DE3751908T2

DE3751908T2 - Chimärisches Murine-Mensch-Immunoglobulin, spezifisch für tumorassoziertes 17-1A Antigen

Info

Publication number: DE3751908T2
Application number: DE3751908T
Authority: DE
Inventors: Hubert J P Schoemaker; Lee K Sun
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 1986-07-07
Filing date: 1987-07-07
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2007-07-08
Also published as: CA1340456C; EP0256654A2; JPH1070991A; EP0256654A3; EP0256654B1; DE3751908D1; ATE143052T1

Description

Grundlagen

Monoklonale Antikörper sind gegen Antigene, die mit Tumoren assoziiert sind, zum Einsatz in der Krebstherapie entwickelt worden. Ein Beispiel ist der murine monoklonale Antikörper 17-1A, der gegen ein Oberflächen- Antigen von Dickdarmkrebszellen und anderen Tumorzellen gerichtet ist. Der Antikörper ist zur Immuntherapie von Dickdarmkrebs eingesetzt worden, und in mehreren Fällen hat die Behandlung zu einer partiellen oder vollständigen Regression von Dickdarm-Karzinomen geführt.
Die meisten monoklonalen Antikörper, die gegen tumorassoziierte Antigene entwickelt worden sind, sind murine Antikörper. Der Hauptgrund ist, daß Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper bei dieser Species weit entwickelt sind. Dagegen sind menschliche monoklonale Antikörper schwierig herzustellen. Die gebräuchliche Standardtechnik zur Herstellung muriner Hybridome - Immunisieren mit Antigen und Ernten der Milzzellen zur Fusion - kann offensichtlich nicht zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper eingesetzt werden. Menschliche Lymphocyten, die Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen produzieren, können von Personen gewonnen werden, die natürlicherweise dem Antigen ausgesetzt waren, aber Hybridome, die mit menschlichen Zellen gebildet werden, sind häufig instabil und stellen die Antikörperproduktion ein.
Das erfolgreiche murine System zur Herstellung monoklonaler Antikörper bietet Herstellungsmöglichkeiten von monoklonalen Antikörpern gegen viele Krebs-Antigentypen. Allerdings besitzen murine Antikörper verschiedene Nachteile, die die Verwendung in der menschlichen Krebstherapie wesentlich einschränken können. Als Fremdproteine lösen murine Antikörper häufig entgegenwirkende Immunreaktionen aus, die ihre therapeutische Wirksamkeit vermindern oder vollständig aufheben können. Zusätzlich können murine Antikörper allergische Reaktionen in Patienten hervorrufen. Leider steigert die notwendige wiederholte Verabreichung in der Therapie die Wahrscheinlichkeit dieser Immunreaktionen in Patienten.
Ein vorgeschlagenes Verfahren, um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, ist die Herstellung von Antikörpern, die aus variablen Regionen der Maus bestehen, die mit menschlichen konstanten Regionen verknüpft sind. Siehe beispielsweise Morrison, S. L. et al. (1984) "Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen-binding Domains with Human Constant Region Domains" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Neuberger, M. S. und Rabbits, T. H. "Production of Chimeric Antibodies" PCT Anmeldung, Nr. PCT/GB85 00392. Diese chimären Antikörper würden die Antigenbindungsspeziftät des murinen Antikörpers besitzen, aber da sie menschliche konstante Regionen besitzen, wären sie zum größten Teil menschliche Antikörper. Da die konstante Region größtenteils für eine Immunantwort gegen Antikörper verantwortlich ist, sollten chimäre Maus/Mensch-Antikörper mit konstanten Regionen menschlichen Ursprungs mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit eine anti-murine Immunantwort beim Menschen auslösen. Ferner können die menschlichen konstanten Regionen einen Antikörper mit besserer Effektor-Funktion beim Menschen liefern.
Die Verknüpfung einer menschlichen konstanten Region mit einer murinen variablen Region könnte die Konformation der variablen Region derart verändern, so daß die Bindungsfähigkeit des resultierenden Chimärs vermindert oder zerstört wird. Chimäre Maus/Maus und Maus/Mensch-Antikörper mit variablen Regionen für Haptene, wie Azophenylarsenat und Trinitrophenyl, sind hergestellt worden, und diese Antikörper haben gezeigt, daß sie die ursprüngliche Hapten-Bindungsspezifität des murinen Antikörpers, von dem die variablen Regionen stammen, beibehalten. Siehe beispielsweise Sharon, J. et al. (1984) "Expression of a VHCK Chimeric Protein in Mouse Myeloma Cells" Nature 309:364-366; Boulianne G. L. et al., (1984) "Production of Functional Chimeric Mouse/Human Antibody" Nature, 312:604-608; und Neuberger, M. S. et al., "A Hapten Specific Chimeric IgE Antibody with Human Physiological Effector Function" (1985) Nature 314:268-270. Da Hapten-Moleküle klein sind, würden Konformationsänderungen, die in der murinen variablen durch das Anfügen einer menschlichen konstanten Region Region induziert werden könnten, ein Binden derartiger Moleküle jedoch nicht signifikant ändern. Wenn das verwandte Antigen ein großes Molekül ist, wie beispielsweise ein tumor- oder proliferationsassoziiertes Zelloberflächen- Antigen, könnten Konformationsänderungen in der Region die Bindungsfähigkeit wesentlich beeinflussen.
In EP-A-0171496 erfolgt die Offenlegung chimärer monoklonaler Antikörper und Gene, die für ein tumorassoziiertes Antigen spezifische chimäre Antikörper codieren.
Herlyn et al., P.N.A.S. USA 76(3) (1979) Seiten 1483-1442 veröffentlichen den 17-1A monoklonalen Antikörper und die produzierende Zellinie.
Herlyn et al., (1985) J. Immunological Methods, 85; Seiten 27-38 veröffentlichen anti-idiotypische Antworten auf den monoklonalen anti-Dickdarmkrebs-Antikörper 17-1A.
Benjamin et al., (1986) J. Exp. Med. 163, Seiten 1539-1552, veröffentlichen anti-idiotypische Antworten auf chimäre Antikörper, die mit Zelloberflächen-Antigenen reagieren.
Shawler et al., (1985) Journal of Immunology 135 (2), Seiten 1530-1535 veröffentlichen anti-idiotypische Antworten auf menschliche monoklonale Antikörper nach Mehrfachinfusionen.

