CN113227134A - 抗体的Fc区变体 - Google Patents
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Abstract
本发明为包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽的变体,其中,所述变体与狗或猫新生儿Fc受体(FcRn)结合的活性比亲本多肽与狗或猫FcRn结合的活性高,且在该Fc区包含至少一个氨基酸改变。由于该变体增强在酸性区条件下的FcRn结合活性,因此通过使用该变体,可提供具有更长的血浆中滞留性的抗体(IgG)和Fc融合蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及狗或猫IgG的Fc区变体(修饰体),特别是增强与新生儿Fc受体的结合亲和性的Fc区变体。
背景技术
新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor;以下也称为FcRn)与IgG的Fc区结合,再循环至血浆中,从而避免IgG被溶酶体降解。IgG通过与FcRn结合而具有长的血浆中滞留性。仅在酸性条件下(例如pH6.0)可观察到IgG与FcRn的结合,在中性条件下(例如pH7.4)几乎观察不到结合。通常,IgG通过内吞作用(endocytosis,胞吞)被非特异性地摄入到细胞中,但在内体(endosome)内的酸性条件下与内体内的FcRn结合,从而返回到细胞表面,在血浆中的中性条件下从FcRn解离,从而被再循环,结果具有比其他血浆中蛋白质更长的血浆中滞留性。在内体内不与FcRn结合的IgG进入溶酶体,且在其中被降解。
作为改善IgG的血浆中滞留性的方法,已报道在人中提高在酸性条件下的对FcRn的结合能的方法。在IgG的Fc区导入氨基酸取代,提高酸性条件下的对FcRn的结合能,从而从内体内到血浆中的再循环效率上升,其结果,改善血浆中滞留性(专利文献1、2,非专利文献1~3)。
另外,虽然已开发融合有IgG的Fc区的细胞因子和可溶性膜受体等(Fc融合蛋白质)作为用于人的治疗用医药品,但是它们与IgG同样地通过与FcRn的结合来实现长的血浆中滞留性。
如上所述,已开发在人中改变(修饰)/应用IgG的Fc区与FcRn的结合的生物医药品,期望开发在狗、猫等人以外的动物中也同样地改善血浆中滞留性的生物医药品。
然而,关于改善、提高狗、猫中的抗体的血浆中滞留性的Fc区的氨基酸改变仍然未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2002/060919公报;
专利文献2:WO2012/083370公报;
非专利文献
非专利文献1:Yeung YA等人、J. Immunol. (2009) 182, 7663-71;
非专利文献2:Datta-Mannan A等人、J. Biol. Chem. (2007) 282, 1709-17;
非专利文献3:Dall'Acqua WF等人、J. Immunol. (2002) 169, 5171-80。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供在酸性条件下与FcRn的结合能增强、特别是血浆中滞留性提高的狗和猫的IgG的Fc区的变体。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题,本发明人针对在IgG的Fc区内的氨基酸改变进行深入研究,所述氨基酸改变与天然的IgG的Fc区比较可显著地增强在pH酸性区条件下的对FcRn的结合,结果发现与野生型相比可提高FnRn结合活性的氨基酸改变(以下也称为本发明的氨基酸改变),从而完成了本发明。
即,本发明如下。
[1] 变体,其为包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽的变体,在酸性条件下,所述变体与狗或猫Fc新生儿受体(FcRn)结合的活性比亲本多肽与狗或猫FcRn结合的活性高,且在该Fc区包含至少一个氨基酸改变。
[2] 上述[1]所述的变体,其中,亲本多肽构成抗体。
[3] 上述[1]或[2]所述的变体,其中,亲本多肽包含狗IgG的Fc区。
[4] 上述[1]或[2]所述的变体,其中,亲本多肽包含猫IgG的Fc区。
[5] 上述[3]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变包含选自下述的至少一个取代:
(i) 252位亮氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,
(v) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(vi) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,
(vii) 434位天冬酰胺向丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代,
(viii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(ix) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(x) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代
此处,Fc区中的氨基酸编号基于以人抗体的Fc区为基准的Kabat的EU索引。
[6] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(ii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[7] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(iii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(iv) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(v) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[8] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[9] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位亮氨酸向酪氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,和
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代。
[10] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,和
(ii) 434位天冬酰胺向丝氨酸的取代。
[11] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,和
