JP6145088B2 - 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照：
本願は、米国特許出願第６１／４８８，７２５号（２０１１年５月２１日付で提出；係属中）の利益を主張し、この出願の全体を参照により本明細書に援用する。
配列表の参照
本願は、米国特許法施行規則１．８２１に従う１又は複数の配列表（以下参照）を含み、これは紙及びコンピューターで読取可能な媒体の両方で開示されており、この紙及びコンピューターで読取可能な開示の全体を参照により本明細書に援用する。
１．技術分野
本発明は、血清タンパク質に結合できる脱免疫化された血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むポリペプチド（例えば、抗原結合分子）に関する。血清結合タンパク質が存在すると、脱免疫化血清結合タンパク質のポリペプチド部分を有さない場合のポリペプチドの血清半減期と比べて、ポリペプチドの血清半減期が延長される。本発明は更に、そのような分子を用いる方法及び使用に関する。
本発明は特に、「二重親和性再標的化試薬（dual affinity retargeting reagent：「ＤＡＲＴ」）」とも呼ばれるダイアボディ分子並びに免疫障害及び癌を含む種々の疾患及び障害の処置におけるその使用に関する。本発明のダイアボディ分子は、会合して同じ又は異なるエピトープを認識し得る少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。更に、エピトープは、同じ分子に由来してもよく、異なる分子に由来してもよく、あるいは同じ細胞上に位置していてもよく、異なる細胞上に位置していてもよい。ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、ペプチド結合ではない共有結合、例えば、限定されるものではないが、各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合、を介して、共有結合により連結され得る。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はＦｃ領域を更に含み、これにより、抗体様の機能性を分子に組み込むことが可能になる。
２．背景技術
共有結合型ダイアボディのデザインは単鎖Ｆｖコンストラクト（ｓｃＦｖ）（Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；その全体を参照により本明細書に援用する）に基づく。インタクトの非改変ＩｇＧでは、ＶＬ及びＶＨドメインは別個のポリペプチド鎖上、すなわちそれぞれ軽鎖及び重鎖上に位置する。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にＶＬ及びＶＨドメインの相互作用により、抗体のエピトープ結合部位の１つが形成される。一方、ｓｃＦｖコンストラクトは、抗体のＶＬ及びＶＨドメインを１つのポリペプチド鎖中に含み、２つのドメインが自己集合して機能的エピトープ結合部位を形成するのに十分な長さの可動性リンカーによりドメインが隔てられている。リンカーの長さが不十分（約１２アミノ酸残基未満）であるために自己集合が不可能な場合、ｓｃＦｖコンストラクトの２つが互いに相互作用して、一方の鎖のＶＬが他方のＶＨに会合した２価分子を形成する（Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658に概括されている）。更に、コンストラクトのｃ末端にシステイン残基を加えると、ポリペプチド鎖のジスルフィド結合が可能になり、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られる二量体が安定化されることが示されている（例えば、Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27参照）。更に、異なる特異性のＶＬ及びＶＨドメインが選択された場合、２価であるだけでなく、二特異性の分子が構築され得る。
２価ダイアボディには治療及び免疫診断を含む幅広い応用例がある。２価であることにより、種々の応用例におけるダイアボディのデザイン及び設計の柔軟性が大きくなり、多量体抗原に対する結合力（アビディティー）の向上、異なる抗原の架橋、及び両方の標的抗原の存在に基づいた特定の細胞型への標的化が可能になる。結合価の増加、低い解離速度、及び循環からの急速なクリアランス（約５０ｋＤａ以下の小サイズのダイアボディ）のため、当該技術分野で知られるダイアボディ分子は腫瘍イメージングの分野における特別な使用も示されている（Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221）。特に重要なのは、異なる細胞の架橋、例えば細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍細胞の架橋である（Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631及びHolliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305）。ダイアボディのエピトープ結合ドメインは、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は他の単核細胞上で発現されるＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４等の任意の免疫エフェクター細胞表面決定基に対するものでもあり得る。多くの研究において、エフェクター細胞決定基、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、へのダイアボディの結合がエフェクター細胞を活性化することも見出されている（Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305；Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916）。通常、エフェクター細胞活性化は、抗原の結合した抗体がＦｃ−ＦｃγＲを介してエフェクター細胞に結合することにより引き起こされる。したがって、この点で、本発明のダイアボディ分子は、Ｆｃドメインを含むかどうかに関わらず、（例えば、当該技術分野で公知であるか本明細書中で例示される任意のエフェクター機能性アッセイにおけるアッセイ（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）でアッセイされるように）Ｉｇ様の機能性を示し得る。腫瘍及びエフェクター細胞を架橋することにより、ダイアボディは、腫瘍細胞の近くにエフェクター細胞を持ってくるだけでなく、効果的な腫瘍の殺作用をもたらす（例えば、その全体を参照により本明細書に援用するCao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197参照）。
２．１ エフェクター細胞受容体及び免疫系におけるそれらの役割
伝統的な免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用により、例えば抗体依存性細胞傷害、マスト細胞脱顆粒、及び食作用等のエフェクター機能からリンパ球増殖及び抗体分泌の制御等の免疫調節シグナルにわたる幅広い反応が生じる。これらの相互作用は全て、造血細胞上の分化した細胞表面受容体に抗体又は免疫複合体のＦｃドメインが結合することにより開始される。抗体及び免疫複合体により引き起こされる細胞反応の多様性はＦｃ受容体の構造的異種性によるものである。Ｆｃ受容体は、細胞内シグナル伝達を仲介すると考えられる構造的に関連する抗原結合ドメインを共有している。
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一員であるＦｃγ受容体は、免疫グロブリン分子のＦｃγ部分に結合できる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Ｆｃγ受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１又は複数のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃγ受容体は、免疫グロブリンサブタイプに対する特異性によって定義される。ＩｇＧに対するＦｃγ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲ、ＩｇＡに対するものはＦｃαＲと呼ばれる。種々のアクセサリー細胞が異なるアイソタイプの抗体に対するＦｃγ受容体を有し、抗体のアイソタイプによって、所与の反応にどのアクセサリー細胞が関与するかが決まる（Ravetch J.V. et al. (1991) "Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92；Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors," Microbes and Infection, 3: 131-139；Billadeau D.D. et al. (2002), "ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation," The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-168l；Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors," Science, 290: 84-89；Ravetch J.V. et al., (2001) "IgG Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors: Rubor Redux," Cell, 78(4): 553-60に概括されている）。種々のＦｃγ受容体、それらを発現する細胞、及びそれらのアイソタイプ特異性を表１に要約する（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから採用）。
Ｆｃγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインＣ２セットに関連する細胞外ドメインである１回膜貫通ドメインと可変長の細胞質内ドメインとを有する内在性膜糖タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と命名された３つのＦｃγＲが知られている。３つの受容体は異なる遺伝子にコードされているが、３つのファミリーメンバー間の広い相同性から、共通の祖先からおそらくは遺伝子重複により生じたことが示唆される。
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）
ＦｃγＲＩＩタンパク質は、単量体Ｉｇに対する親和性が低い（１０６Ｍ−１）ので、複合体化しているＩｇＧにだけ結合する、４０ｋＤａの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は最も広く発現しているＦｃγＲであり、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、及び血小板を含む全ての造血細胞上に存在する。ＦｃγＲＩＩは免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域が２つしかないので、ＩｇＧへの親和性がＦｃγＲＩよりはるかに低い。３つのヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ、ＦｃγＲＩＩ−Ｃ）があり、これらは全て凝集体又は免疫複合体の状態のＩｇＧに結合する。
ＦｃγＲＩＩ−Ａ及びＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質ドメイン内の明確な違いにより、受容体結合に対して機能的に異質な２つの反応が生じる。基本的な違いは、Ａアイソフォームが食作用及び呼吸バースト等の細胞活性化を引き起こす細胞内シグナル伝達を開始させるのに対し、Ｂアイソフォームは抑制性シグナル、例えばＢ細胞活性化の阻害を開始させることである。
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）
このクラス内の異種性のため、マウス及びヒトにおいてＦｃγＲＩＩＩのサイズは４０〜８０ｋＤａにわたる。２つのヒト遺伝子が２つの転写産物、すなわち内在性膜糖タンパク質であるＦｃγＲＩＩＩＡ及びグリコシルホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）結合型であるＦｃγＲＩＩＩＢをコードしている。１つのマウス遺伝子が、膜貫通ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに相同なＦｃγＲＩＩＩをコードしている。ＦｃγＲＩＩＩは他の２つのＦｃγＲのそれぞれと共通する構造的特徴を有する。ＦｃγＲＩＩ同様、ＦｃγＲＩＩＩはＩｇＧに低親和性で結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、マスト細胞中で発現し、ＮＫ細胞中では孤立したＦｃγＲである。ＧＰＩ結合ＦｃγＲＩＩＩＢは現在、ヒト好中球中でのみ発現することが知られている。
ＦｃγＲを介したシグナル伝達
活性化シグナル及び抑制シグナルは両方とも、ライゲーション後にＦｃγＲを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の違いによるものである。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる２つの異なるドメインがこの異なる反応の原因となる。これらの構造体に異なる細胞質酵素が動員されることでＦｃγＲ媒介細胞応答の結果が決まる。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡが含まれるが、ＩＴＩＭ含有複合体に含まれるのはＦｃγＲＩＩＢだけである。
ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異的抗体架橋を介したＦｃγＲＩＩＡクラスター形成は、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと共にＩＴＡＭを凝集させる。ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼのドッキング部位として働き、Ｓｙｋキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）の活性化を引き起こす。細胞活性化により炎症促進性メディエーターが放出される。
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上で発現されており、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、識別できない様式でＩｇＧ複合体と結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在がＦｃγＲのこの抑制サブクラスを規定する。近年、この抑制の分子的基礎が確立された。活性化性（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＦｃγＲとコライゲートするとＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭがリン酸化され、イノシトールポリリン酸５'−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付け、これが、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ介在チロシンキナーゼ活性化の結果放出されたホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ＋＋の流入が妨げられる。したがって、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化反応を低減し、細胞応答性を抑制する。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖、及び抗体分泌が停止される。
３．発明の概要
本発明は特に、共有結合型ダイアボディ及び／又は共有結合型ダイアボディ分子並びに癌、自己免疫障害、アレルギー障害、及び細菌、真菌、又はウイルスによる感染症を含む種々の疾患及び障害の処置におけるその使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは、２つの異なる細胞上の２つの異なるエピトープに結合することができ、第１のエピトープは、ダイアボディが２つの細胞を引き合わせる（bring together）ことができるように第２のエピトープとは異なる細胞型の上で発現されている。
具体的には、本発明は、血清タンパク質に結合できる脱免疫化血清結合タンパク質の部分を含むポリペプチド鎖を含むポリペプチド（特に抗原結合分子）であって、前記血清結合タンパク質部分が、前記脱免疫化血清結合タンパク質の前記部分を有さない場合の前記ポリペプチドの血清半減期との比較において前記ポリペプチドの血清半減期を延ばす、ポリペプチドに関する。
本発明は更に、それに共有結合したポリペプチドの血清半減期を延ばすそのような脱免疫化血清結合タンパク質のポリペプチド部分の使用（又は使用を含む方法）に関し、血清半減期の延長は、アルブミン結合タンパク質を有さない場合の抗原結合分子の血清半減期との比較による。
本発明は更に、ポリペプチド鎖が、更なる脱免疫化血清結合タンパク質の部分を含み、脱免疫化血清結合タンパク質の部分がどちらも血清タンパク質に結合できる、上記ポリペプチド又は使用の実施形態に関する。
本発明は特に、脱免疫化血清結合タンパク質のポリペプチド部分がストレプトコッカスのプロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はそのアルブミン結合変異体であり、特に、ストレプトコッカスのプロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）がストレプトコッカスＧ１４８株のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）である、上記ポリペプチド又は使用の実施形態に関する。
本発明は特に、アルブミン結合ドメインが、
（Ａ）７１位におけるバリンからアラニンへの変異、７４位におけるバリンからアラニンへの変異、又は７９位におけるアスパラギン酸からアラニンへの変異；
（Ｂ）６４位におけるロイシンからアラニンへの変異、６５位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及び７１位におけるバリンからアラニンへの変異；又は
（Ｃ）６６位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、７０位におけるスレオニンからセリンへの置換、及び７１位におけるバリンからアラニンへの変異
を含む、上記ポリペプチド又は使用の実施形態に関する。
本発明は更に、アルブミン結合ドメインが、配列番号３０４、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、又は配列番号３２９の配列を有する、上記ポリペプチド又は使用の実施形態に関する。
本発明は更に、抗原結合分子が抗原結合分子である、上記抗原結合分子又は使用の実施形態に関する。本発明は更に、抗原結合分子が、互いに相互作用して２つの抗原結合部位を形成する少なくとも第１及び第２のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディであり、ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、血清タンパク質に結合できる脱免疫化血清結合タンパク質の部分を含む第２のポリペプチド部分を含む実施形態に関する。本発明は更に、第１及び第２のポリペプチド鎖の両方が、血清タンパク質に結合できる脱免疫化血清結合タンパク質の部分を含む第２のポリペプチド部分を含み且つ／又は第１及び第２のポリペプチド鎖が互いに共有結合している、そのようなダイアボディの実施形態に関する。
本発明は特に、ダイアボディが、
（Ａ）ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；及び
（Ｂ）腫瘍関連抗原
に結合する、上記ダイアボディ又は使用の実施形態に関する。
本発明は特に、抗原が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原である、上記ダイアボディ又は使用の全ての実施形態に関する。
一実施形態では、本発明は、共有結合型二特異性ダイアボディに関し、ダイアボディは第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び場合により、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように、共有結合により連結されており、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び場合により、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
別の実施形態では、本発明は、共有結合型二特異性ダイアボディに関し、ダイアボディは、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
特定の態様では、本発明はダイアボディ分子に関し、その分子は、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
特定の実施形態では、本発明は共有結合型二特異性ダイアボディに関し、ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており；各ダイアボディ分子の第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、各ダイアボディ分子の第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
更に別の実施形態では、本発明は、共有結合型四特異性ダイアボディに関し、ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、ペプチド結合ではない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成し、第２のダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ４）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ３）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており；第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第３のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成し、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第４のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
本発明の特定の態様では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、並びに適用可能な場合第３のエピトープ及び第４のエピトープは同じであり得る。別の態様では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、並びに適用可能な場合第３のエピトープ及び第４のエピトープは互いに異なり得る。第３のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープ及び第３のエピトープは同じであり得る。第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープ及び第４のエピトープは同じであり得る。第３のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープ及び第３のエピトープは同じであり得る。第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープ及び第４のエピトープは同じであり得る。本発明の好ましい態様では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる。第３のエピトープ結合ドメイン及び第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明の更に別の態様では、第３のエピトープ及び第４のエピトープは異なり得る。上記の全ての組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
本発明の特定の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第１のドメイン及び第５のドメインは同じ免疫グロブリンに由来し得る。別の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第２のドメイン及び第４のドメインは同じ免疫グロブリンに由来し得る。更に別の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第１のドメイン及び第５のドメインは異なる免疫グロブリンに由来し得る。更に別の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第２のドメイン及び第４のドメインは異なる免疫グロブリンに由来し得る。上記の全ての組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
本発明の特定の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖との間の共有結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基との間のジスルフィド結合を介し得る。ジスルフィド結合に関与する第１又は第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のドメイン内を含むポリペプチド鎖上の任意の位置に見出され得る。具体的な実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１のドメイン中にあり、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５のドメイン中にある。第１、第２、第４、及び第５のドメインが結合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基はそれぞれ第３及び第６のドメイン内に位置する。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、アミノ酸配列（配列番号１７）によってコードされ得る。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、アミノ酸配列（配列番号１７）によってコードされ得る。この実施形態の更に別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によってコードされ得る、ヒトＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によってコードされ得る、ヒトＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の更に別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態の更に別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第６のドメインはＦｃドメイン又はその一部を含む。この実施形態の更に別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはＦｃドメイン又はその一部を含む。
別の実施形態では、ジスルフィド結合に関与する第１又は第２のポリペプチド上のシステイン残基は、第１のポリペプチド鎖上の第１、第２、又は第３のドメインの外側及び第２のポリペプチド鎖上の第４、第５、及び第６のドメインの外側に位置してもよい。特に、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１のドメインのＮ末端側にあってもよく、第１のドメインのＣ末端側にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第２のドメインのＮ末端側にあってもよく、第２のドメインのＣ末端側にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第３のドメインのＮ末端側にあってもよく、第３のドメインのＣ末端側にあってもよい。更に、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第４のドメインのＮ末端側にあってもよく、第４のドメインのＣ末端側にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５のドメインのＮ末端側にあってもよく、第５のドメインのＣ末端側にあってもよい。したがって、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第６のドメインのＣ末端側にあってもよく、第６のドメインのＮ末端側にあってもよい。具体的な態様では、ジスルフィド結合は第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基との間であり得る。第３のドメイン及び第６のドメインがＦｃドメイン又はその一部を含まない具体的な態様では、システイン残基は第１のポリペプチド鎖のＣ末端及び第２のポリペプチド鎖のＣ末端にある。上記の全ての組合せが本発明に包含されると理解されるべきである。
前述の本発明の具体的な実施形態では、本発明の共有結合型ダイアボディは、各ダイアボディ分子が第１及び第２のポリペプチド鎖を含むダイアボディ分子の二量体を包含する。この実施形態の特定の態様では、ダイアボディ分子は、ペプチド結合ではない共有結合により連結されて二量体を形成し得る。この実施形態の好ましい態様では、共有結合は、二量体のダイアボディ分子それぞれの第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基間のジスルフィド結合である。本発明の更により好ましい態様では、共有結合は、二量体を形成しているダイアボディ分子それぞれの第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基間のジスルフィド結合であり、前記少なくとも１つのシステイン残基は各第１のポリペプチド鎖の第３のドメイン中に位置している。
本発明の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖上の第１のドメインは第２のドメインのＮ末端側であってもよく、第２のドメインのＣ末端側であってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第１のドメインは第３のドメインのＮ末端側であってもよく、第３のドメインのＣ末端側であってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第２のドメインは第１のドメインのＮ末端側であってもよく、第１のドメインのＣ末端側であってもよい。更に、第１のポリペプチド鎖上の第２のドメインは第３のドメインのＮ末端側であってもよく、第３のドメインのＣ末端側であってもよい。したがって、第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインは第１のドメインのＮ末端側であってもよく、第１のドメインのＣ末端側であってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインは第２のドメインのＮ末端側であってもよく、第２のドメインのＣ末端側であってもよい。第２のポリペプチド鎖に関して、第４のドメインは第５のドメインのＮ末端であってもよく、第５のドメインのＣ末端側であってもよい。第４のドメインは第６のドメインのＮ末端側であってもよく、第６のドメインのＣ末端側であってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５のドメインは第４のドメインのＮ末端側であってもよく、第４のドメインのＣ末端側であってよい。第２のポリペプチド鎖上の第５のドメインは第６のドメインのＮ末端側であってもよく、第６のドメインのＣ末端側であってもよい。したがって、第２のポリペプチド鎖上の第６のドメインは第４のドメインのＮ末端側であってもよく、第４のドメインのＣ末端側であってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第６のドメインは第５のドメインのＮ末端側であってもよく、第５のドメインのＣ末端側であってもよい。上記の全ての組合せが本発明に包含されると理解されるべきである。
特定の実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインのＣ末端側に位置してもよく、第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインのＮ末端側に位置してもよい。第２のポリペプチド鎖に関して、第４のドメイン及び第５のドメインは第６のドメインのＣ末端側に位置してもよく、第６のドメインのＮ末端側に位置してもよい。この実施形態の特定の態様では、本発明は、共有結合型二特異性ダイアボディに関し、ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第３のドメインは第１のドメイン及び第２のドメイン両方のＮ末端側に位置し、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖はペプチド結合ではない共有結合により連結されており、各ダイアボディ分子の第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し、各ダイアボディ分子の第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
更に別の実施形態では、本発明は、共有結合型四特異性ダイアボディに関し、ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第３のドメインは第１のドメイン及び第２のドメイン両方のＮ末端側に位置し、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、ペプチド結合でない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第１のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第２のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、第２のダイアボディ分子は第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ４）を含む第２のドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｆｃドメイン又はその一部を含む第３のドメインを含み、第１及び第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第３のドメインは、第１のドメイン及び第２のドメイン両方のＮ末端側に位置し、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ３）を含む第５のドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４及び第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインとが会合してエピトープ結合部位を形成しないように共有結合により連結されており、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、ペプチド結合でない共有結合により連結されており、第１のドメイン及び第５のドメインは、会合して、第３のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成しており、第２のドメイン及び第４のドメインは、会合して、第４のエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
前述の通り、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合により連結されている。具体的な態様では、第１及び第２のドメイン、第１及び第３のドメイン、第２及び第３のドメイン、第４及び第５のドメイン、第４及び第６のドメイン、並びに／又は第５及び第６のドメインの間の共有結合はペプチド結合であり得る。特に、第１及び第２のドメイン並びに第４及び第５のドメインは、第１及び第２並びに第４及び第５のドメインが会合して結合部位を形成しなければ、それぞれ第３のドメイン及び第６のドメインによって又は付加的アミノ酸残基によって隔てられていてよい。アミノ酸残基の数は０、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸残基であり得る。好ましい一態様では、ドメイン間のアミノ酸残基の数は８である。
本発明の特定の態様では、Ｆｃドメインを含む第１及び第２のポリペプチド鎖のドメイン、すなわち、場合によって採用されるそれぞれ第３及び第６のドメインは、ドメインがヒンジ−Ｆｃ領域を含むようにヒンジドメインを更に含んでよい。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインを更に含まずに、ヒンジドメインを含み得る。本発明において使用するための重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Ｆｃドメイン、及び／又はヒンジ−Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭを含む任意の種類の免疫グロブリンに由来し得る。好ましい態様では、免疫グロブリンの種類はＩｇＧ又はそのあらゆるサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。別の態様では、軽鎖及び重鎖が由来する免疫グロブリンはヒト化又はキメラ化されている。
更に、ダイアボディ又はダイアボディ分子が結合する第１のエピトープ及び第２のエピトープ、並びに、適用可能な場合、第３のエピトープ及び第４のエピトープは、同じ抗原に由来する異なるエピトープであってもよく、異なる抗原に由来する異なる抗原であってもよい。抗原は、抗体が作製可能な全ての分子であり得る（例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物等）。具体的な態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は樹状細胞等の特定の細胞上の抗原に特異的である。
本実施形態の特定の態様では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位はＦｃ受容体に特異的であり、このＦｃ受容体は活性化性Ｆｃ受容体又は抑制性Ｆｃ受容体であり得る。具体的な態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であり、Ｆｃγ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、又はＦｃγＲＩＩＩ受容体である。より好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）受容体であり、より好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体である。別の好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体であり、より好ましくはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である。具体的な好ましい態様では、ダイアボディの１つの結合部位はＣＤ３２Ｂに特異的であり、他方の結合部位はＣＤ１６Ａに特異的である。本発明の具体的な実施形態では、ダイアボディ又はダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位は活性化性Ｆｃ受容体に特異的であり、少なくとも１つの他の部位は抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。この実施形態の特定の態様では、活性化性Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ａであり、抑制性Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。この実施形態の別の態様では、活性化性Ｆｃ受容体はＢＣＲであり、抑制性Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。この実施形態の更に別の態様では、活性化性Ｆｃ受容体はＩｇＥＲＩであり、抑制性Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。
１つのエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である場合、ＶＬ及びＶＨドメインは、マウス抗体３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインと同じ又は類似であり得、その配列はクローニングされており、本明細書中に記載されている。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ａに特異的な別の場合には、ＶＬ及びＶＨドメインは、マウス抗体ＩＶ．３のＶＬ及びＶＨドメインと同じ又は類似であり得る。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的な更に別の場合には、ＶＬ及びＶＨドメインは、マウス抗体２Ｂ６のＶＬ及びＶＨドメインと同じ又は類似であり得、その配列はクローニングされており、本明細書中に記載されている。３Ｇ８、２Ｂ６、及びＩＶ．３抗体のＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを任意の組合せで使用することができると理解されるべきである。本発明は更に、第１のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、第２のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、二特異性ダイアボディ又はダイアボディ分子に関する。
別の態様では、エピトープ結合部位は病原性抗原に特異的であり得る。本発明において、病原性抗原とは、癌、感染、及び自己免疫疾患を含む特異的病原性疾患に関わる抗原である。したがって、病原性抗原は、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、又は自己免疫抗原であり得る。病原性抗原の例としては、限定されるものではないが、リポ多糖、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ウエストナイルウイルス（例えば、Ｅ１６及び／又はＥ５３抗原）、及び肝炎ウイルスのウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス抗原、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、並びにコラーゲンが含まれる。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい態様では、１つのエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａ又はＣＤ３２Ａに特異的な場合、他方のエピトープ結合部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。更に別の好ましい態様では、１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的な場合、他方のエピトープ結合部位は任意の病原性抗原に特異的である。具体的な実施形態では、本発明のダイアボディ分子は同じ細胞上の２つの異なる抗原に結合し、例えば１つの抗原結合部位は活性化性Ｆｃ受容体に特異的であり、他方は抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。別の実施形態では、ダイアボディ分子は２つの異なるウイルス中和エピトープ、例えば、限定されるものではないがウエストナイルウイルスのＥ１６及びＥ５３に結合する。
本発明の更に別の実施形態では、本発明のダイアボディは種々の疾患及び障害を処置するために用いられ得る。したがって、本発明は、少なくとも１つの結合部位が病原性抗原、例えば癌細胞の表面又は細菌若しくはビリオンの表面に発現された抗原に特異的であり、少なくとも１つの別の結合部位がＦｃ受容体、例えばＣＤ１６Ａに特異的である、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディ又はダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、少なくとも１つの別の結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、有効量の本発明のダイアボディ又はダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、少なくとも１つの別の結合部位が前記病原性抗原に特異的である、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディ又は共有結合型ダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、病原性抗原に対する免疫寛容を誘導する方法に関する。この実施形態の態様では、病原性抗原はアレルゲン又は免疫寛容が望まれる別の分子、例えば移植組織上で発現されているタンパク質であり得る。
更に別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの結合部位が細胞表面マーカーに特異的であり、少なくとも１つの別の結合部位が毒素に特異的である、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディ又はダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、解毒方法に関する。具体的な態様では、投与される本発明のダイアボディは、１つの結合部位がＦｃ等の細胞表面マーカーに特異的であり、別の結合部位が細菌毒素又は薬物に特異的であるものである。一態様では、細胞表面マーカーは赤血球上に見られないものである。
