KR100864549B1 - 변이체 ｆｃ 영역 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 특히 치료 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 그가 작동가능하게 부착되는 폴리펩티드 상에 변경된 효과기 기능 또는 변경된 혈청 반감기를 부여하는 변이체 Fc 영역을 제공한다.
치료 항체, 효과기 기능, 반감기, 폴리펩티드, 변이체 Fc 영역, 항-CD20 항체

Description

변이체 ＦＣ 영역 {VARIANT FC REGIONS}
본 발명은 신규한 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 신규한 변이체 Fc 영역은 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린에 해당 아미노산 치환이 없는 모 면역글로불린에 비해 변경된 효과기 기능 또는 변경된 혈청 반감기를 부여하는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 본 발명은 모노클로날 항체의 효과기 기능을 변경시키거나, 본 발명의 변이체 Fc 영역이 작동가능하게 부착되는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 단백질, 특히 모노클로날 항체의 치료 용도가 개시된다.
17개 이상의 모노클로날 항체가 현재 미국에서 인간 치료제로서 용도로 승인되었다. 추가로, 예를 들어 이식 거부, 암, 염증성 질병, 패혈증, 신장염, 알츠하이머병, 알레르기, 당뇨병, 자가면역 질병, 관절염, 다발 경색증 및 감염성 질병을 포함한 다양한 질병 또는 질환의 치료를 위해 수백개의 모노클로날 항체가 임상 시험 중이고 수천개가 전-임상 시험 중에 있다. 치료용 모노클로날 항체 분야는 앞으로 수년 동안 급속히 성장할 것이다. 백신 이후에, 항체 (또는 면역글로불린, "Ig")가 임상 시험되는 두번째로 가장 일반적인 유형의 생물 약제를 구성한다 (Stockwin, L.H. et al. Biochemical Society Transactions, 31:433-436, 2003).
유전공학이 치료용 모노클로날 항체 분야의 성장에 실질적으로 기여하고 있다. 잠재적인 치료용 모노클로날 항체의 유효성은 종종 항체의 단백질 서열에 대한 적당한 변화에 따라 변할 것이다. 모노클로날 항체의 가변 영역에서 단일 아미노산 변화는 항체가 항원 에피토프에 결합하는 친화도, 및 항체 특성, 예를 들어 Kon율 또는 Koff율을 변경시키는 가능성을 갖는다. 상기 아미노산 변화는 치료제로서 모노클로날 항체의 성공 또는 실패를 결정할 수 있다. 유사하게, 모노클로날 항체의 Fc 영역의 아미노산 서열에서 적절한 변화는 항체의 효과기 기능 특성 또는 Fc 영역이 작동가능하게 연결되는 단백질의 반감기의 현저한 변화를 일으킬 수 있다.
항체의 Fc 영역 (즉, 도메인 CH2, CH3 및 힌지 영역의 일부에 이르는 항체의 중쇄의 카르복시-말단 단부 (도 1 참조))은 변이성이 제한되고, 항체가 기능하는 생리학적 역할을 수행하는데 관여한다. 항체의 Fc 영역에 기인하는 효과기 기능은 항체의 클래스 및 서브클래스에 따라 변하고, (i) 예를 들어 항체-코팅된 입자의 포식작용 및 파괴, 면역 복합체의 청소, 염증 매개체의 방출, 항체의 태반 이동 및 면역글로불린 생산의 제어를 포함하는 다양한 생물학적 반응을 촉발시키는, 항체의 Fc 영역을 통한 세포 상의 특이적 Fc 수용체 ("FcR")에 대한 결합, (ii) Fc 영역이 보체의 C1q 성분에 결합하여, 표적의 용해를 일으키는 보체 활성화의 전통적인 경로를 개시하는 보체 의존 세포독성 ("CDC"), (iii) 특정 인간 면역계 세포, 예를 들어 포식세포 및 NK 세포가 Fcγ 수용체를 통해 항체의 Fc 영역에 면역 세포 상의 특이적 항체-결합 수용체를 통해 결합하고 후속적으로 항체가 결합하는 대상의 파괴를 신호하는 항체 의존 세포 매개 세포독성 ("ADCC"), 및 (iv) 비만세포, 호염기구 및 호산구에 대한 결합을 포함한다. Fc 영역이 특정 FcR (예를 들어 FcRn)에 결합할 수 있는 친화도, 또는 Fc 영역이 CDC 또는 ADCC 활성을 매개할 수 있는 수준은 치료 단백질, 특히 모노클로날 항체의 효능 및 반감기를 결정하기 위한 중요한 인자이다.
인간 IgG의 Fc 영역에서 아미노산의 특수화된 변형은 치료 단백질, 특히 모노클로날 항체의 개발에 관련한 구조-기능 관계 정보를 얻는 활발한 연구 영역이다 (예를 들어 Fc 영역에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 혈청 반감기의 변경에 관해서는 미국 특허 6,165,745와 PCT 공개 WO2004/035752, 및 변형된 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 효과기 기능의 변경에 관해서는 미국 특허 6,737,056과 PCT 공개 WO2004/029207 참조).
신규 치료 단백질, 특히 모노클로날 항체의 개발은 관심있는 항체에 목적하는 유익한 특성을 부여하는 특정 아미노산 변형을 갖는 Fc 영역을 합리적으로 설계하는 능력이라는 잇점을 얻을 것이다. 모든 모노클로날 항체가 Fc 영역에서 동일한 특정 아미노산 변형으로 인해 치료제로서 개선되는 것으로 예상되는 것은 아니다. 하나의 표적 항원에 결합하는 치료용 모노클로날 항체는 특정 효과기 기능의 증가로부터 이익을 얻을 수 있는 반면, 상이한 표적 항원에 결합하는 상이한 치료용 모노클로날 항체는 상이한 효과기 기능의 증가 또는 심지어 감소로부터 이익을 얻을 수 있다. 하나의 치료용 모노클로날 항체는 보다 큰 친화도로 특정 Fc 수용체에 결합하는 능력으로부터 이익을 얻을 수 있는 한편, 다른 항체는 해당 Fc 수용체에 보다 낮은 친화도로 결합하여 신체로부터 보다 빠른 속도로 청소됨으로써 치료제로서 개선될 수 있다. 또한, 특정 Fc 영역 아미노산 변형 또는 치환 및 치료 항체에 유익한 결과의 효과는 항체가 결합하는 항원 표적 및(또는) 항체에 의해 개선시킬 질병 또는 질환에 따라 결정될 수 있다.
항체의 Fc 영역과 연관된 특정 효과기 기능을 변경시키는 방법 및 조성물은 기존 치료 항체의 특성을 개선하고 목적하는 특성을 갖는 신규 치료 항체를 생성하는 것을 필요로 한다. 변이체 Fc 영역을 갖는 모노클로날 항체는 다양한 질병 또는 질환, 예를 들어 염증성 질환, 암, 자가면역 질환, 세포 신호전달 질환 및 감염성 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 반감기를 증가시켜 보다 적은 투여량을 허용하거나, 반감기를 감소시켜 신체로부터 보다 신속한 청소를 허용하는 치료 단백질의 혈청 반감기를 변경시키는 방법 및 조성물은 치료 항체 및 다른 치료 단백질의 생성에 유익할 것이다.
치료 단백질, 특히 모노클로날 항체의 효능을 개선하기 위해 개선된 특징을 갖는 변이체 Fc 영역이 요구된다.
<발명의 개요>
본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 유익한 특성을 부여하는 변이체 Fc 영역, 즉, 본원에 기재된 아미노산 치환 (예를 들어 표 1 참조)을 포함하는 Fc 영역을 제공한다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 임의의 아미노산 치환이 이루어질 수 있는 모 Fc 영역의 Fc 위치는 Fc 영역의 위치 279, 341, 343 및 373을 포함하고; 여기서 Fc 영역에서 잔기의 넘버링, 즉, 이들의 위치 번호는 카바트 (Kabat)에서와 같은 EU 지수의 것이다 (도 2 참조). 본 발명은 모 Fc 영역의 위치 279, 341, 343 또는 373 또는 이들의 임의의 조합에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 제공한다. 모 Fc 영역은 임의로 279, 341, 343 및 373 이외의 위치에서 비천연 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 인간 IgG에 대한 이들 위치에서 천연 아미노산 잔기는 발린 (279), 글리신 (341), 프롤린 (343) 및 티로신 (373)이다.
본 발명 전체의 바람직한 실시태양에서, 모 Fc 영역 내에 존재하는 것에 대해 치환된 아미노산 잔기는 자연발생 아미노산 잔기이다. 달리 설명하지 않으면, 모 Fc 영역은 바람직하게는 인간 기원의 또는 실질적으로 인간 기원의 천연 또는 비천연 Fc 영역일 수 있다. 모 Fc 영역의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 1, 2, 3 또는 4에 나타낸 것이다. 바람직하게는, 모 Fc 영역은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 치환될 위치에 존재하는 천연 아미노산 잔기를 갖는다. 또한, 본 명세서 전체에서, 변이체 Fc 영역은 본원에 기재된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하도록 변형된 모 Fc 영역인 것이 이해된다. 추가로, 모 Fc 영역은 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 치환될 아미노산 잔기를 포함하는 전장 Fc 또는 그의 일부일 수 있음이 이해된다.
본 발명은 추가로 모 Fc 영역에 비해 위치 279, 341, 343 또는 373에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역 (또는 그의 기능적 단편)을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제공한다. Fc 위치 279, 341, 343 또는 373에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역은 변이체 Fc 영역과 동일한 종류의 천연 Fc 영역 내에 존재하는 아미노산 잔기에 비해 Fc 영역에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 변이체 Fc 영역 (즉, 모 Fc 영역의 변이체)는 다음으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개 또는 더 많은 아미노산 치환을 포함한다: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 38ON, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V 또는 442K.
바람직한 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은 다음으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개 또는 더 많은 아미노산 치환을 포함한다: 235G, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256W, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283H, 283K, 283M, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292G, 292I, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315L, 315P, 316F, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339D, 339F, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373W, 375R, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378D, 378N, 379N, 379Q, 379T, 38ON, 380S, 380T, 382D, 382F, 382I, 382K, 382L, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 440D, 440I 또는 440L.
본 발명의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 본원에 기재된 많은 실험적 방법 중 하나를 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 변이체 Fc 영역은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 변경된 효과기 기능 또는 변경된 혈청 반감기, 또는 변이체 Fc 영역이 작동가능하게 부착된 폴리펩티드에 변경된 혈청 반감기를 부여한다.
바람직하게는, 본 발명의 변이체 Fc 영역의 모 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgM 및 IgD 또는 그의 다형성 변이체, 또는 그의 기능적 단편으로 이루어진 군 중 에서 선택된 인간 기원의 천연 또는 생식세포-코딩된 Fc 영역이다. 바람직하게는, 모 Fc 영역은 IgG Fc 영역, 보다 바람직하게는, IgG1, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역이다. 모 Fc 영역은 임의로 천연 Fc 영역에 비해 본원에 기재된 것 (즉, 표 1에 나열된 치환) 이외의 다른 하나 이상의 추가의 아미노산 치환(들), 특히 당업계에 공지되거나 미국 특허 6,165,745 또는 6,737,056; 또는 PCT 공개 WO2004/035752 또는 WO2004/029207 (그 전부가 본원에 참고로 포함됨)에 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고; 상기 아미노산 치환(들)은 모 Fc 영역 내에 존재하면 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 후속적으로 치환되는 위치에 존재하지 않는 한, 본 발명의 변이체 Fc 영역 내에 및 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 내에 또한 존재할 것이다.
본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 키메릭 항체이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이고, 여기서 항체 내에 존재하는 프레임워크 서열 및 불변 영역 서열은 실질적으로 인간 기원의 것이다. 키메릭, 인간화 또는 인간 항체는 바람직하게는 전장 항체 또는 단일쇄 항체이다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 인간 치료제로서 사용하고자 할 때, Fc 영역은 바람직하게는 실질적으로 인간에서 기원하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하거나 그에 작동가능하게 부착된 폴리펩티드 (즉, "변이체 폴리펩티드")는 모 Fc 영역에 비해 변이체 Fc 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 상기 변이체 Fc 영역의 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 변경된 효과기 기능 또는 변경된 혈청 반감기를 나타내고, 여기서 "변이체 Fc 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 치환"은 (i) Fc 영역의 위치 279, 341, 343 또는 373에서 임의의 아미노산 치환, 또는 (ii) Fc 영역에서 아미노산 치환 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 38OS, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V 또는 442K 중의 적어도 하나, 또는 (iii) 적어도 2개의 상기 (i) 또는 (ii)에 나열된 아미노산 치환, 또는 (iv) 상기 (i) 또는 (ii)에 나열되지 않은 적어도 하나의 Fc 영역 아미노산 치환에 추가하여 적어도 1, 2 또는 3개의 상기 (i) 또는 (ii)에 나열된 아미노산 치환이다. 바람직하게는, 변경된 효과기 기능은 Fc 영역에서 아미노산 치환이 없는 (즉, 모 Fc 영역) 상기 폴리펩티드에 비해 ADCC의 증가, ADCC의 감소, CDC의 증가, CDC의 감소, C1q 결합 친화도의 증가, C1q 결합 친화도의 감소, FcR (바람직하게는 FcRn) 결합 친화도의 증가, 또는 FcR (바람직하게는 FcRn) 결합 친화도의 감소이다.
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 향상된 ADCC를 나타낸다: 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 254F, 254M, 254Y, 256A, 258D, 279A, 283A, 283I, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311A, 311D, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 436I, 440G, 440H, 440I 또는 440L, [바람직하게는 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 311D, 311N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 440I 또는 440L].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 감소된 ADCC 활성을 나타낸다: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 251I, 251W, 252Y, 254L, 254P, 254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283G, 283H, 283L, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 311I, 311K, 311S, 312P, 314F, 314I, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434I, 440D, 440T, 440V 또는 442K, [바람직하게는 235R, 236F, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 250K, 251H, 254T, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272N, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332K, 332R, 341F, 341I, 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376A, 376W, 432R 또는 432S].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 향상된 FcRn 결합 친화도를 나타낸다: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K 또는 442K, [바람직하게는 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 311I, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L 또는 438W].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 감소된 FcRn 결합 친화도를 나타낸다: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F 또는 440M, [바람직하게는 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341I, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P 또는 432S].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 향상된 CDC 활 성을 나타낸다: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251F, 251H, 251I, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332L, 332M, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380A, 380N, 380S, 380T, 382I, 382L, 382Q, 382V, 386K, 426D, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q 또는 440Y, [바람직하게는 236Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 260S, 280K, 283W, 307M, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 332D, 332L, 332M, 332S, 332W, 339D, 339F, 339I, 339K, 339N, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373E, 373F, 373H, 373I, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 382I, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 434Y, 438L 또는 440Y].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 비해 감소된 CDC 활성을 나타낸다: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 247I, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 254I, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332E, 332M, 343I, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M 또는 427N, [바람직하게는 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247I, 247L, 247T, 250M, 257A, 257I, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 378D, 385E, 423N 또는 424H].
본 발명은 추가로 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 실현하고, 상기 항체는 인간 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는 표적 항원은 CD3, CD20, CD25, TNFα, Her2/neu, CD33, CD52, EGFR, EpCAM, MUC1, GD3, CEA, CA125, HLA-DR, TGFβ, VEGF, GDF8, GDF11, 그렐린 (ghrelin), 또는 그의 임의의 전구체 또는 기능적 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 변이체 폴리펩티드를 제공하고, 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 (즉, 변이체 폴리펩티드와 동일하지만 하기 나열된 아미노산 치환이 결핍된 폴리펩티드)에 비해 향상된 혈청 반감기를 나타낸다: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K 또는 442K, [바람직하게는 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 311I, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L 또는 438W].
본 발명은 Fc 영역에서 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 변이체 폴리펩티드를 제공하고, 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 (즉, 변이체 폴리펩티드와 동일하지만 하기 나열된 아미노산 치환이 결핍된 폴리펩티드)에 비해 감소된 혈청 반감기를 나타낸다: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440D, 440E, 440F 또는 440M, [바람직하게는 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341I, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P 또는 432S].
한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)의 ADCC 활성을 증가시키는 방법을 제공한다: 247A, 247F, 247H, 247I, 247L, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 251F, 254F, 254M, 254Y, 256A, 256M, 258D, 268D, 268E, 279A, 280A, 280K, 283A, 283I, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311A, 311D, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 330K, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 436I, 440G, 440H, 440I 또는 440L, [바람직하게는 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 311D, 311N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 38ON, 382A, 440I 또는 440L]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 항체 코딩 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 (즉, 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후)을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 ADCC 활성을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 ADCC 활성이 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체보다 더 큰 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 또는 20% 이상 향상된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 추가로 실현한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)의 ADCC 활성을 감소시키는 방법을 제공한다: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 251I, 251W, 252Y, 254L, 254P, S254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, S267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283G, 283H, 283L, 283T, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 3O7E, 307M, 311F, 311I, 311K, 311S, 312P, 314F, 314I, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 429A, 429F, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434I, 440D, 440T, 440V 또는 442K, [바람직하게는 235R, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251H, 254T, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 329Y, 332K, 332R, 341F, 341I, 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376W, 429A, 432R 또는 432S]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 항체 코딩 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 (즉, 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후)을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 ADCC 활성을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 ADCC 활성이 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체보다 더 작은 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 감소된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하 는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 추가로 실현한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)의 FcRn 결합 친화도를 증가시키는 방법을 제공한다: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K 또는 442K, [바람직하게는 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 311I, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L 또는 438W]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 항체 코딩 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 (즉, 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후)을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 FcRn 결합 친화도를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 FcRn 결합 친화도가 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 FcRn 결합 친화도보다 더 큰 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 향상된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 추가로 실현한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드, 바람직하게는 치료 폴리펩티드의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K 또는 442K, [바람직하게는 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 311I, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L 또는 438W]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 치료 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 폴리펩티드 코딩 핵산 (예를 들어 융합 단백질의 비-Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후에 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 비-Fc 융합 파트너를 코딩하는 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 혈청 반감기를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩티드는 생체내 혈청 반감기가 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 증가된다 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 향상된다). 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 (즉, 융합 폴리펩티드)를 추가로 실 현한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)의 FcRn 결합 친화도를 감소시키는 방법을 제공한다: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, S267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 434I, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F 또는 440M, [바람직하게는 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P 또는 432S]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산이 추가의 항체 서열을 코딩하는 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후에 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 FcRn 결합 친화도를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 FcRn 결합 친화도가 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체보다 더 작은 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 감소된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 모노클로날 항체 (변이체 Fc 영역 포함)를 추가로 실현한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하 는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 공학처리하는 것을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 치료 폴리펩티드의 생체내 혈청 반감기를 감소시키는 방법을 제공한다: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, S267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 434I, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F 또는 440M, [바람직하게는 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P 또는 432S]. Fc 변이체 영역을 코딩하는 핵산은 치료 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 폴리펩티드 코딩 핵산 (예를 들어 융합 단백질의 비-Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후에 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 비-Fc 융합 파트너를 코딩하는 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 혈청 반감기를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩티드는 생체내 혈청 반감기가 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 감소된다 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 감소된다). 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 (즉, 융합 폴리펩티드)를 추가로 실현한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역이 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하도록 제작하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체의 CDC 활성을 증가시키는 방법을 제공한다: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251H, 251I, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332H, 332L, 332M, 332N, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380A, 380N, 380S, 380T, 382I, 382L, 382Q, 382V, 386K, 426D, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q 또는 440Y, [바람직하게는 236Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 250K, 250R, 251H, 251I, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 260S, 280K, 283W, 307M, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 332D, 332L, 332M, 332S, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339I, 339K, 339N, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373H, 373I, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 382I, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 434Y, 438L 또는 440Y]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 항체 코딩 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후에 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모 노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 CDC 활성을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 CDC 활성이 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체보다 더 큰 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 향상된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 추가로 실현한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역이 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하도록 제작하는 것을 포함하는 모노클로날 항체, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체의 CDC 반응을 감소시키는 방법을 제공한다: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 247I, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 254I, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 33OK, 330R, 332K, 339E, 339M, 343I, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M 또는 427N, [바람직하게는 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247I, 247L, 247T, 250M, 257A, 257I, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 33OR, 378D, 385E, 423N 또는 424H]. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 핵산 분자가 추가의 항체 코딩 핵산 (예를 들어 Ig 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열)에 작동가능하게 부착하는 동안 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환을 포함하도록 (예를 들어 모 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자로부터) 공학처리될 수 있거나, 또는 상기 방법은 적어도 하나의 상기 나열된 아미노산 치환의 도입 후에 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산을 추가의 항체 코딩 핵산에 후속적으로 작동가능하게 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 발현 및 정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업계에서 이용가능하거나 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 CDC 활성을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 CDC 활성이 모 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체보다 더 작은 (즉, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상 감소된) 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 추가로 실현한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산에 의해 코딩되는 변이체 Fc 영역 폴리펩티드는 변이체의 모 Fc 영역에 비해 표 1에 나타낸 아미노산 치환을 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 모노클로날 항체이고, 훨씬 더 바람직하게는, 모노클로날 항체는 전장 항체 또는 단일쇄 항체이다. 모노클로날 항체는 키메릭, 인간화, 또는 인간 모노클로날 항체일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 (이로 제한되지 않는다) 플라스미드, 재조합 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 또는 레트로바이러스 발현 벡터를 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 숙주세포는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 구성물을 포함한다. 본 발명의 숙주세포는 본 발명의 벡터가 (예를 들어 형질전환, 형질도입, 감염, 형질감염, 전기천공 등을 통해) 도입된 세포이고, 상기 벡터는 본 발명의 변이체 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 임의로, 벡터는 숙주세포 염색체 내로 안정하게 포함될 수 있다. 숙주세포 종류는 포유동물, 세균, 식물 및 효모 세포를 포함한다. 바람직하게는, 숙주세포는 CHO 세포, COS 세포, SP2/0 세포, NS0 세포, 효모 세포 또는 임의의 바람직한 세포 종류의 유도체 또는 자손체이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 모노클로날 항체이고, 훨씬 더 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체 이다. 모노클로날 항체는 키메릭, 인간화, 또는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 별법으로, 폴리펩티드는 본 발명의 변이체 Fc 영역에 작동가능하게 연결되거나 그와 동시발현됨으로써 폴리펩티드에 부여되는 변경된 혈청 반감기로부터 이익을 얻는 항체 이외의 다른 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 추가로 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 제약 조성물에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 활성 성분이다. 바람직하게는, 제약 조성물은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 균질 또는 실질적으로 균질 집단을 포함한다. 치료용 제약 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이고 동결건조될 수 있다.