(ii) 434位天冬酰胺向酪氨酸的取代。
[12] 上述[5]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位亮氨酸向苏氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,和
(v) 434位天冬酰胺向苯丙氨酸的取代。
[13] 上述[4]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变包含选自下述的至少一个取代:
(i) 252位丝氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 259位缬氨酸向异亮氨酸的取代,
(v) 308位异亮氨酸向脯氨酸或苯丙氨酸的取代,
(vi) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(vii) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,
(viii) 434位丝氨酸向丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代,
(ix) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(x) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(xi) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代,
此处,Fc区中的氨基酸编号基于以人抗体的Fc区为基准的Kabat的EU索引。
[14] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(ii) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[15] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(iii) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(iv) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(v) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[16] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
[17] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位丝氨酸向酪氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,和
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代。
[18] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,和
(ii) 434位丝氨酸向酪氨酸的取代。
[19] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 259位缬氨酸向异亮氨酸的取代,
(ii) 308位异亮氨酸向苯丙氨酸的取代,和
(iii) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代。
[20] 上述[13]所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,和
(v) 434位丝氨酸向苯丙氨酸的取代。
[21] 抗体或Fc融合蛋白质,所述抗体或Fc融合蛋白质包含上述[1]~[20]中任一项所述的变体。
发明效果
由于本发明的Fc区变体增强在酸性区条件下的FcRn结合活性,因此通过使用该变体,可提供具有更长的血浆中滞留性的抗体(IgG)和Fc融合蛋白质。
具体实施方式
本发明提供变体,其为包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽的变体,在酸性条件下,所述变体与狗或猫FcRn结合的活性(以下也称为FcRn结合活性)比亲本多肽的FcRn结合活性高,且在该Fc区包含至少一个氨基酸改变。以下,进行详细说明。
“FcRn”在结构上与主要组织相容性复合体(MHC) I类的多肽结构性地类似,在人中与I类MHC分子具有22至29%的序列同一性(人的参考文献:Ghetie等人, Immunol. Today(1997) 18 (12), 592-598)。
FcRn被表达为由作为可溶性β链(或轻链)的β2-微球蛋白(有记载为β2m的情况)和膜贯通α链(或有记载为重链、FCGRT的情况)组成的异二聚体。FcRn的α链由3个细胞外结构域(胞外域) (α1, α2, α3)组成,α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等人, Immunity (1994) 1, 303-315)。
FcRn在生物体内形成与β2-微球蛋白的复合体。可溶型FcRn与β2-微球蛋白的复合体使用常规的重组表达方法(参考实施例的“FcRn表达载体的制作”“FcRn蛋白质的表达和纯化”之项)进行调制,可将该复合体用于本发明的FcRn结合活性的评价中。本发明中,在没有特别记载的情况下,FcRn用作与β2-微球蛋白的复合体。
“亲本多肽”是指相对于导入有本发明的氨基酸改变的多肽、在导入该改变之前的多肽。作为包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽,可列举包含狗或猫的天然IgG的Fc区的多肽,优选为抗体,可列举特别是构成狗或猫的天然IgG的多肽。也将具有在亲本多肽的Fc区导入有氨基酸改变的Fc区的多肽称为Fc区变体,还将由该变体构成的IgG称为变异型IgG。
狗或猫的野生型IgG是指包含与天然存在的狗或猫的IgG相同的氨基酸序列,且属于实质上由免疫球蛋白伽马基因编码的抗体类别的多肽。
IgG中存在同种型(isoform),其数目因动物物种而异。在人、小鼠或大鼠中已知4种IgG1~IgG4。在狗中也存在4个IgG免疫球蛋白,它们被定义为caIgG-A、caIgG-B、caIgG-C和caIgG-D (Tang等人,Vet. Immunol. Immunopathol. 80(3-4), 259-270, 2001)。在猫中,存在3种类的IgG免疫球蛋白,已报道它们作为IgG1a、IgG1b、IgG2存在。
1) Kanai,T.H. 等人,2000. Identification of two allelic IgG1 C(H)coding regions (Cgamma1) of cat (鉴定猫的两个等位基因IgG1 C(H)编码区(Cgamma1)). Vet. Immunol. Immunopathol. 73(1), 53-62;