Offenlegung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Maus/Mensch- Immunoglobuline, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
Die chimären Immunoglobuline umfassen:
a) mindestens eine chimäre schwere Kette, die eine von der schweren Kette eines murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen ist, verknüpft mit einer menschlichen konstanten Region der schweren Kette; und
b) mindestens eine chimäre leichte Kette, die eine von einer leichten Kette des murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die mit einer menschlichen konstanten Region der leichten Kette verknüpft ist; wobei das chimäre Immunoglobulin eine Bindungsspezifität für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen beibehält.
Die Immunoglobuline können monovalente Dimere, divalente Tetramere oder polyvalente Aggregate sein. Diese chimären Maus/Mensch-Immunoglobuline behalten die ursprüngliche Bindungsspezifität für das Antigen bei.
Die konstanten Regionen des chimären Immunoglobulins stammen von menschlichen Immunoglobulinen. Die konstante Region der schweren Kette kann aus einer beliebigen Isotyp-Klasse oder Unterklasse gewählt werden und die konstante Region der leichten Kette kann aus der kappa oder lambda Klasse sein.
Die chimären Antikörper werden hergestellt durch Klonieren der DNS-Abschnitte, die die variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines murinen Antikörpers codieren, der für ein tumorassoziiertes Antigen spezifisch ist, und Verknüpfen dieser DNS-Abschnitte mit DNS- Abschnitten, die die konstanten Regionen der menschlichen schweren und leichten Kette codieren, um ein chimäres Immunoglobulin codierende Gene herzustellen. Die fusionierten Genkonstrukte, die die leichte und schwere Kette codieren, werden in Expressions-Vektoren eingebaut oder inseriert. Diese Gene werden in eine lymphoide Empfängerzelle (z. B. eine Myelomzelle) cotransfiziert, wo die Immunoglobulin-Proteine synthetisiert, zusammengebaut und sezerniert werden können.
Die chimären Antikörper dieser Erfindung sind in Therapie und Diagnose von Krebs einsetzbar. Die chimären Antikörper können in einer Tumor-Therapie allein oder mit verschiedenen anderen Immunoglobulinen als Mischungen oder "Cocktails" von Antikörpern, die spezifisch für verschiedene bei einem heterogenen Tumor auftretenden Antigene sind, verwendet werden. In einem weiteren Therapieverfahren können die chimären Immunoglobuline entweder mittels chemischer oder gentechnologischer Verfahren konjugiert werden, um therapeutische Mittel gegen Krebs zu bilden, sogenannte "intelligente" Medikamente, die spezifisch gegen Krebszellen gerichtet sind. Für diagnostische Zwecke können die chimären Immunoglobuline Mittel zur Tumor-Darstellung liefern. Beispielsweise können die Immunoglobuline mit verkürzten schweren Ketten hergestellt werden, um "Antikörper-Fragmente" zu liefern und entweder direkt oder mittels eines markierenden Komplexbildners markiert werden. Die chimären Immunoglobuline können so konstruiert werden, daß sie ein(e) "eingebaute(s)" Markierungskomplexbildungsprotein oder - Protein-Domäne enthalten.
Die Verwendung chimärer Maus/Mensch-Antikörper in vivo bietet verschiedene Vorteile gegenüber der Verwendung muriner monoklonaler Antikörper. Erstens können diese Antikörper für die Auslösung menschlicher antimaus- Reaktionen in Patienten weniger immunogen sein. Zweitens kann eine gewünschte menschliche konstante Region mit einem Gen der Maus für die murine variable Region verknüpft werden, um Antikörper mit den gewünschten biologischen Effektor-Funktionen herzustellen. Schließlich ist es möglich, mittels Verknüpfen von Ig-DNS und nicht-Ig-DNS-Sequenzen konstruierte Hybridgene zu exprimieren. Wie oben erwähnt, bilden diese Fusionsproteine auf Antikörper basierende Beförderungssysteme zur selektiven Zerstörung oder Darstellung von Tumorzellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt die Nucleotid-Sequenzen der Gene der funktionsfähigen leichten Kette (A) und schweren Kette (B) von 17-1A und den abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
Abbildung 2 zeigt die Southern-Blot-Analyse der rearrangierten 17-1A VH Gene, die JH Sequenzen enthalten.
Abbildung 3 zeigt die Struktur der Vektoren der chimären schweren und leichten Kette: A, pSV184ΔHneo17- 1AVK-hCK; B, pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCγ3.
Abbildung 4 zeigt eine SDS/PAGE der ³&sup5;S-Methionin markierten chimären Immunoglobulin-Proteine der transfizierten Sp2/0 Zellinie SG3/5 und SG3/7.
Abbildung 5 zeigt die Hemmung der Bindung von 17-1A an SW1116 Zellen durch das chimäre Immunoglobulin SG3/5.
Abbildung 6 zeigt die Struktur des Vektors der chimären schweren Kette pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCµ.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die chimären Immunoglobuline dieser Erfindung bestehen aus einzelnen chimären schweren und leichten Immunoglobulin-Ketten. Die chimäre schwere Kette ist ein zusammenhängendes Polypeptid mit einer murinen variablen Region einer schweren Kette und einer menschlichen konstanten Region einer schweren Kette. Die chimäre leichte Kette ist ein zusammenhängendes Polypeptid mit einer murinen variablen Region einer leichten Kette und einer menschlichen konstanten Region einer leichten Kette.
Die Immunoglobuline können monovalent, divalent oder polyvalent sein. Monovalente Immunoglobuline sind Dimere (HL), die aus einer chimären schweren Kette, assoziiert (über Disulfidbrücken) mit einer chimären leichten Kette, gebildet werden. Divalente Immunoglobuline sind Tetramere (H&sub2;L&sub2;), die aus zwei assoziierten Dimeren gebildet werden. Polyvalente Immunoglobuline können beispielsweise durch Verwendung einer aggregierenden konstanten Region einer schweren Kette (z. B. konstante Regionen des mu-Typs) hergestellt werden.
Die konstante Region der schweren Kette kann aus den fünf Isotypen alpha, delta, epsilon, gamma oder mu beliebig gewählt werden. Ferner können verschiedene Unterklassen der schweren Ketten (wie beispielsweise die IgG Unterklassen) verwendet werden. Die unterschiedlichen Klassen und Unterklassen der schweren Ketten sind für die unterschiedlichen Effektor-Funktionen verantwortlich und folglich können chimäre Antikörper mit gewünschter Effektor-Funktion durch Auswahl der gewünschten konstanten Region der schweren Kette hergestellt werden. Bevorzugte konstante Regionen sind gamma 1 (IgG1) und gamma 3 (IgG3). Die konstante Region der leichten Kette kann die kappa oder lambda Kette sein.
Im allgemeinen werden chimäre Antikörper durch Herstellen, für jede der Komponenten des chimären Immunoglobulins der leichten und schweren Kette, eines fusionierten Gens hergestellt, das einen ersten DNS- Abschnitt umfaßt, der mindestens den funktionsfähigen Teil der murinen variablen Region codiert und mit einem zweiten DNS-Abschnitt verknüpft ist, der mindestens einen Teil einer menschlichen konstanten Region codiert. Jedes fusionierte Gen wird in einen Expressions-Vektor eingebaut oder inseriert. Empfängerzellen, die in der Lage sind, die Genprodukte zu exprimieren, werden dann mit den Genen transfiziert. Die transfizierten Empfängerzellen werden kultiviert und die exprimierten Immunoglobuline oder Immunoglobulin-Ketten werden wiedergewonnen.
Gene, die die variable Region der leichten und schweren Ketten des murinen Ig codieren, können aus Lymphoid-Zellen gewonnen werden, die die spezifischen Antikörper für das gewünschte Tumor-Antigen herstellen. Beispielsweise sind die Hybridomzellinien, die Antikörper gegen die Antigene 17-1A, OC125 oder beliebige andere Antigene herstellen, eine Quelle für Gene der variablen Region des Immunoglobulins gegen bestimmte tumorassoziierte Antigene. Weitere Nager-Zellinien sind erhältlich. Zellinien können durch wiederholtes Immunisieren eines Nagers mit einer Tumorzelle oder einer Tumor-Antigen enthaltenden Zellkomponente oder -fraktion, Bildung fusionierter Hybridzellen aus Antikörper produzierenden Zellen und einem Myelom, Klonierung des Hybrids und Selektion der Klone, die Antikörper gegen das tumorassoziierte Antigen produzieren, hergestellt werden. Siehe U.S. Patent, Nr. 4.172.124, Koprowski et al.
Konstante Regionen können aus humane Antikörper produzierenden Zellen mit Hilfe von Standardklonierungstechniken gewonnen werden. Weil Gene, die die zwei Klassen der leichten Ketten und die fünf Klassen der schweren Ketten repräsentieren, kloniert worden sind, sind alternativ konstante Regionen menschlichen Ursprungs aus diesen Klonen ohne weiteres verfügbar.
Vorzugsweise werden die fusionierten Gene, die die leichten und schweren chimären Ketten codieren, in zwei unterschiedliche Expressions-Vektoren eingebaut, die zur Cotransformation einer Empfängerzelle verwendet werden können. Jeder Vektor enthält zwei selektierbare Gene - ein Gen zur Selektion in einem bakteriellen System und ein Gen zur Selektion in einem eukaryontischen System - wobei jeder Vektor ein unterschiedliches Genpaar besitzt. Diese Vektoren erlauben Herstellung und Amplifikation der fusionierten Gene in bakteriellen Systemen und darauffolgende Cotransfektion eukaryontischer Zellen und Selektion der cotransfizierten Zellen. Beispiele für selektierbare Gene für das bakterielle System sind die Gene, die eine Ampicillin-Resistenz verleihen, und das Gen, das eine Chloramphenicol-Resistenz verleiht. Zwei selektierbare Gene zur Selektion eukaryontischer Transfektanten werden bevorzugt: (i) das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (gpt), und (ii) das Phosphotransferase-Gen aus Tn5 (neo genannt). Die Selektion mit gpt basiert auf der Fähigkeit des Enzyms, das von diesem Gen codiert wird, Xanthin als Substrat für die Purin-Nucleotidsynthese zu verwenden; wozu das analoge endogene Enzym nicht in der Lage ist. In einem Medium, das Xanthin und Mycophenolsäure enthält, die die Umsetzung von Inosinmonophosphat in Xanthinmonophosphat blockiert, können nur Zellen überleben, die das gpt Gen exprimieren. Das Produkt des neo Gens blockiert die Hemmung der Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen, die durch das Antibiotikum G418 und anderen Antibiotika dieser Klasse verursacht wird. Die beiden Selektionsverfahren können zur Selektion auf die Expression der Immunoglobulin-Kettengene, die in zwei verschiedenen DNS-Vektoren in eine eukaryontische Zelle eingeführt wurden, gleichzeitig oder nacheinander angewendet werden.
