DE69820885T2

DE69820885T2 - Peptidsquenzen als Gelenkregionen in Proteinen wie Immunglobulinfragmenten und ihre Verwendung in der Medizin

Info

Publication number: DE69820885T2
Application number: DE69820885T
Authority: DE
Inventors: Paul David Humphreys
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: GB9720054D0; DE69820885D1; EP1015495B1; WO1999015549A2; JP2001517423A; WO1999015549A3; EP1015495A2; JP4257030B2; ES2212340T3; ATE257160T1; AU9174398A; US6642356B1

Description

Diese Erfindung betrifft Peptide, welche als Gelenkregionen in Proteinen fungieren, Proteine, die solche Gelenkregionen enthalten, und die Verwendung der Proteine in der Medizin.
In der klinischen Antikörpertherapie und in bildgebenden Anwendungen ist die Avidität einer dimären Antikörperspezies häufig erforderlich, um eine wirksame Antikörperaffinität in vivo zu erreichen, jedoch ohne die Effektorfunkionen oder lange Serumpermanenz, die durch die Fc-Domäne bereitgestellt wird (Lit. 1–3 – für die Literatur, auf die hier durch Zahlen Bezug genommen wird, siehe die nachfolgende Liste "Literaturstellen"). F(ab')₂-Moleküle erfüllen dieses Erfordernis und können durch proteolytische Spaltung von monoklonalem IgG geeigneter Isotypen oder durch Verwendung von aus rekombinantem Immunoglobulin abgeleiteten Domänen, die in E. coli hergestellt wurden, hergestellt werden.
Die Fähigkeit, Antikörperfragmente an das oxidierende Periplasma von E. coli zu sekretieren, hat zu raschen Fortschritten in der gentechnischen Herstellung von übertragenen, hoch exprimierten Fab's geführt. Es ist wichtig, daß die Verwendung von E. coli auch die kosteneffektive und schnelle Produktion von den Mengen des Antikörpermaterials erlaubt, die erforderlich sind, um einen großen Markt zu versorgen (Lit. 4, 5). Gentechnisch hergestelltes Fab' wird häufig nur mit einem Gelenk-Cystein exprimiert. Dieses Cystein kann für die Bindung anderer Fab's verwendet werden, um ein F(ab')₂ herzustellen, oder für die Bindung therapeutischer Effektormoleküle wie Radionuklide, Enzyme oder Toxine (Lit. 6).
Verschiedene Ansätze zur gentechnischen Herstellung für die Herstellung von divalenten Antigen-bindenden Spezies in vivo in E. coli sind berichtet worden, die sowohl modifizierte scFvs als auch Fab's verwenden. Einfache Gelenkmodifikationen geben keine substantiellen Ausbeuten in vivo an dimeren Spezies aus E. coli (Lit. 7–9). Techniken zur Steigerung der Dimerisierung in vivo sind gut charakterisiert, aber diese verwenden oft große Nicht-Immunoglobulin-Dimerisierungsmotive, welche potentiell immunogen sind und ernsthafte Reduktionen des Niveaus der Expression an löslichem Protein verursachen können (Lit. 10–13). Der einfachste Weg zur Herstellung von dimeren Antigenbindenden Spezies bleibt die direkte Disulfid- oder chemische Vernetzung von Fab's in vitro (Lit. 2, 7, 14, 15). Die Wahl der kovalenten Verknüpfung zwischen den zwei Fab's ist eine wichtige. Falls das F(ab')₂ in vivo gespalten wird, erleiden die entstehenden generierten Fab'-Moleküle dann sowohl einen Verlust an Avidität als auch sehr rasche Clearance aus dem Kreislauf (Lit. 1, 2). Von Einzeldisulfidbindungen ist bekannt, daß sie empfänglicher für die Spaltung in vivo sind als geschützte Disulfid-, Sulfid- oder Thioetherbindungen (Lit. 2, 9, 16). Allerdings ist von zwei Disulfiden, wie sie in der Gelenkregion von F(ab')₂ isoliert aus der proteolytischen Spaltung von IgG1 gefunden wurden, kürzlich gefunden worden, daß sie so robust sind wie eine Thioetherbindung bewertet nach der Serumpermanenz (Lit. 9).
Es besteht ein Bedarf für nicht-immunogene dimere Antikörperspezies, welche das Problem der leichten in vivo-Spaltung überwinden, während sie weiterhin effizient sind, um andere Effektormoleküle herzustellen und mit ihnen zu kuppeln. Wir haben nun ein Peptid gefunden, welches, wenn es Teil eines größeren Proteins wie eines Fab'-Fragments ist, effizient Dimere generiert und dimeres Material ergibt, welches hochresistent gegenüber chemischer Reduktion in vitro ist und lange Serumpermanenzzeiten in vivo aufweist. Vorteilhafterweise wird das Peptid in E. coli gut toleriert und hat in unseren Tests bis heute gezeigt, daß es nicht-immunogen ist.
Somit stellen wir gemäß einem Aspekt der Erfindung ein Peptid der Formel (1) zur Verfügung:
wobei X und Y, welche gleich oder unterschiedlich sein können, jeweils ein neutraler, aliphatischer L-Aminosäurerest sind, und geschützte und reaktive Derivate davon.
In Formel (1) und den anderen, hier beschriebenen Peptiden werden herkömmliche Einzelbuchstabenabkürzungen verwendet, um Aminosäurereste darzustellen ausgenommen jene, bei denen es anders angegeben ist. Die Hochstellungen "N" oder "C" werden verwendet, um den N- beziehungsweise C-terminalen Rest eines Peptids zu bezeichnen.
Neutrale L-Aminosäurereste, die durch jede der Gruppen X und Y dargestellt werden, schließen Glycin-, Alanin-, Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Serin- und Threoninreste ein.
Geschütze Derivate des Peptids der Formel (1) schließen N- und C-terminale geschützte Derivate ein, in welchen die N-terminale Aminogruppe oder die C-terminale Carboxylgruppe mit einer Schutzgruppe verknüpft ist. N-Geschützte Derivate schließen zum Beispiel optional substituierte Benzyloxycarbonylamino-, Allyloxycarbonylamino-, Cycloalkyloxycarbonylamino-, t-Butoxycarbonylamino-, Trifluoracetylamino-, Phthalylamino-, Aralkylamino-, z. B. Benzylamino-, Diphenylmethylamino- oder Triphenylmethylamino-, Tosylamino- oder Formylaminoderivate ein. C-Geschütze Derivate schließen zum Beispiel Ester wie optional substituierte Alkyl-, z. B. Methyl-, Ethyl- oder t-Butyl-, Aralkyl-, z. B. Benzyl- oder Benzhydryl-, Silyl-, z. B. Trimethylsilyl-, und Phthalimidomethylester und Ester mit Polymeren, zum Beispiel funktionalisierte Harze auf Styrolbasis, ein.
Reaktive Derivate von Peptiden der Formel (1) schließen solche ein, in denen die C-terminale Carboxylgruppe funktionalisiert ist, und sind zum Beispiel ein Acylhalogenid wie ein Acylchlorid, ein Acylcyanid oder -azid, ein Anhydrid, ein Ester, zum Beispiel ein N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenyl- oder Pentachlorphenylester, ein N-Acylheterocyclus wie ein N-Acylimidazol, -pyrazol oder -triazol oder eine aktivierte Säure gebildet durch Addition eines Carbodiimid- oder Isoxazoliumreagenzes.
Besonders nützliche Peptide der Formel (1) schließen solche ein, in denen X ein Alaninrest ist. In einer anderen Bevorzugung ist Y insbesondere ein Threoninrest. Ein besonders nützliches Peptid gemäß der Erfindung weist die Formel (2) auf:
und geschützte und reaktive Derivate davon.
Die erfindungsgemäßen Peptide können aus angemessen aktivierten und/oder geschützten Aminosäuren [zum Beispiel unter Verwendung reaktiver Derivate und Schutzgruppen der Arten, die in Verbindung mit den Peptiden der Formel (1) erwähnt wurden] unter Anwendung von Standardpeptidsynthesetechniken hergestellt werden [siehe zum Beispiel Merrifield, B., Science (1985), 232, 341–347].
Das Vorhandensein von vier Cysteinresten in jedem Peptid der Formel (1) stellt vier Zentren für die Disulfid- und/oder Thioetherbindungsbildung bereit und erlaubt damit die Reaktion mit anderen Molekülen, die reaktive Thiolgruppen enthalten. Insbesondere dimere Proteine können durch Einfügen der Peptide in Proteinketten erhalten werden, und die Erfindung erstreckt sich auf eine solche Verwendung. Um Proteindimerisierung zu erreichen, muß ein Peptid der Formel (1) zuerst mit einer existierenden Proteinkette gekuppelt oder de novo als Teil von ihr synthetisiert werden, und wir stellen daher in einem anderen Aspekt der Erfindung ein Protein umfassend eine Polypeptidkette, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kette eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C enthält, wobei X und Y wie für das Peptid der Formel (1) definiert sind, bereit.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf Proteine enthaltend zwei Polypeptidketten, die kovalent über die Cysteinreste in ^NTCPPCPXYCPPCPA^C wie oben erläutert verknüpft sind, und somit stellen wir gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Protein umfassend zwei Polypeptidketten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß jede der Ketten eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C (wobei X und Y wie für das Peptid der Formel (1) definiert sind] enthält und jede Kette kovalent mit der anderen über eine, zwei, drei oder vier der in jeder der Aminosäuresequenzen vorhandenen Cysteinreste verknüpft ist, bereit.
In den erfindungsgemäßen Proteinen ist die Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C bevorzugt eine Sequenz ^NTCPPCPAYCPPCPA^C oder ^NTCPPCPXTCPPCPA^C, insbesondere die Sequenz ^NTCPPCPATCPPCPA^C.
Die erfindungsgemäßen Proteine können natürlich vorkommende Proteine sein, mit denen das Peptid der Formel (1) gekuppelt worden ist, oder rekombinante Proteine, die die Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C enthalten. Die Proteine können im allgemeinen Struktur- oder insbesondere Bindungsproteine sein. Besondere Bindungsproteine schließen Hormone, Cytokine, Interleukine, Wachstumsfaktoren, Freisetzungsfaktoren, Ionentransporter, Toxine und Rezeptoren davon, einschließlich aller oder eines Teils der Rezeptoren, die mit dem Binden an Zelloberflächen-assoziierte Moleküle assoziiert sind, des T-Zellrezeptors, CD4, CD8, CD28, der Cytokinrezeptoren, z. B. ein Interleukinrezeptor, TNF-Rezeptor oder Interferonrezeptor, Rezeptoren für Interleukine, z. B. G-CSF oder GM-CSF, von aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktoren, z. B. PDGF-α und PDGF-β, und insbesondere Antikörper und Antigenbindungsfragmente davon ein.
Wenn das erfindungsgemäße Protein eine Peptidkette enthaltend eine ^NTCPPCPXYCPPCPA^C-Aminosäuresequenz aufweist, kann es ein monomeres Protein sein oder separat mit einem oder mehreren anderen Polypeptidketten verknüpft sein, um insgesamt eine multimere Struktur zu bilden. In solchen Proteinen der Erfindung enthaltend zwei Polypeptidketten mit kovalent verknüpften ^NTCPPCPXYPPCPA^C-Sequenzen wird das Protein eindeutig mindestens dimer sein, kann aber auch aus anderen, separat verknüpften Ketten bestehen, um insgesamt eine multimere Struktur zu bilden. Dimere und Multimere können aus mehr als einer Art einer Polypeptidkette aufgebaut sein und können homo- oder heteromer sein.