2) Strietzel,C.J. 等人,2014. In Vitro functional characterization offeline IgGs (猫IgG的体外功能表征),Vet. Immunol. Immunopathol. 158 (3-4), 214-233。
作为Fc区中的氨基酸改变的实例,包括氨基酸的取代、插入、缺失等,优选为氨基酸的取代。对被改变的氨基酸的数目没有特别限定,可仅改变1处的氨基酸,也可改变2处以上的氨基酸。优选改变2~数处、更优选改变2~5处左右的氨基酸。只要在pH酸性区条件下的FnRn结合活性比被改变前变强,则对氨基酸的改变没有特别限定,优选为以下的改变。
(狗的情况)
(i) 252位亮氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代(L252Y或L252T),
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代(A254T),
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代(T256E),
(iv) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代(I308P),
(v) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代(M428L),
(vi) 433位组氨酸向亮氨酸的取代(H433L),
(vii) 434位天冬酰胺向丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代(N434A、N434S、N434Y或N434F),
(viii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代(Y436T),
(ix) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代(Q438R),和
(x) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代(S440E),
具有至少一个、优选两个以上的该改变。
作为优选的改变的实例,可列举以下的DFV-1~DFV-6、DFV-8。
DFV-1;N434A、Y436T、Q438R、S440E,
DFV-2;M428L、N434A、Y436T、Q438R、S440E,
DFV-3;M428L、N434A、Q438R、S440E,
DFV-4;L252Y、A254T、T256E,
DFV-5;M428L、N434S,
DFV-6;I308P、N434Y,
DFV-8;L252T、A254T、T256E、H433L、N434F。
(猫的情况)
(i) 252位丝氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代(S252Y或S252T),
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代(S254T),
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代(T256E),
(iv) 259位缬氨酸向异亮氨酸的取代(V259I),
(v) 308位异亮氨酸向脯氨酸或苯丙氨酸的取代(I308P或I308F),
(vi) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代(S428L),
(vii) 433位组氨酸向亮氨酸的取代(H433L),
(viii) 434位丝氨酸向丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代(S434A,S434Y或S434F),
(ix) 436位组氨酸向苏氨酸的取代(H436T),
(x) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代(Q438R),和
(xi) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代(S440E),
具有至少一个、优选两个以上的该改变。
作为优选的改变的实例,可列举以下的CFV-1~CFV-4、CFV-6~CFV-8。
CFV-1;S434A、H436T、Q438R、S440E,
CFV-2;S428L、S434A、H436T、Q438R、S440E,
CFV-3;S428L、S434A、Q438R、S440E,
CFV-4;S252Y、S254T、T256E,
CFV-6;I308P、S434Y,
CFV-7;V259I、I308F、S428L,
CFV-8;S252T、S254T、T256E、H433L、S434F。
在本说明书中,数字表示到取代处为至的氨基酸残基数,所述数字左侧显示的字母表示取代前的氨基酸的单字母符号,右侧显示的字母表示取代后的氨基酸的单字母符号。到取代处为止的氨基酸残基数是使人IgG的Fc区的Kabat的EU编号系统与狗或猫的Fc区对应。“EU编号系统”或“EU索引”一般在参考抗体的重链恒定区的残基的情况下使用(例如,Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫相关的蛋白质序列). 第5版. Public Health Service (公共卫生局), National Institutes ofHealth (美国国立卫生研究院), Bethesda, MD. (1991))。“Kabat的EU编号系统”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。在本说明书中,如果没有特别明记,则关于残基编号的提及是使Kabat的EU编号与狗或猫的序列对应。
在本发明中使用的包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽,例如也可实施下述的改变:为了增强ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性或CDC(补体依赖性细胞毒性)活性的改变、为了提高蛋白酶抵抗性的改变、为了减少效应子功能的改变、为了减少对补体的结合活性的改变、为了提高抗体的异质性或稳定性的改变、为了促进抗原消失的改变、为了重复结合多个分子的抗原的改变、以提高血中滞留性为目的为了降低恒定区的pI的改变、为了具有对其他抗原的结合能的改变等。更多详细信息可参考Current PharmaceuticalBiotechnology, 2016, 17, 1298-1314中所记载的Fc工程技术。需说明的是,关于该文献中的残基编号的提及基于Kabat的EU编号系统。这些改变的种类可为例如氨基酸的取代、缺失、附加、插入、修饰中的任一种或也可为它们的组合,但优选为氨基酸的取代。
需说明的是,本说明书中使用的氨基酸的三字母符号与单字母符号的对应如下。
丙氨酸:Ala:A
精氨酸:Arg:R
天冬酰胺:Asn:N
天冬氨酸:Asp:D
半胱氨酸:Cys:C
谷氨酰胺:Gln:Q
谷氨酸:Gln:E