本発明は更に、抗体の抗原結合ドメインを含む分子の半減期を延長する方法を提供し、方法は、２個以上のアルブミン結合ドメインを分子に連結（例えば、直接又はコンジュゲーションを介して間接的に、又は結合等により）することを含む。本発明は特に、２つ以上のアルブミン結合ドメインの連結が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のアルブミン結合ドメインを分子に連結することを含む、上記方法の実施形態に関し、より具体的には、２個以上のアルブミン結合ドメインの連結が、２個のアルブミン結合ドメインを分子に連結することを含む、上記方法の実施形態に関する。そのような２個以上のアルブミン結合ドメインは同じであっても異なっていてもよく、好ましくは、配列番号３０４、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、又は配列番号３２９の配列からなる群から独立して選択される。本発明は特に、２個以上のアルブミン結合ドメインが同じである又はアルブミン結合ドメインの２個が同じである、上記方法の実施形態に関する。本発明は特に、抗体の抗原結合ドメインを含む分子がダイアボディである、上記方法の実施形態に関する。
３．１ 定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される当該技術分野の全ての用語、表記法、及びその他の科学的用語又は用語法は本発明が関する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。一部、一般的に理解されている意味の用語を明瞭性のため及び／又は参照し易いように本明細書中で定義するが、明細書中におけるこのような定義の記載は、必ずしも当該技術分野で通常理解されている定義との実質的違いを示すものと解釈されるべきではない。本発明の実施においては、特に断りのない限り、当該技術分野の技術に含まれる分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は文献、例えばCurrent Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, 2001年までの補遺を含む)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, ２００１年までの補遺を含む)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)；Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996)；Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999；及びBeauage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000)に十分に説明されている。
本発明において、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、ジスルフィド連結二特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体等）、及び上記のいずれかのエピトープ結合性断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであり得る。
本発明において、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」等の用語は、抗原（例えばエピトープ又は免疫複合体）に特異的に結合し且つ別の分子には特異的に結合しない分子を指す。抗原に特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当該技術分野で公知の他のアッセイにより測定される低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドに結合し得る。好ましくは、抗原に特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しない。抗原に特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当業者に公知の他の技術により同定することができる。
本発明において、「免疫複合体」とは、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドとが互いに結合してより大きな分子量の複合体を形成する時に形成される構造体を指す。免疫複合体の例としては、可溶性又は粒子性（例えば細胞表面上の抗原／抗体複合体）のいずれかであり得る抗原抗体複合体が挙げられる。
本発明において、「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」等の用語は免疫学における通常の意味を有し、天然の免疫グロブリン中のドメイン及び合成（例えば組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体等）の対応するドメインを指す。天然免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本的な構造単位は、通常約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現されている、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有する４量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定し、軽鎖は１つの定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する。したがって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃ（式中、Ｈはヒンジ領域である）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）と、一般的に構造を維持し且つＣＤＲループの配置を決定する、フレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントとからなる（但し、特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。したがって、ＶＬ及びＶＨドメインは、ｎ−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４−ｃの構造を有する。
結合性のタンパク質又は抗体（本明細書中で広く定義される）を参照する場合、各ドメインへのアミノ酸の割当はKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)の定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸は鎖内のアミノ酸の位置により指定される。Ｋａｂａｔは、抗体の多くのアミノ酸配列を記載し、各サブグループの多くのアミノ酸コンセンサス配列を特定し、各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Ｋａｂａｔのナンバリングスキームは、問題の抗体を保存アミノ酸を参照してＫａｂａｔのコンセンサス配列の１つと整列させることにより、彼の概論には含まれていない抗体にも応用可能である。残基番号を割り当てるためのこの方法はこの分野の標準となっており、キメラ又はヒト化変異体を含む種々の抗体の同等な位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸はマウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等な位置を占める。
本発明において、「重鎖」という用語はＩｇＧ抗体の重鎖を定義するために使用される。インタクトな天然ＩｇＧでは、重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。本明細書を通して、ＩｇＧ重鎖の残基のナンバリングは、参照により明示的に本明細書に援用するKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)におけるようなＥＵインデックスによるものである。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体のナンバリングを指す。ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列の例を添付の図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂは更に、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の重鎖のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列を記載している。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アイソタイプのアミノ酸配列とＩｇＧ１配列とを、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成するそれぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより整列させている。ＩｇＧ２及びＩｇＧ３ヒンジ領域については、全ての残基がＥＵインデックスによりナンバリングされるわけではない。
「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は通常、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０にまたがるものとして定義される。ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列の例が図１Ａに示されている（図１Ａ中のアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従ってナンバリングされている）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域を、図１Ａに示すように、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる。
本発明において、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」等の用語はＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。ヒトＩｇＧ１を含むアミノ酸配列の例が図１Ｂに示されている。Ｋａｂａｔシステムによりナンバリングで、境界がわずかに異なり得るが、Ｆｃドメインはアミノ酸２３１〜アミノ酸４４７にわたる（図１Ｂのアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従ってナンバリングされている）。図１ＢにはＩｇＧアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の例も記載されている。
ＩｇＧのＦｃ領域は２つの定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでアミノ酸２３１からアミノ酸３４１に延びる（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでアミノ酸３４２〜４４７に延びる（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインともいう）は、もう１つのドメインと接近して対にならない点で独特であり、インタクトな天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメインの間に２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖が挿入されている。
本発明において、「ＦｃγＲ結合タンパク質」、「ＦｃγＲ抗体」、及び「抗ＦｃγＲ抗体」という用語は交換可能に使用されており、種々の免疫グロブリン様タンパク質又は免疫グロブリン由来タンパク質を指す。「ＦｃγＲ結合タンパク質」は、（Ｆｃγ介在結合とは異なる）ＶＬ及び／又はＶＨドメインとの相互作用を介してＦｃγＲに結合する。ＦｃγＲ結合タンパク質の例としては、完全ヒト、ポリクローナル、キメラ、及びヒト化抗体（例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む）、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ断片）、二機能性又は多機能性抗体（例えば、Lanzavecchia et al. (1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 17:105-111参照）、単鎖抗体（例えば、Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-26参照）、融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質）、「ミニボディ」（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号参照）、並びにＶＬ及び／又はＶＨドメイン又はその断片を含むその他の抗原結合タンパク質が含まれる。一態様では、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質は「４量体抗体」であり、すなわち全体として天然ＩｇＧの構造を有し且つ可変ドメイン及び定常ドメイン、すなわちＶＬドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む２つの軽鎖並びにＶＨドメイン、重鎖ヒンジ、及び定常ドメインを含む２つの重鎖を含む。
本発明において、「ＦｃγＲアンタゴニスト」等の用語は、ＦｃγＲの少なくとも１つの生物学的活性に拮抗する、例えばシグナル伝達を阻害する、小分子を包含するタンパク質及び非タンパク質性物質を指す。例えば、本発明の分子はＦｃγＲへのＩｇＧの結合をブロックすることによりシグナル伝達をブロックする。
本発明において、ポリペプチド又はタンパク質に関連して用いられる「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加の導入により変更されたアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。本発明において、「誘導体」という用語は、改変された、すなわちポリペプチド又はタンパク質分子への任意の種類の分子の共有結合により改変された、ポリペプチド又はタンパク質も指す。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞抗原又は他のタンパク質への連結等により改変され得る。誘導体ポリペプチド又はタンパク質は、当業者に公知の技術、例えば、限定されるものではないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を用いて、化学修飾により生成し得る。更に、誘導体ポリペプチド又はタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチド又はタンパク質と同様な又は同一の機能を有する。
本発明において、非タンパク質性誘導体の文脈における「誘導体」という用語は、第１の有機又は無機分子の構造に基づいて形成される第２の有機又は無機分子を指す。有機分子の誘導体としては、限定されるものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシル、又はアミン基の付加又は欠失により改変された分子が含まれる。有機分子は更に、エステル化、アルキル化、及び／又はリン酸化され得る。
本発明において、「ダイアボディ分子」という用語は、各々が少なくとも１つのＶＬ及び１つのＶＨドメイン又はその断片を含み、１個のポリペプチド鎖内に両方のドメインが含まれる、２以上のポリペプチド鎖又はタンパク質の複合体を指す。特定の実施形態では、「ダイアボディ分子」は、Ｆｃ又はヒンジ−Ｆｃドメインを含む分子を含む。複合体中の前記ポリペプチド鎖は同じであっても異なっていてもよく、すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体であってもよく、ヘテロ多量体であってもよい。具体的な態様では、「ダイアボディ分子」は二量体又は４量体を含み、あるいはＶＬ及びＶＨドメインの両方を含む前記ポリペプチド鎖を含む。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合により多量体の少なくとも１つの他のペプチドに共有結合していてよい。
本発明において、「障害」及び「疾患」という用語は交換可能に使用され、対象における状態を指す。特に、「自己免疫疾患」という用語は、「自己免疫障害」という用語と交換可能に使用され、自身の細胞、組織、及び／又は器官に対する対象の免疫学的反応により生じる細胞、組織、及び／又は器官の傷害を特徴とする対象の状態を指す。「炎症性疾患」という用語は、「炎症性障害」という用語と交換可能に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする対象における状態を指す。自己免疫障害は炎症を伴うこともあり、伴わないこともある。更に、炎症は、自己免疫障害により生じることもあり、そうでないこともある。したがって、特定の障害は自己免疫障害及び炎症性障害の両方を特徴とし得る。
本発明において、「同一のポリペプチド鎖」とは、例えば、２つのポリペプチド鎖の活性が有意に異ならないような１又は複数のアミノ酸の差（好ましくは保存的アミノ酸置換）を有する鎖等、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖も指す。
本発明において、「癌」という用語は、細胞の制御されない異常な成長により生じる新生物又は腫瘍を指す。本発明において、癌は明白に白血病及びリンパ腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は、局在したままの良性腫瘍を指す。別の実施形態では、癌は、隣接する身体構造に浸潤してこれを破壊し、遠くの部位に広がる、悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、癌は特異的な癌抗原に関連する。
本発明において、「免疫調節剤」という用語及びそのバリエーションは、宿主の免疫系を調節する薬剤を指す。特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。別の特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣薬剤（mimetic agent）、及び有機分子が含まれる。
本発明において、「エピトープ」という用語は、動物において、好ましくは哺乳動物において、最も好ましくはヒトにおいて抗原性又は免疫原性の活性を有する、ポリペプチド若しくはタンパク質の断片又は非タンパク質性分子を指す。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発するポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原活性を有するエピトープは、イムノアッセイ等の当業者に周知の任意の方法による決定で免疫特異的に抗体が結合するポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性でなくともよい。
本発明において、「断片」という用語は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも連続８０アミノ酸残基、少なくとも連続９０アミノ酸残基、少なくとも連続１００アミノ酸残基、少なくとも連続１２５アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも連続１７５アミノ酸残基、少なくとも連続２００アミノ酸残基、又は少なくとも連続２５０アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。具体的な実施形態では、ポリペプチドの断片はポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持している。
本発明において、「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組合せ又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、並びにＤＮＡ又はＲＮＡ分子のアナログを含む。そのようなアナログは、ヌクレオチドアナログ、例えば、限定されるものではないがイノシン又はトリチル化塩基等、を用いて作製することができる。そのようなアナログは更に、例えばヌクレアーゼ耐性又は細胞膜を通過する能力の向上等の有益な特質を分子に付与する改変骨格を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含み得る。核酸又はヌクレオチド配列は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本発明において、「治療有効量」とは、疾患又は障害を処置又は管理するのに十分な治療剤の量を指す。治療有効量は、疾患の開始を遅らせる又は最小限に抑える、例えば癌の拡散を遅らせる又は最小限に抑えるのに十分な治療剤の量を指し得る。治療有効量は更に、疾患の処置又は管理において治療効果をもたらす治療剤の量を指し得る。更に、本発明の治療剤に関する治療有効量は、疾患の処置又は管理において治療効果をもたらす、単独又は他の治療との組合せにおける治療剤の量を意味する。
本発明において、「予防薬」という用語は、障害の防止又は障害の再発若しくは拡散の防止に用いることができるあらゆる薬剤を指す。予防有効量とは、患者における、例えば、限定されるものではないが、過剰増殖性疾患に罹り易い患者、例えば遺伝的に癌に罹り易い患者又は以前に発癌性物質に暴露した患者における、過剰増殖性疾患、特に癌の発生又はそのような疾患の再発若しくは拡散を防止するのに十分な予防薬の量を指し得る。また、予防有効量は、疾患の防止において予防効果をもたらす予防薬の量を指し得る。更に、疾患の防止において予防効果をもたらす本発明の予防薬に関連する予防有効量は、単独又は他の薬剤と組み合せた予防薬の量を意味する。
本発明において、「防止する」及び「防止」という用語は、予防薬又は治療剤の投与による、対象における障害の１又は複数の症状の再発又は発症の防止を指す。
本発明において、「組み合せて」という用語は、２つ以上の予防及び／又は治療剤の使用を指す。「組み合せて」という用語の使用は、障害を有する対象に予防及び／又は治療剤が投与される順番を限定しない。第１の予防又は治療剤は、障害を有する対象への第２の予防又は治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、投与と同時、又は投与の後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与され得る。
本発明において、「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又は抗原との相互作用により生じる生化学的イベントを意味する。エフェクター機能としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が含まれる。エフェクター機能には、抗原結合後に作用するもの及び抗原結合とは独立して作用するものの両方が含まれる。
本発明において、「エフェクター細胞」とは、１又は複数のＦｃ受容体を発現し、１又は複数のエフェクター機能を仲介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞は、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含み、任意の生物、例えば、限定されるものではないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルに由来し得る。
本発明において、「免疫複合体に特異的に結合する」等の用語は、免疫複合体に特異的に結合し、別の分子に特異的に結合しない分子を指す。免疫複合体に特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当該技術分野で公知の他のアッセイにより決定される、より低い親和性で、他のペプチド又はポリペプチドに結合し得る。好ましくは、免疫複合体に特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しない。免疫複合体に特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当業者に公知のその他の技術により同定することができる。
本発明において、「安定融合タンパク質」とは、当業者に公知の一般的な生化学的及び機能的アッセイを用いた評価で生成及び／又は保存中の分解が最小から検出不可能なレベルであり、生物学的活性、例えばＦｃγＲへの結合を失わずに長期間保存できる融合タンパク質を指す。
ヒトＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ、及びＦｃ領域のアミノ酸配列を示す図である。 ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のヒンジ（Ａ）及びＦｃ（Ｂ）ドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号１）；ＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号２）；ＩｇＧ３ヒンジドメイン（配列番号３）；ＩｇＧ４ヒンジドメイン（配列番号４）；ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号５）；ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号６）；ＩｇＧ３ Ｆｃドメイン（配列番号７）；ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン（配列番号８））。図１Ａ及び１Ｂに示されているアミノ酸残基はＫａｂａｔ ＥＵのナンバリングシステムに従ってナンバリングされている。アイソタイプ配列を、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成するそれぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによりＩｇＧ１配列と整列させている。図１Ｂでは、ＣＨ２ドメイン中の残基が＋で示され、ＣＨ３ドメイン中の残基が〜で示されている。 共有結合型二機能性ダイボディのポリペプチド鎖の模式図を示す図である。 共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチドは、短いペプチドリンカーで隔てられた抗体ＶＬ及び抗体ＶＨドメインからなる。８アミノ酸残基のリンカーにより、単一ポリペプチド鎖が自己集合してｓｃＦｖコンストラクトになるのが防がれ、その代わりに、異なるポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインの間の相互作用が優勢になる。４つのコンストラクトを作製した（各コンストラクトは、コンストラクトの左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと示されている）。コンストラクト（１）（配列番号９）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、コンストラクト（２）（配列番号１１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、コンストラクト（３）（配列番号１２）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、コンストラクト（４）（配列番号１３）はｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含む。 アフィニティー精製ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 還元条件下（レーン１〜３）及び非還元条件下（レーン４〜６）でアフィニティー精製ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。標準のおおよその分子量が示されている（レーン３と４の間）。レーン１及び４、ｈ３Ｇ８ ＣＭＤ；レーン２及び５、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ；レーン３及び６、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ。 アフィニティー精製ダイアボディのＳＥＣ分析を示す図である。 アフィニティー精製ダイアボディのＳＥＣ分析を行った。（Ａ）既知標準の溶出プロファイル：全長ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）、ＩｇＧのＦａｂ断片（約５０ｋＤａ）、及びｓｃＦｖ（約３０ｋＤａ）；（Ｂ）ｈ２ｂ６ ＣＭＤ、ｈ３Ｇ８ ＣＭＤ、及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの溶出プロファイル。 ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの結合を示す図である。 ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａを二次プローブとした。ＣＤ１６Ａに結合するｈ３Ｇ８ ＣＭＤを対照として用いた。 ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ、及びｓＣＤ３２Ａへのダイアボディ結合のＢＩＡＣＯＲＥ分析を示す図である。 ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ、及びｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）へのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ、及びｈ３Ｇ８ ＣＭＤの結合をＳＰＲ分析によりアッセイした。ｈ３Ｇ８ ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６への結合；（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂへの結合、（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａへの結合。受容体表面上にダイアボディを濃度１００ｎＭ、ｓｃＦｖを濃度２００ｎＭで、流速５０ｍｌ／ｍｉｎにて６０秒注入した。 ｓＣＤ１６Ａ及びｓＣＤ３２Ｂへのダイアボディ結合のＢＩＡＣＯＲＥ分析を示す図である。 ｓＣＤ１６Ａ及びｓＣＤ３２Ｂへのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ、及びｈ３Ｇ８ ＣＭＤの結合をＳＰＲ分析によりアッセイした。ｈ３Ｇ８ ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６Ａへのｈ３Ｇ８ ＣＭＤの結合；（Ｂ）ｓＣＤ１６Ａへのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの結合；（Ｃ）ｓＣＤ１６Ａへのｈ３Ｇ８ ｓｃＦｖの結合；（Ｄ）ｓＣＤ３２Ｂへのｈ２Ｂ６ ＣＭＤの結合；（Ｅ）ｓＣＤ３２Ｂへのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの結合。ダイアボディは受容体表面上に濃度６．２５〜２００ｎＭ、流速７０ｍｌ／ｍｉｎで１８０秒注入した。 ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖が相互作用して共有結合型二特異性ダイアボディ分子を形成している様子を模式的に示す図である。 ＮＨ２及びＣＯＯＨはそれぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは各ポリペプチド鎖上のＣ末端システイン残基を表す。ＶＬ及びＶＨはそれぞれ可変軽ドメイン及び可変重ドメインを表す。点線及び破線は、２つのポリペプチド鎖間を区別するものであり、特に前記鎖のリンカー部分を表す。ｈ２Ｂ６ Ｆｖ及びｈ３Ｇ８ ＦｖはそれぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を表す。 共有結合型二特異性ダイボディのＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。 本発明のダイアボディ分子のポリペプチドコンストラクトを示す（各コンストラクトはコンストラクトの左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと示されている）。コンストラクト（５）（配列番号１４）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−ヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み、コンストラクト（６）（配列番号１５）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−ヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み、コンストラクト（７）（配列番号１６）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端配列（ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ）（配列番号１７）−ｃを含み、コンストラクト（８）（配列番号１８）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−及びヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン（アミノ酸置換Ａ２１５Ｖを有する）−ｃを含む。 Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。 Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。アッセイしたダイアボディは３つの組換え発現系、すなわち、コンストラクト１及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９及びｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション；コンストラクト２及び５をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６７及びｐＭＧＸ６７６のコトランスフェクション；並びにコンストラクト６及び５をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７４及びｐＭＧＸ６７６のコトランスフェクションにより生成した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブとしてＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａを用いた。 それぞれがＦｃドメインを含む２つのポリペプチド鎖が相互作用して２価共有結合型ダイアボディを形成している様子を模式的に示す図である。 ＮＨ２及びＣＯＯＨはそれぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは各ポリペプチド鎖の第２のリンカー配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬ及びＶＨはそれぞれ可変軽ドメイン及び可変重ドメインを表す。点線及び破線は２つのポリペプチド鎖の間を区別するものであり、特に前記鎖の第１リンカー部分を表す。ＣＨ２及びＣＨ３はＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを表す。ｈ２Ｂ６ Ｆｖ及びｈ３Ｇ８ ＦｖはそれぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を表す。 ヒンジ／Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。 ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６ＡへのＦｃドメインを含むダイアボディ分子の結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。アッセイしたダイアボディは４つの組換え発現系、すなわち、コンストラクト１及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション；コンストラクト１及び８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクション；コンストラクト７及び６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション；並びにコンストラクト７及び８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクションにより生成した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブとしてＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａを用いた。 ポリペプチド鎖が相互作用して４量体ダイアボディ分子を形成している様子を模式的に示す図である。 ＮＨ２及びＣＯＯＨはそれぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。Ｓは、Ｆｃを有する「重い（heavier）」ポリペプチド鎖の第２のリンカー配列中のシステイン残基とＦｃを有さない「軽い（lighter）」ポリペプチド鎖のＣ末端配列中のシステイン残基との間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬ及びＶＨはそれぞれ可変軽ドメイン及び可変重ドメインを表す。点線及び破線はポリペプチド鎖間を区別するものであり、特に、前記重い（heavier）鎖の第１リンカー部分又は前記軽い（lighter）鎖のリンカーを表す。ＣＨ２及びＣＨ３はＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを表す。ｈ２Ｂ６ Ｆｖ及びｈ３Ｇ８ ＦｖはそれぞれＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を表す。 共有結合型二特異性ダイアボディを形成するＦｃドメインを含むポリペプチド鎖を模式的に示す図である。 本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチドコンストラクトを表す（各コンストラクトはコンストラクトの左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと示されている）。コンストラクト（９）（配列番号１９）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のヒンジ／Ｆｃドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み、コンストラクト（１０）（配列番号２０）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み、コンストラクト（１１）（配列番号２１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６（Ｇ１０５Ｃ）−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−アミノ酸置換Ａ２１５Ｖを含むヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン−ｃを含み、コンストラクト（１２）（配列番号２２）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６（Ｇ４４Ｃ）のＶＨドメイン−Ｃ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）配列−ｃを含む。 親和性４量体ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を示す図である。 コンストラクト１０及び１、コンストラクト９及び１、並びにコンストラクト１１及び１２を発現するベクターでコトランスフェクトした組換え発現系により生成したダイアボディを非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｈ＋Ｌをプローブとして用いたウェスタンブロット分析（Ｂ）に供した。Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（インビトロジェン社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質を可視化した。パネルＡ及びＢの両方について、コンストラクト１０及び１、コンストラクト９及び１、並びにコンストラクト１１及び１２を含むダイアボディ分子はそれぞれレーン１、２、及び３である。 Ｆｃドメイン及び設計された鎖間ジスルフィド結合を含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合を示す図である。 Ｆｃドメイン並びに「軽い（lighter）」及び「重い（heavier）」ポリペプチド鎖の間に設計されたジスルフィド結合を含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、コンストラクト１及び１０、コンストラクト１及び９、並びにコンストラクト１１及び１２をそれぞれ発現する３つの組換え発現系により生成した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブとしてＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａを用いた。ｈ３Ｇ８の結合を対照として用いた。 ダイアボディ分子のポリタンパク質前駆体の模式図及びλ軽鎖及び／又はヒンジドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。 本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチドコンストラクトを示す（各コンストラクトはコンストラクトの左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端へと示されている）。コンストラクト（１３）（配列番号９５）は、ｎ−ＶＬドメイン３Ｇ８−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端ＬＧＧＣドメインを含む（配列番号９５をコードするヌクレオチド配列を配列番号９６に示す）。コンストラクト（１４）（配列番号９７）は、ｎ−ＶＬドメイン３Ｇ８−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端ＬＧＧＣドメインを含む（配列番号９７をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に示す）。コンストラクト（１５）（配列番号９９）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ２Ｂ６−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−Ｃ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）ドメインを含む（配列番号９９をコードするヌクレオチド配列を配列番号１００に示す）。コンストラクト（１６）（配列番号１０１）は、ｎ−ＶＬドメインＨｕ３Ｇ８−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）ドメインを含む（配列番号１０１をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０２に示す）。 ポリタンパク質前駆体分子に由来するダイアボディ分子のｍＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａの結合を示す図である。 ポリタンパク質前駆体分子コンストラクト１３（配列番号９５）に由来するダイアボディ分子のマウスＣＤ３２Ｂ（ｍＣＤ３２Ｂ）及び可溶性ＣＤ１６Ａ（ｓＣＤ１６Ａ）への結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡでアッセイした。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブとしてビオチンコンジュゲートｓＣＤ１６Ａを用いた。 ｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへのλ鎖及び／又はヒンジドメインを含むダイアボディ分子の結合を示す図である。 ヒトλ軽鎖のＣ末端に由来するドメイン及び／又はＩｇＧのヒンジドメインを含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２Ｂ及びｓＣＤ１６Ａへの結合をサンドウィッチＥＬＩＳＡでアッセイし、コンストラクト１及び２（図５）を含むダイアボディと比較した。アッセイしたダイアボディはコンストラクト１５及び１６（それぞれ配列番号９９及び１０１）を発現する組換え発現系により生成した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。小さい四角のバーはコンストラクト１５／１６の組合せを表し、大きい四角のバーはコンストラクト１／２の組合せを表す。 細胞表面に位置するＣＤ３２Ｂとフルオレセインコンジュゲート分子とに結合した２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴを模式的に示す図である。 ＤＡＲＴの「万能アダプター」抗フルオレセインアームの柔軟性と２Ｂ６アームを別の特異性で置換する可能性とを示す。Ｖ領域をボックスとして示し、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）リンカーを線で示し、２つの鎖を連結するジスルフィド結合を示す。一方の鎖の構成要素を青色で示し、他方をピンク色で示す。Ｎ、アミノ末端；Ｃ、カルボキシ末端；ＦＬ、フルオレセイン、ＶＬ、軽鎖可変領域；ＶＨ、重鎖可変領域。 ２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴがフルオレセインコンジュゲート分子に特異的に結合し、ＣＤ３２Ｂに同時に結合できることを示す図である。 （Ａ）ＦＩＴＣ−Ｓタンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８を結合させた。可溶性ＣＤ３２Ｂ、次いでＣＤ３２Ｂに特異的な抗体及び検出用のＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体を結合させることにより、２Ｂ６アームの結合及び機能を検出した。（Ｂ）ＨｕＩｇＧ又はＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧ（フルオレセインコンジュゲート）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８を結合させた。