Die bevorzugte Empfängerzellinie ist eine Myelomzelle. Myelomzellen können Immunoglobuline, die von transfizierten Ig-Genen codiert werden, synthetisieren, zusammenbauen und sezernieren. Ferner besitzen Myelomzellen die Mechanismen zur Glycosylierung des Immunoglobulins. Eine besonders bevorzugte Empfängerzelle ist die nicht Ig-produzierende Myelomzelline Sp2/0. Die Zelle produziert nur Immunoglobuline, die von den transfizierten Immunoglobulin-Genen codiert werden. Myelomzellen können in Kultur oder im Peritoneum von Mäusen, hierbei kann das sezernierte Immunoglobulin aus der Ascitesflüssigkeit gewonnen werden, angezogen werden. Andere Lymphoid-Zellen, beispielsweise B-Lymphocyten oder Hybridomzellen, können als geeignete Empfängerzellen dienen.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Transfektion einer Lymphoid-Zelle mit Vektoren, die die Immunoglobulin codierenden Gene enthalten. Die Protoplastenfusion ist ein bevorzugtes Verfahren zur Einführung von DNS in Lymphoid-Zellen. In diesem Verfahren wird Lysozym verwendet, um die Zellwände der Bakterien zu entfernen, die das die chimären Ig-Gene enthaltende rekombinante Plasmid tragen. Die resultierenden Sphäroplasten werden mit Myelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglycol fusioniert. Nach der Protoplastenfusion werden die Transfektanten selektiert und isoliert. Eine weitere anwendbare Technik, um DNS in viele Zelltypen einzuführen, ist die Calciumphosphat-Präzipitation.
Die chimären Immunoglobulin-Gene können in nicht- Lymphoid-Zellen, wie beispielsweise Bakterien oder Hefe, exprimiert werden. Wenn die Gene in Bakterien exprimiert werden, sind die schweren und leichten Ketten des Immunoglobulins ein Teil der Einschlußkörperchen. Folglich müssen die Ketten isoliert und gereinigt werden und dann zu funktionsfähigen Immunoglobulin-Molekülen zusammengesetzt werden.
Ein funktionsfähiger chimärer Antikörper, der spezifisch für das mit Dickdarmkrebs und einigen anderen Krebsformen assoziierte Antigen 17-1A ist, wurde wie folgt hergestellt.
Genomische DNS-Abschnitte, die die V-Regionen der schweren und leichten Kette von 17-1A (IgG2a, leichte kappa Kette) codieren, wurden kloniert und dann mit DNS- Abschnitten verknüpft, die die menschlichen konstanten (Cγ&sub3;) und konstanten kappa (CK) γ3 Regionen codieren. Die rekombinanten Gene wurden dann in Maus-Myelomzellen transfiziert, wo die Ig-Proteine synthetisiert, zusammengebaut und sezerniert wurden. Um Sonden für die V- Regionen zu erhalten, wurde eine cDNS-Bibliothek für 17- 1A erstellt. RNS wurde extrahiert und mit Hilfe einer Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie wurde PolyA&spplus; RNS gewonnen. Mit PolyA&spplus; RNS als Matrize wurde eine doppelsträngige cDNS mit Hilfe von AMV reverser Transcriptase und E. coli DNS-Polymerase I synthetisiert. Die doppelsträngige cDNS wurde mit S1-Nuklease behandelt und mit Deoxycytidin-Resten verlängert und an zuvor mit PST I geschnittenem pUC8, der einen dG-Schwanz besaß, hybridisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli DH1 transformiert und die Kolonien mit Hilfe einer Maus CK- Sonde und einer Maus Cγ2a-Sonde durchmustert, um Klone mit der leichten beziehungsweise schweren Kette zu isolieren. Diese Klone wurden als Quelle für V-Region-Sonden verwendet.
Um das genomische DNS-Fragment, das das funktionsfähige rearrangierte Gen der leichten kappa Kette enthielt, zu isolieren, wurde eine genomische Bibliothek aus partiell mit Sau3A verdauter 17-1A DNS mit Hilfe von EMBL3A-Phagen-Armen erstellt. Insgesamt wurden 200.000 rekombinante Plaques mit einer Maus CK-Sonde durchmustert, und drei positive Klone wurden erhalten. Von einem dieser Klone, λK&sup4;, konnte mittels Restriktionskartierung und Southern-Analyse mit Hilfe der 17-1A k cDNS als Sonde gezeigt werden, daß er sowohl die V- als auch C-Regionen des rearrangierten funktionsfähigen Gens der leichten kappa Kette von 17-1A enthielt. Wenn das gleiche Verfahren mit einer Maus Cγ2a-Sonde und der schweren Kette V(VH)-Sonde, die aus dem cDNS-Klon stammte, wiederholt wurde, wurden keine positiven Klone gefunden, die sowohl V- als auch C-Regionen des Gens der schweren Ketten enthielten.
Ein anderes Verfahren wurde angewendet, um das VH- Gen zu klonieren. Fragmente, die die rearrangierten V- Gene der schweren Kette von 17-1A enthielten, wurden mittels Southern-Analyse als zusätzliche Banden identifiziert, wenn sie mit dem Muster des Fusionspartner NS-1 verglichen wurden. Wenn eine DNS-Probe aus den Zellen 17- 1A mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut wurde, wurde bei Verwendung einer Maus J-Region-Sonde der schweren Kette (JH), die J3 und J4 Sequenzen enthielt, zwei rearrangierte Fragmente mit 7,4 kb und 3,8 kb festgestellt. Die mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isolierten DNS-Fragmente mit 7 kb und 4 kb wurden mit λgtWES beziehungsweise λgt11 Phagen-Armen ligiert. Die rekombinanten Plaques dieser zwei Teil-Bibliotheken wurden mit einer Maus JH-Sonde durchmustert. Sowohl das 7,4 kb als auch das 3,8 kb EcoRI-Fragment wurde kloniert. Durch Restriktionskartierung und Southern-Analyse unter Verwendung der cDNS der schweren Kette von 17-1A als Sonde konnte gezeigt werden, daß das 7,4 kb Fragment das rearrangierte funktionsfähige VH-Gen enthielt.
Das VK-Gen wurde in einem 4 kb HindIII-Fragment aus dem genomischen Klon λK4 isoliert und mit den menschlichen CK-Sequenzen in dem Expressionsvektor pACYCSVneo verknüpft. Die Transcriptionsrichtung des K-Gens ist der des neo Gens entgegengesetzt. Das das VH-Gen enthaltende 7,4 kb EcoRI-Fragment wurde mit dem menschlichen Cγ&sub3;-Gen in dem Expressionsvektor pSV2gpt in der entgegengesetzten Transcriptionsrichtung von Ecogpt verknüpft. Da das pACYCSVneo Plasmid eine Chloramphenicol-Resistenz und das pSV2gpt Plasmid eine Ampicillin-Resistenz verleiht, ist es möglich, E. coli mit beiden Plasmiden zu transformieren und Zellen zu selektieren, die Resistenz-Phänotypen gegen beide Agentien zeigen. Um die Ig-Gene in Myelomzellen zu transferieren, wurden aus E. coli, die beide Plasmide enthielten, Protoplasten hergestellt und mit einer nichtproduzierenden Maus-Myelomzellinie Sp2/0 fusioniert. Nach der Protoplastenfusion wurden die transfizierten Zellen durch Behandlung mit G418 auf neo Genaktivität selektiert. Um die Synthese der Proteine der schweren und leichten Kette zu untersuchen, wurden die transfizierten Zellen mit ³&sup5;S-Methionin markiert, sowohl der Cytoplasmaextrakt als auch das sezernierte Material wurden mit einem an Sepharose gebundenen Ziege anti- Mensch K Antikörper immunopräzipitiert. Das präzipitierte Material wurde auf Phosphatpuffer haltigen SDS/Polyacrylamidgelen unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Aus 4x10&sup6; Zellen wurden sieben stabile Transformanten etabliert und analysiert. Zwei dieser Klone produzierten Proteine sowohl der schweren als auch leichten Kette, zwei produzierten nur Proteine der leichten Kette und drei produzierten keine detektierbaren Mengen an Ig- Proteinen. Der Klon SG3/5, einer der beiden Transformanten, die Proteine sowohl der schweren als auch der leichten Kette herstellten, produzierte eine Mischung aus H&sub2;L&sub2;, H&sub2;L und HL Molekülen. Die in das Kulturmedium sezernierten Hauptkomponenten waren die tetrameren H&sub2;L&sub2; Moleküle. Das chimäre H&sub2;L&sub2; Immunoglobulin zeigte die gleichen Antigen-Bindungseigenschaften wie der murine Antikörper 17-1A.
Chimäre Maus/Mensch-Antikörper, die spezifisch für mit krebsassoziierte Antigene sind, können in der Krebstherapie oder -diagnose eingesetzt werden. Die Antikörper können in einer Reihe unterschiedlicher Therapieverfahren eingesetzt werden. Bestimmte Antikörper sind in der Lage, spezifisch an Tumorzellen zu binden und diese abzutöten. Chimäre Antikörper mit variablen Regionen derartiger Antikörper können Patienten in anti-Tumor wirksamen Mengen zur Tumorbehandlung verabreicht werden. Die chimären Maus/Mensch Antikörper 17-1A können Patienten verabreicht werden, die an gastromtestinalen Tumoren, mit denen das 17-1A Antigen assoziiert ist, leiden.
Krebszellen sind heterogen und folglich kann ein einzelner monospezifischer chimärer Antikörper nicht in der Lage sein, alle Zellen eines Tumors zu erkennen. Folglich wäre es wünschenswert, mehrere chimäre Antikörper mit unterschiedlicher Antigenspezifität kombiniert zu verabreichen.
Die chimären Antikörper können zusammen mit anderen Antitumor-Mitteln eingesetzt werden. Zu diesem Zweck können die chimären Maus/Mensch-Antikörper mit bestimmten Therapeutika oder cytotoxischen Mitteln oder mit funktionsfähigen Domänen derartiger Proteine konjugiert werden.
Mit dieser Eigenschaft würden die Immunoglobuline spezifisch auf Krebszellen gerichtete Transportsmittel darstellen. Eine derartige Konjugation kann durch chemische Kopplung des Therapeutikums an den Antikörper erhalten werden. In Fällen wo das therapeutische Mittel proteinartig ist, kann die Konjugation durch Verknüpfung einer das Mittel codierenden DNS-Sequenz mit dem chimären Gen, das eine Antikörper-Kette (vorzugsweise die schwere Kette) codiert, ausgeführt werden, so daß die Antikörper- Kette und das Mittel als ein einziges zusammenhängendes Protein exprimiert werden, wo das Mittel über eine Peptidbindung an das Immunoglobulin gebunden ist. Auf diese Weise können Immunoglobulin- und nicht-Immunoglobulin- Teile enthaltende chimäre Immunoglobuline gebildet werden, wobei der nicht-Immunoglobulin-Teil ein ausgewähltes Therapeutikum, wie beispielsweise Interferon, oder ausgewählte cytotoxische Mittel, wie beispielsweise Tumor- Nekrose-Faktor, sein kann.
Die chimären Antikörper sind ebenfalls für diagnostische Techniken in vivo, wie beispielsweise der Immunszintigraphie, einsetzbar. Für diesen Zweck werden im allgemeinen Antikörper-Fragmente bevorzugt. Folglich kann ein chimäres Gen der schweren Kette in einer verkürzten Form konstruiert werden, um ein chimäres Fab Immunoglobulin-Fragment oder ein chimäres F(ab')&sub2;-ähnliches Molekül für die Tumordarstellung zu bilden. Diese Moleküle können direkt oder mittels eines gekoppelten Komplexbildners mit Radioisotopen, wie beispielsweise ¹³¹Iod, ¹²&sup5;Iod, &sup9;&sup9;mTechnetium oder ¹¹¹Indium, markiert werden, um radioimmunszintigraphische Mittel für die Tumordarstellung herzustellen. Alternativ kann eine Radiometallbindungs(Komplexierungs)-Domäne zur Markierung einer Stelle in dem chimären Antikörper konstruiert werden. Folglich kann ein chimäres Immunoglobulin als zusammenhängendes Protein konstruiert werden, das eine murine variable Region, eine menschliche konstante Region (vorzugsweise verkürzt) und eine metallbindende Domäne besitzt, die von einem Metall bindenden Protein, wie beispielsweise Metallothionin, stammt.
Die Erfindung wird durch die folgenden detaillierten Beispiele näher erläutert, wo die Herstellung des chimären Antikörpers mit den von 17-1A stammenden van ablen Regionen und menschlichen konstanten Regionen beschrieben wird.