甘氨酸:Glu:G
组氨酸:His:H
异亮氨酸:Ile:I
亮氨酸:Leu:L
赖氨酸:Lys:K
蛋氨酸:Met:M
苯丙氨酸:Phe:F
脯氨酸:Pro:P
丝氨酸:Ser:S
苏氨酸:Thr:T
色氨酸:Trp:W
酪氨酸:Tyr:Y
缬氨酸:Val:V
关于向氨基酸序列中的、这样的氨基酸的改变(缺失、取代、插入、附加),可通过部分地改变编码该氨基酸序列的碱基序列(核苷酸序列)来进行导入。该碱基序列的部分改变可适当采用已知的位点特异性突变导入法(Site specific mutagenesis,位点特异性诱变) (Proc Natl Acsd Sci USA., 1984 Vol. 81 5662-5666; Sambrook等人, MolecularCloning A Laboratory Manual (1989) 第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(美国冷泉港实验室出版社))或重叠延伸PCR等周知的方法。另外,作为在天然氨基酸以外的氨基酸上进行改变的方法,还可采用多种周知的方法(Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11),6353-6357)。例如,适宜地使用无细胞翻译系统(Clover Direct (蛋白质表达))等,所述无细胞翻译系统包含非天然氨基酸与作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补的琥珀抑制基因tRNA结合的tRNA。
另外,可参考在下述文献中实施的改变人IgG1的Fc区的手法。
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Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7): 637-40、
Nat Biotechnol. 2005 Oct; 23(10): 1283-8、
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5; 103(49): 18709-14、
EP2154157、US20070141052、WO2000/042072、WO2002/060919、WO2006/020114、WO2006/031370、WO2010/033279、WO2006/053301、WO2009/086320。
在本发明中,“具有活性”是指在可测定其活性的系统中,测定值变得高于该系统中的背景值(或测定阴性对照时的值)。例如,具有结合活性是指在ELISA、FACS或Biacore等的可测定结合活性的系统中,测定值变得高于背景值。在本发明中,测定值的高度相对于背景值优选为2倍以上、更优选为3倍以上、进一步优选为5倍以上、特别优选为10倍以上。
例如,在本发明中,可使用KD(解离常数)的倒数作为FcRn结合活性的值。本发明所提供的Fc区变体的KD值的测定可通过使用例如Biacore (GE Healthcare)的周知方法来进行。在Biacore的情况下,具体而言,可通过将本发明所提供的Fc区变体或包含该变体的抗体分子固定在传感芯片上,在其中使作为分析物的FcRn流过,来测定KD值。通过在野生型IgG的Fc区(野生型Fc)和变异型IgG的Fc区(Fc区变体)以及pH酸性区条件下和pH中性条件下进行测定,可算出KD(Fc区变体)/KD(野生型Fc)和KD(pH酸性)/KD(pH中性)的值。
还可使用kd (Dissociation rate constant: 解离速率常数)代替KD。
在本说明书中,与狗或猫FcRn结合的活性高于亲本多肽是指,例如与狗或猫FcRn结合的活性为亲本多肽的105%以上,优选为110%以上、115%以上、120%以上、125%以上,特别优选为130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上。
如果可对本发明的Fc区变体赋予在pH酸性区条件下与狗或猫FcRn结合的活性变得强于天然的狗或猫IgG这样的性质,并且如果可使用该Fc区变体来构成IgG,则通过提高在酸性条件下的对IgG的FcRn的结合,可提高从内体内到血浆中的再循环效率,其结果,可改善乃至提高血浆中滞留性。
在本发明中,在pH酸性区条件下对狗或猫FcRn的结合活性是指在pH4.0~pH6.5下的FcRn结合活性。优选是指在pH5.0~pH6.5下的FcRn结合活性,进一步优选是指在pH5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5中的任一pH下的狗或猫FcRn结合活性,特别优选是指在接近于生物体内的早期内体内的pH的pH5.8~pH6.0下的FcRn结合活性。另外,在本发明中,在pH中性区条件下对狗或猫FcRn的结合活性是指在pH6.7~pH10.0下的FcRn结合活性。优选是指在pH7.0~pH9.0下的FcRn结合活性,进一步优选是指在pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0中的任一pH下的FcRn结合活性,特别优选是指在接近于生物体内的血浆中的pH的pH7.4下的FcRn结合活性。
由于与FcRn的结合亲和力在pH7.4下非常低,因此在难以准确地测定其亲和力的情况下,可使用pH7.0代替pH7.4。作为用于测定条件的温度,可在10℃~50℃的任意温度下测定与FcRn的结合亲和力。为了确定与FcRn的结合亲和力,优选使用15℃~40℃的温度。没有特别限定,但25℃的温度为优选实施方式之一。
在本发明中,可提供编码本发明的Fc区变体的多核苷酸。多核苷酸主要由DNA、RNA、其他核酸类似物等构成。使编码本发明的Fc区变体的多核苷酸与编码构成抗体的其他区的多核苷酸结合,构建编码抗体的基因,插入至合适的表达载体(根据需要,也可使用2种类的表达载体)。或者,使编码本发明的Fc区变体的多核苷酸与编码细胞因子或可溶性膜受体等蛋白质的多核苷酸结合,构建编码Fc融合蛋白质的基因,插入至合适的表达载体。此时,整合至表达载体中,以在表达控制区例如增强子、启动子的控制下表达。接下来,通过该表达载体将宿主细胞进行转化以表达抗体。此时,可使用合适的宿主与表达载体的组合。
作为可使用的载体,只要为稳定地保持所插入的基因的载体,则对种类没有特别限制,可利用市售的各种载体。作为用于基因克隆的载体,例如可列举M13系载体、pUC系载体等。在以生产本发明所提供的Fc区变体为目的中使用载体的情况下,表达载体是特别有用的。作为表达载体,只要是在试验管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体,则没有特别限制。例如作为用于试验管内表达的载体,例如可列举pBEST载体(Promega公司制)等,作为用于大肠杆菌表达的载体,例如可列举pGEX、pET、pBluescript载体(Stratagene公司制)等,作为用于培养细胞表达的载体,例如可列举pME18S-FL3载体(GenBank Accession No. AB009864)等,作为用于动物细胞表达的载体,可列举pcDNA,作为用于生物个体内表达的载体,例如可列举pME18S载体(Mol Cell Biol. 8: 466-472(1988))等。向载体插入本发明的多核苷酸,例如可使用In-Fusion Advantage PCRCloning 试剂盒(Clontech公司制)来进行。
