF-β und, sofern geeignet, deren Rezeptoren.
Der Begriff variable Regionsdomäne, wie er hier in Bezug auf das erfindungsgemäße Fragment verwendet wird, soll den Teil des Antikörperfragments bedeuten, der die Antigenbindungsstelle enthält. Die variable Regionsdomäne kann jede beliebige Größe oder Aminosäurenzusammensetzung aufweisen und wird im allgemeinen mindestens eine hypervariable Aminosäuresequenz umfassen, die für die in einer Gerüstsequenz eingebettete Antigenbindung verantwortlich ist. In allgemeinen Worten, die variable (V) Regionsdomäne kann jede geeignete Anordnung aus schweren (V_H) und/oder leichten (V_L) Ketten von variablen Immunglobulindomänen sein. Somit kann zum Beispiel die V Regionsdomäne monomer und eine V_H oder V_L Domäne sein, sofern diese in der Lage sind das Antigen mit akzeptabler Affinität unabhängig voneinander zu binden. Alternativ dazu kann die V Regionsdomäne dimer sein und V_H-V_H, V_H-V_L oder V_L-V_L Dimere enthalten, in denen die VH und V_L-Ketten nicht-kovalent verbunden sind. Sofern es gewünscht wird, können jedoch die Ketten entweder direkt kovalent verknüpft werden, zum Beispiel über eine Disulfidbindung zwischen den zwei variablen Domänen oder durch einen Linker, zum Beispiel einen Peptidlinker, zur Bildung einer einzigen Kettendomäne.
Die variable Regionsdomäne kann jede natürlich vorkommende variable Domäne oder eine konstruierte Version davon sein. Mit konstruierter Version ist eine variable Regionsdomäne gemeint, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Konstruktionstechniken geschaffen wurde. Solche konstruierten Versionen umfassen diejenigen, die zum Beispiel von natürlichen variablen Antikörperregionen durch Insertionen, Deletionen oder Austausch in oder an den Aminosäuresequenzen der natürlichen Antikörper erzeugt werden. Spezielle Beispiele dieses Typs umfassen diejenigen konstruierten variablen Regionsdomänen, die mindestens eine CDR und wahlweise eine oder mehrere Gerüstaminosäuren von einem Antikörper und die übrige variable Regionsdomäne von einem zweiten Antikörper enthalten.
Die variable Regionsdomäne wird im allgemeinen mindestens an einen Cysteinrest oder insbesondere an zwei oder drei Cysteinreste kovalent gebunden sein, von denen jeder über sein Schwefelatom mit einem Polymermolekül kovalent verknüpft ist.
Der Ort jedes Cysteinrests kann entsprechend der Größe und der Art des erforderlichen Antikörperfragments variiert werden. In einem extremen Beispiel kann somit ein Cysteinrest, der über sein Schwefelatom mit einem Polymer verbunden ist, direkt an eine C-endständige Aminosäure der variablen Regionsdomäne gebunden werden. Dies kann zum Beispiel der C-Terminus eine V_H- oder V_L-Kette, wie vorstehend beschrieben ist, sein. Sofern erwünscht, können in diesem Beispiel weitere Aminosäuren, einschließlich weiterer Cystein-verknüpfter Polymere, mit dem C-Ende des ersten Cysteinrests kovalent verknüpft werden.
In der Praxis wird jedoch im allgemeinen bevorzugt, dass die variable Regionsdomäne kovalent an einer C-endständigen Aminosäure an mindestens eine andere Antikörperdomäne oder deren Fragment gebunden wird, das einen, zwei, drei oder mehrere Cysteinreste enthält oder an sie gebunden ist, wobei jeder über sein Schwefelatom mit einem Polymermolekül kovalent verknüpft ist. Somit kann zum Beispiel dort, wo eine V_H-Domäne in der variablen Regionsdomäne vorhanden ist, diese mit einer Immunglobulin C_H1-Domäne oder einem Fragment davon verknüpft werden. Ähnlich kann eine V_L-Domäne mit einer C_K-Domäne oder mit einem Fragment davon verknüpft werden. In dieser Hinsicht kann zum Beispiel das erfindungsgemäße Fragment ein Fab-Fragment sein, in dem die Antigenbindungsdomäne assoziierte V_H- und V_L-Domänen enthält, die mit ihren C-Termini mit einer CH1-beziehungsweise mit einer C_K-Domäne kovalent verknüpft sind. Die CH1-Domäne kann mit weiteren Aminosäuren verlängert werden, um beispielsweise eine Gelenkregion, wie sie in dem Fab'-Fragment gefunden wurde, zur Verfügung zu stellen oder um weitere Domänen, wie zum Beispiel Antikörper CH2- und CH3 Domänen zur Verfügung zu stellen. In jedem der vorstehenden Fälle können sich einer, zwei oder drei Cysteinreste, von denen jeder mit einem Polymermolekül verknüpft ist, an jedem Punkt überall in jeder Domäne befinden.
Das Polymermolekül in dem erfindungsgemäßen Fragment kann im allgemeinen ein synthetisches oder natürlich vorkommendes Polymer sein, zum Beispiel ein gegebenenfalls substituiertes geradkettiges oder verzweigtkettiges Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymer oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Polysaccharid, beispielsweise ein Homo- oder Heteropolysaccharid..
Spezielle optionale Substituenten, die auf den vorstehend erwähnten synthetischen Polymeren vorhanden sein können, umfassen eine oder mehrere Hydroxy-, Methyl- oder Methoxygruppen. Spezielle Beispiele synthetischer Polymere umfassen ein gegebenenfalls substituiertes geradkettiges oder verwzeigtkettiges Poly(ethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(vinylalkohol) und deren Derivate, hauptsächlich ein gegebenenfalls substituiertes Poly(ethylenglykol), wie zum Beispiel Methoxy(polyethylenglykol) und dessen Derivate. Spezielle natürlich vorkommende Polymere umfassen Laktose, Amylose, Dextran oder Glykogen und deren Derivate. Der Begriff „Derivate", wie er hier verwendet wird, soll reaktive Derivate umfassen, zum Beispiel Thiol-selektive reaktive Gruppen, wie zum Beispiel Maleimide und dergleichen. Die reaktive Gruppe kann direkt oder durch ein Linkersegment mit dem Polymer verknüpft sein. Es ist klar, dass der Rest einer solchen Gruppe in manchen Fällen einen Teil des Produkts der Erfindung bildet, wie die Brückengruppe zwischen dem Antikörperfragment und dem Polymer.
Die Größe des Polymers kann nach Wunsch variiert werden, jedoch wird sie sich im allgemeinen in einem mittleren Molekulargewichtsbereich von ungefähr 500 Da bis ungefähr 50000 Da, zum Beispiel von 5000 bis 40000 Da und einschließlich 25000 bis 40000 Da befinden. Die Polymergröße kann insbesondere auf der Basis der beabsichtigten Verwendung des Produkts ausgewählt werden. Folglich kann es beispielsweise dort, wo das Produkt den Kreislauf verlassen und in des Gewebe eindringen soll vorteilhaft sein, ein Polymer mit niedrigem Molekulargewicht, zum Beispiel mit ungefähr 5000 Da, zu verwenden. Für Anwendungen, bei denen das Produkt in dem Kreislauf bleibt, kann es vorteilhaft sein ein Polymer mit höherem Molekulargewicht, zum Beispiel in dem Bereich von 25000 Da bis 40000 Da, zu verwenden.
Wie vorstehend erklärt, ist jedes Polymermolekül in dem erfindungsgemäßen modifizierten Antikörperfragment mit einem Schwefelatom eines sich in dem Fragment befindlichen Cysteinrests verknüpft. Die kovalente Verknüpfung wird im allgemeinen eine Disulfid-Bindung oder insbesondere eine Schwefel-Kohlenstoffbindung sein.