２Ｂ６ Ｆｖに特異的なポリクローナル血清、次いでＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体と結合させることより、結合を検出した。 抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体を用いた精製Ｂ細胞の活性化を示す図である。 種々の濃度のＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体であるＣＢ３．１−ＦＩＴＣ（Ａ）又はＣＢ３．２−ＦＩＴＣ（Ｂ）並びに５０μｇ／ｍｌのＦｃ特異的なＧＡＭ ＩｇＧのＦ（ａｂ'）２断片（ｘ軸）を用いて精製Ｂ細胞を活性化した。Ｂ細胞を、ＰＢＳ（白色バー）又は５μｇ／ｍｌのαＦＩＴＣαＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（黒色バー）若しくはαＣＤ１６αＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（灰色バー）のいずれかの存在下で活性化させた。反応は３連で行い、標準偏差を計算した。 精製Ｂ細胞の活性化を示す図である。 第２の健康ドナーの精製Ｂ細胞を図２２のパネルＢに示したように活性化した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ７９ｂ抗体であるＣＢ３．２−ＦＩＴＣの存在下で活性化させた細胞の増殖指数（Ａ）を測定し、非標識ＣＢ３．２抗体の存在下で活性化させた細胞の増殖指数（Ｂ）と比較した。 ｈＣＤ１６Ａ／ＢトランスジェニックマウスにおけるＭＧＤ２６１を用いたインビボマウスＢ細胞枯渇を示す図である。 マクロジェニックス社製繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、及びｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、０、３、７、１０、１４及び１７日目にＭＧＤ２６１（１０、３、１、又は０．３ｍｇ／ｋｇ）又は無関係の抗体（ｈＥ１６、１０ｍｇ／ｋｇ）をＩＶ注射した。−１９（出血前）、４、１１、１８、２５、及び３２日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。動物の健康及び活動を週３回記録した。上パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８及びＷＮＶ ｍＡｂ；下パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８ −ｈＣＤ１６Ａ又は−ｈＣＤ３２Ｂマウス及びＷＮＶ ｍＡｂ −ｈＣＤ１６Ａ又は−ｈＣＤ３２Ｂマウス。 ｈＣＤ１６Ａ／Ｂトランスジェニックマウスにおける２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢを用いたインビボマウスＢ細胞枯渇を示す図である。 マクロジェニックス社製繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ｂ＋、及びｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、０、２、４、７、９、１１、１４、１６、及び１８日目に２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢ（７５μｇ／マウス）又はＰＢＳをＩＰ注射した。−１０（出血前）、４、１１、及び１８日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。動物の健康及び活動を週３回記録した。 ヒト腫瘍細胞系ＲＡＪＩの静脈内（ＩＶ）モデルを用いたＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性を実証する図である。 マクロジェニックス社製繁殖コロニーの１２〜２０週齢のｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−のＣ５７Ｂｌ／６マウスに０日目に５×１０６個のＲａｊｉ細胞をＩＶ注射した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７、及び３０日目に、２５０、２５、若しくは２．５μｇのＭＧＤ２６１又はＰＢＳ（陰性対照）で更にマウスを腹腔内（ＩＰ）処置した。次いで、マウスを毎日観察し、体重を週２回記録した。後肢の麻痺を発症したマウスは屠殺した。 非哺乳動物宿主中でのＤＡＲＴ発現を示す図である。 ＢＬ２１ＤＥ３細胞（ノバジェン社製）をｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、ａｍｐ耐性コロニーをブロス培養液に播種した。培養液のＯＤ６００単位が０．５に達した時に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて発現を誘導した。培養を３０℃で２時間成長させ、無細胞培地を回収した。 ＤＡＲＴのＥＬＩＳＡを示す図である。 ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いてｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ ＤＡＲＴ結合ＥＬＩＳＡを行った。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いて読取結果をプロットした。 ＤＡＲＴ誘導ヒトＢ細胞死を示す図である。 ヒトＰＢＭＣを表示されている分子と一晩インキュベートした。ＦＡＣＳ分析により、ＦＳＣ／ＳＳＣのゲーティングされていない全細胞集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ＋集団の百分率として、アポトーシスをアッセイした。 ８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴコンストラクトを示す図である。 本発明を例示するために複数の８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴコンストラクトを作製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、コンストラクト５及び６、６及び７、８及び９、又は９及び１０をコードする発現プラスミドをＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトして抗ｆｌａｇタグを有する又は有さない８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴを発現させた。条件培地を３日毎に３回にわたり回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。 ８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴのＥＬＩＳＡを示す図である。 ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いて８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴ／ｃｈ８Ｂ５競合ＥＬＩＳＡを実施した。反応後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いて読取結果をプロットした。 ４価ＤＡＲＴ構造を模式的に示す図である。 ４つのポリペプチド鎖の集合により生成されるＤＡＲＴ分子種の一般的構造を示す。Ｉｇ様ＤＡＲＴの４個の抗原結合ドメインを縞模様及び濃い灰色の楕円として示す。 Ｉｇ様４価ＤＡＲＴを示す図である。 Ｉｇ様４価ＤＡＲＴのエピトープ結合部位を模式的に示す。 ｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａの結合ＥＬＩＳＡを示す図である。 実施例６．１０のＩｇ様４価ＤＡＲＴ分子種が対照（ｃｈ−ｍＣＤ３２ ｍＡｂ）抗体又は他のＤＡＲＴ分子種よりも大きな親和性で抗原に結合することを示すＥＬＩＳＡの結果を示す。 Ｉｇ ＤＡＲＴ分子を模式的に示す図である。 Ｉｇ ＤＡＲＴ分子の模式図を示す。特異性を影付きの領域、パターン付き領域、又は白色領域で示し、定常領域を黒色で示し、ジスルフィド結合を黒色点線で示す。全てのタンパク質鎖のＮ末端が図の上に向いており、一方、全てのタンパク質鎖のＣ末端は図の下に向いている。図Ａ〜Ｅは二特異性であり、図Ｆ〜Ｊは三特異性である。図Ａ及びＥは４価である。図Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、及びＪは６価である。図Ｄ、Ｇ、及びＨは８価である。個々のドメインの詳細な説明については図１、２、９、１４、及び１７並びにセクション３．１を参照されたい。 Ｈｕ２Ｂ６ ４．５−Ｈｕ３Ｇ８ ５．１生体特異性ダイアボディの結合能力を示す図である。 Ｈｕ２Ｂ６ ４．５又はＨｕ３Ｇ８ ５．１ダイアボディ（三角）と比べた、Ｈｕ２Ｂ６ ４．５−Ｈｕ３Ｇ８ ５．１生体特異性ダイアボディ（四角）がＣＤ３２ｂ及びＣＤ１６ａに結合する能力を示す。 Ｅコイル及びＫコイルＤＡＲＴ誘導体を模式的に示す図である。 Ｅコイル及びＫコイルＤＡＲＴ誘導体の一般的コンホメーションを示している。 好ましいＥコイル及びＫコイルセパレーターのへリックス配置を示す図である。 好ましい「Ｅコイル」配列（ＥＶＡＡＬＥＫ）４（配列番号２９９）及び好ましい「Ｋコイル」配列（ＫＶＡＡＬＫＥ）４（配列番号３００）のへリックス配置を示す。 Ｅコイル及びＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体を示す図である。 鎖交換により形成することができる異なる分子種のＥコイル及びＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体を図解している。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／若しくはＫコイル誘導体並びに／又はＥコイル及び／若しくはＫコイルＦｃ含有誘導体の分子ふるいクロマトグラフィーを示す図である。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／若しくはＫコイル誘導体並びに／又はＥコイル及び／若しくはＫコイルＦｃ含有誘導体の分子ふるいクロマトグラフィーの結果を示す。全てＥコイル及びＫコイルを有するこのような分子の４つの分子種を分析した。ＥＫ（Ｆｃ領域なし）、２．１ｍｇ；ＥＦｃ／Ｋ（ＦｃがＥコイルに連結）、２．７ｍｇ；Ｅ／ＫＦｃ（ＦｃがＫコイルに連結）、１．８ｍｇ；ＥＦｃ／ＫＦｃ（Ｆｃが同じＤＡＲＴのＫコイル及びＥコイルに連結）、２．０ｍｇ。 生成した二量体分子の構造を示す図である。 図４０の分子ふるいクロマトグラフで同定された生成二量体分子の可能な構造を示す。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／又はＫコイル誘導体並びにＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ含有誘導体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／又はＫコイル誘導体並びにＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ含有誘導体の分子ふるいクロマトグラフィー（図４０）で得られた画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。隣接レーン：分子マーカー対照；レーン１：ＥＫ（Ｆｃ領域なし）；レーン２：ＥＦｃ／Ｋ、凝集体画分；レーン３：ＥＦｃ／Ｋ、単量体画分；レーン４：Ｅ／ＫＦｃ、凝集体画分；レーン５：Ｅ／ＫＦｃ、単量体画分；レーン６：ＥＦｃ／ＫＦｃ、凝集体画分；レーン７：ＥＦｃ／ＫＦｃ、二量体画分；レーン８：ＥＦｃ／ＫＦｃ、単量体画分。 二特異的結合のＥＬＩＳＡ分析 Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ、対照、及びＥＦｃ／ＫＦｃ ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体を比較した二特異的結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／又はＫコイル誘導体並びにＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ含有誘導体がＴ細胞増殖を阻害する能力を示す図である。 ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／又はＫコイル誘導体並びにＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ含有誘導体がＴ細胞増殖を阻害する能力を示す。 ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを示す図である。 ｈＣＤ１６及びｈＣＤ３２Ｂ抗原に免疫応答性の組換え二特異性ＤＡＲＴに融合したストレプトコッカスプロテインＧのＡＢＤ３ドメインで構成される組換え抗体分子ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを模式的に示す。 ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性 濃度２μｇ／ｍＬのＣＤ１６抗原（図４６Ａ）又はヒト血清アルブミン（図４６Ｂ）のいずれかでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。２μｇ／ｍＬに始まる種々の濃度のｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）及び対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（○）を結合させた。ビオチン化ｓＣＤ３２Ｂ抗原をプレートに加え、次いでＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを加えて検出した。図４６Ｃは、ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及びＨＳＡに同時に結合できることを示している。図４６Ｄ〜４６Ｉは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ及びそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）及び可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に同等な結合を示すことが見出されたことを示している。図４６ＪはＤＡＲＴ ＡＢＤ融合体がその親ＤＡＲＴの二特異性結合を保持しており、ヒト血清アルブミンの存在の影響を受けないｓＣＤ１６Ａ及びＣＤ３２Ｂへの結合を示したことを示している。 ＤＡＲＴタンパク質の細胞傷害性を示す図である。 ＤＡＲＴタンパク質のＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性を示す。エフェクター細胞としてのＰＢＭＣとインキュベートした標的細胞としてヒトＢ細胞系Ｄａｕｄｉを用いてＡＤＣＣアッセイを行った。個々のアッセイは３連にて行い、エフェクターと標的の比率２０：１で抗体ｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（●）及びｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴ（■）の力価を測定した。細胞媒介性細胞傷害をＬＤＨ放出アッセイにより測定した。１００で下側の曲線がｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴ（■）である。図４７Ｂは、ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴがＣＤ１６Ｂ発現エフェクター細胞に結合することによりそのような細胞を動員してＣＤ３２Ｂを発現する細胞を（再標的化された殺作用により）殺すことを示している。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性の改善を示す図である。 マウス（ｎ＝３）に（Ａ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（●）及び（Ｂ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴ（▲）を５ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した。マウス血清を種々の時点で採取し、血清中のタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。薬物動態学的計算はＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ５．１．を用いて行った。 ＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビボにおける生物学的活性を示す図である。 図４９Ａ〜４９Ｃは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴがマウスへの投与後にインビボで生物学的活性を保持及び発揮したことを示している。Ｔｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスへのＡＢＤ−ＤＡＲＴ又はその親ＤＡＲＴの単回投与は、Ｔ細胞（図４９Ｂ）又はＰＭ細胞（図４９Ｃ）の濃度に影響することなくＢ細胞（図４９Ａ）の濃度を選択的に抑制できることが見出された。 ＨＥＲ２低発現細胞系パネル上でのＨＥＲ２×ＴＣＲｂ ＤＡＲＴの活性を示す図である。Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合性ドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低レベルのＨＥＲ２発現を示すものとして以前に特徴付けられている（したがって、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による処置に抵抗性である）複数の乳癌、結腸癌、及び膀胱癌細胞系において細胞傷害性を媒介する能力について調べた。試験した乳癌細胞系はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２ ２＋）（図５０Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２ １＋）（図５０Ｂ）、及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図５０Ｃ）である。試験した非乳癌細胞系はＨＴ−２９（結腸癌細胞系）（図５０Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞系）（図５０Ｅ）である。 ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイル及び４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製 ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイル及び４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製を示す。 ＫＹＫ２−４４２０ ＶＦ ＤＡＲＴの結合特異性を示す図である。 ＫＹＫ２−４４２０ ＶＦ ＤＡＲＴの結合特異性を示す。 プラスミドｐＰＡＬ７ Ｋコイル−ＡＢＤの構築を示す図である。 プラスミドｐＰＡＬ７ Ｋコイル−ＡＢＤの構築を模式的に示す。 ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂で精製したＫコイルＡＢＤタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。 ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂で精製したＫコイルＡＢＤタンパク質のウェスタンブロット分析を示す（１０ｍｌ培養からの小規模）。レーン１及び５：粗ライセート；レーン２及び６：フロースルー、レーン３、４、８、及び９：精製タンパク質；レーン７：マーカー。一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＥＫ抗体；二次抗体：抗ウサギＨＲＰ。 ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂で精製したＫコイルＡＢＤタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂から溶出した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。Ｌ：粗大腸菌ライセート；ＦＴ：フロースルー；Ｗ：洗浄；Ｍ：マーカー。 二重アフィニティーＥＬＩＳＡによるＫＹＫ２ ４４２０ ＥＫ ＡＢＤ ＤＡＲＴ結合を示す図である。 ＫＹＫ２−４４２０ ＶＦ ＤＡＲＴがＫコイル−ＡＢＤ分子と複合体化して特性の改善されたＥコイル−ＫコイルＡＢＤ ＤＡＲＴを形成することを示すＥＬＩＳＡの結果を示す。図５６Ａ：ＮＫＧ２Ｄ Ｆｃで捕捉されて、ビオチン化モノクローナル抗ＥＫ抗体で検出されたＤＡＲＴ。図５６Ｂ：モノクローナル抗ＥＫ抗体で捕捉されて、ＨＲＰ−ヒトアルブミンで検出されたＤＡＲＴ。図５６Ｃ：ＮＫＧ２Ｄ Ｆｃで捕捉されて、ビオチン化抗ＦＩＴＣ抗体で検出されたＤＡＲＴ。ＥＬＩＳＡの結果は、複合体中のドメインの全てがそれらのそれぞれのリガンドに結合できることを示している。 脱免疫化ＡＢＤ ＥＬＩＳＡを示すである。 アルブミン結合ドメインの配列中の改変により生じた結合性の変化を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。 アルブミン結合アッセイを示す図である。 ＡＢＤ変異体Ｙ６１Ａ／Ｉ６５Ａ、Ｙ６１Ａ／Ｎ６６Ｄ、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ＊、及びＬ６４Ａ／Ｎ６６Ｄ、並びに野生型のアルブミン結合アッセイの結果を示す。 アルブミン結合アッセイを示す図である。 ＡＢＤ変異体Ｌ６４Ｇ／Ｎ６６Ｄ、Ｉ６５Ａ／Ｎ６６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｔ７０Ｓ＊、及びＹ６１Ａ／Ｎ６６Ｓ／Ｔ７０Ｓ、並びに野生型のアルブミン結合アッセイの結果を示す。 アルブミン結合アッセイを示す図である。 ＡＢＤ変異体Ｙ６０Ａ／Ｙ６１Ａ、Ｙ６０Ｔ／Ｙ６１Ａ、Ｉ６５Ａ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６１Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ａ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、及び野生型のアルブミン結合アッセイの結果を示す。 アルブミン結合アッセイを示す図である。 ＡＢＤ変異体Ｙ６０Ａ／Ｙ６１Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６０Ｔ／Ｙ６１Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、及び野生型のアルブミン結合アッセイの結果を示す。 アルブミン結合アッセイを示す図である。 ＡＢＤ変異体Ｌ６４Ｇ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ｇ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６１Ａ／Ｔ７０Ｓ、Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ、Ｙ６１Ａ／Ｎ６６Ｓ、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ、及び野生型のアルブミン結合アッセイの結果を示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ及びＡＢＤ−ＤＡＲＴ変異体の改善された薬物動態特性を示す図である。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ及びＡＢＤ−ＤＡＲＴ変異体の改善された薬物動態特性を示す。マウス（ｎ＝３）にＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質を５ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した。マウス血清を種々の時点で採取し、血清中のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。薬物動態学的計算はＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ５．１を用いて行った。 多価ＡＢＤ ＤＡＲＴタンパク質を示す図である。 ＡＢＤを両方の鎖の末端に融合することにより（ｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ Ｅ ＡＢＤ／Ｋ ＡＢＤ ＤＡＲＴ）（図６４Ａ）又はタンデムＡＢＤを１つの鎖の末端に融合することにより（ｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ Ｅ ＡＢＤ ＡＢＤ／Ｋ ＤＡＲＴ）（図６４Ｂ）構築した、多価ＡＢＤを含むＤＡＲＴの構造を示す。 ｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴの二特異的活性 二重特異性ＥＬＩＳＡを用いてｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴの二特異的活性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのＣＤ１６抗原でコーティングした。種々の濃度のＡＢＤ ＤＡＲＴ及びＦｃ ＤＡＲＴをプレートに結合させた。最後に、プレートにビオチン化ｓＣＤ３２Ｂ抗原、次いでＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを加えて検出した。 ＡＢＤ ＤＡＲＴ及びＦｃ ＤＡＲＴの血清半減期を示す図である。 血清半減期を評価するためにＡＢＤ ＤＡＲＴ又はＦｃ ＤＡＲＴ（５ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７Ｂｌ／６マウスに単回静脈内注射したインビボ薬物動態研究の結果を示す。
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖はＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、これらのドメインは自己集合が制約されるように共有結合している。２つのポリペプチド鎖の相互作用により２つのＶＬ-ＶＨ対合がもたらされ、２つのエピトープ結合部位、すなわち２価の分子が形成される。ＶＨドメインもＶＬドメインも、ポリペプチド鎖内のいかなる位置にも束縛されず、すなわち、アミノ（Ｎ）末端にもカルボキシ（Ｃ）末端にも束縛されず、またこれらのドメインは互いに対するそれらの相対位置を束縛されず、すなわち、ＶＬドメインはＶＨドメインに対してＮ末端側であっても、その逆であってもよい。唯一の束縛は、機能的なダイアボディを形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であるべきことである。ＶＬドメイン及びＶＨドメインが同一の抗体由来である場合、その２つの相補的なポリペプチド鎖は同一であり得る。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体に由来する場合（すなわち、結合ドメインがＶＬＡ-ＶＨＡ相互作用から形成される場合）、各ポリペプチドはＶＨＡ及びＶＬＡを含む。抗体の２つのポリペプチド鎖のホモ２量体化により、２つのＶＬＡ-ＶＨＡ結合部位の形成がもたらされ、２価の単一特異性抗体が生成される。ＶＬドメイン及びＶＨドメインが異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合、機能的な二重特異性ダイアボディの形成は、２つの異なるポリペプチド鎖の相互作用、すなわち、ヘテロ２量体の形成を必要とする。例えば、二重特異性ダイアボディに関して、１つのポリペプチド鎖はＶＬＡ及びＶＬＢを含み；前記鎖のホモ２量体化は２つのＶＬＡ−ＶＨＢ結合部位の形成、又は結合形成無しもしくは予測不可能な結合形成のいずれかをもたらす。対照的に、２つの異なるポリペプチド鎖が自由に相互作用できる場合（例えば、組み換え発現系において）、一方はＶＬＡ及びＶＨＢを含み、他方はＶＬＢ及びＶＨＡを含み、２つの異なる結合部位：ＶＬＡ-ＶＨＡ及びＶＬＢ-ＶＨＢが形成される。全てのダイアボディポリペプチド鎖対に関して、２つの鎖の誤整列又は誤結合の可能性、すなわち、ＶＬ-ＶＬドメイン又はＶＨ-ＶＨドメインの相互作用は起こり得ることであるが、機能的なダイアボディの精製は、当該分野（are）において既知の、又は本明細書で例示される、親和性に基づくあらゆる方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を用いて適切に２量体化した結合部位の免疫学的特異性に基づいて、容易に達成される。
他の実施形態では、ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの１つ又は複数は、Ｆｃドメインを含む。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖中のＦｃドメインは優先的に２量体化し、それによって免疫グロブリン様特性を示すダイアボディ分子（例えば、Ｆｃ-ＦｃγＲ相互作用）の形成がもたらされる。Ｆｃを含むダイアボディは、（例えば、それぞれＶＨドメイン、ＶＬドメイン及びＦｃドメインを含む２つのポリペプチド鎖から成る）２量体であり得る。前記ポリペプチド鎖の２量体化により、未改変の２価の抗体のそれとは異なる構造を有するが、Ｆｃドメインを含む、２価のダイアボディがもたらされる（図１１）。そのようなダイアボディ分子は、野生型の免疫グロブリンと比較した場合に、表現型の変化（例えば、血中半減期、結合特性等の変化）を示す。他の実施形態では、Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子は四量体であり得る。そのような四量体（tertramer）は、２つの「重い（heavier）」ポリペプチド鎖（すなわちＶＬ、ＶＨ及びＦｃドメインを含むポリペプチド鎖）、並びに２つの「軽い（lighter）」ポリペプチド鎖（すなわち、ＶＬ及びＶＨを含むポリペプチド鎖）を含む。前記の軽い（lighter）鎖及び重い（heavier）鎖は相互作用して単量体を形成し、前記単量体はそれらの不対Ｆｃドメインを介して相互作用してＩｇ様分子を形成する。そのようなＩｇ様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性又は四重特異性であり得る。
ダイアボディ分子の少なくとも２つの結合部位が、同じ又は異なるエピトープを認識することができる。異なるエピトープは同一抗原由来である可能性があり、又は異なる抗原由来のエピトープである可能性がある。一実施形態では、エピトープは異なる細胞由来である。別の実施形態では、エピトープは、同一の細胞又はウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合部位は、それに対する抗体を作製可能なあらゆる抗原を認識することができる。例えば、タンパク質、核酸、細菌性毒素、細胞表面マーカー、自己免疫性マーカー、ウイルスタンパク質、薬剤等である。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞又はＴ細胞、食細胞（phagocytotic cell）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は樹状細胞等の特定の細胞上の抗原に対して特異的である。
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン（すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン及びＦＣドメイン）は、ペプチドリンカーによって隔てられている場合がある。ペプチドリンカーは０、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸であり得る。ある実施形態では、アミノ酸リンカー配列は、核酸配列（配列番号７４）にコードされるＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）である。
ある実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、本発明の第二のポリペプチド鎖上の対となる少なくとも１つのシステイン残基と相互作用して鎖間ジスルフィド結合を形成する少なくとも１つのシステイン残基を含むように設計される。前記鎖間ジスルフィド結合はダイアボディ分子を安定化させる機能を持つことで、組換え系における発現及び回収率を向上させ、安定で一貫した製剤をもたらし、さらに単離及び／又は精製した生成物のインビボでの安定性を向上させる。前記少なくとも１つのシステイン残基は、単一のアミノ酸として、又はより大きなアミノ酸配列（例えばヒンジドメイン）の一部として、ポリペプチド鎖のいかなる部分にも導入され得る。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのシステイン残基は、ポリペプチド鎖のＣ末端に生じるよう設計される。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのシステイン残基は、アミノ酸配列ＬＧＧＣ内のポリペプチド鎖中に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣを含む。別の実施形態では、前記少なくとも１つのシステイン残基は、ヒンジドメインを含むアミノ酸配列（例えば配列番号１又は配列番号４）内のポリペプチド中に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖Ｃ末端は、ＩｇＧヒンジドメインのアミノ酸配列（例えば配列番号１）を含む。別の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端はアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含んでおり、これはヌクレオチド配列（配列番号７８）にコードされ得る。他の実施形態では、前記少なくとも１つのシステイン残基はアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）内のポリペプチド鎖中に導入されており、これはヌクレオチド配列（配列番号７６）にコードされ得る。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを含むポリペプチド鎖のＣ末端はアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）を含んでおり、これはヌクレオチド配列（配列番号７６）にコードされ得る。さらに他の実施形態では、前記少なくとも１つのシステイン残基はアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）内のポリペプチド鎖中に導入されており、これはヌクレオチド配列（配列番号７５）にコードされ得る。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを含むポリペプチド鎖のＣ末端はアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含んでおり、これはヌクレオチド配列（配列番号７５）にコードされ得る。
ある実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、そのそれぞれはアミノ酸配列ＬＧＧＣを含み、前記ＬＧＧＣ配列中のシステイン残基間のジスルフィド結合によって共有結合している。別の特定の実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、そのうち一方は配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、他方はヒンジドメイン（少なくとも１つのシステイン残基を含有）を含み、そこで、前記少なくとも２つのポリペプチド鎖は、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）中のシステイン残基とヒンジドメイン中のシステイン残基の間のジスルフィド結合によって共有結合している。特定の態様では、ヒンジドメインに位置するジスルフィド結合に関与するシステイン残基はＣｙｓ-１２８（Ｋａｂａｔ ＥＵによる番号付け；未改変の、インタクトなＩｇＧ重鎖のヒンジドメインに位置する）であり、その対となる配列番号２３中のシステイン残基はＣｙｓ-２１４（Ｋａｂａｔ ＥＵによる番号付け；未改変の、インタクトなＩｇＧ軽鎖のＣ末端に位置する）である（Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem. 280:14402-14412；参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基は、アミノ酸鎖のＮ末端で生じるように設計される。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基は、ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に生じるよう設計される。さらなる実施形態では、ＶＨドメイン又はＶＬドメインは、親ＶＨドメイン又は親ＶＬドメインに対して、親アミノ酸とシステインとの置換を含むような少なくとも１つのアミノ酸改変を含むよう設計される。
本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部（例えばＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。Ｆｃドメイン又はその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含むがこれらに限定はされない、いかなる免疫グロブリンアイソタイプ又はアロタイプに由来していてもよい。好ましい実施形態では、Ｆｃドメイン（又はその一部）はＩｇＧ由来である。特定の実施形態では、ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、又はそのアロタイプである。一実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃドメインを含み、そのＦｃドメインは、あらゆる免疫グロブリンアイソタイプから独立して選択されるＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む（すなわち、ＩｇＧ由来のＣＨ２ドメイン及びＩｇＥ由来のＣＨ３ドメインを含むＦｃドメイン、又はＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ２由来のＣＨ３ドメインを含むＦｃドメイン等）。前記Ｆｃドメインは、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチド鎖中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメイン又は部分に対していかなる位置にも、導入することができる（例えば、Ｆｃドメイン又はその一部は、前記鎖のポリペプチドのＶＬドメイン及びＶＨドメインの両方に対してＣ末端側であってもよく；ＶＬドメイン及びＶＨドメイン両方に対してＮ末端側であってもよく；あるいは、あるドメインに対してはＮ末端側で別のドメインに対してはＣ末端側（すなわち、ポリペプチド鎖の２つのドメインの間））であってもよい
本発明はヒンジドメインを含む分子も包含する。ヒンジドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む、いかなる免疫グロブリンアイソタイプ又はアロタイプ由来であってもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはＩｇＧ由来であり、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、又はそのアロタイプである。前記ヒンジドメインは、ダイアボディ分子がヒンジ-Ｆｃドメインを含むように、Ｆｃドメインと一緒に、ダイアボディ分子を含むポリペプチド鎖中に導入することができる。ある実施形態では、ヒンジ及びＦｃドメインは、当該技術分野において周知の、又は本明細書で例示される、あらゆる免疫グロブリンアイソタイプから独立して選択される。他の実施形態では、ヒンジ及びＦｃドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つの他のドメイン（例えばＶＬドメイン）によって隔てられる。ヒンジドメイン、又は所望によりヒンジ-Ｆｃドメインは、本発明のポリペプチド中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメイン又は部分に対していかなる位置にも、導入することができる。ある実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含み、そのヒンジドメインはポリペプチド鎖のＣ末端に位置し、前記ポリペプチド鎖はＦｃドメインを含まない。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジ-Ｆｃドメインを含み、そのヒンジ-Ｆｃドメインはポリペプチド鎖のＣ末端に位置する。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジ-Ｆｃドメインを含み、そのヒンジ-Ｆｃドメインはポリペプチド鎖のＮ末端に位置する。
前述の通り、本発明はポリペプチド鎖の多量体を包含し、そのポリペプチド鎖はそれぞれＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ある態様では、前記多量体中のポリペプチド鎖はＦｃドメインをさらに含む。Ｆｃドメインの２量体化により、免疫グロブリンに似た機能性、すなわち、Ｆｃにより仲介される機能（例えば、Ｆｃ-ＦｃγＲ相互作用、補体結合等）を示すダイアボディ分子の形成がもたらされる。ある実施形態では、各ポリペプチド鎖を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインは同一の特異性を有し、前記ダイアボディ分子は２価で且つ単一特異性である。他の実施形態では、各ポリペプチド鎖を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインは異なる特異性を有し、前記ダイアボディは２価で且つ二重特異性である。
さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はポリペプチド鎖の四量体を包含し、そのポリペプチド鎖はそれぞれＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ある実施形態では、四量体の２つのポリペプチド鎖はＦｃドメインをさらに含む。従って四量体は、それぞれＶＬ、ＶＨ及びＦｃドメインを含む２つの「重い（heavier）」ポリペプチド鎖、並びにＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む２つの「軽い（lighter）」ポリペプチド鎖から成る。重い（heavier）鎖のＦｃドメインを介した前記単量体の２量体化に伴う、２価の単量体への重い（heavier）鎖及び軽い（lighter）鎖の相互作用により、四価の免疫グロブリン様分子の形成がもたらされる（実施例６．２及び実施例６．３で例示）。ある態様では、単量体は同一であり、四価のダイアボディ分子は単一特異性又は二重特異性である。他の態様では、単量体は異なっており、四価の分子は二重特異性又は四重特異性である。
上記の四重特異性ダイアボディ分子の形成は、４つの異なるポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。そのような相互作用は、起こり得る鎖の誤対合が多様であるため、単一細胞の組換え産生系内で効率よく達成するのが困難である。誤対合の確率を減少させるための１つの解決法は、所望のポリペプチド鎖対に「ノブと穴（knob-into-hole）」型の変異を導入することである。そのような変異はホモ２量体化よりもヘテロ２量体化を好む。例えば、Ｆｃ-Ｆｃ-相互作用に関して、アミノ酸置換（好ましくは、「ノブ」を形成するかさのある側鎖を含むアミノ酸（例えば、トリプトファン）との置換）を、立体障害が同様に変異したドメインとの相互作用を阻止するように、及び変異したドメインに、相補的又は協調的な変異が導入されたドメイン、すなわち、「穴」（例えば、グリシンとの置換）との対合を強制するように、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインに導入することができる。そのような一連の変異は、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいかなる対にも導入することができ、さらに、前記対のポリペプチド鎖のいかなる部分にも導入することができる。ホモ２量体化よりもヘテロ２量体化を好むようにタンパク質を操作する方法、具体的には免疫グロブリン様分子の操作については、当該技術分野において周知であり、本明細書に包含される（例えば、Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101を参照；それぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
本発明は、変異型Ｆｃ又は変異型ヒンジ-Ｆｃドメイン（又はその一部）を含むダイアボディ分子も包含し、その変異型Ｆｃドメインは、比較可能な野生型のＦｃドメイン又はヒンジ-Ｆｃドメイン（又はその一部）に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換、挿入、欠失）を含む。変異型Ｆｃドメイン又はヒンジ-Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む分子（例えば、抗体）は、通常、野生型のＦｃドメインもしくはヒンジ-Ｆｃドメイン又はその一部を含む分子に対して異なる表現型を有する。変異表現型は、血中半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はＮＫ依存的アッセイもしくはマクロファージ依存的アッセイにおいて検定されるエフェクター機能の変化として発現され得る。エフェクター機能を変化させることが特定されたＦｃドメイン変異体は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号及び同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日に出願された同第６０／６３６，６６３号、及び２００６年３月１０日に出願された同第６０／７８１，５６４号、並びに２００５年１１月１０日に出願された米国特許出願第１１／２７１，１４０号、及び２００５年１２月１５日に出願された同第１１／３０５，７８７号、本願発明者らが並行して行った出願に開示されており、それぞれは参照によってその全体が組み込まれる。