对可使用的宿主细胞没有特别限制,例如,可适宜地使用大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞例如可作为用于制造或表达本发明的Fc区变体和包含其的抗体或Fc融合蛋白质的产生系统来使用。在产生系统中包含体外和体内的产生系统。作为体外的产生系统,可列举使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的产生系统。
作为可用作宿主细胞的真核细胞,例如可列举动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞,可示例哺乳类细胞、例如CHO (J. Exp. Med. (1995) 108: 94.0)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK (幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等;两栖类细胞、例如非洲爪蛙卵母细胞(Valle 等人, Nature (1981) 291: 338-340);和昆虫细胞、例如Sf9、Sf21、Tn5。优选使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7、HEK293、BHK。在以大量表达为目的的情况下,特别优选为CHO。对于向宿主细胞导入载体,可使用例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子核糖体DOTAP(Boehringer Mannheim制)的方法、电穿孔法、脂质转染法、显微注射法等本领域技术人员周知的手法。另外,还可使用Free Style 293 Expression System (Invitrogen公司制),进行从基因导入到多肽的表达。
可将所得到的Fc区变体或包含其的抗体或Fc融合蛋白质从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离,纯化为实质上纯净且均质的分子。关于Fc区变体或包含其的抗体或Fc融合蛋白的分离、纯化,可使用在通常的多肽的纯化中所使用的分离、纯化方法,没有任何限定。例如,可适当选择、组合柱层析、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析、重结晶等来进行分离、纯化。
根据需要也可使合适的蛋白质修饰酶作用于本发明的Fc区变体或包含其的抗体或Fc融合蛋白质,从而任意地添加修饰或部分地去除肽。作为蛋白质修饰酶,例如使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
包含本发明的Fc区变体的抗体或Fc融合蛋白质增强在酸性条件下的FcRn结合活性,且血浆中滞留性长。因此,本发明提供包含该抗体作为有效成分的以狗或猫为受试者的药物组合物。尽管药物组合物可用于治疗疾病,但是本发明所提供的药物组合物可用于治疗该抗体的抗原被认为是病因之一的疾病。在本发明书中,“治疗”是指得到药理学和/或生理学的效果。效果是指在完全地或部分地干扰疾病的症状方面可为预防性的,在完全地或部分地治疗疾病的症状方面还可为治疗性的。本说明书中的“治疗”是指包括狗或猫、或与它们为近缘动物物种的疾病的所有治疗。
本发明所提供的药物组合物可通过本领域技术人员周知的方法进行制剂化(例如,Remington's Pharmaceutical Science, 最新版, Mark Publishing Company, 伊斯顿, USA)。通常,包含药学上可接受的添加成分,所述添加成分是本领域惯用的并且适合于出于治疗、诊断或预防目的而给予受试者。例如,在被制剂化为固体的情况下,例如可使用乳糖等填充剂、羧甲基纤维素、明胶等粘合剂、着色剂、包衣剂等,这样的制剂适合于口服给药。另外,作为载体或赋形剂,例如也可添加白凡士林、纤维素衍生物、表面活性剂、聚乙二醇、硅酮、橄榄油等,以霜剂、乳液、洗剂等形式作为外用药涂布在患部而使用。另外,在被制剂化为液体的情况下,可包含通常使用的生理学上可接受的溶剂、乳化剂和稳定剂。作为溶剂,可列举水、PBS、等渗性生理盐水等,作为乳化剂,可示例聚氧乙烯系表面活性剂、脂肪酸系表面活性剂、硅酮等,作为稳定剂,可列举狗血清白蛋白、明胶等多元醇,或山梨糖醇、海藻糖等的糖类等。用于口服给药的组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、含漱液或粉末。
对本发明的药物组合物的给药方法没有特别限定,通过注射给药可期待最大的治疗效果。作为注射给药方法,不限定于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、腹腔内给药、胸腔内给药中的任一种方法。
给药量将取决于所使用的抗体的种类(抗原的种类)、或个体大小、给药方法、疾病的种类、症状等来确定,但给予足以显示治疗效果和预防效果的量即可。
本说明书中所引用的全部现有技术文献均作为参考并入到本说明书中。
实施例
接下来,将举出实施例进一步说明本发明,但是本发明不限于此。
实施例1. 具有野生型Fc的IgG表达载体的制作
对于注册于GenBank: AF354265.1的野生型狗IgG H链的Fc区(SEQ ID NO: 1,以下简称为dog wild type Fc、dog wtFc)和注册于GenBank: AB016710.1的野生型猫IgG H链的Fc区(SEQ ID NO: 2,以下简称为cat wild type Fc、cat wtFc),委托GenscriptJapan株式会社基于氨基酸序列进行基因合成。
对于从IgG H链的Fd至铰链为止的区(SEQ ID NO: 3,以下为Fd-铰链)和IgG L链的全区(SEQ ID NO: 4,以下为L链),委托Genscript Japan株式会社基于作为登录于IMGT(参考网址URL http://www.imgt.org/)的IMGT/mAb-DB ID:77的人源化抗人IgE抗体的奥马珠单抗(Omalizumab)的氨基酸序列进行基因合成,以使得作为分泌信号肽在Fd-铰链的N末端侧附加由MDMRVPAQLLGLLLLWLWLSGARC (SEQ ID NO: 5)组成的氨基酸,以使得在L链的N末端侧附加由MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC (SEQ ID NO: 6)组成的氨基酸。
包含所合成的分泌信号肽的奥马珠单抗的Fd-铰链基因通过PCR法进行扩增,将同样通过PCR法进行扩增的dog wtFc基因和cat wtFc基因各自使用In-Fusion HD Cloning试剂盒(Clontech公司制) (以下为In-Fusion试剂盒)进行连接,以使得Fd-铰链成为N末端侧、wtFc成为C末端侧,同时,插入至pcDNA3.1(+) (Invitrogen)的CMV启动子的正下方(直下)后,将大肠杆菌DH5α进行转化,提取质粒,从而得到H链表达用载体pcDNA3.1(+)/奥马珠单抗Fd-dog wtFc和pcDNA3.1(+)/奥马珠单抗Fd-cat wtFc。