Besonders nützliche erfindungsgemäße Fragmente sind diejenigen, bei denen jeder der zwei oder hauptsächlich drei Cysteinreste, die sich in dem Fragment außerhalb der variablen Regionsdomäne befinden, über sein Schwefelatom mit einem Polymermolekül kovalent verknüpft ist, wobei jeder andere Cysteinrest, der sich in dem Fragment außerhalb der variablen Regionsdomäne befindet, mit einem zweiten sich in dem Fragment befindlichen Cysteinrest über eine Disulfidbrücke verbunden ist. In diesen speziellen Fragmenten kann das Polymer besonders ein synthetisches Polymer, speziell ein Polyalkylenpolymer, wie zum Beispiel Poly(ethylenglykol) oder hauptsächlich Methoxypoly(ethylenglykol) oder ein Derivat davon sein, insbesondere mit einem Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 25000 Da bis ungefähr 40000 Da.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment kann je nach Wunsch ein oder mehrere Effektoroder Reportermoleküle, die an das Fragment gebunden sind, aufweisen und die Erfindung erstreckt sich auf solche modifizierte Antikörper. Die Effektor- oder Reportermoleküle können über jede verfügbare Aminosäuren-Seitenkette oder funktionelle endständige Aminosäurengruppe, die sich in dem Fragment befinden, zum Beispiel jede freie Amino-, Imino-, Hydoxy-oder Carboxylgruppe, mit dem Antikörperfragment verknüpft sein.
Effektormoleküle umfassen zum Beispiel antineoplastische Mittel, Toxine (wie zum Beispiel enzymatisch aktive Toxine bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs und Fragmente davon, zum Beispiel Ricin und Fragmente davon), biologisch aktive Proteine, zum Beispiel Enzyme, Nukleinsäuren und Fragmente davon, zum Beispiel DNA, RNA und Fragmente davon, Radionuklide, besonders radioaktives Iodid und chelatkomplexierte Metalle. Geeignete Reportergruppen umfassen komplexierte Metalle, fluoreszierende Verbindungen oder Verbindungen die durch NMR- oder ESR-Spektroskopie nachgewiesen werden können.
Spezielle antineoplastische Mittel umfassen zytotoxische und zytostatische Mittel, zum Beispiel Alkylierungsmittel, wie zum Beispiel Stickstoffsenfverbindungen (zum Beispiel Chlorambucil., Melphalan, Mechlorethamin, Cyclophosphamid oder Uracilsenf) und Derivate davon, Triethylenphosphoramid, Triethlylenthiophosphoramid, Busulphan oder Cisplatin; Antimetaboliten, wie zum Beispiel Methotrexat, Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Fluoressigsäure oder Fluorzitronensäure, Antibiotika, wie zum Beispiel Bleomycine (zum Beispiel Bleomycinsulfat), Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycine (zum Beispiel Mitomycin C), Actinomycine (zum Beispiel Dactinomycin) Pliamycin, Calichaemicin und Derivate davon, oder Esperamicin und Derivate davon; mitotische Inhibitoren, wie zum Beispiel Etoposid, Vincristin oder Vinblastin und derivate davon; Alkaloide, wie zum Beispiel Ellipticin; Polyole, wie zum Beispiel Taxicin-I oder Taxicin-II; Hormone, wie zum Beispiel Androgene (zum Beispiel Dromostanolon oder Testlacton), Progestine (zum Beispiel Megestrolacetat oder Medroxyprogesteronacetat), Estrogene (zum Beispiel Dimethylstilbrestoldiphosphat, Polyestradiophosphat oder Estramustinphosphat) oder Antiestrogene (zum Beispiel Tamoxifen); Anthrachinone, wie zum Beispiel Mitoxantrone, Harnstoffe, wie zum Beispiel Hydroxyharnstoff, Hydrazine, wie zum Beispiel Procarbazine, oder Imidazole, wie zum Beispiel Decarbazin.
Besonders nützliche Effektorgruppen sind Calichaemicin und Derivate davon (siehe zum Beispiel die Beschreibungen der südafrikanischen Patente mit den Nummern 85/8794, 88/8127 und 90/2839).
Chelatkomplexierte Metalle umfassen Chelate der zweifach oder dreifach positiv geladenen Metalle, die eine Koordinationszahl von 2 bis einschließlich 8 aufweisen. Spezielle Beispiele solche Metalle umfassen Technetium (Tc), Rhenium (Re), Kobalt (Co), Kupfer (Cu), Gold (Au), Silber (Ag); Blei (Pb), Wismut (Bi); Indium (In), Gallium (Ga), Yttrium (Y), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd) und Scandium (Sc). Im allgemeinen ist das Metall vorzugsweise ein Radionuklid. Spezielle Radionuklide umfassen ^99mTC, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵⁸Co, ⁶⁰Co, ⁶⁷Cu, ¹⁹⁵Au, ¹⁹⁹Au, ¹¹⁰Ag, ²⁰³Pb, ²⁰⁶Bi, ²⁰⁷Bi, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁸⁸Y, ¹⁶⁰Tb, ¹⁵³Gd und ⁴⁷Sc.
Das chelatkornplexierte Metall kann zum Beispiel eines der vorstehenden Metallarten sein, die mit einem beliebigen geeigneten Polydentatchelatbildner, zum Beispiel acyclische oder cyclische Polyamine, Polyether (zum Beispiel Kronenether und Derivate davon); Polyamide, Porphyrine; und carbocyklische Derivate chelatkomplexiert sind. Im allgemeinen wird die Art des Chelatbildners von dem verwendeten Metall abhängen. Eine besonders nützliche Gruppe von Chelatbildner in erfindungsgemäßen Konjugaten sind jedoch acyclische und cyclische Polyamine, hauptsächlich Polyaminocarbonsäuren, zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure und Derivate davon, und makrocyclische Amine, zum Beispiel cyclische Tri-aza- und Tetra-azaderivate (wie es zum Beispiel in der Beschreibung der WO 92/22583 beschrieben ist); und Polyamide, hauptsächlich Desferrioxamine und Derivate davon.
Das erfindungsgemäße modifizierte Antikörperfragment kann durch Umsetzung eines Antikörperfragments, das mindestens eines reaktiven Cysteinrest enthält, mit einem Thiol-selektiven aktivierten Polymer hergestellt werden. Die Reaktion kann im allgemeinen in einem Lösungsmittel durchgeführt werden, zum Beispiel in einer wässrigen Pufferlösung, wie zum Beispiel in einem Acetat- oder Phosphatpuffer, bei einem ungefähr neutralem pH-Wert, zum Beispiel bei einem pH-Wert von ungefähr 4,5 bis zum einem pH-Wert von ungefähr 8,0 bei beispielsweise Umgebungstemperatur. Das aktivierte Polymer wird im allgemeinen in einem Konzentrationsüberschuß in Bezug auf die Konzentration des Antikörperfragments verwendet werden. In manchen Fällen kann es notwendig sein, das Antikörperausgangsmaterial mit einem Reagenz, wie zum Beispiel (β-Mercaptoethylamin (zum Beispiel wie hier nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist), zu verringern, um einen geeigneten reaktiven Cysteinrest zu erzeugen. Dort wo es notwendig ist, kann das die gewünschte Zahl an Polymermolekülen enthaltende Produkt von jedem anderen Produkt, das während des Herstellungsverfahrens erzeugt worden ist und eine ungewollte Anzahl an Polymermolekülen enthält, durch herkömmliche Mittel, zum Beispiel durch Chromatographie getrennt werden.
Das Antikörperfragmentausgangsmaterial kann von jedem vollständigen Antikörper, hauptsächlich von einem vollständigen monoklonalen Antikörper [der durch herkömmliche Immunisierung und Zellfusionsverfahren hergestellt wurde], unter Verwendung einer beliebigen geeigneten enzymatischen Standardspaltung und/oder Verdauungstechniken, zum Beispiel durch Behandlung mit Pepsin, erhalten werden. Alternativ kann das Antikörperausgangsmaterial durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, die die Manipulation und Reexpression von DNA-kodierenden variablen oder konstanten Antikörperregionen betreffen. Solche DNA ist bekannt und/oder ist leicht aus DNA-Bibliotheken, einschließlich zum Beispiel Phagen-Antikörper-Bibliotheken erhältlich [siehe Chiswell, D J und McCafferty, J. Tibtech. 10, 80–84 (1992)] oder kann dort wo es erwünscht ist, synthetisiert werden. Standardmolekularbiologische und/oder chemische Verfahren können zur Sequenzierung und Manipulation der DNA verwendet werden, zum Beispiel je nach Wunsch zur Einführung von Codonen zur Erzeugung von Cysteinresten, zur Modifikation, Hinzufügung oder Deletion von anderen Aminosäuren oder Domänen.
