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Diese
Erfindung betrifft Peptide, welche als Gelenkregionen in Proteinen
fungieren, Proteine, die solche Gelenkregionen enthalten, und die
Verwendung der Proteine in der Medizin.
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In
der klinischen Antikörpertherapie
und in bildgebenden Anwendungen ist die Avidität einer dimären Antikörperspezies häufig erforderlich,
um eine wirksame Antikörperaffinität in vivo
zu erreichen, jedoch ohne die Effektorfunkionen oder lange Serumpermanenz,
die durch die Fc-Domäne
bereitgestellt wird (Lit. 1–3 – für die Literatur,
auf die hier durch Zahlen Bezug genommen wird, siehe die nachfolgende
Liste "Literaturstellen"). F(ab')2-Moleküle erfüllen dieses
Erfordernis und können
durch proteolytische Spaltung von monoklonalem IgG geeigneter Isotypen
oder durch Verwendung von aus rekombinantem Immunoglobulin abgeleiteten
Domänen, die
in E. coli hergestellt wurden, hergestellt werden.
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Die
Fähigkeit,
Antikörperfragmente
an das oxidierende Periplasma von E. coli zu sekretieren, hat zu raschen
Fortschritten in der gentechnischen Herstellung von übertragenen,
hoch exprimierten Fab's
geführt. Es
ist wichtig, daß die
Verwendung von E. coli auch die kosteneffektive und schnelle Produktion
von den Mengen des Antikörpermaterials
erlaubt, die erforderlich sind, um einen großen Markt zu versorgen (Lit.
4, 5). Gentechnisch hergestelltes Fab' wird häufig nur mit einem Gelenk-Cystein
exprimiert. Dieses Cystein kann für die Bindung anderer Fab's verwendet werden,
um ein F(ab')2 herzustellen, oder für die Bindung therapeutischer Effektormoleküle wie Radionuklide,
Enzyme oder Toxine (Lit. 6).
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Verschiedene
Ansätze
zur gentechnischen Herstellung für
die Herstellung von divalenten Antigen-bindenden Spezies in vivo
in E. coli sind berichtet worden, die sowohl modifizierte scFvs
als auch Fab's verwenden.
Einfache Gelenkmodifikationen geben keine substantiellen Ausbeuten
in vivo an dimeren Spezies aus E. coli (Lit. 7–9). Techniken zur Steigerung
der Dimerisierung in vivo sind gut charakterisiert, aber diese verwenden
oft große
Nicht-Immunoglobulin-Dimerisierungsmotive,
welche potentiell immunogen sind und ernsthafte Reduktionen des
Niveaus der Expression an löslichem
Protein verursachen können
(Lit. 10–13).
Der einfachste Weg zur Herstellung von dimeren Antigenbindenden
Spezies bleibt die direkte Disulfid- oder chemische Vernetzung von
Fab's in vitro (Lit.
2, 7, 14, 15). Die Wahl der kovalenten Verknüpfung zwischen den zwei Fab's ist eine wichtige.
Falls das F(ab')2 in vivo gespalten wird, erleiden die entstehenden
generierten Fab'-Moleküle dann
sowohl einen Verlust an Avidität
als auch sehr rasche Clearance aus dem Kreislauf (Lit. 1, 2). Von
Einzeldisulfidbindungen ist bekannt, daß sie empfänglicher für die Spaltung in vivo sind
als geschützte
Disulfid-, Sulfid- oder Thioetherbindungen (Lit. 2, 9, 16). Allerdings
ist von zwei Disulfiden, wie sie in der Gelenkregion von F(ab')2 isoliert
aus der proteolytischen Spaltung von IgG1 gefunden wurden, kürzlich gefunden
worden, daß sie
so robust sind wie eine Thioetherbindung bewertet nach der Serumpermanenz
(Lit. 9).
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Es
besteht ein Bedarf für
nicht-immunogene dimere Antikörperspezies,
welche das Problem der leichten in vivo-Spaltung überwinden,
während
sie weiterhin effizient sind, um andere Effektormoleküle herzustellen und
mit ihnen zu kuppeln. Wir haben nun ein Peptid gefunden, welches,
wenn es Teil eines größeren Proteins wie
eines Fab'-Fragments
ist, effizient Dimere generiert und dimeres Material ergibt, welches
hochresistent gegenüber
chemischer Reduktion in vitro ist und lange Serumpermanenzzeiten
in vivo aufweist. Vorteilhafterweise wird das Peptid in E. coli
gut toleriert und hat in unseren Tests bis heute gezeigt, daß es nicht-immunogen ist.
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Somit
stellen wir gemäß einem
Aspekt der Erfindung ein Peptid der Formel (1) zur Verfügung:
wobei X und Y, welche gleich
oder unterschiedlich sein können,
jeweils ein neutraler, aliphatischer L-Aminosäurerest sind, und geschützte und
reaktive Derivate davon.
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In
Formel (1) und den anderen, hier beschriebenen Peptiden werden herkömmliche
Einzelbuchstabenabkürzungen
verwendet, um Aminosäurereste
darzustellen ausgenommen jene, bei denen es anders angegeben ist.
Die Hochstellungen "N" oder "C" werden verwendet, um den N- beziehungsweise
C-terminalen Rest eines Peptids zu bezeichnen.
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Neutrale
L-Aminosäurereste,
die durch jede der Gruppen X und Y dargestellt werden, schließen Glycin-,
Alanin-, Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Serin- und Threoninreste ein.
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Geschütze Derivate
des Peptids der Formel (1) schließen N- und C-terminale geschützte Derivate
ein, in welchen die N-terminale Aminogruppe oder die C-terminale Carboxylgruppe
mit einer Schutzgruppe verknüpft
ist. N-Geschützte
Derivate schließen
zum Beispiel optional substituierte Benzyloxycarbonylamino-, Allyloxycarbonylamino-,
Cycloalkyloxycarbonylamino-, t-Butoxycarbonylamino-, Trifluoracetylamino-,
Phthalylamino-, Aralkylamino-, z. B. Benzylamino-, Diphenylmethylamino-
oder Triphenylmethylamino-, Tosylamino- oder Formylaminoderivate ein. C-Geschütze Derivate
schließen
zum Beispiel Ester wie optional substituierte Alkyl-, z. B. Methyl-,
Ethyl- oder t-Butyl-, Aralkyl-, z. B. Benzyl- oder Benzhydryl-,
Silyl-, z. B. Trimethylsilyl-, und Phthalimidomethylester und Ester
mit Polymeren, zum Beispiel funktionalisierte Harze auf Styrolbasis,
ein.
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Reaktive
Derivate von Peptiden der Formel (1) schließen solche ein, in denen die
C-terminale Carboxylgruppe funktionalisiert ist, und sind zum Beispiel
ein Acylhalogenid wie ein Acylchlorid, ein Acylcyanid oder -azid,
ein Anhydrid, ein Ester, zum Beispiel ein N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenyl-
oder Pentachlorphenylester, ein N-Acylheterocyclus wie ein N-Acylimidazol,
-pyrazol oder -triazol oder eine aktivierte Säure gebildet durch Addition
eines Carbodiimid- oder Isoxazoliumreagenzes.
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Besonders
nützliche
Peptide der Formel (1) schließen
solche ein, in denen X ein Alaninrest ist. In einer anderen Bevorzugung
ist Y insbesondere ein Threoninrest. Ein besonders nützliches
Peptid gemäß der Erfindung
weist die Formel (2) auf:
und geschützte und reaktive Derivate
davon.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
aus angemessen aktivierten und/oder geschützten Aminosäuren [zum
Beispiel unter Verwendung reaktiver Derivate und Schutzgruppen der
Arten, die in Verbindung mit den Peptiden der Formel (1) erwähnt wurden]
unter Anwendung von Standardpeptidsynthesetechniken hergestellt
werden [siehe zum Beispiel Merrifield, B., Science (1985), 232,
341–347].
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Das
Vorhandensein von vier Cysteinresten in jedem Peptid der Formel
(1) stellt vier Zentren für
die Disulfid- und/oder Thioetherbindungsbildung bereit und erlaubt
damit die Reaktion mit anderen Molekülen, die reaktive Thiolgruppen
enthalten. Insbesondere dimere Proteine können durch Einfügen der
Peptide in Proteinketten erhalten werden, und die Erfindung erstreckt
sich auf eine solche Verwendung. Um Proteindimerisierung zu erreichen,
muß ein
Peptid der Formel (1) zuerst mit einer existierenden Proteinkette
gekuppelt oder de novo als Teil von ihr synthetisiert werden, und
wir stellen daher in einem anderen Aspekt der Erfindung ein Protein
umfassend eine Polypeptidkette, die dadurch gekennzeichnet ist,
daß die
Kette eine Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC enthält, wobei
X und Y wie für
das Peptid der Formel (1) definiert sind, bereit.
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Die
Erfindung erstreckt sich auch auf Proteine enthaltend zwei Polypeptidketten,
die kovalent über
die Cysteinreste in NTCPPCPXYCPPCPAC wie oben erläutert verknüpft sind, und somit stellen
wir gemäß einem weiteren
Aspekt der Erfindung ein Protein umfassend zwei Polypeptidketten,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß jede der Ketten eine Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC (wobei
X und Y wie für
das Peptid der Formel (1) definiert sind] enthält und jede Kette kovalent
mit der anderen über
eine, zwei, drei oder vier der in jeder der Aminosäuresequenzen
vorhandenen Cysteinreste verknüpft
ist, bereit.
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In
den erfindungsgemäßen Proteinen
ist die Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC bevorzugt eine
Sequenz NTCPPCPAYCPPCPAC oder NTCPPCPXTCPPCPAC,
insbesondere die Sequenz NTCPPCPATCPPCPAC.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
können
natürlich
vorkommende Proteine sein, mit denen das Peptid der Formel (1) gekuppelt
worden ist, oder rekombinante Proteine, die die Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC enthalten.
Die Proteine können
im allgemeinen Struktur- oder insbesondere Bindungsproteine sein. Besondere
Bindungsproteine schließen
Hormone, Cytokine, Interleukine, Wachstumsfaktoren, Freisetzungsfaktoren,
Ionentransporter, Toxine und Rezeptoren davon, einschließlich aller
oder eines Teils der Rezeptoren, die mit dem Binden an Zelloberflächen-assoziierte
Moleküle
assoziiert sind, des T-Zellrezeptors,
CD4, CD8, CD28, der Cytokinrezeptoren, z. B. ein Interleukinrezeptor,
TNF-Rezeptor oder Interferonrezeptor, Rezeptoren für Interleukine,
z. B. G-CSF oder GM-CSF, von aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktoren,
z. B. PDGF-α und
PDGF-β,
und insbesondere Antikörper
und Antigenbindungsfragmente davon ein.
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Wenn
das erfindungsgemäße Protein
eine Peptidkette enthaltend eine NTCPPCPXYCPPCPAC-Aminosäuresequenz
aufweist, kann es ein monomeres Protein sein oder separat mit einem
oder mehreren anderen Polypeptidketten verknüpft sein, um insgesamt eine
multimere Struktur zu bilden. In solchen Proteinen der Erfindung
enthaltend zwei Polypeptidketten mit kovalent verknüpften NTCPPCPXYPPCPAC-Sequenzen
wird das Protein eindeutig mindestens dimer sein, kann aber auch
aus anderen, separat verknüpften
Ketten bestehen, um insgesamt eine multimere Struktur zu bilden.