본 발명은 치료 유효량, 또는 예방 유효량의 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 (바람직하게는 모노클로날 항체)를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 단백질의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 억제하고자 하는 단백질의 결합 파트너이다. 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자 (예를 들어 인간)에게 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체의 그의 항원 에피토프에 대한 결합으로 인한 신호전달의 억제에 의해 개선되는 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 포장재 및 상기 포장재 내에 함유된 본 발명의 변이체 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제조품을 실현한다. 본 발명은 추가 로 본원에 설명된 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 이종 폴리펩티드, 및 생리학상 또는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 실현한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 i) 비변형된 인간 프레임워크 영역 ("FR") (예를 들어, 자연발생 인간 프레임워크를 변경시키지 않는다), 및 ii) 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시태양에서, 비변형된 인간 프레임워크는 인간 생식세포 프레임워크이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 폴리펩티드는 i) 적어도 하나의 랜덤화 CDR 서열, 및 ii) 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 폴리펩티드는 i) 비변형된 인간 프레임워크 (예를 들어 인간 생식세포 프레임워크), ii) 적어도 하나의 랜덤화 CDR 서열, 및 iii) 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 및 이종 폴리펩티드에 대한 치료 및 진단 용도를 고려한다.
도 1은 다양한 영역 및 섹션을 표지한 IgG 분자의 개략도이다.
도 2는 인간 IgG1 ((서열 1), 비-a 및 a 동종이인자형을 도시함), 인간 IgG2 (서열 2), 인간 IgG3 (서열 3), 인간 IgG4 (서열 4), 쥐 IgG1 (서열 5), 쥐 IgG2A (서열 6), 쥐 IgG2B (서열 7), 및 쥐 IgG3 (서열 8)을 포함하는 다양한 모 Fc 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다.
도 3은 인간 IgG1의 CH2 영역 (서열 9) 및 CH3 영역 (서열 10), 및 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 IgG1의 f 동종이인자형 (서열 11) 및 a, z 동종이인자형 (서열 12) 서열을 포함하는 다양한 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 (a) 항-CD20 항체 (I)의 경쇄 가변 영역 (LCVR) (서열 13); (b) 항-CD20 항체 (I)의 중쇄 가변 영역 (HCVR) (서열 14); (c) 항-CD20 항체 (II)의 LCVR (서열 15); 및 항-CD20 항체 (II)의 HCVR (서열 16) 내에 포함된 다양한 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 4e는 항-CD20 항체의 가변 영역 내에 포함된 아미노산 서열을 도시한 것이다 (모두 본원에 포함된, 2003년 5월 20일 출원된 미국 특허 가출원 60/471,958 및 미국 특허 5,843,439 참조).
도 5a는 항-CD20 항체 AME 133에 대한 완전 경쇄 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 5b는 AME 133에 대한 완전 경쇄 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 6은 항-CD20 항체 AME 133의 3개의 바람직한 변이체의 완전 중쇄에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다. 구체적으로, 도 6a는 247I/339Q 변이체의 완전 중쇄의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 6b는 247I/339Q 변이체의 완전 중쇄의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 6c는 247I/339D 변이체의 완전 중쇄의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 6d는 247I/339D 변이체의 완전 중쇄의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 6e는 378D 변이체의 완전 중쇄의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 6f는 378D 변이체의 완전 중쇄의 핵산 서열을 도시한 것이다.
본 명세서와 청구의 범위 전체에서, 면역글로불린 중쇄 (Fc 영역)에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 EU 지수의 것이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG 항체의 잔기 넘버링을 나타내고 본원에서 도 2에 반영된다. 예를 들어, 위치 438에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 쥐 IgG3은 모두 Q 아미노산을 갖는 반면, 쥐 IgG1은 I 아미노산을 갖고, 쥐 IgG2a는 T 아미노산을 갖고, 쥐 IgG2B는 K 아미노산을 갖는다. 또한, 본원에서 치환은 치환이 일어나는 아미노산 위치 번호에 이어 동일한 위치에서 모 Fc 영역에 존재하는 것에 대해 치환되는 아미노산으로 명명한다 (예를 들어, 249G는 모 Fc 영역의 위치 249에서 존재하는 것에 대해 치환된 글리신 잔기를 나타낸다). 번호는 모 Fc 영역이 인간 IgG1이든 아니든 상관없이 인간 IgG1에서의 위치를 나타내고; 모 Fc 영역이 인간 IgG1이 아닌 경우, 번호는 그 위치에서 인간 IgG1과 정렬된 경우에 모 Fc 영역에서의 상동성 위치를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "대상" 및 "환자"는 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 치료 목적으로 사용할 수 있는 임의의 동물, 예를 들어, 상기 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 인간 및 다른 포유동물 (예를 들어, 가축 (예를 들어 개, 고양이), 스포츠용 동물 (예를 들어 말) 및 식품용 동물 (예를 들어 소, 돼지 및 양))을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "치료하거나 예방하는"은 비정상 수준의 단백질과 연관되거나 단백질의 활성 또는 수준을 변경시키는 것이 유익한 질병 또는 질환을 나타낸다.
핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 보통 그의 천연 원료와 연관되는 적어도 하나의 오염물질 핵산으로부터 확인되고 분리된 핵산이다. 단리된 핵산은 그가 자연에서 발견된 것과 상이한 형태 또는 세팅으로 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 단리된 핵산 분자는 보통 예를 들어 핵산 분자가 플라스미드 내에 또는 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우 그 내부에서 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다. 단리된 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 분자가 단백질을 발현하기 위해 사용되어야 하는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 코딩 가닥을 최소로 함유할 것이지만, 센스 및 안티센스 가닥을 모두 함유할 수 있다 (즉, 이중가닥일 수 있다).
핵산 분자는 다른 핵산 분자와 기능적 관계로 놓일 때 "작동가능하게 연결되거나" "작동가능하게 부착된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 핵산의 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 핵산의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 분자는 발현된 융합 단백질이 변이체 Fc 영역 폴리펩티드의 상류 또는 하류에 접하는 이종 단백질 또는 그의 기능적 단편을 포함하도록 배치되면 이종 단백질 (즉, 자연에 존재할 때 Fc 영역을 포함하지 않는 단백질 또는 그의 기능적 단편)을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결되고; 이종 단백질은 변이체 Fc 영역 폴리펩티드에 바로 인접할 수 있거나 임의의 길이 및 조성의 링커 서열에 의해 그로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드 (본원에서 "단백질"과 동의어로 사용됨) 분자는 다른 폴리펩티드와 기능적 관계로 놓일 때 "작동가능하게 연결되거나" "작동가능하게 부착된다".
폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어 변이체 Fc 영역, 또는 모노클로날 항체)에 관하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "기능적 단편"은 전장 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유하는 그 단백질의 단편을 나타낸다. 단편은 크기가 6개 아미노산 내지 전장 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열 - 1개 아미노산 범위일 수 있다. 본 발명의 변이체 Fc 영역 폴리펩티드의 기능적 단편은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 치환"을 보유한다. 변이체 Fc 영역 폴리펩티드의 기능적 단편은 Fc 영역과 관련하여 당업계에 공지된 기능 (예를 들어, ADCC, CDC, Fc 수용체 결합, C1q 결합, 세포 표면 수용체의 하향 조절, 또는 예를 들어 그가 작동가능하게 부착된 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 반감기의 증가)의 적어도 하나를 보유한다.
용어 "정제된" 또는 "정제하다"는 샘플로부터 적어도 하나의 오염물질의 실질적인 제거를 나타낸다. 예를 들어, 항원-특이적 항체는 적어도 하나의 오염성 비면역글로불린 단백질의 완전한 또는 실질적인 제거 (적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%)에 의해 정제될 수 있고; 또한 동일한 항원에 결합하지 않는 면역글로불린 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 비면역글로불린 단백질의 제거 및(또는) 특정 항원에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거는 샘플 내에 항원-특이적 면역글로불린의 비율을 증가시킨다. 다른 예에서, 세균 숙주세포 내에서 발현된 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린)는 숙주세포 단백질의 완전한 또는 실질적인 제거에 의해 정제되고; 그에 의해 샘플 내에서 폴리펩티드의 비율이 증가한다.
폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역)를 나타낼 때 용어 "천연"은 폴리펩티드가 자연에서 흔히 발생하거나, 그의 자연발생 다형성일 때 폴리펩티드의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 것을 나타내도록 본원에서 사용된다. 천연 폴리펩티드 (예를 들어, 천연 Fc 영역)는 재조합 수단에 의해 생산될 수 있거나 자연발생 원료로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 목적하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 적합한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주세포"는 시험관 내에 또는 계 내에, 또는 생체 내에 위치하는 임의의 진핵 또는 원핵 세포 (예를 들어 세균 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli), CHO 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 나타낸다. 예를 들어, 숙주세포는 트랜스제닉 동물 내에 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 "모 폴리펩티드"는 변이체 (즉, 변이체 폴리펩티드)를 생산하도록 변화되거나 변경 (예를 들어 아미노산 치환)될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드는 적어도 일부의 천연 또는 비천연 Fc 영역, 즉, 자연발생 Fc 영역 또는 적어도 하나의 아미노산 서열 변형을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 모 폴리펩티드보다 더 짧거나 더 긴 변이체가 구체적으로 고려된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드는 변이체에 비해 기능 (예를 들어, 향상되거나 감소된 효과기 기능, 수용체 결합, 생체내 또는 시험관내 반감기 등)이 상이하다.
본원에서 사용되는 용어 "모 폴리펩티드의 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 치환에 의해 모 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 변이체는 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99%의 Fc 영역 (즉, Fc 영역의 "일부")을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드의 변이체 Fc 영역은 모 폴리펩티드로부터 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 치환은 Fc 영역에 존재한다. 모 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드일 수 있거나 아닐 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역 (예를 들어, 도 1에 도시된 것과 같은)을 나타낸다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 일반적으로 인정되는 경계는 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226에서 아미노산 잔기, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실 말단에 이르는 것으로 대체로 정의된다. 일부 실시태양에서, 변이체는 Fc 영역의 일부만을 포함하고, 카르복시 말단을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같은 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 변이체가 고려된다. 다른 실시태양에서, 상기 불변 도메인을 갖지 않는 (또는 상기 불변 도메인의 일부만을 갖는) 변이체가 고려된다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2"도메인으로도 불림)은 대체로 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 이른다 (도 2 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 특유하다. 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH3 도메인" ("Cγ3"도메인으로도 불림)은 일반적으로 C-말단 잔기에서 약 아미노산 잔기 341에서 약 아미노산 잔기 447에 이르는 Fc 영역 내의 CH2 도메인까지의 범위이다 (도 2 참조).
"기능적인 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 효과기 기능은 천연 Fc 영역 또는 변이체의 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대하여 향상되거나 감소될 수 있다. 효과기 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 효과기 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)에 작동가능하게 연결되도록 요구할 수 있고, 다양한 분석 (예를 들어 Fc 결합 분석, ADCC 분석, CDC 분석, 전체 또는 분획화 혈액 샘플로부터 표적 세포 고갈 등)을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "야생형 Fc 영역"은 자연에서 일반적으로 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 나타낸다. 예시적인 천연 서열 인간 Fc 영역이 도 2에 도시되고, 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역, (f 및 a, z 동종이인자형, 즉, 비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 및 이들의 자연발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 쥐 Fc 영역이 또한 도 2에 도시되어 있다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 치환"에 의해 천연 서열 Fc 영역 (또는 그의 단편)과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 별도의 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은 본원에 개시된 방법에 따라 생성될 수 있고, 상기 변이체 Fc 영역은 선택된 이종 폴리펩티드, 예를 들어 항체 가변 도메인 또는 비항체 폴리펩티드, 예를 들어 수용체 또는 리간드의 결합 도메인에 융합될 수 있다.
폴리펩티드의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환의 도입에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 또한 폴리펩티드에 대한 임의의 종류의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 폴리펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형될 수 있고 이로 제한되지 않는다. 유도체 폴리펩티드는 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 이용하는 화학적 변형에 의해 생산할 수 있다. 추가로, 유도체 폴리펩티드는 그가 유도된 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 갖는다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 본원에 정의된 바와 같은 유도체일 수 있음이, 바람직하게는 유도체화가 Fc 영역 내에서 일어나는 것이 이해된다.
폴리펩티드 (예를 들어 Fc 영역 또는 모노클로날 항체)와 관련하여 본원에서 사용되는 "실질적으로 인간 기원의"는 폴리펩티드가 천연 인간 아미노 폴리펩티드에 적어도 80%, 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 것을 나타낸다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 Fc 영역 (예를 들어 항체의 Fc 영역)에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 서브클래스의 수용체 (대립 유전자 변이체 및 별법으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 설명되어 있다. 다른 바람직한 FcR은 모체 IgG의 태아로의 이동을 책임지는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). 미래에 확인될 것을 포함한 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "항체 의존 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 FcR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 비특이적) (예를 들어 천연 킬러 ("NK") 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 일으키는 세포 매개된 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구 (바람직하게는 인간)를 나타낸다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 백혈구의 예는 PBMC, NK 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 천연 원료 (예를 들어, 혈액 또는 PBMC)로부터 단리될 수 있다.
"변경된" FcRn 결합 친화도를 갖는 변이체 폴리펩티드는 pH 6.0에서 측정될 때 변이체의 모 폴리펩티드 또는 천연 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 향상된 (즉, 증가된, 보다 큰 또는 보다 높은) 또는 감소된 (즉, 줄어든, 감소한 또는 보다 작은) FcRn 결합 친화도를 갖는 것이다. FcRn에 대한 증가된 결합 또는 증가된 결합 친화도를 나타내는 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드보다 더 큰 친화도로 FcRn에 결합한다. FcRn에 대한 감소된 결합 또는 감소된 결합 친화도를 나타내는 변이체 폴리펩티드는 그의 모 폴리펩티드보다 더 작은 친화도로 FcRn에 결합한다. FcRn에 대한 감소된 결합을 나타내는 변이체는 모 폴리펩티드에 비해 FcRn에 거의 또는 전혀 감지가능하지 않은 결합, 예를 들어 FcRn에 0-20% 결합을 가질 수 있다. 그의 모 폴리펩티드에 비해 "향상된 친화도"로 FcRn에 결합하는 변이체 폴리펩티드는 결합 분석에서 변이체 폴리펩티드 및 모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일하고, 다른 모든 조건이 동일할 때 모 폴리펩티드보다 더 높은 결합 친화도로 FcRn에 결합하는 것이다. 예를 들어, 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비해 FcRn 결합 친화도에서 약 1.10배 내지 약 100배 (보다 일반적으로는 약 1.2배 내지 약 50배) 증가를 나타낼 수 있고, 여기서 FcRn 결합 친화도는 예를 들어 ELISA 분석 또는 당업자에게 이용가능한 다른 방법으로 결정된다.
본원에서 사용되는 "아미노산 치환"은 주어진 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기를 다른 상이한 "교체" 아미노산 잔기로 교체하는 것을 나타낸다. 교체 잔기(들)은 "자연발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩됨)이고 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 비자연발생 아미노산 잔기를 사용하는 치환이 또한 본원의 아미노산 치환의 정의에 포함된다. "비자연발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬 내의 인접하는 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 상기 나열된 자연발생 아미노산 잔기 이외의 잔기를 나타낸다. 비자연발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오미틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991)]에 기재된 것을 포함한다.
용어 "분석 시그날"은 비색 분석으로부터 흡광도 측정치, 형광 강도, 또는 1분당 붕괴도를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 임의의 방법으로부터의 출력 (output)을 나타낸다. 분석 포맷은 ELISA, facs 또는 다른 방법을 포함할 수 있다. "분석 시그날"에서의 변화는 세포 생존력에서의 변화 및(또는) 운동학 오프율 (off-rate), 운동학 온률 (on-rate)에서의 변화, 또는 둘 모두를 반영할 수 있다. "보다 높은 분석 시그날"은 측정된 출력값이 다른 수보다 더 큰 것을 나타낸다 (예를 들어 변이체는 모 폴리펩티드에 비해 ELISA 분석에서 보다 높은 (보다 큰) 측정값을 가질 수 있다). "보다 낮은" 분석 시그날은 측정된 출력값이 다른 수보다 더 작은 것을 나타낸다 (예를 들어 변이체는 모 폴리펩티드에 비해 ELISA 분석에서 보다 낮은 (보다 작은) 측정값을 가질 수 있다).
용어 "결합 친화도"는 각각의 Fc 수용체-Fc 결합 상호작용과 연관된 평형 해리 상수 (농도 단위로 표현됨)를 나타낸다. 결합 친화도는 운동학 오프율 (일반적으로 역시간 단위, 예를 들어 초-1로 기록됨)을 운동학 온률 (일반적으로 농도 단위/단위 시간, 예를 들어 몰/초로 기록됨)로 나눈 비율에 직접 관련된다. 일반적으로, 각각의 파라미터가 실험적으로 결정되지 않는 한 (예를 들어 BIACORE 또는 SAPIDYNE 측정에 의해), 평형 해리 상수의 변화가 온률, 오프율 또는 둘 모두에서의 차이로 인한 것인지 명확하게 설명하는 것은 불가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "힌지 영역"은 인간 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230까지 이어지는 인간 IgG1 내의 아미노산의 범위를 의미한다. 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 처음 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 위치시킴으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. C1q는 2개의 세린 프로테아제, 즉 C1r 및 C1s과 함께 CDC 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 "면역글로불린" 또는 "Ig"와 상호 변경가능하게 사용되고, 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성 또는 기능적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 단일쇄 항체, 및 키메릭, 인간, 인간화 또는 영장류화 (CDR-이식된) 항체, 및 상이한 종으로부터 유래한 부분을 포함하는 키메릭 또는 CDR-이식된 단일쇄 항체 등도 본 발명과 용어 "항체"에 포함된다. 이들 항체의 다양한 부분은 통상적인 기술에 의해 화학적으로, 합성에 의해 함께 연결될 수 있거나, 유전공학 기술을 이용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 또는 인간화 사슬을 코딩하는 핵산이 인접 단백질을 생산하도록 발현될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567; 유럽 특허 0,125,023 B1; 미국 특허 4,816,397; 유럽 특허 0,120,694 B1; WO 86/01533; 유럽 특허 0,194,276 B1; 미국 특허 5,225,539; 유럽 특허 0,239,400 B1과 미국 특허 5,585,089 및 5,698,762 참조). 또한, 영장류화 항체에 관해서는 문헌 [Newman, R. et al, BioTechnology, 10:1455-1460, 1993]을, 단일쇄 항체에 관해서는 문헌 [Ladner et al., 미국 특허 4,946,778 및 Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988]을 참조한다. Fc 영역 (또는 그의 일부)을 포함하는 모든 형태의 항체는 본원에서 용어 "항체"에 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출가능 표지로 표지되고, 고체상에 고정되고(되거나) 이종 화합물 (예를 들어, 효소 또는 독소)과 컨쥬게이팅될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 나타낸다. 항체 단편의 예는 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; Fc 또는 Fc' 펩티드, Fab 및 Fab 단편, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 항체 단편은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부 및 임의로 IgG 중쇄의 CH1 영역을 보유한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항체 단편은 CH2 영역의 적어도 일부 또는 전체 CH2 영역을 포함한다.
모노클로날 항체와 관련하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "기능적 단편"은 기능적 활성을 여전히 보유하는 모노클로날 항체의 일부를 나타내도록 의도된다. 기능적 활성은 예를 들어 항원 결합 활성 또는 특이성, 수용체 결합 활성 또는 특이성, 효과기 기능 활성 등일 수 있다. 모노클로날 항체 기능적 단편은 예를 들어 개별 중쇄 또는 경쇄 및 그의 단편, 예를 들어 VL, VH 및 Fd; 1가 단편, 예를 들어 Fv, Fab 및 Fab'; 2가 단편, 예를 들어 F(ab')2; 단일쇄 Fv (scFv); 및 Fc 단편을 포함한다. 상기 용어는 예를 들어, 문헌 [Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) 및 Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)]에 설명되어 있다. 용어 기능적 단편은 예를 들어, 모노클로날 항체의 프로테아제 소화 또는 환원에 의해 및 당업자에게 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 생산된 단편을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "단편"은 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100개 이상의 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드의 단편은 전장 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메릭 항체"는 1가, 2가 또는 다가 면역글로불린을 포함한다. 1가 키메릭 항체는 키메릭 중쇄가 디술피드 다리를 통해 키메릭 경쇄와 결합되어 형성된 다이머이다. 2가 키메릭 항체는 2개의 중쇄-경쇄 다이머가 적어도 하나의 디술피드 다리를 통해 결합되어 형성된 테트라머이다. 인간에서 사용하기 위한 항체의 키메릭 중쇄는 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH1 또는 CH2의 적어도 일부에 연결된, 비인간 항체의 중쇄로부터 유래한 항원 결합 영역을 포함한다. 인간에서 사용하기 위한 항체의 키메릭 경쇄는 인간 경쇄 불변 영역 (CL)의 적어도 일부에 연결되는, 비인간 항체의 경쇄로부터 유래한 항원 결합 영역을 포함한다. 동일하거나 상이한 가변 영역 결합 특이성의 키메릭 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체, 단편 또는 유도체는 또한 공지의 방법 단계에 따라 개별 폴리펩티드 사슬의 적합한 연합에 의해 제조할 수 있다. 상기 방법에서, 키메릭 중쇄를 발현하는 숙주를 키메릭 경쇄를 발현하는 숙주와 따로 배양하고, 면역글로불린 사슬은 따로 회수된 다음 연합된다. 별법으로, 숙주들은 동시배양될 수 있고, 사슬들은 배양 배지 내에서 자발적으로 연합된 다음, 조립된 면역글로불린 또는 단편을 회수하거나, 중쇄 및 경쇄가 모두 동일한 숙주세포에서 발현될 수 있다. 키메릭 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 6,284,471; 5,807,715; 4,816,567 및 4,816,397 참조).