Ausgehend davon können einer oder mehrere replizierbare, die DNA enthaltende Expressionsvektoren hergestellt werden und zur Transformierung einer geeigneten Zelllinie, zum Beispiel eine nicht-produzierende Myelomazelllinie, wie zum Beispiel eine Mäuse-NSO-Linie oder eine bakterielle, zum Beispiel eine E.coli-Linie, verwendet werden, in der die Herstellung des Antikörpers stattfindet. Um eine wirksame Transkription und Translation zu erhalten sollte die DNA-Sequenz in jedem Vektor geeignete Regulationssequenzen umfassen, besonders eine Promotor- und Signalsequenz, die mit der variablen Domänensequenz wirksam verbunden ist. Spezielle Verfahren zur Herstellung von Antikörpern auf diese Art sind allgemein gut bekannt und werden routinemäßig verwendet. Zum Beispiel sind grundlegende molekularbiologische Verfahren von Maniatis et al beschrieben [Molecular Clonin, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]; die DNA-Sequenzierung kann nach der Beschreibung in Sanger et al [PNAS 74, 5463, (1977)] und dem Amersham International PLC Sequenzierungs-Handbuch durchgeführt werden; und die ortsspezifische Mutagenese kann nach dem Verfahren von Kramer et al [Nucl. Acids Res. 12, 9441] und dem Anglian Biotechnology Ltd Handbuch ausgeführt werden. Es gibt zusätzlich zahlreiche Veröffentlichungen, einschließlich Beschreibungen von Patenten, die über Techniken, die für die Herstellung von Anfikörper durch DNA-Manipulation, Erzeugung von Expressionsvektoren und Transformation geeigneter Zellen ausführlich berichten, wie es zum Beispiel bei Mountain A. und Adair, J. R. in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [Herausgeber Tombs, M P, 10, Kapitel 1, 1992, Intercept Andover, UK] und in der Beschreibung der WO 91/09967 zusammenfassend beschrieben ist.
Das aktivierte Polymerausgangsmaterial für die Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörperfragmente kann jedes Polymer sein, das eine reaktive Thiolgruppe enthält, wie zum Beispiel eine α-Halogencarbonsäure oder -ester, zum Beispiel Iodacetamid, ein Imid, zum Beispiel Maleimid, ein Vinylsulfon oder ein Disulfid. Solche Ausgangsmaterialien sind kommerziell erhältlich (zum Beispiel von Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) oder können von handelüblichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung herkömmlicher chemischer Verfahren, so wie sie zum Beispiel von Zalipsky, S & Lee, C, ebd und wie es in den hier nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, hergestellt werden.
Wenn es erwünscht ist, erfindungsgemäßes Antikörperfragment zu erhalten, das an ein Effektor- oder Reportermolekül gebunden ist, kann dieses durch chemische Standard- oder rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, bei denen das Antikörperfragment entweder direkt oder über ein Kopplungsmittel mit dem Effektor- oder Reportermolekül entweder vor oder nach der Reaktion mit dem aktivierten Polymer geeignet verknüpft wird. Spezielle chemische Verfahren umfassen zum Beispiel diejenigen, die in den Beschreibungen der WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90,09195 und WO 89/01476 beschrieben sind. Alternativ dazu kann in den Fällen, in denen das Effektor- oder Reportermolekül ein Protein oder Polypeptid ist, die Bindung unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren erreicht werden, so wie sie zum Beispiel in der Beschreibung der WO 86/01533 und der Beschreibung des Europäischen Patents Nr. 392745 beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment kann zur Entdeckung oder Behandlung einer Anzahl von Krankheiten oder krankhaften Störungen brauchbar sein. Solche Krankheiten oder krankhaften Störungen können diejenigen umfassen, die unter den allgemeinen Überschriften von infektiösen Krankheiten beschrieben sind, zum Beispiel vitale Infektion; entzündliche Krankheit/Autoimmunität zum Beispiel rheumatische Arthritis, Osteoarthrose, entzündliche Darmkrankheit; Krebs; allergische/atopische Krankheit zum Beispiel Asthma, Ekzema; angeborene Krankheit, zum Beispiel zystische Fibrose, Sichelzellenanämie; eine dermatologische Krankheit, zum Beispiel Schuppenflechte; eine neurologische Krankheit, zum Beispiel Multiple Sklerose; Transplantate zum Beispiel Organtransplantatabstoßung, eine Transplantat-gegen-Wirt Krankheit; und eine metabolisch/idiopathische Krankheit zum Beispiel Diabetes.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörperfragmente können zur Verwendung in der Therapie und/oder in der Diagnose formuliert werden und entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine modifiziertes monovalentes Antikörperfragment, das ein monovalentes Antikörperfragment und mindestens ein Polymermolekül in einer kovalenten Bindung umfaßt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass jede kovalente Bindung über eine Schwefelatom eines in dem Antikörperfragment außerhalb der variablen Regionsdomäne des Fragments befindlichen Cysteinrests stattfindet, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, Verdünnungsmitteln oder Trägern umfaßt.
Wie vorstehend erläutert wurde, kann das unter diesem Aspekt der Erfindung modifizierte Antikörperfragment gegebenenfalls mit einer oder mehreren Effektor- oder Reportergruppen verknüpft werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann jede geeignete Verabreichungsform annehmen und liegt vorzugsweise in einer für die parenterale Verabreichung geeigneten Form vor, zum Beispiel durch Injektion oder Infusion, wie zum Beispiel durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion. Falls die Zusammensetzung für die Injektion oder Infusion bestimmt ist, kann sie die Form einer Suspension, Lösung oder Emulsion in einem öligen oder wässrigen Vehikel annehmen oder sie kann Formulierungsmittel, wie zum Beispiel Suspensions-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Alternativ dazu kann die Antikörperzusammensetzung in trockener Form vorliegen, wobei sie vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit wiederhergestellt wird.
Falls die Antikörperzusammensetzung für orale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung zusätzlich zu dem Wirkstoff Zusatzmittel, wie zum Beispiel Stärke zum Beispiel Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke oder Zellulose oder Stärkederivate, wie zum Beispiel mikrokristalline Zellulose; Siliziumdioxid; verschiedene Zucker, wie zum Beispiel Lactose; Magnesiumcarbonat und/oder Calciumphosphat enthalten. Es ist wünschenswert, dass die Formulierung für die orale Verabreichung für das Verdauungssystem des Patienten gut verträglich ist. Dazu kann es erwünscht sein, in die Formulierung Schleimbildner und Harze mit aufzunehmen. Es kann ebenfalls erwünscht sein die Verträglichkeit zu verbessern, indem der Antikörper in einer Kapsel zu formulieren, die in den Magensäften unlöslich ist. Es kann auch bevorzugt sein, den Antikörper oder die Zusammensetzung in eine Formulierung mit kontrollierter Abgabe einzubringen.
Falls die Antikörperzusammensetzung für die rektale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung ein Binde- und/oder Gleitmittel enthalten; zum Beispiel Polymerglykole, Gelatinen, Kakaobutter oder andere pflanzlichen Wachse oder Fette.