Dimere und Multimere können
aus mehr als einer Art einer Polypeptidkette aufgebaut sein und
können
homo- oder heteromer sein.
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Die
Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen
kann durch Anwendung üblicher
chemischer oder rekombinanter DNA-Techniken erreicht werden. Chemische
Techniken schließen
chemisches Kuppeln eines Proteins und eines Peptids der Formel (1)
unter Verwendung aktivierter und geschützter Derivate des Proteins und
des Peptids wie oben mit Bezug auf die Herstellung von Peptiden
der Formel (1) beschrieben ein. Auf diesem Weg kann zum Beispiel
ein Peptid der Formel (1) ortsspezifisch mit dem C-terminalen Ende
eines geeignet C-aktivierten Proteins gekuppelt werden.
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Rekombinante
DNA-Techniken sind im allgemeinen mit der Expression eines Proteins
durch eine Wirtszelle, gefolgt von der Gewinnung des Proteins unter
Verwendung von Standardtrenn- und -reinigungstechniken verbunden.
DNA-Codierung für das Protein
kann in jedwedem geeigneten Expressionsvektor durch operatives Verknüpfen der
DNA mit jedweden notwendigen Expressionssteuerungselementen darin
und Transformieren jedweder geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszelle mit dem Vektor unter Anwendung wohlbekannter Verfahren
eingeführt
werden. Eine detailliertere Beschreibung geeigneter Techniken wird
nachfolgend mit Bezug auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Antikörpern gegeben.
Diesen kann im allgemeinen gefolgt und/oder diese können leicht
angepaßt
werden, um die Herstellung irgendeines erfindungsgemäßen Proteins
durch rekombinante Mittel zu ermöglichen.
Die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie stellt stellt einen
flexiblen Zugang zu erfindungsgemäßen Proteinen dergestalt bereit,
daß sie
die leichte Manipulation und Insertion eines Peptids der Formel
(1) an jedweder gewünschten
Position in einem Protein ermöglicht.
DNA-Codierung für
ein Peptid der Formel (1) ist daher besonders nützlich und bildet einen weiteren
Aspekt der Erfindung. DNA enthaltend die folgende Nukleotidsequenz:
[wobei jeder Buchstabe der
Standardcode für
ein Nukleotid ist] und codierend für die Aminosäuresequenz
NTCPPCPATCPPCA
C ist
besonders nützlich,
und die Erfindung erstreckt sich auf DNA umfassend diese Sequenz
zusammen mit Varianten davon, bei denen ein oder mehrere Nukleotide
aufgrund der Degeneration des genetischen Codes substituiert worden
sind. Die Erfindung erstreckt sich auch auf rekombinante Plasmide
enthaltend DNA codierend für
ein Peptid der Formel (1), auf Zellen enthaltend diese Plasmide
und auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins,
welches umfaßt
die Kultivierung der Zellen derart, daß das gewünschte Protein exprimiert wird,
und Gewinnung des Proteins aus der Kultur.
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Die
Aminosäuresequenzen NTCPPCPXYCPPCPYC sind
besonders geeignet für
die Verwendung mit Bindungsproteinen wie zellassoziierten Rezeptoren
oder Antikörpern,
wobei jede Sequenz als eine Gelenkregion fungieren kann, um Dimerisierungskapazität bereitzustellen.
Somit können
zum Beispiel rekombinante Rezeptoren [siehe zum Beispiel die Internationalen
Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. WO 92/100591, WO 92/15322,
WO 93/19163, WO 95/02686 und WO 97/23613] gestaltet werden, welche
diese Sequenzen inkorporieren, um die Dimerisierung der individuellen
Rezeptorketten, die für
effizientes Rezeptorbinden erforderlich sind, zu erleichtern, und
die Erfindung erstreckt sich auf einen rekombinanten Rezeptor umfassend
mindestens ein Peptid der Formel (1). Solche Rezeptoren sind zum
Beispiel von Nutzen für
die Umsteuerung und Aktivierung von Zellen (siehe die gerade erwähnten Patentoffenlegungsschriften],
und die Erfindung schließt solche
Zellen, die einen rekombinanten Rezeptor umfassend mindestens ein
Peptid der Formel (1) exprimieren, ein.
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In
Antikörpern
können
die Sequenzen NTCPPCPXYCPPCPAC als
Substitute für
natürlich
vorkommende Gelenkregionen verwendet werden [die Gelenkregion ist
zwischen den CH1- und CH2-Domänen in natürlich vorkommenden
Immunoglobulinen lokalisiert]. Die Sequenzen sind insbesondere für diesen
Zweck passend, und in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung stellen
wir einen Antikörper
umfassend eine Gelenkregion, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Gelenkregion
eine Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC aufweist, wobei
X und Y wie für
Formel (1) definiert sind, bereit. In diesem Fall weist die Gelenkregion
bevorzugt eine Aminosäuresequenz NTCPPCPAYCPPCPAC oder NTCPPCPXTCPPCPAC,
besonders bevorzugt NTCPPCATCPPCPAC auf.
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Der
Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet
wird, soll im allgemeinen monovalente, divalente oder andere multivalente
Antikörper
einschließen.
Somit kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer monovalenter Antikörper eine
einzelne Kette umfassend eine variable Immunoglobulin-Domäne der schweren
Kette (VH) und eine NTCPPCPXYCPPCPAC-Gelenkregion, die direkt mit ihr verbunden
ist, bevorzugt an dem C-terminalen Ende der VH-Domäne, sein.
Alternativ können
die VH-Domäne und die Gelenkregion durch
eine Abstandsregion umfassend eine oder mehrere Aminosäuren in
Peptidverknüpfung
miteinander und dem Rest des Antikörpers getrennt sein. Die Abstandsregion
kann zum Beispiel eine oder mehrere konstante Immunoglobulin-Domänen der
schweren (CH) oder leichten (CL)
Ketten oder Fragmente davon, zum Beispiel eine CH1-Domäne oder
ein Fragment davon und/oder eine CH2- und/oder
eine CH3-Domäne oder Fragmente davon, sein.
Wenn erwünscht
kann die Gelenkregion eine oder mehrere andere Aminosäuren, die
an ihren C-Terminus gebunden sind, zum Beispiel eine oder mehrere
konstante Immunoglobulinregiondomänen oder Fragmente davon, wie
sie gerade beschrieben wurden, aufweisen. Die VH-Domäne kann
monomer sein, oder sie kann dimer sein und VH-VH- oder VH-VL- (wobei VL eine
variable Immunoglobulin-Domäne
der leichten Kette ist) Dimere enthalten, in welchen die VH- und VL-Ketten
nicht-kovalent assoziiert sind. Wenn gewünscht können die Ketten allerdings
kovalent gekuppelt sein entweder direkt, zum Beispiel über eine
Disulfidbindung zwischen den beiden variablen Domänen, oder über einen
Linker, zum Beispiel einen Peptidlinker, um eine Einzelkettendomäne zu bilden.
Besondere Beispiele für
erfindungsgemäße monovalente
Antikörper
schließen
Fv, Einzelketten-Fv und insbesondere Fab- oder Fab'-Fragmente ein, die
jeweils eine Gelenkregion mit der Sequenz NTCPPCPXYCPPCPAC aufweisen.
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Erfindungsgemäße divalente
Antikörper
schließen
zwei der gerade beschriebenen monomeren Ketten, die kovalent über einen,
zwei, drei oder vier der Cysteinreste der Gelenkregion NTCPPCXYCPPCPAC jeder Kette verknüpft sind, ein. Die Verknüpfung kann
eine einfache Disulfidverknüpfung
sein oder kann über
eine Linkergruppe, zum Beispiel wie in den Internationalen Patentoffenlegungsschriften
mit den Nrn. WO 90109195 und WO 90/09196 beschrieben, erfolgen.
Besondere divalente Antikörper
schließen
F(ab)2- und F(ab')2-Fragmente
ein.
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Erfindungsgemäße multivalente
Antikörper
schließen
zum Beispiel tri- und tetravalente Antikörper umfassend drei oder vier
der oben beschriebenen monomeren Ketten, die über ihre Gelenkregionen mittels
eines Linkers verknüpft
sind, zum Beispiel wie in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift
mit der Nr. 92/22583 beschrieben, ein.
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Die
erfindungsgemäßen Antikörper werden
im allgemeinen in der Lage sein, selektiv an ein Antigen zu binden.
Das Antigen kann jedwedes zellassoziierte Antigen sein, zum Beispiel
ein Zelloberflächenantigen wie
ein T-Zellen-, ein Endothelialzellen- oder Tumorzellenmarker, oder
es kann ein lösliches
Antigen sein. Besondere Beispiele für Zelloberflächenantigene
schließen
Adhäsionsmoleküle wie E-Selectin,
P-Selectin oder L-Selectin, CD2, CD3, CD4, CDS, CD7, CD8, CD11a,
CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52,
CD69, karzinoembryonales Antigen (CEA), Human-Milchfett-Globulin
(HMFG1 und 2), MHC Klasse I- und MHC Klasse II- Antigene und VEGF und, wenn passend,
Rezeptoren davon ein. Lösliche Antigene
schließen
Interleukine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 oder IL-12, virale Antigene,
zum Beispiel Respiratorisches-Synzytial-Virus- oder Cytomegalovirus-Antigene,
Interferone wie Interferon-α,
Interferon-β oder
Interferon-γ,
Tumor-Nekrose-Faktor-α,
Tumor-Nekrose-Faktor-β,
Interleukin-Faktoren
wie G-CSF oder GM-CSF und aus Blutplättchen gewonnene Wachtstumsfaktoren
wie PDGF-α und
PDGF-β und,
wenn passend, Rezeptoren davon ein.
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Die
variable Regiondomäne(n)
kann/können
jedwede natürlich
vorkommende variable Domäne
oder eine gentechnisch hergestellte Version davon sein. Mit gentechnisch
hergestellter Version ist eine variable Regiondomäne gemeint,
welche unter Verwendung rekombinanter DNA-Konstruktionstechniken
geschaffen worden ist. Solche gentechnisch hergestellten Versionen
schließen
solche ein, die zum Beispiel aus natürlichen variablen Antikörperregionen
mittels Insertionen, Deletionen oder Veränderungen in oder an den Aminosäuresequenzen
der natürlichen
Antikörper
geschaffen wurden. Besondere Beispiele dieser Art schließen jene
gentechnisch hergestellten variablen Regiondomänen enthaltend mindestens eine
komplementaritätsbestimmende
Region (CDR) und gegebenenfalls eine oder mehrere Gerüstaminosäuren aus
einem Antikörper
und den Rest der variablen Regiondomäne aus einem zweiten Antikörper ein.