包含所合成的分泌信号肽的奥马珠单抗的L链基因通过PCR法进行扩增,使用In-Fusion试剂盒插入至pcDNA3.1(+) (Invitrogen)的CMV启动子的正下方后,将大肠杆菌DH5α进行转化,提取质粒,从而得到L链表达用的载体pcDNA3.1(+)/奥马珠单抗Lch。
在任一情况下,当使用In-Fusion试剂盒时,按照随附说明书中记载的方法,在In-Fusion反应后的DNA溶液中进行大肠杆菌DH5α感受态细胞(TOYOBO)的转化。将所得到的转化体在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃培养过夜,使用NucleoBondXtra Midi试剂盒(Takara Bio株式会社)从中提取质粒。所得到的表达载体的碱基序列通过本领域技术人员周知的方法确定,并确认目标氨基酸序列的蛋白质已被编码。
奥马珠单抗Fd-铰链区的氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 3)
野生型狗IgG H链Fc区的氨基酸序列
APEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK(SEQ ID NO: 1)
野生型猫IgG H链Fc区的氨基酸序列
PPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK(SEQ ID NO: 2)
奥马珠单抗L链的氨基酸序列
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 4)
实施例2. 具有改变型Fc的IgG H链表达载体的制作
设计编码变异氨基酸的引物,以使Fc区的氨基酸序列取代为下述表1“狗、猫Fc改变的位点”中所示的氨基酸。以实施例1中制作的H链表达用载体pcDNA3.1(+)/奥马珠单抗Fd-dog wtFc和pcDNA3.1(+)/奥马珠单抗Fd-cat wtFc为模板,通过使用所设计的引物的PCR法,扩增在Fc区导入有变异的DNA片段,使用In-Fusion试剂盒连接所扩增的DNA片段,从而制作仅在成为模板的Fc的任意处导入有变异的H链表达载体。
在任一情况下,当使用In-Fusion试剂盒时,按照随附说明书中记载的方法,在In-Fusion反应后的DNA溶液中进行大肠杆菌DH5α感受态细胞(TOYOBO)的转化。将所得到的转化体在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃培养过夜,使用NucleoBondXtra Midi试剂盒(Takara Bio株式会社)从中提取质粒。所得到的表达载体的碱基序列通过本领域技术人员周知的方法确定,并确认目标氨基酸序列的蛋白质已被编码。
将下述表1“狗、猫Fc改变的位点”中所示的氨基酸取代导入至dog-wtFc和cat-wtFc的Fc区来制作各种Fc区变体。
[表1]
“狗、猫Fc改变的位点”
实施例3. 抗体表达和纯化
将实施例1和实施例2中得到的表达载体瞬时地导入至FreeStyle293细胞(Invitrogen)中,进行抗体的表达。回收所得到的培养上清后,通过0.22μm的过滤器Millex(R)-GP (Merck Millipore),得到培养上清。从所得到的培养物上清中,通过使用MabSelect SuRe (GE Healthcare)的亲和层析,用50mM乙酸 进行洗脱,加入1.5M Tris-HCl、pH7.5进行中和处理,从而纯化抗体。将所得到的抗体在20mM组氨酸-HCl、150mM NaCl、pH6.5的缓冲液中使用可分级30kDa的超滤膜(Merck Millipore)进行缓冲液置换。对于纯化抗体浓度,使用分光光度计测定在280nm下的吸光度,使用通过PACE等人的方法算出的吸光系数根据所得到的值算出抗体浓度(Protein Science (1995); 4, 2411-2423)。
实施例4. FcRn表达载体的制作
对于注册于GenBank: XP_005616366.1的狗FCGRT的胞外区(SEQ ID NO: 7,以下简称为dog FCGRT)和注册于GenBankXP_023100998.1的猫FCGRT的胞外区(SEQ ID NO: 8,以下简称为cat FCGRT),以分别成为在C末端侧附加有His标签(HHHHHHHH) (SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的方式,委托Genscript Japan株式会社进行基因合成,以及将所合成的基因克隆至pcDNA3.1(+) (Invitrogen)并提取质粒。将所得到的表达载体作为pcDNA3.1(+)/dog FCGRT、pcDNA3.1(+)/cat FCGRT。
委托Genscript Japan株式会社基于注册于GenBank:NP_001271408的狗β2m (SEQID NO: 10,以下简称为dog β2m)和注册于GenBank:NP_001009876的猫β2m (SEQ ID NO:11,以下简称为cat β2m)氨基酸序列进行基因合成,以及将所合成的基因克隆至pcDNA3.1(+) (Invitrogen)并提取质粒。将所得到的表达载体作为pcDNA3.1(+)/dog β2m、pcDNA3.1(+)/cat β2m。
dog FCGRT胞外区的氨基酸序列
MGVPRPRSWGLGFLLFLLPTLRAADSHLSLLYHLTAVSAPPPGTPAFWASGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPYGAWVWENQVSWYWEKETTDLRTKEGLFLEALKALGDGGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPVAKFALNGEDFMTFDPKLGTWNGDWPETETVSKRWMQQAGAVSKERTFLLYSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS(SEQ ID NO: 7)
cat FCGRT胞外区的氨基酸序列
MGVPRPQPWGLGFLLFLLPTLRAAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRNKQELFLEALKVLGEGGPYTLQGLLGCELGPDNASVPVAKFALNGEDFMDFDPKLGTWSGEWPETETISKRWMQEAGAVSKERTFLLNSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS(SEQ ID NO: 8)
dog β2m的氨基酸序列