Therapeutische oder diagnostische Verwendungen der erfindungsgemäßen Fragmente umfassen typischerweise die Verabreichung einer wirksamen Menge des Antikörperfragments an einen menschlichen Patienten. Die genaue zu verabreichende Menge wird entsprechend der Verwendung des Antikörpers und entsprechend dem Alter, Geschlecht und Verfassung des Patienten variieren, sie variiert jedoch typischerweise von ungefähr 0,1 mg bis 1000 mg zum Beispiel von ungefähr 1 mg bis 500 mg. Der Antikörper kann in einer Einzeldosis oder in einer fortlaufenden Art über eine Zeitdauer verabreicht werden. Die Dosierungen können geeigneterweise wiederholt werden. Typische Dosierungen können zum Beispiel zwischen 0,1–50 mg/kg Körpergewicht pro einzelne therapeutische Dosis, insbesondere zwischen 0,1-20 mg/kg Körpergewicht für eine einzelne therapeutische Dosis liegen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden in jedem Fall die folgenden Antikörperfragmente über ihren unten angegebenen abgekürzten Namen verwendet und identifiziert. In jedem Fall wurde der Antikörper von einem monoklonalen Mäuseantikörper, wie es in der Beschreibung der WO 92/01059 (A5B7) beschrieben ist, oder durch Verwendung ähnlicher Verfahren (hTNF40 und cTN3) hergestellt:

hA5B7 – ist ein konstruierter menschlicher Antikörper, der das carcinoembryonische Antigen erkennt. Das hier verwendete Antikörperfragment weist einen Cysteinrest auf, der für die Poly(ethylenglykol)-ierung verfügbar ist und sich in dessen Gelenkregion nach der Aktivierung mit β-Mercaptoethylamin befindet.
hTNF40 – ist ein konstruierter menschlicher Antikörper, der menschliches FNFα erkennt. In den Beispielen werden zwei hTNF40 Antikörperfragmente verwendet, eines (Beispiel 2), das einen einzigen Cysteinrest in der Gelenkregion aufweist (siehe hA5B7 vorstehend), und ein zweites (Beispiel 3), das zwei für die Poly(ethylenglykol)-ierung verfügbare Gelenkcysteinreste aufweist.
cTN3 – ist ein chimärer Hamster-/Mausantikörper, der Mäuse-TNFα erkennt und ein konstante Mäuse-IgG2a-Region aufweist. Der Antikörper weist drei für die Poly(ethylenglykol)-ierung verfügbare Gelenkcysteinreste auf.
Hg162 – ist ein konstruierte menschlicher Antikörper, der den menschlichen PDGF(β-Rezeptor erkennt. Das hier verwendete Antikörperfragment weist einen einzigen für die Poly(ethylenglykol)-ierung verfügbaren Cysteinrest auf, der sich in dessen Gelenkregion befindet.

In Beispiel 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet: PEG = CH₃O(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₂NHCO(CH₂)₂ PEG-Maleimid = CH₃O(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₂NHCO(CH₂)₂
Fab'-PEG = CH₃O(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₂NHCO(CH₂)₂
in den Beispielen 2-7 wird die PEG-Abkürzung in Bezug auf einen geraden oder verzweigten Methoxypoly(ethylenglykol) mit oder ohne Linkersegment zwischen der Poly(ethylenglykol)kette und der reaktiven Thiolgruppe wie gezeigt verwendet. In jedem Beispiel erfolgt die Bindung an den Antikörper entweder durch eine wie vorstehend beschriebene -S-C-Bindung oder in Beispiel 5 durch eine -S-S-Bindung.
In allen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

DTDP – 4,4'-Dithiodipyridin
PBS – Phosphat-gepufferte Salzlösung
HPLC – Hochleistungsflüssigchromatographie
AUC – Fläche unter der Kurve

BEISPIEL 1
Reinigung von hA5B7 Fab'
hA5B7 Fab' wurde in E.coli W3110 Zellen exprimiert, die in einem Fermentor mit 1,5 Liter vermehrt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und auf das ursprüngliche Volumen mit 100 mM Tris pH-Wert 7,4, das 10 mM EDTA enthielt, resuspendiert und übernacht bei 55°C inkubiert. Das resultierende Zellextrakt wurde dann durch Zentrifugieren geklärt, woraus sich eine 1M Lösung in Bezug auf Glycin ergab, und der pH-Wert wurde mit 50% (w/v) Natriumglycinat auf 7,5 eingestellt. Diese Probe wurde auf eine Säule von Streamline^® A (Pharmacia) gegeben, die mit 1M Glycin/Glycinat bei einem pH-Wert von 8,0 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde hA5B7 Fab' mit 0,1 M Citrat bei einem pH-Wert von 3,0 eluiert. Das eluierte hA5B7 Fab' wurde dann mit 2 M Tris pH-Wert 8,5 auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und durch Ultrafiltration konzentriert.
Herstellung des PEG-Maleimidreagenz
Ein PEG-Maleimidderivat wurde nach einer vorherigen Beschreibung hergestellt [Pedley et al (1994) ebd]. Methoxypolyoxyethylenamin (mittleres Molekulargewicht von näherungsweise 5000, Sigma) wurde in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 aufgelöst und mit einem 1,2-fachen molaren Überschuß an 3-Maleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester während 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Ausmaß der Reaktion wurde durch Tüpfeln von Aliquoten der Reaktionsmischung auf eine TLC-Platte (Kieselgel 60) und Entwickeln mit Ninhydrin bestimmt. Die Reaktion wurde als vollständig betrachtet, wenn keine Purpurfärbung übrig blieb (Aminreaktion mit Ninhydrin). Das PEG-Maleimidprodukt wurde unter Verwendung einer Sephadex G-25 (PD-10) Säule (Pharmacia) zu entionisiertem Wasser entsalzt und lyophilisiert. Das Vorhandensein von aktiven Maleimidgruppen wurde durch Rücktitration mit β-Mercaptoethylamin gezeigt.
Herstellung von hA5B7 Fab'-PEG (ortsspezifisch)
Gereinigtes hA5B7 Fab' bei einer Konzentration von näherungsweise 11 mg/ml wurde zu einem 0,1 M Acetatpuffer, pH-Wert 6,0 unter Verwendung einer Bio-Spin 6 Säule (Bio-Rad) entsalzt. Dann wurde die Gelenkthiolgruppe durch Reduktion mit (β-Mercaptoethylamin aktiviert. hA5B7 Fab' wurde mit 5 mM β-Mercaptoethylamin in 0,1 M Acetatpuffer pH-Wert 6,0 während 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Probe wurde dann unter Verwendung einr Bio-Spin 6 Säule in 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 6,0 entsalzt. Die Anzahl der Tiolgruppen pro Fab'-Molekül wurde durch Titration mit DTDP, wie es schon vorher beschrieben wurde [Lyons et al(1990) ebd] gemessen. Dann wurde die Probe während 2,5 h bei Raumtemperatur mit PEG-Mealeimid, das nach der vorstehenden Beschreibung hergestellt worden war, in einem mehr als 10-fachen molaren Überschuß inkubiert. Das PEG-modifizierte Fab' wurde dann auf einer Bio-Spin 6 Säule zu einer Phosphat-gepufferter Salzlösung pH-Wert 6,8 entsalzt und es wurde eine Thioltitration durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Thiolgruppen vollständig mit dem PEG-Maleimidreagenz reagiert haben.
Herstellung von willkürlich modifiziertem hA5B7 Fab'-PEG
hA5B7 Fab' mit näherungsweise 11 mg/ml wurde zu 0,1 M Phosphat pH-Wert 8,0 unter Verwendung einer Bio-Spin 6 Säule entsalzt. Die Thiole wurden auf Lysinresten durch Reaktion mit 2-Iminothiolan in einem 7-fachen molaren Überschuß (Trauts Reagenz) während 1 h bei Raumtemperatur statistisch eingeführt. Nach dem Entsalzen in 0,1 M Phosphat pH-Wert 6,0 unter Verwendung einer Bio-Spin Säule wurde die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen unter Verwendung der Titration mit DTDP bestimmt. Das thiolierte hA5B7 Fab' wurde dann für die ortsspezifische Modifizierung mit PEG-Maleimid umgesetzt und, wie vorstehend beschrieben, entsalzt.