본원에서 사용되는 비인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화" 형태 (즉, 인간화 항체)는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 서열을 최소로 함유하거나 함유하지 않는 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여 항체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체되는 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 일반적으로 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 대개 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프 (CDR)는 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 대개 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위해 사용된 예시적인 방법은 미국 특허 5,225,539에 설명되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역어드헤신"은 이종 "어드헤신" 단백질 (예를 들어 수용체, 리간드 또는 효소)의 결합 도메인을 면역글로불린 불변 도메인과 화합시키는 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 화합 부위)가 아닌 (즉, "이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 어드헤신 아미노산 서열의 면역글로불린 불변 도메인 서열과의 융합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드 결합 도메인"은 대응하는 천연 수용체의 적어도 정성적 리간드 결합 능력을 보유하는 임의의 천연 수용체 또는 그의 임의의 영역 또는 유도체를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 수용체는 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원에 상동성인 세포외 도메인을 갖는 세포 표면 폴리펩티드로부터 기인한다. 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원은 아니지만 그럼에도 불구하고 상기 정의에 구체적으로 포함되는 다른 수용체는 시토킨에 대한 수용체, 특히 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체 (수용체 티로신 키나제), 헤마토포이에틴 및 신경 성장 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원 및 세포 부착 분자 (예를 들어 E-, L- 및 P-셀렉틴)이다.
본원에서 사용되는 용어 "수용체 결합 도메인"은 수용체에 대한 임의의 천연 리간드, 예를 들어 세포 부착 분자, 또는 적어도 대응하는 천연 리간드의 정성적 수용체 결합 능력을 보유하는 상기 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "항체-면역어드헤신 키메라"는 항체의 적어도 하나의 결합 도메인을 적어도 하나의 면역어드헤신과 화합시킨 분자를 포함한다. 그 예는 문헌 [Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) 및 Charnow et al, J. Immunol., 153:4268 (1994)]에 설명된 이중특이적 CD4-IgG 키메라를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "단리된" 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고(되거나) 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염물질 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 저해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단리된 폴리펩티드는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정할 때 95 중량% 초과, 바람직하게는 99 중량% 초과의 폴리펩티드로, 또는 (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마지 블루 (Coomassie blue) 또는 은 염색제를 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-page에 의해 균질 (homogeneity)한 수준으로 정제된다. 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로, 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에서 계 내의 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계로 제조될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "처리"는 치료적 처리와 예방적 또는 억제적 조치를 모두 나타낸다. 처리를 필요로 하는 대상 또는 환자는 이미 질환에 걸린 대상, 및 질환이 억제되어야 하는 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "질환" 및 "질병"은 상호 변경가능하게 사용되어, 변이체 폴리펩티드 (본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드)를 사용하는 처리로부터 이익을 얻을 임의의 병태, 예를 들어 만성 및 급성 질환 또는 질병 (예를 들어, 환자를 특정 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태)를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 질환은 암이다. 특정 실시태양에서, 용어 "자가면역 질병"은 용어 "자가면역 질환"과 상호 변경가능하게 사용되어, 자신의 세포, 조직 및(또는) 장기에 대한 대상의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및(또는) 장기 손상을 특징으로 하는 대상의 병태를 나타낸다. 용어 "염증성 질병"은 용어 "염증성 질환"과 상호 변경가능하게 사용되어, 염증을 특징으로 하는 대상의 병태를 나타낸다. 자가면역 질환은 염증과 관련되거나 관련되지 않을 수 있다. 또한, 염증은 자가면역 질환에 의해 유발되거나 유발되지 않을 수 있다. 특정 질환은 자가면역 및 염증성 질환 모두를 특징으로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 대개 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암, 결직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "표지"는 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이팅된 검출가능 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "수용체"는 적어도 하나의 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 바람직한 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인 및 임의로 다른 도메인 (예를 들어 트랜스멤브레인 도메인, 세포내 도메인 및(또는) 멤브레인 앵커)를 갖는 세포 표면 또는 가용성 수용체이다. 본원에 설명된 분석으로 평가되는 수용체는 무손상 수용체 또는 그의 단편 또는 유도체 (예를 들어 하나 이상의 이종 폴리펩티드에 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질)일 수 있다. 또한, 그의 결합 특성에 대해 평가되는 수용체는 세포 내에 존재하거나 단리되고, 임의로 분석 플레이트 또는 몇몇 다른 고체상에 코팅되거나 직접 표지되고, 프로브로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 반응성 질병"은 적어도 부분적으로 항체 요법을 이용하여 치료가능한 것으로 나타난 임의의 질병 또는 의학적 상태를 나타낸다. 상기 질병 및 의학적 상태의 예는 림프종 (리툭산 (RITUXAN)을 사용하여 치료가능한 것으로 나타남), 감염성 질병 (시나기스 (SYNAGIS)를 사용하여 치료가능한 것으로 나타난 호흡기 세포융합 바이러스), 신장 이식 (제나팍스 (ZENAPAX)가 유용한 것으로 나타남), 크론병 및 류마티스성 관절염 (레미케이드 (REMICADE)를 사용하여 치료가능한 것으로 나타남), 유방암종 (헤르셉틴 (HERCEPTIN)을 사용하여 치료가능한 것으로 나타남), 및 결장암 (에드레콜로맙 (EDRECOLOMAB)을 사용하여 치료가능한 것으로 나타남)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "면역어드헤신 반응성 질병"은 적어도 부분적으로 면역어드헤신 요법을 사용하여 치료가능한 것으로 나타난 임의의 질병 또는 의학적 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "인간 효과기 세포의 존재 하에 모 항체보다 더 효과적으로 항체 의존 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하는" 변이체 폴리펩티드는 분석에 사용된 변이체 폴리펩티드 및 모 항체의 양이 본질적으로 동일할 때 시험관 내 또는 생체 내에서 ADCC를 매개하는데 있어서 실질적으로 보다 효과적인 것이다. 예를 들어, 주어진 ADCC 분석에서 상기 변이체는 동일한 ADCC 분석에서 모 폴리펩티드보다 더 다량의 표적 세포 용해를 유발한다. 상기 변이체는 예를 들어 ADCC 분석을 이용하여 확인될 수 있지만, ADCC 활성을 결정하기 위한 다른 분석 또는 방법도 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 동물 모델). 바람직한 실시태양에서, 변이체 폴리펩티드는 ADCC를 매개하는데 있어서 모 폴리펩티드보다 약 1.2, 1.3 또는 1.4배, 1.5배, 50배, 100배, 약 500배 또는 약 1000배 더 효과적이다.
용어 "항체 또는 면역어드헤신 반응성 질병의 증상"은 일반적으로 특정 질병과 연관된 증상을 나타낸다. 예를 들어, 보통 크론병과 연관된 증상은 복통, 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 발열, 식욕상실, 탈수, 빈혈, 팽만, 섬유증, 염증성 장 및 영양실조를 포함한다. 용어 "증상이 감소되도록 하는 조건 하에"는 임의의 항체 또는 면역어드헤신 반응성 질병의 검출가능한 증상의 임의의 정도의 정성적 또는 정량적 감소, 비제한적인 예를 들어 질병으로부터 회복 속도 (예를 들어, 체중 증가 속도)에 대한 검출가능한 충격, 또는 보통 특정 질병과 연관된 증상의 적어도 하나의 감소 (예를 들어, 항체 또는 면역어드헤신 반응성 질병이 크론병인 경우, 복통, 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 발열, 식욕상실, 탈수, 빈혈, 팽만, 섬유증, 염증성 장 및 영양실조의 감소의 적어도 하나의 증상)를 나타낸다.
모노클로날 항체 및 수용체
전장 항체 ("면역글로불린" 또는 "Ig")는 자연에 존재할 때 디술피드 결합에 의해 상호연결된 4개의 펩티드 사슬, 즉, 2개의 중쇄 (H) (전장일 때 약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄 (L) (전장일 때 약 25 kDa)로 이루어진 면역글로불린 분자이다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 책임지는 약 100-110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 책임지는 불변 영역을 규정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류되고 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 규정한다. 각각의 중쇄 종류는 특정 불변 영역을 특징으로 한다.
각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 "HCVR"로 칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD 및 IgA에 대해 3개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3); 및 IgM 및 IgE에 대해 4개의 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 "LCVR"로 칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. HCVR 및 LCVR 영역은 보다 보존되는 영역 (프레임워크 영역 (FR)으로 불림)이 산재되어 있는 초변이성의 영역 (상보성 결정 영역 (CDR)으로 불림)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 아미노산을 각각의 도메인에 배정하는 것은 잘 공지된 규약 [예를 들어 Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따른다. 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적 능력은 6개의 CDR에 의해 총체적으로 결정된다. 그러나, 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 단일 가변 도메인도 완전 Fab보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어 당업계에 잘 공지된 하이브리도마 기술 및 재조합 기술, 파지디스플레이 기술, 합성 기술 또는 당업계에 공지된 상기 기술의 조합을 이용하여 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"는 예를 들어 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함한 단일 카피 또는 클론으로부터 유래되는 항체를 나타내고, 그가 생산되는 방법을 나타내지 않는다. "모노클로날 항체"는 무손상 (완전 또는 전장) 항체, 실질적으로 무손상 항체, 항체의 기능적 단편일 수 있거나, 또는 키메릭 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다.
"모노클로날 항체"의 집단은 균질 또는 실질적인 균질 (또는 순수한) 항체 집단을 나타낸다 (즉, 집단 내의 항체의 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 또는 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%가 동일하고, ELISA 분석에서 동일한 항원 또는 에피토프에 대해 경쟁할 것이다).
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합하는"은 특이적 결합쌍의 한 구성원이 그의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 다른 분자에 유의하게 결합하지 않는 상황을 나타낸다. 상기 용어는 또한 예를 들어 본 발명의 항체의 항원 결합 도메인이 많은 항원에 담지된 특정 에피토프에 특이적인 경우에 적용가능하고, 이러한 경우 항원 결합 도메인을 담지하는 특이적 항체는 에피토프를 담지하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다.
Fc 영역은 효소 파파인을 사용한 소화에 의해 생산된 무손상 항체, 예를 들어, IgG의 일부를 나타낸다 (도 1 참조). Fc 영역은 각각의 사슬이 힌지 영역의 일부 및 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지는 동종이합체이다. Fc 영역은 힌지 영역 사이에 형성된 사슬간 디술피드 다리 및 CH3 도메인 사이의 다수의 비-공유 결합 때문에 다이머이다. IgG는 총 면역글로불린의 약 75%를 구성하는 체내에서 가장 풍부한 Ig 클래스이고, 혈관내 및 혈관외 풀 (pool) 내에 동등하게 분포한다. IgG는 항원에 대한 일차 반응의 초기 단계 동안 매우 적게 생산되지만, 2차 반응 동안 생산되는 항체의 주요 형태이다.
상기한 바와 같이, 항체는 비-항원 결합 기능에 관여하는 영역, 주로 CH2 및 CH3 영역을 갖는다. 이들 영역 및 링커 서열의 일부는 함께 일반적으로 Fc 영역으로 공지되고, 효과기 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 효과기 기능을 갖는다.
항체 Fc 영역에 의해 매개되는 효과기 기능은 2개의 카테고리로 나눌 수 있다 : (1) 항체의 항원에 대한 결합 후 작동하는 효과기 기능 (이들 기능은 예를 들어 보체 케스케이드 또는 Fc 수용체 (FcR)-보유 세포의 참여를 포함한다); 및 (2) 항원 결합에 독립적으로 작동하는 효과기 기능 (이들 기능은 예를 들어 순환혈 내 존속 및 세포전달작용 (transcytosis)에 의해 세포 장벽을 가로질러 전달되는 능력을 부여한다). 예를 들어, 보체의 C1q 성분이 항체에 결합하면 보체계를 활성화시킨다. 옵소닌화 (opsonization) 후, 보체의 활성화는 세포 병원체의 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민성에 관여될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하고, 여기서 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 FcR에 결합한다. IgG, IgE, IgA 및 IgM을 포함한 상이한 클래스의 항체에 특이적인 많은 FcR이 존재한다. 본 발명은 임의의 특정 메카니즘에 제한되지 않지만, 항체가 세포 표면 상의 FcR에 결합하면 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응, 예를 들어 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 청소, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (ADCC), 염증 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생산의 제어를 촉발한다.
몇몇 항체 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에 결합하는 FcR에 의해 매개된다. FcR은 면역글로불린 이소형에 대한 그들의 특이성에 의해 규정되고; IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR, IgE에 대해서는 FcεR, IgA에 대해서는 FcαR 등으로 칭한다. FcγR의 3개의 서브클래스가 확인되었다: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16).
각각의 FcγR 서브클래스는 2 또는 3개의 유전자에 의해 코딩되고 교대 RNA 스플라이싱은 다수의 전사체를 생성시키므로, FcγR 이소형에서 넓은 다양성이 존재한다. FcγRI 서브클래스 (FcγRIA, FcγRIB 및 FcγRIC)를 코딩하는 3개의 유전자는 염색체 1의 긴 팔의 영역 I q21.1 내에 군집하고; FcγRII 이소형 (FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC)을 코딩하는 유전자 및 FcγRIII (FcγRIIIA 및 FcγRIIIB)를 코딩하는 2개의 유전자는 모두 영역 1q22에 군집한다. 이들 상이한 FcR 서브타입은 상이한 세포 종류 상에서 발현된다 (예를 들어 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). 예를 들어, 인간에 있어서, FcγRIIIB는 호중구 상에서만 발견되는 반면, FcγRIIIA는 대식세포, 단핵구, NK 세포 및 T-세포의 아집단 상에서 발견된다. 특히, FcγRIIIA는 ADCC에 관련되는 세포 종류중 하나인 NK 세포 상에 존재한다.
인간 FcγRIIIA (CD16) 수용체는 그의 세포외 도메인 내의 위치 158에서 페닐알라닌 또는 발린을 코딩하는 공통적인 다형성을 갖는다. FcγRIIIA의 V 대립유전자는 F 대립유전자보다 인간 IgG1에 대한 친화도가 더 크다. V158 대립유전자는 또한 ADCC를 보다 효율적으로 매개한다. 임상 데이타는 리툭산 치료를 받는 환자에서 FcγRIIIA 수용체의 유전자형과 치료 반응 사이의 상관관계를 보여준다. 진행에 대한 임상적 및 분자적 반응 및 시간은 FcγRIIIA-158V 유전자형에 동형접합성인 환자 (집단의 약 20%)에서 우월한 것으로 나타났다. 반대로, 보다 낮은 친화도 FcγRIIIA-158F 유전자형에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 환자 (집단의 약 80%)는 보다 불량하게 반응한다. 이들 데이타는 158F 보유자의 ADCC 활성을 향상시키는 Fc 돌연변이가 암의 항체-기반 요법의 임상 효능을 향상시킬 수 있음을 제안한다. 그의 세포외 도메인 내의 위치 131에서 히스티딘 (H) 또는 아르기닌 (R)을 코딩하는 인간 FcγRIIA (CD32) 수용체에서 유전적 다형성이 또한 존재한다. 위치 131에서의 다형성은 인간 IgG에 결합하는 그의 능력에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 최근의 데이타는 또한 FcγRIIA 위치 131 다형성과 리툭산에 대한 임상 반응 사이의 상관관계를 보여준다. H131 대립유전자에 대한 동형접합성인 환자는 다른 두 군보다 유의하게 더 빠른 반응 속도를 가졌다.
FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII은 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF) 수용체이고; FcγRI은 그의 세포외 도메인에 3개의 IgSF 도메인을 갖는 한편, FcγRII 및 FcγRIII은 그들의 세포외 도메인에 단지 2개의 IgSF 도메인을 갖는다. 다른 종류의 Fc 수용체는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)이다. FcRn은 주조직적합 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로불린에 비공유 결합된 α-사슬로 이루어진다.
변이체 Fc 영역
본 발명은 변이체 폴리펩티드, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 변이체 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 아미노산 치환에 의해 모 폴리펩티드와 상이하다. "모", "야생형", "출발" 또는 "비변이체" 폴리펩티드는 바람직하게는 항체 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하고, 변이체 폴리펩티드 내의 아미노산 치환은 Fc 영역 내에서 일어난다. Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩티드는 Fc 영역 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 당업계에서 이용가능한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드는 항체이다. 그러나, 모 폴리펩티드는 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 면역어드헤신)일 수 있다. 모 폴리펩티드 내의 Fc 영역의 부분은 천연 또는 비천연 서열의 것일 수 있고, 바람직하게는 인간 기원의 천연 서열이다. 특정 실시태양에서, 변이체 Fc 영역은 (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라) 생성될 수 있고, 선택된 이종 폴리펩티드, 예를 들어 항체 가변 도메인 또는 수용체 또는 리간드의 결합 도메인, 또는 임의의 치료 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드는 Fc 영역 또는 그의 기능적인 일부를 포함한다. 일반적으로, 모 폴리펩티드의 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역, 바람직하게는 인간 천연 서열 Fc 영역을 포함할 것이다. 그러나, 모 폴리펩티드의 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역으로부터 하나 이상의 기존재하는 아미노산 서열 변이 또는 변형 (예를 들어 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 예를 들어, Fc 영역의 C1q 결합 활성이 사전에 변경될 수 있거나, Fc 영역의 FcγR 결합 친화도가 변경될 수 있다. 목적하는 변이체 Fc 영역 또는 관심있는 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산은 변이체 Fc 영역의 목적하는 융합 파트너 (예를 들어, 항체 가변 영역, 이종 단백질)에 작동가능하게 부착되지 않은 상태에서 제작된 다음, 그에 작동가능하게 부착되도록 후속적으로 공학처리될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 모 폴리펩티드 Fc 영역은 개념적이고 (예를 들어, 정신적 사고 또는 컴퓨터 또는 종이 상의 시각적 표현), 물리적으로 존재하지 않지만, 항체 공학자는 목적하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 결정하고, 목적하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 코딩하는 서열 또는 DNA를 포함하는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드의 Fc 영역을 코딩하는 핵산이 이용가능하고, 상기 핵산 서열은 변이체 Fc 영역을 코딩하는 변이체 핵산 서열을 생성하도록 변경된다.
모 폴리펩티드의 변이체 (또는 단순히 변이체 Fc 영역)을 코딩하는 핵산은 특정 서열에 대한 본 명세서의 지침을 이용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 더 일찍 제조된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 부위-지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이 생성, PCR 돌연변이 생성 (예를 들어 Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)) 및 카세트 돌연변이 생성 (예를 들어 Wells et al., Gene 34:315-323 (1985))에 의한 제조를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 부위-지정 돌연변이 생성이 바람직한 변이체 제조 방법이다. 이 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) 및 Kunkel et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987) 참조).
별법으로 또는 추가로, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 목적하는 아미노산 서열이 결정될 수 있고, 변이체 폴리펩티드 (즉, 본원에 설명된 바와 같은 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 서열은 합성적으로 생성될 수 있다. 모 Fc 영역은 변이체 Fc 영역의 분자 전구체가 아니라 목적하는 아미노산 치환의 부재 하에 모 영역 내에 존재하는 Fc 영역의 아미노산 서열이기는 하지만, 이것은 여전히 모 Fc 영역의 변이체 Fc 영역인 것으로 간주된다.
모 폴리펩티드의 아미노산 서열은 시험관 내 및(또는) 생체 내에서 변경된 Fc 수용체 결합 친화도 또는 활성; 및(또는) 시험관 내 및(또는) 생체 내에서 변경된 ADCC 활성; 및(또는) 시험관 내 및(또는) 생체 내에서 변경된 CDC 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 생성하도록 변형될 수 있다. 모 폴리펩티드의 아미노산 서열은 또한 변경된 보체 결합 특성 및(또는) 순환 반감기를 갖는 변이체 Fc 영역을 생성하도록 변형될 수 있다.
Fc 영역의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 시트 또는 나선 형상과 같은 치환 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 측쇄의 부피, (d) 탄수화물과의 상호작용, 또는 (e) 도메인 이동의 탄력성을 변경시키는 것에 대한 그들의 효과가 유의하게 상이한 아미노산 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다. 자연발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기초로 다음 클래스로 나누어진다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향성: trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스의 구성원으로의 교환을 수반할 것이다. 보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로의 교환을 수반할 것이다.