Die Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen kann durch Anwendung üblicher chemischer oder rekombinanter DNA-Techniken erreicht werden. Chemische Techniken schließen chemisches Kuppeln eines Proteins und eines Peptids der Formel (1) unter Verwendung aktivierter und geschützter Derivate des Proteins und des Peptids wie oben mit Bezug auf die Herstellung von Peptiden der Formel (1) beschrieben ein. Auf diesem Weg kann zum Beispiel ein Peptid der Formel (1) ortsspezifisch mit dem C-terminalen Ende eines geeignet C-aktivierten Proteins gekuppelt werden.
Rekombinante DNA-Techniken sind im allgemeinen mit der Expression eines Proteins durch eine Wirtszelle, gefolgt von der Gewinnung des Proteins unter Verwendung von Standardtrenn- und -reinigungstechniken verbunden. DNA-Codierung für das Protein kann in jedwedem geeigneten Expressionsvektor durch operatives Verknüpfen der DNA mit jedweden notwendigen Expressionssteuerungselementen darin und Transformieren jedweder geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle mit dem Vektor unter Anwendung wohlbekannter Verfahren eingeführt werden. Eine detailliertere Beschreibung geeigneter Techniken wird nachfolgend mit Bezug auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Antikörpern gegeben. Diesen kann im allgemeinen gefolgt und/oder diese können leicht angepaßt werden, um die Herstellung irgendeines erfindungsgemäßen Proteins durch rekombinante Mittel zu ermöglichen. Die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie stellt stellt einen flexiblen Zugang zu erfindungsgemäßen Proteinen dergestalt bereit, daß sie die leichte Manipulation und Insertion eines Peptids der Formel (1) an jedweder gewünschten Position in einem Protein ermöglicht. DNA-Codierung für ein Peptid der Formel (1) ist daher besonders nützlich und bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. DNA enthaltend die folgende Nukleotidsequenz:
[wobei jeder Buchstabe der Standardcode für ein Nukleotid ist] und codierend für die Aminosäuresequenz ^NTCPPCPATCPPCA^C ist besonders nützlich, und die Erfindung erstreckt sich auf DNA umfassend diese Sequenz zusammen mit Varianten davon, bei denen ein oder mehrere Nukleotide aufgrund der Degeneration des genetischen Codes substituiert worden sind. Die Erfindung erstreckt sich auch auf rekombinante Plasmide enthaltend DNA codierend für ein Peptid der Formel (1), auf Zellen enthaltend diese Plasmide und auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, welches umfaßt die Kultivierung der Zellen derart, daß das gewünschte Protein exprimiert wird, und Gewinnung des Proteins aus der Kultur.
Die Aminosäuresequenzen ^NTCPPCPXYCPPCPY^C sind besonders geeignet für die Verwendung mit Bindungsproteinen wie zellassoziierten Rezeptoren oder Antikörpern, wobei jede Sequenz als eine Gelenkregion fungieren kann, um Dimerisierungskapazität bereitzustellen. Somit können zum Beispiel rekombinante Rezeptoren [siehe zum Beispiel die Internationalen Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. WO 92/100591, WO 92/15322, WO 93/19163, WO 95/02686 und WO 97/23613] gestaltet werden, welche diese Sequenzen inkorporieren, um die Dimerisierung der individuellen Rezeptorketten, die für effizientes Rezeptorbinden erforderlich sind, zu erleichtern, und die Erfindung erstreckt sich auf einen rekombinanten Rezeptor umfassend mindestens ein Peptid der Formel (1). Solche Rezeptoren sind zum Beispiel von Nutzen für die Umsteuerung und Aktivierung von Zellen (siehe die gerade erwähnten Patentoffenlegungsschriften], und die Erfindung schließt solche Zellen, die einen rekombinanten Rezeptor umfassend mindestens ein Peptid der Formel (1) exprimieren, ein.
In Antikörpern können die Sequenzen ^NTCPPCPXYCPPCPA^C als Substitute für natürlich vorkommende Gelenkregionen verwendet werden [die Gelenkregion ist zwischen den C_H1- und C_H2-Domänen in natürlich vorkommenden Immunoglobulinen lokalisiert]. Die Sequenzen sind insbesondere für diesen Zweck passend, und in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung stellen wir einen Antikörper umfassend eine Gelenkregion, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Gelenkregion eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C aufweist, wobei X und Y wie für Formel (1) definiert sind, bereit. In diesem Fall weist die Gelenkregion bevorzugt eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPAYCPPCPA^C oder ^NTCPPCPXTCPPCPA^C, besonders bevorzugt ^NTCPPCATCPPCPA^C auf.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, soll im allgemeinen monovalente, divalente oder andere multivalente Antikörper einschließen. Somit kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer monovalenter Antikörper eine einzelne Kette umfassend eine variable Immunoglobulin-Domäne der schweren Kette (V_H) und eine ^NTCPPCPXYCPPCPA^C-Gelenkregion, die direkt mit ihr verbunden ist, bevorzugt an dem C-terminalen Ende der V_H-Domäne, sein. Alternativ können die V_H-Domäne und die Gelenkregion durch eine Abstandsregion umfassend eine oder mehrere Aminosäuren in Peptidverknüpfung miteinander und dem Rest des Antikörpers getrennt sein. Die Abstandsregion kann zum Beispiel eine oder mehrere konstante Immunoglobulin-Domänen der schweren (C_H) oder leichten (C_L) Ketten oder Fragmente davon, zum Beispiel eine C_H1-Domäne oder ein Fragment davon und/oder eine C_H2- und/oder eine C_H3-Domäne oder Fragmente davon, sein. Wenn erwünscht kann die Gelenkregion eine oder mehrere andere Aminosäuren, die an ihren C-Terminus gebunden sind, zum Beispiel eine oder mehrere konstante Immunoglobulinregiondomänen oder Fragmente davon, wie sie gerade beschrieben wurden, aufweisen. Die V_H-Domäne kann monomer sein, oder sie kann dimer sein und V_H-V_H- oder V_H-V_L- (wobei V_L eine variable Immunoglobulin-Domäne der leichten Kette ist) Dimere enthalten, in welchen die V_H- und V_L-Ketten nicht-kovalent assoziiert sind. Wenn gewünscht können die Ketten allerdings kovalent gekuppelt sein entweder direkt, zum Beispiel über eine Disulfidbindung zwischen den beiden variablen Domänen, oder über einen Linker, zum Beispiel einen Peptidlinker, um eine Einzelkettendomäne zu bilden. Besondere Beispiele für erfindungsgemäße monovalente Antikörper schließen Fv, Einzelketten-Fv und insbesondere Fab- oder Fab'-Fragmente ein, die jeweils eine Gelenkregion mit der Sequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C aufweisen.
Erfindungsgemäße divalente Antikörper schließen zwei der gerade beschriebenen monomeren Ketten, die kovalent über einen, zwei, drei oder vier der Cysteinreste der Gelenkregion ^NTCPPCXYCPPCPA^C jeder Kette verknüpft sind, ein. Die Verknüpfung kann eine einfache Disulfidverknüpfung sein oder kann über eine Linkergruppe, zum Beispiel wie in den Internationalen Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. WO 90109195 und WO 90/09196 beschrieben, erfolgen. Besondere divalente Antikörper schließen F(ab)₂- und F(ab')₂-Fragmente ein.
Erfindungsgemäße multivalente Antikörper schließen zum Beispiel tri- und tetravalente Antikörper umfassend drei oder vier der oben beschriebenen monomeren Ketten, die über ihre Gelenkregionen mittels eines Linkers verknüpft sind, zum Beispiel wie in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. 92/22583 beschrieben, ein.
Die erfindungsgemäßen Antikörper werden im allgemeinen in der Lage sein, selektiv an ein Antigen zu binden. Das Antigen kann jedwedes zellassoziierte Antigen sein, zum Beispiel ein Zelloberflächenantigen wie ein T-Zellen-, ein Endothelialzellen- oder Tumorzellenmarker, oder es kann ein lösliches Antigen sein. Besondere Beispiele für Zelloberflächenantigene schließen Adhäsionsmoleküle wie E-Selectin, P-Selectin oder L-Selectin, CD2, CD3, CD4, CDS, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, karzinoembryonales Antigen (CEA), Human-Milchfett-Globulin (HMFG1 und 2), MHC Klasse I- und MHC Klasse II- Antigene und VEGF und, wenn passend, Rezeptoren davon ein. Lösliche Antigene schließen Interleukine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 oder IL-12, virale Antigene, zum Beispiel Respiratorisches-Synzytial-Virus- oder Cytomegalovirus-Antigene, Interferone wie Interferon-α, Interferon-β oder Interferon-γ, Tumor-Nekrose-Faktor-α, Tumor-Nekrose-Faktor-β, Interleukin-Faktoren wie G-CSF oder GM-CSF und aus Blutplättchen gewonnene Wachtstumsfaktoren wie PDGF-α und PDGF-β und, wenn passend, Rezeptoren davon ein.
Die variable Regiondomäne(n) kann/können jedwede natürlich vorkommende variable Domäne oder eine gentechnisch hergestellte Version davon sein. Mit gentechnisch hergestellter Version ist eine variable Regiondomäne gemeint, welche unter Verwendung rekombinanter DNA-Konstruktionstechniken geschaffen worden ist. Solche gentechnisch hergestellten Versionen schließen solche ein, die zum Beispiel aus natürlichen variablen Antikörperregionen mittels Insertionen, Deletionen oder Veränderungen in oder an den Aminosäuresequenzen der natürlichen Antikörper geschaffen wurden. Besondere Beispiele dieser Art schließen jene gentechnisch hergestellten variablen Regiondomänen enthaltend mindestens eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) und gegebenenfalls eine oder mehrere Gerüstaminosäuren aus einem Antikörper und den Rest der variablen Regiondomäne aus einem zweiten Antikörper ein.
Erfindungsgemäße Antikörper können aus jedwedem vollständigen Antikörper erhalten werden, insbesondere einem vollständigen monoklonalen Antikörper [hergestellt durch herkömmliche Immunisierungs- und Zellfusionsverfahren] unter Verwendung jedweder geeigneten Standardenzymspaltungs-und/oder -digestionstechniken, zum Beispiel durch Behandlung mit Pepsin, gefolgt von chemischem Kuppeln mit einem Peptid der Formel (1) oder einem geschützten oder aktivierten Derivat davon unter Anwendung von Standardproteinsynthesetechniken wie oben mit Bezug auf die Herstellung von Peptiden der Formel (1) beschrieben. Alternativ kann der Antikörper der Erfindung durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken unter Beteiligung der Manipulation und Re-expression von DNA codierend variable und/oder konstante Antikörperregionen hergestellt werden. Solche DNA ist bekannt und/oder leicht erhältlich aus DNA-Bibliotheken einschließlich von zum Beispiel Phagen-Antikörper-Bibliotheken [siehe Chiswell, D. J., und McCafferty, J. Tibtech. 10, 80–84 (1992)] oder können wenn gewünscht, synthetisiert werden. Standard-Molekularbiologie- und/oder -Chemie-Verfahren können angewendet werden, um die DNA zu sequenzieren und manipulieren, zum Beispiel zur Einführung von Codons zur Schaffung einer Sequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C, um andere Aminosäuren oder Domänen wie gewünscht zu modifizieren, addieren oder entfernen.