本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの隔てられた異なるエピトープと同時に結合することができる。ある実施形態では、エピトープは同一抗原に由来する。他の実施形態では、エピトープは異なる抗原に由来する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合部位は、免疫エフェクター細胞上に発現される決定基（例えばＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等）に対して特異的であり、これらの決定基は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現される。一実施形態では、ダイアボディ分子はエフェクター細胞の決定基に結合し、前記エフェクター細胞を活性化もする。これに関連して、本発明のダイアボディ分子は、それらがさらにＦｃドメインを含むか否かに関わらず、Ｉｇに似た機能性を示し得る（例えば、当該技術分野において周知の、又は本明細書で例示されるあらゆるエフェクター機能アッセイ（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）で検定される）。ある実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上のがん抗原及びエフェクター細胞の決定基の両方と、前記細胞を活性化する間、結合する。別の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ又はダイアボディ分子は、上記（背景技術の節を参照）の、同一細胞上の活性化受容体及び抑制性受容体と同時に結合することにより、従って連結することにより（例えば、ＣＤ３２Ａ及びＣＤ３２Ｂの両方、ＢＣＲ及びＣＤ３２Ｂの両方、又はＩｇＥＲＩ及びＣＤ３２Ｂの両方と結合）、標的（例えば、エフェクター細胞）の活性化を阻害し得る。この実施形態のさらなる態様では、二重特異性ダイアボディは、ウイルス上の２つの中和エピトープ（例えば、ＲＳＶエピトープ；Ｅ１６及びＥ５３等のＷＮＶエピトープ）と同時に結合することにより、抗ウイルス特性を示し得る。
ある実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子によって、特定の細胞型を標的にする独特な機会が与えられる。例えば、二重特異性ダイアボディ又はダイアボディ分子は、標的細胞又は組織型に独特な一連の抗原を認識するエピトープ結合部位の組み合わせを含むように設計することができる。さらに、個々の抗原の一方又は両方が他の組織型及び／又は細胞型において別個に多く存在する場合、ダイアボディ又はダイアボディ分子を構築するために、低親和性結合ドメインを使用することができる。そのような低親和性結合ドメインは、治療目的のために十分な結合活性を以て、個々のエピトープ又は抗原に結合することができない。しかし、両方のエピトープ又は抗原が単一の標的細胞又は組織上に存在する場合、その細胞又は組織に対するダイアボディ又はダイアボディ分子の結合活性は、抗原の１つのみを発現する細胞又は組織に対する結合活性と比較して、前記細胞又は組織が本発明によって効率的に標的化され得るように増加する。そのような二重特異性分子は、前記抗原の１つのみに対して特異性を有する単一特異性ダイアボディ又は抗体と比較して、前記抗原の両方を発現する細胞上のその標的抗原の一方又は両方に対する結合の増強を示し得る。
好ましくは、本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性及び／又は１つ又は複数のＦｃγＲ介在物質エフェクター細胞機能（FcγR mediator effector cell function）（Ｆｃ-ＦｃγＲ相互作用を介して、又はダイアボディ分子のＦｃγＲへの免疫特異的結合によって仲介）を決定するための、インビトロにおける機能分析によって特徴づけられる（第５．４．２節及び第５．４．３節を参照）。ＦｃγＲに対する本発明の分子（例えば、ダイアボディ）の親和性及び結合特性は、結合ドメイン-抗原相互作用又はＦｃ-ＦｃγＲ相互作用、すなわち、それぞれ、抗原の結合ドメインへの特異的結合又はＦｃ領域のＦｃγＲへの特異的結合を決定するための、当該技術分野において周知のインビトロアッセイ（生化学又は免疫学に基づくアッセイ）を用いて決定することができ、該インビトロアッセイとしては、限定はされないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイが挙げられる（第５．４．２節を参照）。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、インビトロに基づくアッセイにおける結合特性に類似した、インビボモデル（本明細書に記載及び開示されるモデル等）における結合特性を有する。しかし、本発明は、インビトロに基づくアッセイにおいて所望の表現型を示さないが、インビボにおいては所望の表現型を示す本発明の分子を除外しない。
一部の実施形態では、本発明の分子は、比較可能な鋳型分子の一部に対して、グリコシル化パターンの変化又はグリコフォームの変化を含むように設計される。設計されたグリコフォームは、エフェクター機能の増強を含むがこれに限定はされない、種々の目的に有用であり得る。設計されたグリコフォームは、当業者に既知のいかなる方法によっても生成することができ、例えば、設計された、もしくは変異体を発現する株を使用することによって、１つ又は複数の酵素、例えば、ＤＩ Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）と共発現することによって、種々の生物もしくは種々の生物に由来する細胞株において本発明のダイアボディを発現することによって、又はダイアボディが発現され精製された後に炭水化物を修飾することによって、生成することができる。設計されたグリコフォームを生成する方法は、当該技術分野において周知であり、限定はされないが、以下に記載の方法が挙げられる：Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity," Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII," Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity," J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity," J Biol Chem 278:3466-3473) 米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願番号１０／２７７，３７０；米国特許出願番号１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（バイオワ社（Biowa, Inc.）、ニュージャージー州プリンストン）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化設計技術（ＧＬＹＣＡＲＴバイオテクノロジーＡＧ社（GLYCART biotechnology AG）、スイス、チューリヒ）；それぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ＷＯ０００６１７３９；ユーラシア特許第０１２２９１２５号；ＵＳ２００３０１１５６１４号；Okazaki et al. (2004) "Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA," JMB, 336: 1239-49（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明はさらに、本発明のダイアボディを作製するための、非天然アミノ酸の組込みを包含する。そのような方法は当業者に既知であり、非天然アミノ酸のタンパク質への組込みを可能にするために天然の生合成機構を用いる方法等があり、例えば、Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code," Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli," Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control," Chem. Comm. 19: 1897-1904（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。別の戦略は、アミノアシル-ｔＲＮＡの生合成に関与する酵素に焦点を当てており、例えば、Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host," J. Am. Chem. Soc. 123(44): 11089-11090; Kiick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli," FEBS Lett. 502(1-2):25-30；（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、本発明は、糖鎖付加部位の付加又は欠失により、本発明の分子のＶＬドメイン、ＶＨドメイン又はＦｃドメインを改変する方法を包含する。タンパク質の糖（carbohydrate）を改変する方法は、当該技術分野において周知であり、本発明に包含され、例えば、米国特許第６，２１８，１４９号；ＥＰ０３５９０９６Ｂ１；米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００２８４８６号；ＷＯ０３／０３５８３５；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明のダイアボディ分子は、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することができる。そのような結合リガンド、特に正常細胞では発現されない結合リガンドとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、retinoic acid early inducible gene-1（ＲＡＥ-１）の産物、及びmurine UL16-binding proteinlike transcript 1（ＭＵＬＴ１）が挙げられる（Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands," Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells," Blood 106:1711-1717）。ヒトＮＫＧ２Ｄと反応するさらなるリガンドとしては、多型ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子であるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢが挙げられる（Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In," Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved?," Trends Immunol. 22:378-385）。
ＭＩＣＡの配列である、配列番号３１１：
ＭＩＣＢの配列である配列番号３１２：
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する抗体としては、抗ＴＣＲ抗体のＢＭＡ０３１が挙げられる（Kurrle, R. et al. (1989) "BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12):4366-4373）。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する抗体としては、ＫＹＫ-２．０が挙げられる（Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156；及びＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１）。
そのようなダイアボディを使用することにより、前記（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を並べている細胞が結合できる細胞になるように、標的細胞をリダイレクトする。ＮＫＧ２Ｄ受容体は全てのヒト（及び他の哺乳類の）ナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29）、並びに全てのＣＤ８＋Ｔ細胞上（Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29）に発現される。
あるいは、本発明のダイアボディ分子は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することができる。ＴＣＲは、天然には、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現され、そのような細胞に、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質によって結合及び提示される抗原ペプチドを認識させる。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド-ＭＨＣ）複合体の認識は、サイトカイン産生及び抗原提示細胞の溶解をもたらす細胞免疫反応の伝播を惹起する（例えば、Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes," Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy," Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6):534-550）を参照）。
例えば、標的細胞の表面上に存在する受容体に結合可能な、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインをさらに含むようなダイアボディ分子を構築することによって、そのようなダイアボディ分子はＤＡＲＴ分子となって、標的細胞に結合可能となり、それによって標的細胞に、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体又はＴＣＲ（標的細胞と結合したダイアボディ上に存在するいずれか一方）に対する結合リガンドを提示させる（例えば、Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein," Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672）を参照されたい。
そのようなダイアボディを使用して、いかなる所望の標的細胞をも、ＮＫ細胞媒介性細胞溶解又はＴ細胞媒介性細胞毒性の標的である細胞にリダイレクトすることができる。一実施形態では、標的細胞の表面上に存在する受容体に結合可能なダイアボディのエピトープ結合ドメインは、そのようながん細胞をＮＫ細胞媒介性細胞溶解又はＴ細胞媒介性細胞毒性のための基質にリダイレクトするために腫瘍関連抗原に結合するエピトープである。特に重要な腫瘍関連抗原は、乳がん抗原、卵巣がん抗原、前立腺がん抗原、子宮頸がん抗原、膵臓癌抗原、肺がん抗原、膀胱がん抗原、結腸がん抗原、精巣がん抗原、神経膠芽腫がん抗原（glioblastoma cancer antigen）、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンリンパ腫関連抗原、又は慢性リンパ球性白血病関連抗原である。
そのような使用に適切な腫瘍関連抗原としては、Ａ３３(結腸直腸癌抗原; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998);Ｂ１ (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); ＢＡＧＥ (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84);βカテニン(Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9);ＣＡ１２５(Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81);ＣＤ５(Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73;ＣＤ１９(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48);ＣＤ２０(Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36);ＣＤ２２(Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51);ＣＤ２３(Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107);ＣＤ２５(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48);ＣＤ２７(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40);ＣＤ２８(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40);ＣＤ３６(Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7);ＣＤ４０／ＣＤ１５４(Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60);ＣＤ４５(Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46);ＣＤ５６(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40);ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106);ＣＤ１０３(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48);ＣＤＫ４(Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4);ＣＥＡ(癌胎児抗原; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9);ＣＴＬＡ４(Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13);ＥＧＦ−Ｒ(上皮増殖因子受容体; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32);Ｅｒｂ(ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38);ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8);ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２(Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25);ｇｐ１００(Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27);ＨＥＲ−２／ｎｅｕ(Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91);ヒトパピローマウイルス−Ｅ６／ヒトパピローマウイルス−Ｅ７(DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59);ＫＳＡ（１７−１Ａ）(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80);ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84);ＭＡＲＴ(Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82);ＭＵＣ−１(Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46);ＭＵＭ−１(Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素(Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34);ｐ１５(Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77);ＰＳＡ(前立腺特異抗原; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11);ＰＳＭＡ(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80);ｓＴｎ(Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91);ＴＮＦ受容体(ＴＮＦα受容体、ＴＮＦβ受容体；又はＴＮＦγ受容体; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64);又はＶＥＧＦ受容体(O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8)が挙げられる。
そのような用途のためのさらなる腫瘍関連抗原（及びそのような抗原に対して特異的な反応性を有する抗体を開示している刊行物）としては、ＡＤＡＭ-９（米国特許出願公開第２００６／０１７２３５０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４０７５）；ＡＬＣＡＭ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０９３４４３）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国特許出願公開第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０３２８１４）；サイトケラチン８（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０２４１９１）；エフリン受容体（具体的にはＥｐｈＡ２（米国特許第７，５６９，６７２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４２２６）；インテグリンα-Ｖ-β-６（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０８７３４０）；ＪＡＭ-３（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４０７８）；ＫＩＤ３（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０２８４９８）；ＫＩＤ３１（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０７６５８４）；ＬＵＣＡ-２（米国特許出願公開第２００６／０１７２３４９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８３８５２）；オンコスタチンＭ（オンコスタチン受容体β）（米国特許第７，５７２，８９６号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４０９２）；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０４／０４３２３９）；ＲＡＡＧ１０（米国特許第７，５２７，９６９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０４／００１３８１）；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７４９号）；ＴＥＳ７（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８／０６６６９１）；及びトランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／１２１１７９）が挙げられる。
特定の感染体に特有な抗原もまた重要であり、例えば、ウイルス性因子（例えば、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、口蹄（コクサッキーウイルス）、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、並びに胃腸炎の原因物質（例えば、ロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス及びノーウォークウイルス））；細菌性因子（例えば、限定はされないが、大腸菌（E. coli）、ネズミチフス菌（Salmonella thyphimurium）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae））、真菌性因子、並びに寄生虫（例えば、ジアルジア属（Giardi））である。
あるいは、例えば急性単球性白血病細胞をＮＫ細胞媒介性細胞溶解の基質にリダイレクトするために、そのようなエピトープはＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩ）に結合することができる。
５．１ ダイアボディ結合ドメイン
本発明のダイアボディは、一般的には免疫グロブリン又は抗体に由来する抗原結合領域を含む。本発明の方法で使用される結合ドメインが由来する抗体は、鳥類及び哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む、いかなる動物起源に由来していてもよい。抗体はヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから単離された抗体、又はヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。
本発明は、本発明のダイアボディに対する結合ドメインの供給源としての、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患又は感染症の治療及び／又は予防のための、当該技術分野において周知のいかなる抗体の使用をも企図している。既知のがん抗体、並びに列挙される標的抗原に特異的な他の抗体及び第５．６．１節で列挙されるがん抗原に対する抗体の非限定例は第５．７．１節に記載され；自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び/又は予防のための既知の抗体、並びに列挙される標的抗原に対する抗体及び第5.6.2節で列挙される抗原に対する抗体の非限定例は、第5.7.2節に記載され； 他の実施形態では、第5.6.3節に列挙される感染症に関連するエピトープに対する抗体が使用され得る。ある実施形態では、抗体は１つ又は複数のアミノ酸改変を含む変異Ｆｃ領域を含み、該抗体は、野生型Ｆｃ領域を含む比較可能な分子と比較した場合に、本発明の方法によって、エフェクター機能が与えられ、及び／又はＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強され、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が減少されることが確認されている。本発明により設計することができる、炎症性疾患の治療又は予防に使用される抗体の非限定例は表９に記載され、自己免疫障害の治療又は予防に使用される抗体の非限定例は表１０に記載される。
抗体のヒトにおけるインビボでの使用及びインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの使用について、ヒト抗体、キメラ抗体の又はヒト化抗体に由来する可変ドメインを有するダイアボディを使用することが好ましい場合がある。完全ヒト抗体由来の可変ドメインは、ヒト対象の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野において周知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び同第４，７１６，１１１号；並びに国際公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することが可能で、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む、抗体、その変異体又はその断片である。ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に一致し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み得る。
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲ領域は親配列に正確に一致している必要はなく、例えば、ドナーＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失によって変異誘発された結果、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基（residue）がコンセンサス又はドナー抗体のいずれにも一致していなくてもよい。しかし、そのような変異は、広範でないことが好ましい。通常、ヒト化抗体残基（residue）の少なくとも７５％が親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列のそれに一致し、より頻繁には９０％、最も好ましくは９５％超が一致する。ヒト化抗体は当該技術分野において周知の種々の技術を用いて作製することができ、例えば、限定はされないが、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７；並びに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）又はリサーフェシング（resurfacinｇ）（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第５１９，５９６号；Padlan (1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties," Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues," Protein Engineering 7(6):805-814; and Roguska et al. (1994) "Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing," Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973）、鎖シャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）、及び、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，５８５，０８９号、国際公開番号ＷＯ９３１７１０５、Tan et al. (2002) "'Superhumanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28," J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al. (2000) "Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen," Protein Eng. 13:353-60, Morea et al. (2000) "Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design," Methods 20:267-79, Baca et al. (1997) "Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display," J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al. (1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing," Protein Eng. 9:895-904, Couto et al. (1995) "Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates," Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al. (1995) "Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization," Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies," Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains. Implication For Humanization Of Murine Antibodies," J. Mol. Biol. 235:959-973, Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525, Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327, and Presta (1992) "Antibody Engineering," Curr. Op. Biotech. 3(4):394-398に記載の技術が挙げられる。しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらのフレームワーク置換は当該技術分野において周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング、並びに特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって同定される。（例えば、Queen et al.、米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許出願公開第２００４／００４９０１４号及び同第２００３／０２２９２０８号；米国特許第６，３５０，８６１号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；及び同第５，５３０，１０１号、並びにRiechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327（これらは全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
最も好ましい実施形態では、ヒト化結合ドメインはドナーマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。本発明が概して抗体のＣＤＲグラフティングを包含することは、当業者に理解される。従って、ドナー抗体及びアクセプター抗体は、同種の動物由来であってもよく、さらには同じ抗体クラス又はサブクラスであってもよい。しかし、より一般的には、ドナー抗体及びアクセプター抗体は異種の動物由来である。典型的には、ドナー抗体はげっ歯類モノクローナル抗体等の非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
一部の実施形態では、ドナー抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲがヒト抗体に移植される。他の実施形態では、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域それぞれの少なくとも２つ、好ましくは３つ全てのＣＤＲが、ヒト抗体に移植される。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、構造ループＣＤＲ（structural loop CDR）又はそれらの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ移植重鎖及び少なくとも１つのＣＤＲ移植軽鎖を含むヒト化ＦｃγＲＩＩＢ抗体を包含する。
本発明の方法で使用されるダイアボディには、改変された（すなわち、ダイアボディへのあらゆる型の分子の共有結合による）誘導体が含まれる。例えば、限定が目的ではないが、ダイアボディ誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基（protecting/blocking group）による誘導体化、タンパク質切断、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結等によって改変されたダイアボディが含まれる。多数の化学修飾のいずれも、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むがこれらに限定はされない既知の技術によって、遂行することができる。さらに、誘導体は１つ又は複数の非古典的なアミノ酸（non-classical amino acid）を含有していてもよい。
キメラ抗体は、その抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子であり、例えば非ヒト抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体等である。キメラ抗体を作製する方法は当該技術分野において既知である。例えば、Morrison (1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies," Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) "Chimeric Antibodies," BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes," J. Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第６，３１１，４１５号、同第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、及び同第４，８１６，３９７号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらのフレームワーク置換は当該技術分野において周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング、並びに特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって同定される。（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；及びRiechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
本発明のダイアボディの結合ドメインを得ることができる抗体は、ハイブリドーマの使用、組換え技術、ファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせを含む当該技術分野において既知の種々様々な技術を用いることで作製することができる、モノクローナル抗体。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて作製することができ、当該技術分野において周知であり、且つ、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)（これらは共にその全体が参照によって組み込まれる）で教示されるハイブリドーマ技術が含まれる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語が指すものは、あらゆる真核生物、原核生物、又はファージのクローンを含む単一クローンに由来する抗体であって、それが作製される方法ではない。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製及びスクリーニングする方法は、当該技術分野においては、通例であり、よく知られている。非限定例において、目的の抗原又はそのような抗原を発現する細胞でマウスを免疫することができる。免疫応答を検出した後（例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出した後）、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によってあらゆる適切な骨髄腫細胞に融合する。ハイブリドーマを限界希釈によって選択及びクローニングする。次に、ハイブリドーマクローンを、当該技術分野において周知の方法によって、抗原と結合可能な抗体を分泌する細胞についてアッセイする。腹水は、通常高レベルの抗体を含有するが、これはマウス腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを播種することにより作製することができる。目的の抗原重要なとしては、限定はされないが、第５．８．１節に記載のがん関連抗原、第５．８．２節に記載の自己免疫疾患及び炎症性疾患の関連抗原、第５．８．３節に記載の感染症関連抗原、並びに第５．８．４節に記載の毒素が挙げられる。
抗体は、当該技術分野において周知の種々のファージディスプレイ法を用いても作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に、該ドメインが提示される。特定の実施形態では、そのようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される、Ｆａｂ及びＦｖ又はジスルフィド結合により安定化したＦｖ等の抗原結合領域を提示するために利用され得る。目的の抗原と結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識抗原又は固体表面又はビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて）、選択又は同定することができる。これらの方法で使用されるファージは典型的には繊維状ファージであり、ｆｄ及びＭ１３が含まれる。抗原結合領域は、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質又はファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン又はその断片を作製するのに使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmann et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al. (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins," J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments," Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Advances in Immunology, 57:191-280；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される方法が挙げられる。
ファージディスプレイ技術は、抗体の、その抗原に対する親和性を増加させるのに使用することができる。この技術は高親和性抗体を得る際に有用であるだろう。親和性成熟と称される技術は、変異誘発又はＣＤＲウォーキング（CDR walking）、及び初期の又は親の抗体と比較した場合に、抗原に対しより高い親和性で結合する抗体を同定するために同種抗原を用いる再選択を利用する（例えば、Glaser et al. (1992) "Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody," J. Immunology 149:2607-2614を参照）。単一ヌクレオチドよりむしろコドン全体の変異誘発によって、アミノ酸変異体の半無作為化レパートリーがもたらされる。各々が単一ＣＤＲ内の単一アミノ酸変化だけ異なり、且つ各ＣＤＲ残基に対して可能なアミノ酸置換をそれぞれ示す変異体を含有する、変異体クローンのプールから成るライブラリーを構築することができる。抗原に対する結合親和性が増加した変異体は、固定化した変異体を標識抗原と接触させることで、スクリーニングすることができる。抗原に対し増加した結合活性を有する変異抗体を同定するために、当該技術分野において周知のあらゆるスクリーニング法が使用可能である（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Wu et al. (1998) "Stepwise インビトロ Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb," Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037-6042; Yelton et al. (1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunology 155:1994-2004を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングも可能である（Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Bio. 263:551-567を参照）。
本発明は、フレームワーク領域又はＣＤＲ領域内に変異（例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換）を有する、本明細書に記載の、又は当該技術分野において周知の結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用も包含する。これらの結合ドメインにおける変異によって、結合ドメインの、それらが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する結合活性及び／又は親和性が維持又は増強されることが好ましい。当業者に既知の標準的な技術（例えば、免疫測定法）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
当業者に既知の標準的な技術を使用して、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができ、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲを介した変異誘発が含まれ、これらによりアミノ酸置換がもたらされる。誘導体は、元の抗体又はその断片と比較して、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、又は２個未満のアミノ酸置換を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、誘導体は、１つ又は複数の所定の非必須アミノ酸残基で起こった保存的アミノ酸置換を有する。