하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 변이체 Fc 영역을 변경된 활성 (효과기 기능(들) 및(또는) 약동학)을 갖도록 공학처리할 수 있다. 예를 들어, ADCC 활성 또는 CDC 활성 또는 FcRn 결합 친화도를 변경 (예를 들어 증가 또는 감소)시키기 위해 Fc 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 변형은 본원에서 표 1에 나열된 것과 같은 치환이다. 일반적으로, 상기 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 본원에서 ADCC 활성에 영향을 미치는 것으로 확인된 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 아미노산 치환을 수행할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 1 내지 약 10개 이하의 Fc 영역 잔기가 치환될 것이다. 본원에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역은 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 모 Fc 영역 서열 또는 천연 인간 Fc 영역 서열을 보유할 것이다.
모 Fc 영역에 적절한 아미노산 서열 변형(들)을 도입함으로써, (모 Fc 영역에 비해) (a) 인간 효과기 세포의 존재 하에 보다 더 또는 보다 덜 효과적으로 ADCC를 매개하고(하거나) (b) 인간 보체의 존재 하에 보다 더 또는 보다 덜 효과적으로 CDC를 매개하고(하거나) (c) 목적하는 친화도로 C1q에 결합하고(하거나) (d) 목적하는 친화도로 Fc 감마 수용체 (FcγR) 또는 Fc 신생아 수용체 (FcRn)에 결합하는 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 상기 변이체 Fc 영역은 일반적으로 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함할 것이다. 바람직하게는, 변형은 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 본원에서 표 1-9에 나열된 바와 같은 아미노산 치환이다.
바람직한 실시태양에서, 모 폴리펩티드 Fc 영역은 인간 Fc 영역 또는 그의 기능적 단편, 예를 들어 천연 인간 Fc 영역 인간 IgG1 (f 및 a,z 동종이인자형), IgG2, IgG3, IgG4, 및 임의의 종으로부터 공지되거나 밝혀진 모든 동종이인자형이다. 상기 영역은 천연 서열, 예를 들어 본원에서 도 2 (서열 1-8) 및 도 3 (서열 9-12)에 나타낸 서열을 갖는다.
특정 실시태양에서, 향상된 ADCC 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해, 모 폴리펩티드는 바람직하게는 기존재하는 ADCC 활성을 갖는다 (예를 들어 모 폴리펩티드는 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 Fc 영역을 포함한다). 일부 실시태양에서, 변이체는 모 폴리펩티드에 비해 향상된 ADCC 활성 (예를 들어, 본원에 설명된 ADCC 분석에 따라 모 폴리펩티드에 비해 더 큰 수준)을 갖는다. 즉, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는, 모 Fc 영역 또는 천연 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역 서열을 포함하지만 그 외에는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체와 동일한 모노클로날 항체에 비해 동일한 상황 하에서 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 아미노산 치환(들)은 Fc 영역의 CH2 및(또는) CH3 도메인 내로 도입된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이체를 생성하기 위해 템플레이트로서 사용된 모 Fc 영역은 인간 IgG Fc 영역을 포함한다.
특정 실시태양에서, 향상된 CDC 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해, 모 폴리펩티드는 바람직하게는 기존재하는 CDC 활성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 변이체는 모 폴리펩티드에 비해 향상된 CDC 활성 (예를 들어, 본원에 설명된 CDC 분석에 따라 모 폴리펩티드에 비해 더 큰 수준)을 갖는다. 즉, 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 모 Fc 영역 또는 천연 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역 서열을 포함하지만 그 외에는 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체와 동일한 모노클로날 항체에 비해 동일한 상황 하에서 향상된 CDC 활성을 갖는다.
본원에 설명된 변이체 폴리펩티드는 폴리펩티드의 목적하는 또는 의도된 용도에 따라 추가로 변형될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 아미노산 서열의 추가의 변경 (아미노산 잔기의 치환, 삽입 및(또는) 결손), 탄수화물 변형, 이종 폴리펩티드(들)에 대한 융합 및(또는) 공유 변형을 포함할 수 있다. 상기 추가의 변형은 Fc 수용체 결합 및(또는) ADCC 활성 및(또는) CDC 활성을 변경시키는 본원에 개시된 아미노산 변형(들)에 앞서, 그와 동시에 또는 그후에 이루어질 수 있다.
별법으로 또는 추가로, 아미노산 변형을 Fc 영역의 C1q 결합 및(또는) CDC 기능을 변경시키는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형과 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 출발 폴리펩티드는 C1q에 결합할 수 없고(없거나) CDC를 매개할 수 없고, 이들 추가의 효과기 기능을 획득하도록 본원의 교시내용에 따라 변형될 수 있다. 또한, 기존재하는 C1q 결합 활성을 갖고, 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는 폴리펩티드는 이들 활성 중 하나 또는 둘 모두가 향상되도록 (또는 별법으로 감소되도록) 변형될 수 있다. C1q 결합을 변경하고(하거나) CDC 활성을 변형시키는 특정 Fc 영역 아미노산 변형은 본원 (표 2, 7, 8 및 10 참조)과 예를 들어 WO00/42072에 기재되어 있다.
상기 논의한 바와 같이, 예를 들어 CDC 활성 및(또는) ADCC 활성을 변형시킴으로써 변경된 효과기 기능을 갖는 Fc 영역 또는 그의 일부를 설계할 수 있다. 예를 들어, 개선된 CDC 활성 및 개선된 ADCC 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 별법으로, 효과기 기능을 감소하거나 제거하기를 원하는 경우, 감소된 CDC 활성 및(또는) 감소된 ADCC 활성을 갖도록 변이체 Fc 영역을 공학처리할 수 있다. 다른 실시태양에서, 개선된 ADCC 활성 및 감소된 CDC 활성을 갖거나 그 반대의 변이체 Fc 영역을 생성하기 위해 이들 활성 중 하나만을 증가시키고 임의로 다른 활성을 또한 감소시킬 수 있다. 추가로, FcRn, 단백질 A, 및(또는) 다른 Fc 결합 단백질에 대한 변형된 결합 친화도를 갖도록 변이체 Fc 영역을 공학처리할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 모 폴리펩티드는 Fc 영역 (또는 그의 일부)를 포함하고, 변이체는 Fc 영역 내에서 적어도 하나의 표면 잔기 아미노산 변형을 포함한다 (예를 들어 Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-70, April 1981, 및 WO00/42072 참조). 다른 실시태양에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 변이체는 Fc 영역에서 적어도 하나의 비-표면 잔기 아미노산 변형을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 Fc 영역에서 적어도 하나의 표면 아미노산 변형 및 적어도 하나의 비-표면 아미노산 변형을 포함한다.
조합 변이체
일부 실시태양에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 2 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함한다. 상기 조합 변이체는 예를 들어 2 이상의 상기 설명된 아미노산 치환 (예를 들어, 표 1 참조), 또는 당업계에 공지된 치환에 추가하여 표 1에 나열된 하나 이상의 아미노산 치환을 선택함으로써 생산할 수 있다.
표 10에 나타낸 조합 변이체 및 다른 조합 변이체 (예를 들어 본원에 개시된 것과 조합으로 사용되는 WO00/42072에 개시된 치환)는 주어진 활성 (예를 들어, FcRn 결합 활성, ADCC 활성 및 CDC 활성)에 대해 다양한 분석 (하기 실시예 참조)으로 시험할 수 있다. 이와 관련하여, 유용한 조합 변이체가 확인될 수 있다.
바람직한 특정 실시태양에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역에 존재하는 다수의 아미노산 치환은 ADCC 활성을 증가시키는 하나의 아미노산 치환, 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 (예를 들어, pH 6.0에서) 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 친화도를 증가시키는 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 조합 변이체는 본 발명의 변이체 Fc 영역에서 하나의 표면 아미노산, 및 하나의 비-표면 아미노산 변형을 갖는다. 본 발명의 변이체 Fc 영역에서 추가의 조합 변이체는 2 이상의 본원에 설명된 아미노산 치환, 또는 적어도 하나의 본원에 설명된 아미노산 치환을 예를 들어 WO00/42072에 설명된 것과 조합함으로써 생성될 수 있다.
변이체 폴리펩티드 분석
본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 스크리닝하기 위한 다양한 분석을 제공한다. 스크리닝 분석은 유용한 변이체를 찾거나 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 조합 변이체 (예를 들어, 표 10 참조)는 변경된 FcR 결합, 및(또는) 변경된 ADCC 및(또는) 변경된 CDC 활성 (예를 들어, 증가 또는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성) 및(또는) 전혈로부터 표적 세포 (예를 들어, B 세포)를 고갈시키는 변형된 능력을 갖는 변이체를 찾기 위해 스크리닝될 수 있다. 또한, 아래 설명된 바와 같이, 본 발명의 분석은 대상 (예를 들어, 항체 또는 면역어드헤신 반응성 질병의 증상이 있는 인간)에서 유익한 치료 활성을 갖는 변이체를 찾거나 확인하기 위해 사용될 수 있다. 모 폴리펩티드에 비해 변이체에서 임의의 변화를 평가하기 위해 다양한 분석 종류가 사용될 수 있다 (예를 들어, WO00/42072에 제공된 스크리닝 분석). 추가의 예시적인 분석을 아래 설명한다.
바람직한 실시태양에서, 변이체 폴리펩티드 (즉, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 기능적인 일부)는 모 폴리펩티드에 비해 (비변형된 항원 결합 영역 또는 변형된 항원 결합 영역을 통해) 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 본질적으로 보유하는 모노클로날 항체이다 (예를 들어, 결합능은 모 폴리펩티드에 비해 바람직하게는 20배, 10배, 7배 미만, 또는 약 5배 미만으로 상이하다). 항원에 대한 변이체 폴리펩티드의 결합능은 ELISA, 형광 활성화 세포 분리 (FACS) 분석, 또는 방사성 면역침전 (RIA)과 같은 기술을 이용하여 결정될 수 있고, 예를 들어 FcR 결합 분석이 본 발명의 변이체를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체, 예를 들어 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, FcRn 등의 결합은 ELISA 포맷에서 변이체 폴리펩티드에 결합하는 항체를 이용하여 변이체 폴리펩티드를 적정하고 결합된 변이체 폴리펩티드를 측정함으로써 측정될 수 있다 (하기 실시예 참조). 예를 들어, 항체를 포함하는 변이체는 pH 6.0 및 pH 7.0 또는 pH 7.4에서 FcRn에 대한 결합을 결정하기 위해 표준 ELISA 분석으로 스크리닝될 수 있다. 임의의 종, 예를 들어 마우스 또는 인간으로부터 비오틴 표지된 FcRn을 포획하기 위해 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘으로 코팅된 고체 표면이 사용될 수 있다. 차단 후, 포획 수용체는 pH 6.0 또는 pH 7.0에서 버퍼에 희석된 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)와 함께 인큐베이팅될 수 있다. 다음 단계에서, 인간 항체에 특이적인 분자가 첨가된다 (예를 들어, 효소에 컨쥬게이팅된 염소 (Fab')2 항-인간-Fab). 그후, pH 6.0 또는 pH 7.0 또는 pH 7.4에서 고정된 FcRn에 대한 변이체 폴리펩티드의 결합의 양을 결정하기 위해 기질이 첨가될 수 있다. 상기 분석의 결과는 동일한 FcR에 결합하는 모 (비-변이체) 폴리펩티드의 능력에 비교될 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 변이체를 스크리닝하기 위해 ELISA (예를 들어, FcRn을 사용하는)를 수행하기 위한 성분들은 키트 (예를 들어, 사용 지시서와 함께)에 포장된다.
본 발명의 변이체를 스크리닝하기 위해 ADCC 분석이 또한 사용될 수 있다. ADCC 분석은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행할 수 있다. 변이체 폴리펩티드의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 변화하는 효과기:표적 비를 이용하여 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 예시적인 ADCC 분석은 임의의 다음 표적 항원을 발현하는 표적 세포주를 사용할 수 있다: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, EGF 수용체, her-2 수용체, 전립선-특이적 막 항원, LewisY 탄수화물, GD2 및 GD3 강글리오시드, 램프 (lamp)-i, CO-029, L6 및 ephA2. 효과기 세포는 건강한 공여자 (예를 들어, 실험일에) 및 Histopaque (Sigma (시그마))를 사용하여 정제된 PBMC로부터 얻을 수 있다. 이어서, 표적 세포는 효과기 세포와 예를 들어 40:1, 20:1 및 10:1의 효과기:표적 비로 혼합하기 전에 약 30분 동안, 예를 들어 0.1 - 1,000 ng/ml에서 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 IgG와 함께 예비인큐베이팅된다. 이어서 ADCC 활성은 손상된 세포의 세포질액으로부터 상등액 내로 방출된 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성의 측정에 기초한 세포 사멸 및 용해의 정량을 위해 세포독성 검출 키트 (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals))를 사용하여 비색계로 측정할 수 있다. ADCC 활성은 또한 크롬 로딩된 표적 세포 분석에서 방출된 생성되는 크롬 51을 측정함으로써 측정할 수 있다. 항체 독립적 세포 세포독성은 항체의 부재 하에 표적 및 효과기 세포로부터 LDH 활성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 총 방출은 1% Triton X-100을 표적 및 효과기 세포의 혼합물에 첨가한 후 측정할 수 있다. 표적 및 효과기 세포의 인큐베이션은 5.0% CO2 내에서 37℃에서 최적화 기간 (0.54-18 시간) 동안 수행한 후 분석 플레이트를 원심분리할 수 있다. 이어서, 상등액을 96웰 플레이트에 옮기고 LDH 검출 시약과 함께 25℃에서 30분 동안 인큐베이팅할 수 있다. 이어서, 샘플 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 측정할 수 있다. 이어서, %세포독성은 다음 식을 이용하여 계산할 수 있다: %세포독성 = (실험값 - 저대조군)/(고대조군 - 저대조군) X 100%. 이어서, 항-CD20 및 변이체의 %세포독성은 상대적 유효성의 측정치를 제공하기 위해 동량의 리툭산을 사용하여 직접 비교될 수 있다. 예시적인 ADCC 분석은 표적 세포원으로서 CD20 항원을 과발현하는 SKW6.4 세포 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 구입함)를 사용할 수 있다. 상기 분석에 대한 많은 변형이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Zuckerman et al., CRC Crit Rev Microbiol 1978;7(1): 1-26).
상기 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 NK 세포, 대식세포 및 다른 PBMC를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 별법으로 또는 추가로, 본 발명의 변이체 폴리펩티드의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998))에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
본 발명의 변이체는 또한 보체 활성화에 대해 스크리닝될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) 참조). 예를 들어, 다양한 농도의 변이체 폴리펩티드 및 인간 보체를 버퍼로 희석할 수 있다. 변이체 폴리펩티드가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 1 x 106 세포/ml의 밀도로 희석할 수 있다. 변이체 폴리펩티드, 희석된 인간 보체 및 항원을 발현하는 세포의 혼합물을 평저 조직 배양 96웰 플레이트에 첨가하고 보체 매개된 세포 용해를 촉진하기 위해 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 이어서, 50 ㎕의 알라마르 블루 (어큠드 인터내셔날 (Accumed International))를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 밤새 인큐베이팅할 수 있다. 흡광도는 530 nm에서 여기 및 590 nm에서 방출하는 96웰 형광계를 사용하여 측정할 수 있다. 결과는 상대 형광 단위 (RFU)로 표현할 수 있다. 샘플 농도는 표준 곡선으로부터 컴퓨터로 계산할 수 있고, 비변이체 폴리펩티드에 비교한 %활성을 관심있는 변이체 폴리펩티드에 대해 기록할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 보체를 활성화시키지 않거나 보체를 불량하게 활성화시킨다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 돌연변이되지 않은 IgG1 Fc 영역을 갖는 대조군 항체에 비해 본 분석에서 약 0-10% CDC 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체는 상기 CDC 분석에서 임의의 CDC 활성 (예를 들어, 배경을 넘는)을 갖는 것으로 보이지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비해 향상된 CDC를 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, IC5O값을 비교할 때 시험관 내 또는 생체 내에서 CDC 활성에서 바람직하게는 약 1.1, 1.5, 1.7 또는 2배 내지 약 100배 (이상의) 향상을 나타낸다).
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 또한 전혈 분석에서 표적 세포의 고갈에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 다양한 농도의 CD20 표적 특이성을 갖는 변이체 폴리펩티드가 facs를 이용하여 전혈 분석에서 B 세포의 고갈에 대해 스크리닝될 수 있고 (Vugmeyster et al., 2003 Cytometry 52A, 101-109); 새로 취한 혈액을 변화하는 농도의 변이체 폴리펩티드와 함께 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 (시간은 변화될 수 있다) 인큐베이팅한다. 인큐베이션 후, 적혈구를 제조자의 지시에 따라 염화암모늄 시약 (벡톤-디킨슨 (Beckton-Dickinson) cat. #555899)을 사용하여 용해시키고, B 세포를 B 세포에 특이적인 형광-표지된 항체 (예를 들어, 항-CD 19)를 사용하여 facs에 의해 검출한다. 결과를 비처리 샘플 또는 무관한 (비-고갈) 항체와 함께 인큐베이팅한 샘플에 대한 상대적인 B 세포의 %고갈로서 표현할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 B 세포를 고갈시킨다. 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드보다 예를 들어 약 2배 이상 더 큰 정도, 바람직하게는 약 5배 이상으로 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 또한, 변이체는 B 세포를 고갈시키는데 있어서 더 큰 효력을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변이체는 약 5배 미만, 바람직하게는 약 10배 미만의 항체를 이용하여 모 폴리펩티드에 비해 동일한 비율의 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 변이체에 의해 매개된 표적 세포 고갈은 모 폴리펩티드에 비해 약 2배, 3배, 5배 내지 약 1000배 이상, 바람직하게는 약 5배 내지 약 1000배 개선될 수 있다.
본 발명의 변이체는 또한 생체 내에서 스크리닝될 수 있다. 임의의 종류의 생체내 분석이 사용될 수 있다. 하나의 분석 종류의 특정 예를 아래에 제공한다. 본 예시적인 분석은 생체 내에서 Fc 변이체의 전임상 평가를 허용한다. 시험될 변이체는 일부 활성을 갖는 것으로 공지된 특정 항체의 Fc 영역 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 돌연변이 생성에 의해 항-CD20 IgG의 Fc 영역 내로 포함될 수 있다. 이는 모 IgG 및 Fc 변이체 IgG가 리툭산 (종양 회귀를 촉진하는 것으로 공지된)과 직접 비교되도록 한다. 전임상 평가는 2상 (약동학 및 약역학 상)으로 이루어질 수 있다. I상 약동학 연구의 목표는 Fc 변이체 IgG와 공지의 생체내 활성을 갖는 항체 (예를 들어, 리툭산) 사이의 청소율에 차이가 있는지 결정하기 위한 것이다. 청소율에서의 차이는 혈청 내 IgG의 항정 상태 수준에서의 차이를 일으킬 수 있다. 따라서, 항정 상태 농도에서의 차이가 검출되면, 정확한 비교가 이루어질 수 있도록 이들은 표준화되어야 한다. II상 약역학 연구의 목표는 본 경우에 종양 성장에 대한 Fc 돌연변이의 효과를 결정하기 위한 것이다. 리툭산을 사용하는 선행 연구에서는 종양 성장을 완전히 억제한 단일 용량을 사용하였다. 이는 정량적 차이를 측정할 수 없기 때문에, 일정 용량 범위가 사용되어야 한다.
Fc 변이체, 야생형 모 Fc 및 리툭산의 I상 약동학 비교는 예를 들어 다음 방식으로 수행할 수 있다. 먼저, 동물마다 40 ㎍ (또는 시험될 다른 용량)을 정맥내 주사하고, 0, 0.25, 0.5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 및 336 hr에서 IgG의 혈장 수준을 정량할 수 있다. 데이타는 청소율을 얻기 위해 예를 들어 제로 래그 (zero lag) 2 컴파트먼트 (compartment) 약동학 모델을 사용하는 약동학 프로그램 (WinNonLin)을 사용하여 피팅할 수 있다. 청소율은 다음 식을 이용하여 항정 상태 혈장 수준을 규정하기 위해 사용될 수 있다: C = 용량/(청소율 X t) (여기서, t는 용량 사이의 간격이고 C는 항정 상태에서의 혈장 수준이다). 약동학 실험은 예를 들어 시점당 최소 5마리의 마우스를 사용하여 비-종양 담지 마우스에서 수행할 수 있다.
예시적인 동물 모델은 그 다음 상에서 다음 방식으로 사용될 수 있다. CB17-SCID 마우스의 우측 옆구리에 106 Raji 세포를 피하 이식할 수 있다. 변이체 Fc 항체, 야생형 Fc 항체 및 리툭산의 정맥내 볼러스를 이식 직후 개시하여 종양 크기가 직경 2 cm를 초과할 때까지 계속할 수 있다. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 길이, 폭 및 깊이를 측정함으로써 종양 부피를 월요일, 수요일 및 금요일마다 결정할 수 있다 (종양 부피= W x L x D). 종양 부피 대 시간의 플롯은 약역학 계산을 위한 종양 성장율을 제공할 것이다. 군당 최소 약 10마리의 동물을 사용해야 한다.