Von hier aus können ein oder mehrere replizierbare Expressionsvektoren enthaltend die DNA hergestellt und verwendet werden, um eine geeignete Zelllinie, z. B. eine nicht-produzierende Myelomzelllinie, wie eine Maus-NSO-Linie oder eine bakterielle, z. B. E. coli-Linie, in welcher die Herstellung des Antikörpers auftreten wird, zu transformieren. Um effiziente Transkription und Translation zu erhalten, sollte die DNA-Sequenz in jedem Vektor geeignete regulatorische Sequenzen einschließen, insbesondere eine Promotor- und Leitsequenz operabel verknüpft mit der variablen Domänsequenz. Besondere Verfahren für die Herstellung von Antikörpern auf diese Weise sind allgemein gut bekannt und werden routinemäßig angewendet. Zum Beispiel werden grundlegende molekularbiologische Verfahren beschrieben von Maniatis et al., [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]; kann DNA-Sequenzieren ausgeführt werden wie beschrieben in Sanger et al., [PNAS 74, 5463, (1977)) und dem Amersham International plc Sequenzierungshandbuch; und kann ortsgerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Kramer of al., [Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1994)] und dem Anglian Biotechnology Ltd Handbuch ausgeführt werden. Außerdem gibt es zahlreiche Publikationen einschließlich Patentoffenlegungsschriften, die die für die Herstellung von Antikörpern durch Manipulation von DNA, Schaffung von Expressionsvektoren und Transformation geeigneter Zellen geeignete Techniken detailliert beschreiben, wie zum Beispiel zusammengefaßt von Mountain, A., und Adair, J. R., in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [Hrsg. Tombs, M. P., 10, Kapitel 1, 1992, Intercept, Andover, UK] und in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. WO 91/09967. Einmal exprimiert kann der Antikörper von der Wirtszelle getrennt und unter Anwendung von Standardzentrifugieren, -filtration, -chromatographie und anderen Trenn/Reinigungstechniken, wie zum Beispiel in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, gereinigt werden.
Antikörperfragmente enthaltend eine Sequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C, insbesondere Fab- oder Fab'-Fragmente, sind besonders geeignet für die Herstellung in E. coli wie oben und in den Beispielen hier beschrieben.
Wenn gewünscht kann das erfindungsgemäße Protein, einschließlich Antikörper, ein oder mehrere daran verknüpfte Effektor- oder Rezeptormoleküle aufweisen, und die Erfindung erstreckt sich auf solche modifizierten Proteine und insbesondere Antikörper. Die Effektor- oder Reportermoleküle können mit dem Protein durch irgendeine zugängliche Aminosäureseitenkette oder eine terminale funktionelle Aminosäuregruppe, die in dem Protein lokalisiert ist, zum Beispiel jede freie Amino-, Imino-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, verknüpft sein. In einer Bevorzugung kann das Molekül jedoch mit einem Cysteinrest in einer Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C verknüpft sein. Dimere enthaltend diese Sequenzen sind besonders resistent gegenüber chemischer Reduktion in vitro und können vorteilhafterweise partiell reduziert werden, um reaktive Thiole zu exponieren, mit welchen Effektor- oder Reportermoleküle verknüpft werden können. Ein, zwei, drei oder mehr Effektor- oder Reportermoleküle können auf diese Weise verknüpft werden.
Effektormoleküle schließen zum Beispiel antineoplastische Agentien, Toxine (wie enzymatisch wirksame Toxine bakterieller oder pflanzlicher Herkunft und Fragmente davon, z. B. Ricin und Fragmente davon), biologisch wirksame Proteine, zum Beispiel Enzyme, synthetische oder natürlich vorkommende Polymere, Nukleinsäuren und Fragmente davon, z. B. DNA, RNA und Fragmente davon, Radionuklide, insbesondere Radioiodid und chelatisierte Metalle ein. Geeignete Reportergruppen schließen chelatisierte Metalle, Fluoreszenzverbindungen oder Verbindungen, welche mittels NMR- oder ESR-Spektroskopie detektiert werden können, ein.
Besondere antineoplastische Agentien schließen cytotoxische und cytostatische Mittel, zum Beispiel alkylierende Mittel wie Stickstoff-Losts (z. B. Chlorambucil, Melphalan, Mechlorethamin, Cyclophosphamid oder Uracil-Lost) und Derivate davon, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid, Busulphan oder Cisplatin; Antimetabolite wie Methotrexat, Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Fluoressigsäure oder Fluorzitronensäure, Antibiotika wie Bleomycine (z. B. Bleomycinsulfat), Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycine (z. B. Mitomycin C), Actinomycine (z. B. Dactinomycin), Plicamycin, Calichaemicin und Derivate davon oder Esperamicin und Derivate davon; Mitosehemmer wie Etoposid, Vincristin oder Vinblastin und Derivate davon; Alkaloide wie Ellipticin; Polyole wie Taxicin-I oder Taxicin-II; Hormone wie Androgene (z. B. Dromostanolon oder Testolacton), Progestine (z. B. Megestrolacetat oder Medroxyprogesteronacetat), Estrogene (z. B. Dimethylstilbestroldiphosphat, Polyestradiolphosphat oder Estramustinphosphat) oder Antiestrogene (z. B. Tamoxifen); Anthrachinone wie Mitoxantron, Harnstoffe wie Hydroxyharnstoff; Hydrazine wie Procarbazin; oder Imadazole wie Dacarbazin ein.
Synthetische oder natürlich vorkommende Polymere schließen zum Beispiel gegebenenfalls substituierte gerad- oder verzweigtkettige Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymere wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere Methoxypolyethylenglykol, oder verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, z. B. ein Homo- oder Heteropolysaccharid wie Lactose, Amylose, Dextran oder Glykogen, ein.
Chelatisierte Metalle schließen Chelate oder zweifach oder dreifach positiv geladene Metalle mit einer Koordinationszahl von 2 bis 8 einschließlich ein. Besondere Beispiele solcher Metalle schließen Technetium (Tc), Rhenium (Re), Cobalt (Co), Kupfer (Cu), Gold (Au), Silber (Ag), Blei (Pb), Bismut (Bi), Indium (In), Gallium (Ga), Yttrium (Y), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd) und Scandium (Sc) ein. Im allgemeinen ist das Metall bevorzugt ein Radionuklid. Besondere Radionuklide schließen ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵⁸Co, ⁶⁰Co, ⁶⁷Cu, ¹⁹⁵Au, ¹⁹⁹Au, ¹¹⁰Ag ²⁰³Pb ²⁰⁶Bi ²⁰⁷Bi ¹¹¹In ⁶⁷Ga ⁶⁸Ga ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹⁶⁰Tb ¹⁵³Gd und ⁴⁷Sc ein.
Das chelatisierte Metall kann zum Beispiel eines der oben genannten Arten von Metallen chelatisiert mit irgendeinem geeigneten vielzähnigen Chelatbildner, zum Beispiel acyclische oder cyclische Polyamine, Polyether (z. B. Kronenether und Derivate davon); Polyamide; Porphyrine und carbocyclische Derivate, sein.
Im allgemeinen wird die Art des Chelatbildners von dem verwendeten Metall abhängen. Eine besonders nützliche Gruppe von Chelatbildnern in erfindungsgemäßen Konjugaten sind allerdings acyclische und cyclische Polyamine, insbesondere Polyaminocarbonsäuren, zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure und Derivate davon, und makrocyclische Amine, z. B. cyclische Triaza- und Tetraaza-Derivate (zum Beispiel wie in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. WO 92/22583 beschrieben); und Polyamide, insbesondere Desferrioxamin und Derivate davon.
Besonders nützliche Effektorgruppen sind Calichaemicin und Derivate davon (siehe zum Beispiel Südafrikanische Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. 85/8794, 88/8127 und 90/2839).
Wenn es erwünscht ist, ein erfindungsgemäßes Protein verknüpft mit einem Effektor- oder Reportermolekül zu erhalten, kann dieses mittels üblicher chemischer oder rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden, in welchen das Protein entweder direkt oder über ein Kupplungsmittel mit dem Effektor- oder Reportermolekül verknüpft wird. Besondere chemische Verfahren schließen zum Beispiel solche ein, die in den Internationalen Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 und WO 89/01476 und den Beispielen hier unter Verwendung funktioneller Gruppen, z. B. Thiolen, in dem Protein und wenn notwendig angemessen aktivierter Effektor- oder Reportermoleküle, zum Beispiel thiolselektive Derivate wie Maleimide, bei denen das Target eine Proteinthiolgruppe ist, beschrieben sind. Alternativ kann, wenn das Effektor- oder Reportermolekül ein Protein oder Polypeptid ist, die Verknüpfung unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, zum Beispiel wie hier oder in der Internationalen Patentoffenlegungsschrift mit der Nr. WO 86/01533 und der Europäischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 392745 beschrieben, erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Protein kann nützlich sein bei der Bestimmung oder Behandlung einer Zahl von Krankheiten oder Störungen. Solche Krankheiten oder Störungen können solche einschließen, die unter den allgemeinen Überschriften Infektionskrankheit, z. B. Virusinfektion; entzündliche Krankheit/Autoimmunität, z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, entzündliche Darmkrankheit; Krebs; allergische/atopische Krankheit, z. B. Asthma, Ekzem; angeborene Krankheit, z. B. zystische Fibrose, Sichelzellenanämie; dermatologische Krankheit, z. B. Psoriasis; neurologische Krankheit, z. B. Multiple Sklerose; Transplantate, z. B. Organtransplantatabstoßung, Transplantat-Wirt-Abstoßungsreaktion; und metabolische/idiopathische Krankheit, z. B. Diabetes, beschrieben sind, einschließen.
Die erfindungsgemäßen Proteine können für die Verwendung in der Therapie und/oder Diagnose formuliert werden, und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein erfindungsgemäße Protein zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger bereit. Wie oben erläutert kann das Protein in diesem Aspekt der Erfindung gegebenenfalls mit einer oder mehreren Effektor- oder Reportergruppen verknüpft sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann jedwede geeignete Form für die Verabreichung annehmen und ist bevorzugt in einer Form, die für die parenterale Verabreichung, z. B. durch Injektion oder Infusion, zum Beispiel durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, geeignet ist. Wenn die Zusammensetzung für die Injektion einer Infusion ist, kann sie die Form einer Suspension, Lösung oder Emulsion in einem ölartigen oder wäßrigen Vehikel annehmen und kann Formulierungsmittel wie Suspensions-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
Alternativ kann die Proteinzusammensetzung in trockener Form sein, für die Rekonstitution vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit.
Falls die Proteinzusammensetzung für die orale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung zusätzlich zu dem Wirkstoff Additive wie Stärke, z. B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke, oder Cellulose oder Stärkederivate wie mikrokristalline Cellulose; Siliziumdioxid; verschiedene Zucker wie Lactose; Magnesiumcarbonat und/oder Calciumphosphat enthalten. Es ist wünschenswert, daß, falls die Formulierung für die orale Verabreichung ist, sie gut von dem Verdauungssystem des Patienten toleriert wird. Zu diesem Zweck kann es wünschenswert sein, Schleimbildner und Harze in die Formulierung aufzunehmen. Es kann auch wünschenswert sein, die Toleranz durch Formulierung des Proteins in einer Kapsel, welche in den Magensäften unlöslich ist, zu verbessern. Es kann auch bevorzugt sein, das Protein oder die Zusammensetzung in einer Formulierung mit gesteuerter Freisetzung aufzunehmen.
Falls die Proteinzusammensetzung für die rektale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung ein Binde- und/oder Gleitmittel, zum Beispiel polymere Glykole, Gelatinen, Kakaobutter oder andere pflanzliche Wachse oder Fette, enthalten.