BEISPIELE

Beispiel 1. Herstellung von chimärem 17-1A IgG3.

A. Material und Methoden

Konstruktion einer cDNS-Bibliothek

Cytoplasma RNS wurde aus 17-1A Zellen extrahiert und PolyA&spplus; RNS wurde mittels Oligo(dT)-Cellulose-Chromatögraphie hergestellt. Doppelsträngige cDNS wurde mit polyA&spplus; RNS als Matrize mit Hilfe AMV reverser Transcriptase und E. coli DNS-Polymerase 1 synthetisiert. Die doppelsträngige cDNS wurde mit S1-Nuclease behandelt und mit Deoxycytidin-Resten verlängert und an einen zuvor mit PstI geschnittenem pUC8, der einen dG-Schwanz besaß, hybridisiert. Curtis, P.J., (1983) J. Biol. Chem. 258:4459. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli DH1 transformiert, und die Kolonien nach der von Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual beschriebenen üblichen Methode durchmustert.

Konstruktion einer genomischen Bibliothek

Die genomische Bibliothek wurde im lambda Phagen- Vektor EMBL3A erstellt. Hochmolekulare DNS wurde unvollständig mit der Restriktionsendonuclease Sau3A verdaut und in einem 10-40% Sucrose-Dichtegradienten der Größe nach aufgetrennt. DNS-Fragmente mit einer Größe von 18-23 kb wurden mit den EMBL3A lambda-Armen ligiert und nach Hohn und Murray (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3259 verpackt. Die genomische Bibliothek wurde bei einer Dichte von 10.000 rekombinanten Plaques pro Petrischale (150 mm Durchmesser) durchmustert. Die Plaque-Hybridisierungen wurden in 5x SSC bei 65ºC 18 h durchgeführt. Das letzte Waschen wurde in 1,0x oder 0,5x SSC bei 65ºC durchgeführt.

Konstruktion einer Dartiellen genomischen Bibliothek

Hochmolekulare genomische DNS wurde vollständig mit Restriktionsendonuclease verdaut und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. DNS-Fragmente geeigneter Größe wurden isoliert und mit lambda Phagen-Armen ligiert. Die ligierte DNS wurde verpackt und rekombinante Plaques wurden, wie oben beschrieben, durchmustert.

DNS-Analyse

Genomische DNS wurde mit Restriktionsendonucleasen verdaut, mittels Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Siehe Maniatis et al. supra. Die Hybridisierungen wurden in 5x SSC und 50% Formamid 48 h bei 37ºC durchgeführt. Das letzte Waschen wurde in 0,5x SSC bei 65ºC durchgeführt.

DNS-Sonden

Die Maus γ2a-Sonde ist ein 4,9 kb EcoRI DNS- Fragment, das das Gen der konstanten Region γ2a enthält. Die Maus CK-Sonde ist ein genomisches 6 kb BglII DNS- Fragment, das die Sequenzen der konstanten Region der leichten k-Kette der Maus enthält. Die Maus J-(JH)-Sonde der schweren Kette ist ein 2 kb BamHI/EcoRI-Fragment, das sowohl das J3- als auch das J4-Segment enthält. ³²P-markierte Sonden wurden mit Hilfe von Kalbsthymus-Primern hergestellt. Summers, J. (1975) J. Virol 15:946. Freie Nucleotide wurden mittels Zentrifugation durch eine Sephadex G-75 Minisäule entfernt.