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Erfindungsgemäße Antikörper können aus
jedwedem vollständigen
Antikörper
erhalten werden, insbesondere einem vollständigen monoklonalen Antikörper [hergestellt
durch herkömmliche
Immunisierungs- und Zellfusionsverfahren] unter Verwendung jedweder
geeigneten Standardenzymspaltungs-und/oder -digestionstechniken,
zum Beispiel durch Behandlung mit Pepsin, gefolgt von chemischem
Kuppeln mit einem Peptid der Formel (1) oder einem geschützten oder
aktivierten Derivat davon unter Anwendung von Standardproteinsynthesetechniken
wie oben mit Bezug auf die Herstellung von Peptiden der Formel (1)
beschrieben. Alternativ kann der Antikörper der Erfindung durch Anwendung
rekombinanter DNA-Techniken unter Beteiligung der Manipulation und
Re-expression von DNA codierend variable und/oder konstante Antikörperregionen
hergestellt werden. Solche DNA ist bekannt und/oder leicht erhältlich aus
DNA-Bibliotheken einschließlich
von zum Beispiel Phagen-Antikörper-Bibliotheken
[siehe Chiswell, D. J., und McCafferty, J. Tibtech. 10, 80–84 (1992)]
oder können
wenn gewünscht,
synthetisiert werden. Standard-Molekularbiologie-
und/oder -Chemie-Verfahren können
angewendet werden, um die DNA zu sequenzieren und manipulieren,
zum Beispiel zur Einführung
von Codons zur Schaffung einer Sequenz NTCPPCPXYCPPCPAC, um andere Aminosäuren oder Domänen wie gewünscht zu
modifizieren, addieren oder entfernen.
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Von
hier aus können
ein oder mehrere replizierbare Expressionsvektoren enthaltend die
DNA hergestellt und verwendet werden, um eine geeignete Zelllinie,
z. B. eine nicht-produzierende Myelomzelllinie, wie eine Maus-NSO-Linie oder eine bakterielle,
z. B. E. coli-Linie, in welcher die Herstellung des Antikörpers auftreten
wird, zu transformieren. Um effiziente Transkription und Translation
zu erhalten, sollte die DNA-Sequenz in jedem Vektor geeignete regulatorische
Sequenzen einschließen,
insbesondere eine Promotor- und Leitsequenz operabel verknüpft mit
der variablen Domänsequenz.
Besondere Verfahren für
die Herstellung von Antikörpern
auf diese Weise sind allgemein gut bekannt und werden routinemäßig angewendet.
Zum Beispiel werden grundlegende molekularbiologische Verfahren
beschrieben von Maniatis et al., [Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, 1989]; kann DNA-Sequenzieren ausgeführt werden
wie beschrieben in Sanger et al., [PNAS 74, 5463, (1977)) und dem
Amersham International plc Sequenzierungshandbuch; und kann ortsgerichtete
Mutagenese gemäß dem Verfahren
von Kramer of al., [Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1994)] und dem Anglian
Biotechnology Ltd Handbuch ausgeführt werden. Außerdem gibt
es zahlreiche Publikationen einschließlich Patentoffenlegungsschriften,
die die für
die Herstellung von Antikörpern
durch Manipulation von DNA, Schaffung von Expressionsvektoren und
Transformation geeigneter Zellen geeignete Techniken detailliert
beschreiben, wie zum Beispiel zusammengefaßt von Mountain, A., und Adair,
J. R., in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [Hrsg. Tombs,
M. P., 10, Kapitel 1, 1992, Intercept, Andover, UK] und in der Internationalen
Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. WO 91/09967. Einmal exprimiert
kann der Antikörper
von der Wirtszelle getrennt und unter Anwendung von Standardzentrifugieren,
-filtration, -chromatographie und anderen Trenn/Reinigungstechniken,
wie zum Beispiel in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, gereinigt
werden.
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Antikörperfragmente
enthaltend eine Sequenz NTCPPCPXYCPPCPAC, insbesondere Fab- oder Fab'-Fragmente, sind
besonders geeignet für
die Herstellung in E. coli wie oben und in den Beispielen hier beschrieben.
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Wenn
gewünscht
kann das erfindungsgemäße Protein,
einschließlich
Antikörper,
ein oder mehrere daran verknüpfte
Effektor- oder Rezeptormoleküle
aufweisen, und die Erfindung erstreckt sich auf solche modifizierten
Proteine und insbesondere Antikörper.
Die Effektor- oder Reportermoleküle
können
mit dem Protein durch irgendeine zugängliche Aminosäureseitenkette
oder eine terminale funktionelle Aminosäuregruppe, die in dem Protein
lokalisiert ist, zum Beispiel jede freie Amino-, Imino-, Hydroxyl-
oder Carboxylgruppe, verknüpft sein.
In einer Bevorzugung kann das Molekül jedoch mit einem Cysteinrest
in einer Aminosäuresequenz NTCPPCPXYCPPCPAC verknüpft sein.
Dimere enthaltend diese Sequenzen sind besonders resistent gegenüber chemischer
Reduktion in vitro und können
vorteilhafterweise partiell reduziert werden, um reaktive Thiole zu
exponieren, mit welchen Effektor- oder Reportermoleküle verknüpft werden
können.
Ein, zwei, drei oder mehr Effektor- oder Reportermoleküle können auf
diese Weise verknüpft
werden.
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Effektormoleküle schließen zum
Beispiel antineoplastische Agentien, Toxine (wie enzymatisch wirksame
Toxine bakterieller oder pflanzlicher Herkunft und Fragmente davon,
z. B. Ricin und Fragmente davon), biologisch wirksame Proteine,
zum Beispiel Enzyme, synthetische oder natürlich vorkommende Polymere,
Nukleinsäuren
und Fragmente davon, z. B. DNA, RNA und Fragmente davon, Radionuklide,
insbesondere Radioiodid und chelatisierte Metalle ein. Geeignete
Reportergruppen schließen
chelatisierte Metalle, Fluoreszenzverbindungen oder Verbindungen,
welche mittels NMR- oder ESR-Spektroskopie
detektiert werden können, ein.
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Besondere
antineoplastische Agentien schließen cytotoxische und cytostatische
Mittel, zum Beispiel alkylierende Mittel wie Stickstoff-Losts (z.
B. Chlorambucil, Melphalan, Mechlorethamin, Cyclophosphamid oder
Uracil-Lost) und Derivate davon, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid,
Busulphan oder Cisplatin; Antimetabolite wie Methotrexat, Fluoruracil,
Floxuridin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Fluoressigsäure oder
Fluorzitronensäure,
Antibiotika wie Bleomycine (z. B. Bleomycinsulfat), Doxorubicin,
Daunorubicin, Mitomycine (z. B. Mitomycin C), Actinomycine (z. B.
Dactinomycin), Plicamycin, Calichaemicin und Derivate davon oder
Esperamicin und Derivate davon; Mitosehemmer wie Etoposid, Vincristin
oder Vinblastin und Derivate davon; Alkaloide wie Ellipticin; Polyole
wie Taxicin-I oder Taxicin-II; Hormone wie Androgene (z. B. Dromostanolon
oder Testolacton), Progestine (z. B. Megestrolacetat oder Medroxyprogesteronacetat),
Estrogene (z. B. Dimethylstilbestroldiphosphat, Polyestradiolphosphat
oder Estramustinphosphat) oder Antiestrogene (z. B. Tamoxifen);
Anthrachinone wie Mitoxantron, Harnstoffe wie Hydroxyharnstoff;
Hydrazine wie Procarbazin; oder Imadazole wie Dacarbazin ein.
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Synthetische
oder natürlich
vorkommende Polymere schließen
zum Beispiel gegebenenfalls substituierte gerad- oder verzweigtkettige
Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymere wie Polyethylenglykol,
Polypropylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere Methoxypolyethylenglykol,
oder verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, z. B. ein Homo-
oder Heteropolysaccharid wie Lactose, Amylose, Dextran oder Glykogen,
ein.
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Chelatisierte
Metalle schließen
Chelate oder zweifach oder dreifach positiv geladene Metalle mit
einer Koordinationszahl von 2 bis 8 einschließlich ein. Besondere Beispiele
solcher Metalle schließen
Technetium (Tc), Rhenium (Re), Cobalt (Co), Kupfer (Cu), Gold (Au),
Silber (Ag), Blei (Pb), Bismut (Bi), Indium (In), Gallium (Ga),
Yttrium (Y), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd) und Scandium (Sc) ein.
Im allgemeinen ist das Metall bevorzugt ein Radionuklid. Besondere
Radionuklide schließen 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag 203Pb 206Bi 207Bi 111In 67Ga 68Ga 88Y, 90Y, 160Tb 153Gd und 47Sc ein.
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Das
chelatisierte Metall kann zum Beispiel eines der oben genannten
Arten von Metallen chelatisiert mit irgendeinem geeigneten vielzähnigen Chelatbildner,
zum Beispiel acyclische oder cyclische Polyamine, Polyether (z.
B. Kronenether und Derivate davon); Polyamide; Porphyrine und carbocyclische
Derivate, sein.
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Im
allgemeinen wird die Art des Chelatbildners von dem verwendeten
Metall abhängen.
Eine besonders nützliche
Gruppe von Chelatbildnern in erfindungsgemäßen Konjugaten sind allerdings
acyclische und cyclische Polyamine, insbesondere Polyaminocarbonsäuren, zum
Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure und Derivate davon, und
makrocyclische Amine, z. B. cyclische Triaza- und Tetraaza-Derivate
(zum Beispiel wie in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift
mit der Nr. WO 92/22583 beschrieben); und Polyamide, insbesondere
Desferrioxamin und Derivate davon.
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Besonders
nützliche
Effektorgruppen sind Calichaemicin und Derivate davon (siehe zum
Beispiel Südafrikanische
Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. 85/8794, 88/8127 und 90/2839).
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Wenn
es erwünscht
ist, ein erfindungsgemäßes Protein
verknüpft
mit einem Effektor- oder Reportermolekül zu erhalten, kann dieses
mittels üblicher
chemischer oder rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden,
in welchen das Protein entweder direkt oder über ein Kupplungsmittel mit
dem Effektor- oder
Reportermolekül
verknüpft
wird. Besondere chemische Verfahren schließen zum Beispiel solche ein,
die in den Internationalen Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn.
WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 und WO 89/01476 und den Beispielen
hier unter Verwendung funktioneller Gruppen, z. B. Thiolen, in dem
Protein und wenn notwendig angemessen aktivierter Effektor- oder
Reportermoleküle,
zum Beispiel thiolselektive Derivate wie Maleimide, bei denen das
Target eine Proteinthiolgruppe ist, beschrieben sind. Alternativ
kann, wenn das Effektor- oder Reportermolekül ein Protein oder Polypeptid
ist, die Verknüpfung
unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, zum Beispiel wie hier oder
in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. WO
86/01533 und der Europäischen
Patentoffenlegungsschrift Nr. 392745 beschrieben, erreicht werden.
-
Das
erfindungsgemäße Protein
kann nützlich
sein bei der Bestimmung oder Behandlung einer Zahl von Krankheiten
oder Störungen.
