DE3751004T2

DE3751004T2 - Chimärer Antikörper mit Spezifität für menschliches Tumor-Antigen.

Info

Publication number: DE3751004T2
Application number: DE3751004T
Authority: DE
Inventors: Ingegerd Hellstrom; Karl Erik Hellstrom; Alvin Y Liu; Randy R Robinson
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1986-10-27
Filing date: 1987-10-27
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2007-10-28
Also published as: EP0266663B1; IL84285A0; JPH02501886A; OA09115A; FI891984A; AU8326187A; IE872880L; ATE117370T1; HU209154B; GR3015810T3; IE62304B1; DE3751004D1; AU656633B2; PT85995A; WO1988003145A1; ZA878044B; IL84285A; HUT52153A; EP0266663A1; NZ222309A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen chimären Antikörper, der für das humane Tumorantigen L6 spezifisch ist, einen immobilisierten chimären Antikörper und ein chimäres Antikörperkonjugat. Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung der Zell-Zell-Fusion zum Erzeugen monoklonaler Antikörper durch Köhler und Milstein (Nature (London), 256: 495, 1975) bedeutete eine Revolution für die Biologie, die hinsichtlich ihrer Auswirkungen der Erfindung der rekombinanten DNA- Klonierung gleichwertig ist. Von Hybridomen erzeugte monoklonale Antikörper werden bereits weithin für klinische und grundlegende wissenschaftliche Untersuchungen verwendet. Die Anwendung humaner monoklonaler, von B-Zellhybridomen erzeugter Antikörper ist für die Behandlung von Krebs, viralen und mikrobiellen Infektionen, B-Zell-Immundefizienzen mit verringerter Antikörpererzeugung und anderen Erkrankungen und Störungen des Immunsystemes sehr vielversprechend.
Unglücklicherweise gibt es bei der Entwicklung humaner monoklonaler Antikörper eine Reihe von Hindernissen. Dies trifft insbesondere für den Versuch zu, monoklonale Antikörper, die humane Tumorantigene definieren, für die Diagnose und Behandlung von Krebs zu entwickeln. Viele dieser Tumorantigene werden vom humanen Immunsystem nicht als fremde Antigene erkannt; daher sind diese Antigene möglicherweise im Menschen nicht immunogen. Im Gegensatz dazu können diese humanen Tumorantigene, die in Mäusen immunogen sind, für die Erzeugung von monoklonalen Maus-Antikörpern verwendet werden, die das humane Antigen spezifisch erkennen und in Menschen therapeutisch verwendet werden können. Die wiederholte Injektion von "fremden" Antikörpern, beispielsweise Maus-Antikörpern in Menschen, kann jedoch zu nachteiligen
Hypersensitivitätsreaktionen sowie einer erhöhten Clearence-Rate der zirkulierenden Antikörpermoleküle führen, so daß die Antikörper ihre Zielstelle nicht erreichen.
Ein weiteres Problem, dem sich die Immunologen gegenübersehen, ist es, daß die meisten in Zellkultur erhaltenen humanen monoklonalen Antikörper vom Typ IgM sind. Wenn es jedoch erwünscht ist, humane monoklonale Antikörper vom Typ IgG zu erhalten, ist es notwendig gewesen, Verfahren wie die Zellsortierung zu verwenden, um die wenigen Zellen, die Antikörper vom Typ IgG oder von einem anderen Typ produzieren, in der Überzahl von Zellen, die Antikörper vom Typ IgM produzieren, zu identifizieren und so daraus zu isolieren. Es besteht daher ein Bedarffür ein effizientes Verfahren zum Wechsel der Antikörperklassen für jeden gegebenen Antikörper einer vorbestimmten oder gewünschten Antigenspezifität.
Die vorliegende Erfindung verbindet die Hybridomtechnologie und die Technologie der genetischen Manipulation, um ein schnelles und effizientes Verfahren sowie die davon abgeleiteten erhaltenen Produkte für die Erzeugung eines chimären humanen/nichthumanen Antikörpers bereitzustellen.
Die erfindungsgemäßen chimären Antikörper verkörpern eine Kombination der vorteilhaften Eigenschaften von monoklonalen Antikörpern, die aus Maus-Maus-Hybridomen abgeleitet sind, und von humanen monoklonalen Antikörpern. Die chimären monoklonalen Antikörper können, wie monoklonale Maus-Antikörper, ein humanes Ziel-Antigen erkennen und binden; jedoch verhindert im Unterschied zur Situation bei monoklonalen Maus-Antikörpern die Spezies-spezifischen Eigenschaften der chimären Antikörper die Induktion nachteiliger Hypersensitivitätsreaktionen und erlauben eine Beständigkeit gegenüber der Clearance, wenn sie in vivo im Menschen verwendet werden. Darüber hinaus kann bei Verwendung der in der Beschreibung offenbarten Verfahren einer bestimmten Antigen-Bindungsstelle jeder gewünschte Antikörper-Isotyp verliehen werden.
Angaben zum Stand der Technik (Information Disclosure Statement*)
Versuche zum Problem der Erzeugung chimärer Antikörper sind von verschiedenen Autoren publiziert worden.
Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851- 6855 (November 1984), beschreiben die Erzeugung eines Maus- Human-Antikörpermoleküles mit def inierter Antigenbindungsspezifität, das durch Verbinden der Gene für die variable Region einer Maus-Antikörper-erzeugenden Myelomzellinie mit bekannter Antigenbindungsspezifität mit den Immunglobulingenen für eine konstante Humanregion unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren erzeugt wurde. Es wurden chimäre Gene konstruiert, in denen das Exon der variablen Region der schweren Kette aus der Myelomzellinie S107 mit den Exons der konstanten Region der humanen schweren IgG1- oder IgG2-Kette verbunden waren, und das Exon der variablen Region der leichten Kette aus dem gleichen Myelom mit dem Exon der humanen leichten κ-Kette. Diese Gene wurden in Maus-Myelom-zellinien transfiziert. Auf diese Weise werden transformierte Zellen, die chimäre Maus-Human-anti-Phosphocholin- Antikörper erzeugten, entwickelt.
Morrison, S.L., et al., europäische Patentveröffentlichung Nr. 173494 (offengelegt am 5. März 1986), offenbaren chimäre "Rezeptoren" (z.B. Antikörper) mit variablen Regionen, die von einer Spezies abgeleitet sind, und von einer anderen Spezies abgeleiteten konstanten Regionen. Es wird erwähnt, daß zur Konstruktion dieser Gene cDNA-Klonierung verwendet worden ist, obwohl keine Einzelheiten der cDNA-Klonierung oder des Primings gezeigt sind (siehe Seiten 5, 7 und 8). ------------
*Zur Beachtung: Das vorliegende Information Disclosure Statement entspricht der Vorschrift 37 C.F.R. 1.97(b). Die Anmelder behalten sich darüber hinaus das Recht vor, nachzuweisen, daß ihre Erfindung vor einer oder mehrerer der erwähnten Publikationen gemacht worden ist.
Boulianne, G.L., et al., Nature, 312: 643 (13. Dezember 1984) erzeugten ebenfalls Antikörper, die aus mit konstanten Humanregionen verbundenen variablen Mausregionen bestanden. Sie konstruierten Immunglobulingene, in denen die DNA-Segmente, die für variable Mausregionen kodieren, die für das Hapten Trinitrophenyl (TNP) spezifisch sind, mit Segmenten verbunden waren, die für die konstanten u-und κ-Humanregionen kodieren. Diese chimären Gene wurden als funktionelle TNP-bindende chimäre IgM exprimiert.
Für einen Kommentar zur Arbeit von Boulianne et al. und Morrison et al. siehe Munro, Nature, 312: 597 (13. Dezember 1984), Dickson, Genetic Engineering News, 5 Nr. 3 (März 1985), oder Marx, Science, 229: 455 (August 1985).
Neuberger, M.S., et al., Nature, 314: 268 (25. März 1985), konstruierten ebenfalls ein chimäres Immunglobulingen für eine schwere Kette, in dem ein DNA-Segment, das für eine für das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl (NP) spezifische variable Mausregion kodiert, an ein für die &epsi;-Humanregion kodierendes Segment gebunden war. Wenn dieses chimäre Gen in die Zellinie J558L transfiziert wurde, wurde ein Antikörper erzeugt, der an das NP- Hapten band und die Eigenschaften von Human-IgE hatte.
Neuberger, M.S., et al., haben weiter Arbeiten publiziert, die die Herstellung von Zellinien zeigen, die Hapten-spezifische Antikörper ausscheiden, in denen der Fc-Teil entweder durch eine aktive Enzymgruppe (Williams, G. und Neuberger, M.S., Gene, 43:319, 1986) oder durch ein Polypeptid, das antigene c-myc- Determinanten aufweist (Nature, 312:604, 1984), ersetzt worden war.
Neuberger, M., et al., PCT-Veröffentlichung WO 86/01533 (veröffentlicht am 13. März 1986), offenbaren weiter die Erzeugungvon chimären Antikörpern (siehe Seite 5) und schlagen unter den vielen Verwendungen des Verfahrens das Konzept des "class switching" (Klassenumstellung) vor (siehe Seite 6). Taniguchi, M., offenbart in der europäischen Patentanmeldung Nr. 171 496 (veröffentlicht am 19. Februar 1985) die Erzeugung von chimären Antikörpern mit von Versuchstieren abgeleiteten variablen Regionen mit Tumorspezifität und vom Menschen abgeleiteten konstanten Regionen. Die korrespondierenden Gene für schwere und leichte Ketten werden in genomischer Form erzeugt und in Säugerzellen exprimiert.
EP-A-0184187 bezieht sich auf eine schwere chimäre Maus-Human- Immunglobulinkette, umfassend die Aminosäureseguenz der variablen Region einer schweren Maus-Immunglobulinkette, wobei das Immunglobulin spezifisch mit einem humanen Leukämie-Antigen reagiert.
Takeda, S., et al., Nature, 314: 452 (4. April 1985), haben ein mögliches Verfahren für die Konstruktion chimärer Immunglobulingene beschrieben, in denen die Intronseguenzen durch die Verwendung eines Retrovirus-Vektors entfernt werden. Eine unerwartete Spleiß-Donor-Stelle verursachte jedoch die Deletion der Leitsequenz (leader seguence> der V-Region. Dieser Ansatz führte daher nicht zu vollständigen chimären Antikörpermolekülen.
Cabilly, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. . USA, 81: 3272-3277 (Juni 1984), beschreiben Plasmide, die die Synthese von schweren und/oder leichten Ketten eines Antikörpers gegen das carcinoembryonale Antigen (CEA) in E. coli steuern. Ein weiteres Plasmid wurde für die Expression einer verstümmelten Form eines Fragmentes der schweren Kette (Fd') in E. coli konstruiert. Durch in vitro-Rekonstitution eines Teiles der schweren Kette mit leichter Kette wurde in E. coli-Extrakten eine funktionelle CEA- Bindungsaktivität erhalten.
Cabilly, S., et al., europäische Patentveröffentlichung 125023 (offengelegt am 14. November 1984) beschreiben chimäre Immunglobulingene und ihre mutmaßlichen Produkte sowie andere modifizierte Formen. Auf den Seiten 2l, 28 und 31 werden die cDNA- Klonierung und das Priming diskutiert.
Boss, M.A., europäische Patentanmeldung 120694 (offengelegt am 3. Oktober 1984) , zeigt die Expression von nicht-chimären Immunglobulinketten mit 4-Nitrophenyl-Spezifität in E. coli. Es gibt eine ausführliche Beschreibung chimärer Antikörper, aber keine Details (siehe Seite 9).
Wood, C.R., et al., Nature, 314: 446 (April 1985), beschreiben Plasmide, die die Synthese von Maus-anti-NP-Antikörperproteinen in Hefe steuern. Die Antikörperproteine der schweren Kette mu schienen in der Hefezelle glykosyliert zu sein. Wenn sowohl die schwere als auch die leichte Kette in der gleichen Zelle synthetisiert wurden, setzte sich ein Teil des Proteins zu funktionellen Antikörpermolekülen zusammen, wie durch anti-NP- Bindungsaktivität in löslichem Protein, das aus Hefezellen erzeugt wurde, festgestellt wurde.
Alexander, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 79: 3260- 3264 (1982) , beschreiben die Herstellung einer cDNA-Sequenz, die für eine anomal kurze schwere Humankette vom Typ Ig-gamma_ kodiert (OMM γ³ HCD Serumprotein), die eine Leitsequenz von 19 Aminosäuren, gefolgt von den ersten 15 Resten der V-Region, enthält. Eine extensive interne Deletion entfernt den Rest der V- und die gesamte CH¹-Domäne. Dies ist eine für ein intern deletiertes Molekül kodierende cDNA.
Dolby, T.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 6027-6031 (1980), beschreiben die Herstellung einer cDNA-Sequenz und rekombinanter Plasmide, die die gleiche Kodierung für humane muund kappa-Immunglobulin-Polypeptide enthielt. Eines der rekombinanten DNA-Moleküle enthielt Kodons für einen Teil der CH³-Domäne der konstanten Region und die gesamte 3'-nicht-kodierende Sequenz.
Seno, M., et al., Nucleic Acids Research, 11: 719-726 (1983), beschreiben die Herstellung einer cDNA-Sequenz und rekombinanter Plasmide, die diese enthalten, die für einen Teil der variablen Region und die gesamte konstante Region der schweren IgE-Humankette kodieren (&epsi;-Kette).
Kurokawa, T., et al., ibid, 11: 3077-3085 (1983), zeigen die Konstruktion von drei Expressionsplasmiden, die für den konstanten Teil der schweren IgE-Humankette kodieren, unter Verwendung von cDNA.
Liu, F.T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 5369-5373 (September 1984), beschreiben die Herstellung einer cDNA-Sequenz und rekombinanter Plasmide, die diese enthalten, die für ungefähr 2/3 der CH2-Domäne und die gesamten CH3 und CH4-Domänen der schweren IgE-Humankette kodiert.
Tsujimoto, Y., et al., Nucleic Acids Res., 12: 8407-8414 (November 1984) , beschreiben die Erzeugung einer Human-V-lambda- cDNA-Seguenz aus einer Ig-lambda-erzeugenden humanen Burkitt- Lymphom-Zellinie, wobei ein kloniertes Gen für die konstante Region als Primer für die cDNA-Synthese verwendet wurde.
Murphy, J., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 83/03971 (veröffentlicht 24. November 1983), offenbart Hybridproteine, die aus Fragmenten gemacht sind, die ein Toxin und einen zellspezifischen Liganden umfassen (von dem nahegelegt wird, daß es sich um einen Antikörper handele).
Tan et al., J. Immunol., 135: 8564 (November 1985), erhielten die Expression eines chimären genomischen Human-Maus-Immunglobulingens nach Transfektion in Mausmyelomzellen.
Jones, P.T., et al., Nature, 321: 552 (Mai 1986), konstruierten und exprimierten ein genomisches Konstrukt, in dem CDR-Domänen variabler Regionen aus einem monoklonalen Maus-Antikörper verwendet wurden, um die entsprechenden Bereiche in einem menschlichen Antikörper zu ersetzen.
Sun, L.K., et al., Hvbridoma 5 Anlage 1 S17 (1986), beschreiben einen chimären Human/Maus-Antikörper mit möglicher Tumorspezifität. Die Gene für chimäre schwere und leichte Ketten sind genomische Strukturen und werden in Säugerzellen exprimiert. Sahagan et al., J. Immun. 137: 1066-1074 (August 1986), beschreiben einen chimären Antikörper mit Spezifität für ein mit menschlichen Tumoren assoziiertes Antigen, dessen Gene aus genomischen Sequenzen zusammengesetzt sind.
Für einen neueren Überblick über das Feld siehe auch Morrison, S.L., Science 229: 1202-1207 (20. September 1985), und Oi, V.T., et al., BioTechniques 4:214 (1986).
Die Oi, et al. Veröffentlichung ist relevant, indem sie lehrt, daß die Produktion chimärer Antikörper aus cDNA-Konstrukten in-Hefe und/oder Bakterien nicht notwendigerweise vorteilhaft ist.
Siehe auch die Kommentare auf Seite 835 in Biotechnology 4(1986)