Gen-Transfer mittels Protoplastenfusion

Die Konstruktion von pSV184neo- und pSV2gpt-, die von Plasmiden stammen, die die Gene der chimären leichten und schweren Kette enthalten, wird unten beschrieben. E. coli HB101, der beide Plasmide enthielt, wurde in Anwesenheit von Ampicillin und Chloramphenicol angezogen. Die Plasmid-Kopienzahl wurde mit 100 µg/ml Spectinomycin amplifiziert. Protoplasten wurden präpariert und nach Oi, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825 mit Sp2/0 Maus-Myelomzellen fusioniert. Die Transformanten wurden in nach Dulbecco modifizierten Eagle-Medium selektiert, das 0,8 mg/ml Antibiotikum G418 enthielt, supplementiert mit 15% fötalen Kälberserum. Die Zellinie SG3/5 wurde in dem obigen Medium mit zusätzlich 50 µg/ml Xanthin, 4 µg/ml Hypoxanthin und 0,8 µg/ml Mycophenolsäure kultiviert.

Analyse von Ig mittels biosynthetischer Markierung und Immunopräzipitation.

Die Zellen wurden 3 h in Methionin-freiem RPMI 1640 Medium, das 25 µCi/ml ³&sup5;S-Methionin enthielt, markiert. Affinitätsgereinigter Ziege anti-Mensch leichte K Kette Antikörper (Southern Biotechnology Associated, Inc., Birmingham, AL) und Ziege anti-Mensch IgG Fc Antikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Avondale, PA) wurden zur Immunopräzipitation verwendet. Morrison, S.L. (1979) J. Immunol. 123:793. Sowohl cytoplasmatische als auch sezernierte Antikörper wurden auf einem 5%igen SDS/Polyacrylamidgel in Phosphatpuffer unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Matsuuchi, L. et al., (1981) Biochem. 20:4827. Das Gel wurde mit einem Autoradiographie-Verstärker, EN3HANCE (NEN Products Boston, MA) vor dem Runtertrocknen auf 3mm Filterpapier behandelt.

Quantitative Bestimmung der Antikörderproduktion.

Der Gewebekulturüberstand wurde auf IgG-Proteingehalt mittels Partikel-Konzentrations-Fluoreszenz- Immunoassay (Jolley, ME. et al., (1984) J. Immunol. Meth. 67:21) unter Verwendung einer mit gereinigtem IgG erstellten Eichkurve analysiert. Die Konzentration des MAb 17-1A wurde mit Hilfe von Ziege anti-Maus Antikörper beschichteten Polystyrol-Kügelchen und Fluoreszein konjugiertem anti-Maus Fab Antikörper bestimmt. Chimäre Antikörper mit menschlichen konstanten Regionen wurden mit Hilfe von Ziege anti-Mensch IgG Fc Antikörper beschichteten Polystyrol-Kügelchen und Fluoreszein konjugiertem anti-Mensch IgG Fc Antikörper bestimmt. Der Test wurde mit einem automatisierten Gerät (Pandex Laboratories, Inc., Mundelein, IL) durchgeführt.

Radioiodierung von MAb 17-1A.

MAb 17-1A wurde aus der Aszitesflüssigkeit mit Hilfe der Protein A-Sepharose Chromatographie gereinigt. Gebundenes IgG wurde mit einem Citratpuffer (pH 3,5) eluiert. Gereinigter MAb 17-1A wurde mit Hilfe von 1 mCi Na¹²&sup5;I mit 1,4 mM Chloramin-T markiert. Nach 3 min wurde die Reaktion mit einem Überschuß an Ascorbinsäure gestoppt. Freies Iodid wurde mit einer fertiggepackten PD- 10 Säule (Pharmacia) entfernt. Die spezifische Aktivität entsprach typischerweise 10.000 cpm/ng Protein.

Bindungsinhibitionstest.

Der Gewebekulturüberstand wurde mit einer Diaflo YM100 Ultrafiltrationsmembran (Amicon, Danvers, MA) aufkonzentriert. Monolayer Dickdarmkrebszellen wurden mit Trypsin behandelt und in Phosphat gepufferter Saline (PBS) gewaschen. Die Zellen (5x10&sup5;) wurden mit radioiodiertem 17-1A und den kompetitiven Antikörper enthaltenden Kulturüberstand in einem Endvolumen von 100 µl inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur 2 Stunden in einem Schüttler bei 140 rpm. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und Zell-gebundene Radioaktivität in einem gamma Zähler gemessen.

B. Ergebnisse

Isolierung und Sequenzierung der cDNS der leichten und schweren Kette von 17-1A.

Eine cDNS-Bibliothek für die 17-1a Zellen wurde mit Hilfe des Plasmid-Vektors pUC8 erstellt. Rekombinante Kolonien wurden mit einer Maus CK-Sonde und der Maus Cγ2a-Sonde durchmustert, um Klone der leichten beziehungsweise schweren Kette zu isolieren. Insgesamt wurden 7.500 Kolonien durchmustert, wovon annähernd 250 Kolonien CK-Sequenzen und 150 Kolonien Cγ2a-Sequenzen enthielten. Aus einigen dieser positiven Kolonien präparierte Plasmid-DNS wurde mit PstI verdaut, um die Größe der cDNS-Inserts zu vergleichen. Der Klon der leichten Kette, pMK-9, und der Klon der schweren Kette, pM-γ2a-1, wurden für die Nucleotid-Sequenzierung ausgewählt. Die Nucleotid-Sequenzen für die 5' Region, die das Leader-Peptid und die variable Region enthalten, und die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen werden in Abbildung 1A für pMK-9 und in Abbildung 1B für pMγ2a-1 gezeigt. (Aminosäurereste sind numeriert und die negativen Ziffern beziehen sich auf die Aminosäuren im Leader-Peptid). Eine spezifische variable Region (VL)-Sonde stammte von pMK-9 als ein BamHI/PvuI-Fragment, das die ersten 320 Nucleotide des Gens der leichten Kette (Abbildung 1A) enthielt. Die Sonden für die V-Region der schweren Kette enthielten zwei PstI-Fragmente: die 228 bp VH1- und die 132 bp VH2- Sonden, die mit den Nucleotiden 52 bis 280 beziehungsweise 281 bis 412 übereinstimmten (Abbildung 1B) . Diese Sonden für die V-Region wurden in nachfolgenden Experimenten zur Charakterisierung der genomischen DNS- Fragmente, die die funktionsfähigen rearrangierten Gene enthielten, verwendet.

Klonierung des genomischen DNS-Fragments das die funktionsfähigen rearrangierten Gene der leichten und schweren Kette von 17-1A enthält.