Solche Krankheiten oder Störungen
können
solche einschließen,
die unter den allgemeinen Überschriften
Infektionskrankheit, z. B. Virusinfektion; entzündliche Krankheit/Autoimmunität, z. B.
rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, entzündliche Darmkrankheit; Krebs;
allergische/atopische Krankheit, z. B. Asthma, Ekzem; angeborene
Krankheit, z. B. zystische Fibrose, Sichelzellenanämie; dermatologische Krankheit,
z. B. Psoriasis; neurologische Krankheit, z. B. Multiple Sklerose;
Transplantate, z. B. Organtransplantatabstoßung, Transplantat-Wirt-Abstoßungsreaktion;
und metabolische/idiopathische Krankheit, z. B. Diabetes, beschrieben
sind, einschließen.
-
Die
erfindungsgemäßen Proteine
können
für die
Verwendung in der Therapie und/oder Diagnose formuliert werden,
und gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir eine pharmazeutische Zusammensetzung
umfassend ein erfindungsgemäße Protein
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff, Verdünnungsmittel
oder Träger
bereit. Wie oben erläutert
kann das Protein in diesem Aspekt der Erfindung gegebenenfalls mit
einer oder mehreren Effektor- oder Reportergruppen verknüpft sein.
-
Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann jedwede geeignete Form für die Verabreichung
annehmen und ist bevorzugt in einer Form, die für die parenterale Verabreichung,
z. B. durch Injektion oder Infusion, zum Beispiel durch Bolusinjektion
oder kontinuierliche Infusion, geeignet ist. Wenn die Zusammensetzung
für die
Injektion einer Infusion ist, kann sie die Form einer Suspension,
Lösung
oder Emulsion in einem ölartigen oder
wäßrigen Vehikel
annehmen und kann Formulierungsmittel wie Suspensions-, Konservierungs-,
Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
-
Alternativ
kann die Proteinzusammensetzung in trockener Form sein, für die Rekonstitution
vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit.
-
Falls
die Proteinzusammensetzung für
die orale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung zusätzlich zu
dem Wirkstoff Additive wie Stärke,
z. B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke, oder Cellulose oder Stärkederivate
wie mikrokristalline Cellulose; Siliziumdioxid; verschiedene Zucker
wie Lactose; Magnesiumcarbonat und/oder Calciumphosphat enthalten.
Es ist wünschenswert,
daß, falls
die Formulierung für
die orale Verabreichung ist, sie gut von dem Verdauungssystem des
Patienten toleriert wird. Zu diesem Zweck kann es wünschenswert
sein, Schleimbildner und Harze in die Formulierung aufzunehmen.
Es kann auch wünschenswert
sein, die Toleranz durch Formulierung des Proteins in einer Kapsel,
welche in den Magensäften
unlöslich ist,
zu verbessern. Es kann auch bevorzugt sein, das Protein oder die
Zusammensetzung in einer Formulierung mit gesteuerter Freisetzung
aufzunehmen.
-
Falls
die Proteinzusammensetzung für
die rektale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung ein
Binde- und/oder Gleitmittel, zum Beispiel polymere Glykole, Gelatinen,
Kakaobutter oder andere pflanzliche Wachse oder Fette, enthalten.
-
Therapeutische
und diagnostische Verwendungen der erfindungsgemäßen Proteine umfassen typischerweise
die Verabreichung einer wirksamen Menge des Proteins an ein menschliches
Wesen. Die exakte zu verabreichende Menge wird gemäß der Verwendung
des Proteins und des Alters, Geschlechts und Zustands des Patienten
variieren, kann jedoch typischerweise von etwa 0,1 mg bis 1000 mg,
zum Beispiel von etwa 1 mg bis 500 mg, variiert werden. Das Protein
kann als eine Einzeldosis oder in einer kontinuierlichen Weise über einen
Zeitraum hinweg verabreicht werden. Dosen können wie angemessen wiederholt
werden. Typische Dosen können
zum Beispiel zwischen 0,1–50
mg/kg Körpergewicht
pro einzelner therapeutischer Dosis, insbesondere zwischen 0,1–20 mg/kg
Körpergewicht
für eine
einzelne therapeutische Dosis sein.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die folgenden
Abkürzungen
werden verwendet:
AUC Fläche
unter der Kurve; β-ME β-Mercaptoethylamin;
DCM
Di-Fab'-Maleimid;
DTDP 4,4'-Dithiodipyridin;
Fab' Antigen-bindendes
Antikörperfragment
(mit Gelenk);
F(ab')2 dimeres Fab'; HC schwere Kette; LC leichte Kette;
NEM
N-Ethylmaleimid; PEG Polyethylenglykol.
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BEISPIEL 1
-
Evaluierung der Di-Fab'-Produktion in E.
coli unter Verwendung verschiedener Gelenksequenzen.
-
Strategie – Um jedwede
mögliche
falsche Interkettendisulfidbindungen zwischen Gelenkregionen und irgendwelchen
anderen Cysteinen zu minimieren, wurde die Interkettendisulfidbindung
von allen Fab'-Konstrukten
entfernt. Es ist vorher gezeigt worden, daß die Entfernung der Interkettendisulfidbindung
eines Di-Fab' die
Stabilität
des Proteins bewertet nach den Serumpermanenzzeiten (Lit. 9) nicht
beeinflußt.
PCR-Mutagenese wurde angewendet, um die Interkettencysteine von
cKappa und CH1 gegen Serine auszutauschen.
Dies ermöglicht
auch die Analyse der % Di-Fab'-Bildung
durch Analyse periplasmatischer Extrakte auf nicht-reduzierendem
SDS-PAGE, gefolgt von spezifischem Schwere-Kette-(HC-)Western-Blotting.
Dieser Ansatz erlaubt dabei die Analyse vieler Konstrukte im Schüttelkolbenmaßstab. Es
wurde die Mutagenese von CH1 ausgenutzt,
um eine Spe I-Restriktionsstelle zur Erleichterung raschen Klonierens
neuer Gelenksequenzen als wieder verbundene Oligonukleotidkassetten
einzuführen.
Um diese Stelle einzuführen,
wurde das Ser N-terminal zu dem Interkettendisulfid-Cys in der schweren
Kette gegen ein Thr ausgetauscht und somit der C-Terminus des CH1 von NKSCDKTHTCAAC gegen NKTSDKTHTCAAC (Veränderungen
unterstrichen) ausgetauscht.
-
Bakterienstamm-
und Plasmidkonstruktionen – Alle
Endexpressionsplasmide basierten auf pACYC184 [Yarranton, G. T.,
und Mountain, A. (1992) in: Protein Engineering – a Practical Approach (Rees, A.
R., Starnberg, M. J. E., und Wetzel, R., Hrsg.) IRL Press, Oxford,
S. 303–326]
und wurden verwendet, um W3110, Wildtyp E. coli ATCC 27325 zu transformieren.
-
Eine
Variante von A5B7g3 Fab' (Pfropfzahl
3 eines humanisierten Fab' bindend
an CEA – karzinoembryonales
Antigen) ohne die Interkettendisulfidbindung wurde zuerst aufgebaut.
Das Interketten-Cys-Codon in der leichten Kette (LC) cKappa wurde
mittels PCR-Mutagenese gegen Ser ausgetauscht unter Verwendung des
mutagenen Oligos:
-
-
Eine ähnliche
Strategie wurde angewendet, um das Interketten-Cys-Codon aus dem
CH1 der schweren Kette (HC) zu entfernen
und die Spel-Restriktionsstelle einzuführen unter Verwendung des mutagenen
Oligos:
-
-
Diese
und alle nachfolgenden Klone wurden mittels DNA-Sequenzierens auf
einem ABI 373A-Sequenzierer unter Verwendung des PRISM-Zyklussequenzierungs-Kits überprüft. Neue
Gelenksequenzen wurden hergestellt durch Ligation von wieder verbundenen
Oligonukleotidpaaren mit 5' Spel-HindIII
3'-Enden über ein ähnlich beschränktes A5B7g3
nur-HC-Plasmid, gefolgt von Rekonstitution des endgültigen bicistronischen Expressionsplasmids.
-
Die
codierende Region für
Fab' 40.4 (ein humanisiertes
Fab' bindend ein
humanes Cytokin) cKappa wurde ähnlich
verändert
unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids
-
-
Ein
Restriktionsfragment für
das ursprüngliche
Fab' Gelenk (NCAAC) CH1
ohne das Interkettendisulfidbindungscystein wurde von A5B7g3 in
das Expressionsplasmid für
Fab 40.4 als ein Restriktionsfragment gebracht. Da die Spel-Stelle
in dem endgültigen
Fab 40.4-Expressionsplasmid pDPH40 einzigartig war, war es möglich, weitere
Gelenkvarianten rasch herzustellen durch direkte Ligation von wieder
verbundenen Oligonukleotidpaaren mit 5' Spel-Notl 3'-Überhängen in ähnlich beschränkte pDPH40.
Details der Geleksequenzen und Plasmide sind in Tabelle I gezeigt.
Während
der DNA-Manipulierungsschritte
wurden bevorzugte Codons für
E. coli wie von Wada, K. N., et al., Nucleic Acids Res. (1991) 19,
1981, definiert, gewählt.
-
Schüttelkolbenexgerimente – Schüttelkolbenexperimente
wurden im wesentlichen wie zuvor beschrieben ausgeführt mit
der Ausnahme, daß diese
Einzelplasmidexperimente waren und Tetracyclin bei 10 μgml–1 erforderten
[Humphreys, D. P., et al., FEBS Lett. (1996), 380, 194]. L-Nährlösung wurde
für alle
Experimente mit A5B7 verwendet, und um die größtmögliche Zelldichte zu erreichen,
wurde für
solche mit Fab 40.4 2xTY verwendet. Redoxaktive Verbindungen wurden
als Feststoffe bis zu einer Endkonzentration von 1 mM wenn erforderlich
hinzugegeben. Proben wurden bei 0, 1, 2 und 4 Stunden nach Induktion
genommen.
-
Fermentation – Synthetische
SM6 C-Medien: (5,0 g/l (NH4)2SO4, 3,312 g/l Na2H2PO4·H2O, 3,870 g/l KCl, 1,0 g/l MgSO4·7H2O, 1,0 g/l Citrat, 4,00 g/l Zitronensäure, 0,05
g/l CaCl2·6H2O,
0,02 g/l ZnSO4·4H2O,
0,02 g/l MnSO4·4H2O,
0,005 g/l CuSO4·5H2O,
0,004 g/l CoSO4·6H2O,
0,0967 g/l FeCl3·6H2O,
0,0003 g/l H3BO3, 0,0002
g/l NaMoO4). Gylcerol wurde als eine Kohlenstoffquelle
zu 3% (Gew./Vol.) verwendet, und MAZU wurde als Entschäumer zu
0,02% (Vol./Vol.) verwendet. Der pH-Wert wurde mit 50% (Vol./Vol.)
NH4OH kontrolliert. Fab'-Expression wurde durch Umschalten der
Kohlenstoffquelle auf Lactose zu 5% (Gew./Gew.) induziert, Zellen
wurden 24–36
Stunden nach Induktion geerntet. Die Fab'-Ausbeuten betrugen typischerweise 100–150 mg/l.