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen genetisch manipulierten chimären Antikörper mit einer Spezifität der variablen Region für das humane Tumorantigen L6 mit den Eigenschaften einer konstanten Humanregion durch Genklonierung und Expression von leichten und schweren Ketten zur Verfügung. Die klonierten Immunglobulin- Genprodukte können durch Expression in genetisch manipulierten Zellen erzeugt werden.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung für das humane Tumorantigen L6 spezifische chimäre Antikörper zur Verfügung, die eine konstanten Humanregion und eine variable Mausregion umfassen, in der die Antigenbindungsstelle des chimären Antikörpers die immunspezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers L6, der von Hybridom HB8677, wie es bei der ATCC hinterlegt ist, erzeugt wird, kompetetiv inhibiert; der chimäre Antikörper vermittelt eine stärkere Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität und Komplement-abhängige Cytotoxizität als durch den monoklonalen Antikörper L6 vermittelt wird, der vom Hybridom HB8677, wie es bei der ATCC hinterlegt ist, erzeugt wird.
Unter den von der Erfindung bereitgestellten Immunglobulinmolekülen sind:
a) ein vollständiges funktionelles Immunglobulinmolekül, umfassend:
i) zwei identische chimäre schwere Ketten, umfassend eine variable Mausregion mit der Spezifität für das humane Tumorantigen L6 und eine konstante Humanregion, und
ii) zwei identische, insgesamt humane (d.h. nicht-chimäre) leichte Ketten.
b) Ein vollständiges, funktionelles Immunglobulinmolekül, umfassend:
i) zwei identische chimäre schwere Ketten, umfassend eine variable Mausregion, wie angegeben, und eine konstante Humanregion, und
ii) zwei identische leichte Mausketten (d.h. nicht chimär).
c) Einen monovalenten Antikörper, d.h. ein vollständiges, funktionelles Immunglobulinmolekül, umfassend:
i) zwei identische chimäre schwere Ketten, umfassend eine variable Region, wie angegeben, und eine konstante Humanregion, und
ii) zwei verschiedene leichte Ketten, von denen nur eine die gleiche Spezifität wie die variable Region der schweren Ketten hat. Das resultierende Antikörpermolekül bindet nur an ein Ende davon und ist daher zur divalenten Bindung unfähig.
Die Anwendung von Oligodesoxynukleodtidsynthese, rekombinanter DNA-Klonierung und Erzeugung von spezifischen Immunglobulin- ketten in verschiedenen prokaryontischen und eukaryontischen Zellen stellt ein Mittel für die Erzeugung chimärer monoklonaler Mensch-Maus-Antikörper mit Spezifität für ein humanes Tumorantigen im großen Maßstab zur Verfügung.
Die Erfindung verwendet cDNA-Sequenzen, die für Immunglobulinketten kodieren, die eine konstante Humanregion und eine variable Mausregion umfassen. Die Immunglobulinketten können entweder schwer oder leicht sein.
Die Erfindung verwendet Gensequenzen, die für Immunglobulinketten kodieren, die eine cDNA für eine variable Region mit Spezifität für das humane L6-Tumorantigen umfassen. Diese können mit genomischen konstanten Regionen menschlichen Ursprungs kombiniert werden.
Die Erfindung verwendet Sequenzen wie oben erwähnt, die in rekombinanten DNA-Molekülen in Vehikeln, beispielsweise Plasmidvektoren, vorhanden sind, die zur Expression in gewünschten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten fähig sind.
In der Beschreibung werden Wirte, die zur Erzeugung der chimären Antikörper durch Kultur fähig sind, und Verfahren zum Verwenden dieser Wirte beschrieben.
Die Erfindung stellt außerdem vollständige zusammengesetzte Moleküle mit konstanten Humanregionen und variablen Regionen mit Spezifität für das humane Tumorantigen L6 zur Verfügung, in denen beide variable Regionen die gleiche Bindungsspezifität haben.
Genetische Sequenzen, insbesondere cDNA-Sequenzen, die für die zuvor erwähnten Kombinationen von chimären Ketten oder nicht chimären Ketten kodieren, sind hier beschrieben.
Die Beschreibung bezieht sich auf eine genetische Sequenz, insbesondere eine cDNA-Sequenz, die für die variable Region mit gewünschter Spezifität eines schweren und/oder leichten Antikörperkettenmoleküls kodiert und funktionell mit einer Sequenz verbunden ist, die für ein Polypeptid kodiert, das von einer Immunglobulinkette verschieden ist (z.B. ein Enzym). Diese Sequenzen können zusammengesetzt werden und exprimiert werden, um Moleküle mit gemischter Funktion zu ergeben.
Die Verwendung von cDNA-Sequenzen ist insbesondere dahingehend vorteilhafter als die Verwendung genomischer Sequenzen (die Introns enthalten), daß die cDNA-Sequenzen in Bakterien oder anderen Wirten, denen geeignete RNA-Spleiß-Systeme fehlen, exprimiert werden können.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die DNA-Umstellungen und die Expression der Immunglobulingene für die schweren mu- und gamma-Ketten. Dies ist eine schematische Darstellung des humanen Genkomplexes für die schwere Kette, die nicht im Maßstab gezeichnet ist. Die Bildung der variablen Region V der schweren Ketten geschieht über die korrekte Verbindung der VH-, D- und JH-Gensegmente. Dies erzeugt ein aktives mu-Gen. Eine davon verschiedene Art der DNA-Umstellung, die "Klassenumstellung" genannt wird, stellt die verbundene VH-, D- und JH-Region aus der Nachbarschaft der konstanten Region C-mu in die einer anderen C-Region für eine schwere Kette um (hier ist die Umstellung zu gamma dargestellt).
Figur 2 zeigt die bekannten Nukleotidsequenzen für die Humanund Maus-J-Regionen. Konsensussequenzen für die J-Regionen sind unter den aktuellen Sequenzen angegeben. Die Oligonukleotidsequenz unter der Maus-kappa-J-Region-Konsensussequenz ist ein Universal-Immunglobulingen(UIG) -Oligonukleotid. Zu beachten ist, daß es in jedem Immunglobulingenlocus nur einige wenige J- Regionen mit relativ konservierten Sequenzen gibt, insbesondere nahe den konstanten Regionen.
Figur 3 zeigt die Nukleotidsequenzen der Maus-J-Regionen. Darunter sind die Oligonukleotidprimer UIG-H und UIG-K gezeigt. Zu beachten ist, daß jeder eine Restriktionsenzymschnittstelle enthält. Sie können als Primer für die Synthese von zur variablen Region der mRNA komplementären cDNA verwendet werden, und können außerdem für die in vitro-Mutagenese klonierter cDNA verwendet werden.

Figur 4 Modul für die konstante Humandomäne.