Analyse der PEG-modifizierten Proben
Zum Vergleich der zwei Verfahren der PEG-Anbindung (ortsspezifisch und willkürlich) wurde nach Proben mit einem ähnlichen Modifizierungsgrad gesucht. Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Bedingungen führt die ortsspezifische Anbindung an dem Gelenk zu durchschnittlich 0,98 PEG-Molekülen pro Fab'-Molekül, wohingegen die willkürliche Anbindung über Trauts Reagenz zu durchschnittlich 1,18 Peg-Molekülen pro Fab' führte. Die Analyse durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (1) zeigte, dass die Hauptbande in der nicht-modifizierten hA5B7 Fab'-Probe (Spur 1) ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa, so wie erwartet, aufwies. Die Probe, bei der PEG durch ortsspezifische Mittel an das Gelenk gebunden wurde (Spur 2) enthält etwas restliches nicht-modifziertes Fab sowie zwei andere deutliche Spezies von größerer Größe, von denen das deutlichste augenscheinlich ein Molekulargewicht von näherungsweise 66 kDa aufweist. Eine ähnliche Menge an restlichem nicht umgesetzten Fab' wird ebenfalls bei der willkürlich modifizierten Probe entdeckt. Es ist ersichtlich, dass diese Probe sehr viel heterogener, als die ortsspezifisch modifizierte Probe ist mit einigen diskreten Banden jedoch ebenfalls einer diffusen Färbung von Banden, die einen relativen breiten Molekulargewichtsbereich abdecken. Die genaue Größe des PEG-modifizierten Proteins kann aus dieser Technik nicht abgeleitet werden, da bekannt ist, dass die PEG-Anbindung den Lauf der Proteinbanden auf der Elektrophorese im Vergleich zu den Standardproteinen verändert. Es ist jedoch ersichtlich, dass beide Präparate mit PEG modifiziert worden sind und dass in jedem Fall unterschiedliche molekulare Spezies produziert worden sind.
Zur Bewertung der Wirkung der PEG-Modifikation auf die Aktivität des hA5B7 Fab' wurde ein kinetischer Assay mittels Oberflächen-Plasmonresonanz unter Verwendung eines Biacore 200 Instruments (Pharmacia Biosensor) durchgeführt. Der Assay wurde durch Modifizierung eines früher beschriebenen Verfahrens ausgeführt [Abraham et al J. Immunol. Methods (1995), 183, 119–125].
Der Puffer der karzinoembryonischen Antigens (CEA) (100 ml, 0,92 μg/ml) wurde in 0,1 M Natriumacetat pH-Wert 5,5 unter Verwendung einer BioSpin 6 Säule (BioRad) ausgetauscht. Natriumperiodat (2 μl, 50 mM in 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5, frisch hergestellt) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde auf Eis während 20 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Austausch des Puffers in 10 mM Natriumacetat pH-Wert 4,0 auf einer BioSpin 6 Säule beendet, woraus sich 100 μl oxidiertes CEA mit näherungsweise 0,89 mg/ml ergab. Das oxidierte CEA wurde dann auf einem CMS Sensorchip (Pharmacia Biosensor) unter Verwendung des Standard-Aldehydkopplungsverfahrens, das in der Bedienungsanleitung beschrieben ist, immobilisiert. Kurz gesagt, dies betraf die Aktivierung der Oberfläche durch Einspritzung des EDC/NHS Reagenz (15 μl, Aminkopplungskit, Pharmacia Biosensor) bei einer Durchflussrate von 5 μl/min, gefolgt von der Einspritzung von 35 μl 5 mM Hydrazin und dann 35 μl 1 m Ethanolamin. Danach wurden 35 μl oxidiertes CEA mit entweder 5, 1, 0,2 oder 0,05 μg/ml in 10 mM Natriumacetat pH-Wert 4,0 eingespritzt. Schließlich ließ man 40 μl Natriumcyanoborhydrid über die Oberfläche passieren und der Sensorchip wurde vor der Verwendung mit 4 aufeinanderfolgenden Aliquoten von 10 mM Salzsäure gewaschen. Jede hA5B7 Fab'-Probe wurde aus 20 μg/ml in HBS-Puffer (Pharmacia Biosensor) mit acht sich verdoppelnden Verdünnungen verdünnt. Die Proben wurden über die CEA-Oberfläche gespritzt, um die Bindungs- und Dissoziationskinetik zu beobachten. Die Assoziation- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten wurden berechnet, indem eine einfache 1 : 1 Bindungskinetik vorausgesetzt wurde und die nicht-linearen Geschwindigkeitsgleichungen angewandt wurden, die mit dem Analyseprogramm des Herstellers geliefert wurden.
Die Ergebnisse dieser Analyse (Tabelle 1) zeigen, dass es in diesem Assay einen gewissen Verlust an Wirksamkeit gab (bis zu 56% des nicht modifizierten hA5B7 Fab') als Ergebnis der ortsspezifischen Anbindung an dem Gelenk. Jedoch führte die Anbindung einer ähnlichen Zahl von PEG-Molekülen in einer willkürlichen Art zu einem Material mit einer Immurireaktivität von nur 29%. Der Verlust an Wirksamkeit scheint hauptsächlich durch eine verringerte Assoziationsgeschwindigkeit verursacht zu sein, obwohl es ebenfalls eine leicht erhöhte Dissaziationsrate geben könnte.
Für die pharmakokinetische Analyse wurden Fab'-Proben mit ¹²⁵I unter Verwendung des Bolton-Hunter Reagenz durch eine Standardmethodologie markiert und zu einer Phosphatgepufferten Salzlösung pH-Wert 6,8 zur Entfernung von nicht umgesetztem ¹²⁵I entsalzt. Gruppen von sechs männlichen Wistar-Ratten wurden intravenös 20 μg markiertes Fab' in die Schwanzvene; injiziert. Zu ausgewählten Zeitpunkten wurden Blutproben genommen, in einem Gammazähler gezählt und die prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Blut berechnet. Die Löschungsgeschwindigkeiten und die Fläche unter den Kurvenwerten wurden unter Verwendung des SIPHAR Softwarepakets berechnet.
In 2 sind die Löschungskurven für da hA5B7 Fab' und die zwei PEG-modifizierten Präparate gezeigt. Aus diesen Kurven ist klar ersichtlich, dass die Löschung des PEGmodifizierten hA5B7 Fab' signifikant langsamer ist als diejenige des nicht modifizierten hA5B7 Fab'. Zusätzlich ist die Löschung des ortsspezifisch modifizierten Fab' unerwartet langsamer, als diejenige des willkürlich modifizierten Materials. Die berechneten pharmakokinetischen Parameter (Tabelle 2) zeigen, dass die Modifikation mit PEG die Löschungsgeschwindigkeit von hA5B7 Fab' in sowohl den a als auch ß Phasen näherungsweise um das zweifache verringert. Diese Verbesserungen spiegeln sich in der Fläche unter den Kurven(AUC)werten wider, die einen signifikanten PEG-Bindungseffekt zeigen. Die ortsspezifische PEG-Anbindung führt zu einer AUC-Vergrößerung näherungsweise um das 18-fache im Vergleich zu dem nicht modifizierten Fab', wohingegen willkürlich gebundenes PEG nur zu einer sechsfachen Vergrößerung im Vergleich zu dem nicht modifizierten Fab' führt. Tabelle 1 Immunreaktivität der an CEA bindenden hA5B7 Fab'-Proben durch BIAcore Analyse.
Tabelle 2 Pharmakokinetische Eigenschaften PEG-modifizierter Fabs
BEISPIEL 2
Ortsspezifische Bindung von PEG an hTNF40 Fab' Reinigung von hTNF40 Fab'
hTNF40 Fab' wurde in E.coli W3110 Zellen exprimiert, die in einem Fermentor mit 1,5 Liter vermehrt wurden und ein Zellextrakt wurde nach der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt. Das Zeltextrakt wurde auf eine Leitfähigkeit von 3,5 μS/cm verdünnt, ein pH-Wert von 4,5 eingestellt und auf eine Säule von Streamline^® SP (Pharmacia) gegeben, die mit einem 50 mM Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde das Fab' mit 200 mM Natriumchlorid in 50 mM Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 eluiert. Der pH-Wert des eluierten Materials wurde auf 6 eingestellt und das Fab' wurde weiterhin durch Aufbringen auf eine Protein G-Sepharosesäule, die in PBS äquilibriert worden war, gereinigt. Nach dem Waschen mit PBS wurde das Fab' mit 0,1 M Glycin-Salzsäure pH-Wert 2,7 eluiert und der pH-Wert wurde sofort auf 6 eingestellt. Das gereinigte Fab' wurde dann durch Ultrafiltration auf > 10 mg/ml konzentriert.