-
Western
Blotting – Proben äquivalent
zu 2 l periplasmatischer Fraktionen wurden 5fach mit d-H2O verdünnt
und für
5 Minuten in nicht-reduzierendem SDS-PAGE-Beladungspufter gekocht, bevor
sie einer Elektrophorese auf 4–20%
Tris-Glycingelen
(Novex) bei 125v für
1,75 Stunden unterworfen wurden. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran
(Novex) für
2 Stunden bei 100 mA transferiert. Die Membran wurde für 1 Stunde bei
Raumtemperatur mit 50 ml pro Membran des "Blockierungspuffers" (PBS/0,1% (Vol./Vol.) Tween 20/2% (Gew./Vol.)
Magermilch) blockiert, bevor sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde
mit 5 ml pro Membran des Anti-Fd-Antikörpers (Schaf IgG Anti-Human
IgG(Fd), Ref. PC075, The Binding Site, Birmingham, UK) zu 1/1000 (Vol./Vol.)
in "Antikörperpuffer" (PBS/0,1% (Vol./Vol.)
Tween 20 / 0,1 "Blockierungspuffer") geschüttelt wurde. Die
Membran wurde intensiv in PBS 0,1% (Vol./Vol.) Tween 20 gewaschen,
bevor sie bei Raumtemperatur für 1
Stunde mit 5 ml pro Membran eines Esel-Anti-Schaf-HRP-konjugierten
Antikörpers
(Hasen F(ab')2 Anti-Schaf IgG Fc-Fragment HRP Konjugat,
Ref. 313-036-046, Jackson) zu 1/1000 (Vol./Vol.) in "Antikörperpuffer" geschüttelt wurde.
Die Membran wurde intensiv in PBS/0,1% (Vol./Vol.) Tween 20 vor
Entwicklung mit DAB-Substrat (Pierce) gewaschen. Kreuzreaktive LC-Banden
werden durch die Spuren 4 und 1 der 1 beziehungsweise 2 gezeigt. Lebensgroße Diapositive
der Blots wurden für
die Laser-Scanning-Densitometrie
auf einer Molecular Dynamics Modell 300A-Maschine unter Verwendung
von ImageQuant-Software Version 4.2 verwendet. Von Di-Fab abgeleiteten
schweren Ketten (Di-NC) trennen sich von Fab abgeleiterter HC (freie
HC) während
der Elektrophorese. Quantifizierung der relativen Intensitäten der
zwei leicht identifizierbaren Banden in jeder Spur ergaben eine
Abschätzung
von % gebildetem Di-Fab. Dieses unterstellt ein relativ konstantes
Niveau der Produktion von HC und seiner Assoziation mit LC zwischen
verschiedenen Fab'-Varianten.
Die verwendeten, von pTTO-1 abgeleiteten Plasmide produzieren einen Überschuß an LC,
und somit ist freie HC im Periplasma nicht detektierbar (Shauna
West, persönliche
Mitteilung). Di-HC der Proteine ohne Interkettendisulfid wandern
mit einer Beweglichkeit, die der eines gereinigten Fab'-Standards mit dem
Interkettendisulfid ähnlich
ist (vergleiche Spuren 11 und 3 von 1).
Die Gesamtabsorption jedes Peaks wurde quantifiziert, und % Di-Fab
in jeder Probe wurde wie folgt berechnet: Absorption der Di-HC-Bande ÷ Absorption
der Di-HC-Bande + Absorption der HC-Bande.
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Fab'-Reinigung – Periplasmatische
Extrakte wurden mittels Zentrifugieren bei 25.000 g für 30 Minuten geklärt, der
pH wurde auf 6,5 mit 2,5 M Tris erhöht, und sie wurden auf eine
ProteinG Sepharose-Säule
(GammaBind, Pharmacia Biotech), deren Gleichgewicht zuvor mit P.
B. S. eingestellt worden war, aufgebracht. Nach Waschen mit P. B.
S. zur Entfernung ungebundenen Materials wurde das Fab'-verwandte Material
durch Waschen der Säule
mit 0,1 M Glycin. Cl pH 2,7 eluiert. Der pH des Eluats wurde zum
Neutralwert mit 2,5 M Tris für
die Lagerung bei 4°C
erhöht,
die Fab'-Konzentrationen
nach der Reinigung betrugen typischerweise ≤ 0,2 mgml–1.
-
Plasmide
wurden mit zwei Kopien der Wiederholungssequenz TCPPCPA mit zwischen
0 und 5 Abstandsresten aufgebaut, siehe pDPH30-35, Tabelle I (Fab'-Konstrukt-Nomenklatur zeigt die Zahl
der Mittelgelenksequenzwiederholungen, gefolgt von römischen
Ziffern, um die Zahl der Abstandsreste zu zeigen und ob das Protein
das die Interkettendisulfidbindung bildende Cystein aufweist oder
nicht. Zum Beispiel pDPH34 exprimiert A5B7g3 Gelenk 2iv Inter =
Propf 3 von A5B7 mit zwei Gelenkwiederholungen, unterbrochen durch
vier Aminosäuren
und ohne die Interkettendisulfidbindung. pDPH42 exprimiert Fab' 40.4 Gelenk 2o +
Cys, weist zwei Gelenkwiederholungen auf ohne Abstandsreste und
mit der Interkettendisulfidbindung). Diese wurden nach ihrer Fähigkeit
zur Bildung von Di-Fab's
in Schüttelkolbenkulturen
bewertet nach Western-Blotting evaluiert und mit den Gelenk-½- und
Gelenk-1-Konstrukten verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
II gezeigt.
-
Vergleichbar
dem, was andere gesehen haben (Lit. 7), produzierte das Gelenk½-Fab' kein detektierbares
Di-Fab' in Schüttelkolben. "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" produzierten eine
mäßige Menge
an Di-Fab' (7,3%
beziehungsweise 4,8%). Diese Versionen wurden dann in dem stärker exprimierten
Fab 40.4 hergestellt, um zu sehen, ob das Erhöhen der periplasmatischen Proteinkonzentration
dieser Fabs sowohl einen Anstieg der Di-Fab'-Bildung in vivo bewirken als auch die
relativen Vorteile einer zunehmenden Zahl an Gelenkwiederholungen
diskriminieren würde.
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Es
war überraschend
zu sehen, daß alle
der A5B7-Konstrukte mit Abstandsresten zwischen den Gelenkwiederholungen
kein detektierbares Di-Fab' produzierten. Die
zunehmende Länge
und Flexibilität
dieser Abstandsregionen könnte
der zweiten Kopie der Gelenkwiederholung erlauben, zurückzufalten
und Intea-HC-Disulfidbindungen zu bilden und dadurch die Cysteine
vor dem Bilden der gewünschten
Inter-HC-Disulfidbildungen zu maskieren. Obwohl es schwierig ist,
diese Annahme direkt zu beweisen, wurden zwei neue Konstrukte unter
Verwendung von Fab 40.4 mit vermindertem/r Abstand/Flexibilität durch
Entfernen eines (Ala) oder zweier (Ala-Thr) der endogenen Abstandsreste
zwischen den starren Polyprolin-II-Helices gestaltet. Deren Ergebnisse
gezeigt in Tabelle II waren nicht vorteilhaft, so daß ein Fab' 40.4 mit drei Kopien
des Gelenks, "Gelenk
3o", hergestellt
wurde.
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Die
Ergebnisse zeigen, daß eine
Zunahme der Zahl an Kopien der Gelenkwiederholungen zu einer stetigen
Abnahme an % produziertem Di-Fab' führen. Diese
Abnahme an % Di-Fab' kann
vermutlich auf eine Zunahme der Toxizität des Proteins im Periplasma
zurückgeführt werden,
da die. Proteine reicher an Cystein werden. Die Abnahme an % Di-Fab' korrelierte mit
verminderter Lebensfähigkeit
nach Fab'-Induktion,
wie durch kleinere O.D.600's-Peaks und erhöhte Zellauflösung zu
späteren
Zeitpunkten gezeigt. Der Disulfidredoxmechanismus in dem E. coli-Periplasma
ist nun gut verstanden, aber es wird angenommen, daß er weniger gut
adaptiert ist, um Proteine mit komplexeren Disulfidanordnungen als
denen des endoplasmatischen Retikulums (zusammengefaßt von Humphreys
et al., 1996 ibid) zu bewältigen.
Es erscheint wahrscheinlich, daß komplexe
Gelenke nicht gut toleriert werden.
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Verminderung
des Abstands zwischen zwei Gelenkwiederholungen steigert nicht die
Di-Fab'-Bildung. "Fab' 40.4 Inter Gelenk
2–1" zeigt vermindertes
Di-Fab' verglichen
mit der "Gelenk
2o"-Variante (8,1% ± 4,3 verglichen
mit 25,1% ± 8,34 – siehe
Tabelle II). "Fab' 40,4 Inter Gelenk
2–2" zeigt 49,8% ± 16,78
Di-Fab'. Diese Figur
legt ein hohes Niveau an Di-Fab'-Produktion
nahe. Tatsächlich
erscheint dieses Proteine auch nicht in der Lage zu sein, wesentliche
Mengen an Volllängen-Fab' zu produzieren,
dies wird durch die erhöhte
Zahl und Intensität
der proteolytischen Banden in Spur Nr. 7 des Western-Blots gezeigt
in 1 demonstriert. Daher
ist dort eine kleine Menge an Di-Fab', welche groß ist im Vergleich zu der Menge
an Fab', aber sehr
wenig jedes Proteins wird produziert im Vergleich zu "Gelenk 1" und "Gelenk 2o". Es kann postuliert
werden, daß die Entfernung
von einem oder beiden dieser Abstandsreste die Gelenkregionen so
unflexibel macht, daß die
Cysteine in eine Konformation gezwungen werden, welche sie der Proteolyse
aussetzt oder sie reaktiv gegenüber nativen
E. coli-Proteinen macht. Da das nicht modifizierte 1 Gelenk die
größten Di-Fab'-Ausbeute in vivo
ergab, wurde entschieden, andere Gelenk-Isotypen auf ihre Wirksamkeit
zu testen.