Der Human-C-γ-1-Klon, pGMH6, wurde aus der Zellinie GM2146 isoliert. Die Sequenz an seiner JH-CH1-Verbindung ist gezeigt. Für die Rekombination des CH1-Genes mit verschiedenen VH-Genen sind zwei Restriktionsenzymschnittstellen als Verbindungsstellen nützlich. Die BstEII-Stelle liegt in der JH-Region und wurde bei einer früheren Konstruktion einer schweren Kette eines chimären Maus-Human-lmmunglobulins verwendet. Die Apal-Stelle liegt 16 Nukleotidreste innerhalb der für CH1 kodierenden Domäne von Human-γ-1 und wird in der in dieser Anmeldung beschriebenen Konstruktion verwendet.
Der Human-CK-Klon, pGML60, ist aus zwei cDNA-Klonen zusammengesetzt, deren einer aus GM1500 (pK2-3) und deren anderer aus GM2146 (pcML1) isoliert ist. Die Sequenz der gezeigten JK-CK- Verbindung kommt aus pK2-3. Um eine HindIII-Stelle 14 Nukleotidreste 5' der J-C-Verbindung einzuführen, wurde eine in vitro- Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotides J-HindIII durchgeführt. Dies überführt ein humanes Kodon GTG in ein Kodon CTT.
Figur 5 zeigt die Nukleotidsequenz der V-Region des L6 VH-cDNA- Klones pH3-6a. Die Sequenz wurde mittels des Didesoxyterminationsverfahrens unter Verwendung von M13-Subklonen von Genfragmenten (darunter gezeigt) bestimmt. Offene Kreise bezeichnen Aminosäurereste, die durch die Peptidsequenz bestätigt wurden. Eine zu DSP.2 in der CDR3-Region homologe Sequenz ist unterstrichen.
Figur 6 zeigt die Nukleotidsequenz der V-Region des L6 VK-cDNA- Klones pL3-12a. Der Oligonukleotidprimer, der für die stellengerichtete Mutagenese verwendet wurde, ist unterhalb des JK5- Segmentes gezeigt. Offene Kreise bezeichnen Aminosäurereste, die durch die Peptidsequenz bestätigt wurden.
Figur 7 zeigt die Konstruktion von chimären Expressionsplasmiden mit L6-VH plus Human-C-gamma-1. Reihe (a) zeigt die Sequenzen des BAL-31-Deletionsklones M13mp19-C1-delta 4 (C1-delta 4) und M13mp19-C1-delta 21(C1-delta 21). Das 5'-Ende des cDNA-Klones, pH3-6a, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die M13-Sequenzen sind unterstrichen. Der für dieses Experiment verwendete Oligonukleotidprimer ist H3-6a (5'-GACTGCACCAACTGG-3'), der in FR1 nahe dem reifen N-Terminus startet. Reihe (b) zeigt die Strategie für die stellengerichtete Mutagenese von 1 ug des Klones C1-delta 4 und C1-delta 21, jeweils hybridisiert mit 20 ng des 31-mer-Oligonukleotides MJH2-Apal. Die Synthese des Komplementärstranges mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase wurde 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt, dann 72 Stunden bei 15ºC. Transfizierte Phagen-Plaques wurden an Nitrozellulose adsorbiert, mit NaOH fixiert und gegen 32P-markiertes MJH2-ApaI- Oligonukleotid 18 Stunden bei 65ºC in 4xTBS (0,6 M NaCl, 0,04 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,004 M EDTA) + 10% Dextransulfat hybridisiert. Das letzte Waschen der Filter erfolgte bei 65ºC, 4xSSPE, 0,1% SDS für 15 min (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982). Positive Plaques wurden durch Übernacht-Exposition mit Kodak XAR-Filmen nachgewiesen und direkt für die Wachstums- und Restriktionsenzymanalyse von RF-DNA ausgewählt. Fehlpaarungen des MJH2-ApaI-Oligonukleotides an Maus-CH1 sind angegeben, was zu den Kodierungsveränderungen, die unterhalb des Oligonukleotids gezeigt werden, führt. Reihe (c) zeigt die Strategie der Substitution jedes mutagenisierten L6-VH-Moduls für das residente VH des chimären Expressionsplasmides pING2012, um pING2111 und pING2112 zu erzeugen.
Figur 8 zeigt die Konstruktion des chimären L6-Expressionsplasmides pING2119. Das SalI- bis BamHI-Fragment aus pING2100 ist identisch mit dem SalI- bis BamHI-A-Fragment aus pING2012E.
Figur 9 zeigt die Modifizierung des VK-Genes und seine Verwendung zur Konstruktion von Expressionsplasmiden für leichte Ketten sowie schwere und leichte Ketten.
(a) Deletion des Oligo-d[GC]-Segmentes 5' von VK von L6. Das Oligonukleotid ist ein 22-mer und enthält eine SalI-Stelle. Drei Fehlpaarungsstellen sind gezeigt. Das VK-Gen wird nach der Mutagenese als ein SalI-HindIII-Fragment mit dem Human-CK-Modul verbunden. Das so gebildete Expressionsplasmid ist pING2119.
(b) pING2114, ein Expressionsplasmid für schwere und leichte Ketten. Das Expressionsplasmid pING2114 enthält das chimäre Gen für die schwere L6-Kette aus pING2111 und die chimäre leichte Kette aus pING2119 (fette Linie)
Figur 10 zeigt eine Zusammenfassung der Sequenzveränderungen, die bei der Konstruktion der Expressionsplasmide für den chimären Antikörper L6 vorgenommen worden sind. Die unterstrichenen Reste im 5'-nicht-translatierten Bereich sind von den klonierten Mausgenen für die κ- und die schwere Kette abgeleitet. Die am V/C-Übergang eingekreisten Reste resultieren aus Mutageneseoperationen, um in diesem Bereich Restriktionsenzymstellen zu konstruieren. Die durch kleine Kreise über sich bezeichneten Reste in den schweren chimären L6-Ketten stammen ebenfalls von einer Mutagenese. Bei ihnen handelt es sich um stumme Austausche.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Einleitung

Im allgemeinen sind Antikörper aus Molekülen für zwei leichte und zwei schwere Ketten zusammengesetzt. Leichte und schwere Ketten werden in Domänen struktureller und funktioneller Homologie aufgeteilt. Die variablen Domänen sowohl der leichten (VL) als auch der schweren (VH) Ketten bestimmen die Erkennung und die Spezifität. Die Domänen der konstanten Regionen der leichten (CL) und der schweren (CH) Ketten verleihen wichtige biologische Eigenschaften, beispielsweise Antikörperkettenassoziierung, Sekretion, transplazentare Mobilität, Komplementbindung und ähnliches.
In den B-Zellen führt eine komplexe Reihe von Ereignissen zur Expression der Immunglobulingene. Die Gensequenzen für die V- Region, die Antigenspezifität und -bindung verleihen, sind in separaten Keimbahn-Gensegmenten angeordnet, die VH, D und JH oder VL und JL genannt werden. Diese Gensegmente werden durch DNA- Umstellungen miteinander verbunden, um die vollständigen V- Regionen, die in schweren bzw. leichten Ketten exprimiert werden (Figur 1), zu ergeben. Die umgestellten, verbundenen (VL-JL und VH-D-JH) V-Segmente kodieren dann für die vollständigen variablen Regionen oder Antigenbindungsdomänen der leichten bzw. der schweren Ketten.

Definitionen

Bestimmte Bezeichnungen und Ausdrücke werden in der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet. Die folgenden Definitionen werden zum Zweck der Klarheit und Konsistenz bereitgestellt.
1. Expressionsvektor - eine Plasmid-DNA, die in den Vektor insertiert die notwendigen regulatorischen Signale für die Synthese von mRNA enthält, die von Gensequenzen abgeleitet sind.
2. Modul-Vektor - eine Plasmid-DNA, die ein Genmodul für eine konstante oder eine variable Region enthält.
3. Expressionsplasmid - ein Expressionsvektor, der ein insertiertes Gen, beispielsweise ein chimäres Immunglobulingen, enthält.
4. Genklonierung - Synthese eines Genes, Insertion in DNA- Vektoren und Identifizierung durch Hybridisierung, Sequenzanalyse und ähnliches.
5. Transfektion - der Transfer von DNA in Säugerzellen.

Genetische Verfahren und Produkte

Die Erfindung stellt einen neuen chimären Human-Maus-Antikörper mit Spezifität für ein humanes Tumorantigen zur Verfügung. Das Antigen ist das vom in Cancer Research 46:3917-3923 (1986) und in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986) beschriebenen monoklonalen Antikörper gebundene Antigen. Das diesen monoklonalen Antikörper ausscheidende Hybridom wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 6. Dezember 1984 unter der Hinterlegungsnummer HB 8677 hinterlegt.

Das Verfahren verbindet fünf Elemente:

1) Isolieren von Messenger-RNA (mRNA) aus Maus-B-Zell-Hybridomlinien, die den monoklonalen Antikörper produzieren, Klonierung und CDNA-Erzeugung davon;
2) Herstellen von Universal-Immunglobulingen(UIG)-Oligonukleotiden, die als Primer und/oder Sonden für die Klonierung der Gensegmente für die variable Region der mRNA für leichte und schwere Ketten aus Hybridomzellinien nützlich sind, und cDNA-Erzeugung damit;
3) Herstellen von Gensegmenten für die konstante Region durch cDNA-Präparation und -Klonierung, oder Präparation genomischer Gene und Klonierung;
4) Konstruktion vollständiger kodierender Sequenzen für schwere oder leichte Ketten durch Verbinden der klonierten spezifischen Immunglobulin-Gensegmente für die variable Region von Teil (2) oben an klonierte Gensegmentmodule für die konstante Humanregion;
5) Expression und Erzeugung von leichten und schweren Ketten in ausgewählten Zellen, einschließlich prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, entweder in getrennten Fermentationen, gefolgt vom Zusammensetzen der Antikörpermoleküle in vitro, oder durch Erzeugen beider Ketten in der gleichen Zelle.
Ein immer auftretendes Merkmal aller exprimierten Immunglobulingene und Messenger-RNA's für leichte und schwere Ketten ist die sogenannte J-Region (d.h. "joining region" (Verbindungsregion), siehe Figur 1). Die J-Regionen für schwere und leichte Ketten haben unterschiedliche Sequenzen, jedoch besteht ein hoher Grad von Sequenzhomologie (mehr als 80%) innerhalb der JH-Regionen für schwere Ketten oder der J-Regionen für die leichten κ-Ketten, insbesondere nahe der konstanten Region. Diese Homologie wird erfindungsgemäß ausgenutzt und Konsensussequenzen für J-Regionen von leichten und schweren Ketten wurden verwendet, um Oligonukleotide (im folgenden als UIGs bezeichnet) für die Verwendung als Primer oder Sonden zum Klonieren von Immunglobulin-mRNAs oder Genen für leichte oder schwere Ketten zu entwerfen (Figur 3).
In Abhängigkeit von der Sequenz eines speziellen UIG's kann dieses an alle Immunglobulin-mRNAs oder Gene hybridisieren, die eine einzelne spezifische J-Sequenz enthalten. Eine andere Verwendungsmöglichkeit für eine bestimmte UIG-Sonde kann die Hybridisierung an mRNAs für leichte oder schwere Ketten einer speziellen konstanten Region sein, beispielsweise UIG-MJK, das alle Maus-JK-haltigen Sequenzen nachweist (Figur 2). Der Entwurffür ein UIG kann außerdem eine Sequenz zum Einführen einer Restriktionsenzymstelle in die cDNA-Kopie eines Immunglobulingenes vorsehen (siehe Figur 3). Erfindungsgemäß kann man beispielsweise chemische Gensynthese für die Erzeugung von UIG-Sonden zur Klonierung und Modifizierung von V-Regionen in Immunglobulin-mRNAs verwenden. Auf der anderen Seite können Oligonukleotide als diagnostische Hilfe zur Identifizierung der in der ImmunglobulinmRNA vorhandenen besonderen J-Region synthetisiert werden, um die weniger konservierte 5'-Region der J-Regionen zu erkennen.
Weiter können Oligonukleotide als diagnostische Hilfe bei der Identifizierung der in der Ig-mRNA vorhandenen besonderen J- Region synthetisiert werden, um individuell die weniger konservierten 5'-Regionen der J-Region zu erkennen.
Ein viele Stufen umfassendes Verfahren wird zum Erzeugen von cDNA-Klonen für vollständige V+C-Regionen aus mRNAs für leichte und schwere Ketten aus Hybridomzellen verwendet. Zuerst wird der komplementäre Strang von Oligo-dT-gestarteter cDNA synthetisiert, und diese doppelsträngige cDNA wird in einem geeigneten cDNA-Klonierungsvektor, beispielsweise pBR322 (Gubler and Hoffman, Gene. 25: 263 (1983)) kloniert. Die Klone werden durch Hybridisieren mit UIG-Oligonukleotidsonden durchmustert. Für schwere und leichte Ketten positive Klone, die durch dieses Durchmusterungsverfahren identifiziert werden, werden kartiert und sequenziert, um solche auszuwählen, die für die V-Region und die Leitsequenzen kodierende Sequenzen enthalten. Zur Manipulation erwünschter Restriktionsenzymspaltstellen wird dann in vitro-Mutagenese, beispielsweise einschließlich der Verwendung von UIG-Oligonukleotiden, verwendet.
Ein alternatives Verfahren ist die Verwendung synthetischer UIG- Oligonukleotide als Primer für die Synthese von cDNA.
Als zweites werden cDNA-Modul-Vektoren für die konstante Region aus Humanzellen hergestellt. Diese cDNA-Klone werden, falls notwendig, durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um eine Restriktionsstelle an die analoge Position in der Humansequenz oder an einen anderen gewünschten Ort nahe einer Grenze der konstanten Region zu plazieren. Ein alternatives Verfahren verwendet genomische C-Region-Klone als Quelle für C-Region-Modul- Vektoren.
Drittens werden klonierte V-Region-Segmente, erzeugt wie oben beschrieben, ausgeschnitten und mit Modul-Vektoren für die C- Region leichter oder schwerer Ketten ligiert. Beispielsweise kann man eine vollständige Human-kappa-C-Region der leichten Kette und die vollständige Human-γ-1-C-Region klonieren. Zusätzlich kann man die Human-γ-1-Region modifizieren, um ein Terminationskodon einzuführen und dadurch eine Gensequenz zu erhalten, die für den Teil der schweren Kette eines Fab-Moleküles kodiert.
Die kodierenden Sequenzen, mit denen V- und C-Regionen funktionell verbunden sind, werden dann in geeignete Expressionsvehikel zur Expression in geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten übertragen. Funktionell verbunden bedeutet eine Verbindung der kodierenden Sequenzen im Leseraster, um eine kontinuierlich translatierbare Gensequenz ohne Veränderungen oder Unterbrechungen des Triplet-Leserasters abzuleiten.
Ein besonderer Vorteil der Verwendung von genetischen cDNA- Sequenzen in der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß sie kontinuierlich entweder für schwere oder leichte Immunglobulinketten kodieren. Mit "kontinuierlich" ist gemeint, daß die Sequenzen keine Introns enthalten (d.h., es sind keine genomischen Sequenzen, sondern, da sie durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet sind, Sequenzen mit aneinandergrenzenden Exons). Dieses Merkmal der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen gestattet es, sie in prokaryontischen Wirten, beispielsweise Bakterien, oder in niederen eukaryontischen Wirten, beispielsweise Hefe, zu exprimieren.
Ein weiterer Vorteil der cDNA-Klonierungsverfahren ist die Leichtigkeit und Einfachheit, mit der V-Region-Genmodule erhalten werden.
Die Ausdrücke "konstant" und "variabel" werden funktionell verwendet, um solche Regionen entweder einer schweren oder einer leichten Immunglobulinkette zu bezeichnen, die für die Eigenschaften und Merkmale kodieren, die die variablen und konstanten Regionen in natürlichen, nicht-chimären Antikörpern haben. Wie bereits festgestellt, ist es nicht notwendig, daß eine vollständige kodierende Region für die variablen oder konstanten Regionen vorhanden ist, solange wie eine funktionell wirkende Region vorhanden und verfügbar ist.
Expressionsvehikel umfassen Plasmide oder andere Vektoren. Unter diesen sind Vehikel bevorzugt, die eine funktionell vollständige Humansequenz für den konstanten Teil einer schweren oder leichten Kette mit geeigneten eingeführten Restriktionsstellen tragen, so daß jede variable Sequenz einer schweren oder leichten Kette mit geeigneten kohäsiven Enden leicht dorthinein insertiert werden kann. Vehikel, die eine Humansequenz für den konstanten Teil einer schweren oder leichten Kette enthalten, sind daher eine wichtige Ausführungsform der Erfindung. Diese Vehikel können als Intermediate für die Expression jeder gewünschten vollständigen schweren oder leichten Kette in jedem geeigneten Wirt verwendet werden.
Ein bevorzugter Wirt ist Hefe. Hefe stellt wesentliche Vorteile für die Erzeugung von leichten und schweren Immunglobulinketten zur Verfügung. Hefen führen eine posttranslationale Peptidmodifikation einschließlich Glykosylierung durch. Es gibt bereits eine Anzahl von Strategien für rekombinante DNA, die Sequenzen für starke Promotoren und Plasmide mit hoher Kopienzahl verwenden, die für die Überproduktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leitsequenzen von klonierten Säugergenprodukten und scheidet Peptide, die Leitsequenzen tragen (d.h., Prepeptide) aus (Hitzman, et al., 11th International Conference on Yeast, Genetics und Molecular Biology, Montpelier, France, September 13-17, 1982)
Genexpressionssysteme in Hefe können routinemäßig auf den Grad der Erzeugung von schweren und leichten Ketten, Proteinstabilität und Sekretion überprüft werden. Es kann jedes aus einer Reihe von Hefegenexpressionssystemen, die einen Promoter und Terminationselemente von aktiv exprimierten Genen enthalten, die für glykolytische Enzyme kodieren, die in großen Mengen erzeugt werden, wenn Hefen in glukosereichen Medien gezüchtet werden, verwendet werden. Bekannte glykolytische Gene können außerdem effiziente Transkriptionskontrollsignale zur Verfügung stellen. Beispielsweise können der Promoter und die Terminationssignale des iso-1-Cytochrom C (CYC-1)-Genes verwendet werden.
Der folgende Ansatz kann zum Bestimmen der optimalen Expressionsplasmide für die Expression klonierter Immunglobulin-cDNAs in Hefe gewählt werden.
(1) Die klonierte Immunglobulin-DNA, die die V- und C-Regionen verbindet, wird an verschiedene Transkriptionspromotoren und -terminator-DNA-Fragmente angeheftet;
(2) Die chimären Gene werden auf Hefeplasmide gebracht (siehe beispielsweise Broach, J.R., in Methods in Enzymology, Vol. 101:307, Hrsg. Wu, R. et al., 1983);
(3) Weitere genetische Einheiten, wie z.B. Hefe-Leitpeptide, können auf den Immunglobulin-DNA-Konstrukten vorgesehen werden, um eine Antikörperausscheidung zu erreichen.
(4) Ein Teil der Sequenz, häufig die ersten 6 bis 20 Kodons der Gensequenz, können modifiziert werden, um die von Hefe bevorzugte Kodonverwendung zu verkörpern.
(5) Die chimären Gene werden auf Plasmide, die für die Integration in Hefechromosomen verwendet werden, verbracht.
Die folgenden Ansätze können gewählt werden, um gleichzeitig Gene für leichte und schwere Ketten in Hefe zu exprimieren.
(1) Die Gene für leichte und schwere Ketten werden jeweils an eine Hefepromoter- und eine Terminatorsequenz angeheftet und auf dem gleichen Plasmid angeordnet. Dieses Plasmid kann entweder für die autonome Replikation in Hefe oder für die Integration an speziellen Stellen im Hefechromosom vorgesehen sein.
(2) Die Gene für leichte und schwere Ketten werden jeweils auf getrennten Plasmiden, die verschiedene selektive Marker enthalten, an eine Hefepromoter- und eine Terminatorsequenz angeheftet. Beispielsweise kann das Gen für die leichte Kette auf einem Plasmid angeordnet werden, daß das trp1-Gen als einen selektiven Marker enthält, während das Gen für die schwere Kette auf einem Plasmid angeordnet sein kann, das ura3 als selektiven Marker enthält. Die Plasmide können jeweils für die autonome Replikation in Hefe oder Integration an speziellen Stellen in Hefechromosomen bestimmt sein. Ein für beide selektive Marker defekter Hefestamm wird entweder gleichzeitig oder nacheinander mit dem das Gen für die leichte Kette enthaltenden Plasmid und dem das Gen für die schwere Kette enthaltenden Plasmid transformiert.
(3) Die Gene für die leichte und schwere Kette werden jeweils auf getrennten Plasmiden, die jeweils verschiedene selektive Marker enthalten, wie in (2) oben beschrieben, an eine Hefepromoter- und eine Terminatorsequenz angeheftet. Ein Hefestamm vom Paarungstyp "a", der für die selektiven Marker, die auf den Expressionsplasmiden für die leichte und schwere Kette gefunden werden, defekt ist (trp1 und ura3 in dem obigen Beispiel) wird mit dem Plasmid transformiert, das das Gen für die leichte Kette enthält, indem auf einen der beiden selektiven Marker selektioniert wird (trp1 im obigen Beispiel). Ein Hefestamm vom Paarungstyp "alpha", der für die gleichen selektiven Marker defekt ist wie der "a"-Stamm (d.h., trp1 und ura3 als Beispiele), wird mit einem Plasmid transformiert, das das Gen für die schwere Kette enthält, indem auf den alternativen selektiven Marker (d.h., ura3 in dem obigen Beispiel) selektioniert wird. Der "a"-Stamm, der das Plasmid für die leichte Kette enthält (Phänotyp: Trp&spplus; Ural&supmin; in dem obigen Beispiel) und der Stamm, der das Plasmid für die schwere Kette enthält (Phänotyp: Trp&spplus; Ural in dem obigen Beispiel) werden gepaart und Diploide selektioniert, die für die beiden oben genannten selektiven Marker prototroph sind (Trp&spplus; Ura&spplus; in dem obigen Beispiel)
Unter den bakteriellen Wirten, die als Transformationswirte verwendet werden können, ist insbesondere E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) nützlich. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli 1776 (ATCC 31537). Die zuvor genannten Stämme, sowie E. coli W3110 (ATCC 27325) und andere Enterobakterien, wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, und verschiedene Pseudomonasstämme können verwendet werden.
Im allgemeinen werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von mit der Wirtszelle kompatiblen Arten abgeleitet sind. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie spezifische Gene, die eine Phänotypselektion in den transformierten Zellen ermöglichen. Beispielsweise wird E. coli leicht unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E. coli-Art abgeleitet ist (Bolivar, et al., Gene 2: 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher ein einfaches Mittel für die Identifizierung transformierter Zellen zur Verfügung. Das pBR322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide müssen weiterhin Promotoren enthalten oder modifiziert werden, um Promotoren zu enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können. Die am weitesten verbreiteten Promotoren, die in rekombinanten DNA- Konstruktionen verwendet werden, umfassen die beta-Laktamase- (Penicillinase-) und Laktose- (beta-Galaktosidase-) Promotersysteme (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198:1056 (1977)); und Tryptophan-Promotersysteme (Goeddel et al., Nucleic Acids Research, 8: 4057 (1980); EPA Publikation Nr. 0036776). Während dies die am häufigsten verwendeten Promotoren sind, sind weitere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet worden.
Beispielsweise kann ein genetisches Konstrukt für jede schwere oder leichte chimäre Immunglobulinkette unter die Kontrolle des linken Promoters des Bakteriophagen Lambda (PL) gestellt werden. Dieser Promoter ist eine der stärksten bekannten Promotoren, der kontrolliert werden kann. Die Kontrolle wird durch den Lambdarepressor ausgeübt, und benachbarte Restriktionsstellen sind bekannt.
Die Expression der Immunglobulinkettensequenz kann ebenso unter die Kontrolle anderer regulatorischer Sequenzen gestellt werden, die dem Organismus in seinem nicht-transformierten Zustand "homolog" sind. Beispielsweise umfaßt die chromosomale DNA aus Laktose-abhängigem E. coli ein Laktose- oder Lac-Operon, das den Laktoseabbau durch Bereitstellen des Enzyms beta-Galaktosidase vermittelt. Die Lac-Kontrollelemente können aus dem Bakteriophagen Lambda pLAC5 erhalten werden, der für E. coli infektiös ist. Das Lac-Promoter-Operatorsystem kann durch IPTG induziert werden.
Andere Promoter/Operatorsysteme oder Teile davon können ebenfalls angewendet werden. Beispielsweise können Arabinose, Colicin E1, Galaktose, alkalische Phosphatase, Tryptophan, Xylose, Tac und ähnliche verwendet werden.
Weitere bevorzugte Wirte sind Säugerzellen, die in vitro in Gewebekulturen oder in vivo in Tieren gezüchtet werden. Säugerzeller können Immunglobulinproteinmoleküle post-translational modifizieren, einschließlich Entfernung des Leitpeptides, der korrekten Faltung und Zusammensetzung der schweren und leichten Ketten, der Glykosylierung an den richtigen Stellen und der Sekretion funktionellen Antikörperproteins.
Säugerzellen, die als Wirte für die Erzeugung von Antikörperproteinen nützlich sein können, umfassen Zellen lymphoiden Ursprungs, wie z.B. Hybridom Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581) oder das Myelom P3X63Ag8 (ATCC TIB 9) und seine Derivate, andere umfassen Zellen mit Fibroblastenursprung, z.B. Vero (ATCC CRL 81) oder CHO-K1 (ATCC CRL 61).
Für die Expression klonierter Gene für schwere und leichte Ketten in Säugetierzellen sind verschiedene mögliche Vektorsysteme verfügbar. Eine Klasse von Vektoren beruht auf der Integration der gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellengenom. Zellen mit stabil integrierter DNA können durch gleichzeitiges Einführen von Wirkstoff-Resistenz-Genen, z.B. E. coli gpt (Mulligan, R. c., und Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)) oder Tn5 neo (Southern, P. J., und Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)) ausgewählt werden. Das selektierbare Markergen kann entweder an die DNA-Gensequenzen, die exprimiert werden sollen, gebunden werden, oder in die gleiche Zelle durch Co-Transfektion eingeführt werden (Wigler, M., et al., Cell, 16: 77 (1979)). Eine zweite Klasse von Vektoren verwendet DNA- Elemente, die einem extrachromosomalen Plasmid die Fähigkeit zur autonomen Replikation verleihen. Diese Vektoren können von Animalviren, beispielsweise dem Rinder-Papillomavirus (Sarver, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 79: 7147 (1982)), dem Polyomavirus (Deans, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 1292 (1984)) oder dem SV40-Virus (Lusky, M., und Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981)) abgeleitet werden.
Da eine Immunglobulin-cDNA nur aus Sequenzen zusammengesetzt ist, die die reife mRNA darstellen, die für ein Antikörperprotein kodiert, sind weitere Genexpressionselemente, die die Transkription des Genes und das Weiterprozessieren der RNA regulieren, für die Synthese der Immung1obulin-mRNA erforderlich. Diese Elemente können Spleiß-Signale umfassen sowie Transkriptionspromotoren einschließlich induzierbarer Promotoren, Enhancer und Terminationssignale. cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente enthalten, umfassen die von Okayama, H., und Berg, P., Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983); Cepko, C. L. et al., Cell 37. 1053 (1984); und Kaufman, R. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985) beschriebenen Vektoren.
Ein weiterer Vorteil von Säugerzellen als Wirten ist ihre Fähigkeit, chimäre Immunglobulingene zu exprimieren, die von genomischen Sequenzen abgeleitet sind. Säugerzellen können daher chimäre Immunglobulingene exprimieren, die ein cDNA-Modul für eine variable Region und eine konstante Region umfassen, die insgesamt oder teilweise aus genomischen Sequenzen zusammengesetzt ist. Verschiedene genomische Klone für die konstante Humanregion sind beschrieben worden (Ellison, J. W., et al., Nucl. Acids Res. , 10: 4071 (1982) , oder Max, E., et al, Cell, 29: 691 (1982)). Die Verwendung solcher genomischen Sequenzen kann für das gleichzeitige Einführen von Immunglobulin-Enhancern, Spleißsignalen und Transkriptions-Terminationssignalen zusammen mit den Gensegmenten für die konstante Region angebracht sein.
Es kann verschiedenen Ansätzen gefolgt werden, um vollständige H&sub2;L&sub2;-Antikörper zu erhalten.
Erstes kann man die leichten und schweren Ketten getrennt exprimieren, gefolgt von einem Zusammensetzen der gereinigten leichten und schweren Ketten zu vollständigen H&sub2;L&sub2;-IgG-Antikörpern in vitro. Die Wege für das Zusammensetzen, die für die Erzeugung von vollständigen H&sub2;L&sub2;-IgG-Molekülen in Zellen verwendet werden, sind ausführlich untersucht worden (siehe beispielsweise Scharff, M., Harvey Lectures, 69: 125 (1974)). In vitro- Reaktionsparameter für die Bildung von IgG-Antikörpern aus reduzierten isolierten leichten und schweren Ketten sind von Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis. Academic Press, New York, Seite 69, 1979 definiert worden.
Zweitens ist es möglich, leichte und schwere Ketten in der gleichen Zelle zu co-exprimieren, um eine intrazelluläre Assoziation und Verbindung von schweren und leichten Ketten zu vollständigen H&sub2;L&sub2;-IgG-Antikörpern zu erhalten. Die co-Expression kann entweder geschehen, indem gleiche Plasmide im gleichen Wirt verwendet werden, oder, indem verschiedene Plasmide im gleichen Wirt verwendet werden.