Therapeutische und diagnostische Verwendungen der erfindungsgemäßen Proteine umfassen typischerweise die Verabreichung einer wirksamen Menge des Proteins an ein menschliches Wesen. Die exakte zu verabreichende Menge wird gemäß der Verwendung des Proteins und des Alters, Geschlechts und Zustands des Patienten variieren, kann jedoch typischerweise von etwa 0,1 mg bis 1000 mg, zum Beispiel von etwa 1 mg bis 500 mg, variiert werden. Das Protein kann als eine Einzeldosis oder in einer kontinuierlichen Weise über einen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Dosen können wie angemessen wiederholt werden. Typische Dosen können zum Beispiel zwischen 0,1–50 mg/kg Körpergewicht pro einzelner therapeutischer Dosis, insbesondere zwischen 0,1–20 mg/kg Körpergewicht für eine einzelne therapeutische Dosis sein.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
AUC Fläche unter der Kurve; β-ME β-Mercaptoethylamin;
DCM Di-Fab'-Maleimid; DTDP 4,4'-Dithiodipyridin;
Fab' Antigen-bindendes Antikörperfragment (mit Gelenk);
F(ab')₂ dimeres Fab'; HC schwere Kette; LC leichte Kette;
NEM N-Ethylmaleimid; PEG Polyethylenglykol.
BEISPIEL 1
Evaluierung der Di-Fab'-Produktion in E. coli unter Verwendung verschiedener Gelenksequenzen.
Strategie – Um jedwede mögliche falsche Interkettendisulfidbindungen zwischen Gelenkregionen und irgendwelchen anderen Cysteinen zu minimieren, wurde die Interkettendisulfidbindung von allen Fab'-Konstrukten entfernt. Es ist vorher gezeigt worden, daß die Entfernung der Interkettendisulfidbindung eines Di-Fab' die Stabilität des Proteins bewertet nach den Serumpermanenzzeiten (Lit. 9) nicht beeinflußt. PCR-Mutagenese wurde angewendet, um die Interkettencysteine von cKappa und C_H1 gegen Serine auszutauschen. Dies ermöglicht auch die Analyse der % Di-Fab'-Bildung durch Analyse periplasmatischer Extrakte auf nicht-reduzierendem SDS-PAGE, gefolgt von spezifischem Schwere-Kette-(HC-)Western-Blotting. Dieser Ansatz erlaubt dabei die Analyse vieler Konstrukte im Schüttelkolbenmaßstab. Es wurde die Mutagenese von C_H1 ausgenutzt, um eine Spe I-Restriktionsstelle zur Erleichterung raschen Klonierens neuer Gelenksequenzen als wieder verbundene Oligonukleotidkassetten einzuführen. Um diese Stelle einzuführen, wurde das Ser N-terminal zu dem Interkettendisulfid-Cys in der schweren Kette gegen ein Thr ausgetauscht und somit der C-Terminus des C_H1 von ^NKSCDKTHTCAA^C gegen ^NKTSDKTHTCAA^C (Veränderungen unterstrichen) ausgetauscht.
Bakterienstamm- und Plasmidkonstruktionen – Alle Endexpressionsplasmide basierten auf pACYC184 [Yarranton, G. T., und Mountain, A. (1992) in: Protein Engineering – a Practical Approach (Rees, A. R., Starnberg, M. J. E., und Wetzel, R., Hrsg.) IRL Press, Oxford, S. 303–326] und wurden verwendet, um W3110, Wildtyp E. coli ATCC 27325 zu transformieren.
Eine Variante von A5B7g3 Fab' (Pfropfzahl 3 eines humanisierten Fab' bindend an CEA – karzinoembryonales Antigen) ohne die Interkettendisulfidbindung wurde zuerst aufgebaut. Das Interketten-Cys-Codon in der leichten Kette (LC) cKappa wurde mittels PCR-Mutagenese gegen Ser ausgetauscht unter Verwendung des mutagenen Oligos:
Eine ähnliche Strategie wurde angewendet, um das Interketten-Cys-Codon aus dem C_H1 der schweren Kette (HC) zu entfernen und die Spel-Restriktionsstelle einzuführen unter Verwendung des mutagenen Oligos:
Diese und alle nachfolgenden Klone wurden mittels DNA-Sequenzierens auf einem ABI 373A-Sequenzierer unter Verwendung des PRISM-Zyklussequenzierungs-Kits überprüft. Neue Gelenksequenzen wurden hergestellt durch Ligation von wieder verbundenen Oligonukleotidpaaren mit 5' Spel-HindIII 3'-Enden über ein ähnlich beschränktes A5B7g3 nur-HC-Plasmid, gefolgt von Rekonstitution des endgültigen bicistronischen Expressionsplasmids.
Die codierende Region für Fab' 40.4 (ein humanisiertes Fab' bindend ein humanes Cytokin) cKappa wurde ähnlich verändert unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids
Ein Restriktionsfragment für das ursprüngliche Fab' Gelenk (^NCAA^C) C_H1 ohne das Interkettendisulfidbindungscystein wurde von A5B7g3 in das Expressionsplasmid für Fab 40.4 als ein Restriktionsfragment gebracht. Da die Spel-Stelle in dem endgültigen Fab 40.4-Expressionsplasmid pDPH40 einzigartig war, war es möglich, weitere Gelenkvarianten rasch herzustellen durch direkte Ligation von wieder verbundenen Oligonukleotidpaaren mit 5' Spel-Notl 3'-Überhängen in ähnlich beschränkte pDPH40. Details der Geleksequenzen und Plasmide sind in Tabelle I gezeigt. Während der DNA-Manipulierungsschritte wurden bevorzugte Codons für E. coli wie von Wada, K. N., et al., Nucleic Acids Res. (1991) 19, 1981, definiert, gewählt.
Schüttelkolbenexgerimente – Schüttelkolbenexperimente wurden im wesentlichen wie zuvor beschrieben ausgeführt mit der Ausnahme, daß diese Einzelplasmidexperimente waren und Tetracyclin bei 10 μgml^–1 erforderten [Humphreys, D. P., et al., FEBS Lett. (1996), 380, 194]. L-Nährlösung wurde für alle Experimente mit A5B7 verwendet, und um die größtmögliche Zelldichte zu erreichen, wurde für solche mit Fab 40.4 2xTY verwendet. Redoxaktive Verbindungen wurden als Feststoffe bis zu einer Endkonzentration von 1 mM wenn erforderlich hinzugegeben. Proben wurden bei 0, 1, 2 und 4 Stunden nach Induktion genommen.
Fermentation – Synthetische SM6 C-Medien: (5,0 g/l (NH₄)₂SO₄, 3,312 g/l Na₂H₂PO₄·H₂O, 3,870 g/l KCl, 1,0 g/l MgSO₄·7H₂O, 1,0 g/l Citrat, 4,00 g/l Zitronensäure, 0,05 g/l CaCl₂·6H₂O, 0,02 g/l ZnSO₄·4H₂O, 0,02 g/l MnSO₄·4H₂O, 0,005 g/l CuSO₄·5H₂O, 0,004 g/l CoSO₄·6H₂O, 0,0967 g/l FeCl₃·6H₂O, 0,0003 g/l H₃BO₃, 0,0002 g/l NaMoO₄). Gylcerol wurde als eine Kohlenstoffquelle zu 3% (Gew./Vol.) verwendet, und MAZU wurde als Entschäumer zu 0,02% (Vol./Vol.) verwendet. Der pH-Wert wurde mit 50% (Vol./Vol.) NH₄OH kontrolliert. Fab'-Expression wurde durch Umschalten der Kohlenstoffquelle auf Lactose zu 5% (Gew./Gew.) induziert, Zellen wurden 24–36 Stunden nach Induktion geerntet. Die Fab'-Ausbeuten betrugen typischerweise 100–150 mg/l.
Western Blotting – Proben äquivalent zu 2 l periplasmatischer Fraktionen wurden 5fach mit d-H₂O verdünnt und für 5 Minuten in nicht-reduzierendem SDS-PAGE-Beladungspufter gekocht, bevor sie einer Elektrophorese auf 4–20% Tris-Glycingelen (Novex) bei 125v für 1,75 Stunden unterworfen wurden. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran (Novex) für 2 Stunden bei 100 mA transferiert. Die Membran wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 50 ml pro Membran des "Blockierungspuffers" (PBS/0,1% (Vol./Vol.) Tween 20/2% (Gew./Vol.) Magermilch) blockiert, bevor sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 5 ml pro Membran des Anti-Fd-Antikörpers (Schaf IgG Anti-Human IgG(Fd), Ref. PC075, The Binding Site, Birmingham, UK) zu 1/1000 (Vol./Vol.) in "Antikörperpuffer" (PBS/0,1% (Vol./Vol.) Tween 20 / 0,1 "Blockierungspuffer") geschüttelt wurde. Die Membran wurde intensiv in PBS 0,1% (Vol./Vol.) Tween 20 gewaschen, bevor sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 5 ml pro Membran eines Esel-Anti-Schaf-HRP-konjugierten Antikörpers (Hasen F(ab')₂ Anti-Schaf IgG Fc-Fragment HRP Konjugat, Ref. 313-036-046, Jackson) zu 1/1000 (Vol./Vol.) in "Antikörperpuffer" geschüttelt wurde. Die Membran wurde intensiv in PBS/0,1% (Vol./Vol.) Tween 20 vor Entwicklung mit DAB-Substrat (Pierce) gewaschen. Kreuzreaktive LC-Banden werden durch die Spuren 4 und 1 der 1 beziehungsweise 2 gezeigt. Lebensgroße Diapositive der Blots wurden für die Laser-Scanning-Densitometrie auf einer Molecular Dynamics Modell 300A-Maschine unter Verwendung von ImageQuant-Software Version 4.2 verwendet. Von Di-Fab abgeleiteten schweren Ketten (Di-NC) trennen sich von Fab abgeleiterter HC (freie HC) während der Elektrophorese. Quantifizierung der relativen Intensitäten der zwei leicht identifizierbaren Banden in jeder Spur ergaben eine Abschätzung von % gebildetem Di-Fab. Dieses unterstellt ein relativ konstantes Niveau der Produktion von HC und seiner Assoziation mit LC zwischen verschiedenen Fab'-Varianten. Die verwendeten, von pTTO-1 abgeleiteten Plasmide produzieren einen Überschuß an LC, und somit ist freie HC im Periplasma nicht detektierbar (Shauna West, persönliche Mitteilung). Di-HC der Proteine ohne Interkettendisulfid wandern mit einer Beweglichkeit, die der eines gereinigten Fab'-Standards mit dem Interkettendisulfid ähnlich ist (vergleiche Spuren 11 und 3 von 1). Die Gesamtabsorption jedes Peaks wurde quantifiziert, und % Di-Fab in jeder Probe wurde wie folgt berechnet: Absorption der Di-HC-Bande ÷ Absorption der Di-HC-Bande + Absorption der HC-Bande.
Fab'-Reinigung – Periplasmatische Extrakte wurden mittels Zentrifugieren bei 25.000 g für 30 Minuten geklärt, der pH wurde auf 6,5 mit 2,5 M Tris erhöht, und sie wurden auf eine ProteinG Sepharose-Säule (GammaBind, Pharmacia Biotech), deren Gleichgewicht zuvor mit P. B. S. eingestellt worden war, aufgebracht. Nach Waschen mit P. B. S. zur Entfernung ungebundenen Materials wurde das Fab'-verwandte Material durch Waschen der Säule mit 0,1 M Glycin. Cl pH 2,7 eluiert. Der pH des Eluats wurde zum Neutralwert mit 2,5 M Tris für die Lagerung bei 4°C erhöht, die Fab'-Konzentrationen nach der Reinigung betrugen typischerweise ≤ 0,2 mgml^–1.