Herstellung von hTNF40 Fab'-PEG(25 kDa) und hTNF40 Fab'-PEG(40 kDa) über Gelenk-Thiol-PEGbindung
Der Puffer des gereinigten Fab' wurde in einen 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 6, der 2 mM EDTA enthielt, ausgetauscht. Die Gelenkt-Thiogruppe wurde dann durch Reduktion mit 5 mM (3-Mercaptoethylamin, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert. Dies führte zu durchschnittlich 1,1 Thiole pro Fab', wie durch Titration mit DTDP bestimmt wurde. Dann wurden Fab'-PEG-Proben mit sowohl 25 kDa als auch 40 kDa PEG unter Verwendung von PEG-Maleimidderivaten hergestellt, die von Shearwater Polymets Inc. Huntsville, AL, USA geliefert wurden. Das 25 kDa PEG-Maleimidderivat war eine einzelne direkt mit einer Maleimidgruppe verknüpfte PEG-Kette und das 40 kDa PEG-Maleimidderivat wurde aus einer verzweigten Struktur hergestellt, die zwei über ein Lysinderivat mit einer Maleimidgruppe verknüpfte 20 kDa PEG-Ketten umfasste. Frisch reduziertes und entsalztes Fab' wurde mit einem dreifachen molaren Überschuß an 25 kDa PEG-Maleimid oder mit einem neunfachen molaren Überschuß an 40 kDa PEG-Maleimid über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und die resultierenden Fab'-PEG-Konjugate wurden durch Gel-Filtrations HPLC unter Verwendung einer in einem 0,2 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,0 laufenden Zorbax GF-250 Säule gereinigt. Für Vergleichszwecke wurde auch ein willkürlich PEG-modifiziertes hTNF40 Fab' mit 25 kDa PEG hergestellt, so wie es für die 5kDa PEG-Bindung an das A5B7 Fab' in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wurde ein Konjugat mit durchschnittlich 1,5 PEG-Molekülen pro Fab' hergestellt.
Analyse der Fab'-PEGKoniugate
Gereinigte Proben wurden durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht: Wie erwartet liefen PEG-Konjugate mit geringerer Beweglichkeit als das nichtmodifizierte-Fab' und es wurde gezeigt, dass sie frei von nicht-modifiziertem Fab' waren (3). Zusätzlich waren die Gelenk-modifizierten Fab'-PEG-Konjugate definierter auf dem SDS-PAGE als das willkürliche PEG-Konjugat.
Die Fähigkeit der PEG-Konjugate zur Bindung ihres. Antigens, TNF, wurde in einem L929 Bioassay untersucht und mit sowohl dem nicht-modifizierten Fab' als auch IgG verglichen. L929 ist eine anhaftende Mäusefibroblastenzelllinie, die gegenüber der zytotoxischen Wirkung von TNF in Gegenwart des Proteinsyntheseinhibitors Actinomycin D empfindlich ist. Es ist daher möglich die Aktivität von TNF-Antagonisten, wie zum Beispiel von Anti-TNF-Antikörpern unter Verwendung dieser Zelllinie zu vergleichen. Platten mit 96 Vertiefungen, die mit L929 Zellmonoschichten geimpft sind, werden in 100 ng/ml menschlichem TNF mit 1 μg/m1 Actinomycin D während 18 Stunden in einem mit Glutamin ergänzten RPMI Medium kultiviert. Unter diesen Bedingungen werden zwischen 95–100% der Zellen abgetötet und hören auf an dem Gewebekulturkunststoff zu haften. Die übrigen Zellen werden dann mit 100%-igem Methanol während 1 Minute fixiert und mit 5 %-igem Kristallviolett: gefärbt. Die Platten wurden dann gewaschen und die gefärbten Zellen wurden vor der Analyse auf einem Plattenleser in 30%-iger Essigsäure gelöst. Dieses Experiment wurde ebenfalls mit Titrationen von Antikörperproben durchgeführt, die gleichzeitig mit dem TNF in die Vertiefungen gegeben wurden. Die Ergebnisse wurden als TNF-Antagonistkonzentration gegenüber restlichem TNF aufgetragen, wobei die TNF-Konzentration umso geringer, je größer die Hemmung ist. Die hemmenden Antikörper können dann miteinander verglichen werden, indem die Konzentration von jedem Antikörper berechnet wird, die erforderlich ist 90% der TNF-Aktivität zu hemmen, woraus sich ein IC90 Wert ergibt.
In diesem L929 Assay weisen der hTNF40 Antikörper und sein Fab'-Fragment ein IC90 von 3 ng/ml auf. Die Ergebnisse mit sowohl 25 kDa und 40 kDA Gelenk-modifizierten PEG-Konjugaten zeigten ebenfalls IC90 Werte von 3 ng/ml, was darauf schließen lässt, das diese Konjugate TNF im selben Ausmaß neutralisieren wie hTNF40 Fab' und IgG (4). Willkürlich konjugiertes hTNF40 Fab'-PEG war mit einem IC90-Wert von 10 ng/ml weniger wirksam, als die Gelenk-konjugierten Präparate.
Die pharmakokinetische Analyse der Konjugate wurde in Ratten mit ¹²⁵I markiertem Material durchgeführt, so wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse (5) zeigen für alls PEGmodifizierten Fab'-Fragmente im Vergleich zu den nicht-modifiziertem Fab' eine erhöhte Zirkulationshalbwertszeit. Die Anbindung größerer PEG-Moleküle an der Gelenkregion erhöhte die Zirkulationshalbwertszeit mehr als kleinere PEG-Moleküle. Willkürlich modifiziertes Fab' mit durchschnittlich 1,5 25 kDa PEG-Molekülen pro Fab' (durchschnittlich 37,5 kDa Peg pro Fab') zeigte eine Halbwertszeit, die zwischen den Gelenkregion Fab'-Konjugaten mit 25kDa und den 40kDa PEG lag.
In einem gesonderten Experiment wurde die Pharmakokinetik von hTNF40 IgG, Fab' und Fab'-PEG (25 kDa Gelenk-gebunden) in Ratten nach Markierung mit ¹¹¹In miteinander verglichen. IgG und Fab' wurden an einen 9N3 makrocyclischen Chelatbildner zur Markierung mit ¹¹¹In wie beschrieben ist, [Turner et al, Br. J. Cancer 70 35–41 (1994)] konjugiert. Für das PEG-Konjugat wurde das Fab'-9N3-Konjugat hergestellt und mit ¹¹¹In unter Verwendung desselben Verfahrens markiert und anschließend wurde 25 kDa PEG wie vorstehend beschrieben an die Gelenkregion gebunden. Das markierte Konjugat wurde dann durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt. Die Ergebnisse des pharmakokinetischen Rattenexperiments mit diesen ¹¹¹In markierten Konjugaten (6) zeigte wiederum eine erhöhte Zirkulationshalbwertszeit für das PEG-modifizierte Fab' im Vergleich zu dem nichtmodifizierten Fab', wobei die Blutkonzentrationen nach 144 Stunden höher als diejenigen von IgG waren.
BEISPIEL 3
Herstellung von hTNF40 Fab'-(PEG)₂
In diesem Beispiel wird die Anwendbarkeit des Verfahrens auf Fab'-Fragmente gezeigt, die durch Verdauung von IgG, das zwei Gelenkcysteinreste enthält, hergestellt werden.
Herstellung von hTNF40 Fab'-(PEG)2
Der vollständige hTNF40-Antikörper wurde in NSO Zellen exprimiert, durch Protein A Sepharose Chromatographie gereinigt und F(ab')₂ wurde durch Verdauung mit Pepsin unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt. F(ab')₂ wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-200 HR gereinigt. Nach Austausch des Puffers in einen 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8, der 5 mM EDTA enthielt, wurde F(ab')₂ zu Fab' durch Inkubation mit 5 MM β-Mercaptoethylamin während 30 Minuten bei 37 °C reduziert. Dann wurde PEG-Maleimid (25 kDa PEG – siehe Beispiel 2) bis zu einem 3-fachen molaren Überschuß bezüglich der Fab'-Konzentration zugegeben und man ließ die Reaktion über Nacht weiterablaufen. Die resultierende Mischung wurde durch Gelfiltrations-HPLC analysiert und es wurde festgestellt, dass sie eine Mischung aus nicht-modifiziertem Fab', Fab'-PEG und Fab'-(PEG)₂ enthielt (7). Das PEG modifizierte Material wurde durch durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und es resultierte eine Mischung mit. 1 : 1,2, Fab'-PEG:Fab'-(PEG)2.