변이체 Fc 항체, 야생형 Fc 항체 및 리툭산의 II상 약역학적 비교는 다음 방식으로 수행할 수 있다. 공개된 데이타를 기초로, 리툭산은 매주 10 ㎍/g에서 생체 내에서 종양 성장을 완전히 억제하였다 (Clynes et al, Nat. Med. 6:443-6, 2000). 따라서, 10 ㎍/g, 5 ㎍/g, 1 ㎍/g, 0.5 ㎍/g 및 0 ㎍/g의 1주 투여량 범위를 시험할 수 있다. 종양 성장율이 50% 억제되는 항정 상태 혈장 수준을 항정 상태 혈장 수준과 유효성 사이의 관계에 의해 그래프로 결정할 수 있다. 항정 상태 혈장 수준은 상기한 바와 같이 계산할 수 있다. 필요한 경우, τ는 따라서 각각의 변이체 Fc 항체 및 야생형 Fc 항체에 대해 리툭산에 상당하는 항정 상태 혈장 수준을 달성하기 위해 그들의 약동학 특성에 따라 조정될 수 있다. 모 폴리펩티드 (예를 들어, 야생형 Fc 항체) 및 리툭산에 비교하여 변이체 Fc 항체의 통계학상 개선된 약역학 값은 일반적으로 변이체 Fc 항체가 생체 내에서 개선된 활성을 부여함을 나타낸다.
변이체 Fc 항체, 야생형 Fc 항체 및 리툭산의 추가의 약역학적 비교는 문헌에서 설명된 바와 같이 사이노몰거스 원숭이에서 수행할 수 있다 (Reff et al, Blood 83, 435-445, 1994). Fc 변이체의 상대적 효능을 정맥내 및(또는) 피하 투여된 야생형 Fc 및 리툭산과 비교하기 위해 말초 B 세포 및 림프절 B 세포의 고갈에 대한 용량 반응을 사용할 수 있다. 모 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 야생형) 및 리툭산에 비교하여 Fc 변이체의 통계학상 개선된 약역학값은 일반적으로 변이체 Fc 항체가 생체 내에서 개선된 활성을 부여함을 나타낸다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 변이체 (즉, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 기능적인 일부)는 적어도 2개의 종에서 치료 용도로 유용한 변이체가 확인되도록 스크리닝된다. 상기 변이체는 본원에서 "이중 (dual)-종 개선된 변이체"로서 칭하고, 인간에서 치료제이고 또한 동물 모델에서 효능을 나타내는 (또는 나타낼 것으로 보이는) 변이체를 확인하기 위해 특히 유용하다. 이와 관련하여, 본 발명은 동물 모델 데이타가 아마 정부 감독 기관 (예를 들어, 미국 식품 의약청)에서 인정된 임의의 인간 시험 용도를 지지할 것이므로 인간 임상 시험에 대해 승인될 가능성이 큰 변이체를 확인하기 위한 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 이중-종 개선된 변이체는 먼저 인간 효과기 세포를 사용하는 ADCC 분석을 수행하여 개선된 변이체를 발견한 다음, 마우스, 래트, 또는 비인간 영장류 효과기 세포를 사용하는 제2 ADCC 분석을 수행하여 이중-종 개선된 변이체인 개선된 변이체의 서브세트를 확인함으로써 확인된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) 적어도 일부의 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체 (여기서, 후보 변이체는 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 후보 변이체는 제1 종 (예를 들어 인간)의 효과기 세포의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개한다)를 포함하는 조성물 및 iii) 제2 종 (예를 들어 마우스, 래트, 또는 비인간 영장류) 효과기 세포를 제공하고, b) 후보 변이체가 표적 세포에 결합하여 후보 변이체 결합된 표적 세포를 생성시키도록 하는 조건 하에 조성물을 표적 세포와 함께 인큐베이팅하고, c) 제2 종 효과기 세포를 후보 변이체 결합된 표적 세포와 혼합하고, d) 후보 변이체에 의해 매개된 표적 세포 세포독성을 측정하는 것을 포함하는, 이중-종 개선된 변이체를 확인하기 위한 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 상기 방법은 e) 후보 변이체가 제2 종 효과기 세포의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는지 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 f) 후보 변이체를 제2 종 효과기 세포의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는 이중-종 개선된 변이체로서 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 확인된 이중-종 변이체는 이어서 하나 이상의 동물 분석으로 생체 내에서 스크리닝된다.
특정 실시태양에서, 이중-종 개선된 변이체는 인간 혈액을 사용하는 전혈 분석을 수행하여 개선된 변이체를 발견한 다음, 마우스, 래트, 또는 비인간 영장류 혈액을 사용하는 제2 전혈 분석을 수행하여 이중-종 개선된 변이체인 개선된 변이체의 서브세트를 확인함으로써 확인된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) 적어도 일부의 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체를 포함하는 조성물 (여기서, 후보 변이체는 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 후보 변이체는 제1 종 (예를 들어 인간) 혈액의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개한다) 및 iii) 제2 종 (예를 들어 마우스, 래트, 또는 비인간 영장류) 혈액을 제공하고, b) 후보 변이체가 표적 세포에 결합하여 후보 변이체 결합된 표적 세포를 생성하는 조건 하에 조성물을 표적 세포와 함께 인큐베이팅하고, c) 제2 종 혈액을 후보 변이체 결합된 표적 세포와 혼합하고, d) 후보 변이체에 의해 매개된 표적 세포 고갈을 측정하는 것을 포함하는, 이중-종 개선된 변이체를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 e) 후보 변이체가 제2 종 혈액의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개하는지 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 f) 후보 변이체를 제2 종 혈액의 존재 하에 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개하는 이중-종 개선된 변이체로서 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 확인된 이중-종 변이체는 이어서 하나 이상의 동물 분석으로 생체 내에서 스크리닝된다.
특정 실시태양에서, 이중-종 개선된 변이체는 인간 성분 (예를 들어, 인간 세포, 인간 FcR 등)을 사용하는 임의의 상기 분석을 수행하여 개선된 변이체를 확인한 다음, 비인간 동물 성분 (예를 들어, 마우스 세포, 마우스 FcR 등)을 사용하는 동일한 분석 (또는 상이한 분석)을 실행함으로써 확인된다. 이와 관련하여, 인간 기초 분석 및 제2 종 기초 분석 모두에서 주어진 기준에 따라 잘 수행하는 변이체의 서브세트가 확인될 수 있다.
이중-종 개선된 변이체를 확인하기 위한 예시적인 공정은 다음과 같다. 먼저, IgG Fc 영역의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열이 발현된 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산 변화를 가져서 변이체를 생성하도록 돌연변이된다. 이어서, 상기 발현된 IgG 변이체는 인간 PBMC 또는 서브세트 (예를 들어, NK 세포 또는 대식세포)를 사용하는 ADCC 분석으로 특성화된다. 향상된 ADCC 활성이 발견되면, 변이체를 마우스 또는 래트 PBMC를 사용하는 제2 ADCC 분석으로 스크리닝한다. 별법으로 또는 추가로, 클로닝된 설치류 수용체 또는 세포주에 대한 결합에 대해 변이체를 사용하여 분석을 수행할 수 있다. 마지막으로, 변이체가 이중-개선된 변이체로 만드는 제2 분석에서 개선되는 것으로 밝혀지면, 변이체는 마우스 또는 래트에서 생체내 스크리닝된다.
예시적인 변이체 Fc 영역 함유 분자
본 발명의 변이체 Fc 영역은 보다 큰 분자의 일부일 수 있다. 보다 큰 분자는 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 면역어드헤신 등일 수 있다. 추가로, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 그가 변경 (증가 또는 감소)된 반감기를 부여할 수 있는 비-항체 폴리펩티드에 작동가능하게 부착될 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이체 Fc 영역에 대한 넓은 용도 범위가 존재하는 것이 명백하다
변이체 Fc 영역을 함유하는 항체
바람직한 실시태양에서, 변이체 Fc 영역 함유 분자 (예를 들어, 폴리펩티드)는 항체이다. 항체 생산 기술을 아래에서 설명한다.
(i) 항원 선택 및 제조
일반적으로, 변이체 Fc 영역 함유 분자가 항체이면, 항체는 관심있는 항원에 대해 지정된다. 바람직하게는, 항원은 폴리펩티드이고, 항원 분자의 양 또는 활성 감소로부터 이익을 얻는 질병 또는 질환에 걸린 포유동물에 항체를 투여하면 그 포유동물에서 치료상 유익할 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원 (예를 들어, 종양 관련 당지질 항원; 미국 특허 5,091,178 참조)에 대해 지정된 항체도 또한 사용될 수 있다.
예시적인 항원은 분자, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-i-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란드 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시 조절됨, 정상적으로 T-세포 발현 분비됨); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 물러관 억제물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예를 들어 골 유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자; 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 FGF 및 FGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 또는 TGF-5를 포함한 TGF-알파 및 TGF 베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골형성 단백질 (BMP); 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF8); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-25; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-25 세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 그렐린; 세포자멸 경로의 구성원; 및 임의의 상기 나열된 폴리펩티드의 단편 또는 전구체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바람직한 항원은 CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p I50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, a4/p7 인테그린 및 (5 또는 그의 서브유닛을 포함하는 Xv/p3 인테그린 (예를 들어 항-CDIIa, 항-CD18 또는 항-CDIIb 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (α-IFN); 성장 분화 인자, 예를 들어 GDF-8; 인터루킨, 예를 들어 IL-8; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 및 그렐린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
임의로 다른 분자에 컨쥬게이팅된 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 트랜스멤브레인 분자, 예를 들어 수용체에 대해, 이들의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 별법으로, 트랜스멤브레인 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 원료 (예를 들어, 암 세포주)로부터 유래할 수 있거나, 트랜스멤브레인 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 다른 항원 및 그의 항체를 제조하기 위해 유용한 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
(ii) 폴리클로날 항체
본 발명은 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리클로날 항체를 제공한다. 예를 들어, 변형된 IgG1 불변 영역을 함유하는 인간 면역글로불린 레파토리를 면역글로불린-불활성화된 마우스 내로 이식하여, 변형된 Fc 영역을 함유하는 IgG 레파토리를 발현하는 마우스를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, Mendez, MJ et al, Nature Genetics 15:146 (1997) 참조). 폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보강제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 유도된다. 이중기능적 물질 또는 유도화제 (예를 들어, 시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션을 위해 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르, 리신 잔기를 통한 컨쥬게이션을 위해 N-히드록시숙신이미드, 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다))를 사용하여, 면역화시킬 종에 면역원성인 단백질 (예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제)에 관련 항원을 컨쥬게이팅하는 것이 유용할 수 있다.
토끼 및 마우스에 대한 일반적 면역화 프로토콜의 예는 다음과 같다. 동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (예를 들어, 각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 완전 보강제와 혼합하고 용액을 다수 부위에서 피부내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 동물에게 프로인트 완전 보강제 중 원래 양의 펩티드 또는 컨쥬게이트의 1/5 또는 1/10을 다수 부위에서 피하 주사에 의해 접종한다. 7 내지 14일 후, 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 평탄해질 때까지 동물을 추가 접종한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 컨쥬게이팅되고(되거나) 상이한 가교결합 시약을 통한 동일한 항원의 컨쥬게이트로 추가 접종한다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체와 같이 재조합 세포 배양으로 제조될 수 있다. 또한, 면역 반응을 향상시키기 위해 응집제, 예를 들어 백반이 적합하게 사용된다.
(iii) 모노클로날 항체
본 발명은 변이체 Fc 영역을 갖는 모노클로날 항체를 제공한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어 Kohler et al, Nature, 256: 495, 1975에 설명됨)을 사용하거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567)에 의한 것을 포함한 많은 방식으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 (macaque) 원숭이를 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하도록 면역화시킨다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에 접종되어 배양된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종주, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-1 I 마우스 종양 (솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능함), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 매릴랜드주 록빌)로부터 입수가능함)로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 설명되었다 (예를 들어, Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 RIA 또는 ELISA에 의해 결정된다. 목적하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 계대배양하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양과 같이 생체 내에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 원료로서 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내에 넣을 수 있고, 이를 이어서 숙주세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주세포 내에서 모노클로날 항체를 합성시킨다. 항체의 재조합 생산은 아래에서 보다 상세히 설명한다.
일부 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 문헌 [McCafferty et al, Nature, 348: 552554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리된다. 문헌 [Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991))에서는 파지 라이브러리를 사용하는 각각 쥐 및 인간 항체의 단리를 설명한다. 후속 문헌은 사슬 셔플링 (shuffling) (Marks et al, BioTechnology, 10: 779-783 (1992))에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산, 및 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 방법으로서 조합 감염 및 생체내 재조합을 설명한다 (예를 들어, Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). 따라서, 이들 기술 및 유사한 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 당업계에 공지된 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실용적인 대안이다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 Morrison, et al, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부에 공유 연결함으로써 변형될 수 있다.
일반적으로, 상기 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 한 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 갖는 키메릭 2가 항체를 생성하기 위해 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환된다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
본 발명은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 갖는 인간화 및 인간 항체를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 인간화 항체는 인간 항체 아미노산 서열을 인간 항체로부터 유래하지 않은 아미노산 잔기와 함께 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간화 항체 내의 인간 서열은 프레임워크 영역 ("FR")을 구성하고, 인간 항체로부터 유래하지 않은 서열 또는 잔기는 하나 이상의 CDR을 구성한다. FR 및 CDR은 경쇄 및 VL 영역에서 아미노산 잔기 넘버링을 기초로 규정될 수 있다. 용어 CDR은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원 결합 부위를 의미하도록 의도된다. 이들 영역은 문헌 [Kabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977) 및 Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991)]; "카바트", 문헌 [Chothia et al, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; "코티아" 및 문헌 [MacCallum et al, J. Mol. Biol 262:732-745 (1996)]; "맥칼룸"]에 의해 정의되고, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 (인간화 항체 포함)의 CDR을 나타내기 위해 단독으로 (예를 들어, 카바트 정의) 또는 조합 (단지 예로서, 카바트 및 코티아의 조합 정의)하여 임의의 이들 정의를 적용하는 것은 본원에서 정의하고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
또한, 항체 가변 영역을 참조하여 사용될 때 용어 "프레임워크"는 항체의 가변 영역 내에서 CDR 영역 밖의 모든 아미노산 잔기를 의미하도록 의도된다. 따라서, 가변 영역 프레임워크는 약 100-120개 아미노산의 길이이지만, CDR 밖의 아미노산만을 의미하도록 의도된다. 용어 "프레임워크 영역"은 CDR에 의해 분리된 프레임워크의 각각의 도메인을 의미하도록 의도된다. 따라서, VH 영역의 구체적인 예 및 카바트에 의해 정의되는 CDR에 있어서, 프레임워크 영역 1 (FR1)은 아미노산 1-30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 대응하고; 프레임워크 영역 2 (FR2)는 아미노산 36-49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 대응하고; 영역 3 (FR3)은 아미노산 66-94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 대응하고, 영역 4 (FR4)는 아미노산 103에서 가변 영역의 말단까지의 가변 영역의 도메인에 대응한다. 경쇄에 대한 FR은 각각의 경쇄 가변 영역 CDR에 의해 유사하게 분리된다. 유사하게, 코티아 또는 맥칼룸에 의한 CDR의 정의, 또는 CDR 정의의 임의의 조합을 이용하여, 프레임워크 경계는 상기한 바와 같이 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. CDR의 다수 정의에도 불구하고, 일부 실시태양에서 CDR을 정의하기 위해 카바트 정의를 사용하는 것이 바람직하다.
인간 항체로부터 유래하지 않은 인간화 항체 내의 잔기는 다른 종 (비제한적으로 마우스 포함)으로부터 이입 (import)되거나 유래된 잔기 또는 서열일 수 있거나, 이들 서열은 인간화 항체 서열 내로 삽입된 랜덤 아미노산 서열 (예를 들어, 랜덤화 핵산 서열로부터 생성된)일 수 있다. 상기한 바와 같이, 인간화 항체 내의 인간 아미노산 서열은 바람직하게는 FR인 반면, 인간 항체로부터 유래하지 않은 잔기 (다른 종으로부터 유래되든 랜덤 아미노산 서열이든)는 바람직하게는 CDR에 대응한다. 그러나, 일부 실시태양에서, 하나 이상의 FR이 하나 이상의 비인간 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 다른 인간 프레임워크에 대한 변이 또는 변형 (예를 들어, 비인간 잔기의 도입에 의한)의 경우, 변경된 또는 변형된 FR이 다른 종 또는 랜덤 CDR 서열로부터의 변형된 CDR에 인접한 것이 가능하지만, 다른 실시태양에서, 변경된 FR은 다른 종 또는 랜덤 CDR 서열로부터의 변경된 CDR 서열에 인접하지 않는다. 일부 실시태양에서, 인간화 항체의 프레임워크 서열은 전적으로 인간의 것이다 (즉, 인간 프레임워크에 대해 프레임워크 변화가 이루어지지 않는다). 바람직한 실시태양에서, 인간화 항체의 프레임워크 서열은 전적으로 인간 생식세포의 것이다 (즉, 인간 생식세포 프레임워크에 대해 프레임워크 변화가 이루어지지 않는다).
다른 종으로부터의 또는 랜덤 서열의 비인간 아미노산 잔기는 종종 "이입" 잔기로서 불리고, 이는 일반적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter) 및 동료 (예를 들어 Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)))의 방법에 따라 설치류 (또는 다른 포유동물) CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응하는 서열에 대해 치환함으로써 수행할 수 있다. 또한, 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인보다 작은 부분이 비인간 종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환된 항체가 또한 생성될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된, 또는 상기한 바와 같이 CDR 서열이 랜덤 서열에 의해 치환된 인간 항체이다. 단지 비제한적인 예로서, 항체 수여 가변 영역 프레임워크에 공여 CDR 결합 친화도를 부여하는 방법은 WO 01/27160 A1 및 미국 특허 출원 09/434,870 및 09/982,464에 설명된 바 있다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따라, 인간화시킬 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 것에 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (예를 들어, Sims et al, J. Immnunol., 151: 2296 (1993), 및 Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 몇몇의 상이한 인간화 항체를 위해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 (예를 들어, Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
다른 실시태양에서, 특정 인간 항체 프레임워크를 "예비선택할 (pre-select)" 필요가 없다 (즉, 인간화시킬 주어진 후보 항체에 가장 가까운 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크를 선택할 필요가 없다). 이들 실시태양에서, 공통적 또는 보편적 (universal) 인간 프레임워크가 하나 이상의 비인간 CDR을 수용하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 단일의 보편적인 완전 인간 프레임워크가 후보 항체의 프레임워크 서열(들)에 대한 그의 상동성에 무관하게 인간화시킬 모든 항체에 대한 프레임워크로서 사용된다. 이와 관련하여, 프레임워크 영역에서 임의의 변화를 하지 않은 인간화 항체가 생성될 수 있다. 이어서 상기 보편적인 완전 인간 프레임워크는 하나 이상의 CDR 서열을 수용할 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 CDR 서열은 다른 종으로부터의 무손상 항체 내의 대응하는 CDR에 비교하여 변형된 다른 종 (예를 들어 마우스 또는 래트)으로부터의 항체로부터의 CDR 서열이다 (즉, CDR의 도입 및 보편적 인간 프레임워크 내로 도입되는 CDR의 변형이 동시에 존재한다). 변형은 다른 종으로부터의 무손상 항체 내의 대응하는 CDR에 비교하여 하나 이상의 아미노산 변경 (변형된 CDR 내의)에 대응한다. 한 실시태양에서, CDR 내의 모든 아미노산 잔기는 라이브러리에 포함되는 반면, 다른 실시태양에서, CDR 아미노산 잔기의 모두가 라이브러리에 포함되지는 않는다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 CDR 서열은 CDR 서열을 대체하는 랜덤 서열이다.
바람직한 실시태양에서, 항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화된다. 일부 실시태양에서, 항원에 대한 인간화 항체의 친화도는 대응하는 비인간화, 무손상 항체 또는 그의 단편 또는 일부 (예를 들어, 후보 설치류 항체)의 친화도보다 더 크다. 이와 관련하여, 일부 실시태양에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시를 검사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 그의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 목적하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수여 및 이입 서열로부터 선택되고 결합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
항체 CDR (또는 항체 CDR을 대체하는 랜덤 서열)을 항체 프레임워크 내로 도입하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 특정 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 09/434,879 및 09/982,464 참조). 일부 실시태양에서, 겹치는 올리고뉴클레오티드가 항체 유전자 또는 그의 일부 (예를 들어, 인간화 항체를 코딩하는 유전자)를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 항체 템플레이트의 돌연변이 생성이 예를 들어 CDR을 대체하기 위해 변형된 CDR 또는 랜덤 서열을 도입하도록 문헌 [Kunkel (하기 문헌)]의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 실시태양에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 따로 인간화된 다음, 인간화 가변 영역으로서 동시발현된다. 다른 실시태양에서, 인간화 가변 영역이 무손상 항체의 가변 영역을 구성한다. 일부 실시태양에서, 인간화 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 Fc 영역은 변형된다 (예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 변형이 Fc 영역에서 이루어진다). 예를 들어, 랜덤화 CDR을 사용하여 인간화되고 프레임워크 변경을 갖지 않는 항체는 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레파토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)이 사용된다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결손이 내인성 항체 생산을 완전 억제하는 것으로 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스 내에 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하면 항원 접종시 인간 항체를 생산할 것이다 (예를 들어, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), 및 Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993) 참조). 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래할 수 있다 (예를 들어, Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), 및 Vaughan et al, Nature Biotech 14: 309 (1996)).
본 발명은 Fc 영역에서 본원에서 표 1에 나열된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 인간화 항체 (및 항체 단편)을 생성하는 방법을 제공한다 (아미노산 치환을 갖지 않는 Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩티드에 비해). 그러한 인간화 항체를 생성하기 위한 추가의 방법을 아래 논의한다. 본 발명은 또한 이들 방법에 의해 생성된 항체 및 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 중요하게는, 아래 논의된 인간화 방법 및 다른 인간화 방법 (예를 들어, 상기 논의된)은 본 발명의 변이체 Fc 영역과 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 변경된, 특유의 Fc 영역을 갖는 인간화 항체를 본 발명에 따라 제작할 수 있다.