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Effekt
des Gelenkisotyps – Echte
Gelenksequenzen für
die IgG2, 3 und 4 konnten nicht geschaffen werden, sondern statt
dessen wurde das mittlere Gelenk eines jeden mit dem existierenden
oberen IgG1-Gelenk verschmolzen. Die geschaffenen Gelenke wurden
daher IgG2-"artig" genannt. Weil lange,
cysteinreiche Gelenke schlecht toleriert werden, wurden nur das
CPRC und die erste der drei Wiederholungssequenzen des mittleren
IgG3-Gelenks verwendet. Der hochgestellte Apostroph wird verwendet,
um zu zeigen, daß diese IgG3-Sequenz trunkiert
wurde. Diese Konstrukte wurden in der gleichen Weise wie zuvor analysiert,
und die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
-
Das
IgG3'-artige Gelenk
wurde schlecht toleriert und ergab somit eine artefaktisch hohe
% Di-Fab'-Messung
in der gleichen Weise wie Gelenk 2–2,
wobei ein Beispiel dieser Proteolyse in Spur 4 von 2 gezeigt ist. Von dem langen IgG3-Gelenk
wird angenommen, daß es
hochflexibel ist [Brekk, O. H., et al., (1995) Immunol. Today 16,
85], und dies ist verantwortlich für einige der Eigenschaften
dieses Isotyps. Es ist wahrscheinlich, daß im Periplasma diese Länge an exponiertem
Peptid empfänglich
ist für
Proteolyse, und dies kann der Grund für das niedrige Niveau der Produktion
dieses Proteins sein. Das IgG 2-artige
Gelenk produzierte eine vernünftige
Menge an Di-Fab' (20,8% ± 3,58),
aber ergab keinen Anstieg über
das, was zuvor mit den IgG 1-Derivaten gesehen wurde. Die relative
Unfähigkeit
des IgG 4-artigen Fab',
Di-Fab' zu produzieren
(8,63% ± 1,41),
wurde beobachtet. Es besteht nur eine Aminosäuredifferenz zwischen dem IgG
4-artigen Gelenk und dem IgG 1-Gelenk – CPSP im
Vergleich zu CPPC. Die Ergebnisse sind konsistent mit vorangehenden
Arbeiten (Lit. 22, 23), welche fanden, daß IgG 4 weniger in der Lage
war, Inter-HC-Disulfidbindungen zu bilden, als IgG 1. Das Vorhandensein
eines Serins zwischen den zwei Cysteinen kann erhöhte Flexibilität des mittleren
Gelenks gestatten und dadurch die Bildung von Intea-HC-Disulfiden,
welche Inter-HC-Disulfidbildung blockieren.
-
Wirkung
von IgM und IgA-Schwanzstücken – IgM und
IgA weisen beide 18 C-terminale
Aminosäureverlängerungen
auf, die sekretorische Schwanzstücke
genannt werden, welche bei ihrer Polymerisation beteiligt sind.
Der vorletzte Rest beider Schwanzstücke ist ein Cystein. Von diesem
und anderen HC-Cysteinen
ist bekannt, daß sie
zusammen mit nicht-kovalenten Wechselwirkungen bei der Polymerbildung
beteiligt sind, obwohl die genaue Disulfidorganisation nicht vollständig verstanden
ist [Davis, A. C., et al., (1989), EMBO J. 8, 2519, und Wiersma,
E. J., und Shulman, M. J., (1995) J. Immunol. 154, 5265]. Das Schwanzstück ist allen
vier IgG-Isotypen hinzugefügt
worden und bewirkte ihre Polymerisation auch in der Abwesenheit
der zusätzlichen HC-Cysteine und nicht-kovalent
wechselwirkenden Reste, die in IgM und IgA gefunden wurden [Smith,
R. I. F., et al., (1995) J. Immunol. 154, 2226). Die Wildtyp- und
Schwanzstücksequenzen
beschrieben von S⌀rensen, V.,
et al., (1996) J. Immunol. 156, 2858], wurden zu Fab' 40.4 enthaltend
eine "Gelenk 1"-Sequenz hinzugegeben. Die "Gelenk 1"-Sequenz wurde ausgewählt, weil
es möglich
erschien, daß mindestens
ein freies Cystein erforderlich sein könnte, um als eine Nachahmung
von Cys414 von IgM zu wirken, um Schwanzstück-HC bereitzustellen,
und zum anderen, um direkte Inter-HC-Wechselwirkungen, von denen
angenommen wird, daß sie
bereitgestellt werden von Cys337 von IgM,
zu gestatten. Die in pDPH 50 und 51 konstruierten Sequenzen sind
in Tabelle I gezeigt.
-
Die
Fab's wurden mittels
Schüttelkolbenkultur/Western-Blotting
auf Anwesenheit erhöhter
Polymerbildung analysiert. Obwohl von "Gelenk 1" bekannt war, daß es ~30% Di-Fab'-Bildung ergibt,
wurde gefunden, daß die
Anwesenheit eines jeden der Schwanzstücke vollständig die Di-Fab'-Bildung unterdrückt. Es
wird kein Hinweis auf die Bildung höheren Polymerzuständen gefunden
beurteilt nach Western-Blots nicht-reduzierender nativer und SDS
PAGE. Es wurde angenommen, daß die
Unterdrückung
von Dimerbildung, die "Gelenk
1" inhärent ist,
auf die Rückfaltung
der Schwanzstücke
unter Bildung eines Intra-HC-Disulfids zwischen dem Schwanzstück-Cys und
einem dieser in dem Gelenk zurückzuführen ist.
Dies erscheint ziemlich wahrscheinlich, da von den Schwanzstücksequenzen
angenommen wird, daß sie
in der Lage sind, einen Beta-Strang zu bilden, wodurch dem Schwanzstück-Cys erlaubt
wird, dem Gelenk nahe zu sein [Pumphrey, R., (1986) Immunol. Today
7, 174].
-
Im
allgemeinen zeigen die Ergebnisse, daß die Anwesenheit von Extra-Gelenk-Cysteinen über das einzelne
hinaus, das in dem Orginal-Fab' gefunden
wird, der wichtigste Faktor bei der Förderung der Di-Fab'-Bildung in vivo
ist, wobei "Gelenk
1" und "Gelenk 2o" die besten Sequenzen
sind. Es wurde kein Vorteil mit anderen Versionen des 1 Gelenks
gegenüber
diesen gefunden, noch mit irgendwelchen der anderen getesteten 3
IgG-Isotypen. Es wurde gezeigt, daß einfache Gelenke an nützlichsten
sind, wobei mit zunehmender Länge
des Gelenks weniger % Di-Fab' und
eine höhere
Zellmortalität
produziert wurden. Dies wurde sowohl mit zunehmender Kopienzahl
der IgG 1-Gelenksequenz, d. h. Gelenk 1, 2o und 3o, als auch mit
dem langen und flexibel trunkierten IgG 3 beobachtet.
-
Subtilere
strukturelle Differenzen beeinflußten ebenfalls die Effizienz
der Di-Fab'-Bildung in vivo.
Manipulation der Abstandsreste zwischen zwei Kopien der Gelenksequenz 'NTCPPCPAC' implizierte
die Wichtigkeit, die Konformation der Gelenk-Cysteine in einem Di-Fab'-Bildungszustand
zu halten. Wenn die Abstandsregion zu groß wurde, wurde die Di-Fab'-Bildung vollständig unterdrückt, vermutlich
durch Zurückwinden
der gelenkmaskierenden Gelenk-Cysteine,
während
das Gelenk, wenn der Abstand zu klein war, schlecht in vivo abgebaut
wurde.
-
Vorangehende
Berichte fanden eine variable Produktion von Di-Fab' aus Hochzelldichtefermentation von
5–70%
unter Verwendung der Gelenksequenz NCPPCPPCPPC (Lit. 9). Die Ergebnisse hier zeigen, daß es sehr
schwierig ist, mehr als 5–10%
Di-Fab' in vivo
aus Fermentationen zu produzieren, und daß dies reproduzierbar ist.
Außer
der Gelenksequenz können
diese Unterschiede den Unterschieden in den Fab'-Expressionsniveaus, den Fermentations bedingungen
und dem Wirtsstamm zugeschrieben werden. Die Fab'-Ausbeute war hier 5- bis 10fach kleiner
als die von Rodrigues et al., (Lit. 9), beschriebene. Allerdings
ist es bekannt, daß spezifische
Bedingungen eine spontane, hohe Effizienz (~80%) und ansatzspezifische
Di-Fab'-Bildung
während der
Reinigung verursachen können.
Solche Proteinreinigungsbedingungen wurden während dieser Experimente im
kleinen Maßstab
nicht angewendet.
-
Zusammenfassend
ist festzustellen, daß Di-Fab'-Bildung in vivo
im Periplasma von E. coli ein ineffizientes Verfahren ist, das unter
anderem durch die Gelenksequenz und -komplexität moduliert wird. Zwei Gelenksequenzen
("Gelenk 1" und "Gelenk 2o") sind unter in vivo-Selektionsbedingungen
als am effizientesten für
die Di-Fab'-Bildung
identifiziert worden.
-
BEISPIEL 2
-
Untersuchung der Serumpermanenzzeiten
und der gelenkspezifischen Pegylierung von Flab')2-Molekülen mit modifizierten
Gelenken
-
Reagenzien
-
NEM, β-MA, DTDP
und Tris waren von Sigma (UK) und vom höchsten erhältlichen Reinheitsgrad. Pyrogenfreies "Flowfusor"-Wasser wurde für die Chromatographie
verwendet (Fresenius, Basingstoke, UK). Alle anderen Laborreagenzien
waren von BDH (UK) mit Reagenzienreinheitsgrad.
-
Herstellung und Reinigung
von Fab'
-
Das
verwendete Fab' war
wie in Beispiel 1 beschriebenes "Fab
40.4". Fab'-Fermentationen und Protein-G-Sepharose-Reinigungen
(GammaBind Plus, Pharmacia Biotech) waren wie in Beispiel 1 beschrieben mit
einer Modifikation. E. coli-Periplasmaproteine wurden aus Fermentationszellpaste
durch Übernachtinkubation
bei 30°C
und unter Schütteln
bei 250 Upm in einem Fermentationserntevolumen von 100 mM Tris/10
mM EDTA (pH 7,4) extrahiert. Die Leitfähigkeit und der pH-Wert des
Rohextrakts wurden auf ≤ 3,5
mS cm–1 beziehungsweise ≤ 4,5 durch
Zugabe von Wasser beziehungsweise Eisessig verändert. Rohextrakt wurde dann durch
ein 80 ml Bettvolumen (kompaktiert) eines Streamline SP-Kationenaustauscherharzes
(Pharmacia Biotech) im expandierten Bettmodus durchgeführt. Das
Gleichgewicht des Harzes wurde mit 50 mM Natriumacetat pH 4,5 im
expandierten Bettmodus voreingestellt. Nach intensivem Waschen wurde
gebundenes Material im kompaktierten Modus mit 50 mM Natriumacetat/200
mM NaCl pH 4,5 eluiert. Der pH-Wert der Peakfraktion wurde auf ≥ 6,5 mit 2,5
M Tris erhöht,
und sie wurde auf eine Protein-G-Sepharosesäule, deren Gleichgewicht mit
PBS voreingestellt war, aufgebracht. Nach Waschen mit PBS zur Entfernung
von ungebundenem Material wurde Fab'-Material mit 0,1 M Glycin. Cl pH 2,7
eluiert. Das Eluat wurde mit 2,5 M Tris für die Lagerung bei 4°C neutralisiert.
-
Herstellung und Reinigung
von F(ab')2
-
Fab'-Material wurde konzentriert
und pufferausgetauscht auf ≥ 12
mgml–1 in
0,1 M Natriumphosphatbuffer pH 8,0 unter Anwendung von Ultrafiltration
mit einer 10 kDa Cut-off-Membran. Gelenkthiole wurden aktiviert
und Spuren von F(ab')2 in Abhängigkeit
von der Endproteinkonzentration durch Reduktion mit 9 mM β-MA in 0,1
M Natriumphosphatpuffer pH 8,0 für
45 min bei 37°C
entfernt. Das Reduktionsmittel wurde durch Entsalzen auf einer G25M-Sephadexsäule (PD10)
(Pharmacia Biotech), deren Gleichgewicht mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer
pH 8,0 voreingestellt worden war, entfernt. Man ließ F(ab')2 sich
durch Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht bilden. Jedwede verbleibenden
Thiolgruppen wurden durch Inkubation mit 10 mM NEM in PBS vor der
Analyse mit SDS-PAGE (4–20%
Tris/Glycingele, Novex, UK) und HPLC (GF-250-Säule, deren Gleichgewicht mit
0,2 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 eingestellt war) blockiert.