Polypeptidprodukte

Die Erfindung stelle "chimäre" Immunglobulinketten, entweder schwere oder leichte, zur Verfügung. Eine chimäre Kette enthält eine konstante Region, die im wesentlichen der in einer schweren Kette eines natürlichen Human-Immunglobulins vorhandenen ähnlich ist, und eine variable Region mit der gewünschten erfindungsgemäßen Antigenspezifität, d.h. gegen das angegebene humane Tumorantigen.
Die Erfindung stellt weiterhin Immunglobulinmoleküle mit schweren und leichten Ketten zur Verfügung, die so assoziiert sind, daß das Gesamtmolekül die gewünschten Bindungs- und Erkennungseigenschaften aufweist. Verschiedene Typen von Immunglobulinmolekülen werden bereitgestellt: monovalente, divalente Moleküle mit chimären schweren Ketten und nicht-chimären leichten Ketten, oder Moleküle mit den erfindungsgemäßen variablen Bindungsdomänen, die an die die gewünschten Funktionen tragenden Gruppen angeheftet sind.
Antikörper mit chimären schweren Ketten mit der gleichen oder einer unterschiedlichen Bindungsspezifität der variablen Region und nicht-chimären leichten (d.h., insgesamt Human- oder insgesamt nicht-Human-) Ketten, können durch entsprechende Assoziation der gewünschten Polypeptidketten hergestellt werden. Diese Ketten werden individuell durch die erfindungsgemäßen modularen Verfahren zum Zusammensetzen hergestellt.

Verwendungen

Die erfindungsgemäßen Antikörper mit einer konstanten Humanregion können für die passive Immunisierung, insbesondere in Menschen, ohne negative Immunreaktionen, wie beispielsweise Serumerkrankung oder anaphylaktischen Schock, verwendet werden. Die Antikörper können natürlich ebenfalls in nachweisbar markierter Form (z.B. Enzyme, ¹²&sup5;J, ¹&sup4;C, Fluoreszenzmarker, usw.) oder in immobilisierter Form (auf polymeren Röhrchen, Perlen, usw.), in markierter Form für die Bildgebung in vivo, wobei die Markierung ein radioaktiver Strahler oder ein NMR-Kontrastmittel, beispielsweise ein Kohlenstoff-13-Kern oder ein Röntgenkontrastmittel, beispielsweise ein Schwermetallkern, sein kann, in immundiagnostischen Tests und Kits aus dem Stand der Technik verwendet werden. Die Antikörper können außerdem für die in vitro-Lokalisierung von Antigenen durch entsprechende Markierung verwendet werden.
Die Antikörper selbst können für therapeutische Zwecke bei der Komplement-vermittelten Lyse verwendet werden oder an Toxine oder therapeutische Gruppen, z.B. Ricine usw., gekoppelt werden.
Gemischte Antikörper-Enzym-Moleküle können für immundiagnostische Verfahren, beispielsweise ELISA, verwendet werden. Gemischte Antikörper-Peptid-Effektorkonjugate können für die gezielte Abgabe der Effektorgruppe mit einem hohen Grad an Effizienz und Spezifität verwendet werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen chimären Antikörper für jeden und alle Verwendungen verwendet werden, bei denen der monoklonale Maus-Antikörper L6 verwendet werden kann, mit dem offensichtlichen Vorteil, daß die chimären Antikörper für den menschlichen Körper verträglich sind.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie weiter unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele, die hier nur zum Zweck der Veranschaulichung einbezogen sind und die Erfindung, wo es nicht anders angegeben ist, nicht beschränken sollen, verständlich werden.

Experimentelles

Material und Methoden Gewebekultur-Zellinien

Die Humanzellinien GM2146 und GM1500 wurden vom Human Mutant Cell Repository (Camden, New Jersey) erhalten und in RPMI1640 plus 10% fötales Rinderserum (M. A. Bioproducts) kultiviert. Die Zellinien Sp2/0 wurde von der American Type Culture Collection erhalten und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) plus 4,5 g/l Glukose (M. A. Bioproducts) plus 10% fötales Rinderserum (Hyclone, Sterile Systems, Logan, Utah) wachsen gelassen. Die Medien wurden mit Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific, Irvine, California) supplementiert.

DNA von rekombinanten Plasmiden und Bakteriophagen

Die Plasmide pBR322, pL1 und pUC12 wurden von Pharmacia P-L Biochemicals (Milwaukee, Wisconsin) gekauft. Die Plasmide pSV2-neo und pSV2-gpt wurden von BRL (Gaithersburg, Maryland) erhalten und sind von der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) erhältlich. pHu-gamma-1 ist ein Subklon des 8,3 kb HindIII - BamHI-Fragmentes des chromosomalen humanen IgG1-Genes. Ein Isolierungsverfahren für das chromosomale humane IgG1-Gen wird von Ellison, J. W., et al., Nucl. Acids Res., 10: 4071 (1982) beschrieben. M8alphaRX12 enthält das 0,7 kb XbaI - EcoRI- Fragment, das den Enhancer der schweren Mauskette aus der J-C- Intronregion des chromosomalen M603-Genes enthält (Davis, M., et al., Nature, 283: 733), insertiert in M13mp10. DNA-Manipulationen, die die Reinigung von Plasmid-DNA durch Dichtegradienten-Zentrifugation, Restriktionsendonukleaseabbau, Reinigen der DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese, Ligation und Transformation von E. coli involvieren, wurden, wie von Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982) beschrieben, oder nach anderen Verfahren durchgeführt. Restriktionsendonukleasen und andere DNA/RNA-modifizierende Enzyme wurden von Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana), BRL, New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) und Pharmacia P-L erworben.

Oligonukleotidherstellung

Oligonukleotide wurden entweder nach dem Triester-Verfahren von Ito et al. (Nucl. Acids Res., 10: 1755 (1982)) synthetisiert oder von ELESEN, Los Angeles, Kalifornien, gekauft. Tritylierte, deblockierte Oligonukleotide wurden auf Sephadex-G50 gereinigt, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC mit einem Acetonitrilgradienten von 0-25% in 10 mM Triethylamin-Essigsäure, pH 7,2, auf einer C18 uBondapak-Säule (Waters Associates) . Die Detritylierung wurde 30 min in 80% Essigsäure, gefolgt von 3-facher Verdampfung, durchgeführt. Die Oligonukleotide wurden mit [gamma-³²P]ATP plus T4 Polynukleotidkinase markiert.

RNA-Herstellung und Analyse

Die zelluläre Gesamt-RNA wurde aus Gewebekulturzellen mit dem Verfahren nach Auffray, C., und Rougeon, F. (Eur. J. Biochem., 107: 303 (1980)) oder Chirgwin, J. M., et al. (Biochemistry, 18: 5294 (1979)) gewonnen. Die Präparation von Poly(A)&spplus;-RNA, die Methyl-Quecksilber-Agarosegelelektrophorese und der "Northern"- Transfer auf Nitrozellulose wurden wie von Maniatis, T., et al., s.o., beschrieben, durchgeführt. Die zelluläre Gesamt-RNA oder Poly(A)&spplus;-RNA wurde direkt an Nitrozellulose gebunden, indem die RNA zuerst mit Formaldehyd behandelt wurde (White, B. A., und Bancroft, F. C., J. Biol. Chem., 257: 8569 (1982)). Die Hybridisierung an filtergebundene RNA wurde mit "nick"-translatierten DNA-Fragmenten unter den von Margulies, D. H., et al. (Nature, 295: 168 (1982)) beschriebenen Bedingungen oder mit ³²P-markierten Oligonukleotiden unter Verwendung von 4xSSC, 10X Denhardt's, 100 ug/ml Lachssperma-DNA bei 37ºC über Nacht, gefolgt von Waschen in 4xSSc bei 37ºC, durchgeführt.

cDNA-Herstellung und Klonierung

Oligo-dT gestartete cDNA-Banken wurden mit Poly(A)&spplus;-RNA aus GM1500- und GM2146-Zellen nach dem Verfahren von Land, H., et al. (Nucl. Acids Res., 9: 2251 (1981)) bzw. Gubler, V., und Hoffman, B.J., Gene 25: 263 (1983) hergestellt. Die cDNA-Banken wurden durch Hybridisierung (Maniatis, T., s.o.) mit ³²P- markierten Oligonukleotiden unter Verwendung des Verfahrens von de Lange et al. (Cell, 34: 891 (1983)) oder mit "nick"-translatierten DNA-Fragmenten durchmustert.

Oligonukleotid-Primer-Verlängerung und Klonierung

Poly(A)&spplus;-RNA (20 ug) wurde mit 1,2 ug Primer in 40 ul 64 mM KC1 gemischt. Nach 5 min Denaturierung bei 90ºc und anschließendem Abkühlen auf Eis wurden 3 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor aus Human-Plazenta (BRL) in 3 ul 1 M Tris-HCl, pH 8,3, zugefügt. Das Oligonukleotid wurde dann mit der RNA 15 min bei 42ºC hybridisiert, dann wurden 12 ul einer Lösung mit 0,05 M DTT, 0,05 M MgCl&sub2;, und jeweils 1 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP zugefügt. 2 ul alpha-³²P-dATP (400 Ci/mmol, New England Nuclear) wurden zugefügt, gefolgt von 3 ul von AMV Reverser Transkriptase (19 Einheiten/ul, Life Sciences)
Nach 105 min Inkubation bei 42ºC wurden 2 ul 0,5 M EDTA und 50 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6, zugefügt. Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Sephadex G-50 Säulen-Chromatographie unter Zentrifugation entfernt, und das RNA-DNA-Hybrid wurde mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Synthese des zweiten Stranges, die Homopolymerverlängerung mit dGTP oder dCTP und die Insertion in Homopolymer-verlängerte Vektoren wurde wie von Gubler und Hoffmann, s.o., beschrieben, durchgeführt.

Stellengerichte Mutagenese

Einzelsträngige M13-Subklon-DNA (1 ug) wurde mit 20 ng Oligonukleotidprimer in 12,5 ul Hin-Puffer (7 mM Tris-HCl, pH 7,6, 7 mM MgCl&sub2;, 50 mM Nacl) kombiniert. Nach Erwärmen auf 95ºC in einem verschlossenen Röhrchen wurde der Primer mit der Matrize durch langsames Abkühlen von 70ºC auf 37ºC über 90 min hybridisiert. Zwei ul dNTPs (jeweils 1 mM), 1 ul ³²P-dATP (10 uCi), 1 ul DTT (0,1 M) und 0,4 ul Klenow-DNA-PolI (2E, Boehringer Mannheim) wurden zugefügt und die Ketten bei 37ºC 30 min verlängert. Dazu wurde 1 ul (10 ng) Reverser M13-Primer (New England Biolabs) zugesetzt, und die Schritte des Erhitzens/Hybridisierens und der Kettenverlängerung wurden wiederholt. Die Reaktion wurde mit 2 ul 0,5 M EDTA, pH 8, plus 80 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA beendet. Die Produkte wurden mit Phenol extrahiert und mit einer Sephadex G-50-Zentrifugations-Säulen-Chromatographie gereinigt und vor dem Abbau mit Restriktionsenzymen und der Ligation an entsprechende Vektoren mit Ethanol präzipitiert.