Plasmide wurden mit zwei Kopien der Wiederholungssequenz TCPPCPA mit zwischen 0 und 5 Abstandsresten aufgebaut, siehe pDPH30-35, Tabelle I (Fab'-Konstrukt-Nomenklatur zeigt die Zahl der Mittelgelenksequenzwiederholungen, gefolgt von römischen Ziffern, um die Zahl der Abstandsreste zu zeigen und ob das Protein das die Interkettendisulfidbindung bildende Cystein aufweist oder nicht. Zum Beispiel pDPH34 exprimiert A5B7g3 Gelenk 2iv Inter = Propf 3 von A5B7 mit zwei Gelenkwiederholungen, unterbrochen durch vier Aminosäuren und ohne die Interkettendisulfidbindung. pDPH42 exprimiert Fab' 40.4 Gelenk 2o + Cys, weist zwei Gelenkwiederholungen auf ohne Abstandsreste und mit der Interkettendisulfidbindung). Diese wurden nach ihrer Fähigkeit zur Bildung von Di-Fab's in Schüttelkolbenkulturen bewertet nach Western-Blotting evaluiert und mit den Gelenk-½- und Gelenk-1-Konstrukten verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
Vergleichbar dem, was andere gesehen haben (Lit. 7), produzierte das Gelenk½-Fab' kein detektierbares Di-Fab' in Schüttelkolben. "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" produzierten eine mäßige Menge an Di-Fab' (7,3% beziehungsweise 4,8%). Diese Versionen wurden dann in dem stärker exprimierten Fab 40.4 hergestellt, um zu sehen, ob das Erhöhen der periplasmatischen Proteinkonzentration dieser Fabs sowohl einen Anstieg der Di-Fab'-Bildung in vivo bewirken als auch die relativen Vorteile einer zunehmenden Zahl an Gelenkwiederholungen diskriminieren würde.
Es war überraschend zu sehen, daß alle der A5B7-Konstrukte mit Abstandsresten zwischen den Gelenkwiederholungen kein detektierbares Di-Fab' produzierten. Die zunehmende Länge und Flexibilität dieser Abstandsregionen könnte der zweiten Kopie der Gelenkwiederholung erlauben, zurückzufalten und Intea-HC-Disulfidbindungen zu bilden und dadurch die Cysteine vor dem Bilden der gewünschten Inter-HC-Disulfidbildungen zu maskieren. Obwohl es schwierig ist, diese Annahme direkt zu beweisen, wurden zwei neue Konstrukte unter Verwendung von Fab 40.4 mit vermindertem/r Abstand/Flexibilität durch Entfernen eines (Ala) oder zweier (Ala-Thr) der endogenen Abstandsreste zwischen den starren Polyprolin-II-Helices gestaltet. Deren Ergebnisse gezeigt in Tabelle II waren nicht vorteilhaft, so daß ein Fab' 40.4 mit drei Kopien des Gelenks, "Gelenk 3o", hergestellt wurde.
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Zunahme der Zahl an Kopien der Gelenkwiederholungen zu einer stetigen Abnahme an % produziertem Di-Fab' führen. Diese Abnahme an % Di-Fab' kann vermutlich auf eine Zunahme der Toxizität des Proteins im Periplasma zurückgeführt werden, da die. Proteine reicher an Cystein werden. Die Abnahme an % Di-Fab' korrelierte mit verminderter Lebensfähigkeit nach Fab'-Induktion, wie durch kleinere O.D.₆₀₀'s-Peaks und erhöhte Zellauflösung zu späteren Zeitpunkten gezeigt. Der Disulfidredoxmechanismus in dem E. coli-Periplasma ist nun gut verstanden, aber es wird angenommen, daß er weniger gut adaptiert ist, um Proteine mit komplexeren Disulfidanordnungen als denen des endoplasmatischen Retikulums (zusammengefaßt von Humphreys et al., 1996 ibid) zu bewältigen. Es erscheint wahrscheinlich, daß komplexe Gelenke nicht gut toleriert werden.
Verminderung des Abstands zwischen zwei Gelenkwiederholungen steigert nicht die Di-Fab'-Bildung. "Fab' 40.4 Inter Gelenk 2_–1" zeigt vermindertes Di-Fab' verglichen mit der "Gelenk 2o"-Variante (8,1% ± 4,3 verglichen mit 25,1% ± 8,34 – siehe Tabelle II). "Fab' 40,4 Inter Gelenk 2_–2" zeigt 49,8% ± 16,78 Di-Fab'. Diese Figur legt ein hohes Niveau an Di-Fab'-Produktion nahe. Tatsächlich erscheint dieses Proteine auch nicht in der Lage zu sein, wesentliche Mengen an Volllängen-Fab' zu produzieren, dies wird durch die erhöhte Zahl und Intensität der proteolytischen Banden in Spur Nr. 7 des Western-Blots gezeigt in 1 demonstriert. Daher ist dort eine kleine Menge an Di-Fab', welche groß ist im Vergleich zu der Menge an Fab', aber sehr wenig jedes Proteins wird produziert im Vergleich zu "Gelenk 1" und "Gelenk 2o". Es kann postuliert werden, daß die Entfernung von einem oder beiden dieser Abstandsreste die Gelenkregionen so unflexibel macht, daß die Cysteine in eine Konformation gezwungen werden, welche sie der Proteolyse aussetzt oder sie reaktiv gegenüber nativen E. coli-Proteinen macht. Da das nicht modifizierte 1 Gelenk die größten Di-Fab'-Ausbeute in vivo ergab, wurde entschieden, andere Gelenk-Isotypen auf ihre Wirksamkeit zu testen.
Effekt des Gelenkisotyps – Echte Gelenksequenzen für die IgG2, 3 und 4 konnten nicht geschaffen werden, sondern statt dessen wurde das mittlere Gelenk eines jeden mit dem existierenden oberen IgG1-Gelenk verschmolzen. Die geschaffenen Gelenke wurden daher IgG2-"artig" genannt. Weil lange, cysteinreiche Gelenke schlecht toleriert werden, wurden nur das CPRC und die erste der drei Wiederholungssequenzen des mittleren IgG3-Gelenks verwendet. Der hochgestellte Apostroph wird verwendet, um zu zeigen, daß diese IgG3-Sequenz trunkiert wurde. Diese Konstrukte wurden in der gleichen Weise wie zuvor analysiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
Das IgG3'-artige Gelenk wurde schlecht toleriert und ergab somit eine artefaktisch hohe % Di-Fab'-Messung in der gleichen Weise wie Gelenk 2_–2, wobei ein Beispiel dieser Proteolyse in Spur 4 von 2 gezeigt ist. Von dem langen IgG3-Gelenk wird angenommen, daß es hochflexibel ist [Brekk, O. H., et al., (1995) Immunol. Today 16, 85], und dies ist verantwortlich für einige der Eigenschaften dieses Isotyps. Es ist wahrscheinlich, daß im Periplasma diese Länge an exponiertem Peptid empfänglich ist für Proteolyse, und dies kann der Grund für das niedrige Niveau der Produktion dieses Proteins sein. Das IgG 2-artige Gelenk produzierte eine vernünftige Menge an Di-Fab' (20,8% ± 3,58), aber ergab keinen Anstieg über das, was zuvor mit den IgG 1-Derivaten gesehen wurde. Die relative Unfähigkeit des IgG 4-artigen Fab', Di-Fab' zu produzieren (8,63% ± 1,41), wurde beobachtet. Es besteht nur eine Aminosäuredifferenz zwischen dem IgG 4-artigen Gelenk und dem IgG 1-Gelenk – CPSP im Vergleich zu CPPC. Die Ergebnisse sind konsistent mit vorangehenden Arbeiten (Lit. 22, 23), welche fanden, daß IgG 4 weniger in der Lage war, Inter-HC-Disulfidbindungen zu bilden, als IgG 1. Das Vorhandensein eines Serins zwischen den zwei Cysteinen kann erhöhte Flexibilität des mittleren Gelenks gestatten und dadurch die Bildung von Intea-HC-Disulfiden, welche Inter-HC-Disulfidbildung blockieren.
Wirkung von IgM und IgA-Schwanzstücken – IgM und IgA weisen beide 18 C-terminale Aminosäureverlängerungen auf, die sekretorische Schwanzstücke genannt werden, welche bei ihrer Polymerisation beteiligt sind. Der vorletzte Rest beider Schwanzstücke ist ein Cystein. Von diesem und anderen HC-Cysteinen ist bekannt, daß sie zusammen mit nicht-kovalenten Wechselwirkungen bei der Polymerbildung beteiligt sind, obwohl die genaue Disulfidorganisation nicht vollständig verstanden ist [Davis, A. C., et al., (1989), EMBO J. 8, 2519, und Wiersma, E. J., und Shulman, M. J., (1995) J. Immunol. 154, 5265]. Das Schwanzstück ist allen vier IgG-Isotypen hinzugefügt worden und bewirkte ihre Polymerisation auch in der Abwesenheit der zusätzlichen HC-Cysteine und nicht-kovalent wechselwirkenden Reste, die in IgM und IgA gefunden wurden [Smith, R. I. F., et al., (1995) J. Immunol. 154, 2226). Die Wildtyp- und Schwanzstücksequenzen beschrieben von S⌀rensen, V., et al., (1996) J. Immunol. 156, 2858], wurden zu Fab' 40.4 enthaltend eine "Gelenk 1"-Sequenz hinzugegeben. Die "Gelenk 1"-Sequenz wurde ausgewählt, weil es möglich erschien, daß mindestens ein freies Cystein erforderlich sein könnte, um als eine Nachahmung von Cys⁴¹⁴ von IgM zu wirken, um Schwanzstück-HC bereitzustellen, und zum anderen, um direkte Inter-HC-Wechselwirkungen, von denen angenommen wird, daß sie bereitgestellt werden von Cys³³⁷ von IgM, zu gestatten. Die in pDPH 50 und 51 konstruierten Sequenzen sind in Tabelle I gezeigt.
Die Fab's wurden mittels Schüttelkolbenkultur/Western-Blotting auf Anwesenheit erhöhter Polymerbildung analysiert. Obwohl von "Gelenk 1" bekannt war, daß es ~30% Di-Fab'-Bildung ergibt, wurde gefunden, daß die Anwesenheit eines jeden der Schwanzstücke vollständig die Di-Fab'-Bildung unterdrückt. Es wird kein Hinweis auf die Bildung höheren Polymerzuständen gefunden beurteilt nach Western-Blots nicht-reduzierender nativer und SDS PAGE. Es wurde angenommen, daß die Unterdrückung von Dimerbildung, die "Gelenk 1" inhärent ist, auf die Rückfaltung der Schwanzstücke unter Bildung eines Intra-HC-Disulfids zwischen dem Schwanzstück-Cys und einem dieser in dem Gelenk zurückzuführen ist. Dies erscheint ziemlich wahrscheinlich, da von den Schwanzstücksequenzen angenommen wird, daß sie in der Lage sind, einen Beta-Strang zu bilden, wodurch dem Schwanzstück-Cys erlaubt wird, dem Gelenk nahe zu sein [Pumphrey, R., (1986) Immunol. Today 7, 174].