５．１．１ ＦｃγＲＩＩＢと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボディ
特定の実施形態では、本発明のダイアボディの結合ドメインのうち少なくとも１つは、少なくとも１つのＦｃγＲＩＩＢ活性を作動させる（agonize）。本発明の一実施形態では、前記活性は、Ｂ細胞受容体仲介性シグナル伝達の阻害である。別の実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１つもしくは複数の下流のシグナル伝達分子の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化又はＳＨＩＰ動員を増強する。本発明の更なる実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞受容体仲介性シグナル経路におけるＭＡＰキナーゼ活性又はＡｋｔ動員を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢを介したＦｃεＲＩシグナル伝達の阻害を作動させる。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、ＦｃεＲＩ誘導性肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、又はセロトニン放出を阻害する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を刺激し、ＳＨＩＰの動員を刺激し、ＳＨＩＰリン酸化及びＳＨＩＰのＳｈｃとの会合を刺激し、あるいはＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）の活性化を阻害する。さらに別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化、並びにｐ６２ｄｏｋのＳＨＩＰ及びｒａｓＧＡＰとの会合を増強する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、単球又はマクロファージにおけるＦｃγＲ仲介性貪食作用を阻害する。
別の実施形態では、結合ドメインは、少なくとも１つのＦｃγＲＩＩＢ活性を相殺する。一実施形態では、前記活性はＢ細胞受容体仲介性シグナル伝達の活性化である。特定の実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１つ又は複数の下流のシグナル伝達分子の活性を増強する。さらに別の特定の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化又はＳＨＩＰ動員を低減する。本発明の更なる実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞受容体仲介性シグナル経路におけるＭＡＰキナーゼ活性又はＡｋｔ動員を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢを介したＦｃεＲＩシグナル伝達の阻害を相殺する。特定の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃεＲＩ誘導性肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、又はセロトニン放出を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を阻害し、ＳＨＩＰの動員を阻害し、ＳＨＩＰリン酸化及びＳＨＩＰのＳｈｃとの会合を阻害し、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）の活性化を増強する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化並びにｐ６２ｄｏｋのＳＨＩＰ及びｒａｓＧＡＰとの会合を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、単球又はマクロファージにおけるＦｃγＲ仲介性貪食作用を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、脾臓マクロファージによる、貪食作用、オプソニン化した粒子のクリアランスを阻止する。
他の実施形態では、結合ドメインのうち少なくとも１つを使用して、ＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞に本発明のダイアボディを標的化することができる。
特定の一実施形態では、結合ドメインの１つは、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１及びＰＴＡ−４５９２を有するクローン２Ｂ６又は３Ｈ７によって産生されたマウスモノクローナル抗体に由来する。抗体２Ｂ６及び３Ｈ７を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（１０８０１、ユニバーシティー大通り（University Blvd.）、マナッサス、バージニア州、２０１１０−２２０９）に２００２年８月１３日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−４５９１（２Ｂ６を産生するハイブリドーマ）及びＰＴＡ−４５９２（３Ｈ７を産生するハイブリドーマ）がそれぞれ付与されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、結合ドメインは、ヒト結合ドメインであるか、又はヒト化されており、好ましくはクローン３Ｈ７又は２Ｂ６によって産生された抗体のヒト化バージョンに由来する。
本発明は、ＦｃγＲＩＩＢ、好ましくはヒトＦｃγＲＩＩＢ、より好ましくは天然のヒトＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９５８、ＰＴＡ−５９６１、ＰＴＡ−５９６２、ＰＴＡ−５９６０、及びＰＴＡ−５９５９を有する１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、及び１Ｆ２を含むがこれらに限定はされないクローンに由来する、他の抗体由来の結合ドメインを有するダイアボディも包含する。上記で同定されたクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づき、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（１０８０１、ユニバーシティー大通り、マナッサス、バージニア州、２０１１０−２２０９）に２００４年５月７日に寄託されており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、上記の抗体に由来する結合ドメインは、ヒト化結合ドメインである。
特定の実施形態では、本発明のダイアボディで使用される結合ドメインは、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生された抗体に由来し、又はその抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、好ましくは６つ全てのＣＤＲを含むもの）に由来する。別の実施形態では、結合ドメインは、それぞれクローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２から産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、及び／又は、例えばＥＬＩＳＡアッセイ又は他の適切な競合免疫測定法において決定されるように、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２から産生されるマウスモノクローナル抗体と競合し、また、結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと結合もする。
本発明は、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列に対し、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディも包含する。本発明はさらに、前記抗体又はその断片がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるマウスモノクローナル抗体の１つ又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列に対し、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一な１つ又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む、結合ドメインを有するダイアボディも包含する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む、当業者に既知のいかなる方法によっても決定することができる。
本発明は、結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされる、結合ドメインを含有するダイアボディの使用も包含する。好ましい実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、ストリンジェントな条件下でクローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されたマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされる可変軽鎖及び／又は可変重鎖を含む。別の好ましい実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されたマウスモノクローナル抗体の１つ又は複数のＣＤＲのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされる１つ又は複数のＣＤＲを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定はされないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でフィルター結合ＤＮＡ（filter-bound DNA）にハイブリダイズし、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約５０〜６５℃で１回又は複数回の洗浄をすること、６×ＳＳＣ中、約４５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイズし、続いて０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６０℃で１回又は複数回の洗浄すること等の高度にストリンジェントな条件、又は当業者に既知の他のあらゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY、頁6.3.1〜6.3.6及び2.10.3（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）が挙げられる。
本発明は、フレームワーク又はＣＤＲ領域内に変異（例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換）を有する上記結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用も包含する。これらの結合ドメイン内の変異によって、結合ドメインが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する、結合ドメインの結合活性及び／又は親和性が維持又は増強されることが好ましい。当業者に既知の標準的な技術（例えば、免疫測定法）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
当業者に既知の標準的な技術を使用して、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができ、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲを介した変異誘発が含まれ、これらによりアミノ酸置換がもたらされる。誘導体は、元の抗体又はその断片と比較して、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、又は２個未満のアミノ酸置換を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、誘導体は、１つ又は複数の所定の非必須アミノ酸残基で起こった保存的アミノ酸置換を有する。
好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体は、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に一致し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み得る。
本発明のダイアボディは、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域の１つ又は複数のＣＤＲの１つ又は複数の領域が、ＦｃγＲＩＩＡよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるモノクローナル抗体）の１つ又は複数のＣＤＲの類似部分によって置換されている、ＦｃγＲＩＩＢに対して特異的なヒト化可変ドメインを含む。他の実施形態では、ヒト化抗体は、それぞれ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２と同じエピトープに結合する。
好ましい実施形態では、ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインのＣＤＲ領域は、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なマウス抗体に由来する。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体は、アクセプター抗体（すなわち、ドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持するのに必要なヒトの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域）のアミノ酸の欠失、挿入、改変を含むがこれらに限定はされない、変化を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体のフレームワーク領域は、自然発生のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列から成ることを必ずしも必要としないが、ヒト化抗体の特性を変化させる（例えば、マウスＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体と同じ標的に対して特異的なヒト化抗体領域の結合特性を向上させる）アミノ酸の欠失、挿入、改変を含むがこれらに限定はされない、種々の変化を含有する。最も好ましい実施形態では、非ヒトフレームワーク残基の大規模な導入を避けるため、及びヒトにおけるヒト化抗体の最小の免疫原性を保証するために、最少数の変化がフレームワーク領域に作製される。ドナーモノクローナル抗体は、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
特定の実施形態では、結合ドメインは、前記抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲ移植抗体の可変ドメインを包含し、該ＣＤＲ移植抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基、及び前記抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるモノクローナル抗体）由来の残基を含む、重鎖可変領域ドメインを含む。別の特定の実施形態では、本発明のダイアボディは、前記抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲ移植抗体由来の可変ドメインを含み、該ＣＤＲ移植抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基、及び前記抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２によって産生されるモノクローナル抗体）由来の残基を含む、軽鎖可変領域ドメインを含む。
本発明において使用されるヒト化抗ＦｃγＲＩＩＢ可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号２４又は配列番号２５）及び／もしくはＣＤＲ２（配列番号２６又は配列番号２７）及び／もしくはＣＤＲ３（配列番号２８又は配列番号２９）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに／又はＣＤＲ１（配列番号３０又は配列番号３１）及び／もしくはＣＤＲ２（配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５）及び／もしくはＣＤＲ３（配列番号３６又は配列番号３７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有し得る。
特定の一実施形態では、ダイアボディは、ヒト化２Ｂ６抗体由来の可変ドメインを含み、そのＶＨ領域は、ヒト生殖系ＶＨセグメントのＶＨ１−１８（Matsuda et al. (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region Locus," J. Exp. Med. 188:2151-2162）及びＪＨ６（Ravetch et al. (1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes," Cell 27(3 Pt. 2): 583-91）由来のＦＲセグメント、並びに配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する、２Ｂ６ ＶＨの１つ又は複数のＣＤＲ領域から成る。一実施形態では、２Ｂ６ ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、２Ｂ６ ＶＨドメインは、Ｈｕ２Ｂ６ＶＨのアミノ酸配列（配列番号８５）を有し、配列番号８６のヌクレオチド配列によってコードされ得る。別の特定の実施形態では、ダイアボディはＶＬ領域をさらに含み、該ＶＬ領域は、ヒト生殖系ＶＬセグメントのＶＫ−Ａ２６（Lautner-Rieske et al. (1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Characterization Of The Duplicated A Regions," Eur. J. Immunol. 22:1023-1029）及びＪＫ４（Hieter et al. (1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes," J. Biol. Chem. 257:1516-22）のＦＲセグメント、並びに配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する２Ｂ６ＶＬの１つ又は複数のＣＤＲ領域から成る。一実施形態では、２Ｂ６ ＶＬは配列番号３９；配列番号４０、又は配列番号４１のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、２Ｂ６ ＶＬはＨｕ２Ｂ６ＶＬのアミノ酸配列（配列番号８７）を有し、配列番号８８に記載されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
別の特定の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化３Ｈ７抗体由来の可変ドメインを有し、そのＶＨ領域は、ヒト生殖系ＶＨセグメント由来のＦＲセグメント、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する３Ｈ７ ＶＨのＣＤＲ領域から成る。別の特定の実施形態では、ヒト化３Ｈ７抗体はＶＬ領域をさらに含み、該ＶＬ領域は、ヒト生殖系ＶＬセグメントのＦＲセグメント、及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する３Ｈ７ＶＬのＣＤＲ領域から成る。
具体的には、結合ドメインは、天然のヒトＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインに免疫特異的に結合し、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１、又は１Ｆ２のＣＤＲ配列を、以下の組み合わせのいずれかで含む（あるいは、から成る）：ＶＨ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ１；ＶＨ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ１；ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＨ ＣＤＲ１；ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ１ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ１；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ１；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ２；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３；ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３；又は本明細書で開示されるＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ ＣＤＲのそのあらゆる組み合わせ。
本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインが由来する抗体を、エピトープマッピングによってさらに特徴付けることができ、それによりＦｃγＲＩＩＡと比較してＦｃγＲＩＩＢに対し最も大きな特異性を有する抗体を選択することができる。抗体のエピトープマッピング法は当該技術分野において周知であり、本発明の方法に包含される。ある実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープマッピングに使用することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分に融合したＦｃγＲＩＩＢの領域のアミノ酸配列を含有する。各融合タンパク質は、下の表２に示される、アミノ酸置換及び／又は受容体のある領域と相同受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ）由来の対応領域との置換をさらに含み得る。ｐＭＧＸ１２５及びｐＭＧＸ１３２は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のＩｇＧ結合部位を含有し、前者はＦｃγＲＩＩＢのＣ末端を含有し、後者はＦｃγＲＩＩＡのＣ末端を含有し、Ｃ末端結合に差異を生じさせるために使用することができる。その他のものは、ＩｇＧ結合部位にＦｃγＲＩＩＡ置換、及びＦｃγＩＩＡ又はＦｃγＩＩＢいずれかのＮ末端を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役立つことができる。
融合タンパク質は、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体（例えば、ＥＬＩＳＡ）に対する結合を決定するための、いかなる生化学分析にも使用することができる。他の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ配列由来のもので置換された特定の残基を有するペプチドを用いることで、エピトープ特異性のさらなる確認を行うことができる。
本発明の抗体の機能、特に、ＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達を調節する活性を同定するためのアッセイを用いて、抗体を特徴付けすることができる。例えば、本発明の特徴付けアッセイは、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフにおけるチロシン残基のリン酸化の測定、又はＢ細胞受容体により発生するカルシウム動員の阻害の測定が可能である。本発明の特徴付けアッセイは、細胞に基づくアッセイであっても、無細胞系のアッセイであってもよい。
肥満細胞において、ＦｃγＲＩＩＢと高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩとの共凝集により、抗原誘導性の脱顆粒、カルシウム動員、及びサイトカイン産生の阻害がもたらされることは、当該技術分野において確証されている（Metcalfe D.D. et al. (1997) "Mast Cells," Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors," Annu. Rev. Immunol. 17: 875-904）。このシグナル経路の分子に関する詳細は最近になって解明された（Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling," J. Immunol. 162(9):4430-4439）。ＦｃεＲＩと共凝集した後、ＦｃγＲＩＩＢは、そのＩＴＩＭモチーフ内のチロシンにおいて迅速にリン酸化され、その後Ｓｒｃホモロジー２含有イノシトール−５−ホスファターゼ（Src Homology-2 containing inositol-5-phosphatase）（ＳＨＩＰ）、ＳＨ２ドメイン含有イノシトールポリリン酸５−ホスファターゼ（SH2 domain-containing inosital polyphosphate 5-phosphatase）を動員し、それが今度はリン酸化され、Ｓｈｃ及びｐ６２ｄｏｋと会合する（ｐ６２ｄｏｋはアダプター分子ファミリーの代表例であり、アミノ末端のプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）、ＰＴＢドメイン、並びにＰＸＸＰモチーフ及び多数のリン酸化部位を含有するカルボキシ末端領域等のシグナル伝達ドメインを含む）（Carpino et al. (1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells," Cell, 88: 197-204; Yamanshi et al. (1997) "Identification Of The Abl- And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok," Cell, 88:205-211）。
本発明で使用するための抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、１つ又は複数のＩｇＥ仲介性応答を調節する能力について、同様に特徴付けすることができる。ＩｇＥ仲介性応答を調節することにおける抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の特徴付けに、ＩｇＥに対する高親和性受容体及びＦｃγＲＩＩＢに対する低親和性受容体を共発現する細胞株を使用することが好ましい。特定の実施形態では、完全長ヒトＦｃγＲＩＩＢを形質移入されたラット好塩基球性白血病細胞株由来の細胞（ＲＢＬ−Ｈ２３；Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol.11:317-323（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））が使用される。ＲＢＬ−２Ｈ３は、ＩｇＥを介した細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するために広く使用されている、十分に特徴付けされたラット細胞株である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞中で発現され、ＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃεＲＩ誘導性のカルシウム動員、脱顆粒、及びサイトカイン産生を阻害する（Malbec et al. (1998) "Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation," J. Immunol. 160:1647-1658; Daeron et al. (1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors," J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling," J. Immunol. 162(9):4430-4439）。
ＦｃεＲＩ誘導性の肥満細胞活性化の阻害について、本発明で使用するための抗体を特徴付けすることもできる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢを形質移入されたラット好塩基球性白血病細胞株由来の細胞（ＲＢＬ−Ｈ２３；Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol.11:317-323）を、ＩｇＥで感作し、ＦｃεＲＩ単独を凝集させるためのウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ'）２断片で、又はＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃεＲＩを共凝集させるための全ウサギ抗マウスＩｇＧで刺激する。この系では、細胞を感作及び刺激するために本発明の抗体を添加した際の、下流シグナル伝達分子の間接的な調節をアッセイすることができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化並びにＳＨＩＰの動員及びリン酸化、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、又はｐ３８を含むがこれらに限定はされないＭＡＰキナーゼファミリーメンバーの活性化；並びにｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化及びｐ６２ｄｏｋのＳＨＩＰ及びＲａｓＧＡＰとの会合をアッセイすることができる。
本発明の抗体によるＦｃεＲＩ誘導性肥満細胞活性化の阻害を決定するための代表的なアッセイは、以下から成り得る：ＲＢＬ−Ｈ２３細胞にヒトＦｃγＲＩＩＢを形質移入し；該ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をＩｇＥで感作し；ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ'）２で刺激するか（対照として、ＦｃεＲＩ単独を凝集させ、ＦｃεＲＩ仲介性シグナル伝達を誘発させるため）、又はＲＢＬ−Ｈ２３細胞を全ウサギ抗マウスＩｇＧで刺激すること（ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃεＲＩを共凝集させることで、ＦｃεＲＩ仲介性シグナル伝達を阻害するため）。全ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で刺激された細胞は、さらに、本発明の抗体と一緒にプレインキュベートされ得る。本発明の抗体と共にプレインキュベートされた細胞及び本発明の抗体と共にプレインキュベートされなかった細胞のＦｃεＲＩ依存性活性の測定、並びにこれらの細胞におけるＦｃεＲＩ依存性活性のレベルの比較により、本発明の抗体によるＦｃεＲＩ依存性活性の調節が示されるであろう。
上記の代表的なアッセイを使用して、例えば、リガンド（ＩｇＧ）がＦｃγＲＩＩＢ受容体に結合することを阻止し、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃεＲＩの共凝集を阻止することによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢを介した阻害を相殺する抗体を同定することができる。このアッセイにより、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃεＲＩの共凝集を増強し、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃεＲＩの共凝集を促進することによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢを介した阻害を作動する抗体が、同様に同定される。
一部の実施形態では、本発明の、本明細書に記載の又は当該技術分野において周知の、同定された抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体のエピトープ結合ドメインを含む抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、ＩｇＥ仲介性応答を調節する抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディの能力について、肥満細胞又は好塩基球の脱顆粒を、好ましくは細胞機能性試験において、モニター及び／又は測定することによって特徴付けされる。そのようなアッセイで使用するための肥満細胞又は好塩基球は、当業者に既知の標準的な組換え法を用いてヒトＦｃγＲＩＩＢを含有するように操作されていることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、ＩｇＥ仲介性応答を調節するそれらの能力について、細胞に基づくβヘキソサミニダーゼ（顆粒に含有される酵素）放出アッセイにおいて特徴付けされる。肥満細胞及び好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ放出は、急性アレルギー性疾患及び炎症性疾患における初期事象である（Aketani et al. (2001) "Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen-Specific IgEs," Immunol. Lett. 75: 185-189; Aketani et al. (2000) "A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling," Anal. Chem. 72: 2653-2658）。本発明の方法に従って、セロトニン及びヒスタミンを含むがこれらに限定はされない他の炎症性メディエーターの放出をアッセイして、ＩｇＥ仲介性応答を測定することができる。特定の作用機序に拘束されることを意図するものではないが、肥満細胞及び好塩基球から生じたβヘキソサミニダーゼを含有するもの等の顆粒の放出は、ＦｃγＲＩｓと多価抗原の架橋結合によって惹起される、細胞内カルシウム濃度に依存するプロセスである。
ヒト肥満細胞を研究する能力は、適切な長期ヒト肥満細胞培養物が存在しなかったことにより、制限されてきた。近年、ＬＡＤ１及びＬＡＤ２と命名された、２種の新規幹細胞因子依存性ヒト肥満細胞株が、肥満細胞肉腫／白血病を有する患者より得られた骨髄穿刺液から樹立された（Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI," Leukemia research, 27:677-82（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。両細胞株は、ＦｃεＲＩ及びいくつかのヒト肥満細胞マーカーを発現すると報告されている。ＬＡＤ１細胞及びＬＡＤ２細胞は、ＩｇＥ仲介性応答に対する本発明の抗体の影響を評価するために使用することができる。特定の実施形態では、上記のような細胞に基づくβヘキソサミニダーゼ放出アッセイをＬＡＤ細胞において使用することで、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体によるＩｇＥ仲介性応答のいかなる調節をも決定することができる。代表的なアッセイでは、ヒト肥満細胞（例えば、ＬＡＤ１）がキメラヒトＩｇＥ抗ニトロフェノール（ＮＰ）で初回抗原刺激され、多価抗原であるＢＳＡ−ＮＰに暴露され、上清中に放出されたβヘキソサミニダーゼを測定することによって、細胞脱顆粒がモニターされる（Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI," Leukemia research, 27:677-82（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
一部の実施形態では、当該技術分野において周知の標準方法（例えば、ＦＡＣＳ染色）を用いることで決定される、ヒト肥満細胞の内在性ＦｃγＲＩＩＢの発現量が少ない場合、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディによって仲介される阻害経路の活性化における差異をモニター及び／又は検出することは困難である場合がある。従って、本発明は別の方法を包含し、その方法によってサイトカイン及び特定の増殖条件を用いることでＦｃγＲＩＩＢ発現が上方制御され得る。ＦｃγＲＩＩＢは、ヒト単球細胞株（例えば、ＴＨＰ１及びＵ９３７）（Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089）及び初代ヒト単球（Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines," J. of Immunol., 166: 531-537）において、ＩＬ-４によって高度に上方制御されることが報告されている。ジブチリルサイクリックＡＭＰを用いたＵ９３７細胞の分化は、ＦｃγＲＩＩの発現を増加させることが報告されている（Cameron et al. (2002) "Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor, FcgammaRIIB," Immunology Letters 83, 171-179）。従って、検出の感度を増強するために、サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）を用いて、本発明の方法で使用するためのヒト肥満細胞における内在性ＦｃγＲＩＩＢの発現を上方制御することができる。
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）仲介性シグナル伝達の阻害について、抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディをアッセイすることもできる。ＢＣＲ仲介性シグナル伝達は、Ｂ細胞の活性化及び増殖、抗体産生等の、少なくとも１つ又は複数の下流の生物学的反応を含み得る。ＦｃγＲＩＩＢ及びＢＣＲの共凝集により、細胞周期進行及び細胞生存の阻害がもたらされる。さらに、ＦｃγＲＩＩＢ及びＢＣＲの共凝集により、ＢＣＲ仲介性シグナル伝達の阻害がもたらされる。
具体的には、ＢＣＲ仲介性シグナル伝達は、以下のうちの少なくとも１つ又は複数を含む：下流シグナル伝達分子の調節（例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態、ＳＨＩＰ動員、Ｂｔｋ及び／又はＰＬＣγの局在化、ＭＡＰキナーゼ活性、Ａｋｔ動員（抗アポトーシス性シグナル）、カルシウム動員、細胞周期進行、及び細胞増殖）。
ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害の多数のエフェクター機能はＳＨＩＰを通じて仲介されるが、近年、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞が、カルシウム動員、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３産生、並びにＥｒｋ及びＡｋｔのリン酸化の有意なＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を示すことが明らかにされた（Brauweiler et al. (2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells," Journal of Immunology, 167(1): 204-211）。従って、ＳＨＩＰ欠損マウス由来の生体外Ｂ細胞を使用して、本発明の抗体を特徴付けることができる。本発明の抗体によるＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を決定するための代表的なアッセイは、以下を含み得る：ＳＨＩＰ欠損マウスからの脾臓Ｂ細胞の単離、リポ多糖での前記細胞の活性化、及びＢＣＲを凝集させるためのＦ（ａｂ'）２抗ＩｇＭでの、又はＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させるための抗ＩｇＭでの前記細胞の刺激。ＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させるためのインタクトな抗ＩｇＭで刺激された細胞は、さらに、本発明の抗体と共にプレインキュベートされ得る。細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性活性は、当該技術分野において既知の標準的な技術によって測定することができる。前記抗体と共にプレインキュベートされた細胞及びプレインキュベートされていない細胞におけるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性のレベルの比較、並びに前記レベルの比較によって、抗体によるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の調節が示されるだろう。
ＦｃγＲＩＩＢ依存性活性測定には、例えば、フローサイトメトリーによる細胞内カルシウム動員の測定、Ａｋｔ及び／又はＥｒｋのリン酸化測定、ＢＣＲを介したＰＩ（３，４，５）Ｐ３蓄積の測定、又はＦｃγＲＩＩＢを介したＢ細胞増殖の測定が含まれ得る。
これらのアッセイは、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対するリガンド（ＩｇＧ）結合部位を遮断し、ＦｃγＲＩＩＢ及びＢＣＲの共凝集を阻止することによりＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を相殺することで、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を調節する、本発明で使用するためのダイアボディ又は抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を同定するために、使用することができる。これらのアッセイは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＢＣＲの共凝集を増強し、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を作動させる抗体を同定することにも使用することができる。
ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩ仲介性シグナル伝達について、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体をアッセイすることもできる。ＦｃγＲＩＩＢと、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する受容体との共凝集は、ＳＨＩＰをそのエフェクターとして用いるＦｃγＲ仲介性貪食作用を下方制御するように作用する（Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089）。ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの共凝集は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、それによって、ＳＨＩＰリン酸化の増強、ＳＨＩＰとＳｈｃとの会合、及び１２０及び６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化が生じる。さらに、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの共凝集は、細胞制御に関わり、アポトーシス抑制に機能するセリン−トレオニンキナーゼである、Ａｋｔリン酸化の下方制御をもたらす。
ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ仲介性貪食作用の阻害について、抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディをアッセイすることもできる。例えば、ヒト単球細胞株由来の細胞であるＴＨＰ−１は、（ＦｃγＲＩＩＡ単独を凝集させるための）ＦｃγＲＩＩに対するマウスモノクローナル抗体ＩＶ．３のＦａｂフラグメント及びヤギ抗マウス抗体を用いて、又は（ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを共凝集させるための）全ＩＶ．３マウスモノクローナル抗体及びヤギ抗マウス抗体を用いて、刺激することができる。この系において、活性化細胞への本発明の分子の添加後に、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化、ＳＨＩＰのリン酸化、ＳＨＩＰ及びＳｈｃの会合、Ａｋｔのリン酸化、並びに１２０及び６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化等の、下流シグナル伝達分子の調節をアッセイすることができる。さらに、単球細胞株のＦｃγＲＩＩＢ依存性貪食作用の効率を、本発明の抗体の存在下及び非存在下で、直接的に測定することができる。
本発明の抗体によるヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ仲介性貪食作用の阻害を決定するための別の代表的なアッセイは、以下を含み得る：ＩＶ．３マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体のＦａｂ及びヤギ抗マウス抗体（ＦｃγＲＩＩＡ単独を凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ仲介性シグナル伝達を誘発するため）で；又はマウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体及びヤギ抗マウス抗体（ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを共凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ仲介性シグナル伝達を阻害するため）で、ＴＨＰ−１細胞を刺激。マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体及びヤギ抗マウス抗体で刺激された細胞は、さらに、本発明の分子と共にプレインキュベートされ得る。本発明の分子と共にプレインキュベートされた活性化細胞及び本発明の抗体と共にプレインキュベートされなかった細胞のＦｃγＲＩＩＡ依存性活性を測定し、これらの細胞におけるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性レベルを比較することより、本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節が示されるだろう。