Antigenbindungs- und pharmakokinetische Analyse
Die Antigenbindungsaktivität wurde durch einen BIAcore Assay bewertet, der die TNF-Bindungsaffinität maß. Fab' oder PEG-modifizierte Proben wurden mit einem immobilisierten Anti-Fab'-Antikörper eingefangen und menschliches TNF passierte die Oberfläche. Die Kinetik der TNF-Bindung wurde dann analysiert. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Mischung aus Fab'-PEG und Fab'-(PEG)₂ eine Bindungsaffinität, K_D von 0,14 nM aufwies. Dies ist vorteilhaft im Vergleich zu dem nicht-modifizierten Fab', das in demselben Assay ein K_D von 0,28 nM aufwies, was darauf hinweist, dass es keinen Verlust an Antigenbindungsaktivität aufgrund der PEG-Anbindung gab.
Die Pharmakokinetik des eine Mischung aus Fab'-PEG und Fab'-(PEG)₂ enthaltenden gereinigten Materials wurde in Ratten nach der radioaktiven Markierung mit ¹²⁵I bewertet. Die Ergebnisse (8) zeigen eine verbesserte Zirkulationshalbwertszeit im Vergleich zu Fab'-PEG alleine, das aus dem von E.coli exprimierten Material mit einem einzigen nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellten Gelenkcystein hergestellt worden war.
BEISPIEL 4
Herstellung von cTN3 Fab'-PEG, Fab'-(PEG)2 und Fab'-(PEG)3
Der cTN3-Antikörper wurde in NSO Zellen exprimiert, gereinigt und mit Pepsin unter Herstellung von F(ab')₂ unter Verwendung von Standardtechniken verdaut. Der Puffer des gereinigten F(ab')₂ wurde in einen 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 8,0, der 5 mM EDTA enthielt, ausgetauscht und dann wurde F(ab')₂ mit 9 mM (3-Mercaptoethylamin reduziert und mit PEG wi ein Beispiel 3 beschrieben an der Gelenkregion modifiziert. Es wurde eine Mischung aus Fab', Fab'-PEG, Fab'-(PEG)₂ und Fab'-(PEG)₃ erhalten. Fab' und Fab'-PEG wurden von Fab'-(PEG)₂ und Fab'-(PEG)₃ durch Gelfiltrations-HPLC getrennt. Die gereinigte Probe mit Fab'-(PEG)₂ und Fab'-(PEG)₃ enthielt ein Verhältnis von 1,6 : 1 Fab'(PEG)₂: Fab'-(PEG)₃.
Antigenbindungs- und pharmakokinetische Analyse
Die Antigenbindungsanalyse von cTN3 Fab', Fab'-PEG und Fab'-(PEG)₂ + Fab'-(PEG)₃ wurde in einer Variante der vorstehend beschriebenen L929 Bioassays durchgeführt. Die TN3-Antikörper wurden mit Mäuse-TNF inkubiert. In diesem Assay weist cTN3 IgG einen IC90-Wert von näherungsweise 1000 pg/ml auf. In demselben Assay weisen sowohl Fab' als auch Fab'-PEG dasselbe Hemmprofil und dieselben IC90-Werte auf. Die Ergebnisse zeigten daher keinen Verlust an Antigenbindungsfunktion nach der PEG-Modifikation (9).
Die Pharmakokinetik des gereinigten Fab'-PEG-Materials und eine Mischung aus Fab'(PEG)₂ und Fab'-(PEG)₃ wurde in Ratten nach der radioaktiven Markierung mit ¹²⁵I bewertet. cTN3 Fab' und IgG wurden in demselben Experiment ebenfalls verglichen. Die Ergebnisse (10) zeigen eine sehr schnelle Löschung für das nicht-modifizierte Fab', wohingegen PEG-modifiziertes Fab' eine viel längere Zirkulationshalbwertszeit aufwies. Dies wird weiterhin durch die Zugabe von weiterem PEG verbessert, wie durch die Fab'-(PEG)₂ + Fab'(PEG)₃-Probe gezeigt wird. Diese Probe wies im Vergleich zu IgG eine größere AUC auf (10).
In den Beispielen 5 und 6 wird die Verwendung alternativer Thiol-selektiver Reagenzien gezeigt:
BEISPIEL 5
Herstellung von hTNF40 Fab'-PEG unter Verwendung eines Vinylsulfonreagenz
Es wurde berichtet, dass Vinylsulfone bei Verwendung bei oder unterhalb eines pH-Werts von 8 Thio-spezifisch sind [Morpurgo, M. et al, Bioconjugate Chem. (1996), 7, 363–368]. In diesem Beispiel wird PEG auf eine ortsspezifische Art an Fab' unter Verwendung eines 5 kDA PEG-Vinylsulfonderivats gebunden (Shearwater Polymers Inc. ebd), bei dem das PEG direkt an die Sulfongruppe gebunden ist.
hTNF40 Fab' wurde zur Bildung eines wie in Beispiel 2 beschriebenen freien Gelenkthiols hergestellt und reduziert. Bei dieser Herstellung ergaben sich durchschnittlich 1,1 Thiole pro Fab', wie durch Titration mit DTDP bestimmt wurde. Nach dem Entsalzen in einen 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,0, der 2 mM EDTA enthielt wurde ein 30-facher molarer Überschuß an PEG-Vinylsulfon zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht inkubiert. Die SDS-PAGE Analyse zeigte die Konjugation von PEG auf das Fab'-Molekül mit einer Ausbeute von näherungsweise 30% (11).
Fab'-PEG wurde durch Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung unter Verwendung einer Phenyl-Sepharose HP Hi Trapsäule (Pharmacia) gereinigt. Die Vernetzungsmischung wurde in Bezug auf Ammoniumsulfat auf 1,5 M eingestellt und auf eine Phenyl-Sepahrose HP Säule gegeben, die mit einem 50 mM Phosphatpuffer pH-Wert 7,0 der 1,5 M Ammoniumsulfat enthielt, prääquilibriert worden war. Fab'-PEG wurde unter Verwendung eines 50 Säulenvolumen linearen Gradient zu 50 mM Phosphat pH-Wert 7 eluiert. Die Antigenbindungsaffinität wurde mit nicht-modifiziertem Fab' durch BIAcore Analyse verglichen, so wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieser Analyse (Tabelle 3) zeigten keinen Verlust an Antigenbindungsaktivität durch die Konjugation von PEG über ein Vinylsulfonreagenz, ebenso war die Bindungsaffinität des Fab'-PEG-Konjugats ähnlich zu IgG.
BEISPIEL 6
Herstellung von hTNF40 Fab'-PEG unter Verwendung eines Iodacetamidreagenz
In diesem Beispiel wird PEG auf eine ortsspezifische Art mit Fab' unter Verwendung eines 5 kDa PEG-Iodacetamidderivats (Shearwater Polymers Inca edb.), in dem PEG direkt an die Acetamidgruppe gebunden ist, verknüpft.
hTNF40 Fab'-PEG wurde wie in Beispiel s beschrieben hergestellt und gereinigt, wobei ein 30-facher molarer Überschuß an PEG-Iodacetamid verwendet wurde. Die Antigenbindungsaffinität des Produkts wurde wie in Beispiel 3 beschrieben mit derjenigen von nicht-modifiziertem Fab' durch BIAcore Analyse verglichen. Die Ergebnisse dieser Analyse (Tabelle 3) zeigten keinen Verlust an Antigenbindungsaktivität durch die Konjugation von PEG über ein Iodacetamidreagenz, ebenso war die Bindungsaffinität des Fab'-PEG-Konjugats ähnlich zu IgG. Tabelle 3 Kinetische Analyse der hTNF40 Fab'-PEG-Konjugate
BEISPIEL 7
Herstellung von Anti-PDGFβR Fab'-PEG
In diesem Beispiel wird die Anwendung der ortsspezifischen PEG-Anbindung mit einem weiteren rekombinanten Fab'-Fragment gezeigt.