Im allgemeinen zeigen die Ergebnisse, daß die Anwesenheit von Extra-Gelenk-Cysteinen über das einzelne hinaus, das in dem Orginal-Fab' gefunden wird, der wichtigste Faktor bei der Förderung der Di-Fab'-Bildung in vivo ist, wobei "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" die besten Sequenzen sind. Es wurde kein Vorteil mit anderen Versionen des 1 Gelenks gegenüber diesen gefunden, noch mit irgendwelchen der anderen getesteten 3 IgG-Isotypen. Es wurde gezeigt, daß einfache Gelenke an nützlichsten sind, wobei mit zunehmender Länge des Gelenks weniger % Di-Fab' und eine höhere Zellmortalität produziert wurden. Dies wurde sowohl mit zunehmender Kopienzahl der IgG 1-Gelenksequenz, d. h. Gelenk 1, 2o und 3o, als auch mit dem langen und flexibel trunkierten IgG 3 beobachtet.
Subtilere strukturelle Differenzen beeinflußten ebenfalls die Effizienz der Di-Fab'-Bildung in vivo. Manipulation der Abstandsreste zwischen zwei Kopien der Gelenksequenz '^NTCPPCPA^C' implizierte die Wichtigkeit, die Konformation der Gelenk-Cysteine in einem Di-Fab'-Bildungszustand zu halten. Wenn die Abstandsregion zu groß wurde, wurde die Di-Fab'-Bildung vollständig unterdrückt, vermutlich durch Zurückwinden der gelenkmaskierenden Gelenk-Cysteine, während das Gelenk, wenn der Abstand zu klein war, schlecht in vivo abgebaut wurde.
Vorangehende Berichte fanden eine variable Produktion von Di-Fab' aus Hochzelldichtefermentation von 5–70% unter Verwendung der Gelenksequenz ^NCPPCPPCPP^C (Lit. 9). Die Ergebnisse hier zeigen, daß es sehr schwierig ist, mehr als 5–10% Di-Fab' in vivo aus Fermentationen zu produzieren, und daß dies reproduzierbar ist. Außer der Gelenksequenz können diese Unterschiede den Unterschieden in den Fab'-Expressionsniveaus, den Fermentations bedingungen und dem Wirtsstamm zugeschrieben werden. Die Fab'-Ausbeute war hier 5- bis 10fach kleiner als die von Rodrigues et al., (Lit. 9), beschriebene. Allerdings ist es bekannt, daß spezifische Bedingungen eine spontane, hohe Effizienz (~80%) und ansatzspezifische Di-Fab'-Bildung während der Reinigung verursachen können. Solche Proteinreinigungsbedingungen wurden während dieser Experimente im kleinen Maßstab nicht angewendet.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß Di-Fab'-Bildung in vivo im Periplasma von E. coli ein ineffizientes Verfahren ist, das unter anderem durch die Gelenksequenz und -komplexität moduliert wird. Zwei Gelenksequenzen ("Gelenk 1" und "Gelenk 2o") sind unter in vivo-Selektionsbedingungen als am effizientesten für die Di-Fab'-Bildung identifiziert worden.
BEISPIEL 2
Untersuchung der Serumpermanenzzeiten und der gelenkspezifischen Pegylierung von Flab')₂-Molekülen mit modifizierten Gelenken
Reagenzien
NEM, β-MA, DTDP und Tris waren von Sigma (UK) und vom höchsten erhältlichen Reinheitsgrad. Pyrogenfreies "Flowfusor"-Wasser wurde für die Chromatographie verwendet (Fresenius, Basingstoke, UK). Alle anderen Laborreagenzien waren von BDH (UK) mit Reagenzienreinheitsgrad.
Herstellung und Reinigung von Fab'
Das verwendete Fab' war wie in Beispiel 1 beschriebenes "Fab 40.4". Fab'-Fermentationen und Protein-G-Sepharose-Reinigungen (GammaBind Plus, Pharmacia Biotech) waren wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer Modifikation. E. coli-Periplasmaproteine wurden aus Fermentationszellpaste durch Übernachtinkubation bei 30°C und unter Schütteln bei 250 Upm in einem Fermentationserntevolumen von 100 mM Tris/10 mM EDTA (pH 7,4) extrahiert. Die Leitfähigkeit und der pH-Wert des Rohextrakts wurden auf ≤ 3,5 mS cm^–1 beziehungsweise ≤ 4,5 durch Zugabe von Wasser beziehungsweise Eisessig verändert. Rohextrakt wurde dann durch ein 80 ml Bettvolumen (kompaktiert) eines Streamline SP-Kationenaustauscherharzes (Pharmacia Biotech) im expandierten Bettmodus durchgeführt. Das Gleichgewicht des Harzes wurde mit 50 mM Natriumacetat pH 4,5 im expandierten Bettmodus voreingestellt. Nach intensivem Waschen wurde gebundenes Material im kompaktierten Modus mit 50 mM Natriumacetat/200 mM NaCl pH 4,5 eluiert. Der pH-Wert der Peakfraktion wurde auf ≥ 6,5 mit 2,5 M Tris erhöht, und sie wurde auf eine Protein-G-Sepharosesäule, deren Gleichgewicht mit PBS voreingestellt war, aufgebracht. Nach Waschen mit PBS zur Entfernung von ungebundenem Material wurde Fab'-Material mit 0,1 M Glycin. Cl pH 2,7 eluiert. Das Eluat wurde mit 2,5 M Tris für die Lagerung bei 4°C neutralisiert.
Herstellung und Reinigung von F(ab')₂
Fab'-Material wurde konzentriert und pufferausgetauscht auf ≥ 12 mgml^–1 in 0,1 M Natriumphosphatbuffer pH 8,0 unter Anwendung von Ultrafiltration mit einer 10 kDa Cut-off-Membran. Gelenkthiole wurden aktiviert und Spuren von F(ab')₂ in Abhängigkeit von der Endproteinkonzentration durch Reduktion mit 9 mM β-MA in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 8,0 für 45 min bei 37°C entfernt. Das Reduktionsmittel wurde durch Entsalzen auf einer G25M-Sephadexsäule (PD10) (Pharmacia Biotech), deren Gleichgewicht mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 8,0 voreingestellt worden war, entfernt. Man ließ F(ab')₂ sich durch Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht bilden. Jedwede verbleibenden Thiolgruppen wurden durch Inkubation mit 10 mM NEM in PBS vor der Analyse mit SDS-PAGE (4–20% Tris/Glycingele, Novex, UK) und HPLC (GF-250-Säule, deren Gleichgewicht mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 eingestellt war) blockiert.
F(ab')₂ wurde von Fab' in einem kleinen Maßstab durch Sammeln von Fraktionen der präparativen HPLC (GF-250XL-Säule, deren Gleichgewicht mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 eingestellt war) oder in einem großen Maßstab unter Verwendung von Hydrophobwechselwirkungschromatographie (HIC) getrennt. Festes (NH₄)₂SO₄ wurde zu Fab'/F(ab')₂-Mischungen zu 0,75 M vor dem Aufladen auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia Biotech), die mit 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0/0,75 M (NH₄)₂SO₄ ins Gleichgewicht gebracht wurde, hinzugegeben. Nach Waschen mit Gleichgewichtspuffer wurde gebundenes Material mit 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 eluiert. Die dimere Spezies weist eine höhere Affinität zu der HIC-Matrix als das monomere Fab' auf. Das gesamte gereinigte F(ab')₂ wurde als zu 100% F(ab')₂ mittels HPLC und als zu ≥ 95% F(ab')₂ durch Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE bewertet.
Herstellung von chemisch vernetztem F(ab')₂ (DFM)
DFM wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von 1,6-Bismaleimidohexan-(BMH-)Vernetzter (Lit. 2) hergestellt.
Widerstand gegenüber Reduktion von F(ab')₂
Gereinigtes F(ab')₂ bei 0,25 mgml^–1 in 0,1 M Phosphat pH 7,0 wurde mit β-MA von 0 bis 2 mM für 45 min bei 37°C behandelt. Reduktionen wurden durch Zugabe von NEM bis 10 mM beendet, und die relativen Mengen von F(ab')₂ und Fab' wurden mittels HPLC-Analyse berechnet.
Partielle Reduktion von "Gelenk 2o"-F(ab')₂ für gelenkspezifische Modifikation
Gereinigtes F(ab')₂ bei 6 mgml^–1 in 0,1 M Phosphat pH 6,0 wurde mit β-MA von 0 bis 2 mM für 45 Minuten bei 37°C behandelt. Das Reduktionsmittel wurde durch Entsalzen mit einer P6-Biospin-Säule (BioRad, UK) entfernt, und Proben wurden sofort für den Thiol-Assay, das NEM-Quenchen und die HPLC-Analyse und Modifikation genommen. 1,3 mM β-MA wurde für alle präparativen Partialreduktionen verwendet.
Herstellung und Kationenaustauschreinigung von F(ab')₂
Das wie oben partiell reduzierte PEG-F(ab')₂ wurde mit einem gleichen Volumen von 25 kDa linearem PEG-Maleimid in 0,1 M Phosphat pH 6,0 (Shearwater Polymers Inc., Birmingham, Alabama, USA) gemischt, um einen 30fachen molaren Endüberschuß von PEG:F(ab')₂ zu ergeben. Nach Umsetzung über Nacht bei Raumtemperatur wurde F(ab')₂-PEG von der Hauptmenge des verbleibenden F(ab')₂ unter Anwendung von HPLC im präparativen Maßstab getrennt. Nach Konzentration und Pufferaustausch unter Verwendung einer PD10-Säule zu 50 mM Natriumacetat pH 4,5 wurde die F(ab')₂-PEG/nichtumgesetztes PEG-Fraktion auf eine Poros HS-Säule mit 1,6 ml Bettvolumen (PerSeptive Biosystems, Hertford, UK) auf einer BioCad Vision-Arbeitsstation geladen. Nach Waschen mit 5 Säulenvolumina zur Entfernung von ungebundenem PEG-Maleimid wurde F(ab')₂-PEG mit 50 mM Natriumacetat/40 mM NaCl pH 4,5 eluiert, und F(ab')₂ wurde aus der Säule mit einem linearen Gradienten von 50 mM Natriumacetat pH 4,5 mit NaCl von 40 mM bis 1 M entfernt. Fraktionen wurden konzentriert und pufferausgetauscht zu 0,2 M Natrium-Phosphatpuffer pH 7,0, bevor die Proteinkonzentrationen unter Verwendung von A₂₈₀ bestimmt wurden. Protein wurde mittels SDS-PAGE unter Verwvendung von 4–12% Tris-MES-Gelen (Novex, UK) analysiert.
Thiol-Assay
Thiole pro F(ab')₂ wurden unter Verwendung von DTDP wie zuvor beschrieben (Lit. 17) bestimmt.
Iodierung von F(ab')₂
300 μg F(ab')₂ pro Tiergruppe wurden ¹²⁵I-markiert unter Verwendung von Bolton-und-Hunter-Reagenz (Amersham) bis zu einer spezifischen Aktivität von 0,22–0,33 μCi/μg.
Massenspektrometrie
Molekularmassen für Fab' wurden bestimmt unter Verwendung von Fisons VG Quattro Dreifach-Quadrupol-Ausstattung im Electrospray-Ionisations-Modus.
Tierstudien
Männlichen Sprague Dawley-Ratten von 220–250 g (Harlan) wurde intravenös 20 μg¹²⁵I-markiertes Fab 40.4 F(ab')₂-Gelenkvarianten unter Halothan-Anästhesie injiziert (n = 6 pro Gruppe, mit Ausnahme für "Gelenk 2o" mit n = 10). Arterielle Blutentnahmen in Serie aus dem Schwanz wurden 0,5, 2, 4, 6, 24, 48, 72 und 144 Stunden nach Verabreichung entnommen. Proben wurden unter Verwendung eines COBRA^TM-Autogamma-Zählers (Canberra Packard) gezählt. Die Daten wurden geplottet, und die Fläche unter der Kurve wurde unter Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software Incorporated) berechnet und ist als % injizierte Dosis Stunde (% id. hr) ausgedrückt. Das t½β ist durch die Zeitpunkte 24, 48, 72 definiert. Die Mittel und Standardfehler der Mittel (SEM) der Daten sind gezeigt.