上記の代表的なアッセイを用いて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合を遮断し、且つＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＡの共凝集を阻止することによりＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を相殺する結合ドメインを同定することができる。このアッセイによって、同様に、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＡの共凝集を増強し、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を作動させる結合ドメインが同定される。
対象となるＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインは、以前に報告された方法により、蛍光標識化ＩｇＧオプソニン化ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによって、アッセイされ得る（Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: 20480-7）。例えば、貪食作用を測定するための代表的なアッセイは、ＴＨＰ−１細胞を本発明の抗体で、又はＦｃγＲＩＩに結合しない対照抗体で処理し、前記細胞の活性レベルを比較することから成り、これらの細胞の活性（例えば、ロゼット形成活性（ＩｇＧで被覆されたＳＲＢＣと結合しているＴＨＰ−１細胞の数）、粘着性活性（ＴＨＰ−１細胞に結合したＳＲＢＣの総数）、及び貪食作用の速度）における差異によって、本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節が示されるだろう。このアッセイは、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合を遮断し、貪食作用のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を相殺する抗体を同定するのに使用することができる。このアッセイによって、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害を増強する抗体を同定することができる。
好ましい実施形態では、結合ドメインは、以下の方法のうちの少なくとも１つ又は複数で、ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性を調節する：下流シグナル伝達分子の調節（例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態の調節、ＳＨＩＰリン酸化の調節、ＳＨＩＰ及びＳｈｃの会合の調節、Ａｋｔリン酸化の調節、約１２０及び６０〜６５ｋＤａのさらなるタンパク質のリン酸化の調節）、及び貪食作用の調節。
５．１．２ ＣＤ１６Ａ結合ドメイン
以下の節では、共有結合性ダイアボディ作製のための、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の源として使用され得るＣＤ１６Ａ結合タンパク質について考察する。本発明では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質には、抗ＣＤ１６Ａ抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む分子が含まれ、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは本発明のダイアボディの作製において使用される。
本発明に関連して、種々のＣＤ１６Ａ結合タンパク質を使用することができる。適切なＣＤ１６Ａ結合タンパク質には、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体、及びＣＤ１６Ａ結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ又は一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、ミニボディ）、並びに軽鎖可変領域ドメイン、重鎖可変領域ドメイン又は両方との相互作用を介してＣＤ１６Ａに結合する別の抗体様タンパク質が含まれる。
一部の実施形態では、本発明に従って使用するためのＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、マウス抗ＣＤ１６Ａ抗体等の非ヒト抗ＣＤ１６Ａ抗体由来の配列を有する１つ又は複数のＣＤＲ、及び１つ又は複数のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する配列を有する１つ又は複数のフレームワーク領域を有するＶＬドメイン及び／又はＶＨドメインを含む。ＣＤＲ及び他の配列を得ることができる、いくつかの非ヒト抗ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体が知られている（例えば、Tamm et al. (1996) "The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding," J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al. (1989) p.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al., eds. New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francisを参照）。さらに、実施例で示されるように、細胞上に発現されるヒトＣＤ１６Ａを認識する新規ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、モノクローナル抗体又は関連する結合タンパク質を作製及び選択するための周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ等）を用いて得ることができる。例えば、O'Connell et al. (2002) "Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies," J. Mol. Biol. 321:49-56; Hoogenboom et al. (2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology," Imm. Today 21:371078; Krebs et al. (2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies," J. Imm. Methods 254:67-84；及び本明細書で引用される他の参考文献を参照されたい。ヒト以外の種由来のモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の抗体ヒト化技術を用いて、キメラ化又はヒト化することができる。
あるいは、ＣＤ１６Ａに対する完全ヒト抗体は、ヒト免疫系の要素を有する遺伝子導入動物を用いて（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号及び同第５，５４５，８０６号を参照）、ヒト末梢血細胞（Casali et al. (1986) "Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV," Science 234:476-479）を用いて、Huse et al. (1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda," Science 246:1275-1281によって概説される一般プロトコルに従ってヒトＢ細胞から得られたＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、及び他の方法によって、作製することができる。
好ましい実施形態では、結合ドナーは、３Ｇ８抗体又はそのヒト化バージョン、例えば、米国特許出願公開第２００４／００１０１２４号（そ全体が参照することによって本願に組み込まれる）で開示されたもの等に由来する。いくつかの目的のために、３Ｇ８が結合する同じエピトープで、又は少なくとも３Ｇ８による結合を遮断するのに十分なだけこのエピトープに近い位置で、ＣＤ１６Ａ受容体と結合するＣＤ１６Ａ結合タンパク質を使用することは、有利であり得ると考えられる。所望の結合特性を有する結合タンパク質を同定するためのエピトープマッピング及び競合的結合の実験に用いる方法は、実験免疫学の当業者に周知である。例えば、Harlow and Lane, cited supra; Stahli et al. (1983) "Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies," Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al. (1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies," J. Immunol. 137:3614-3619; Morel et al. (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations," Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al. (1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks," Virology 176:546-552; and Moldenhauer et al. (1990) "Identity Of HML-1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia," Scand. J. Immunol. 32:77-82を参照されたい。例えば、２つの抗体が同じ部位に結合するかどうかは、これらの抗体のうち一方を用いてＥＬＩＳＡプレート上の抗原を捕捉し、次に捕捉された抗原に対する第二の抗体の結合能を測定することによって、決定することが可能である。エピトープ比較は、酵素、放射性核種又はフルオロフォアで直接的又は間接的に第一の抗体を標識し、細胞上の、溶液中の、又は固相上の抗原に対する第一抗体の結合を阻害する未標識第二抗体の能力を測定することによっても、達成することもできる。
ＥＬＩＳＡプレート上で形成された免疫複合体に対するＣＤ１６Ａ受容体の結合を遮断する、抗体の能力を測定することも可能である。そのような免疫複合体は、最初にプレートをフルオレセイン等の抗原と接触させ、次に特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートに添加することによって形成される。その後、この免疫複合体は、ｓＦｃＲＩＩＩａ等の可溶性Ｆｃ受容体に対するリガンドとして機能する。あるいは、可溶性の免疫複合体が形成され、酵素、放射性核種又はフルオロフォアで直接的又は間接的に標識されてもよい。その後、細胞上、溶液中又は固相上のＦｃ受容体に対するこれらの標識免疫複合体の結合を阻害する抗体の能力を測定することができる。
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含んでいても含んでいなくてもよい。Ｆｃ領域は、例えば、ｓｃＦｖ結合タンパク質中には存在しない。Ｆｃ領域は、例えば、ヒト又はヒト化四量体モノクローナルＩｇＧ抗体中に存在する。上記のように、本発明の一部の実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、未変化のＦｃ領域（例えば、自然発生のＩｇＧ１タンパク質のＦｃ）と比較した場合に、変化したエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分等のエフェクターリガンドに対する親和性の低減）を有するＦｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、２９７位に対応するＦｃ領域アミノ酸でグリコシル化されていない。そのような抗体はＦｃエフェクター機能が欠如している。
従って、他の場合においては、結合又はエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域における変化が原因であるが、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質がＦｃ受容体又は補体のＣ１成分等のエフェクターリガンドに対するＦｃ仲介性結合を示さないのは、結合タンパク質にＦｃドメインが存在しないためであり得る。
５．１．２．１ モノクローナル抗体３Ｇ８のＣＤＲ配列と類似したＣＤＲ配列を含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質
本発明の実践に使用され得るＣＤ１６Ａ結合タンパク質には、マウスモノクローナル抗体３Ｇ８のＣＤＲ由来のＣＤＲ配列を含む（すなわち、それと同一又は類似の配列を有する）タンパク質が含まれる。ＣＤＲコード配列を含む、マウス３Ｇ８モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする相補的なｃＤＮＡをクローニングし、記載の通りに配列決定した。３Ｇ８の核酸配列及びタンパク質配列を以下に記載する。マウスの可変領域及びＣＤＲ配列を用いて、３Ｇ８のＣＤＲに由来する相補性決定領域を含む多数のキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を分析した。高い親和性でＣＤ１６Ａと結合し、他の望ましい特性を有するヒト化抗体を同定するために、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＨ領域を含む抗体重鎖を作製し、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＬ領域を含む抗体軽鎖と（共発現により）組み合わせることで、分析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の特性を、下記の通りに決定した。下記の通り、本明細書に記載のヒト化抗体タンパク質等の、３Ｇ８のＣＤＲを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、本発明に従って使用することができる。
５．１．２．１．１ ＶＨ領域
一態様では、本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８重鎖のＣＤＲ（より典型的には３つ全てのＣＤＲ）の配列を有し、結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒト（１つ又は複数のヒト抗体の重鎖可変領域に由来し実質的に類似した）である、重鎖可変ドメインを含み得る。
一態様において、本発明は、実質的にヒトフレームワークに３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含有するが、重鎖可変ドメインのＣＤＲのうち少なくとも１つは対応するマウス抗体３Ｇ８重鎖ＣＤＲと配列において異なっている、ヒト化３Ｇ８抗体又は抗体断片を提供する。例えば、一実施形態において、前記ＣＤＲは、少なくとも、当該技術分野において既知であるように、又は
３及び表４Ａ〜Ｈに開示されるように、３Ｇ８のＣＤ１６Ａへの結合に影響することが当該技術分野で示され、知られている、１つ又は複数のＣＤＲ置換を有することにより、３Ｇ８のＣＤＲ配列と異なっている。適切なＣＤ１６結合タンパク質は、これらの置換を０、１、２、３、もしくは４個、又はより多く含んでいてもよく（しばしば、これらの置換を１〜４個有する）、所望によりさらなる置換を有していてもよい。



一実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１コンストラクトのＶＨドメインと同一又は類似の重鎖可変ドメイン配列を含んでいてもよく、その配列は配列番号６８に提供される。例えば、本発明は、（１）０、１、又は２つ以上の表１記載のＣＤＲ置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメイン（配列番号６８）と異なり；（２）０、１又は２つ以上の表１記載のフレームワーク置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインと異なり；（３）残りの位置ではＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨ配列に対して、少なくとも約８０％同一の、しばしば少なくとも約９０％同一の、時に少なくとも約９５％同一の、又は少なくとも約９８％同一ですらある、配列を有するＶＨドメインを含む、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
本発明のＣＤ１６結合タンパク質のＶＨドメインの例は、３Ｇ８ＶＨ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５及びＨｕ３Ｇ８ＶＨ−２２の配列（それぞれ、配列番号７９、配列番号６９及び配列番号７０）を有する。３Ｇ８ＶＨ及びＨｕ３Ｇ８ＶＨ−５の配列（それぞれ、配列番号７９及び配列番号６９）をコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ、配列番号８０及び配列番号８１で提供される。
ＶＨドメインは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６個の表３に示される置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号６８）の配列と異なる配列を含んでいてもよい。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増加及び／又はヒトに投与された場合のＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性の低減をもたらすと考えられている。ある実施形態では、残りの位置におけるＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインとの配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％である。
説明のためであり限定を目的とはしないが、いくつかのＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＨドメインの配列を表４に示す。ヒトＣγ１定常領域に融合したこれらの配列を含む重鎖をｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１軽鎖（下記）と共発現させて四量体抗体を形成し、その抗体のＣＤ１６Ａへの結合を測定し、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインと比較した場合のアミノ酸置換の影響を評価した。ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、２、３、４、５、８、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４３、４４及び４５の配列を有するコンストラクトは高親和性結合を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−６及びｈｕ３Ｇ８ＶＨ−４０のＶＨドメインは中間の結合（intermediate binding）を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５及びｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２のＶＨドメイン（それぞれ、配列番号６９及び配列番号７０）を含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に有利な結合特性を有すると考えられている。
５．１．２．２ ＶＬ領域
有利な結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を特定するために、同様の研究を行った。一態様では、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖のＣＤＲ（より典型的には３つ全てのＣＤＲ）の配列を有し、結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトである（１つ又は複数のヒト抗体の重鎖可変領域に由来し実質的に類似する）、軽鎖可変ドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
一態様では、本発明は、実質的ヒトフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含有するが、軽鎖可変ドメインのＣＤＲのうち少なくとも１つはマウスモノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖ＣＤＲと配列において異なっている、ヒト化３Ｇ８抗体の断片を提供する。一実施形態では、ＣＤＲは、少なくとも、表２に示される１つ又は複数の置換（例えば、ＣＤＲ１中２４位のアルギニン；ＣＤＲ１中２５位のセリン；ＣＤＲ１中３２位のチロシン；ＣＤＲ１中３３位のロイシン；ＣＤＲ２中５０位のアスパラギン酸、トリプトファン又はセリン；ＣＤＲ２中５３位のセリン；ＣＤＲ２中５５位のアラニン又はグルタミン；ＣＤＲ２中５６位のトレオニン；ＣＤＲ３中９３位のセリン；及び／又はＣＤＲ３中９４位のトレオニン）等の、ＣＤＲ内の１つ又は複数のアミノ酸置換を有することによって、３Ｇ８配列と異なる。種々の実施形態では、可変ドメインは、０、１、２、３、４、５、又はそれ以上のこれらの置換を有する可能性があり（しばしば、１〜４個のこれらの置換を有する）、所望により、さらなる置換を有する可能性もある。
一実施形態では、適切なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）コンストラクトのＶＬドメインと同一又は類似の軽鎖可変ドメイン配列を含む場合があり、その配列は表６に提供される。例えば、本発明は、（１）０、１、又はそれ以上の表５に記載のＣＤＲ置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメイン（配列番号７１）と異なり；（２）０、１又はそれ以上の表５に記載のフレームワーク置換によってＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメインと異なり；（３）残りの位置ではＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬ配列（配列番号７１）に対して、少なくとも約８０％同一の、しばしば少なくとも約９０％同一の、時に少なくとも約９５％同一の、又は少なくとも約９８％同一ですらある、配列を有するＶＬドメインを含む、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。


本発明のＣＤ１６結合タンパク質のＶＬドメインの例は、表５及び表６に示される、３Ｇ８ＶＬ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１又はＨｕ３Ｇ８ＶＬ−４３の配列（それぞれ、配列番号８２、配列番号７１及び配列番号７２）を有する。３Ｇ８ＶＬ（配列番号８２）及びＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）をコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ、配列番号８３及び配列番号８４に提供される。
ＶＬドメインは、０、１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、又は少なくとも９個の表２に示される置換によって、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１の配列（配列番号７１）と異なる配列を含んでいてもよい。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増加及び／又はヒトに投与された場合のＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性の低減をもたらすと考えられている。ある実施形態では、残りの位置における配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％である。
説明のためであり限定を目的とはしないが、いくつかのＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶLドメインの配列を表６に示す。ヒトCκ定常ドメインに融合したこれらの配列を含む軽鎖をｈｕ３Ｇ８ＶＨ重鎖（上記）と共発現させて四量体抗体を形成し、その抗体のＣＤ１６Ａへの結合を測定し、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメイン（配列番号７１）と比較した場合のアミノ酸置換の影響を評価した。ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、２、３、４、５、１０、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２７、２８、３２、３３、３４、３５、３６、３７及び４２の配列を有するコンストラクトは高親和性結合を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１５、１７、２０、２３、２５、２６、２９、３０、３１、３８、３９、４０及び４１の配列を有するコンストラクトは中間の結合（intermediate binding）を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２、及びｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３のＶＬドメイン（それぞれ、配列番号７１、配列番号７３及び配列番号７２）を含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に有利な結合特性を有すると考えられている。
５．１．２．２．１ ＶＬドメイン及び／又はＶＨドメインの組み合わせ
当該技術分野において既知であり、本明細書の他の場所に記載されるように、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それらが会合してダイアボディを生成する条件下で組換え発現することが可能であり、あるいは、インビトロでそのように組み合わせることが可能である。従って、本明細書に記載の３Ｇ８由来ＶＬドメインを本明細書に記載の３Ｇ８由来ＶＨドメインと組み合わせて、ＣＤ１６Ａ結合ダイアボディを生成できることは明らかであり、すべてのそのような組み合わせは企図されている。
説明のためであって限定が目的ではないが、有用なＣＤ１６Ａダイアボディの例は、少なくとも１つのＶＨドメイン及び少なくとも１つのＶＬドメインを含み、該ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２又はｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５由来であり（それぞれ、配列番号６８、配列番号７０及び配列番号６９）、該ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２又はｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３由来である（それぞれ、配列番号７１、配列番号７３及び配列番号４１）、ＣＤ１６Ａダイアボディである。特に、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（配列番号２２）及びｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２もしくはｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ配列番号７１、配列番号７０及び配列番号７２）のいずれかを含むヒト化抗体、又はｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（配列番号６９）及びｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）を含むヒト化抗体は、有利な特性を有する。
本明細書に記載のＶＬドメイン及びＶＨドメインの配列を、親和性成熟等の当該技術分野において既知の方法によってさらに改変できることは、当業者には明らかである（Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567; Daugherty et al. (1998) "Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display," Protein Eng. 11:825-832; Boder et al. (1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries," Nat. Biotechnol. 15:553-557; Boder et al. (2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97:10701-10705; Hudson et al. (2003) "Engineered Antibodies," Nature Medicine 9:129-39を参照）。例えば、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに対する親和性が増加したタンパク質及び／又はＣＤ１６Ｂに対する親和性が低減したタンパク質を同定するために、親和性成熟技術を用いて改変され得る。
ＣＤ１６結合タンパク質の一例は、マウス３Ｇ８抗体である。ヒト化３Ｇ８のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むアミノ酸配列は、図２、９、１４に記載され、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載される。
５．２ Ｆｃ領域又はその一部を含むダイアボディ
本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部（例えば、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。ある実施形態では、Ｆｃドメイン、又はその一部は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域の１つ又は複数の定常領域（例えば、ＣＨ２又はＣＨ３）を含む。他の実施形態では、本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部を含み、前記Ｆｃドメイン又はその一部が比較可能な野生型Ｆｃドメイン又はその一部と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換）を含む、分子を包含する。変異型Ｆｃドメインは当該技術分野において周知であり、当該技術分野において周知の結合活性アッセイ又はエフェクター機能アッセイのいずれか（例えばＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ分析、又はＡＤＣＣ）においてアッセイされるように、前記変異型Ｆｃドメインを含む抗体の表現型を変更するために主に使用される。そのような変異型Ｆｃドメイン、又はその一部は、例えば、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるように、Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能を与える又は調節することにより、本発明における用途を有する。エフェクター機能を変更することが確認されたＦｃドメイン変異体は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号及び同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日に出願された同第６０／６３６，６６３号、及び２００６年３月１０日に出願された同第６０／７８１，５６４号、並びに２００５年１１月１０日に出願された米国特許出願第１１／２７１，１４０号、及び２００５年１２月１５日に出願された同第１１／３０５，７８７号、本願発明者らが並行した行った出願（それぞれは参照によってその全体が組み込まれる）に記載されている。
他の実施形態では、本発明は、以下に開示されるものなどの、当該技術分野において既知のいかなるＦｃ変異体の使用をも包含する：Duncan et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties インビボ," Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92:11980-11984; Jefferis et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-117; Lund et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) "Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al. (1999) "Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-2624; Idusogie et al. (2000) "Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Fc," J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al. (2000) "インビトロ Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-2575; Shields et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Jefferis et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-490)；米国特許第５，６２４，８２１号；同第５，８８５，５７３号；同第６，１９４，５５１号；ＰＣＴ ＷＯ００／４２０７２；ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
ある実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸に対する前記１つ又は複数の改変は、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する、Ｆｃ領域の、従って本発明のダイアボディ分子の親和性及び結合活性を低減させる。特定の実施形態では、本発明は、変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、前記変異Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記変異Ｆｃ領域は１つのＦｃγＲとのみ結合し、前記ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩＡである、ダイアボディを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、前記変異Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記変異Ｆｃ領域は１つのＦｃγＲとのみ結合し、前記ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＡである、ダイアボディを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、変異Ｆｃ領域又はその一部を含み、前記変異Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記変異Ｆｃ領域は１つのＦｃγＲとのみ結合し、前記ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＢである、ダイアボディを包含する。ある実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含み、当業者に既知であり本明細書に記載の方法を用いて測定されるように、前記変異体はＦｃドメインを含まない分子又は野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較した場合にＡＤＣＣ活性の増加及び／又はＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に対する結合の増加を与えるか又は仲介する、分子を包含する。別の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含み、当業者に既知であり本明細書に記載の方法を用いて測定されるように、前記変異体はＦｃドメインを含まない分子又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（又は他のエフェクター機能）の低減及び／又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）への結合の増加を与えるか仲介する、分子を包含する。
本発明は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ由来のドメイン又は領域を含むＦｃドメインの使用も包含する。当該技術分野で知られているように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変は、Ｆｃを介したエフェクター機能及び／又は結合活性に大きな影響を与え得る。しかし、機能的特徴におけるこれらの変更は、選択されたＩｇＧアイソタイプとの関連において実行された場合に、さらに洗練及び／又は操作することができる。同様に、アイソタイプＦｃの天然の特徴は１つ又は複数のアミノ酸改変によって操作することができる。複数のＩｇＧアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、それらのヒンジドメイン及び／又はＦｃドメインのアミノ酸配列における差異による、血中半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクター機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を含む、異なる物理的及び機能特性を示す。ある実施形態では、所望の特徴を有するダイアボディを設計するために、アミノ酸改変及びＩｇＧのＦｃ領域は、それら各自の別々の結合及び／又はエフェクター機能活性に基づいて独立して選択される。ほとんどの実施形態では、前記アミノ酸改変及びＩｇＧのヒンジ／Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１との関連において本明細書に記載されるか又は当該技術分野において周知の通りに、結合及び／又はエフェクター機能活性について別々にアッセイされた。ある実施形態では、前記アミノ酸改変及びＩｇＧのヒンジ／Ｆｃ領域は、ダイアボディ分子又は他のＦｃ含有分子（例えば免疫グロブリン）との関連においてＦｃγＲ結合又はエフェクター機能について別々にアッセイされた場合に、同様の機能性（例えば、ＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の増加）を示す。前記アミノ酸改変及び選択されたＩｇＧのＦｃ領域の組み合わせは、次に、野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディ分子と比較して、本発明のダイアボディ分子における前記機能性を改変するように相加的に又は、より好ましくは相乗的に作用する。他の実施形態では、前記アミノ酸改変及びＩｇＧのＦｃ領域は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において既知の野生型Ｆｃ領域を含むダイアボディ分子又は他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）との関連において、ＦｃγＲ結合及び／又はエフェクター機能について別々にアッセイされた場合に、反対の機能性（例えば、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の増加及び低減）を示し；前記「反対の」アミノ酸改変及び選択されたＩｇＧ領域の組み合わせは、次に、Ｆｃ領域を含まない又は同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディと比較して、本発明のダイアボディにおける特定の機能性を選択的に調節する又は低減するように作用する。あるいは、本発明は、新規の特性を示す、当該技術分野において既知のアミノ酸改変及び選択されたＩｇＧ領域の組み合わせを含む変異Ｆｃ領域を包含し、その特性は、前記改変及び／又は領域が本明細書に記載の通りに独立してアッセイされた場合には検出不可能であった。
複数のＩｇＧアイソタイプ及びそのドメインの機能的特徴は当該技術分野において周知である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアミノ酸配列を図１Ａ〜１Ｂに示す。本発明の方法で使用するための、特定のＩｇＧアイソタイプからの２つ以上のドメインの選択及び／又は組み合わせは、ＦｃγＲに対する親和性を含む、親アイソタイプのいかなる既知のパラメータにも基づき得る（表７；Flesch et al. (2000) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody," J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合が制限された又は存在しないＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）に由来する領域又はドメインを使用することにより、ダイアボディが、活性化受容体への結合を最大限にし、抑制性受容体への結合を最小限にするように設計されることが望ましい場合に、特定の用途を見出すことができる。同様に、Ｃ１ｑ又はＦｃγＲＩＩＩＡと優先的に結合することが知られているＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ３）（Bruggemann et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med. 166:1351-1361）に由来するＦｃ領域又はドメインの使用を、ＡＤＣＣを増強するための当該技術分野において既知のＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性（例えば、補体活性化又はＡＤＣＣ）が最大化されるようにダイアボディ分子を設計してもよい。
５．３ 分子結合体
本発明のダイアボディ分子は、異種ポリペプチド（すなわち、非関連ポリペプチド；又はその一部、好ましくは、該ポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００個のアミノ酸）に組換え的に融合されるか又は化学的に結合して（共有結合及び非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成し得る。融合は必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こる場合がある。
さらに、本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）は、所与の生物学的反応を調節する治療薬又は薬剤部分に結合することができる。直接的な結合の代用として、多価（例えば四価）の本発明のダイアボディ分子における複数のエピトープ結合部位のために、ダイアボディの少なくとも１つの結合領域を、ダイアボディ結合に影響を与えなること無しに、治療薬又は所望の薬剤部分と結合するように設計することができる。
治療薬又は薬剤部分は、古典的な化学治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素（すなわち、ＰＥ−４０）、もしくはジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、及びヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質等の毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロン（限定はされないが、αインターフェロン（ＩＦＮ−α）、βインターフェロン（ＩＦＮ−β）を含む）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３８９９に開示））、ＡＩＭ ＩＩ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３４９１１を参照）、Ｆａｓリガンド、及びＶＥＧＩ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２３１０５）、血栓症治療薬（thrombotic agent）もしくは血管新生阻害剤（例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン）等のタンパク質、又は例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、マクロファージコロニー刺激因子、（「Ｍ−ＣＳＦ」）、もしくは増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））等の生物学的応答調節物質；プロテアーゼ、又はリボヌクレアーゼが含まれ得る。