-
F(ab')2 wurde
von Fab' in einem
kleinen Maßstab
durch Sammeln von Fraktionen der präparativen HPLC (GF-250XL-Säule, deren
Gleichgewicht mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 eingestellt
war) oder in einem großen
Maßstab
unter Verwendung von Hydrophobwechselwirkungschromatographie (HIC)
getrennt. Festes (NH4)2SO4 wurde zu Fab'/F(ab')2-Mischungen
zu 0,75 M vor dem Aufladen auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia
Biotech), die mit 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0/0,75 M (NH4)2SO4 ins
Gleichgewicht gebracht wurde, hinzugegeben. Nach Waschen mit Gleichgewichtspuffer
wurde gebundenes Material mit 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0
eluiert. Die dimere Spezies weist eine höhere Affinität zu der
HIC-Matrix als das monomere Fab' auf.
Das gesamte gereinigte F(ab')2 wurde als zu 100% F(ab')2 mittels HPLC
und als zu ≥ 95%
F(ab')2 durch
Coomassie-gefärbtes
SDS-PAGE bewertet.
-
Herstellung von chemisch
vernetztem F(ab')2 (DFM)
-
DFM
wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von 1,6-Bismaleimidohexan-(BMH-)Vernetzter (Lit.
2) hergestellt.
-
Widerstand gegenüber Reduktion
von F(ab')2
-
Gereinigtes
F(ab')2 bei
0,25 mgml–1 in
0,1 M Phosphat pH 7,0 wurde mit β-MA
von 0 bis 2 mM für
45 min bei 37°C
behandelt. Reduktionen wurden durch Zugabe von NEM bis 10 mM beendet,
und die relativen Mengen von F(ab')2 und Fab' wurden mittels HPLC-Analyse
berechnet.
-
Partielle Reduktion von "Gelenk 2o"-F(ab')2 für gelenkspezifische
Modifikation
-
Gereinigtes
F(ab')2 bei
6 mgml–1 in
0,1 M Phosphat pH 6,0 wurde mit β-MA
von 0 bis 2 mM für
45 Minuten bei 37°C
behandelt. Das Reduktionsmittel wurde durch Entsalzen mit einer
P6-Biospin-Säule
(BioRad, UK) entfernt, und Proben wurden sofort für den Thiol-Assay,
das NEM-Quenchen und die HPLC-Analyse und Modifikation genommen.
1,3 mM β-MA
wurde für
alle präparativen
Partialreduktionen verwendet.
-
Herstellung und Kationenaustauschreinigung
von F(ab')2
-
Das
wie oben partiell reduzierte PEG-F(ab')2 wurde mit
einem gleichen Volumen von 25 kDa linearem PEG-Maleimid in 0,1 M
Phosphat pH 6,0 (Shearwater Polymers Inc., Birmingham, Alabama,
USA) gemischt, um einen 30fachen molaren Endüberschuß von PEG:F(ab')2 zu
ergeben. Nach Umsetzung über
Nacht bei Raumtemperatur wurde F(ab')2-PEG von der
Hauptmenge des verbleibenden F(ab')2 unter Anwendung
von HPLC im präparativen
Maßstab
getrennt. Nach Konzentration und Pufferaustausch unter Verwendung
einer PD10-Säule
zu 50 mM Natriumacetat pH 4,5 wurde die F(ab')2-PEG/nichtumgesetztes
PEG-Fraktion auf eine Poros HS-Säule
mit 1,6 ml Bettvolumen (PerSeptive Biosystems, Hertford, UK) auf
einer BioCad Vision-Arbeitsstation
geladen. Nach Waschen mit 5 Säulenvolumina
zur Entfernung von ungebundenem PEG-Maleimid wurde F(ab')2-PEG
mit 50 mM Natriumacetat/40 mM NaCl pH 4,5 eluiert, und F(ab')2 wurde
aus der Säule
mit einem linearen Gradienten von 50 mM Natriumacetat pH 4,5 mit
NaCl von 40 mM bis 1 M entfernt. Fraktionen wurden konzentriert
und pufferausgetauscht zu 0,2 M Natrium-Phosphatpuffer pH 7,0, bevor
die Proteinkonzentrationen unter Verwendung von A280 bestimmt
wurden. Protein wurde mittels SDS-PAGE unter Verwvendung von 4–12% Tris-MES-Gelen
(Novex, UK) analysiert.
-
Thiol-Assay
-
Thiole
pro F(ab')2 wurden unter Verwendung von DTDP wie zuvor
beschrieben (Lit. 17) bestimmt.
-
Iodierung von F(ab')2
-
300 μg F(ab')2 pro
Tiergruppe wurden 125I-markiert unter Verwendung
von Bolton-und-Hunter-Reagenz (Amersham) bis zu einer spezifischen
Aktivität
von 0,22–0,33 μCi/μg.
-
Massenspektrometrie
-
Molekularmassen
für Fab' wurden bestimmt
unter Verwendung von Fisons VG Quattro Dreifach-Quadrupol-Ausstattung
im Electrospray-Ionisations-Modus.
-
Tierstudien
-
Männlichen
Sprague Dawley-Ratten von 220–250
g (Harlan) wurde intravenös
20 μg 125I-markiertes Fab 40.4 F(ab')2-Gelenkvarianten
unter Halothan-Anästhesie
injiziert (n = 6 pro Gruppe, mit Ausnahme für "Gelenk 2o" mit n = 10). Arterielle Blutentnahmen
in Serie aus dem Schwanz wurden 0,5, 2, 4, 6, 24, 48, 72 und 144
Stunden nach Verabreichung entnommen. Proben wurden unter Verwendung
eines COBRATM-Autogamma-Zählers (Canberra
Packard) gezählt.
Die Daten wurden geplottet, und die Fläche unter der Kurve wurde unter
Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software Incorporated) berechnet
und ist als % injizierte Dosis Stunde (% id. hr) ausgedrückt. Das
t½β ist durch
die Zeitpunkte 24, 48, 72 definiert. Die Mittel und Standardfehler
der Mittel (SEM) der Daten sind gezeigt.
-
ERGEBNISSE
-
Herstellung von F(ab')2 in
vitro
-
Drei
Gelenksequenzen wurden verwendet, um F(ab')2 in vitro
herzustellen: "Gelenk ½" = NTHTCAAC; "Gelenk
1" = NTHTCPPCPAC; und "Gelenk
2o" = NTHTCPPCPATCPPCPAC. Diese enthalten 1, 2 beziehungsweise 4
Gelenk-Cysteine.
Die "Gelenk 1"- und "Gelenk 2o"-Proteine enthalten
auch eine Aminosäuredifferenz gegenüber "Gelenk ½" eines Ser-zu-Thr-Wechsels
in dem C-Terminus von CH1 wie in Beispiel
1 beschrieben.
-
Nach
Reinigung und Konzentration bei pH 8,0 wurde gefunden, daß die Fab's signifikante Mengen
an F(ab')2 enthalten. Um das F(ab')2-Produkt so
homogen wie möglich
zu erhalten, wurden die Fab'-Zubereitungen
identischen, stark reduzierenden Bedingungen (80 mM β-MA, pH 8,0)
unterworfen, so daß das
Oxidationsverfahren von 100% Fab' startete.
Antigen-Bindungsanalyse (BIAcore) von F(ab')2 zeigt, daß diese
sehr starken Reduktionsbedingungen die Fab-Affinität für lösliches
Antigen nicht beeinflussen. Reduziertes und entsalztes Fab' wurde bei Raumtemperatur über Nacht
für maximale
F(ab')2-Ausbeute belassen.
Allerdings konnte durch Probennahme während der Oxidation für Quenchen
mit NEM gesehen werden, daß etwa
60% des erreichbaren F(ab')2 sich innerhalb der ersten 60 Minuten der
Oxidation bilden – siehe 3. Sowohl "Gelenk ½" als auch "Gelenk 2o" erreichten ähnliche
Endausbeuten von ~65% mit einer Übernacht-Inkubation,
wobei jedoch die F(ab')2-Bildung innerhalb der ersten 30 Minuten
für "Gelenk 2o" schneller war als
für "Gelenk ½". Dies ist wahrscheinlich
eine Konsequenz der größeren Zahl
an Gelenkcysteinen, die die Wahrscheinlichkeit von auftretenden
Fab'-Fab'-Gelenk-Cystein-Wechselwirkungen erhöht. Die
Ausbeute an F(ab')2 unter Verwendung von "Gelenk 2o" kann auf 80% einfach durch Erhöhen der
Konzentration von Fab' auf ≥ 20 mgml–1 erhöht werden.
-
Es
war überraschend,
daß "Gelenk 1" nicht die gleichen
Endausbeuten der F(ab')2-Bildung wie die beiden anderen Proteine
erreichte. Es ist möglich,
daß nach
der Reduktion ein Prozentsatz an "Gelenk 1" rasche Intra-Gelenkdisulfidbildung eingeht, wodurch
die Thiole von der Inter-Gelenkdisulfidbildung
abgeschnitten werden.
-
Keine
C-terminale Proteolyse wurde mit gereinigtem "Gelenk 1" -oder "Gelenk 2o"-F(ab')2 beobachtet, was
die Möglichkeit
beseitigt, daß einem
Anteil an "Gelenk"-Molekülen ein
Cystein fehlt. Von den HCs aus der Reduktion von sowohl "Gelenk 1" als auch "Gelenk 2o" wurde mittels Massenspektrometrie
gezeigt, daß sie Gesamtlängenmoleküle sind – "Gelenk 1" hatte eine beobachtete
Masse von 24703,65 ± 0,55
Da im Vergleich zu der vorhergesagten Masse von 24705,12 Da, "Gelenk 2o" hatte eine beobachtete
Masse von 25366,40 ± 6,13
Da im Vergleich zu der vorhergesagten Masse von 25374,88 Da.
-
Zahl der Disulfidbindungen
in F(ab')2-Gelenkregionen
-
"Gelenk ½'-F(ab')2 weist
einen Vorteil gegenüber "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" dahingehend auf,
daß das
Produkt der Gelenkdisulfidbindungsbildung homogen ist. Im Gegensatz
dazu kann "Gelenk
1" in der Lage sein,
drei verschiedene Spezies von F(ab')2 mit einer
Mischung aus Einzel- und Doppel-Disulfid und "Kopf-zu-Kopf'- und "Kopf-zu-Schwanz"-Spezies zu bilden (siehe 4). Das Bild ist potentiell
noch komplexer mit "Gelenk
2o". Überlegungen
zur Primärsequenz
(unter Nichtberücksichtigung
von Modelling-Voraussagen) zeigen eine große Zahl an Spezies, die gebildet
werden könnten.