ERGEBNISSE
Herstellung von F(ab')₂ in vitro
Drei Gelenksequenzen wurden verwendet, um F(ab')₂ in vitro herzustellen: "Gelenk ½" = ^NTHTCAA^C; "Gelenk 1" = ^NTHTCPPCPA^C; und "Gelenk 2o" = ^NTHTCPPCPATCPPCPA^C. Diese enthalten 1, 2 beziehungsweise 4 Gelenk-Cysteine. Die "Gelenk 1"- und "Gelenk 2o"-Proteine enthalten auch eine Aminosäuredifferenz gegenüber "Gelenk ½" eines Ser-zu-Thr-Wechsels in dem C-Terminus von C_H1 wie in Beispiel 1 beschrieben.
Nach Reinigung und Konzentration bei pH 8,0 wurde gefunden, daß die Fab's signifikante Mengen an F(ab')₂ enthalten. Um das F(ab')₂-Produkt so homogen wie möglich zu erhalten, wurden die Fab'-Zubereitungen identischen, stark reduzierenden Bedingungen (80 mM β-MA, pH 8,0) unterworfen, so daß das Oxidationsverfahren von 100% Fab' startete. Antigen-Bindungsanalyse (BIAcore) von F(ab')₂ zeigt, daß diese sehr starken Reduktionsbedingungen die Fab-Affinität für lösliches Antigen nicht beeinflussen. Reduziertes und entsalztes Fab' wurde bei Raumtemperatur über Nacht für maximale F(ab')₂-Ausbeute belassen. Allerdings konnte durch Probennahme während der Oxidation für Quenchen mit NEM gesehen werden, daß etwa 60% des erreichbaren F(ab')₂ sich innerhalb der ersten 60 Minuten der Oxidation bilden – siehe 3. Sowohl "Gelenk ½" als auch "Gelenk 2o" erreichten ähnliche Endausbeuten von ~65% mit einer Übernacht-Inkubation, wobei jedoch die F(ab')₂-Bildung innerhalb der ersten 30 Minuten für "Gelenk 2o" schneller war als für "Gelenk ½". Dies ist wahrscheinlich eine Konsequenz der größeren Zahl an Gelenkcysteinen, die die Wahrscheinlichkeit von auftretenden Fab'-Fab'-Gelenk-Cystein-Wechselwirkungen erhöht. Die Ausbeute an F(ab')₂ unter Verwendung von "Gelenk 2o" kann auf 80% einfach durch Erhöhen der Konzentration von Fab' auf ≥ 20 mgml^–1 erhöht werden.
Es war überraschend, daß "Gelenk 1" nicht die gleichen Endausbeuten der F(ab')₂-Bildung wie die beiden anderen Proteine erreichte. Es ist möglich, daß nach der Reduktion ein Prozentsatz an "Gelenk 1" rasche Intra-Gelenkdisulfidbildung eingeht, wodurch die Thiole von der Inter-Gelenkdisulfidbildung abgeschnitten werden.
Keine C-terminale Proteolyse wurde mit gereinigtem "Gelenk 1" -oder "Gelenk 2o"-F(ab')₂ beobachtet, was die Möglichkeit beseitigt, daß einem Anteil an "Gelenk"-Molekülen ein Cystein fehlt. Von den HCs aus der Reduktion von sowohl "Gelenk 1" als auch "Gelenk 2o" wurde mittels Massenspektrometrie gezeigt, daß sie Gesamtlängenmoleküle sind – "Gelenk 1" hatte eine beobachtete Masse von 24703,65 ± 0,55 Da im Vergleich zu der vorhergesagten Masse von 24705,12 Da, "Gelenk 2o" hatte eine beobachtete Masse von 25366,40 ± 6,13 Da im Vergleich zu der vorhergesagten Masse von 25374,88 Da.
Zahl der Disulfidbindungen in F(ab')₂-Gelenkregionen
"Gelenk ½'-F(ab')₂ weist einen Vorteil gegenüber "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" dahingehend auf, daß das Produkt der Gelenkdisulfidbindungsbildung homogen ist. Im Gegensatz dazu kann "Gelenk 1" in der Lage sein, drei verschiedene Spezies von F(ab')₂ mit einer Mischung aus Einzel- und Doppel-Disulfid und "Kopf-zu-Kopf'- und "Kopf-zu-Schwanz"-Spezies zu bilden (siehe 4). Das Bild ist potentiell noch komplexer mit "Gelenk 2o". Überlegungen zur Primärsequenz (unter Nichtberücksichtigung von Modelling-Voraussagen) zeigen eine große Zahl an Spezies, die gebildet werden könnten. Diese unterscheiden sich in der Zahl der Disulfidbindungen (zwischen eins und vier), der gestaffelten linearen Anordnungen und der Gesamtquartärstruktur (sowohl "Kopf-zu-Kopf'- als auch "Kopf-zu-Schwanz"-Bildungen). Rotation um eine Disulfidbildung läßt es als unwahrscheinlich erscheinen, daß Einfach-Disulfidgebundene Formen von "Gelenk 2o" länger als kurze Zeit in Abwesenheit von Thiol-Cap-Bildungsmitteln überleben könnten.
Bei in vivo in E. coli produziertem F(ab')₂ resultiert das Vorhandensein von mehr Gelenk-Cysteinen nicht per se in einem hoch Disulfid-gebundenen Gelenk (Lit. 9). Daher war es wichtig zu zeigen, ob die beiden größeren Gelenke mehr als eine Disulfidbindung enthielten. Dabei war eine Beobachtung von Vorteil, die während der Optimierung der Reduktion/Oxidations-Bedingungen gemacht wurde, daß "Gelenk 2o" eine größere β-MA-Konzentration erforderte, um das gesamte kontaminierende F(ab')₂ in dem gereinigten Fab' zu reduzieren. Es war möglich, daß die verschiedenen gereinigten F(ab')₂-Proteine Unterschiede in ihrer Fähigkeit, der Reduktion zu Fab' zu widerstehen, zeigen würden. Es wurde gefunden, daß bei 0,25 mgml^–1 und pH 7,0 "Gelenk ½" vollständig mit 125 μM β-MA reduziert wird (siehe 5). Bei der gleichen Konzentration von β-MA sind 68,3% der "Gelenk 1"-Präparation weiterhin dimer. Dies impliziert, daß etwa 68% der Population von "Gelenk 1"-F(ab')₂ zwei Disulfidbindungen aufweisen. Bei der etwas höheren β-MA-Konzentration von 166 μM sind 100% der "Gelenk 2o"-Präparation weiterhin dimer. Daher müssen nach Extrapolation > 68% der "Gelenk 2o"-Moleküle mehr als 2 Disulfidbindungen, d. h. 3 oder 4, aufweisen. Obwohl Gelenkstrukturunterschiede einen Einfluß auf die Zugänglichkeit oder chemische Reaktivität der Gelenkdisulfide haben können, erscheint es unwahrscheinlich, daß sie signifikant genug sein würden, um die in 5 gesehenen Gesamtunterschiede zu verursachen. Daher weisen "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" einen hohen Grad an Vielfachdisulfidbindungen auf.
Wirkung der Gelenksequenz der F(ab')₂-Pharmokokinetik in der Ratte
F(ab')₂ hergestellt aus allen drei Gelenkkonstrukten wurden zusammen mit einer DFM-Kontrolle ¹²⁵I-markiert, so daß ihre Pharmakokinetik in einem Rattenmodell verfolgt werden konnten. Die in Tabelle III gezeigten Daten unterstützen die Vergleiche, die in vitro zwischen den Gelenken ½, 1 und 2o gemacht wurden. F(ab')₂ mit einem Einzelgelenk-Disulfid-"Gelenk ½" wird am schnellsten aus dem Kreislauf entfernt mit einer AUC von 166,2 ± 9,8% injizierte Dosis. Stunde (% id. hr). F(ab')₂ mit einer identischen Proteinsequenz, aber verknüpft über Thioetherbindungen, wird langsamer entfernt, AUC = 384,2 ± 32,1 (% id. hr). Dies wird als ein Beleg für die größere Labilität der Disulfidgegenüber der Thioetherverknüpfung interpretiert, was zu einem rascheren Abbau in vivo zu Fab' führt. Das kleinere Fab' wird rascher über die Nieren ausgeschieden als F(ab')₂. Die Zunahme der durchschnittlichen Zahl der Disulfidbindungen in dem Gelenk bei "Gelenk 1" und "Gelenk 2o" führt zu erhöhter AUC (423,6 ± 35,0 beziehungsweise 509,7 ± 31,3 (% id. hr)) gegenüber der von "Gelenk ½". Die Kurven der Clearance aus dem Kreislauf von Ratten für die getesteten vier F(ab')₂-Moleküle sind in 6 gezeigt. Dies zeigt graphisch, daß die Hauptwirkung der unterschiedlichen Gelenkstabilitäten auf die α-Phase zu sein scheint. Die ursprüngliche Clearance von "Gelenk ½-F(ab')₂ ist viel schneller als die der anderen drei F(ab')₂-Moleküle, welche enger zusammen gruppiert sind. Vermutlich erhöhte Widerstandskraft von "Gelenk 1", "Gelenk 2o" und DFM-F(ab')₂ gegenüber reduktiven oder proteolytischen Kräften im zirkulierenden Blut führt zu den Molekülen, die für längere Zeit überleben als die größeren F(ab')₂-Spezies, welche langsamer aus dem Kreislauf entfernt werden.
Partielle Reduktion und PEGylierung von "Gelenk 2o"-F(ab')₂ in vitro
Da das "Gelenk 2o"-F(ab')₂ einen großen Anteil an Molekülen mit zahlreichen Gelenkdisulfiden aufweist, erschien es möglich, daß eine Anzahl an Disulfidbindungen gebrochen und ungekuppelte Thiole aktiviert werden könnten, während das Molekül als eine dimere Spezies verbliebe. Solche Thiole wären besonders nützlich für die Verknüpfung von Effektor- oder Reportergruppen wie Radionukleotiden, Toxinen oder PEG. Kovalente Verknüpfung von PEG mit Proteinen ist attraktiv, weil sie eine einfache Route zur Erhöhung der Serumpermanenz, zur Verminderung der Immunogenizität und zur Verminderung der Proteolyse in vivo ist.
Unter Verwendung einer Reihe von β-MA-Konzentrationen bei pH 6,0 und durch Analyse von NEM-gequenchten Proben von HMPC wurde gefunden, daß bei ≤ 1,8 mM β-ME 100% der F(ab')₂-Population dimer verblieb. Dieses Bild kann zwischen verschiedenen Ansätzen von F(ab')₂ aufgrund der Gelenkdisulfidbesetzungsheterogenität variieren. Bei 1,3 mM β-ME zeigte der Thiolassay mit DTDP, daß 1,34 ± 0,090 Thiole pro F(ab')₂ für die Umsetzung freigesetzt werden. F(ab')₂, das nicht mit β-ME behandelt wurde, zeigte wenige freie Thiole pro F(ab')₂. Die Effizienz der PEGylierung von F(ab')₂ wurde nach Reinigung von F(ab')₂-PEG durch Kationenaustausch und Bestimmung der Proteinkonzentration bei A₂₈₀ zu ≤ 1,3% berechnet.
Tabelle II Wirkung der Gelenksequenzen auf die Effizienz der Di-Fab-Bildung in vivo in Schüttelkolbenexperimenten.