일부 실시태양에서, a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) 수용 VH 영역의 FR의 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 (여기서, 제2 참조 서열에 비해 FR의 일부는 비변형된다), 및 i) 변형된 제1 CDR의 적어도 일부 (상기 제1 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 비변형된 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드의 집단을 합성하고; c) 제1 올리고뉴클레오티드를 제2 올리고뉴클레오티드의 집단과 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; d) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) 수용 VL 영역의 FR의 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 (여기서, FR의 일부는 제2 참조 서열에 비교할 때 비변형된다), 및 i) 변형된 제1 CDR의 적어도 일부 (상기 제1 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 비변형된 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드의 집단을 합성하고; c) 제1 올리고뉴클레오티드를 제2 올리고뉴클레오티드의 집단과 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; d) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 제공된다.
일부 실시태양에서, A) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); B) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 CDR의 적어도 일부를 각각 코딩하는 (여기서, 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단, 및 i) 수용 VH 영역의 FR의 일부 (여기서, FR의 일부는 참조 서열에 비교할 때 비변형된다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단에 혼성화할 수 있는 CDR의 하나 이상의 부분을 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하고; C) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단을 제2 올리고뉴클레오티드와 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; D) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
다른 실시태양에서, A) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); B) a) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 CDR의 적어도 일부를 각각 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드의 집단 (여기서, 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다); 및 b) i) 수용 VL 영역의 FR의 일부 (여기서, FR의 일부는 참조 서열에 비교할 때 비변형된다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단에 혼성화할 수 있는 CDR의 하나 이상의 부분을 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하고; C) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단을 제2 올리고뉴클레오티드와 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; D) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 제공된다.
일부 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 경쇄 가변 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 (heteromeric) 가변 영역의 다양한 집단을 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 합성은 화학적 합성을 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용자는 인간이다. 일부 실시태양에서, 단계 (d)의 처리는 폴리머라제에 의한 연장을 포함한다 .
다른 실시태양에서, a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고, 제2 참조 서열은 VH 영역을 포함한다); b) 변경된 VH 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역의 FR은 제2 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 변형되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
일부 실시태양에서, a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) 변경된 VL 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역의 FR은 제2 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 VL 영역의 적어도 제1 CDR은 변형되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
일부 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 VH 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용자는 인간이다. 일부 실시태양에서, 합성은 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
또다른 실시태양에서, a) 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) 변경된 VH 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역의 FR은 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 랜덤 아미노산 서열을 포함한다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
다른 실시태양에서, a) 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) 변경된 VL 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역의 FR은 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 VL 영역의 적어도 제1 CDR은 랜덤 아미노산 서열을 포함한다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
또다른 실시태양에서, a) 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 참조 서열은 FR을 포함하는 인간 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) 변경된 VH 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역의 FR은 인간 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 랜덤 아미노산 서열을 포함한다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다. 일부 실시태양에서, 인간 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다.
다른 실시태양에서, a) 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 참조 서열은 FR을 포함하는 인간 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) 변경된 VL 영역 항체 유전자 서열의 집단을 합성하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역의 FR은 인간 참조 서열의 FR과 동일하고, 변경된 항체 VL 영역의 적어도 제1 CDR은 랜덤 아미노산 서열을 포함한다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법이 고려된다.
일부 실시태양에서, 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 VH 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 합성은 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 일부 실시태양에서, CDR은 카바트 정의에 의해 정의된다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 FR은 하나 이상의 변형된 CDR의 도입과 동시에 변형된다. 다른 실시태양에서, 변형된 프레임워크는 변형된 CDR에 인접한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) a) 변형된 VH 영역 FR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, VH 영역 FR, 또는 그의 일부는 수용 프레임워크 영역 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경되는 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다) 및 b) i) 적어도 하나의 변형된 CDR, 또는 그의 일부 (여기서 변형된 CDR, 또는 그의 일부는 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단에 혼성화할 수 있는 인접한 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는, 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 합성은 화학적 합성을 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용자는 인간이다. 바람직한 실시태양에서, 변경된 헤테로머 가변 영역의 하나 이상의 다양한 집단은 Fc 영역을 포함하는 항체의 일부이고, 여기서 Fc 영역은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) a) 변형된 VL 영역 FR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, VL 영역 프레임워크 영역, 또는 그의 일부는 수용 프레임워크 영역 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경되는 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다), 및 b) i) 적어도 하나의 변형된 CDR, 또는 그의 일부 (여기서, 변형된 CDR, 또는 그의 일부는 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단에 혼성화할 수 있는 인접한 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는, 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 중쇄 가변 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다; b) a) 변형된 VH 영역 프레임워크 영역, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, VH 영역 FR, 또는 그의 일부는 수용 FR 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경되는 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다), 및 b) i) 적어도 하나의 변형된 CDR, 또는 그의 일부 (여기서, 변형된 CDR, 또는 그의 일부는 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단에 혼성화할 수 있는 인접한 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제를 사용하여 연장시키는 것을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) a) 변형된 VL 영역 FR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, VL 영역 FR, 또는 그의 일부는 수용 FR 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경되는 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다); 및 b) i) 적어도 하나의 변형된 CDR, 또는 그의 일부 (여기서, 변형된 CDR, 또는 그의 일부는 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단에 혼성화할 수 있는 인접한 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제를 사용하여 연장시키는 것을 포함하는, 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 변형은 하나 이상의 변형된 CDR의 도입과 동시에 프레임워크 내로 도입된다. 변형된 CDR은 참조 서열의 대응하는 CDR과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) i) 적어도 하나의 변형된 CDR (여기서, 변형된 CDR은 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)을 각각 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 및 ii) VH 영역 프레임워크의 변형된 부분을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 부분은 수용 프레임워크 영역 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경된 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다)을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 혼성화하도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 수용자는 인간이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) i) 각각 적어도 하나의 변형된 CDR (여기서, 변형된 CDR은 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)을 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단; 및 ii) VL 영역 프레임워크의 변형된 부분을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 부분은 수용 FR 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경된 프레임워크 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다)을 합성하고; c) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 혼성화하도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는, 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, Fc 변이체 및 변경된 중쇄 변이체 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) A) 수용 VH 영역의 FR의 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 (여기서, FR의 일부는 제2 참조 서열에 비교할 때 비변형된다) 및 B) i) 변형된 제1 CDR의 적어도 일부 (상기 제1 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 비변형된 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드의 집단을 합성하고; c) 제1 올리고뉴클레오티드를 제2 올리고뉴클레오티드의 집단과 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; d) 중복 올리고뉴클레오티드를 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) a) 수용 VL 영역의 FR의 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드 (여기서, FR의 일부는 제2 참조 서열에 비교할 때 비변형된다), 및 b) i) 변형된 제1 CDR의 적어도 일부 (상기 제1 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 비변형된 FR의 하나 이상의 부분을 각각 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드의 집단을 합성하고; c) 제1 올리고뉴클레오티드를 제2 올리고뉴클레오티드의 집단과 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; d) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 (여기서, 변경된 VL 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다) 것을 포함하는, 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 A) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); B) a) 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 CDR의 적어도 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드의 집단 (여기서, 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다); 및 b) i) 수용 VH 영역의 FR의 일부 (여기서, FR의 일부는 참조 서열에 비교할 때 비변형된다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단에 혼성화할 수 있는 CDR의 하나 이상의 부분을 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하고; C) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단을 제2 올리고뉴클레오티드와 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; D) 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VH 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 상기 방법은 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 A) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 서열은 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); B) a) 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 CDR의 적어도 일부를 코딩하는 제1 올리고뉴클레오티드의 집단 (여기서, 변형된 제1 CDR은 제1 참조 서열의 대응하는 공여 CDR에 비해 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다); 및 b) i) 수용 VL 영역의 FR의 일부 (여기서, FR의 일부는 참조 서열에 비교할 때 비변형된다) 및 ii) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단에 혼성화할 수 있는 CDR의 하나 이상의 부분을 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하고; C) 제1 올리고뉴클레오티드의 집단을 제2 올리고뉴클레오티드와 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성하고; D) 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단이 제작되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는 (여기서, 변경된 VL 영역 코딩 핵산에 의해 코딩된 FR은 제2 참조 서열에 관하여 비변형된다), 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하고 (상기 돌연변이된 가변 영역은 (i) 야생형 인간 항체 프레임워크, (ii) 3개의 비인간 중쇄 CDR, 및 (iii) 3개의 비인간 경쇄 CDR을 포함하고, 여기서 상기 CDR은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의되고, 적어도 하나의 경쇄 CDR은 대응하는 야생형 비인간 CDR에 비교할 때 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 상이한 아미노산에서 돌연변이-함유 경쇄 CDR이고, 제1 돌연변이된 항체 가변 영역은 대응하는 돌연변이되지 않은 항체 가변 영역보다 더 큰 결합 친화도를 갖는다); b) 제1 돌연변이된 항체 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제2 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역이 코딩되도록 하는 조건 하에 돌연변이시키는 것을 포함하는 (상기 제2 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역은 돌연변이-함유 경쇄 CDR 내의 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 추가의 상이한 아미노산을 포함하고, 상기 추가의 돌연변이는 제1 돌연변이와 함께 보다 큰 결합 친화도를 생성시킨다), 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 결합 친화도를 개선하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 돌연변이-함유 경쇄 CDR은 CDR3 (LCDR3)이다.
다른 실시태양에서, 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 적어도 하나의 비인간 중쇄 CDR은 돌연변이를 포함하여, 대응하는 야생형 비인간 CDR에 비교할 때 적어도 하나의 위치에서 상이한 아미노산이 코딩된다. 추가의 실시태양에서, 중쇄 CDR 돌연변이는 HCDR3 내에 존재한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VH 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) 4개의 FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 4개의 FR을 포함하는 수용 VH 영역의 서열을 포함한다); b) i) 변형시킬 모든 FR에 대해, 변형된 FR, 또는 그의 일부를 각각 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 집단 (상기 변형된 FR 또는 그의 일부는 수용 VH 영역 참조 서열 내의 대응하는 프레임워크 영역에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 상기 변경된 FR 위치는 제1 참조 서열의 공여 프레임워크 영역 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 프레임워크 위치 중에서 선택된다), 및 ii) 변형시킬 모든 CDR에 대해, 변형된 CDR, 또는 그의 일부를 각각 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 집단 (상기 변형된 CDR은 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다); 및 iii) 각각의 임의의 나머지 및 비변형된 FR에 대해, 제2 참조 수용 서열의 대응하는 FR과 동일한 서열을 갖는 FR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드; 및 iv) 각각의 임의의 나머지 및 비변형된 CDR에 대해, 제1 참조 공여 서열의 대응하는 CDR과 동일한 서열을 갖는 CDR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 (여기서, VH 영역의 인접한 부분들을 코딩하는 (i) 내지 (iv)의 개별 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단에서 중복 서열을 갖는다); c) 올리고뉴클레오티드 및 단계 b)에서 합성된 올리고뉴클레오티드의 집단을 개별 올리고뉴클레오티드의 중복 서열이 혼성화하도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 변경된 VH 영역 코딩 뉴클레오티드의 집단이 형성되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 것을 포함하는, 변경된 VH 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하면서 적어도 하나의 CDR 및 적어도 하나의 FR을 동시에 변형시키는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 제1 및 제2 참조 서열의 표상은 전자 형식으로 존재한다. 추가의 실시태양에서, 변형시킬 프레임워크 영역은 HFR1, HFR2 및 HFR3으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 변형시킬 CDR은 HCDR3이다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 e) VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다. 상이한 실시태양에서, 상기 방법은 e) VH 영역 코딩 핵산의 집단을 VL 영역 코딩 핵산의 집단과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 변경된 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 제작하면서 적어도 하나의 CDR 및 적어도 하나의 FR을 동시에 변형시키는 방법이 사용되고, 여기서 상기 방법은 a) 제1 및 제2 참조 아미노산 서열의 표상을 제공하고 (상기 제1 참조 아미노산 서열은 공여 VL 영역의 서열을 포함하고, 상기 공여 가변 영역은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 i) 4개의 FR 및 ii) 3개의 CDR을 포함하고; 제2 참조 아미노산 서열은 카바트 및 코티아의 조합 정의에 의해 정의된 4개의 FR을 포함하는 수용 VL 영역의 서열을 포함한다); b) i) 변형시킬 모든 FR에 대해, 변형된 FR, 또는 그의 일부를 각각 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 집단 (상기 변형된 FR, 또는 그의 일부는 수용 VL 영역 참조 서열 내의 대응하는 프레임워크 영역에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 다수의 변경된 아미노산을 함유하고, 변경된 FR 위치는 제1 참조 서열의 공여 FR 위치에 비해 대응하는 위치에서 상이한 제2 참조 서열의 수용 FR 위치들 중에서 선택된다), 및 ii) 변형시킬 모든 CDR에 대해, 각각 변형된 CDR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 집단 (여기서, 변형된 CDR은 대응하는 공여 CDR 아미노산 참조 서열에 비교할 때 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다); 및 iii) 각각의 임의의 나머지 및 비변형된 FR 영역에 대해, 제2 참조 수용 서열의 대응하는 FR과 동일한 서열을 갖는 FR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드; 및 iv) 각각의 임의의 나머지 및 비변형된 CDR에 대해, 제1 참조 공여 서열의 대응하는 CDR과 동일한 서열을 갖는 CDR, 또는 그의 일부를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 (여기서, VL 영역의 인접한 부분들을 코딩하는 (i) 내지 (iv)의 개별 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단에서 중복 서열을 갖는다), c) 올리고뉴클레오티드 및 단계 b)에서 합성된 올리고뉴클레오티드의 집단을 개별 올리고뉴클레오티드의 중복 서열이 혼성화하도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키고; d) 중복 올리고뉴클레오티드를 변경된 VL 영역 코딩 뉴클레오티드의 집단이 형성되도록 하는 조건 하에 처리하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 VL 영역 코딩 핵산의 집단을 VH 영역 코딩 핵산의 집단과 동시발현시켜 변경된 헤테로머 가변 영역의 다양한 집단을 생산시키는 단계를 추가로 포함한다.
(v) 다중특이적 항체
본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 상기 분자는 정상적으로 2개의 항원만을 가질 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예를 들어 삼중특이적 항체도 본원에 사용되는 상기 표현에 포함된다. BsAb의 예는 종양 세포 항원에 대해 지정된 한 팔 및 세포독성 촉발 분자에 대해 지정된 다른 팔을 갖는 것, 예를 들어 항-FcγRI/항-CD 15, 항-pl 85HER2/FcγRIII (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (D1D0), 항-CD3/항-pl 85HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장 세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항CD3/L-D I (항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 항 EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMAI, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-범용 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3; 종양 항원에 특이적으로 결합하는 한 팔 및 독소에 결합하는 한 팔을 갖는 BsAb, 예를 들어 항-사포린/항-id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 사슬, 항-인터페론-α (IFN-α)/항-하이브리도마 개별특이형, 항-CEA/항-빙카 알칼로이드; 효소 활성화된 전구약물을 전환시키기 위한 BsAb, 예를 들어 항-CD30/항-알칼린 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물을 미토마이신 알콜로의 전환을 촉매하는); 섬유소용해제로서 사용될 수 있는 BsAb, 예를 들어 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 항-피브린/항유로키나제-타입 플라스미노겐 활성제 (uPA); 면역 복합체를 세포 표면 수용체에 표적하기 위한 BsAb, 예를 들어 항-저밀도 지질단백질 (LDL)/항-FcR (예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII); 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한 BsAb, 예를 들어 항-CD3/항-단순 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV; 시험관 내 또는 생체 내 종양 검출을 위한 BsAb, 예를 들어 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185HER2/항-합텐; 백신 보강제로서 BsAb; 및 진단 툴로서 BsAb, 예를 들어 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-섭스턴스 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-p-갈락토시다제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
삼중특이적 항체의 예는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초한다 (여기서, 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다) (예를 들어, Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 재분류 (assortment) 때문에, 이들 하이브리도마 (콰드로마 (quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하고, 그 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행할 수 있다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 방법에서, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합체 내에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비가 최적 결과를 제공할 때 실시태양 내의 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 제공할 때 또는 비가 특히 중요하지 않을 때 2 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내로 삽입하는 것도 가능하다. 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한 팔에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 팔에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 구성된다 (예를 들어 WO 94/04690 참조). WO96/27011에 설명된 다른 방법에 따라, 항체 분자의 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이합체의 백분율을 최대화하기 위해 공학처리될 수 있다. 특이적 항체는 또한 가교결합 또는 "이종컨쥬게이트 (heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다.
B. 면역어드헤신 분자
본 발명은 또한 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역어드헤신 분자를 제공한다. 한 종류의 면역어드헤신 디자인은 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))을 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역 (예를 들어, 변이체 Fc 영역)과 결합시킨다. 보통, 본 발명의 면역어드헤신을 제조할 때, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단에서 융합될 것이지만, N-말단 융합체도 또한 가능하다.
일반적으로, 상기 융합에서, 코딩된 키메릭 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적 활성의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 융합은 또한 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에서, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 대응하는 영역에 바로 N-말단에서 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않으며; 특정 부위는 잘 알려져 있고 면역어드헤신의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 어드헤신 서열은 면역글로불린 G1의 변이체 Fc 영역의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, IgG Fc를 화학적으로 규정하는 파파인 절단 부위의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하는 서열 (즉, 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기가 114인 것으로 할 때), 또는 다른 면역글로불린의 유사한 부위가 융합에 사용된다. 특정 바람직한 실시태양에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 CH2 및 CH3, 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다. 일부 실시태양에서, 면역어드헤신은 이중특이적이다. 별법으로, 어드헤신 서열은 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있어서, 키메릭 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 얻어진다. 상기 실시태양에서, 어드헤신 서열은 면역글로불린의 각각의 팔에서 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 힌지와 CH2 도메인 사이, 또는 CH2와 CH3 도메인 사이에 융합될 수 있다 (예를 들어 Hoogenboom et al, Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991) 참조).
면역글로불린 경쇄의 존재는 본 발명의 면역어드헤신에 요구되지 않지만, 면역글로불린 경쇄는 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유 연결되거나, 또는 어드헤신에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우에, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 일반적으로 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 동시발현된다. 분비시에, 하이브리드 중쇄 및 경쇄는 공유 연결되어 2개의 디술피드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 상기 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어 미국 특허 4,816,567에 개시되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 면역어드헤신은 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 면역글로불린 cDNA 서열에 인 프레임 (in-frame)으로 융합시킴으로써 제작된다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에 대한 융합도 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 후자 종류의 융합은 발현을 위해 Ig 조절 서열의 존재를 필요로 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 혼성화 또는 PCR 기술에 의해 비장 또는 말초 혈액 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열을 기초로 단리될 수 있다. 면역어드헤신의 "어드헤신" 및 면역글로불린 부분을 코딩하는 cDNA는 선택된 숙주세포 내에서 효율적인 발현을 지정하는 플라스미드 벡터 내로 일렬로 삽입될 수 있다.
변이체 폴리펩티드의 변경된 반감기
신생아 Fc 수용체 "FcRn"은 임신 동안 모체태아 장벽을 가로질러 IgG를 전달할 뿐만 아니라 IgG 혈청 반감기의 조절에도 관여하는 주조직적합 복합체 (MHC) 유사체이다. 최근 FcRn 리뷰를 위해서는 문헌 [Ghetie, V and E.S. Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000]을 참조한다. FcRn은 pH-의존 방식으로 IgG에 결합하여 약산성 pH에서 결합이 일어나고 pH 7.4에서는 검출가능한 결합의 거의 또는 전혀 없다. IgG는 FcRn-발현 세포에 의해 흡수되어 FcRn-IgG 상호작용이 일어나는 산성 엔도좀 내로 도입되는 것으로 가정된다. 이어서, IgG는 세포 표면으로 전달되고 중성 pH 부근에서 방출된다. 세포 내로 흡수된 후, FcRn에 결합하지 않은 IgG는 리소솜 컴파트먼트로 도입되어 파괴된다. 상기 모델은 증가된 친화도로 FcRn에 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 보다 작은 친화도를 갖는 것보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다는 이론과 일치한다.
IgG 트랜스포터로서 FcRn의 역할은 FcRn에 대한 변경된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역이 모노클로날 항체의 맥락에서 또는 이종 단백질, 즉, 비-항체에 작동가능하게 부착될 때 치료 효용을 가질 수 있음을 나타낸다. 대상 또는 환자로부터 신속하게 제거됨으로써 또는 태반막을 가로질러 전달되지 않음으로써 이익을 얻을 치료 폴리펩티드, 예를 들어 방사선 표지된 폴리펩티드는 감소된 FcRn 결합 친화도를 나타내는 Fc 영역에 작동가능하게 부착됨으로써 이익을 얻을 것이다. 별법으로, 보다 긴 혈청 반감기를 갖고 따라서 보다 적은 횟수로 투여할 필요가 있거나 태반막을 가로질러 전달됨으로써 이익을 얻을 폴리펩티드는 우선적으로 향상된 FcRn 결합 친화도를 나타내는 Fc 영역에 작동가능하게 부착될 것이다 (표 2, 5 및 6 참조). Fc 특성의 많은 조합이 고려되고, 예를 들어, 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖지만 CDC 또는 ADCC 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 Fc 영역은 표 2에 나열된 바와 같은 FcRn 결합 친화도를 향상시키는 하나 이상의 Fc 아미노산 치환을 CDC 및 ADCC 활성을 감소시키는 아미노산 치환과 조합하여, 예를 들어 IgG4 모 Fc 영역 내로 또는 IgG1 모 Fc 영역 내로 포함시킴으로써 생성될 수 있다.