MAPRPALATAGFLALLLILLAACRLDAVQHPPKIQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPEIEIDLLKNGKEMKAEQTDLSFSKDWTFYLLVHTEFTPNEQDEFSCRVKHVTLSEPQIVKWDRDN(SEQ ID NO: 10)
cat β2m的氨基酸序列
MARFVVLVLLGLLYLSHLDAVQHSPKVQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPQIDITLMKNGKKMEAEQTDLSFNRDWTFYLLVHTEFTPTVEDEYSCQVNHTTLSEPKVVKWDRDM (SEQ ID NO: 11)
实施例5. FcRn蛋白质的表达和纯化
以在实施例4中得到的pcDNA3.1(+)/dog FCGRT与pcDNA3.1(+)/dog β2m的组合、以及pcDNA3.1(+)/cat FCGRT与pcDNA3.1(+)/cat β2m的组合,将表达载体共转染至FreeStyle 293细胞(Invitrogen公司)中,使猫和狗的FcRn蛋白质表达。进行培养、回收所得到的培养上清后,通过0.22μm的过滤器Millex(R)-GP (Merck Millipore),得到培养上清。所得到的培养上清原则上通过以下两步进行纯化。第一步是对His标签进行亲和柱层析(His Trap HP),通过使用20mM Tris、0.5M NaCl、10mM咪唑、pH7.4和20mM Tris、0.5MNaCl、500mM咪唑、pH 7.4的缓冲液的咪唑浓度的梯度洗脱,将作为目标的蛋白质进行分级。第二步是使用凝胶过滤柱层析(Superdex200),置换成D-PBS(-)、pH7.0缓冲液并进行尺寸分级,进行作为目标的蛋白质的纯化。关于纯化蛋白质,使用分光光度计测定在280nm下的吸光度,使用通过PACE等人的方法算出的吸光系数根据所得到的值算出纯化蛋白质的浓度(Protein Science (1995); 4, 2411-2423)。
试验例1:基于Biacore的相互作用测定(结合分析)
评价所获取的抗体对猫和狗的FcRn的结合能
关于所获取的抗体,为了判断是否存在对狗和猫的FcRn结合能,使用BiacoreX100(GE Healthcare)进行评价。作为血浆中条件,设定pH7.4。作为内体内条件(酸性条件),设定pH6.0。在传感芯片蛋白质L (GE Healthcare)上捕获目标抗体,使用狗、猫FcRn作为抗原。使用3种类的运行缓冲液(1;50mmol/L磷酸、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween-20、pH7.4,2;50mmol/L磷酸、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween-20、pH7.0,3;50mmol/L磷酸、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween-20、pH6.0)进行测定。
测定的实施方法
将用运行缓冲液稀释的抗体以5μL/分钟的流速注射1分钟,使其在传感芯片上被捕获。之后,将用运行缓冲液稀释至1600、800、400、200、100nM的FcRn和运行缓冲液(作为参考溶液)以30uL/分钟的流速注射2分钟,使其与所捕获的抗体进行相互作用,此外,使运行缓冲液以30μL/分钟的流速流过10分钟,观察FcRn的解离。最后,将10mmol/L甘氨酸-HCl、pH1.7以30μL/分钟的流速注射2次,每次1分钟,使传感芯片再生。通过再生的操作,洗涤在传感芯片上捕获的抗体,重复使用传感芯片。
由于野生型IgG与FcRn的结合亲和力在pH7.4下非常低,因此难以算出KD值,因此在难以准确地测定亲和力的情况下,使用pH7.0代替pH7.4来实施测定。
分析方法
为了算出对包含各Fc区变体的抗体的FcRn的解离常数KD(mol/L),动力学分析按照以下方法进行实施。首先,在上述传感芯片上捕获目标抗体,与用运行缓冲液稀释的FcRn进行相互作用,对于所得到的传感图,通过Biacore Evaluation Software,将测定结果以1:1的结合模型进行全局拟合(global fitting),从而算出结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s),根据该值算出解离常数KD(mol/L)。
在所得到的传感图是箱形且立即达到平衡状态的情况下,在注射FcRn过程中的平衡值(=结合量)反映了解离常数KD(M),各变体对FcRn的解离常数KD(mol/L)的算出,通过对于作为Biacore的测定结果而得到的传感图使用Biacore Evaluation Software进行稳态亲和力(steady state affinity)分析来算出。
以1:1结合模型进行相互作用的分子在Biacore上的行为可由以下的式1表示。
Req = C × Rmax/(KD + C) + RI (式1)
上述式中的各项目的含义如下。
Req(RU):稳态结合水平(steady state binding levels)
Rmax(RU):分析物的表面结合能(Affinity binding capacity of the surface)
RI(RU):样品中的容量折射率贡献(Bulk refractive index contribution inthe sample)
C(M):分析物浓度(Analyte concentration)
KD(M):平衡解离常数(Equilibrium dissociation constant)
结果如下表所示。
[表2]
狗Fc区变体和狗FcRn的KD(mol/L)值比较
[表3]
猫Fc区变体和猫FcRn的KD(mol/L)值比较
[表4]
pH 6.0下的狗Fc区变体和狗FcRn的KD(mol/L)值比较
[表5]
pH6.0下的猫Fc区变体和猫FcRn的KD(mol/L)值比较
所得到的这些结果不一定与在人中所报道的结果一致。特别是,DFV-7的氨基酸取代在人中显著增强在酸性条件下的与FcRn的结合(Zelevsky, J等人, Nat Technol(2010) 28, 157-159),而在狗中完全观察不到该效果。这强烈表明:在狗或猫的抗体药物的调制中使用狗或猫的FcRn来确认该效果的重要性。
产业利用性
由于本发明的Fc区变体增强在酸性区条件下的FcRn结合活性,因此通过使用该变体,可提供具有更长的血浆中滞留性的抗体(IgG)和Fc融合蛋白质。
本申请以在日本申请的特愿No.2018-228448 (申请日:2018年12月5日)为基础,其内容全部包括在本说明书中。
Claims (21)
1.变体,其为包含狗或猫IgG的Fc区的亲本多肽的变体,在酸性条件下,所述变体与狗或猫新生儿Fc受体(FcRn)结合的活性比亲本多肽与狗或猫FcRn结合的活性高,且在该Fc区包含至少一个氨基酸改变。
2.权利要求1所述的变体,其中,亲本多肽构成抗体。
3.权利要求1或2所述的变体,其中,亲本多肽包含狗IgG的Fc区。
4. 权利要求1或2所述的变体,其中,亲本多肽包含猫 IgG的Fc区。
5.权利要求3所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变包含选自下述的至少一个取代:
(i) 252位亮氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,
(v) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(vi) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,
(vii) 434位天冬酰胺向丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代,
(viii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(ix) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(x) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代,
此处,Fc区中的氨基酸编号基于以人抗体的Fc区为基准的Kabat的EU索引。
6.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(ii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
7.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(iii) 436位酪氨酸向苏氨酸的取代,
(iv) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(v) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
8.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位天冬酰胺向丙氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
9.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位亮氨酸向酪氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,和
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代。
10.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位蛋氨酸向亮氨酸的取代,和
(ii) 434位天冬酰胺向丝氨酸的取代。
11.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,和
(ii) 434位天冬酰胺向酪氨酸的取代。
12.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位亮氨酸向苏氨酸的取代,
(ii) 254位丙氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,和
(v) 434位天冬酰胺向苯丙氨酸的取代。
13.权利要求5所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变包含选自下述的至少一个取代:
(i) 252位丝氨酸向酪氨酸或苏氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 259位缬氨酸向异亮氨酸的取代,
(v) 308位异亮氨酸向脯氨酸或苯丙氨酸的取代,
(vi) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(vii) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,
(viii) 434位丝氨酸向丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的取代,
(ix) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(x) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(xi) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代,
此处,Fc区中的氨基酸编号基于以人抗体的Fc区为基准的Kabat的EU索引。
14.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(ii) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
15.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(iii) 436位组氨酸向苏氨酸的取代,
(iv) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(v) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
16.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代,
(ii) 434位丝氨酸向丙氨酸的取代,
(iii) 438位谷氨酰胺向精氨酸的取代,和
(iv) 440位丝氨酸向谷氨酸的取代。
17.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位丝氨酸向酪氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,和
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代。
18.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 308位异亮氨酸向脯氨酸的取代,和
(ii) 434位丝氨酸向酪氨酸的取代。
19.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 259位缬氨酸向异亮氨酸的取代,
(ii) 308位异亮氨酸向苯丙氨酸的取代,和
(iii) 428位丝氨酸向亮氨酸的取代。
20.权利要求13所述的变体,其中,
Fc区的氨基酸改变为:
(i) 252位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(ii) 254位丝氨酸向苏氨酸的取代,
(iii) 256位苏氨酸向谷氨酸的取代,
(iv) 433位组氨酸向亮氨酸的取代,和
(v) 434位丝氨酸向苯丙氨酸的取代。
21.抗体或Fc融合蛋白质,所述抗体或Fc融合蛋白质包含权利要求1~20中任一项所述的变体。
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