Transfektion von Myelom-Gewebekulturzellen

Es wurde das Elektroporationsverfahren von Potter, H., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984)) verwendet. Nach der Transfektion konnten sich die Zellen in vollständigem DMEM 48-72 Stunden erholen, wurden dann mit 10000 bis 50000 Zellen pro Vertiefung in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von selektivem Medium ausgesät. Eine Selektion mit G418 (GIBCO) wurde bei 0,8 mg/ml durchgeführt, mit 6 ug/ml Mykophenolsäure (Calbiochem) plus 0,25 mg/ml Xanthin, und HAT (Sigma) wurde in der üblichen Konzentration verwendet.

Tests auf Immunglobulinsynthese und Sekretion

Ausgeschiedenes Immunglobulin wurde direkt aus den Gewebekulturzellüberständen gemessen. Ein Extrakt cytoplasmatischer Proteine wurde durch heftiges Mischen von 1x10&sup6; Zellen in 160 ul 1% NP40 , 0,15 M Nacl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6 bei 0ºC, 15 min, gefolgt von Zentrifugation bei 10000 x g zur Entfernung unlöslicher Debris hergestellt.
Ein Doppel-Antikörper-Sandwich-ELISA (Voller, A., et al., in Manual of Clinical Immunology, 2. Auflage, Hrsg. Rose, N. und Friedman, H., Seiten 359-371, 1980) unter Verwendung von affinitätsgereinigten Antiseren wurde zum Nachweis spezifischer Immunglobuline verwendet. Zum Nachweis von Human-IgG diente als an die Platte gebundenes Antiserum Ziege-anti-Human-IgG (KPL, Gaithersburg, Maryland) bei einer Verdünnung von 1/1000, während das Peroxidase-gebundene Antiserum von Ziege-anti-Human-IgG (KPL oder Tago, Burlingame) 1/4000 verdünnt war. Zum Nachweis von Human-Immunglobulin kappa hat das an die Platte gebundene Antiserum Ziege-anti-Human kappa (Tago) eine Verdünnung von 1/500, während das Peroxidase-gebundene Antiserum Ziege-anti-Human κ (Cappel) eine Verdünnung von 1/1000 hat.

Beispiel I: Ein chimärer Human-Maus-Antikörper mit Krebs-Antigenspezifität

(1) Antikörper L6

Der monoklonale Antikörper (MAk) L6 wurde von einer Maus erhalten, die mit Zellen aus einem Human-Lungenkarzinom immunisiert worden war, woran anschließend Milzzellen mit NS-1- Mausmyelomzellen hybridisiert worden waren. Der Antikörper bindet an ein zuvor nicht identifiziertes Kohlenhydratantigen, das in großen Mengen an der Oberfläche der Zellen der meisten Human-Karzinome exprimiert wird, einschließlich von Lungenkarzinomen (Adenokarzinom, squamösem Karzinom) , Brustkarzinomen, Kolonkarzinomen und Ovarialkarzinomen, während das Antigen nur in Spurenmengen in normalen Zellen des erwachsenen Wirtes vorhanden ist. MAk L6 ist ein IgG2a und kann die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, ADCC, in Gegenwart von humanen peripheren
Blutleukozyten als Quelle für Effektorzellen vermitteln, um so L6-positive Tumorzellen zu lysieren, und es kann L6-positive Tumorzellen in Gegenwart eines Humanserums als Quelle für Komplement lysieren; die Lyse wird als Freisetzung von &sup5;¹Cr aus markierten Zellen über einen Inkubationszeitraum von 4 Stunden nachgewiesen. MAk L6 kann L6-positive Tumore, die auf nackte Mäuse xenotransplantiert worden sind, lokalisieren, und kann das Auswachsen solcher Tumore inhibieren. MAk L6 ist in Cancer Res. 46:3917-3923, 1986 (MAk-Spezifität) und in Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7059-7063, 1986 (MAk-Funktion), beschrieben.
Mak L6 ist außerdem in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 776321, eingereicht am 18. Oktober 1985, und der Anmeldung mit der Seriennummer 684759, eingereicht am 21. Dezember 1984, beschrieben, deren Inhalte hier durch Verweis einbezogen werden.

(2) Identifizierung von J-Sequenzen in der Immunglobulin-mRNA von L6

Gefrorene Zellen wurden 10 min auf Eis und dann bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Suspension wurde mit 15 ml PBS verdünnt und die Zellen abzentrifugiert. Nach Waschschritten in PBS wurden sie in 16 ml 3 M LiCl, 6 M Harnstoff resuspendiert und in einem Polytronscherer (polytron sheer) aufgebrochen. Die Herstellung der mRNA und die Selektion der Poly(A&spplus;)-Fraktion wurden nach dem Verfahren von Auffray, C., und Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107:303, 1980, durchgeführt.
Die Poly(A&spplus;)-RNA von L6 wurde einzeln mit markiertem JH1-, JH2-, JH3- und JH4-Oligonukleotiden unter den von Nobrega et al., Anal. Biochem 131:141, 1983, beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Die Produkte wurden dann einer Elektrophorese auf einem 1,7% Agarose-TBE-Gel unterworfen. Das Gel wurde in 10% TCA fixiert, trockengeblottet und autoradiographiert. Die Ergebnisse zeigten, daß L6-VH JH2-Sequenzen enthält.
Für die Analyse der VK-mRNA wurde das Dotblot-Verfahren von White und Bancroft, J. Biol. Chem. 257:8569 (1982), verwendet. Poly(A&spplus;)-RNA wurde auf Nitrozellulosefiltern immobilisiert und dann mit markierten Sonden-Oligonukleotiden bei 400 in 4xSSC hybridisiert. Diese Experimente zeigen, daß L6 JK5-Sequenzen enthält. Eine schwache Hybridisierung mit JK2 wurde beobachtet.

(3) cDNA-Klone der V-Region

Eine durch Oligo(dT) auf L6-Poly(A&spplus;)-RNA gestartete Bank wurde mit einer Sonde für die Maus-CK-Region auf kappa-Klone überprüft. Aus der L6-Bank wurden mehrere Klone isoliert. Eine zweite Überprüfung mit einer 5'-JK5-spezifischen Sonde identifizierte die L6 (JK5) Klone für die leichte Kette. Klone für die schwere Kette von L6 wurden durch Überprüfung mit dem JH2- Oligonukleotid isoliert.
Die Gene oder Genfragmente aus den cDNA-Klonen pH3-6a und pL3- 12a für die schwere und leichte Kette, wurden in M13-Bakteriophagen-Vektoren zur Nukleotidsequenzanalyse insertiert. Die vollständigen Nukleotidsequenzen der variablen Region dieser Klone wurde mit dem Didesoxykettenterminationsverfahren (Figuren 15 und 16) bestimmt. Diese Sequenzen sagen Aminosäurezusammensetzungen der V-Region vorher, die gut mit den beobachteten Zusammensetzungen übereinstimmen, und sagen Peptidsequenzen vorher, die durch direkte Aminosäuresequenzierung von Teilen der V- Regionen verifiziert worden sind.
Die Nukleotidsequenzen der cDNA-Klone zeigen, daß es sich um Immunglobulin-V-Region-Klone handelt, da sie Aminosäurereste enthalten, die für V-Domänen typisch (diagnostic) sind (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; U.S. Dept. of HHS, 1983)
L6-VH gehört zur Subgruppe II. Die cDNA sagt eine N-terminale Sequenz von 24 Aminosäureresten voraus, die der eines bekannten VH identisch sind (45-165 CRI; Margolies et al. Mol. Immunol. 18:1065, 1981). L6-VH hat die JH2-Sequenz. L6-VL gehört der VK- KpnI-Familie an (Nishi et al., Proc.Nat.Acd. Sci. USA 82:6399, 1985) und verwendet Jk5. Das klonierte L6-VL sagt eine Aminosäuresequenz voraus, die durch Aminosäuresequenzierung von Peptiden, die den Resten 18-40 und 80-96 der leichten L6-Kette entsprechen, bestätigt wird.
In Vitro-Mutagenese zum Einführen von Restriktionsenzymstellen in die J-Region zur Verbindung mit einem Human-C-Modul und zur Entfernung von Oligo(dC)- Sequenzen 5' von den V-Modulen
Die beiden durch das Starten mit oligo(dT) erzeugten Klone, L6- VK und L6-VH, bedürfen der Modifizierung. Für L6-VK wurde der T- Region-Mutagenese-Primer JKHindIII, wie gezeigt in Figur 6, verwendet. Ein Human-CK-Modul, abgeleitet von einem cDNA-Klon, wurde mutagenisiert, um die HindIII-Sequenz zu erhalten (siehe Figur 4). Die Mutagenesereaktion wurde an M13-Subklonen dieses Genes durchgeführt. Die Frequenz der Mutanten-Klone lag im Bereich von 0,5 bis 1% der erhaltenen Plaques.
Es war zuvor beobachtet worden, daß die oligo(dC)-Sequenz stromaufwärts des ATG-Kodons in einem chimären VH-Gen ein sauberes Spleißen in einem bestimmten Genkonstrukt stört. Es wurde angenommen, daß vielleicht über 70% der RNA-Transkripte diesem Fehl spleißen unterworfen worden waren, wobei ein kryptischer 3'- Spleißakzeptor in der Leitsequenz verwendet wurde. Darum war die oligo(dC)-Sequenz stromaufwärts vom Initiator-ATG in all diesen Klonen entfernt worden.
In einem Ansatz wurde ein Oligonukleotid verwendet, das eine SalI-Restriktionstelle enthält, um den L6-VK-Klon zu mutagenisieren. Der für diese Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese verwendete Primer ist ein 22-mer, der eine SalI-Stelle zwischen dem oligo(dC) und dem Initiator met-Kodon einführt (Figur 9).
In einem anderen Ansatz wurde die Nuklease BAL-31 verwendet, um das oligo(dC) im L6-VH-Klon pH3-6a abzubauen. Die Größe der Deletion in zwei der erhaltenen Mutanten wurde durch Nukleotidsequenzierung bestimmt und ist in Figur 7 gezeigt. In den beiden Mutanten (delta 4 und delta 21) war das gesamte oligo(dC) 5' von der kodierenden Region deletiert.
Diese Klone wurden dann durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese mit dem MJH2-ApaI-Primer (Figur 7) modifiziert. Dieser 31- Basen-Primer führt eine ApaI-Stelle in das Maus-CH-Gen in einer Position ein, die analog einer existierenden ApaI-Stelle im Human-C-gamma1-cDNA-Genmodul ist. Der Primer führt die entsprechenden Kodons für das Human-C-ciammal-Gen ein. Das chimäre schwere Gen, das durch Verbinden des mutagenisierten Maus-VH- Genmodules mit einem Human-CH-Modul hergestellt wird, kodiert daher für ein chimäres Protein, das keine humanen Aminosäuren für die gesamte VH-Region enthält.
Das Human-C-gamma1-Genmodul ist eine cDNA, die von GM2146-Zellen (Human Genetic Mutant Cell Repository, Newark, New Jersey) abgeleitet ist. Dieses C-gamma1-Genmodul war zuvor mit einem Maus- VH-Genmodul kombiniert worden, um das chimäre Expressionsplasmid pING2012E zu bilden.

(5) Chimäre L6-Expressionsplasmide

Die chimären Expressionsplasmide für die schwere Kette von L6 wurden durch Ersetzen des VH-Modules pING2012E durch das VH- Modul der Mutanten delta 21 und delta 4 abgeleitet, um die Expressionsplasmide pING2111 und pING2112 (Figur 7) zu ergeben. Diese Plasmide steuern die Synthese von chimärer schwerer L6- Kette, wenn sie in Säugerzellen transfiziert worden sind.
Für das chimäre Gen der leichten L6-Kette wurde das SalI- bis HindIII-Fragment des Maus-VK-Modules mit dem Human-CK-Modul gemäß dem in Figur 8 dargestellten Verfahren unter Bildung von pING2119 verbunden. Das Ersetzen der neo-Sequenz durch das E. coli-gpt-Gen, abgeleitet von pSV2-gpt, führte zu pING2120, das chimäre leichte L6-Kette exprimierte und Mykophenolsäureresistenz verleiht, wenn es in Säugerzellen transfiziert wird.
Das Einbeziehen von chimären Genen sowohl für die schwere als auch für die leichte Kette in das gleiche Plasmid erlaubt die Einführung eines 1:1 Genverhältnisses von Genen für schwere und leichte Ketten in transfizierte Zellen, was zu einer ausgeglichenen Gendosis führt. Dieses kann die Expression verbessern und die Manipulation der transfizierten Zellen zur optimalen Expression chimärer Antikörper verringern. Zu diesem Zweck wurden die von den chimären Genen für schwere und leichte Ketten abgeleiteten DNA-Fragmente von pING2111 und pING2119 im Expressionsplasmid pING2114 kombiniert (Figur 9). Dieses Expressionsplasmid enthält einen selektierbaren neo -Marker und getrennte Transkriptionseinheiten für jedes chimäre Gen, jedes einschließlich eines Enhancers für die schwere Mauskette.
Die Modifikationen und V-C-Verbindungsregionen der chimären L6- Gene sind in Figur 10 zusammengefaßt.