本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）は、精製を促進するためのペプチド等の、マーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン社、9259 イートン通り（Eton Avenue）、チャッツワース、カリフォルニア州、91311）において提供されるタグ等の、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、特にその多くは市販されている。Gentz et al. (1989) "Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Requires mRNA Synthesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Wilson et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778）及び「ｆｌａｇ」タグ（Knappik et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques, 17(4):754-761）が挙げられる。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリング（集合的に「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技術を通じて生成することができる。本発明の分子の活性を変更するために、ＤＮＡシャフリングを使用することができる（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有するエピトープ結合部位）。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；及び同第５，８３７，４５８号、並びにPatten et al. (1997) "Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines," Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling," Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al. (1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling," J. Mol. Biol. 287:265-276; and Lorenzo et al. (1998) "PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus," BioTechniques 24:308-313（これらの特許及び刊行物はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のダイアボディ分子、又は本発明の分子をコードする核酸は、エラープローンＰＣＲ、ランダムなヌクレオチド挿入又は他の組換えに先立つ方法によるランダム変異誘発を受けることによって、さらに変更することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの１つ又は複数の部分は、１つ又は複数の異種分子の１つ又は複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片等と再結合させることができる。
本発明は、血中半減期が増加／減少することが望まれる診断薬もしくは治療薬もしくはあらゆる他の分子に結合した、もしくはそれを免疫特異的に認識する、及び／又は特定の細胞サブセットに標的化された、本発明のダイアボディ分子も包含する。例えば、所与の治療計画の有効性を決定するための臨床検査法の一部として、本発明の分子を診断のために使用して、例えば、疾患、障害又は感染の発生又は進行をモニターすることができる。本発明の分子を検出可能な物質にカップリングすることによって、又は検出可能な物質を免疫特異的に認識する分子によって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術分野において既知の技術を用いることで、本発明の分子に直接的に、又は中間体（例えば、当該技術分野において既知のリンカー等）を介して間接的にカップリング又は結合することができ、又は該分子は、検出可能な物質を免疫特異的に認識（免疫特異的に前記物質と結合）することができる。例えば、本発明に従って診断薬として使用するための抗体に結合することができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。そのような診断及び検出は、検出可能な物質を免疫特異的に認識するように分子を設計することによって、又は本発明の分子を以下の検出可能な物質にカップリングすることによって、達成することができる：例えば、限定はされないが、種々の酵素、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含むがこれらに限定はされない酵素；限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン等の補欠分子族複合体；限定はされないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリン等の蛍光物質；限定はされないが、ルミノール等の発光物質；限定はされないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン等の生物発光物質；限定はされないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、亜リン酸（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）等の放射性物質；種々の陽電子放出型断層撮影法で用いられる陽電子放出金属、並びに非放射性常磁性金属イオン。
本発明のダイアボディ分子は、細胞毒（例えば、細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤（cytocidal agent））、治療薬又は放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体等）等の治療的部分を免疫特異的に認識するか、又はそれに結合され得る。細胞毒又は細胞傷害性薬物には、細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。治療薬としては、限定はされないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗菌剤（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
さらに、本発明のダイアボディ分子は、放射性金属イオン（放射性物質の例に関する上記参照）を結合するのに有用な放射性物質又は大環状キレート剤等の治療的部分に結合されるか、又はそれを免疫特異的に認識するように設計することができる。ある実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合され得る１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は当該技術分野において周知であり、以下に記載されている：Denardo et al. (1998) "Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-Tetraacetic Acid (DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast Cancer Xenografts," Clin. Cancer Res. 4:2483-2490; Peterson et al. (1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates," Bioconjug. Chem. 10:553-; and Zimmerman et al, (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab′)2 Fragments," Nucl. Med. Biol. 26:943-950（各々はそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
そのような治療的部分をポリペプチド（例えば、Ｆｃドメインを含む）に結合するための技術は周知であり；例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.);Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.);Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506);"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press;及びThorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62:119-158を参照されたい。
本発明のダイアボディ分子は、それに結合した治療的部分の有無にかかわらず投与されてもよく、単独で投与されてもよく、又は治療的処置としての使用のための細胞傷害性因子及び／又はサイトカインと併用して投与されてもよい。単独投与される場合、多価（例えば、四価）のダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープを、治療薬（例えば、細胞傷害性因子及び／又はサイトカイン）を免疫特異的に認識するように設計することができ、それは本発明の分子と同時に投与されてもよく、又はその後に投与されてもよい。このようにして、ダイアボディ分子は直接的結合に似た様式で治療薬を特異的に標的とすることができる。あるいは、本発明の分子を抗体に結合することで、米国特許第４，６７６，９８０号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）においてＳｅｇａｌにより記載された抗体ヘテロ結合体を形成することができる。本発明のダイアボディ分子は固形の支持体に結合することもでき、その支持体は免疫測定法又は標的抗原の精製に特に有用である。そのような固形の支持体としては、限定はされないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。
ダイアボディ分子の結合の特徴付け
本発明のダイアボディ分子は、種々の方法で特徴付けすることができる。具体的には、本発明の分子を、抗原（例えば、ＦｃＲＩＩＩＡ又はＦｃＲＩＩＢ）に免疫特異的に結合する能力についてアッセイすることができ、該分子がＦｃドメイン（又はその一部）を含む場合は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用（すなわちＦｃドメイン（又はその一部）のＦｃγＲへの特異的結合）を示す能力についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、溶液中（例えば、Houghten (1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides," BioTechniques, 13:412-421）、ビーズ上（Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity," Nature, 354:82-84）、チップ上（Fodor (1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips," Nature, 364:555-556）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；及び同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al. (1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869）又はファージ上（Scott et al. (1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library," Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules," Science, 249:404-406; Cwirla et al. (1990) "Peptides OnPhage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; and Felici (1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector," J. Mol. Biol., 222:301-310）で行うことができる（これら各々の参考文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。抗原（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）に免疫特異的に結合することが確認された分子は、次に、抗原に対するそれらの特異性及び親和性についてアッセイされ得る。
複数のエピトープ結合ドメインを含むよう設計された本発明の分子を、当該技術分野において既知のあらゆる方法によって、１つ又は複数の抗原（例えば、がん抗原）に対する免疫特異的結合、及び他の抗原（例えば、ＦｃγＲ）との交差反応性についてアッセイすることができ、あるいは、該分子がＦｃドメイン（又はその一部）を含む場合は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用についてアッセイすることができる。免疫特異的結合、交差反応性、及びＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を分析するのに使用することができる免疫学的検定としては、限定はされないが、ほんの数例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオ免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法等の技術を用いる競合的アッセイ系及び非競合的アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは当該技術分野においては通例であり周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York（その特許の全体は参照することによって本願に組み込まれる）を参照）。
抗原−結合ドメイン相互作用又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結合親和性及び解離速度（off-rate）は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例は、標識抗原（四量体ＦｃγＲ等（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ、第５．４．１節参照））を、漸増量の非標識エピトープ（四量体ＦｃγＲ等（第５．４．１参照節））の存在下で、目的の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子）と共にインキュベートし、標識抗原に結合した分子を検出することを含む、ラジオ免疫測定法である。抗原に対する本発明の分子の親和性及び結合解離速度（binding off-rate）は、スキャチャード解析による飽和データから決定することができる。
抗原又はＦｃγＲに対する本発明の分子の親和性及び結合特性は、最初に、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含むがこれらに限定はされない、抗原−結合ドメイン相互作用又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用のための、当該技術分野において既知のインビトロアッセイ（生化学又は免疫学に基づくアッセイ）を用いて決定することができる。本発明の分子の結合特性は、第５．４．２節に記載される、１つ又は複数のＦｃγＲ仲介性エフェクター細胞機能を決定するためのインビトロ機能分析によっても特徴付けされることが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、インビトロに基づくアッセイにおける結合特性に類似した、インビボモデル（本明細書で記載及び開示されるもの等）における結合特性を有する。しかし、本発明は、インビトロに基づくアッセイにおいては所望の表現型を示さないがインビボでは所望の表現型を示す、本発明の分子を除外しない。
一部の実施形態では、複数のエピトープ結合ドメイン、及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む分子のスクリーニング及び同定は、機能に基づくアッセイにおいて、好ましくはハイスループットな様式で行われる。前記機能に基づくアッセイは、本明細書の第５．４．２節及び第５．４．３節に記載のアッセイ等の、１つ又は複数のＦｃγＲ仲介性エフェクター細胞機能を特徴付けするための、当該技術分野において既知のいかなるアッセイであってもよい。本発明の方法に従って使用され得るエフェクター細胞機能の非限定的な例としては、限定はされないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性貪食作用、貪食作用、オプソニン作用、オプソニン化貪食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及び補体依存性細胞傷害が挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明の分子の、抗原又はＦｃγＲに対する結合解離速度（binding on and off rate）を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析が使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、チップ表面上に固定された分子（例えば、それぞれエピトープ結合ドメイン又はＦｃドメイン（又はその一部）を含む分子）を有するチップからの、抗原又はＦｃγＲの結合及び解離を解析することを含む。ＢＩＡｃｏｒｅ解析は第５．４．３節に記載される。
本発明の分子を特徴付けるための免疫学的アッセイ又は機能に基づくアッセイ（functional based assay）に、当業者に既知の技術のいずれかを用いる蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が使用されることが好ましい。フローソーターは、本発明の分子が結合している（例えば、オプソニン化した）多数の個々の細胞を迅速に試験することが可能である（例えば、１０〜１００×１０６細胞／時間）（Shapiro et al. (1995) Practical Flow Cytometry）。さらに、ダイアボディの挙動の最適化に使用される特定のパラメーターとしては、限定はされないが、抗原濃度（すなわち、ＦｃγＲ四量体複合体、第５．４．１節参照）、反応速度競合時間（kinetic competition time）、又はＦＡＣＳストリンジェンシーが挙げられ、その各々は、特異的な結合特性（例えば、複数のエピトープへの同時結合）を示す本発明の分子を含むダイアボディ分子を選択するために変更することができる。生体細胞を選別し試験するためのフローサイトメーターは当該技術分野において周知である。既知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許第４，３４７，９３５号；同第５，４６４，５８１号；同第５，４８３，４６９号；同第５，６０２，０３９号；同第５，６４３，７９６号；及び同第６，２１１，４７７号（それらの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。他の既知のフローサイトメーターは、ベクトン・ディッキンソン社製のＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システム、及びユニオンバイオメトリカ社（Union Biometrica）製のＣＯＰＡＳ（商標）システムである。
標的抗原結合親和性又はＦｃ−ＦｃγＲ結合親和性の特徴付け、及び標的抗原又はＦｃγＲの細胞表面上密度の評価は、スキャチャード解析等の当該技術分野において周知の方法によって、又はＱｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（バングスラボラトリーズ（Bangs Laboratories, Inc.）、インディアナ州フィッシャーズ）等のキットを製造業者の取扱説明書に従って使用することによって、行うことができる。１つ又は複数の機能アッセイは、当業者に既知の、又は本明細書に記載の、１つ又は複数のＦｃγＲ仲介性エフェクター細胞機能を特徴付けるための、当該技術分野において既知のいかなるアッセイであってもよい。特定の実施形態では、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子は、１つもしくは複数の標的抗原又は１つもしくは複数のＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ）への結合についてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて；続いて１つ又は複数のＡＤＣＣアッセイにおいて、アッセイされる。一部の実施形態では、本発明の分子は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）をさらに用いてアッセイされる。表面プラズモン共鳴に基づくアッセイは当該技術分野において周知であり、第５．４．３節でさらに考察され、本明細書（例えば、実施例６．１）に例示される。
最も好ましい実施形態では、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子は、標的抗原（例えば、ＦｃγＲ）との相互作用について、又はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について、動物モデルにおいてさらに特徴付けされる。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用が評価される場合、本発明の方法で使用するための好ましい動物モデルは、例えば、ヒトＦｃγＲを発現する遺伝子導入マウスであり、例えば、米国特許第５，８７７，３９７号及び同第６，６７６，９２７号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のあらゆるマウスモデルである。そのような方法で使用するためのさらなる遺伝子導入マウスとしては、限定はされないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡを保有するＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡノックアウトヌードマウス、並びにヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを保有するＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢノックアウトヌードマウスが挙げられる。
５．３．１ ＦｃγＲを含む結合アッセイ
ＦｃγＲに特異的なＦｃドメイン（又はその一部）を含む、及び／又はエピトープ結合ドメインを含む分子によるＦｃγＲへの結合の特徴付けは、ＦｃγＲの多型変異体を含むがこれに限定はされないいかなるＦｃγＲを用いても行うことができる。一部の実施形態では、１５８位にフェニルアラニンを有するＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体が使用される。他の実施形態では、１５８位にバリンを有するＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体を用いて特徴付けが行われる。ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｖは、１５８Ｆよりも高いＩｇＧ１に対する親和性、及び増加したＡＤＣＣ活性を示し（例えば、Koene et al. (1997) "Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype," Blood, 90:1109-14; Wu et al. (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease," J. Clin. Invest. 100: 1059-70（これらは共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）；ＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩＡ共結晶化試験によって最近示されたように、この残基は実際にＩｇＧ１の下部（lower）ヒンジ領域と直接相互作用する（Sondermann et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc gammaRIII complex," Nature, 406(6793):267-273（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）。いくつかの場合で、抗体医薬が、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖホモ接合体患者において向上した有効性を有することが研究によって示された。例えば、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブは、ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｆホモ接合体患者と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ １５８Ｖホモ接合体患者において治療的により有効であった（例えば、Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene," Blood, 99(3): 754-758を参照）。他の実施形態では、この領域を含む治療的分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに関してヘテロ接合型の患者において、並びにＦｃγＲＩＩＡ−１３１Ｈを有する患者においてもより有効であり得る。特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、別のアロタイプを有する本発明の分子の選択は、治療的ダイアボディに導入された場合に前記アロタイプに関してホモ接合型の患者患者に対して臨床的により効果的となる、変異体を提供し得る。
ＦｃγＲに対する本発明の分子の結合を決定するための、具体的には、ＦｃγＲに対するＦｃドメインの結合を決定するためのＦｃγＲ結合アッセイが開発された。前記アッセイは、受容体のそのリガンドに対する本質的に弱い親和性にかかわらず（例えば、マイクロモル範囲のＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡ）、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の検出及び定量化を可能にする。前記方法は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１並びに米国特許出願公開第２００５／００３７０００号及び同第２００５／００６４５１４号（それら各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。簡潔に説明すると、前記方法は、当該技術分野において既知のあらゆる標準的な免疫測定法（例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴等）で使用することができる、ＦｃγＲ複合体の形成を含む。さらにＦｃγＲ複合体は、非複合体型ＦｃγＲと比較した場合、Ｆｃ領域に対する結合活性が向上している。本発明によれば、好ましい分子複合体は、（ａ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）；（ｂ）ＦｃγＲの可溶性領域のＣ末端（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）に機能的に連結したビオチン化１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列（ＡＶＩＴＡＧ）；及び（ｃ）ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）を、四量体ＦｃγＲ複合体を形成するためのモル比（好ましくは５：１モル比）で含む、四量体免疫複合体である。融合タンパク質は、例えば、１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列中のリジン残基を特異的にビオチン化するビオチンリガーゼである大腸菌のＢｉｒＡ酵素を用いて、酵素的にビオチン化される。ビオチン化された可溶性ＦｃγＲタンパク質は次に、１×ＳＡ−ＰＥ：５×ビオチン化可溶性ＦｃγＲのモル比でＳＡ−ＰＥと混合され、四量体ＦｃγＲ複合体を形成する。
Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、単量体非複合体型ＦｃγＲよりも少なくとも８倍高い親和性で、四量体ＦｃγＲ複合体と結合することが示されている。四量体ＦｃγＲ複合体に対するＦｃ領域を含むポリペプチドの結合は、当業者に既知の標準的な技術（例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ラジオ免疫測定法、ＥＬＩＳＡアッセイ等）を用いて決定することができる。
本発明は、細胞に基づくアッセイ又は無細胞系のアッセイにおいてＦｃ領域を含む分子の機能性を決定するための、本発明の分子を含み、上記の方法に従って形成された、免疫複合体の使用を包含する。
便宜上、これらの試薬は、アッセイキット、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子の、ＦｃγＲ四量体複合体と結合する能力をアッセイするための、パッケージ化された試薬の組み合わせの中に提供されてもよい。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の決定に使用するための分子複合体の他の形態は、本発明の方法での使用のために企図され、例えば、２００３年１月１３日に出願された米国仮特許出願６０／４３９，７０９号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の通りに形成された融合タンパク質である。
５．３．２ 変異重鎖を有する分子の機能アッセイ
本発明は、分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に既知のアッセイを用いる、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子の特徴付けを包含する。特に、本発明は、ＦｃγＲ仲介性エフェクター細胞機能に関する本発明の分子の特徴付けを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原のうち少なくとも１つがＦｃγＲである場合、ダイアボディ分子によるＦｃγＲの結合は、ＦｃγＲ−Ｆｃ結合によって活性化される経路に類似したＦｃγＲ仲介性経路を活性化するように機能し得る。従って、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＦｃγＲを認識する場合、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメイン（又はその一部）を含むことなしに、又はＦｃ−ＦｃγＲ結合を伴わずに、ＦｃγＲ仲介性エフェクター細胞機能を誘発し得る。本発明によってアッセイすることが可能なエフェクター細胞機能の例としては、限定はされないが、抗体依存性細胞傷害、貪食作用、オプソニン作用、オプソニン化貪食作用、Ｃ１ｑ結合、及び補体依存性細胞傷害が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を決定するための、当業者に既知の、いかなる細胞に基づくアッセイも無細胞系のアッセイも使用することができる（エフェクター細胞アッセイに関しては、Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al. (1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity," Experientia, 44(10): 841-848; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry," J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "インビトロ Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al. (1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor," J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al. (2002) "Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8:403-411（これら各々の全体は参照することによって本願に組み込まれる）を参照されたい）。
一実施形態では、ヒト単球において、ＦｃγＲ仲介性貪食作用について本発明の分子をアッセイすることができる。あるいは、本発明の分子のＦｃγＲ仲介性貪食作用を、他の貪食細胞（例えば、好中球（多形核白血球（polymorphonuclear leukocyte）；ＰＭＮ）；ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージ）においてアッセイすることができ、これらは当業者に既知の標準的な手順を用いて入手できる（例えば、Brown (1994) "インビトロ Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 147-164を参照）。一実施形態では、本発明の分子の機能は、前述の方法によって、蛍光標識されＩｇＧ−オプソニン化された羊赤血球（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することにより、特徴付けされる（Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: 20480-20487）。
本発明の分子の貪食作用を決定するための別の例示的なアッセイは、以下を含み得る抗体依存性オプソニン化貪食作用アッセイ（ＡＤＣＰ）である：大腸菌標識ＦＩＴＣ（モレキュラープローブス社）又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）−ＦＩＴＣ等の標的生体粒子を、（ｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰに対する対照抗体としてのフルオレセインに対する抗体である野生型４−４−２０抗体（Bedzyk et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569参照（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））で；又は（ｉｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰに対するバックグラウンド対照としてのＦｃγＲＩＩＩへの結合をノックアウトするＤ２６５Ａ変異を内部に有する４−４−２０抗体で、（ｉｉｉ）４−４−２０のエピトープ結合ドメイン並びにＦｃγＲＩＩＩに特異的なＦｃドメイン及び／もしくはエピトープ結合ドメインを含むダイアボディで、被覆し；オプソニン化粒子を形成させ；（ｉ〜ｉｉｉ）に記載のオプソニン化粒子のいずれかを、ＴＨＰ−１エフェクター細胞（ＡＴＣＣから入手可能な単球細胞株）に、１：１、１０：１、３０：１、６０：１、７５：１又は１００：１の比で添加し、ＦｃγＲ仲介性貪食作用を生じさせ；好ましくは細胞及び大腸菌−ＦＩＴＣ／抗体を３７℃で１．５時間インキュベートし；インキュベーション後にトリパンブルーを細胞に添加して（好ましくは室温で２〜３分間）、内部移行されずに細胞表面の外側に付着している細菌の蛍光をクエンチし；細胞をＦＡＣＳ緩衝液（例えば、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に移し、ＦＡＣＳ（例えば、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いてＴＨＰ１細胞の蛍光を解析する。前記アッセイで使用されるＴＨＰ−１細胞を、細胞表面上のＦｃγＲ発現についてＦＡＣＳ解析することが好ましい。ＴＨＰ−１細胞はＣＤ３２Ａ及びＣＤ６４の両方を発現する。ＣＤ６４は、本発明の方法に従ってＡＤＣＰアッセイを行う際にブロックされる高親和性ＦｃγＲである。ＴＨＰ−１細胞を、１００μｇ／ｍＬの可溶性ＩｇＧ１又は１０ヒト血清でブロックすることが好ましい。ＡＤＣＰの程度を解析するために、ＴＨＰ−１細胞にゲートを設定して、蛍光強度中央値（median fluorescence intensity）を測定することが好ましい。個々の変異体のＡＤＣＰ活性を算出し、得られた野生型ｃｈＭａｂ ４−４−２０に対して正規化された値として報告する。オプソニン化粒子は、オプソニン化粒子のＴＨＰ−１細胞に対する比が３０：１又は６０：１になるように、ＴＨＰ−１細胞に添加される。最も好ましい実施形態では、対照、例えば、培地中の大腸菌−ＦＩＴＣ、大腸菌−ＦＩＴＣ及びＴＨＰ−１細胞（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性として機能）、大腸菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞及び野生型４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性として機能）、大腸菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞、４−４−２０Ｄ２６５Ａ（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性のバックグラウンド対照として機能）等を用いて行われる。
別の実施形態では、当業者に既知の標準方法のいずれかを用い、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）において、ＦｃγＲ仲介性ＡＤＣＣ活性について本発明の分子をアッセイすることができる（例えば、Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8:403-411を参照）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を決定するための代表的なアッセイは、以下から成る５１Ｃｒ放出アッセイに基づく：標的細胞を［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４で標識し（この細胞膜透過性分子は、細胞質タンパク質と結合するために標識に一般に使用され、ゆっくりとした速度で細胞から自然に放出されるが、標的細胞の壊死後は大量に放出される）；変異重鎖を含む本発明の分子で標的細胞をオプソニン化し；オプソニン化され放射性標識された標的細胞とエフェクター細胞とを、マイクロタイタープレート中で、エフェクター細胞に対する標的細胞の適切な比率で混ぜ合わせ；その細胞混合物を３７℃で１６〜１８時間インキュベートし；上清を集め；放射活性を解析する。本発明の分子の細胞毒性は、次に、例えば以下の式を用いることで決定され得る：溶解％＝（実験的ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的漏出）×１００％。あるいは、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自然放出）。特異的な溶解は以下の式を用いて算出することができる：特異的な溶解＝本発明の分子での溶解％−本発明の分子非存在下での溶解％。標的：エフェクター細胞比又は抗体濃度のいずれかを変えることで、グラフを作製することができる。
本発明のＡＤＣＣアッセイで使用されるエフェクター細胞は好ましくは、当業者に既知の標準方法を用いて（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心法を用いて）正常ヒト血液から精製されることが好ましい末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。本発明の方法で使用するために好ましいエフェクター細胞は、異なるＦｃγＲ活性化受容体を発現する。本発明は、野生型ＩｇＧ１抗体と比較して、重鎖抗体変異体がＡＤＣＣ活性及び貪食作用の増加を示すかどうかを決定するための、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを発現するエフェクター細胞ＴＨＰ−１、並びにＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの両方を発現する人全血液由来の単球由来初代マクロファージを包含する。
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１は、高親和性受容体ＦｃγＲＩ及び低親和性受容体ＦｃγＲＩＩＡの発現を介して貪食作用を活性化する（Fleit et al. (1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII," J. Leuk. Biol. 49: 556-565）。ＴＨＰ−１細胞は、ＦｃγＲＩＩＡもＦｃγＲＩＩＢも恒常的には発現していない。サイトカインによるこれらの細胞の刺激は、ＦｃＲ発現パターンに影響を与える（Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines," J. of Immunol., 166: 531-537）。サイトカインＩＬ４存在下でのＴＨＰ−１細胞の増殖は、ＦｃγＲＩＩＢ発現を誘導し、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩの発現低下を引き起こす。ＦｃγＲＩＩＢ発現は、細胞密度の増加によっても増強され得る（Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089）。対照的に、ＩＦＮγはＦｃγＲＩＩＩＡの発現を引き起こすことが報告されている（Pearse et al. (1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318）。細胞表面上の受容体の有無は、当業者に既知の通常の方法を用いるＦＡＣＳによって決定することができる。サイトカインによって誘導された、細胞表面でのＦｃγＲ発現は、ＦｃγＲＩＩＢ存在下での活性化及び阻害の両方を試験するための系を提供する。ＴＨＰ−１細胞がＦｃγＲＩＩＢを発現できない場合、本発明は別のヒト単球細胞株Ｕ９３７も包含する。これらの細胞は、ＩＦＮγ及びＴＮＦの存在下でマクロファージに最終分化することが示されている（Koren et al. (1979) "インビトロ Activation Of A Human Macrophage-Like Cell Line," Nature 279: 328-331）。
ＦｃγＲ依存性腫瘍細胞死滅は、マウス腫瘍モデルにおけるマクロファージ及びＮＫ細胞を介して行われる（Clynes et al. (1998) "Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 652-656）。本発明は、エフェクター細胞としてドナーから単離した（elutriated）単球を使用して、貪食作用アッセイ及びＡＤＣＣアッセイの両方において標的細胞の細胞毒性を引き起こすＦｃ変異体の効率を分析することを包含する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＢの発現パターンは種々の増殖条件に影響される。凍結され単離された単球、新たに単離された単球、１０％ＦＢＳ中で維持された単球、並びにＦＢＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ中及び／又はヒト血清中で培養された単球からのＦｃγＲ発現は、当業者に既知の通常の方法を用いて決定することができる。例えば、細胞をＦｃγＲ特異的抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳで解析して、ＦｃＲプロファイルを決定することができる。次に、マクロファージのインビボＦｃγＲ発現を最良に模倣する条件を本発明の方法に使用する。
一部の実施形態では、本発明は、特に、正しい（right）ＦｃγＲプロファイルを有するヒト細胞を入手することができない場合の、マウス細胞の使用を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを形質移入することができるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、及び当該技術分野において既知の方法を用いて単離された安定な形質移入体を包含する（例えば、Ralph et al. (1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS," J. Immunol. 119: 950-4）を参照）。通例の実験法を用いるＦＡＣＳ解析により、形質移入体をＦｃγＲＩＩＩＡ発現について定量化することができ、高発現体を本発明のＡＤＣＣアッセイで使用することができる。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるような、遺伝子導入ノックアウトマウスからの、ヒトＦｃγＲを発現する脾臓腹腔マクロファージ（spleen peritoneal macrophage）の単離を包含する。
リンパ球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（ファルマシア社）を用いてドナーの末梢血（ＰＢＭ）から採取することができる。単離された単核細胞集団内では、ＡＤＣＣ活性の大部分は、細胞表面上にＦｃγＲＩＩＩＡを含有するがＦｃγＲＩＩＢは含有しないナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を介して生じる。これらの細胞を用いた結果により、ＮＫ細胞のＡＤＣＣの誘起に対する変異体の有効性が示され、単離した単球を用いて試験するための試薬が確立される。
本発明のＡＤＣＣアッセイで使用される標的細胞としては、限定はされないが、乳がん細胞株（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−３０を有するＳＫ−ＢＲ−３）（例えば、Tremp et al. (1976) "Human Breast Cancer In Culture," Recent Results Cancer Res. 33-41参照）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−８６を有するＲａｊｉ細胞（例えば、Epstein et al. (1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EB1) Of Human Lymphoblasts From Burkitt's Lymphoma," J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240参照）、及びＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２１３を有するＤａｕｄｉ細胞（例えば、Klein et al. (1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell インビボ And In Derived Culture Lines," Cancer Res. 28: 1300-1310）参照））が挙げられる。標的細胞はアッセイされるダイアボディ分子の抗原結合部位によって認識されなければならない。