Das Fab' aus dem konstruierten menschlichen Antikörper hgl62, das den PDGF(β-Rezepotr erkennt wurde in E.coli exprimiert, so wie es für das Fab'-Fragment von hTNF40 beschrieben wurde (siehe Beispiel 2). Die Zellen wurden aus einer durch Zentrifugation Fermentationskultur geerntet und Fab' wurde durch Resuspendieren der Zellen in 100 mM tris pH-Wert '7,4, das 10 mM EDTA enthielt, und Inkubieren über Nacht bei 60 °C extrahiert. Dann wurde Fab' durch expandierte Bettchromatographie unter Verwendung einer Säule von Streamline A^TM (Pharmacia), die mit 1 M Glycin/Glycinat pH-Wert 8,0 prääquilibriert worden war, gereinigt. Die Probe wurde auf 1 M in Bezug auf Glycin eingestellt und der pH-Wert wurde auf 7,5 mit 50% (W/v) Natriumglycinat vor dem Aufbringen der Säule im expandierten Bettmodus eingestellt. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde das Säulenmaterial in ein gepacktes Bett gepackt und Fab' wurde mit 0,1 M Citrat mit einem pH-Wert von 3,0 eluiert.
Weitere Aufreinigung wurde erreicht, indem der pH-Wert des Eluats mit 2 M Tris auf 7,5 eingestellt wurde und es auf eine Säule von Protein G Sepharose gebracht wurde, die mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wurde Fab' mit 0,1 M Glycin-HCl mit einem pH-Wert von 2,7 eluiert. Der pH-Wert des eluierten Fab' wurde dann mit 2 M Tris auf 6,0 eingestellt.
Das gereinigte Anti-PDGF(βR-Fab' wurde in einen 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 6,0, der 2 mM EDTA enthielt, diafiltriert. Das Gelenkthiol wurde durch Reduktion mit (3-Mercaptoethylamin aktiviert. Fab' wurde mit 5 mM (3-Mercaptoethylamin on 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0, der 2 mM EDTA enthielt, während 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Probe in einen 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0 mit 2 mM EDTA, unter Verwendung von Sephadex G-25 (PD10) Säulen entsalzt. Die Anzahl der Thiolgruppen pro Fab'-Molekül wurde durch Titration mit DTDP gemessen und es wurde festgestellt, dass sie 1,08 betrug: Dann wurde PEG-Maleimid (40 kDa siehe Beispiel 2) in einem dreifachen molaren Überschuß zugegeben und man ließ die Mischung über Nacht reagieren. Die Umsetzung zu Fab'-PEG wurde mit einer Ausbeute von näherungsweise 60% erreicht (12). Dann wurde das Fab'-PEG-Konjugat wie in Beispiel 2 beschrieben durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt.
Die Antigenbindungsaffinität von Anti-PDGFßR Fab'-PEG wurde mit derjenigen von nichtmodifiziertem Fab' durch eine BIAcore Analyse verglichen. Die kinetische Analyse zur Bestimmung der Bildungs- und Verlustgeschwindigkeiten für die Anti-PDGFßR Fab'-PEG-Bindung zu PDGFβR wurde unter Verwendung eine BIACORE 2000 (Biacore AB) durchgeführt. Ein Mäuse-IgG Fc-PDGFβR-Fusionsmolekül wurde durch ein auf der Sensorchipoberfläche immobilisiertes Anti-Mäuse-IgG eingefangen. Dana Anti-PDGFβR-Fab'-PEG injiziert. Das affinitätsreine F(ab')₂-Fragment des Ziegen Anti-Mäuse Ig, Fc-Fragment-spezifisch (Jackson Immunoresearch), wurde auf einem Sensorchip CMS über Aminkopplungschemie auf eine Gehalt von 11500 RU immobilisiert. Nach dem Immobilisierungsverfahren wurde eine leere Oberfläche hergestellt, jedoch wurde eine Injektion der einfangenden Moleküle unterlassen. Der HBS Puffer (10 mM HEPES pH-Wert 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% grenzflächenäktives Mittel P20, Biacore AB) wurde als Laufpuffer mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 μl/min verwendet. Eine Injektion des Überstandes von Mäuse IgG Fc- PDGFβR, das in der der rekombinanten COS Zelle exprimiert worden war, wurde durch das immobilisierte Anti-Mäuse IgG zu einem Gehalt von zwischen 200–250 RU eingefangen. Anti- PDGFβR Fab' oder Fab'-PEG-Moleküle wurden über die eingefangene Mäuse-IgG Fc- PDGFβR-Oberfläche von 2 mg/ml bis 0,52 mg/ml titriert. Die Oberflächen wurden durch Injektion von 10 ml 30 mM Salzsäure regeneriert. Die Injektionen von Mäuse-IgG Fc- PDGFβR und jede Konzentration von Anti- PDGFβR-Fab' oder Fab'-PEG wurden über die leere Oberfläche hinweg als Kontrollen wiederholt. Das Sensorgramm für jede Anti- PDGFβR-Fab'- oder Fab'-PEG-Konzentration wurde mit dem entsprechenden Sensorgramm für die leere Oberflächen nach Deletion der Mäuse-Ig Fc-PDGFβR-Injektion und dem Regenerierungsschritt korrigiert. Die kinetischen Parameter wurden unter Verwendung der BIAauswertungssoftware 2.1 berechnet.
Die Ergebnisse für Fab' und Fab'-PEG sind in Tabelle 4 gezeigt. Es gab wenig Unterschied in den Werten der bestimmten kinetischen Parameter, was zeigt, dass die Bindung von PEG an die Gelenkregion zu wenig Verlust in der Antigenbindungsaffinität führte. Tabelle 4 BIAcore Analyse von Anti- PDGFβR Fab' und Fab'-PEG
Die Pharmakokinetik von Anti- PDGFβR Fab' und Fab'-PEG wurde in einem Rattenexperiment unter Verwendung von in Beispiel 1 beschrieben ¹²⁵I-markierten Proben untersucht. Die Ergebnisse zeigten für Fab'-PEG im Vergleich zu Fab' eine viel geringere Entfernung aus dem Blut (13). Dies spiegelte sich in den Berechnungen der in Tabelle 5 gezeigten pharmakokinetischen Parameter wider. Tabelle 5 Pharmakokinetische Parameter von Anti- PDGFβR Fab'-POEG im Vergleich zu Fab' und I G

Claims

Modifiziertes, monovalentes Antikörperfragment, welches eine schwere Kette und eine leichte Kette umfaßt, wobei die schwere Kette aus einer über ihren C-Terminus mit einer CH1-Domäne kovalent verknüpften V_H-Domäne besteht, die leichte Kette aus einer V_L-Domäne besteht, welche komplementär zu der über ihren C-Terminus mit einer C_L-Domäne kovalent verknüpften V_H-Domäne ist, die C_H1-Domäne zur Bereitstellung einer Gelenkdomäne, welche nur einen Cysteinrest enthält, verlängert ist, die Cysteinreste in den V_H-, C_H1-, V_L- und C_L-Domänen Disulfid-Bindungen miteinander aufweisen und der Cysteinrest in der Gelenkdomäne über sein Schwefelatom mit einem Polymermolekül kovalent verknüpft ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein gegebenenfalls substituiertes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymer oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Polysaccharid ist.
Antikörperfragement nach Anspruch 2, wobei das Polymer ein gegebenenfalls substituiertes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Poly(ethylenglykol, Poly(propylenglykol) oder Poly(vinylalkohol) oder ein Derivat davon ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 3, wobei das Polymer Methoxy(polyethylenglykol) oder ein Derivat davon ist.
Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches an ein oder mehrere Effektor- oder Reportermoleküle kovalent gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein monovalentes Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, Verdünnungsmitteln oder Trägern umfaßt.