(6) Stabile Transfektion von lymphoiden Mauszellen für die Erzeugung von chimärem Antikörper

Für das Einführen von chimärer L6-Expressionsplasmid-DNA in Maus-Sp2/0-Zellen wurde die Elektroporation verwendet (Potter et al., s.o.; Toneguzzo et al. Mol. Cell. Biol. 6:703, 1986). Das Elektroporationsverfahren ergab eine Transfektionsfrequenz von 1-10 x 10&supmin;&sup5; für Sp2/0-Zellen.
Das Zwei-Gen-Expressionsplasmid pING2114 wurde durch Abbau mit der Restriktionsendonuklease AatII linearisiert und in Sp2/0- Zellen transfiziert, was ungefähr fünfzig G418-resistente Klone ergab, die auf die Synthese von schweren und leichten Humanketten überprüft wurden. Das Ausmaß der Synthese chimärer Antikörperketten von den zwei Produzenten, D7 und 3E3, ist in Tabelle 1 gezeigt. Der chimäre Antikörper L6 wurde durch 24 Stunden Kultivieren der D7-Transfektanten-Zellen mit 2x10&sup6;-Zellen/ml in 5 1 DMEM, supplementiert mit HEPES-Puffer und Penicillin und Streptomycin, hergestellt. Der Überstand wurde über eine Amicon YM30 -Membran in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, konzentriert. Die Präparation wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule geladen, die das Immunglobulin in ungebundene und gebundene Fraktionen trennte. Proben der DEAE-ungebundenen, DEAE-gebundenen und prä-DEAE-Präparationen (von 1,6 1 Medium) wurden getrennt durch Affinitäts-Chromatographie auf einer Protein-A Sepharose -Säule, die mit 0,1 M Natriumcitrat, pH 3,5, eluiert wurde, gereinigt. Der eluierte Antikörper wurde neutralisiert und durch Amicon- Centricon-Filtration in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung konzentriert. Die Ausbeuten für die drei Präparationen betrugen 12 ug (DEAE-ungebunden), 6 ug (DEAE-gebunden) und 9 ug (prä-DEAE- Säule). Die Western-Analyse der Antikörperketten wies darauf hin, daß sie in einem H&sub2;L&sub2;-Tetramer vereinigt waren, ähnlich wie native Immunglobuline.

(7) Reinigung der in die Gewebekultur ausgeschiedenen chimären L6-Antikörper

a) Sp2/0.pING2114.D7-Zellen wurden in Kulturmedium [DMEM (Gibco #320-1965), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone #A-1111-D), 10 mM HEPES, 1 x Glutamin-Pen-Strep (Irvine Scientific #9316)], auf 1 x 10&sup6; Zellen/ml wachsen gelassen
b) Die Zellen wurden dann bei 400xg zentrifugiert und in serumfreiem Kulturmedium zu 2 x 10&sup6; Zellen/ml 18-24 Stunden resuspendiert.
c) Das Medium wurde bei 4000 UpM in einem JS-4.2 Rotor (3000xg) 15 min zentrifugiert.
d) 1,6 Liter des Überstandes wurden dann durch einen 0,45 um-Filter filtriert und mit einem YM30-(Amicon Corp.) Filter auf 25 ml konzentriert.
e) Die Leitfähigkeit des konzentrierten Überstandes wurde auf 5,7-5,6 mS/cm CDM 80 Radiometer eingestellt und der pH auf 8,0 eingestellt.
f) Der Überstand wurde bei 2000xg 5 min zentrifugiert und dann auf eine 40 ml DEAE-Säule geladen, die mit 10 mM Natriumphosphat, pH 8,0, prääquilibriert worden war.
g) Die Durchflußfraktion wurde gesammelt und auf eine 1 ml- Protein A-Sepharose (Sigma)-Säule geladen, die mit 10 mM Natriumphosphat, pH 8,0, prääquilibriert worden war.
h) Die Säule wurde zuerst mit 6 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 8,0 gewaschen, gefolgt von 8 ml 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, dann mit 6 ml 0,1 M Zitronensäure (pH 2,2). Fraktionen von 0,5 ml wurden in Röhrchen, die 50 ul 2 M Trisbase (Sigma) enthielten, gesammelt.
i) Die Hauptmenge des IgG befand sich in dem Eluat mit pH 3,5 und wurde vereinigt und konzentriert über Centricon 30 (Amicon Corp.) auf ungefähr 0,06 ml.
j) Der Puffer wurde im Centricon 30 durch wiederholtes Verdünnen mit PBS und Rekonzentrieren zu PBS (10 mM Natriumphosphat pH 7,4, 0,15 M NaCl) verändert.
k) Die IgG-Lösung wurde dann auf 0,10 ml eingestellt und 1,0% Rinderserumalbumin (Fraktion V, U.S. Biochemicals) wurde als Stabilisierungsmittel zugefügt.

(8) Erzeugung und Reinigung von in Aszitesflüssigkeit ausgeschiedenem chimären L6-Antikörper

a) Die Aszitesflüssigkeit wurde zuerst 10 min bei 2000xg zentrifugiert.
b) Die Leitfähigkeit des Überstandes wurde auf 5,7-5,6 mS/cm und sein pH auf 8,0 eingestellt.
c) Der Überstand wurde dann auf eine 40 ml DEAE-Cellulose-Säule geladen, die mit 10 mM Na&sub2;PO&sub4;H pH 8,0 prääquilibriert worden war.
d) Der Durchfluß aus der DEAE-Säule wurde gesammelt und sein pH auf 7,4 eingestellt und er wurde dann auf eine 1,0 ml Ziegeanti-Human-IgG (H&spplus;L) -Sepharose-Säule geladen.
e) Die Säule wurde zuerst mit 6 ml 10 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid gewaschen, gefolgt von 8 ml 0,5 M NH&sub4;OH und 3 M Natriumthiocyanat.
f) Das Natriumthiocyanateluat wurde gesammelt und gegen 2 1 PBS über Nacht dialysiert.
Der Antikörper kann weiter durch die Schritte j) und k) des voranstehenden Verfahrens konzentriert werden. Tabelle 1 Mengen ausgeschiedener chimärer L6-Ketten aus Sp2-Transfektantena Sp2/0D.7 Sp2/0.3E3 Kulturbedingungen FRS Kappa Gamma ausgesät: 2x10&sup5;/ml ausgesät: 2x10&sup6;/ml Balb/c-Aszites a - Sp2/0 Zellen, transfiziert durch Elektroporation mit pING2114 (pL6HL) b - ug/l, gemessen durch für Human-Kappa spezifischen ELISA - humaner Bence-Jones-Proteinstandard c - ug/l, gemessen mit für Human-Gamma spezifischen ELISA - Human-IgG-Standard n.b. - nicht bestimmt FRS: fötales Rinderserum

(9) Am chimären L6-Antikörper durchgeführte Untersuchungen

Zuerst wurden die Proben mit einem Bindungstest getestet, in dem die Zellen sowohl einer L6-Antigen-positiven als auch einer L6- Antigen-negativen Zellinie mit dem monoklonalen Standard- Mausantikörper L6, dem chimären L6-Antikörper, der aus den Zellkulturüberständen erhalten worden war, und aus Aszites erhaltenem chimären L6-Antikörper (wie zuvor beschrieben) inkubiert wurden, gefolgt von einem zweiten Reagens, Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten Ziegen-Antikörpern gegen Human- (oder Maus-, für den Standard)Immunglobulin.
Da der Bindungstest eine starke Reaktivität des chimären L6 mit der L6-Antigen-positiven Zellinie und ein totales Fehlen einer Reaktivität mit der negativen Zellinie zeigte, war der nächste Schritt, die Fähigkeit des chimären L6 zur Inhibition der Bindung von Maus-L6 an Antigen-positive Zellen zu untersuchen; solche Inhibitionstest werden routinemäßig zur Etablierung der Identität der Erkennungsstellen zweier Antikörper auf einem Antigen verwendet. Diese Daten werden weiter unten diskutiert ("Inhibition der Bindung"). Als Teil dieser Untersuchungen wurde eine grobe Schätzung der Antikörperavidität vorgenommen.
Schließlich wurden zwei Aspekte der Antikörperfunktion untersucht, nämlich die Fähigkeit, ADCC in Gegenwart von humanen peripheren Blutleukozyten zu vermitteln, und die Fähigkeit, L6- positive Tumorzellen in Gegenwart von Humanserum als Komplementquelle zu töten (siehe "Funktionelle Tests", unten).

Bindungstests

Zellen von einer Human-Kolonkarzinomlinie, 3347, von denen zuvor gezeigt worden war, daß sie ungefähr 5 x 10&sup5;-Moleküle des L6- Antikörpers auf der Zelloberfläche exprimieren, wurden als Zielzellen verwendet. Zellen der T-Zell-Linie HSB2 wurden als negative Kontrolle verwendet, da sie, gemäß vorhergehenden Tests, keine nachweisbaren Mengen des LG-Antigens exprimieren. Die Zielzellen wurden zuerst 30 min bei 4ºC entweder mit dem chimären L6 oder mit Maus-L6-Standard, der aus Mausaszites gereinigt worden war, inkubiert. Dem folgte eine Inkubation mit einem zweiten, FITC-markierten Reagens, im Falle des chimären Antikörpers Ziege-anti-Human-Immunglobulin, erhalten von TAGO (Burlingame, CA), das in einer Verdünnung von 1:50 verwendet wurde. Für den Mausstandard war das ein Ziege-anti-Maus- Immunglobulin, ebenfalls von TAGO erhalten und in einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Die Antikörperbindung an die Zelloberfläche wurde unter Verwendung eines Coulter Model EPIC-C Zellsortierers bestimmt.
Wie in Tabelle 2 und in Tabelle 2A gezeigt wird, banden sowohl der chimäre als auch der Standard-Maus-L6-Antikörper signifikant und ungefähr im gleichen Ausmaß an die L6-positive 3347-Linie. Sie banden nicht über den Hintergrund hinausgehend an die L6- negative HSB2-Linie.
Angesichts der Tatsache, daß die drei verschiedenen chimären L6- Proben, die in Tabelle 2 dargestellt sind, sich in den Bindungstests ähnlich verhielten, wurden sie für die unten dargestellten Inhibitionsstudien vereinigt. Die gleichen Inhibitionsstudien wurden für aus Aszitesflüssigkeit erhaltenen chimären L6 durchgeführt und sind in Tabelle 2A dargestellt.

Inhibition der Bindung

Als nächster Schritt wurde das Ausmaß untersucht, in dem abgemessene Dosen des chimären L6-Antikörpers oder des Standard- Maus-L6-Antikörpers die Bindung von FITC-markiertem Maus-L6 an die Oberfläche Antigen-positiver 3347-Kolonkarzinomzellen inhibieren konnten.
Sowohl der chimäre als auch der Standard-Maus-L6-Antikörper inhibierten die Bindung von direkt markiertem L6-Antikörper, wobei die Bindungskurven parallel verliefen. Der chimäre Antikörper war leicht weniger effektiv als der Standard, wie aus den Ergebnissen ersichtlich, die zeigten, daß 3,4 ug/ml des vereinigten chimären L6-MAk, im Vergleich zu 2,0 ug/m1 des Standard-Maus-L6- MAk, für eine 50%-ige Inhibition der Bindung benötigt wurden, und daß 5,5 ug/ml des chimären L6 (erhalten aus Aszites) im Vergleich zu 2,7 ug/ml der Standard-Maus-L6-MAk für eine 50%-ige Inhibition der Bindung erforderlich waren.
Als Teil dieser Untersuchungen wurde eine grobe Schätzung der Antikörper-Avidität vorgenommen. Die Avidität des Standard-Maus- L6-Antikörpers war zuvor mit ungefähr 4 x 10&sup8; bestimmt worden. Die Daten weisen darauf hin, daß es keinen signifikanten Unterschied der Avidität zwischen dem chimären und dem Maus-L6- Antikörper gibt.

Funktionelle Untersuchungen

Es wurde ein Vergleich zwischen der Fähigkeit von chimärem L6 und Standard-Maus-L6, L6-Antigen-positive Zellen in Gegenwart von humanen peripheren Blutleukozyten als Quelle für Effektor- Zellen (die die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität, Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC, vermitteln) oder Humanserum als Quelle für Komplement (das die komplementabhängige Zytolyse, Complement-Dependent Cytolysis, CDC, vermittelt) zu lysieren, vorgenommen.
Wie in Tabelle 3 und den Tabellen 3A-3D gezeigt wird, erwies sich der chimäre L6-Antikörper als der gleichzeitig getesteten Probe von Maus-L6 bei der Verursachung von ADCC als überlegen, wie durch einen 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungstest gemessen wurde.
Die Tabellen 4 und 4A-4B zeigen die Daten aus Untersuchungen über die Komplement-vermittelte Zielzellenlyse. In diesem Fall wurde eine hohe zytolytische Aktivität sowohl mit den Maus- als auch mit den chimären L6-Antikörpern beobachtet.