Diese unterscheiden sich in der Zahl der Disulfidbindungen (zwischen
eins und vier), der gestaffelten linearen Anordnungen und der Gesamtquartärstruktur
(sowohl "Kopf-zu-Kopf'- als auch "Kopf-zu-Schwanz"-Bildungen). Rotation
um eine Disulfidbildung läßt es als
unwahrscheinlich erscheinen, daß Einfach-Disulfidgebundene
Formen von "Gelenk
2o" länger als kurze
Zeit in Abwesenheit von Thiol-Cap-Bildungsmitteln überleben
könnten.
-
Bei
in vivo in E. coli produziertem F(ab')2 resultiert
das Vorhandensein von mehr Gelenk-Cysteinen nicht per se in einem
hoch Disulfid-gebundenen Gelenk (Lit. 9). Daher war es wichtig zu
zeigen, ob die beiden größeren Gelenke
mehr als eine Disulfidbindung enthielten. Dabei war eine Beobachtung
von Vorteil, die während
der Optimierung der Reduktion/Oxidations-Bedingungen gemacht wurde,
daß "Gelenk 2o" eine größere β-MA-Konzentration
erforderte, um das gesamte kontaminierende F(ab')2 in dem gereinigten
Fab' zu reduzieren.
Es war möglich,
daß die
verschiedenen gereinigten F(ab')2-Proteine Unterschiede in ihrer Fähigkeit,
der Reduktion zu Fab' zu
widerstehen, zeigen würden.
Es wurde gefunden, daß bei
0,25 mgml–1 und
pH 7,0 "Gelenk ½" vollständig mit
125 μM β-MA reduziert
wird (siehe 5). Bei
der gleichen Konzentration von β-MA sind
68,3% der "Gelenk
1"-Präparation
weiterhin dimer. Dies impliziert, daß etwa 68% der Population von "Gelenk 1"-F(ab')2 zwei
Disulfidbindungen aufweisen. Bei der etwas höheren β-MA-Konzentration von 166 μM sind 100%
der "Gelenk 2o"-Präparation
weiterhin dimer. Daher müssen
nach Extrapolation > 68%
der "Gelenk 2o"-Moleküle mehr
als 2 Disulfidbindungen, d. h. 3 oder 4, aufweisen. Obwohl Gelenkstrukturunterschiede
einen Einfluß auf
die Zugänglichkeit
oder chemische Reaktivität
der Gelenkdisulfide haben können,
erscheint es unwahrscheinlich, daß sie signifikant genug sein
würden,
um die in 5 gesehenen
Gesamtunterschiede zu verursachen. Daher weisen "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" einen hohen Grad an Vielfachdisulfidbindungen
auf.
-
Wirkung der Gelenksequenz
der F(ab')2-Pharmokokinetik in der Ratte
-
F(ab')2 hergestellt
aus allen drei Gelenkkonstrukten wurden zusammen mit einer DFM-Kontrolle 125I-markiert, so daß ihre Pharmakokinetik in einem
Rattenmodell verfolgt werden konnten. Die in Tabelle III gezeigten
Daten unterstützen
die Vergleiche, die in vitro zwischen den Gelenken ½, 1 und
2o gemacht wurden. F(ab')2 mit einem Einzelgelenk-Disulfid-"Gelenk ½" wird am schnellsten
aus dem Kreislauf entfernt mit einer AUC von 166,2 ± 9,8%
injizierte Dosis. Stunde (% id. hr). F(ab')2 mit einer
identischen Proteinsequenz, aber verknüpft über Thioetherbindungen, wird
langsamer entfernt, AUC = 384,2 ± 32,1 (% id. hr). Dies wird
als ein Beleg für
die größere Labilität der Disulfidgegenüber der
Thioetherverknüpfung
interpretiert, was zu einem rascheren Abbau in vivo zu Fab' führt. Das
kleinere Fab' wird
rascher über
die Nieren ausgeschieden als F(ab')2. Die Zunahme
der durchschnittlichen Zahl der Disulfidbindungen in dem Gelenk
bei "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" führt zu erhöhter AUC
(423,6 ± 35,0
beziehungsweise 509,7 ± 31,3
(% id. hr)) gegenüber
der von "Gelenk ½". Die Kurven der
Clearance aus dem Kreislauf von Ratten für die getesteten vier F(ab')2-Moleküle sind
in 6 gezeigt. Dies zeigt
graphisch, daß die
Hauptwirkung der unterschiedlichen Gelenkstabilitäten auf
die α-Phase zu
sein scheint. Die ursprüngliche
Clearance von "Gelenk ½-F(ab')2 ist
viel schneller als die der anderen drei F(ab')2-Moleküle, welche
enger zusammen gruppiert sind. Vermutlich erhöhte Widerstandskraft von "Gelenk 1", "Gelenk 2o" und DFM-F(ab')2 gegenüber reduktiven
oder proteolytischen Kräften
im zirkulierenden Blut führt
zu den Molekülen,
die für
längere
Zeit überleben
als die größeren F(ab')2-Spezies,
welche langsamer aus dem Kreislauf entfernt werden.
-
Partielle Reduktion und
PEGylierung von "Gelenk
2o"-F(ab')2 in
vitro
-
Da
das "Gelenk 2o"-F(ab')2 einen
großen
Anteil an Molekülen
mit zahlreichen Gelenkdisulfiden aufweist, erschien es möglich, daß eine Anzahl
an Disulfidbindungen gebrochen und ungekuppelte Thiole aktiviert werden
könnten,
während
das Molekül
als eine dimere Spezies verbliebe. Solche Thiole wären besonders nützlich für die Verknüpfung von
Effektor- oder Reportergruppen wie Radionukleotiden, Toxinen oder
PEG. Kovalente Verknüpfung
von PEG mit Proteinen ist attraktiv, weil sie eine einfache Route zur
Erhöhung
der Serumpermanenz, zur Verminderung der Immunogenizität und zur
Verminderung der Proteolyse in vivo ist.
-
Unter
Verwendung einer Reihe von β-MA-Konzentrationen
bei pH 6,0 und durch Analyse von NEM-gequenchten Proben von HMPC
wurde gefunden, daß bei ≤ 1,8 mM β-ME 100%
der F(ab')2-Population dimer verblieb. Dieses Bild
kann zwischen verschiedenen Ansätzen
von F(ab')2 aufgrund der Gelenkdisulfidbesetzungsheterogenität variieren.
Bei 1,3 mM β-ME
zeigte der Thiolassay mit DTDP, daß 1,34 ± 0,090 Thiole pro F(ab')2 für die Umsetzung
freigesetzt werden. F(ab')2, das nicht mit β-ME behandelt wurde, zeigte
wenige freie Thiole pro F(ab')2. Die Effizienz der PEGylierung von F(ab')2 wurde
nach Reinigung von F(ab')2-PEG durch Kationenaustausch und Bestimmung
der Proteinkonzentration bei A280 zu ≤ 1,3% berechnet.
-
-
-
-
-
-
Tabelle
II
Wirkung der Gelenksequenzen auf die Effizienz der Di-Fab-Bildung
in vivo in Schüttelkolbenexperimenten.
-
Tabelle
III
Wirkung der Gelenkzusammensetzung auf die F(ab')
2-Pharmakokinetik
in der Ratte.
-
FIGURENLEGENDEN
-
1. Wirkung der Gelenkseguenz und -komplexität auf die
Di-Fab'-Bildung
in vivo.
-
Anti-Fd-Western
blot von 4–20%
Tris-Glycin SDS-PAGE, reduzierend für Spuren 1 und 2, nicht-reduzierend
für Spuren
3 bis 12. Die Molekulargröße der Standards
(kDa) sind rechts gezeigt. Alle periplasmatischen Proben gleich
geladen, mit Ausnahme der Nur-LC-Kontrolle (Spur 4), welche einen
5fachen Überschuß aufweist.
Spur 1, pDPH52 Fab 40.4 Gelenk 1 + cys; Spur 2, pDPH44 Fab 40.4
Gelenk 1 Inter; Spur 3, gereinigtes Fab' 40.4 + cys Kontrolle; Spur 4, Fab 40.4
Nur-leichte-Kette-Kontrolle; Spur 5, pDPH42 Fab 40.4 Gelenk 2o +
cys; Spur 6, pDPH52 Fab 40.4 Gelenk 1 + cys; Spur 7, pDPH54 Fab
40.4 Gelenk 2–2 Inter;
Spur 8, pDPH53 Fab 40.4 Gelenk 2–1 Inter;
Spur 9 pDPH69 Fab 40.4 Gelenk 3o Inter; Spur 10, pDPH41 Gelenk 2o Inter;
Spur 11, pDPH44 Gelenk 1 Inter; Spur 12, pDPH40 Gelenk Inter.
-
2. Vergleich der Wirkung des Gelenkisotyps
auf die Di-Fab'-Bildung
in vivo.
-
Anti-Fd-Western
blot von 4–20%
Tris-Glycin nicht-reduzierendes SDS-PAGE. Die Molekulargrößen der
Standards (kDa) sind rechts gezeigt. Alle periplasmatischen Proben
gleich geladen, mit Ausnahme der Nur-LC-Kontrolle (Spur 1), welche
einen 5fachen Überschuß aufweist.
Spur 1 Fab 40.4 Nurleichte-Kette-Kontrolle; Spur 2, gereinigtes
Fab' 40.4 + cys
Kontrolle; Spur 3, pDPH63 Fab 40.4 "IgG4-artiges"-Gelenk Inter; Spur 4, pDPH62 Fab 40.4 "IgG3-artiges"-Gelenk Inter; Spur
5, pDPH62 Fab 40.4 "IgG2-artiges"-Gelenk Inter; Spur
6 pDPH44 Fab 40.4 Gelenk 1 Inter (IgG1).
-
3. Wirkung der Gelenksequenzen und der
Oxidationsdauer auf die F(ab')2-Bildung in vitro.
-
Das
Mittel und die SD dreier unabhängiger
Experimentdurchführungen
bei pH 8,0 und Raumtemperatur sind gezeigt.
-
4. Bereich von F(ab')2-Molekülen die
in der Lage sind, gebildet zu werden
-
A.
F(ab')2 gebildet
durch "Gelenk 1" und B, F(ab')2 gebildet
durch "Gelenk 2o", nur die "Kopf-zu-Kopf"-Formen sind für "Gelenk 2o" gezeigt, daher der
Gebrauch von "x2", um mögliche "Kopf-zu-Schwanz"-Formen zu bezeichnen.
-
5. Wirkung der Gelenksequenz auf die
Widerstandsfähigkeit
von F(ab')2 gegenüber
Reduktion in vitro
-
F(ab')2 bei
0,25 mgml–1 werden
einer Reduktion bei pH 7,0, 37°C
für 45
Minuten in dem Bereich gezeigter b-MA-Konzentrationen unterworfen.
-
6. Wirkung der Gelenkzusammensetzung
auf die F(ab')2-Pharmakokinetik in der Ratte.
-
Das
Mittel und der Standardfehler des Mittels für jedes F(ab')2 sind
gezeigt. T war hier sechs Tiere in jeder Gruppe mit Ausnahme von "Gelenk 2o", bei dem n = 10.
-
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