모 폴리펩티드에 비해 향상된 FcRn 결합 친화도를 나타내는 본 발명의 변이체 Fc 영역에 작동가능하게 부착됨으로써 증가된 혈청 반감기로부터 이익을 얻을 바람직한 폴리펩티드는 포유동물 치료 폴리펩티드, 예를 들어 분자, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬; 인간 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 그렐린; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; α1-항트립신; PAI-1; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란드 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 인터루킨, 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, IL-20; 종양 괴사인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 물러관 억제물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예를 들어 뇌-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타, 카디오트로핀 (심비대 인자), 예를 들어 카디오트로핀-1 (CT-1); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGR); 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF, 표피 성장 인자 (EGF) 또는 그의 수용체; 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골형성 단백질, 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF-8); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF; GM-CSF 및 G-CSF; IgG의 천연 Fc 영역을 갖지 않는 항-HER-2 항체; IgG의 천연 Fc 영역을 갖지 않는 항-RSV 항체; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, HIV-I 외피의 단백질; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; IgG의 천연 Fc 영역을 갖지 않는 항체; 및 임의의 상기 나열된 폴리펩티드의 단편 또는 전구체이다.
그가 작동가능하게 부착되는 폴리펩티드에 변경된 혈청 반감기 (즉, 향상된 FcRn 결합 친화도)를 부여하는 본 발명의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 관심있는 폴리펩티드의 카르복시- 또는 아미노 말단에 작동가능하게 부착되어 융합 단백질을 생성한다.
변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열
본 발명은 또한 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열, 및 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 벡터 및 숙주세포를 제공한다. 본 발명은 또한 변이체 Fc 영역을 생산하기 위한 재조합 방법을 제공한다.
일반적으로, 변이체의 재조합 생산을 위해, 변이체 코딩 핵산은 단리되어 벡터 내로 삽입된다. 숙주세포는 벡터로 형질감염되어, 핵산 서열이 증폭되고(되거나) 변이체 펩티드가 생산되도록 할 수 있다. 본 발명의 펩티드 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 변이체 코딩 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 단리되고 서열분석될 수 있다. 일반적으로, 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 다른 성분, 예를 들어 시그날 서열 (예를 들어, 분비 시그날 서열), 복제 기점, 적어도 하나의 마커 유전자, 인핸서, 프로모터, 또는 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시태양에서, 특정 변이체를 발현하는 세포주를 생성하기 위해 숙주세포는 변이체 코딩 핵산으로 안정하게 형질감염된다. 바람직한 실시태양에서, 변이체는 CHO, NSO, Sp2/0, PER.C6, 또는 HEK293 세포에서 발현된다. 재조합 방법은 당업계에 공지되어 있다.
핵산 서열은 변이체 Fc 영역이 생산될 수 있도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 모 Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어 서열 1-12)은 핵산 서열이 발현될 때 적어도 하나의 아미노산 변경이 생성되도록 돌연변이될 수 있다. 또한, 모 Fc 영역의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열은 변이체 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 생산하기 위해 돌연변이될 수 있다.
특정 실시태양에서, 돌연변이된 서열을 생성시키기 위해 코돈 기반 합성이 사용된다. 코돈 기반 합성의 예는 예를 들어 미국 특허 5,264,563, 5,523,388 및 5,808,022에 기재된 것을 포함한다. 간단히 설명하면, 코돈 기반 합성은 모노머들을 별개의 지지체 상에 순차적으로 커플링시켜 적어도 2개의 상이한 터플렛 (tuplet)을 형성함으로써 수행될 수 있다. 커플링은 별개의 반응 용기에서 수행된 다음, 반응 용기로부터 지지체들을 혼합하고, 혼합된 지지체를 2개 이상의 별개의 반응 용기 내로 분할하고, 커플링, 혼합 및 분할 단계를 반응 용기 내에서 1회 이상 반복하고, 혼합 또는 분할 단계로 끝낼 수 있다. 추가로, 올리고뉴클레오티드는 지지체로부터 절단될 수 있다.
치료 용도 및 제제
일부 실시태양에서, 본 발명은 본원에 설명된 변이체를 포함하는 치료 제제를 제공한다. 본 발명은 치료 조성물의 특정 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔, 고체 담체, 희석제, 보강제 및 부형제와 이들의 조합물과 함께 제공되는 변이체 폴리펩티드 (또는 그의 일부)를 포함할 수 있다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 참조).
또한, 변이체 폴리펩티드는 살리실레이트, 스테로이드, 면역억제제, 항체 또는 항생제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 치료제와 함께, 다른 치료제보다 먼저 또는 나중에 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체와 함께 사용될 수 있는 특정 치료제는 아조벤젠 화합물 (미국 특허 4,312,806), 벤질-치환 로다민 유도체 (미국 특허 5,216,002), 아연 L-카르노신염 (미국 특허 5,238,931), 3-페닐-5-카르복시피라졸 및 이소티아졸 (미국 특허 5,294,630) IL-10 (미국 특허 5,368,854), 퀴놀린 류코트리엔 합성 억제제 (미국 특허 5,391,555), 2'-할로-2'-데옥시아데노신 (미국 특허 5,506,213), 페놀 및 벤즈아미드 화합물 (미국 특허 5,552,439), 트리부티린 (미국 특허 5,569,680), 특정 펩티드 (미국 특허 5,756,449), 오메가-3 다중불포화산 (미국 특허 5,792,795), VLA-4 차단제 (미국 특허 5,932,214), 프레드니솔론 메타술포벤조에이트 (미국 특허 5,834,021), 시토킨 억제제 (미국 특허 5,888,969) 및 니코틴 (미국 특허 5,889,028)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
변이체 폴리펩티드는 세포의 생존력 또는 증식 가능성을 감소시키는 약제와 함께 사용될 수 있다. 세포의 생존력 또는 증식 가능성을 감소시키는 약제는 예를 들어, DNA 합성을 억제하거나, 세포분열을 억제하거나, 세포자멸을 유도하거나, 비세포자멸성 세포 치사를 유발하는 것을 포함한 다양한 방식으로 기능할 수 있다. 세포독성 및 세포증식억제제의 구체적인 예는 억새풀 항바이러스 단백질, 아브린, 리신 및 각각의 그들의 A 사슬, 독소루비신, 시스플라틴, 요오딘-131, 이트륨-90, 레늄-188, 비스무트-212, 탁솔, 5-플루오로우라실 VP-16, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, BCNU, 미토마이신 및 시클로포스파미드 및 특정 시토킨, 예를 들어 TNF-α 및 TNF-β를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 따라서, 세포독성 또는 세포증식억제제는 예를 들어 방사성 핵종, 화학치료 약물, 단백질 및 렉틴을 포함할 수 있다.
치료 조성물은 예를 들어 상기 통상 사용되는 첨가제, 예를 들어 결합제, 충전제, 담체, 보존제, 안정화제, 유화제, 버퍼 및 부형제, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 함유할 수 있다. 이들 조성물은 대개 1%-95%의 활성 성분, 바람직하게는 2%-70%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 또한 상용성이고 생리학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 희석제 및 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등과 이들의 조합물이다. 또한, 필요한 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 분무제로서 또는 고체 형태로 제조된다. 경구 제제는 대체로 상기 통상 사용되는 첨가제, 예를 들어 결합제, 충전제, 담체, 보존제, 안정화제, 유화제, 버퍼 및 부형제, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지연방출 제제 또는 분말제의 형태를 취하고, 대개 1%-95%, 바람직하게는 2%-70%의 활성 성분을 함유한다. 본 발명의 치료 조성물 전달에 유용한 경구 조성물의 예는 미국 특허 5,643,602에 기재되어 있다.
다른 투여 방식, 예를 들어 국소 투여에 적합한 추가의 제제는 연고, 팅크제, 크림, 로션, 경피용 패치 및 좌제를 포함한다. 연고 및 크림의 경우, 전통적인 결합제, 담체 및 부형제는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다. 국소 전달 방법의 일례는 미국 특허 5,834,016에 기재되어 있다. 다른 리포좀 전달 방법을 사용할 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,851,548 및 5,711,964 참조).
제제는 또한 치료하는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기 분자는 적합하게는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
지연방출 제제를 제조될 수도 있다. 지연방출 제제의 적합한 예는 변이체 폴리펩티드를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스 (상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태임)를 포함한다. 지연방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드, L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해가능 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해가능 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일에 걸쳐 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 치료제는 질병에 걸린 대상에게 투여될 수 있거나, 예방 목적으로 대상 (예를 들어, 질병에 걸리기 쉬운 대상)에게 투여될 수 있다. 치료될 수 있는 병태의 예는 암 (예를 들어, 변이체 폴리펩티드가 HER2 수용체, CD20 또는 혈관내피 성장 인자 (VEGF)에 결합한다); 알레르기 병태, 예를 들어 천식 (항-IgE 항체를 사용함); 및 LFA-1-매개 질환 (예를 들어, 변이체 폴리펩티드가 항-LFA-I 또는 항-ICAM-I 항체임) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
바람직한 실시태양에서, 대상을 치료하기 위해 사용되는 폴리펩티드 변이체는 항체 또는 면역어드헤신을 포함한다. 또한, 바람직한 실시태양에서, 치료되는 질병은 항체 또는 면역어드헤신 반응성 질병이다. 항체 반응성 질병의 예는 림프종 (항-CD20 항체인 리툭산으로 치료가능한 것으로 밝혀짐), 감염성 질병 (호흡기 세포융합 바이러스의 F 단백질에 작용하는 항체인 시나기스로 치료가능한 것으로 밝혀짐), 신장 이식 (항-IL-2 수용체 항체인 제나팍스가 도움이 되는 것으로 밝혀짐), 크론병 및 류마티스성 관절염 (항-TNFα 항체인 레미케이드로 치료가능한 것으로 밝혀짐), 유방암종 (항-20 HER2 항체인 헤르셉틴으로 치료가능한 것으로 밝혀짐) 및 결장암 (항-17-1A 항체인 에드레콜로맙로 치료가능한 것으로 밝혀짐)과 같은 질병 및 의학적 병태를 포함한다. 암 치료에 사용되는 변이체 폴리펩티드는 바람직하게는 폴리펩티드에 향상된 ADCC 활성 및(또는) 향상된 CDC 활성을 부여하는 본 발명의 Fc 영역 아미노산 치환을 포함할 것이다.
일부 실시태양에서, 개선된 ADCC 활성을 갖는 변이체 폴리펩티드는 조직 또는 외래 미생물의 파괴 또는 제거가 요망되는 질병 또는 질환의 치료에 사용된다. 예를 들어, 변이체는 암; 염증성 질환; 감염 (예를 들어 세균, 바이러스, 진균 또는 효모 감염); 및 조직의 제거가 요망되는 다른 병태 (예를 들어 갑상선종)의 치료에 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 변이체 폴리펩티드는 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 상기 변이체는 긴 반감기를 갖는 Fc 영역-함유 폴리펩티드가 요망되는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있지만, 폴리펩티드는 바람직하게는 바람직하지 않은 효과기 기능(들)을 갖지 않는다. 예를 들어, Fc 영역-함유 폴리펩티드는 항-조직 인자 (TF) 항체; 항-IgE 항체; 및 항-인테그린 항체 (예를 들어, 항-a 437 항체)일 수 있다. 상기 Fc 영역-함유 폴리펩티드의 목적하는 작용 기전은 리간드-수용체 결합쌍을 차단하기 위한 것일 수 있다. 또한, 감소된 ADCC 활성을 갖는 Fc-영역 함유 폴리펩티드는 아고니스트 항체일 수 있다.
암 치료에 사용되는 변이체 폴리펩티드는 바람직하게는 폴리펩티드에 향상된 ADCC 활성 및(또는) 향상된 CDC 활성을 부여하는 본 발명의 Fc 영역 아미노산 치환 (예를 들어, 표 2 참조)을 포함할 것이다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 피하, 국소, 복강내, 폐내, 및 비내 및 병소내 투여 (예를 들어, 국소 면역억제 처리를 위해)에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 폴리펩티드 변이체는 적합하게는 특히 감소하는 용량의 변이체 폴리펩티드를 사용하는 펄스 주입에 의해 투여된다. 바람직하게는, 투여량은 부분적으로 투여가 단기간인지 만성인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 폴리펩티드 변이체의 적절한 투여량은 치료되는 질병의 종류, 질병의 심도 및 경과, 변이체 폴리펩티드가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 환자의 임상 병력 및 폴리펩티드 변이체에 대한 반응 및 주치의의 판단에 따라 결정될 것이다. 변이체 폴리펩티드는 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다.
예를 들어, 질병의 종류 및 심도에 따라, 약 0.1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.120 mg/kg)의 변이체 폴리펩티드가 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 요인에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 수일 또는 그 이상의 기간에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 증상이 충분히 감소하거나 제거될 때까지 유지된다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링되고, 치료 효과를 얻기 위한 투여량 조절에 이용될 수 있다.
이들 제안된 양의 변이체 폴리펩티드는 상당한 치료상 판단에 따른다. 적합한 투여량 및 투여계획 선택시에 중요한 인자는 얻어진 결과이다. 이러한 측면에서 고려할 요인은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 항체 전달 부위, 항체의 특정 종류, 투여 방법, 투여 계획 및 의료인에게 공지된 다른 요인을 포함한다.
투여될 변이체 폴리펩티드의 치료 유효량은 질병 증상이 치료되거나 감소되도록 하기 위해 환자에게 요구되는 용량 수준이다. 추가로, 치료 유효량은 질병 발병을 지연하거나 최소화하는 예방하기 위해, 예를 들어, 암 확산을 지연하거나 최소화하거나 예방하기 위해 충분한 치료제의 양을 나타낼 수 있다. 치료 유효량은 치료제 (예를 들어, 변이체 폴리펩티드)의 양을 나타낼 수 있고, 또한 대상에서 질병의 치료 또는 관리에서 치료상 잇점을 제공하는 치료제의 양을 나타낼 수 있다. 추가로, 본 발명의 치료제에 관하여 치료 유효량은 대상에서 질병의 치료 또는 관리에서 치료상 잇점을 제공하는, 단독으로의 또는 다른 치료제와 조합으로의 치료제의 양을 나타낸다. 변이체 폴리펩티드는 반드시 그럴 필요는 없지만 임의로 해당 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제제화된다. 상기 다른 약제의 유효량은 제제 내에 존재하는 변이체 폴리펩티드의 양, 질환 또는 치료의 종류 및 상기 논의한 다른 요인에 의해 결정된다. 제1 예방제 또는 치료제 (예를 들어, 변이체 폴리펩티드 또는 본 발명의 변이체 Fc 영역 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드)는 질환에 걸린 대상에게 제2 예방제 또는 치료제의 투여에 앞서, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 치료제는 저장을 위해 동결되거나 동결건조되고 사용 전에 적합한 멸균 담체 내에 재구성될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도로 항체 활성을 손실시킬 수 있다. 이를 보충하기 위해 투여량을 조정해야 할 수 있다. 일반적으로, 6 내지 8의 pH가 바람직하다.
모노클로날 항체가 결합하는 항원이 해롭거나 항원 수준을 감소시키는 것이 유익한 적어도 하나의 상기 언급된 질환 (예를 들어, 암)의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 본원에서 고려된다. 추가로, 적어도 하나의 상기 언급된 질환의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체의 용도도 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 목적하는 약리학적 및(또는) 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 면에서 예방적일 수 있고(있거나) 질병 및(또는) 질병에 기인하는 부작용에 대한 부분 또는 완전 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질병 또는 병태의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 투여를 포함하고, (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상에서 질병이 발생하는 것을 방지하고; (b) 질병을 억제하고, 즉, 그의 발달을 저지하고; (c) 질병을 경감시키고, 즉, 질병 또는 질환의 퇴행을 야기하거나 증상 또는 그의 복합증을 완화시키는 것을 포함한다. 투여 계획은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 투여량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 투여량은 치료 상황의 요건이 지시될 때 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
항- CD20 항체
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-CD20 항체가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다 (예를 들어, 본원의 실시예 4 및 도 4 참조). 한 실시태양에서, 항-CD20 항체는 본원의 표 1-10에 나열된 것과 같은 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 변이체 Fc 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 항-CD20 항체는 추가로 서열 13, 14, 15 또는 16에 나타낸 서열을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 항-CD20 항체는 본원의 표 1-10에 나열된 것과 같은 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 변이체 Fc 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 추가로 다음에 나타낸 서열을 갖는 펩티드를 포함한다:
a) 서열 13 및 서열 14;
b) 서열 15 및 서열 16;
c) 서열 17, 18, 19, 20, 21 및 22; 또는
d) 서열 23, 24, 25, 26, 27 및 28.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항-CD20 항체는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 치환(들)을 포함하는 변이체 Fc 영역 또는 그의 일부를 포함하고:
a) 247I 및 339D;
b) 247I 및 339Q; 및
c) 378D;
추가로 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 가변 영역을 포함한다:
a) 서열 13 및 서열 14;
b) 서열 15 및 서열 16;
c) 서열 17, 18, 19, 20, 21 및 22; 및
d) 서열 23, 24, 25, 26, 27 및 28.
추가의 변이체 Fc 영역 용도
본 발명의 변이체 및 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 많은 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체는 약물 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 변이체를 후보 화합물과 접촉시키고 후보 화합물의 변이체에 대한 결합을 결정함으로써 Fc 효과기 기능을 변경시키거나 방해하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 변이체는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 글루타티온을 함유하는 중합체 비드에 대한 GST-변이체 융합 단백질의 결합을 사용하여 고정시킬 수 있다. GST 융합 단백질을 코딩하는 키메릭 유전자는 목적하는 변이체를 코딩하는 DNA를 GST의 카르복실 말단을 코딩하는 DNA에 융합시켜 제조한다 (예를 들어 Smith et al, Gene 67:31 [1988] 참조). 이어서, 융합 구성체는 GST 융합 단백질의 발현을 이소프로필-f-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 사용하여 유도할 수 있는 적합한 발현 시스템 (예를 들어, 이. 콜라이 XA90) 내로 형질전환된다. IPTG를 사용한 유도는 가용성 세포 단백질의 주요 구성분으로서 융합 단백질을 생성시켜야 한다. 융합 단백질은 글루타티온 친화도 크로마토그래피에 의한 정제를 포함하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 후보 화합물의 변이체에 대한 결합은 하나 이상의 효과기 기능을 붕괴시키는 화합물의 능력과 상호 관련된다.
다른 스크리닝 방법에서, 변이체 또는 선택된 FcR은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 플라스틱 미세역가 플레이트 상의 흡착 또는 GST-융합 단백질의 글루타티온 함유 중합체 비드에 대한 특이적 결합을 사용하여 고정된다. 예를 들어, GST-변이체는 글루타티온-세파로스 비드에 결합된다. 이어서, 고정된 변이체는 FcR 및 후보 화합물과 접촉한다. 이어서, 비결합된 펩티드는 제거되고, 복합체는 가용화되어 결합된 표지 펩티드의 양을 결정하기 위해 분석된다. 결합 감소는 후보 화합물이 변이체와 FcR의 상호작용을 억제함을 나타낸다. 상기 스크리닝 방법은 증가된 수준을 보이는 본 발명의 변이체를 사용할 때 특히 유용하다. 상기 방법의 변형은 기형성된 변이체/Fc 수용체 복합체를 붕괴시킬 수 있는 화합물의 스크리닝을 허용한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 FcR에 결합된 변이체를 포함하는 복합체는 상기한 바와 같이 고정되고, 후보 화합물과 접촉한다. 후보 화합물에 의한 복합체의 분해는 시험되는 변이체와 FcR 사이의 상호작용을 붕괴시키거나 억제하는 화합물의 능력과 상호관련된다. 이러한 측면에서, 치료 잠재력 (예를 들어 인간에서)을 갖는 화합물을 확인할 수 있다 (예를 들어 인간 질병, 예를 들어 자가면역 질병 치료에 유용한 화합물).
약물 스크리닝을 위한 다른 기술은 변이체 펩티드에 대한 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO 84/03564에 상세하게 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 다량의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물은 고체 기재, 예를 들어 플라스틱 핀 또는 몇몇의 다른 표면 상에서 합성된다. 펩티드 시험 화합물은 이어서 변이체 펩티드와 반응하고, 세척된다. 이어서, 결합된 변이체 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출된다.
또다른 기술은 변이체 펩티드에 대해 작용하는 항체를 사용한다. 변이체 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 항체는 주어진 변이체에 대한 결합에 대해 시험 화합물과 경쟁한다. 상기 방식으로, 항체를 사용하여 변이체 펩티드의 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.
본 발명은 스크리닝 화합물의 많은 다른 수단을 고려한다. 상기 제공된 예는 단지 이용가능한 기술 범위를 예시하기 위해 제시된 것이다. 당업자는 많은 다른 스크리닝 방법을 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
특히, 본 발명은 활성에 대한 화합물의 스크리닝, 특히 조합 라이브러리 (예를 들어 104 초과의 화합물을 포함하는 라이브러리)로부터 화합물의 고처리량 스크리닝을 위한, 적어도 하나의 변이체 Fc 영역을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포주의 용도를 고려한다. 본 발명의 세포주는 다양한 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 변이체는 친화도 정제제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 고상, 예를 들어 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정될 수 있다. 고정된 변이체는 이어서 정제될 항원을 포함하는 샘플과 접촉한 후, 고정된 폴리펩티드 변이체에 결합된 정제될 항원을 제외하고 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거하는 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 마지막으로, 지지체를 변이체 폴리펩티드로부터 항원을 방출시키는 다른 적합한 용매, 예를 들어 글리신 버퍼 (pH 5.0)로 세척한다.