Schlußfolgerungen

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen eine Anzahl wichtiger, unerwarteter Qualitäten des erfindungsgemäßen monoklonalen chimären L6-Antikörpers. Erstens bindet der chimäre L6-Antikörper an L6-Antigen-positive Tumorzellen im ungefähr gleichen Ausmaß wie der Maus-L6-Standard und mit ungefähr der gleichen Avidität. Dies ist aus den folgenden Gründen von Signifikanz: Der L6- Antikörper definiert (a) ein Oberflächenkohlehydrat-Antigen und (b) ein Protein-Antigen von ungefähr 20.000 Dalton, deren jedes für "non-small cell" Lungenkarzinome (NSCLC) und bestimmte andere humane Karzinome charakteristisch ist. Signifikanterweise bindet der L6-Antikörper nicht nachweisbar an normale Zellen, wie z. B. Fibroblasten, Endothelzellen oder Epithelzellen in den Hauptorganen. Der monoklonale chimäre L6-Antikörper definiert daher ein Antigen, das für Karzinomzellen und nicht für normale Zellen spezifisch ist.
Zusätzlich zu der Fähigkeit des erfindungsgemäßen monoklonalen chimären L6-Antikörpers, spezifisch an maligne Zellen zu binden und Tumoren zu lokalisieren, übt der chimäre L6 tiefgreifende biologische Wirkungen auf die Bindung an sein Ziel aus, die den chimären Antikörper zu einem ersten Kandidaten für eine Tumor- Immuntherapie machen. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, daß der chimäre L6 in der Lage ist, an Tumorzellen zu binden und nach Bindung die Tumorzellen abzutöten, entweder durch ADCC oder durch CDC. Eine solche tumorabtötende Aktivität wurde unter Verwendung von Konzentrationen des chimären L6-Antikörpers von nur 0,01 ug/m1 (10 ng/ml) demonstriert.
Obwohl die Aussicht, eine Tumortherapie unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern zu versuchen, attraktiv ist, wobei über einige Tumor-Teilregressionen berichtet wurde, hat bis zum heutigen Tage eine solche Therapie mit monoklonalen Antikörpern nur begrenzten Erfolg gehabt (Houghton, Februar 1985, Proc. Natl. Acad. Sci 82: 1242-1246). Die therapeutische Effizienz von monoklonalen Mausantikörpern (mit denen die bisherigen versuche durchgeführt worden sind) scheint für die meisten praktischen Zwecke zu gering sein. Die Entdeckung der starken biologischen Aktivität von chimärem L6, gekoppelt mit seiner Spezifität für ein Karzinomantigen, macht den chimären L6-Antikörper zum therapeutischen Mittel der Wahl für die Behandlung von Tumoren in vivo. Darüber hinaus wird der monoklonale chimäre L6-Antikörper wegen seiner "humanen" Eigenschaften, die den monoklonalen chimären L6-Antikörper gegen eine Clearance in vivo resistenter machen, vorteilhaft nicht nur für die Therapie mit unmodifizierten chimären Antikörpern verwendet werden, sondern auch für die Entwicklung von verschiedenen Immunkonjugaten mit Wirkstoffen, Toxinen, Immunmodulatoren, Isotopen usw., sowie für diagnostische Zwecke, beispielsweise in vivo-Bildgebung von Tumoren unter Verwendung von entsprechend markierten chimären L6-Antikörpern. Solche Immunkonjugationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und können verwendet werden, um das erfindungsgemäße chimäre L6- Antikörper-Molekül zu modifizieren.
Zwei illustrative Zellinien, die chimären L6-Antikörper ausscheiden, wurden vor dem Anmeldetag der US-Anmeldung bei der ATCC, Rockville, Maryland, hinterlegt. Dabei handelt es sich um das transfizierte Hybridom C255 (entspricht den 3E3-Zellen, s.o.), ATCC HB 9240 und das transfizierte Hybridom C256 (C7- Zellen, s.o.), ATCC HB 9241.

(10) Exrression von L6-Ketten in Hefe

Genetische kodierende Sequenzen für schwere und leichte Ketten chimären L6-Antikörpers wurden hergestellt und in Vektoren eingeführt. Hefezellen wurden damit transfiziert und die Expression von getrennten schweren und leichten Antikörperketten für L6- Antikörper nachgewiesen.
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll durch die hinterlegten Zellinien nicht eingeschränkt werden, da die hinterlegte Ausführungsform als eine einzelne Illustration eines Aspektes der Erfindung beabsichtigt ist; alle Zellinien, die funktionell äquivalent sind, liegen im Schutzbereich der Erfindung. Tatsächlich sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denen, die aus der voranstehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen ersichtlich sind, möglich. Es ist beabsichtigt, daß solche Modifikationen im Schutzbereich der angefügten Ansprüche liegen. Tabelle 2 Bindungstests für chimären L6-Antikörper und monoklonalen Maus-L6-Antikörper auf einer L6-Antigen-positiven und einer L6- Antigen-negativen Zellinie. Bindungsverhältnis für H3347-Zellen (L6 +) Antikörper Ansatz GAM GAH Standard-L6 chimärer L6 Bindungsverhältnis für HSB-2-Zellen (L6 -) GAM GAH Standard-L6 chimärer L6
* Alle Tests wurden unter Verwendung einer Antikörper-Konzentration von 10 ug/ml durchgeführt. Das Bindungsverhältnis gibt an, wieviel stärker eine Testprobe als eine mit GAM (FITC- konjugiertem Ziege-anti-Maus) oder GAH (FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch) behandelte Kontrollprobe ist. Ein Verhältnis von 1 bedeutet, daß die Testprobe genauso stark ist wie die Kontrolle; ein Verhältnis von 2 bedeutet, daß die Testprobe doppelt so stark wie die Kontrolle ist, usw. Tabelle 2A Bindungstests für chimäre L6-Antikörper und monoklonalen Mausantikörper auf einer L6-Antigen-positiven und einer L6-Antigen-negativen Zellinie. Antikörperkonzentration Bindungsverhältnis für H3347-Zellen (L6 +) Antikörper GAM GAH Standard-L6 chimärer L6 (Aszites) chimärer L6 (Zellkultur) Bindungsverhältnis für HSB-2-Zellen (L6 -) GAM GAH Standard-L6 chimärer L6 (Aszites) chimärer L6 (Zellkultur)
* Das Bindungsverhältnis gibt an, wieviel stärker eine Testprobe als eine mit GAM (FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus) behandelte Kontrollprobe ist. Ein Verhältnis von 1 bedeutet, daß die Testprobe genauso stark wie die Kontrolle ist; ein Verhältnis von 2 bedeutet, daß die Testprobe doppelt so stark wie die Kontrolle ist, usw. Tabelle 3 ADCC für chimäre L6-(Maus)Antikörper bei der Kolonkarzinomzellinie 3347. Antikörper PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 Standard-L6 keiner
* Die Zielzellen waren mit &sup5;¹Cr markiert worden und wurden 4 h einer Kombination von MAk und humanen peripheren Blutleukozyten (PBL) ausgesetzt und die Freisetzung von &sup5;¹Cr anschließend gemessen. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr (nach Korrektur der Werte für die spontane Freisetzung nichtbehandelter Zellen) ist ein Maß für den Prozentsatz Zytolyse. Tabelle 3A ADCC für chimäre L6- und Standard-(Maus)L6-Antikörper bei der Kolonkarzinomzellinie 3347. Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) chimärer L6 (Zellkultur) Standard-L6
* Die Zielzellen waren mit &sup5;¹Cr markiert worden und wurden 4 h einer Kombination von MAk und humanen peripheren Blutleukozyten (PBL) ausgesetzt und die Freisetzung von &sup5;¹Cr anschließend gemessen. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr (nach Korrektur der Werte für die spontane Freisetzung nichtbehande1ter Zellen) ist ein Maß für den Prozentsatz Zytolyse. Tabelle 3B ADCC für chimären L6- und Standard(Maus)-L6-Antikörper auf der Kolonkarzinomzellinie 3347. Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) Standard-L6 keiner
* Die Zielzellen waren mit &sup5;¹Cr markiert worden und wurden 4 h einer Kombination von MAk und humanen peripheren Blutleukozyten (PBL) ausgesetzt und die Freisetzung von &sup5;¹Cr anschließend gemessen. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr (nach Korrektur der Werte für die spontane Freisetzung nichtbehandelter Zellen) ist ein Maß für den Prozentsatz Zytolyse. Tabelle 3C ADCC für chimären L6- und Standard(Maus)-L6-Antikörper auf der Lungenkarzinomzellinie H2669. Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) Standard-L6 keiner chimärer L6 (Aszites) Standard-L6 keiner Tabelle 3C (Fortsetzung Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) Standard-L6
* Die Zielzellen waren mit &sup5;¹Cr markiert worden und wurden 4 h einer Kombination von MAk und humanen peripheren Blutleukozyten (PBL) ausgesetzt und die Freisetzung von &sup5;¹Cr anschließend gemessen. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr (nach Korrektur der Werte für die spontane Freisetzung nichtbehandelter Zellen) ist ein Maß für den Prozentsatz Zytolyse. Tabelle 3D ADCC für chimären L6- und Standard(Maus)-L6-Antikörper auf der Kolonkarzinomzellinie H3347. Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) Standard-L6 keiner
* Die Zielzellen waren mit &sup5;¹Cr markiert worden und wurden 4 h einer Kombination von MAk und humanem peripheren Blutleukozyten (PBL) ausgesetzt und die Freisetzung von &sup5;¹Cr anschließend gemessen. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr (nach Korrektur der Werte für die spontane Freisetzung nichtbehandelter Zellen) ist ein Maß für den Prozentsatz Zytolyse. Tabelle 4 Komplement-abhängiger zytotoxischer Effekt des chimären und des Standard(Maus)-L6 auf Kolonkarzinomzellen der Linie 3347, gemessen mittels eines 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungstests. Als Quelle für Komplement wurde das Humanserum einer gesunden Person verwendet. Antikörper Human-Komplement % Zytolyse Standard-Antikörper L6 10 ug/ml Chimärer-Antikörper L6 10 ug/ml Tabelle 4A Komplement-abhängiger zytotoxischer Effekt von chimären L6- und Standard(Maus)-L6-Antikörpern auf die Kolonkarzinom-Zellinie 3347 Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) chimärer L6 (Zellkultur) Standard-L6 keiner inaktiviert
* Die Komplement-vermittelte Zytolyse wurde mittels eines 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungstests gemessen. Als Quelle für Komplement wurde das Humanserum einer gesunden Person verwendet. Tabelle 4B Komplement-abhängiger zytotoxischer Effekt von chimären L6- und Standard(Maus)-L6-Antikörpern auf die Kolonkarzinom-Zellinie 3347 Antikörperkonzentration PBL pro Antikörper Zielzelle Zytolyse chimärer L6 (Aszites) Standard-L6 keiner
* Die Komplement-vermittelte Zytolyse wurde mittels eines 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungstests gemessen. Als Quelle für Komplement wurde das Humanserum einer gesunden Person verwendet.

Claims

1. Chimärer Antikörper, der für das humane Tumorantigen L6 spezifisch ist, umfassend eine konstante Humanregion und eine variable Mausregion, in denen:

a) die Antigenbindungsstelle des chimären Antikörpers die immunspezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers L6, der vom Hybridom HB8677, hinterlegt bei der ATCC, erzeugt wird, kompetitiv inhibiert; und

b) der chimäre Antikörper eine stärkere Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität und Komplement-abhängige Zytooxizität vermittelt, als durch den monoklonalen Antikörper L6 vermittelt wird, der vom Hybridom HB8677, hinterlegt bei der ATCC, erzeugt wird.

2. Markierter chimärer Antikörper, umfassend den chimären Antikörper nach Anspruch 1, der mit einer Signal-erzeugenden Verbindung konjugiert ist.

3. Markierter chimärer Antikörper nach Anspruch 2, in dem die Signal-erzeugende Verbindung eine Radiomarkierung, eine fluoreszierende Verbindung oder ein Enzym umfaßt.

4. Immobilisierter chimärer Antikörper, umfassend den chimären Antikörper nach Anspruch 1, der an einen wasserunlöslichen Träger angeheftet ist.

5. chimäres Antikörperkonjugat, umfassend den mit einem Wirkstoff konjugierten chimären Antikörper nach Anspruch 1.

6. Chimäres Antikörperkonjugat nach Anspruch 5, in dem der Wirkstoff ein Toxin umfaßt.

7. Chimäres Antikörperkonjugat nach Anspruch 5, in dem der Wirkstoff ein Isotop umfaßt.