Eine genomische DNS-Bibliothek wurde für die 17-1A Zellen erstellt. Annähernd 200.000 lambda Phagen-Rekombinanten wurden mit der Maus CK-Sonde durchmustert. Drei positive Klone wurden erhalten. Von einem der Klone, λK4, wurde mittels Restriktionskartierung und Southern-Analyse unter Verwendung der von dem cDNS Klon pMK-9 stammenden VL-Sonde gezeigt, daß er die Sequenzen der variablen Region enthielt. Ein genomisches 4,2 kb HindIII-Fragment, das 1,5 kb der 5' flankierenden Region und die Sequenzen enthielt, die das Leader-Peptid und die V-Gene codierten, wurde in pUC 18 subkloniert und als pVK4,2H bezeichnet. Dieser Subklon wurde in der nachfolgenden Konstruktion des Gens der chimären Maus/Mensch leichten Kette verwendet.
Als die genomische 17-1A Bibliothek mit der Maus Cγ2a Sonde durchmustert wurde, wurden zwei positive Klone erhalten, aber keiner der beiden enthielt das variable (VH) Gen der schweren Kette des cDNS Klons pMγ2a-1. Ein alternativer Versuch wurde zur Klonierung des VH-Gens unternommen. Während eines Gen-Rearrangements, das zur Ig-Gen Expression erforderlich ist, wird das V-Gen immer mit dem geeigneten J-Segment verbunden. Die DNS-Sonde JH kann folglich zur Detektion der rearrangierten VH Gene verwendet werden. Abbildung 2 zeigt die Southern-Analyse der rearrangierten Fragmente, die die JH Sequenzen enthalten. (Zehn µg genomische DNS wurde mit EcoRI verdaut, auf 0,7% Agarose aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und die Filter mit der JH-Sonde der schweren Kette der Maus hybridisiert. Spur 1, Mäuseleber-DNS; Spur 2, P3, eine Maus Plasmacytom-Zellinie; Spur 3, 17-1A, eine Hybridomzellinie, die sich aus einer Fusion mit P3 als Partner ableitet. Die Pfeilspitze zeigt auf das rearrangierte Fragment, das die funktionsfähigen VH-Gene von 17- 1A enthält. Der schwarze Punkt markiert ein zusätzliches Rearrangement im Locus der schweren Kette).
Die DNS der 17-1A Zellen zeigte zusätzlich zu dem für den Fusionspartner P3 charakteristischen Bandenmuster zwei rearrangierte EcoRI-Fragmente mit 7,4 kb und 3,8 kb. Die P3 Zellen besaßen zwei rearrangierte VH-Gene, die beide bei 6 kb liefen. Eine der beiden Banden von 17-1A repräsentierte das funktionsfähige Rearrangement, während die andere das Produkt eines aberranten Gen-Rearrangements in dem Locus der schweren Kette war. Mit Hilfe der Maus JH-Sonde wurden beide Gene aus den genomischen Phagen-Bibliotheken, die mit angereicherten DNS-Fragmenten geeigneter Größe erstellt wurden, kloniert. Der Klon λVH 7,4E wurde aus einer λgtWES Bibliothek isoliert und das EcoRI Insert lief mit dem rearrangierten 7,4 kb Fragment wie in Abbildung 2 mit der Pfeilspitze markiert. Der Klon λVH3,BE wurde aus einer λgt11 Bibliothek isoliert, und sein EcoRI Insert lief mit der 3,8 kb Bande, wie in Abbildung 2 mit einem schwarzen Punkt markiert.
Um das genomische Gegenstück des funktionsfähigen Gens der schweren Kette zu identifizieren, wurde sowohl λVH7,4E als auch λVH3,8E mit PstI verdaut und mit den gemischten VH1 und VH2 Sonden hybridisiert, die aus dem cDNS-Klon pMγ2a-1 stammten. λVH7,4E enthielt zwei PSTI- Fragmente mit 300 bp und 130 bp. Da die VH1-Sonde Sequenzen enthielt, die für den genau stromaufwärts der Intron/Exon Grenze innerhalb des Leader-Peptids liegende Aminosäurerest -5 codierten, ließ der Unterschied zwischen dem längeren PstI-Fragment in dem genomischen Klon (200 bp) und jenem in dem cDNS Klon (228 bp) vermuten, daß die Größe des Introns zwischen dem Leader-Peptid und dem Gen der variablen Region 70 bp betrug. Klon λVH3,8E enthielt PstI-Fragmente unterschiedlicher Länge und kreuzhybridisierte nicht mit den VH1 und VH2 Sonden. Um weiter zu beweisen, daß λVH7,4E das genomische Gegenstück des cDNS-Klons pMγ2a-1 ist, wurde eine 24-mer Oligonucleotid-Sonde, die mit Nucleotid 352 bis 375 (Abbildung 1B) übereinstimmte, synthetisiert und festgestellt, daß sie spezifisch mit dem 130 bp PstI-Fragment von λVH7,4E hybridisierte (Daten nicht gezeigt). Dieses Oligomer enthielt Sequenzen, die für die CDR3 Region codierten und für dieses V-Gen charakteristisch sein sollten. λVH7,4E wurde zur Konstruktion des chimären Gens der schweren Maus/Mensch Kette verwendet.

Vektoren und Expressionssystem

Die aus den 17-1A Zellen klonierten V-Gene der leichten und schweren Kette wurden mit den menschlichen K und γ3 Genen der konstanten Region in den Expressionsvektoren pSV184 Hneo (Chang, A.C.Y., und S.N. Cohn, J. Bacteriol., (1978) 143:1141), beziehungsweise pSV2 Hgpt (Mulligan, R.C., und P. Berg., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:2072) verknüpft. Das pSV184ΔHneo-DNSVL-hCK- Plasmid wurde verwendet, wobei das Dansyl-spezifische Gen der leichten Kette und das menschliche K-Gen der konstanten Region in BamHI- und HindIII-Schnittstellen in pSV184 Hneo kloniert war. Zur Konstruktion des gewünschten chimären Gens wurde das das Dansyl-VL-Gen enthaltende HindIII-Fragment von pSV184ΔHneoDNSVL-hCK durch das 4,2 kb HindIII-Fragment ersetzt, das das rearrangierte funktionsfähige genomische Gen der leichten Kette von 17-1A aus dem Klon pVK4,2H enthielt. Für den Vektor der schweren Kette wurde das EcoRI-Fragment in dem pSV2ΔHgptDNSVH- hCγ3 Plasmid, das das Dansyl-spezifische VH-Gen enthielt, durch das 7,4 kb EcoRI-Fragment ersetzt, das das rearrangierte funktionsfähige Gen der schweren Kette von 17-1A aus dem Klon λVH7,4E enthielt. Das resultierende Plasmid wird als pSV2ΔHgpt171AVH-hCγ&sub3; bezeichnet. Die Struktur von pSV184ΔHneo17-1AVK-hCK wird in Abbildung 3A gezeigt und die Struktur von pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCγ&sub3; in Abbildung 3B. (Immunoglobulin-DNS ist mit dicken Linien dargestellt und die Exons sind mit schwarzen Kästchen dargestellt. Vektor-Sequenzen sind als dünne Linien dargestellt. Die Transcriptionsrichtung der neo und gpt Gene ist wie angegeben. Die Bereiche der DNS-Sequenzen werden mit horizontalen Doppelpfeilen mit zwei Spitzen angegeben. L, Leader-Exon; V, VJ oder VDJ Exon; C, Exon der konstanten Region; H, Hinge Exon; 1, 2 und 3 Exons, die weitere Domänen des Gens der schweren Kette codieren. Abkürzungen der Restriktionsendonucleasen: E, EcoRI B, BamI; H, HindIII).
Die in Abbildung 3 gezeigten Vektoren der leichten und schweren Kette wurden verwendet, um Maus-Myelomzellen zu transfizieren. Das pACYC184 Plasmid verleiht eine Chloramphenicol-Resistenz und das pBR Plasmid verleiht eine Ampicillin-Resistenz. Es ist deshalb möglich, E. coli mit beiden Plasmiden der leichten und schweren Kette zu transformieren und Zellen zu selektieren, die Resistenz-Phänotypen gegen beide Agentien zeigen. Um die chimären Gene in Maus-Myelomzellen zu transfizieren, wurden aus E. coli, die beide Plasmide enthielten, Protoplasten hergestellt und mit einer nicht-produzierenden Maus-Myelomzellinie Sp2/0 fusioniert. Nach der Protoplastenfusion wurden die transfizierten Zellen zuerst nur auf die neo Genaktivität mit G418 selektiert. Die stabilen Transformanten-Linien wurden anschließend in ein Medium, das sowohl G418 als auch Mycophenolsäure enthielt, überführt.

Analyse der chimären Antikörperproduktion.

Um die Synthese der Proteine der leichten und schweren Kette zu untersuchen, wurden die transfizierten Zellen 3 Stunden mit ³&sup5;S-Methionin markiert, danach wurde sowohl der Cytoplasma-Extrakt als auch das sezernierte Material mit einem an Sepharose gebundenen Ziege anti- Mensch K Antikörper immunopräzipitiert. Das präzipitierte Material wurde auf Phosphatpuffer haltigen 5% SDS/Polyacrylamidgelen unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Matsuuchi L et al. 1981 Biochem 20:4827. Von 4x10&sup6; Zellen wurden sieben stabile Transformanten etabliert und analysiert. Zwei dieser Klone produzierten sowohl Proteine der schweren als auch der leichten Kette, zwei produzierten nur Proteine der leichten Kette und drei produzierten keine detektierbaren Mengen an Immunoglobulin-Proteinen. Abbildung 4 zeigt das Ergebnis eines Biosynthese-Markierungsexperiments der Zellinie SG3/5, die sowohl Proteine der schweren als auch der leichten Kette produzierte. (c, Cytoplasma; s, sezerniert. Die Positionen des tetrameren H&sub2;L&sub2; Proteins und des Proteins der leichten Kette (L) sind gekennzeichnet.) Eine Molekülmischung aus schwerer und leichter Kette wurde im Zellextrakt detektiert; jedoch waren die in das Kulturmedium sezernierten Hauptkomponenten die tetrameren Moleküle H&sub2;L&sub2;. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung der an Sepharose gebundenen anti-Mensch IgG Fc Antikörper für die Immunopräzipitationen erhalten. Die SG3/7 Zellen, die ebenfalls eine Resistenz sowohl gegen G418 als auch Mycophenolsäure zeigten, produzierten und sezernierten nur die Proteine der leichten Kette.