또한, 변이체 폴리펩티드는 진단 분석 (예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 목적하는 항원의 발현을 검출하기 위한)에 유용할 수 있다. 진단 적용을 위해, 변이체는 일반적으로 검출가능 잔기 (상기 표지는 상기한 Fc 영역 분석에도 유용함)로 표지될 것이다. 방사성 동위원소 (예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I), 형광 표지 (예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드), 및 다양한 효소-기질 표지 (예를 들어, 미국 특허 4,275,149 참조), 및 루시퍼라제, 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, 3-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등)를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 표지를 이용할 수 있다. 효소-기질 조합체의 예는 예를 들어 (i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체 (예를 들어 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴); (ii) 알칼린 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 (iii) R-D-갈락토시다제 (R-D-Gai)와 발색 기질 또는 형광 기질을 포함한다.
또한, 본 발명의 변이체를 생체내 진단 분석에 사용할 수 있다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 그를 발현하는 항원 또는 세포를 면역섬광조영술을 사용하여 편재화시킬 수 있도록 방사성 핵종으로 표지된다.
[표 1]
Fc 변이체
Figure 112007010298887-pct00001
[표 2]
Fc 변이체: 효과기 기능 변화
Figure 112007010298887-pct00002
Figure 112007010298887-pct00003
Figure 112007010298887-pct00004
Figure 112007010298887-pct00005
Figure 112007010298887-pct00006
Figure 112007010298887-pct00007
Figure 112007010298887-pct00008
Figure 112007010298887-pct00009
Figure 112007010298887-pct00010
Figure 112007010298887-pct00011
[표 3]
향상된 ADCC
Figure 112007010298887-pct00012
[표 4]
감소된 ADCC
Figure 112007010298887-pct00013
[표 5]
향상된 FcRn 결합 친화도
Figure 112007010298887-pct00014
[표 6]
감소된 FcRn 결합 친화도
Figure 112007010298887-pct00015
[표 7]
향상된 CDC
Figure 112007010298887-pct00016
[표 8]
감소된 CDC
Figure 112007010298887-pct00017
다음 실시예는 특정한 바람직한 실시태양 및 본 발명의 측면을 입증하고 추가로 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 생각하지 않아야 한다.
실시예 I - ADCC 분석에서 변이체 Fc 영역의 스크리닝
본 실시예는 ADCC 분석에서 변이체 Fc 영역을 항체 (예를 들어 항-CD20)의 측면에서 스크리닝하는 방법을 설명한다.
i. 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 단리
약 50 ml의 말초 혈액을 건강한 공여자로부터 얻어 포스페이트 완충 염수 (PBS, pH 7.0)로 1:2로 희석하였다. 튜브를 부드럽게 빙빙 돌려 용액을 혼합하였다. 약 12 ml의 Histopaque-1077 (시그마 (Sigma) 카탈로그 번호 1077-1)을 희석된 혈액 샘플 아래에 조심스럽게 적층시킨 후, 진동 버킷 로터가 장치된 Sorvall RT6000B 원심분리기로 1000 rpm에서 10 min 동안 중단 없이 원심분리하였다. 상부의 상을 흡입에 의해 버리고, 백색의 PBMC 함유 내부상을 수집하여 행크 균형 염 용액 (깁코 (Gibco) 카탈로그 번호 14025-092)으로 3회 세척하였다. 세척된 세포 펠렛을 약 20 ml의 10% 태아 소 혈청 (FBS) 함유 RPMI 1640 배지 (오메가 사이언티픽 (Omega Scientific) 카탈로그 번호 FB-01)에 현탁시켰다. 재현탁된 PBMC를 2개의 T-175 배양 플라스크에 나누고, 30 ml의 10% FBS 함유 RPMI를 각각 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 철야 인큐베이션하였다. 다음날, 비부착 PBMC를 50 mL Falcon 튜브에 수집하고, 상기와 같이 원심분리하여 페놀 레드가 없는 1% FBS 함유 RPMI에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 작은 분획을 10배 희석하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 나머지 PBMC를 필요할 때까지 인큐베이터에 두었다.
ii. 표적 세포주 (항- CD20 ADCC 분석에 특이적)
Wil.2 및 SKW6.4 CD20-발현 B-세포주를 ATCC로부터 입수하여 권고되는 바와 같이 성장시켰다. 사용 1일 전에, 세포를 둘로 나누었다. 다음날, 세포수를 4 X 105 세포/ml로 조정하고, 50 ㎕ 분취액 (20,000 세포/웰)을 96웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다.
iii. IgG 희석액
스크리닝 전에, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 IgG를 발현시키고, 정제하여 표준 ELISA로 정량하였다. 1차 단일점 ADCC 스크리닝을 위해, IgG 변이체를 페놀 레드가 없는 1% FBS를 포함하는 RPMI 배지에 40 ng/ml로 희석하였다. 분석의 최종 IgG 농도를 4배 (즉, 10 ng/ml 최종 농도)로 희석하였다. 50 ㎕ 분취액의 IgG를 표적 세포에 첨가하고, 효과기 세포를 옵소닌 작용된 표적 세포에 첨가하기 전에 약 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
IgG 적정을 수행할 때, IgG 농도를 약 0.0001 내지 1 ㎍/ml로 변경하였다. 96웰 미세역가 플레이트를 사용하여 페놀 레드가 없는 1% FBS를 포함하는 RPMI로 샘플을 희석하여 IgG 희석액을 제조하였다. 이어서, 희석된 IgG 샘플을 표적 세포를 포함하는 분석 플레이트에 가하였다.
iv. 효과기 세포
효과기 대 표적 비율이 10-20:1 (즉 2-4 X 106 세포/ml)이 되도록 PBMC의 농도를 조정하였다. 100 ㎕의 재현탁된 PBMC를 옵소닌 작용된 표적 세포의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2의 존재 하에 3-4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
v. 락테이트 - 데히드로게나제 ( LDH )-방출 검출
세포질로부터 배양 상등액 내로의 LDH 효소의 방출을 검출하여 표적 세포 용해를 측정하였다. 옵소닌 작용된 표적 세포와 효과기 세포의 인큐베이션 후에, 분석 플레이트를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛화된 세포 및 파편을 유지시키면서 약 75 ㎕의 세포 배양 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 상기 상등액을 직접 미세역가 플레이트에 가하고, 여기에 75 ㎕의 LDH 검출 시약 (로슈 카탈로그 번호 1 644793)을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 약 15-30 min 동안 인큐베이션하고, 몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices) Vmax Kinetic 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 판독하였다.
vi. 데이타 분석
모든 ADCC 스크리닝 분석을 2회 수행하였다. 각각의 분석 플레이트는 자연적인 표적 용해, IgG의 부재 하의 자연적인 효과기 + 표적 용해 및 표적 세포 완전 용해를 위한 대조군을 포함하였다. 표적 세포 완전 용해는 1% Triton X-100을 표적 세포에 첨가하여 달성하였다. 야생형 대조군을 각각의 분석 플레이트에 포함시키고, ADCC 분석 시그날을 평균하였다. 자연적인 용해 대조군으로부터 얻은 배경 값을 각각의 샘플로부터 차감하였다. 희석된 IgG로부터 얻은 배경값을 각각의 샘플로부터 차감하였다. 데이타를 흡광도값으로부터 자연적인 및 완전 용해 대조군을 기초로 한 특이적 용해 비율로 전환시켰다. 특이적 용해 비율은 다음 식으로 계산하였다: 특이적 용해 비율 = (실험 A490 -배경 A490)/(최대 A490 - 배경 A490) X 100 (여기서, 배경 A490은 IgG의 부재 하의 효과기 및 표적 세포로부터 얻은 A490 및 조 IgG 상등액에 존재하는 오염 LDH에 의한 IgG 배경의 총합이다). Fc 변이체 활성의 비율은 야생형 대조군 평균에 대해 정규화시켰다. 2회 분석 플레이트에 대한 정규화된 활성의 비율을 평균하고, 개별 분석 플레이트 사이의 표준편차를 각각의 샘플에 대해 계산하였다.
vii. 결과
상대적인 ADCC 특이적 활성을 하기 표 9 (단일 치환) 및 10 (조합 치환)에 제시한다. 표 9에 나타낸 CDC 값은 하기 실시예 2에 기재되는 바와 같이 생성시키고, 표 9에 나타낸 FcRn 결합 분석값은 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 결과를 상기 표 1 및 2에 추가로 요약하였다. 단일 치환 단독보다 더 큰 ADCC 값을 생성시키는 조합 치환은 247F,339D; 247I,339D; 247L,339D; 247L,339T; 및 247I,339Q이었다. 단독 시험시에 야생형 ADCC보다 더 큰 ADCC 값을 생성시키지만 야생형 ADCC의 80% 미만의 ADCC 값을 생성시키는 조합 치환은 247A,339D; 247Y,339H; 247I,3391; 247T,339I; 247L,339N; 247A,339Q; 및 247A,339R이었다. 단독 시험시에 야생형 ADCC보다 더 큰 ADCC 값을 생성시키지만 야생형 ADCC의 10% 미만의 ADCC 값을 생성시키는 조합 치환은 247I,339I; 247T,339I; 및 247L,339N이 었다.
[표 9]
Figure 112007010298887-pct00018
Figure 112007010298887-pct00019
Figure 112007010298887-pct00020
Figure 112007010298887-pct00021
Figure 112007010298887-pct00022
Figure 112007010298887-pct00023
Figure 112007010298887-pct00024
Figure 112007010298887-pct00025
Figure 112007010298887-pct00026
Figure 112007010298887-pct00027
Figure 112007010298887-pct00028
Na = 이용가능하지 않거나 미실시
*: 예를 들어 L235A는 Fc 아미노산 번호 235 (EU 넘버링에 따른)에 존재하는 류신이 알라닌 잔기로 치환된 Fc를 나타낸다.
시험 대상: Fc 영역은 IgG1 Fc이고, 항체는 항-CD20 항체이다.
[표 10]
Figure 112007010298887-pct00029
wt = 야생형
CV% =
n = 측정되고 평균한 샘플의 수
[표 11]
ADCC가 개선된 조합 변이체
Fc 변이체 ADCC EC50 (ng/ml)
야생형 6.8
247L 2.2
330L 3.1
332E 1.5
339T 3.8
247L,330K 1.5
247L,332E 0.73
247L,339T 2.0
330K,332E 0.73
330K,339T 2.0
332E,339T 1.0
247L,332E,339T 0.75
247L,330K,332E 0.25
247L,330K,339T 1.5
330K,332E,339T 0.25
247L,330K,332E,339T 0.25
* ADCC 활성은 적정 곡선으로부터 계산하였다.
[표 12]
조합 변이체
Figure 112007010298887-pct00030
[표 13]
조합 변이체
돌연변이 FcRn6.0 CV% n=
야생형 100
258D272R 382.8 8.2 2
258D283R 411.1 3.7 2
258D286F 445.0 1.7 2
258D307E 237.1 4.8 2
258D311I 522.0 7.0 2
258D376V 415.1 4.3 2
272R283R 439.3 21.7 2
272R286F 338.4 8.9 2
272R311I 396.1 14.4 2
272R376V 368.7 8.1 2
279D307E 522.4 8.8 2
283R307E 400.2 9.1 2
283R311I 531.3 6.1 2
283R376V 474.8 1.1 2
286F307E 431.2 3.8 2
286F311I 412.3 0.0 2
286F376V 348.9 1.5 2
307E376V 480.1 4.3 2
311I376V 413.5 39.1 2
실시예 2 - 변이체의 CDC 활성의 특성화
본 실시예는 다양한 변이체 Fc 영역의 CDC 활성을 결정하는 방법을 설명한다.
본 분석은 인간 보체 (퀴델 코포레이션 (Quidel Corp.), cat#AI 13)을 사용하여 15 Ramos (RA #1) 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-1596)에 대해 수행하였다. Ramos 세포를 10% FBS 함유 깁코 RPMI1640 배지에서 37℃ 및 5% C02 하에서 배양하였다. 분석 전날, 세포를 1 x 106 세포로 T175 플라스크에 씨딩하였다. 다음날, 세포를 1% FBS를 포함하는 페놀 레드가 없는 RPMI1640에 3.57 x 105 세포/ml로 재현탁시켰다. 웰당 70 ㎕ 세포를 코스타 (Costar) 3917 평저 플레이트에 분배하였다. 적정 곡선을 위해, 변이체 Fc 영역을 갖는 IgG를 RPMI1640 배지 중의 3배 연속 희 석액으로 제조하였다. 단일점 라이브러리 스크리닝 분석을 위해, 배양 상등액 중의 일시적으로 발현된 IgG 변이체를 모의 배지 (mock media)에 1 ㎍/ml로 정규화하였다. RPMI 1640 + 1% FBS 중에 1:5로 희석된 30 ㎕의 변이체 IgG (즉, 200 ng/ml 최종 농도)와 50 ㎕의 인간 보체 (퀴델 코포레이션, cat#Al 13)를 표적 세포에 첨가하고, 피펫으로 부드럽게 잘 혼합하였다. 플레이트를 5% CO2의 존재 하에 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 15 ㎕/웰의 알라마르 블루 (세로텍 (Serotec), cat#BUF012B)를 첨가한 후, 인큐베이션을 철야 계속하였다. 이어서, 560 nm에서 여기되고 590 nm에서 방출하는 퍼킨엘머 (PerkinElmer)의 EnVision 2100 다중표지 판독기로 형광 시그날을 측정하였다.
ii. 데이타 분석
모든 단일점 분석은 2회 수행하였다. 각각의 분석 플레이트는 IgG의 부재 하에 인간 보체에 의한 자연적인 표적 세포 용해 및 1% Triton X-100의 존재 하의 표적 세포 최대 용해를 위한 대조군을 포함하였다. 3개의 야생형 대조군이 각각의 분석 플레이트에 포함되었고, CDC 분석 시그날을 평균하였다. 자연적인 용해 대조군으로부터 얻은 배경값을 각각의 샘플로부타 차감하였다. 데이타는 희석된 IgG로부터 얻은 배경값을 각각의 샘플로부터 차감하였다. 데이타를 형광 시그날로부터 자연적인 및 최대 용해 대조군을 기초로 한 특이적 용해 비율로 전환시켰다. 특이적 용해 비율은 다음 식으로 계산하였다: 특이적 용해 비율 = (실험 형광 시그날 -자연적인 시그날)/(최대 용해 시그날 - 자연적인 시그날) X 100. 3개의 야생형 대 조군의 평균에 대한 Fc 변이체 활성의 비율을 계산하였다. 2회 분석 플레이트에 대해 야생형에 대한 활성의 비율을 평균하고, 개별 분석 플레이트 사이의 표준편차를 계산하였다.
실시예 3 - FcRn 에 대한 결합의 특성화
본 실시예는 변이체 Fc 영역을 갖는 IgG에 대한 Fc 신생아 수용체 (FcRn) 결합의 분석을 설명한다.
U-바닥 96웰 ELISA 플레이트 (코스타)를 50 mM 탄산염 버퍼 (pH 9.3) 중의 2 ㎍/ml 뉴트라비딘 (피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology), Cat#3 1000)으로 50 ㎕/웰로 4℃에서 철야 코팅하였다. 비결합된 뉴트라비딘을 제거하고, 플레이트를 PBST (0.1% Tween 20 함유 PBS)로 3회 세척하였다. PBS 중의 2.5 ㎍/ml의 비오틴-표지된 가용성 FcRn를 웰당 50 ㎕로 첨가하고, 실온에서 1 hr 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 75 ㎕의 카제인 차단 버퍼 (피어스 바이오테크놀로지, Cat#37528)를 플레이트에 1 hr 동안 첨가하였다. 이어서, ELISA 플레이트를 PBST로 세척하고, 50 ㎕/웰의 변이체 IgG와 함께 인큐베이팅하였다. 적정 곡선을 위해, 시험되는 IgG를 FcRn-결합 버퍼 (100 mM NaPO4, 0.05% Tween-20, 임의의 상이한 pH (6.0 내지 7.4)) 중의 3배 연속 희석액으로 제조하였다. 단일점 스크리닝을 위해, 배양 상등액 중의 일시 발현된 변이체 IgG를 최종 농도 50 ng/ml로 정규화하고, FcRn 결합 버퍼로 pH를 6.0으로 조정하였다. 다음 단계에서, 대응하는 pH의 FcRn-결합 버퍼를 사용하여 플레이트를 세척하고, 시약을 희석하였다. 결합 반응 은 실온에서 1 hr 동안 수행하였다. 3회 세척 후에, 결합된 IgG를 염소 (Fab')2 항-인간-Fab-HRP 컨쥬게이트로 1 hr 동안 검출하였다. HRP 활성은 피어스의 HRP 기질 (Turbo TMB-ELISA, Cat#34022)에서 5-30분 동안 발생시켰다. 50 ㎕의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 VMAX 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)로 판독하였다.
실시예 4 - 항- CD20 - I332E Fc 변이체 인간 요법
시험관내 연구 및 쥐 종양 모델 (Clynes RA, et al. Nat Med. 6:443 (2000))은 ADCC가 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭산의 항종양 효과에서 특정 역할을 수행한다는 증거를 제공한다. 인간 환자는 문헌 [Cartron et al., Blood 99:754 (2002)]에 기재된 바와 유사한 방식으로 항-CD20-I332E Fc 변이체 항체 또는 리툭산으로 치료할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 측정가능한 질병 부위 및 GELF 기준에 따른 낮은 종양 부하를 갖는 Ann-Arbor 분류에 따른 단계 II 내지 IV 질병을 나타내는 환자는 정맥내 주입 (1, 8, 15 및 22일)에 의해 투여되는, 총 4회의 약 375 mg/m2 투여량의 항-CD20-Fc 변이체 또는 리툭산으로 치료될 수 있다. 1차 효능 종말점은 객관적인 반응 비율, 즉 국제 전문가 위원회에서 최근 제안된 기준에 따른 완전 관해 (CR), 미확인된 CR (Cru) 또는 부분 반응 (PR)을 달성하는 환자의 비율이다. 임상 반응은 2개월째 (M2)에 평가할 수 있다. 환자는 또한 1년째 (M12)에 경과에 대해 평가할 수 있다.
리툭산 또는 항-CD20-Fc 변이체로 치료된 환자에 대한 M2 및 M12에서의 객관 적인 반응 비율을, Fc 변이체가 제공하는 개선된 ADCC 활성을 정량화할 수 있도록 비교할 수 있다. 상기와 동일한 실시예를 다른 항-CD20 변이체 (예를 들어 표 1-10 참조)를 사용하여 반복할 수 있다.
추가로, 변이체의 향상된 효능은 상이한 투여 경로, 보다 낮은 빈도의 주사 및(또는) 보다 적은 용량의 투여를 가능하게 할 수 있다. 모든 문헌 및 특허는 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않는, 설명된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경을 당업자는 쉽게 알 수 있을 것이다. 본 발명을 구체적인 바람직한 실시태양과 관련하여 설명하였지만, 특허청구되는 본 발명은 상기 특정 실시태양으로 부당하게 제한되지 않아야 한다. 실제로, 화학 분야 및 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련인에게 자명한, 본원에서 설명된 본 발명의 수행 방식의 다양한 변형은 하기 청구의 범위에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Applied Molecular Evolution (AME) <120> Variant Fc Regions <130> X16877 <140> US 60/643,718 <141> 2005-01-13 <150> US 60/638,442 <151> 2004-12-23 <150> US 60/609,101 <151> 2004-10-09 <150> US 60/604,339 <151> 2004-08-25 <150> US 60/602,953 <151> 2004-08-19 <150> US 60/598,855 <151> 2004-04-08 <160> 36 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 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Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagctc aagtgtaccg tacatccact ggtaccagca gaaacctggc 120 caggctccca ggctcctcat ctatgccaca tccgctctgg cttctggcat cccagacagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa 240 gattttgcag tgtattactg tcagcagtgg ctgagtaacc cacccacttt tggccagggg 300 accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642 <210> 31 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser 50 55 60 Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 32 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac 180 aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300 tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa atcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaacaga aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356 <210> 33 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser 50 55 60 Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 34 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac 180 aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300 tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa atcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagaca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356 <210> 35 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser 50 55 60 Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 36 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac 180 aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300 tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356

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  60. (a) 서열 13으로 이루어진 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (b) 서열 14로 이루어진 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및
    (c) 변이체 Fc 영역이 247I/339Q 및 247I/339D로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 모 Fc 영역의 변이체
    를 포함하는 항-CD20 항체.
  61. 제60항에 있어서, Fc 변이체가 247I/339Q인 항-CD20 항체.
  62. 제60항에 있어서, Fc 변이체가 247I/339D인 항-CD20 항체.
  63. 제61항에 있어서, 서열 29로 이루어진 경쇄 아미노산 서열 및 서열 31로 이루어진 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 항체.
  64. 제63항에 있어서, 경쇄가 서열 30을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 중쇄가 서열 32를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 항-CD20 항체.
  65. 제62항에 있어서, 서열 29로 이루어진 경쇄 아미노산 서열 및 서열 33으로 이루어진 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 항체.
  66. 제65항에 있어서, 경쇄가 서열 30을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 중쇄가 서열 34를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 항-CD20 항체.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항-CD20 항체를 포함하는 암 치료용 제약 조성물.
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  69. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항-CD20 항체를 포함하는 림프종 치료용 제약 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 림프종 치료용 제약 조성물.
  71. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항-CD20 항체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 제약 조성물.
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