Tabelle III Wirkung der Gelenkzusammensetzung auf die F(ab')₂-Pharmakokinetik in der Ratte.
FIGURENLEGENDEN
1. Wirkung der Gelenkseguenz und -komplexität auf die Di-Fab'-Bildung in vivo.
Anti-Fd-Western blot von 4–20% Tris-Glycin SDS-PAGE, reduzierend für Spuren 1 und 2, nicht-reduzierend für Spuren 3 bis 12. Die Molekulargröße der Standards (kDa) sind rechts gezeigt. Alle periplasmatischen Proben gleich geladen, mit Ausnahme der Nur-LC-Kontrolle (Spur 4), welche einen 5fachen Überschuß aufweist. Spur 1, pDPH52 Fab 40.4 Gelenk 1 + cys; Spur 2, pDPH44 Fab 40.4 Gelenk 1 Inter; Spur 3, gereinigtes Fab' 40.4 + cys Kontrolle; Spur 4, Fab 40.4 Nur-leichte-Kette-Kontrolle; Spur 5, pDPH42 Fab 40.4 Gelenk 2o + cys; Spur 6, pDPH52 Fab 40.4 Gelenk 1 + cys; Spur 7, pDPH54 Fab 40.4 Gelenk 2_–2 Inter; Spur 8, pDPH53 Fab 40.4 Gelenk 2_–1 Inter; Spur 9 pDPH69 Fab 40.4 Gelenk 3o Inter; Spur 10, pDPH41 Gelenk 2o Inter; Spur 11, pDPH44 Gelenk 1 Inter; Spur 12, pDPH40 Gelenk Inter.
2. Vergleich der Wirkung des Gelenkisotyps auf die Di-Fab'-Bildung in vivo.
Anti-Fd-Western blot von 4–20% Tris-Glycin nicht-reduzierendes SDS-PAGE. Die Molekulargrößen der Standards (kDa) sind rechts gezeigt. Alle periplasmatischen Proben gleich geladen, mit Ausnahme der Nur-LC-Kontrolle (Spur 1), welche einen 5fachen Überschuß aufweist. Spur 1 Fab 40.4 Nurleichte-Kette-Kontrolle; Spur 2, gereinigtes Fab' 40.4 + cys Kontrolle; Spur 3, pDPH63 Fab 40.4 "IgG4-artiges"-Gelenk Inter; Spur 4, pDPH62 Fab 40.4 "IgG3-artiges"-Gelenk Inter; Spur 5, pDPH62 Fab 40.4 "IgG2-artiges"-Gelenk Inter; Spur 6 pDPH44 Fab 40.4 Gelenk 1 Inter (IgG1).
3. Wirkung der Gelenksequenzen und der Oxidationsdauer auf die F(ab')₂-Bildung in vitro.
Das Mittel und die SD dreier unabhängiger Experimentdurchführungen bei pH 8,0 und Raumtemperatur sind gezeigt.
4. Bereich von F(ab')₂-Molekülen die in der Lage sind, gebildet zu werden
A. F(ab')₂ gebildet durch "Gelenk 1" und B, F(ab')₂ gebildet durch "Gelenk 2o", nur die "Kopf-zu-Kopf"-Formen sind für "Gelenk 2o" gezeigt, daher der Gebrauch von "x2", um mögliche "Kopf-zu-Schwanz"-Formen zu bezeichnen.
5. Wirkung der Gelenksequenz auf die Widerstandsfähigkeit von F(ab')₂ gegenüber Reduktion in vitro
F(ab')₂ bei 0,25 mgml^–1 werden einer Reduktion bei pH 7,0, 37°C für 45 Minuten in dem Bereich gezeigter b-MA-Konzentrationen unterworfen.
6. Wirkung der Gelenkzusammensetzung auf die F(ab')₂-Pharmakokinetik in der Ratte.
Das Mittel und der Standardfehler des Mittels für jedes F(ab')₂ sind gezeigt. T war hier sechs Tiere in jeder Gruppe mit Ausnahme von "Gelenk 2o", bei dem n = 10.
LITERATURSTELLEN

1. Covell, D. G., J. Barbet., O. D. Holton., C. D. V. Black., R. J. Parker and J. N. Weinstein. 1986. Pharmacokinetics of monoclonal Immunoglobulins G1, F(ab')₂, and Fab' in Mice. Cancer Research 46: 3969.
2. King, D. J., A. Turner., A. P. H. Farnsworth., J. R. Adair., R. J. Owens., B. Pedley., D. Baldock., K. A. Proudfoot., A. D. G. Lawson., N. R. A. Beeley., K. Millar., T. A. Millican., B. A. Boyce., P. Antoniw., A. Mountain., R. H. J3. Begent., D. Shochat and G. T. Yarranton. 1994. Improved tumour targeting with chemically cross-linked recombinat antibody fragments. Cancer Research 54: 6176.
3. Kaku, S., S. Yano., T. Kawasaki., Y. Sakai., K. I. Suzuki., K. Kawamura., Y. Masuho., N. Satoh., T. Takenaka., N. F. Landolfi and M. S. Co. 1996. Comparison of the antiplatelet agent potential of the whole molecule, F(ab')₂ and Fab fragments of humanized anti-GPIIb/IIIa monoclonal antibody in Monkeys. Geral Pharmacology 27: 435
4. Plückthun, A. 1992. Mono- and bivalent antibody fragments produced in Escherichia coli: engineering, folding and antigen binding. Immunological Reviews 130: 151
5. George, A. J. T. and A. Epenetos. 1996. Advances in antibody engineering. Expert Opinion in Therapeutic Patents 6: 441
6. Melton, R. G. 1996. Preparation and purification of antibody-enzyme conjugates for therapeutic applications. Advanced Drug Delivery Reviews 22: 289.
7. Carter, P., R. F. Kelley., M. L. Rodrigues., B. Snedecor., M. Covarrubias., M. D. Velligan., W. L. T. Wong., A. M. Rowland., C. E. Kotts., M. E. Carver., M. Yang and A. et al. 1992. High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Bio/Technology 10: 163
8. Better, M., S. L. Bernhard., S. P. Lei., D. M. Fishwild., 3. A. Lane., S. F. Carroll and A. H. Horwitz. 1993. Petent anti-CD5 ricin A chain immunoconjugates from bacterially produced Fab' and F(ab')₂. Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A. 90: 457.
9. Rodrigues, M. L., B. Snedecor., C. Chen., W. L. T. Wong., S. Garg., G. S. Blank., D. Maneval and P. Carter. 1993. Engineering Fab' fragments for efficient F(ab')₂ formation in Escherichia coli and for improved in vivo stability. Journal of Immunology 12: 6954.
10. Pack, P. and A. Plückthun. 1992. Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry 31: 1579
11. Ducancel, F., D. Gillet., A. Carrier., E. Lajeunesse., A. Menez and J. C. Boulain. 1993. Recombinant colorimetric antibodies: construction and characterization of a bifunctional F(ab)₂/alkaline phosphat conjugate produced in Escherichia coli. Bio/Technology 11: 601.
12. Speck, R. R., J. R. Couto., S. G. Godwin., R. B. Christian., R. Kiwan., R. L. Ceriani and J. A. Peterson. 1996. Inverted Fab2s (IFab2s): engineering and expression of novel, dimeric molecules, with a molecular weight of 100 000. Molecular Immunology 33: 1095.
13. Rheinecker. M., C. Hardt., L. L. hag., P. Kufer., R. Gruber., A. Hoess., A. Lupas., C. Rottenberger., A. Pluckthun and P. Pack. 1996. Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumour-associated carbohydrate antigen. Journal of Immunology 157: 2989.
14. Glennie, M. 3., H. M. McBride., A. T. Worth and G. T. Stevenson. 1987. Preparation and performance of bispecific F(ab'γ)₂ antibody containing thioetherlinked Faby fragments. Journal of Immunology 139: 2367.
15. King, D. J., J. R. Adair., S. Angal., D. C. Low., K. A. Proudfoot., J. C. Lloyd., M. W. Bodmer and G. T. Yarranton. 1992. Expression, purification and characterization of a mouse-human chimeric antibody and chimeric Fab' fragment. Biochemical Journal 281: 317.
16. Worrell, N. R., A. J. Cucumber., G. D. Parnell., A. Mirza., J. A. Forrester and W. C. J. Ross. 1986. Effect of linkage variation on pharmacokinetics of ricin A chain-antibody conjugates in normal rats. Anti-Cancer Drug Design 1: 179.
17. Lyons. A., D. J. King., R. J. Owens., G. T. Yarranton., A. Millican., N. R. Whittle and J. R. Adair. 1990. Site-specific attachment to recombinant antivodies via introduced surface cysteine residues. Protein Engineering 3: 703.
18. Moroder, L., G. Hübener., S. Göhring-Romani., W. Göhring., H. J. Musiol and E. Wünsch. 1990. Fully synthetic immunogens. Part I. Kinetic studies on air oxidation of the human IgGi bis-cysteinyl fragment 225–232. Tetrahedron 46: 3305.
19. Harris, L. J., S. B. Larson., K. W. Hasel., 3. Day., A. Greenwood and A. McPherson. 1992. The three-dimensinal structure of an intact monoclonal antibody for canine lymphma. Nature 360: 369.
20. Burton, D. R. and J. M. Woof. 1992. Human antibody effector function. Advances in Immunolgy 51: 1.
21. Buchegger, F., A. Pelegrin., N. Hardman., C. Heusser., 3. Lukas., W. Dolci and J. P. Mach. 1992. Different behavior of mouse-human chimeric antibody F(ab')₂ fragments of IgG₁, IgG₂, and IgG₄ sub-class in vivo. International Jounal of Cancer 50: 416.
22. Angal, S., D. J. King., M. W. Bodmer., A. Turner., A. D. G. Lawson., G. Roberts., B. Pedley and J. R. Adair. 1993. A single amino acid substitution abolishes the herogeneity of chimmeric mouse/human (IgG4) antibody. Molecular Immunology 30: 105.
23. Bloom, J. W., M. S. Madanat., D. Marriott., T. Wong and S. Y. Chan. 1997. Intrachain disulfide bond in the core hinge region of human IgG4. Protein Science 6: 407.
24. Yoshimori, T., T. Semba., N. Takemoto., S. Akagi., A. Yamamoto and Y. Tashiro. 1990. Protein disulfide-isomerase in rat exocrine pancreatic cells is exported from the endoplasmic reticulum despite possessing the retention signal. Journal of Biological Chemistry 265: 15984.

Claims

Peptid der Formel (1)
wobei X und Y, welche gleich oder unterschiedlich sein können, jeweils ein neutraler, aliphatischer L-Aminosäurerest sind, und geschützte und reaktive Derivate davon.
Peptid nach Anspruch 1, wobei X ein Alaninrest ist.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Y ein Threoninrest ist.
Protein, umfassend eine Polypeptidkette, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C enthält, wobei X und Y wie in Anspruch 1 definiert sind.
Protein, umfassend zwei Polypeptidketten, gekennzeichnet dadurch, daß jede der Ketten eine Aminosäuresequenz ^NTCPPCPXYCPPCPA^C enthält, wobei X und Y wie in Anspruch 1 definiert sind und jede Kette mit der anderen durch ein, zwei, drei oder vier Cysteinreste, die in jeder der Aminosäurese quenzen vorliegen, kovalent verknüpft ist.
Protein nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, welches ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon ist.
Protein nach Anspruch 6, welches ein Fab- oder Fab'-Fragment ist.
Protein nach einem der Ansprüche 4 bis 7, welches eines oder mehrere daran verknüpfte Effektor- oder Reportermoleküle aufweist.