Untersuchung des chimären Antikörpers.

Die Menge der von den SG3/5 Zellen sezernierten Antikörper wurde mittels Partikel-Konzentrations- Fluoreszenz-Immunoassay auf 20 µg/ml geschätzt. Der Kulturüberstand wurde als Quelle für chimären SG3/5 MAb ohne weitere Aufreinigung verwendet. Mit einem Bindungs- Inhibitionstest wurde gezeigt, daß der chimäre SG3/5 MAb an das gleiche Oberflächen-Antigen der Dickdarmkrebszeilen SW1116 wie MAb17-1A band. Wie in Abbildung 5 gezeigt, waren die Bindungskurven von radioiodierten 17- 1A und SG3/5 mehr oder weniger übereinstimmend. Dies zeigte, daß die unterschiedlichen konstanten Regionen von MAb 17-1A und SG3/5 nur einen geringen Effekt auf die Antigen-Bindungseigenschaften dieser beiden Antikörper besitzen.

Beispiel 2. Herstellung chimärer IgG1, 2 und 4.

Der DNS-Abschnitt, der die variable Region der schweren Kette des Maus MAb 17-1A codiert, wurde mit den menschlichen konstanten Regionen γ1, γ2 und γ4 verknüpft. Die resultierenden Gene der schweren Kette wurden mit dem chimären Gen der leichten Kette in Sp2/0 Zellen cotransfiziert (Abbildung 3B) , um stabile (γ1,κ) , (γ2,κ) und (γ4,κ) Antikörper sezernierende Zellinien herzustellen. Alle diese chimären Antikörper haben gezeigt, daß sie die gleichen Tumor-Antigen-Bindungsspezifität wie der murine MAb 17-1A beibehalten.

Beispiel 3. Herstellung von chimärem 17-1A IgM.

Das chimäre µ Konstrukt (pSV2ΔHgpt17-1A-VH-hCµ) wird in Abbildung 6 gezeigt. Dieses Genkonstrukt wurde zusammen mit dem chimären K Genkonstrukt der leichten Kette von 17-1A (Abb. 3A) in die nichtproduzierenden Maus Sp2/0 Myelomzellen transfiziert. Eine stabile Zellinie, die den chimären Ig (µ,κ) Antikörper produzierte, wurde etabliert. Sezernierte Antikörper wurden mit einer anti- Mensch IgM Affinitätssäule gereinigt. Das gereinigte IgM besaß ein ähnliches HPLC-Profil wie die Kontrolle, ein menschliches pentameres IgM, wobei 99% des Materials unterhalb eines Peaks waren. Das gereinigte chimäre IgM wurde verwendet, um die Bindungsaktivität und die Komplement-abhängige Cytotoxizität zu überprüfen.

Kompetitive Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I 17-1A an die Zellinie HT-29 durch chimäres 17-1A IgG&sub1; und IgM.

¹²&sup5;I-markierter nativer 17-1A wurde mit adhärenten HT-29 Dickdarmkrebszellen in verschiedenen Konzentrationen mit oder ohne kompetitiven nichtradioaktiven chimären 17-1A IgG1 und IgM 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Zell-gebundene Radioaktivität wurde bestimmt. Die Hemmkurve für jede kompetitive Immunoglobulin-Präparation wurde aufgezeichnet und die Konzentration, die eine 50%ige Hemmung verursacht (I&sub5;&sub0;), bestimmt. Tabelle 1

Komplement-abhängige Cytotoxizität von Tumor- und Normalzellinien vermittelt durch chimäres 17-1A IgG&sub1; und IgM.

Komplement-abhängige Cytotoxizität wurde mit Hilfe eines 45 minütigen Radiomarkierungsfreisetzungstests mit Antikörper beschichteten Zielzellen, die in einer Kaninchen-Komplement-Verdünnungsreihe inkubiert wurden, abgeschätzt. Die in dem Test verwendeten Zielzellen waren die menschlichen Dickdarmkrebslinien SW1116, HT-29 und SW948; die menschliche Brustkrebslinien BT-20 und ZR75-1; menschliche Ovarialkarzinom OVCAR3; menschliche embryonale Niere (HEK); und menschlicher embryonaler Darm (HEI). Tabelle 2 Tabelle 3

Beispiel 4. In vitro und in vivo Untersuchungen, die die Anti-Tumoraktivität der chimären 17-1A Antikörper zeigen.

A. In Vitro Untersuchungen

Das isolierte chimäre Genprodukt G1K 17-1A wurde biologisch getestet in 1) Antikörper abhängigen Zell-vermittelten Cytotoxizitätstests (ADCC) und 2) Bindungstests mit HT-29 Zellen (eine das Antigen 17-1A exprimierende Dickdarmkrebszellinie) und teilweise gereinigtem 17-1A Antigen. Methoden für diese Untersuchungen werden detailliert von Shaw, D.R. et al. J. Immunol., Juni 1987; Levy, P.C. et al. J. Immunol. 123(2) :594(1979); und Ross, A.H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 135(1) :297 (1986) dargestellt. In den ADCC und kompetitiven Bindungstests mit HT-29 Zellen wurden chimäre G1K 17-1A zusammen mit dem nativen murinen 17-1A IgG und 3 zusätzlichen unten aufgeführten chimären Isotypen getestet; Kaninchen anti-CEM* wurde als polyklonale Kontrolle verwendet. In den kompetitiven Bindungstests, bei denen partiell gereinigtes 17-1A Antigen verwendet wurde, wurde chimäres G1K 17- 1A mit dem nativen murinen 17-1A IgG verglichen.
Die Daten für Monocyten- und Lymphocyten-ADCC Tests wurden aus vier getrennten Experimenten mit Hilfe von Monocyten und Lymphocyten aus vier verschiedenen gesunden erwachsenen Spendern erhalten. Die mittlere Spontanfreisetzung +/- Standardabweichung betrug 18,7 +/- 2,8% des gesamten Zielzellen &sup5;¹Cr (N=28).
Der Monocyten ADCC Test wurde bei Effektor:Ziel (E:Z) Verhältnissen von 25:1, 10:1 und 3:1 durchgeführt. Die durchschnittliche Lyse in % (+/- Standardabweichung) für das jeweilige Testmaterial mit den angegebenen E:Z Verhältnissen ist unten angeführt. Tabelle 4
*Polyklonale Kaninchen anti-Sera gegen eine T-Zell Lymphoblastoid-Zellinie.
In dem Monocyten ADCC Test war die Lyse in % mit chimärem G1K 17-1A IgG vergleichbar mit der Lyse, die mit murinem 17-1A beobachtet wurde.
Der Lymphocyten ADCC Test wurde bei E:Z Verhältnissen von 100:1, 30:1 und 10:1 durchgeführt. Die durchschnittlichen Lysewerte in % (+/- Standardabweichung) sind unten angeführt. Tabelle 5
In dem Lymphocyten ADCC Test war die Lyse in % mit chimärem G1K 17-1A IgG vergleichbar mit der Lyse, die mit 17-1A beobachtet wurde.
In dem Bindungstest, bei dem intakte HT-29 Zellen verwendet wurden, wurden die Zellen mit dem Test-Antikörper beschichtet. Zur Mengenbestimmung von 17-1A und Kaninchen anti-CEM wurde ¹²&sup5;I-Protein A verwendet; zur Mengenbestimmung der chimären Antikörper wurde ¹²&sup5;I-anti- Mensch IgG(Fc) verwendet. Die Meßwerte von an Tumorzellen gebundenem IgG sind unten aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen einen Mittelwert (+/- Sx, Standardabweichung des Mittelwerts) aus vier oder fünf separaten Versuchen. Tabelle 6
Die Bindung an die HT-29 Zellen war vergleichbar mit dem G1K 17-1A chimären IgG und murinen 17-1A.
In dem kompetitiven Bindungstest, bei Verwendung von partiell gereinigtem 17-1A Antigen, wurden die Mikrotiterplatten mit partiell gereinigtem 17-1A Antigen (aus SW116 Zellen isoliert) 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Unspezifische Bindungsstellen der Vertiefungen wurden mit PBS + 1% BSA eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert und mit PBS gewaschen. ¹²&sup5;I-markierter muriner 17-1A und der kompetitive Antikörper (nichtradioaktiver muriner 17-1A oder chimäres G1K 17-1A IgG) wurden in den Vertiefungen bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Vertiefungen wurden 3 mal mit PES gewaschen und in einem gamma Zähler gemessen. Die 50% Bindungswerte für chimären G1K 17-1A und murinen 17-1A lagen bei 0,30 µg/ml beziehungsweise 0,16 µl/ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Antikörper-Bindung des chimären G1K 17-1A IgG mit murinem 17-1A vergleichbar ist.
Zusätzlich zu den obigen in vitro Untersuchungen wurden in vitro immunhistopathologische-Untersuchungen mit G1K 17-1A und murinern 17-1A mit verschiedenen menschlichen Tumorgeweben mit Hilfe der Immunfluoreszenz- Technik durchgeführt. Von murinern 17-1A (24µg/ml) und chimärern G1K 17-1A IgG (96 µg/ml) wurde gezeigt, daß sie mit 4 von 4 untersuchten Dickdarmtumorproben reagierten. Weitere untersuchte Tumorzellen umfaßten Pankreaskrebs, Lungenkrebs (Adeno- und Bronchien-), Brustfibroadenoma und -karzinom, Magenkrebs, Melanom, Hepatom und Ovarialkarzinom. Muriner 17-1A reagierte mit Lungenkrebs (Bronchien), Magenkrebs, Melanom und Ovarialkarzinom. Chimäres G1K 17-1A IgG reagierte mit keiner der untersuchten Tumorproben außer Dickdarmtumoren.

B. In vivo Untersuchungen

Hemmversuche des Tumorwachstums in Nacktmäusen haben gezeigt, daß chimärer G1K 17-1A bei Hemmung der Tumorvergrößerung wirksam ist. Die Untersuchungen der Tumorinhibition in Nacktmäusen wurden bei 6 bis 8 Wochen alten Nacktmäusen (Nu/Nu Balb C genetischer Hintergrund) mittels zuvor beschriebener Verfahren (Herlyn, D.M. et al., Cancer Res. 40:717 (1980) durchgeführt. Den Mäusen (5/Gruppe) wurden 5x10&sup6; SW948 (Dickdarmtumorzellen) subkutan in das Genick injiziert und dann wurde 5 Tagesdosen 100 µg murinen 17-1A oder eines der 4 chimären Isotypen (einschließlich G1K 17-1A) oder eines Kontroll anti- Influenza Antikörpers (H24B5) intraperitoneal injiziert. Die Tumorgröße wurde wöchentlich 6 Wochen mittels externer Messung kontrolliert. Die Tumorvolumina des einzelnen Tieres sowie die Gruppendurchschnittswerte für jedes Meßintervall werden in Tabelle 7 auf der folgenden Seite gezeigt. Der relative Reihenfolge der Tumor-Inhibition war 17-1A, G4K, G1K. Die chimären Antikörper G3K und G2K waren bei der getesten Dosismenge nicht wirksam.

Tabelle 7

Das Tumorvolumen (CM³) in Nacktmäusen (5 Tiere/- Gruppe) nach subkutaner Injektion von 5x10&sup6; SW948 mit nachfolgenden 5 täglichen intraperitonealen Injektionen von 100 µg murinen 17-1A, vier chimären Antikörpern von 17-1A oder H24B5 (negative Kontrolle). Tag nach Dosigabe

Claims

1. Ein chimäres Murin/Mensch-Immunoglobulin oder ein chimäres Fragment davon, das eine von einem murinen (z.B. Maus) Antikörper stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen ist und mindestens mit einem Teil einer konstanten Region menschlichen Ursprungs verknüpft ist, wobei das chimäre Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment eine Bindungsspezifität für besagtes Antigen beibehält.

2. Ein chimäres Immunoglobulin, das umfaßt:

a) mindestens eine chimäre schwere Kette, die eine von der schweren Kette eines murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen ist, verknüpft mit einer menschlichen konstanten Region der schweren Kette (z. B. des gamma Typs) und assoziiert damit:

b) mindestens eine chimäre leichte Kette, die eine von einer leichten Kette des murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die mit einer menschlichen konstanten Region der leichten Kette verknüpft ist, wobei das chimäre Immunoglobulin eine Bindungsspezifität für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen beibehält.

3. Ein chimäres Immunoglobulin, das umfaßt:

b) mindestens eine chimäre leichte Kette, die eine von einer leichten Kette des murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die mit einer menschlichen konstanten Region der leichten Kette verknüpft ist, und

c) ein Nicht-Immunoglobulin-Protein oder Peptid (besagtes Protein oder Peptid ist beispielsweise ein therapeutisches Mittel gegen Krebs, ein cytotoxisches Mittel, ein metallbindendes Mittel oder eine funktionale Domäne davon), das mit mindestens einer der menschlichen konstanten Regionen verknüpft ist, wobei das chimäre Immunoglobulin eine Bindungsspezifität für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen beibehält.

4. Ein chimäres Fab, Fab' oder F(ab')&sub2; Immunoglobulin-Fragment, das umfaßt:

a) Antigen-Bindungsregionen murinen Ursprungs, die spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen sind, und

b) eine menschliche konstante Region, wobei das chimäre Immunoglobulin eine Bindungsspezifität für besagtes Antigen beibehält.

5. Ein Reagenz zur Tumor-Szintigraphie, das das chimäre Immunoglobulin-Fragment gemäß Anspruch 4 umfaßt und mit einem Radioisotop markiert ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus ¹³¹Jod, ¹²&sup5;Jod, &sup9;&sup9;mTechnetium und ¹¹¹Indium besteht.

6. Ein chimäres Immunoglobulin-Fragment gemäß Anspruch 4, das außerdem umfaßt:

c) ein metallbindendes Protein (z. B. Metallothionein) oder eine mit der konstanten Region verknüpfte Protein-Domäne.

7. Ein fusioniertes Gen, das ein chimäres Murin/Mensch-Immunoglobulin codiert, das spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen ist, das umfaßt:

a) eine erste DNS-Sequenz, die mindestens den funktionalen Teil einer variablen Region einer murinen Immunoglobulin-Kette codiert und verknüpft damit:

b) eine zweite DNS-Sequenz, die mindestens einen Teil einer konstanten Region eines menschlichen Immunoglobulins codiert.

8. Ein fusioniertes Gen gemäß Anspruch 7, das außerdem umfaßt:

c) eine dritte DNS-Sequenz, die ein Nicht-Immunoglobulin-Protein oder Peptid (besagtes Protein oder Peptid ist beispielsweise ein therapeutisches Mittel gegen Krebs, ein cytotoxisches Mittel, ein metallbindendes Mittel oder eine funktionale Domäne davon) codiert, wobei die Sequenz mit dem 3' Ende der zweiten DNS-Sequenz verknüpft ist.

9. Ein chimäres Immunoglobulin oder Immunoglobulin- Fragment gemäß Anspruch 1 oder ein Fragment gemäß Anspruch 4 zur Verwendung in Therapie oder Diagnose.

10. Ein chimäres Immunoglobulin gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in der Immuntherapie eines gastrointestinalen Tumors.

11. Ein chimäres Immunoglobulin zur Tumor-Immuntherapie, das umfaßt:

a) mindestens eine chimäre schwere Kette, die eine von der schweren Kette eines murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die spezifisch für das von dem murinen monoklonalen Antikörper 17-1A definierte Antigen ist, verknüpft mit einer konstanten Region der menschlichen schweren Kette und assoziiert damit:

b) mindestens eine chimäre leichte Kette, die eine von einer leichten Kette eines murinen Antikörpers stammende Antigen-Bindungsregion aufweist, die mit einer konstanten Region der menschlichen leichten Kette verknüpft ist; und

c) ein Antitumor-Therapeutikum oder cytotoxisches Mittel, das mit mindestens einer der konstanten Regionen verknüpft ist.

12. Verwendung eines chimären Immunoglobulins oder Immunoglobulin-Fragments gemäß Anspruch 1, eines Fragments gemäß Anspruch 4 oder eines fusionierten Gens gemäß Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments oder diagnostischen Mittels, z. B. zur Tumor-Immuntherapie oder Tumor-Diagnose.