ＡＤＣＣアッセイは、ＮＫ細胞の、アポトーシス経路を介して細胞死を仲介する能力に基づいている。ＮＫ細胞は、部分的には、細胞表面上の抗原に結合したＩｇＧ ＦｃドメインをＦｃγＲＩＩＩＡが認識することによって、細胞死を仲介する。本発明の方法に従って使用されるＡＤＣＣアッセイは、放射活性に基づくアッセイ又は蛍光に基づくアッセイであり得る。変異Ｆｃ領域を含む本発明の分子を特徴付けるために使用されるＡＤＣＣアッセイは、標的細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ細胞）を標識し、抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体で標的細胞をオプソニン化し；標識しオプソニン化した標的細胞とエフェクター細胞とを、通例の実験法によって決定することができる適切な比率で混ぜ合わせ；これらの細胞を回収し；使用された標識に応じた適切な検出スキームを用いて、溶解した標的細胞の上清中の標識を検出することを含む。標的細胞は、当該技術分野において既知の標準方法を用いて、放射性標識又は蛍光ラベルのいずれを使用しても標識することができる。例えば標識としては、限定はされないが、［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４；及び蛍光増強リガンドの２，２'：６'，２"−テルピリジン−６−６"−ジカルボキシレート（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルが挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、蛍光増強リガンド、２，２'：６'，２"−テルピリジン−６−６"−ジカルボキシレート（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルで標識された標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定するために、時間分解蛍光分光法が使用される。そのような蛍光アッセイは当該技術分野において既知であり、例えば、Blomberg et al. (1996) "Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand," Journal of Immunological Methods, 193: 199-206（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。簡潔に説明すると、生細胞の細胞膜を通過して急速に拡散する、膜透過性のＴＤＡのアセトキシメチルジエステル（ビス（アセトキシメチル）２，２'：６'，２"−テルピリジン−６−６"−ジカルボキシレート（ＢＡＴＤＡ） で標的細胞を標識する。細胞内エステラーゼは前記エステル基を切断し、再生成された膜不透過性のＴＤＡ分子は細胞内にトラップされる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２下で少なくとも２時間、最大で３．５時間、エフェクター細胞及び標的細胞をインキュベートした後、溶解した標的細胞から放出されたＴＤＡをＥｕ３＋でキレート化し、形成されたユウロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ １４２０、パーキンエルマー／ウォレス社）で定量化する。
別の特定の実施形態では、複数のエピトープ結合部位及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子を特徴付けるために使用されるＡＤＣＣアッセイは、以下のステップを含む：４〜５×１０６個の標的細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ細胞）を、ビス（アセトキシメチル）２，２'：６'，２"−テルピリジン−ｔ−６"−ジカルボキシレート（ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ Ｒｅａｇｅｎｔ、パーキンエルマー／ウォレス社）で標識することが好ましい。最適な標識効率のために、ＡＤＣＣアッセイに使用される標的細胞の数は、好ましくは、５×１０６個を超えるべきではない。ＢＡＴＤＡ試薬を細胞に添加し、その混合物を３７℃で、好ましくは５％ＣＯ２下で、少なくとも３０分間インキュベートする。次に、これらの細胞を生理的緩衝液（例えば、０．１２５ｍＭのスルフィンピラゾール（sulfinpyrazole）を含有するＰＢＳ、０．１２５ｍＭのスルフィンピラゾンを含有する培地で洗浄する。次に、標識した標的細胞を、ＦｃγＲＩＩＡに特異的なエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子でオプソニン化（被覆）する。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣアッセイで使用される分子は、細胞表面受容体、腫瘍抗原、又はがん抗原に対しても特異的である。本発明のダイアボディ分子は、第５．６．１節で列挙されるような、いかなるがん抗原又は腫瘍抗原とも特異的にも結合することができる。ダイアボディが標的細胞の細胞表面受容体と特異的に結合するように、本発明のダイアボディに導入されたエピトープ結合部位に応じて、ＡＤＣＣアッセイにおける標的細胞を選択する。
標的細胞をエフェクター細胞（例えば、ＰＢＭＣ）に加えて、エフェクター：標的の比率をおよそ１：１、１０：１、３０：１、５０：１、７５：１、又は１００：１にする。エフェクター細胞及び標的細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で、少なくとも２時間、最大３．５時間インキュベートする。細胞上清を回収し、酸性のユウロピウム溶液（acidic europium solution）（例えば、ＤＥＬＦＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、パーキンエルマー／ウォレス社）に加える。形成されたユウロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ １４２０、パーキンエルマー／ウォレス社）で定量化する。最大放出（ＭＲ）及び自然放出（ＳＲ）を、それぞれ、１％ＴＸ−１００と共に、及び培地単独で、標的細胞をインキュベートすることにより決定する。試験分子（例えば、本発明のダイアボディ）の非存在下で標的細胞及びエフェクター細胞をインキュベートすることにより、抗体依存性細胞傷害（ＡＩＣＣ）を測定する。それぞれのアッセイは三連で行われることが好ましい。特異的溶解の平均パーセンテージを以下のように算出する：実験放出値（ＡＤＣＣ）−ＡＩＣＣ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００。
本発明は、Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子による、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の仲介を特徴付けるための、当該技術分野において既知で、本明細書で例示されるアッセイを包含する。Ｃ１ｑ結合のＥＬＩＳＡを行うことで、Ｃ１ｑ結合を決定することができる。代表的なアッセイは以下を含み得る：アッセイプレートが、被覆緩衝液中の本発明の分子を含むポリペプチド又は開始ポリペプチド（対照）で、４℃で一晩被覆され得る。次に、そのプレートは洗浄及びブロッキングされ得る。洗浄後、一定分量のヒトＣ１ｑが各ウェルに添加され、室温で２時間インキュベートされ得る。さらなる洗浄の後、１００μＬのペルオキシダーゼ結合型ヒツジ抗補体Ｃ１ｑ抗体が各ウェルに添加され、室温で１時間インキュベートされ得る。プレートは洗浄緩衝液で再度洗浄され、１００μｌのＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（シグマ社））含有基質緩衝液が各ウェルに添加され得る。黄色に発色することで観察される酸化反応が３０分間進行され、１００μｌの４．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止され得る。次に吸光度が（４９２〜４０５）ｎｍで読み取られ得る。
補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al. (1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody," J. Immunol. Methods 202:163-171（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイが行われ得る。簡潔に説明すると、種々の濃度の、（変異）Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む分子及びヒト補体が、緩衝液で希釈され得る。ダイアボディ分子が結合する抗原を発現する細胞が、約１×１０６細胞／ｍｌの密度に希釈され得る。（変異）Ｆｃドメイン（又はその一部）を含むダイアボディ分子、希釈されたヒト補体及び前記抗原を発現する細胞の混合物が、平底組織培養９６ウェルプレートに添加され、補体仲介性細胞溶解を促進するために３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートされ得る。次に、５０μＬのａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ａｃｃｕｍｅｄインターナショナル社（Accumed International））が各ウェルに添加され、３７℃で一晩インキュベートされ得る。吸光度が、５３０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの蛍光波長で、９６ウェル蛍光光度計を用いて測定される。結果は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表され得る。試料濃度は検量線から算出され得、非変異（nonvariant）分子、すなわち、Ｆｃドメインを含まない又は非変異型Ｆｃドメインを含む分子と比較した場合の活性パーセントが、目的の変異体について報告される。
５．３．３ 他のアッセイ
複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメインを含む本発明の分子は、抗原−結合ドメイン結合又はＦｃ−ＦｃγＲ結合の反応速度パラメーターを特徴付けるための、当該技術分野において既知のいかなる表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを用いてもアッセイすることができる。販売されているあらゆるＳＰＲ装置、例えば、限定はされないが、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ社（スウェーデン、ウプサラ）から販売されるＢＩＡｃｏｒｅ装置；アフィニティ・センサーズ社（Affinity Sensors）（マサチューセッツ州フランクリン）から販売されるＩＡｓｙｓ装置；ウインザー・サイエンティフィック・リミテッド社（Windsor Scientific Limited）（英国、バークシャー）から販売されるＩＢＩＳシステム、日本レーザー社（Nippon Laser and Electronics Lab）（日本、北海道）から販売されるＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム、及びテキサス・インスツルメンツ社（テキサス州ダラス）から販売されるＳＰＲ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｐｒｅｅｔａが、本発明で使用可能である。ＳＰＲに基づく技術の総説としては、Mullet et al. (2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays," Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) "Some new aspects in biosensors," Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivash et al. (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction," Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al. (2000) "Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis," Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61（これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号；同第６，２８９，２８６号；同第５，３２２，７９８号；同第５，３４１，２１５号；同第６，２６８，１２５号（これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の、タンパク質間相互作用を測定するためのいかなるＳＰＲ装置及びＳＰＲに基づく方法も、本発明の方法において企図されている。
簡潔に説明すると、ＳＰＲに基づくアッセイは、表面上に結合ペアの一方のメンバーを固定し、溶液中での結合ペアのもう一方のメンバーとのその相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。ＳＰＲは、複合体の形成又は解離時に起こる、表面近くの溶媒の屈折率における変化を測定することに基づく。固定化が起こる表面はセンサーチップであり、センサーチップはＳＰＲ技術の要である。センサーチップは金の薄層で被膜されたガラス表面から成り、該表面への分子の結合を最適化するよう設計された様々な特殊化した表面の基盤を形成する。特に上に列挙した会社から種々のセンサーチップが市販されており、それら全てを本発明の方法で使用することができる。センサーチップの例としては、ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ社から販売されるセンサーチップ（例えば、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡ、及びＨＰＡ）が挙げられる。本発明の分子は、当該技術分野において周知の固定化法及び化学作用のいずれを用いてもセンサーチップの表面上に固定化することができ、例えば、限定はされないが、アミン基を介した直接的共有結合、スルフヒドリル基を介した直接的共有結合、アビジン被覆表面へのビオチン結合、炭水化物基へのアルデヒド結合、及びヒスチジンタグを介したＮＴＡチップとの結合が挙げられる。
一部の実施形態では、複数のエピトープ結合部位及び所望によりＦｃドメインを含む本発明の分子の結合の、抗原又はＦｃγＲへの反応速度パラメーター は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ １０００、ＢＩＡｃｏｒｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて測定することができる。上記のように（第５．４．１節参照）、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位がＦｃγＲを免疫特異的に認識する場合、及び／又はダイアボディ分子がＦｃドメイン（又はその一部）を含む場合、本発明の分子の結合を評価するためにいかなるＦｃγＲをも使用することができる。特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩＡであり、好ましくは可溶性単量体ＦｃγＲＩＩＩＡである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体ＦｃγＲＩＩＩＡは、リンカー−ＡＶＩＴＡＧ配列に連結したＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域である（２００３年１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／４３９，４９８号、及び２００３年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／４５６，０４１号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）。別の特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＢであり、好ましくは可溶性２量体ＦｃγＲＩＩＢである。例えば一実施形態では、可溶性２量体ＦｃγＲＩＩＢタンパク質は、２００３年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／４３９，７０９号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って調製される。
全ての免疫学的アッセイに関して、本発明の分子によるＦｃγＲ認識／結合は複数のドメインによってもたらされ得る。ある実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合ドメインのうちの１つを介してＦｃγＲを免疫特異的に認識し；さらに他の実施形態では、本発明の分子がＦｃドメイン（又はその一部）を含む場合、ダイアボディ分子はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を介してＦｃγＲを免疫特異的に認識することができ；さらに別の実施形態では、本発明の分子がＦｃドメイン（又はその一部）及びＦｃγＲを免疫特異的に認識するエピトープ結合部位の両方を含む場合、ダイアボディ分子は、エピトープ結合ドメイン及びＦｃドメイン（又はその一部）の一方又は両方を介してＦｃγＲを認識することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて、抗原及び／又はＦｃγＲに対する、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む分子の反応速度パラメーターを決定するための代表的なアッセイは、以下を含む：約５０００反応単位（ＲＵ）の第一抗原が表面上に固定化されるように、好ましくはアミン結合化学作用を介して、センサーチップ表面の４つのフローセルのうちの１つに第一抗原を固定化する。適切な表面を作製した後、前記第一抗原免疫特異的に認識する本発明の分子を、好ましくは５μＬ／ｍＬの流速での２０μｇ／ｍＬ溶液の１分間注入により、その表面上を通過させる。この段階での前記表面に結合した本発明の分子のレベルは、典型的には、４００〜７００ＲＵの範囲である。次に、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中の第二抗原（例えば、ＦｃγＲ）又はＦｃγＲ受容体の希釈系列を、１００μＬ／分で表面上に注入する。異なる第二抗原間又は受容体希釈物間での分子の再生は、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．４）；３ＭのＮａＣｌの単回５秒間注入によって行われることが好ましい。当該技術分野において既知のいかなる再生技術も、本発明の方法において企図されている。
全体のデータセットが収集された後、ＳＰＲ装置製造業者（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって与えられるコンピューターアルゴリズムを用いて得られた結合曲線を包括的にフィッティングする。これらのアルゴリズムにより、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆの両方を算出し、それらから、その２つの速度定数の比（すなわち、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として見かけの平衡結合定数Ｋｄを推定する。個々の速度定数を導くためのより詳細な処理は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に見出すことができる。作成されたデータの解析は、当該技術分野において既知のいかなる方法を用いても行うことができる。作成された速度論データの種々の解釈法に関する総説については、Myszka (1997) "Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors," Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. (1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions," Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy (1994) "Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature," Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et al. (1992) &quot Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands," Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Morton et al. (1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration," Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83（これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
好ましい実施形態では、ＳＰＲ解析（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて決定された反応速度パラメーターを、本発明の分子が機能的アッセイ（例えばＡＤＣＣ）においてどのように機能するかを予測する指標として用いることができる。ＳＰＲ解析から得られた反応速度パラメーターに基づいて本発明の分子の有効性を予測するための例示的方法は、以下を含み得る：ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに対する本発明の分子の（エピトープ結合ドメイン及び／又はＦｃドメイン（又はその一部）を介した）結合に関するＫｏｆｆ値を決定し；（１）ＦｃγＲＩＩＩＡに関するＫｏｆｆ（ｗｔ）／Ｋｏｆｆ（ｍｕｔ）；（２）ＦｃγＲＩＩＢに関するＫｏｆｆ（ｍｕｔ）／Ｋｏｆｆ（ｗｔ）をＡＤＣＣデータに対してプロットすること。１より大きい数値は、野生型と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡに関する解離速度が減少し、ＦｃγＲＩＩＢに関する解離速度が増加し；増強したＡＤＣＣ機能を有することこと示す。
５．４ 本発明のダイアボディ分子を製造する方法。
本発明のダイアボディ分子は、新規タンパク質合成及び結合タンパク質をコードする核酸の組み換え発現を含む、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて作製することができる。所望の核酸配列は、組換え法（例えば、先に作製された所望のポリヌクレオチド変異体のＰＣＲ変異誘発）によって、又は固相ＤＮＡ合成によって、作製することができる。通常、組み換え発現法が使用される。一態様では、本発明は、ＣＤ１６ＡのＶＨ及び／又はＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し；別の態様では、本発明は、ＣＤ３２ＢのＶＨ及び／又はＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝暗号の縮重のために種々の核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることから、本発明は本明細書に記載の結合タンパク質をコードする全ての核酸を含む。
５．４．１ 本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明は、ポリペプチド及び抗体を含む、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドも包含する。当該技術分野において既知のいかなる方法によっても、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
本発明の方法によって同定された分子のヌクレオチド配列が決定された後、当該技術分野において周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ等）を用いてヌクレオチド配列を操作して（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY;及びAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY（それら両方はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の技術を参照）、例えばアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせることにより、例えば、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製することができる。
一実施形態では、ヒトライブラリー又は当該技術分野において利用可能な他のあらゆるライブラリーを、当該技術分野において既知の標準的な技術によってスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングすることができる。
５．４．２ 本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（すなわち、抗体）をコードする核酸配列を得た後、当該技術分野において周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって、その分子を生成するためのベクターを作製することができる。当業者に周知の方法を使用して、本発明の分子のコード配列、並びに適切な転写調節シグナル及び翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝的組換えが挙げられる。（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照）。
従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、及びリン酸カルシウム沈殿）によって本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することができ、次に、形質移入細胞を従来技術により培養することで本発明の分子を産生させる。特定の実施形態では、本発明の分子の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって制御される。
本発明の方法により同定された分子を発現するために使用される宿主細胞は、特に組換え免疫グロブリン分子全体の発現のための、大腸菌等の細菌細胞、又は、好ましくは真核細胞であり得る。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳類細胞と、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメント等のベクターとの併用が、免疫グロブリンの効率的な発現系である（Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors," Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification," Biotechnology 8:662-667）。
種々の宿主−発現ベクター系を使用して、本発明の方法により同定された分子を発現させることができる。そのような宿主−発現系は、本発明の分子のコード配列を生成し、続いて精製することができるビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された、又はそれをを形質移入された場合に、本発明の分子をインサイツで発現することができる細胞も表す。これらとしては、限定はされないが、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物（例えば、大腸菌及び枯草菌）；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces） ピキア属（pichia））；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を感染させた、もしくは本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ系細胞（lymphotic cell）（米国特許第５，８０７，７１５号参照）、Ｐｅｒ Ｃ．６細胞（クルーセル社（Crucell）により開発されたヒト網膜細胞）が挙げられる。
細菌系では、発現されている分子に企図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するために、そのようなタンパク質を大量に産生させる場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、限定はされないが、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列をベクターの中にｌａｃＺコード配列とインフレームで個々に連結することができる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794）；ｐＩＮベクター（Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509）等が挙げられる。ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着及び結合、続いて遊離グルタチオン存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又は活性化第Ｘ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているため、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができる。
昆虫系では、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてキンウワバ科（Autographa californica）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。前記ウイルスはヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御化に置くことができる。
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター配列及び三分割リーダー配列）に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）への挿入により、感染宿主中で生存可能であり、免疫グロブリン分子を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされる（例えば、Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に、特定の開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入配列の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同位相になければならない。これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは様々な起源のものであってよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることにより増強することができる（Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。
さらに、挿入配列の発現を変調する、又は遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。例えば、ある実施形態では、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチドは、本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形成するために天然又は組換え細胞の機構によるタンパク質切断を必要とする単一の遺伝子産物として（例えば、１本鎖ポリペプチドとして、すなわちポリプロテイン前駆体として）発現することができる。従って本発明は、本発明のポリペプチドを含むポリプロテイン前駆体分子をコードし、前記ポリプロテイン前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含むように、核酸配列を設計することを包含する。ポリプロテイン前駆体の翻訳後切断により、本発明のポリペプチドが得られる。本発明のポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断は、インビボで（すなわち、天然又は組換え細胞の系／機構（例えば適切な部位でのフューリン切断）により宿主細胞内で）起こすこともでき、又はインビトロで（例えば、活性が既知であるプロテアーゼもしくはペプチダーゼを含む組成で、及び／又は所望のタンパク質分解作用を促進することが知られている条件もしくは試薬を含む組成での、前記ポリペプチド鎖のインキュベーション）起こすこともできる。組換えタンパク質の精製及び修飾は当該技術分野において周知であるため、ポリプロテイン前駆体の設計は、当業者に既に認められているいくつかの実施形態を含み得る。当該技術分野において既知のあらゆる既知のプロテアーゼ又はペプチダーゼが、前駆物質分子の前記修飾に使用可能である（例えば、トロンビン（アミノ酸配列ＬＶＰＲ＾ＧＳ（配列番号８９）を認識）、又は活性化第Ｘ因子（アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ＾（配列番号９０）を認識（Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255、及びJenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa," Protein Expr. Purif. 31:1-11で総括（そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる））、エンテロキナーゼ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ＾（配列番号９１）を認識（Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA," Biotechnology 13:982-987（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））、フューリン（アミノ酸配列ＲＸＸＲ＾を認識、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒ＾を優先（それぞれ、配列番号９２及び配列番号９３）（Ｐ６位へのＲの追加は切断を増強するように思われる））、及びＡｃＴＥＶ（アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱ＾Ｇ（配列番号９４）を認識（Parks et al. (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase," Anal. Biochem. 216:413-417（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））並びに口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）。例えば、上記第６．４節を参照されたい。
様々な宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び翻訳後修飾のための特徴的で特殊な機構を有している。適切な細胞株又は宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にすることができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０並びにＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
組換えタンパク質の長期高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を設計することができる。ウイルス性複製起点（viral origins of replication）を含有する発現ベクターを用いずに、宿主細胞を、適切な発現調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、及び選択可能なマーカーによって調節されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡ導入後、操作された細胞は、栄養強化培地中で１〜２日間増殖せられ、その後、選択培地に切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定的に組み込み、増殖して、増殖層を形成することを可能にし、その後、その細胞をクローニングし、細胞株に増殖させることができる。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株の操作に有利に使用することができる。そのような操作された細胞株は、本発明の分子と直接的又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価に、特に有用であり得る。
いくつかの選択系が使用可能であり、例えば、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11: 223-232）、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy," Bioessays 14: 495-500）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene," Cell 22: 817-823）を、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞又はａｐｒｔ細胞に使用することができる。また、以下の遺伝子に関する選択の機序として、代謝拮抗剤耐性を使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932;及びMorgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217）、及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の当該技術分野において周知の方法は、以下に記載されている：Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 及びChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14。
本発明の分子の発現レベルはベクター増幅で増加させることができる（総説としては、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3（Academic Press, New York, 1987）を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅されると、宿主細胞の培養液中に存在する阻害剤のレベル増加により、マーカー遺伝子の複製物数が増加する。増幅領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配列と関連しているため、該ポリペプチドの産生も増加する（Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266）。
宿主細胞に、本発明の２つの発現ベクターである、ダイアボディ分子の第一ポリペプチドをコードする第一ベクター及びダイアボディ分子の第二ポリペプチドをコードする第二ベクターを同時形質移入することができる。２つのベクターは、両ポリペプチドの同等発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有し得る。あるいは、両ポリペプチドをコードする単一のベクターを使用することができる。本発明の分子のポリペプチドのコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み得る。
本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）は、組換え発現された後、ポリペプチド、ポリタンパク質又はダイアボディを精製するための当該技術分野において既知のいかなる方法（例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームと類似）によっても精製することができ、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に特異的抗原に対する親和性によるクロマトグラフィー（ダイアボディ分子がＦｃドメイン（又はその一部）を含む場合は所望によりプロテインＡ選択後）、及び分子ふるいクロマトグラフィー（sizing column chromatography））、遠心分離、溶解性の差異（differential solubility）、又はポリペプチド、ポリタンパク質もしくはダイアボディを精製するための他のあらゆる標準的な技術が挙げられる。
５．５ 予防法及び治療法
本発明の分子は、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ）が望まれる疾患、障害又は感染症（例えば、がん、感染症）の治療及び／又は予防に特に有用である。上記の通り、本発明のダイアボディは、たとえＦｃドメインを含まなくても、エフェクター機能を誘発する際に抗体様機能性を示すことができる。ＦｃγＲを免疫特異的に認識する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、ダイアボディ分子は、ＦｃγＲ結合及びＦｃ−ＦｃγＲ相互作用と類似した活性を示すことができる。例えば、本発明の分子は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞表面抗原及びＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）と結合し、前記細胞に対するエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、貪食作用、オプソニン作用等）を刺激することができる。
他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はＦｃドメイン（又はその一部）を含む。そのような実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメイン（又はその一部）と比較し、少なくとも１つのアミノ酸改変をさらに含み得る、及び／又は１つ又は複数のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）由来のドメインを含み得る。変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子は、野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較し、変化した又は付与されたエフェクター機能活性等の、付与された又は変化した表現型を示し得る（例えば、ＮＫ依存性アッセイ又はマクロファージ依存性アッセイでアッセイされる）。前記実施形態では、付与された又は変化したエフェクター機能活性を有する本発明の分子は、エフェクター機能活性の有効性の増強が望まれる、疾患、障害又は感染症の治療及び／又は予防に有用である。ある実施形態では、Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む本発明のダイアボディ分子は、補体依存性カスケードを仲介する。エフェクター機能を変化させることが確認されたＦｃドメイン変異体は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号及び同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日に出願された同第６０／６３６，６６３号、及び２００６年３月１０日に出願された同第６０／７８１，５６４号、並びに２００５年１１月１０日に出願された米国特許出願第１１／２７１，１４０号、及び２００５年１２月１５日に出願された同第１１／３０５，７８７号、本願発明者らが並行して行った出願（それぞれは参照によってその全体が組み込まれる）に開示される。
本発明は、本発明に従って導入された１つ又は複数のエピトープ結合部位及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含み、さらにがん抗原と結合する、治療有効量の１つ又は複数の分子を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療、予防又は管理のための方法及び組成物を包含する。本発明の分子は、特に、原発腫瘍の増殖又は退縮、がん細胞の転移、及び感染症の予防、阻害、低減に有用である。特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、本発明の分子は、腫瘍クリアランス、腫瘍減少又はそれらの組み合わせをもたらすエフェクター機能を仲介する。別の実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原及び／又は受容体の架橋結合、並びにアポトーシス又は負の増殖調節シグナル伝達の増強によって、治療的活性を仲介する。
特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、本発明のダイアボディ分子は、部分的には、特定の抗原（例えば、ＦｃγＲ）を低減されたレベルで発現する標的細胞と免疫特異的に結合するダイアボディの能力のために、例えば、ダイアボディ−エピトープ相互作用の向上した結合活性による、標的細胞上により長期に残存するダイアボディの能力のために、当該技術分野において既知の抗体医薬と比較して、増強された治療効果を示す。
抗原（例えば、ＦｃγＲ）に対して増強された親和性及び結合活性を有する本発明のダイアボディは、ＦｃγＲｓが標的細胞集団において低レベルで発現される、対象におけるがん、又は別の疾患もしくは障害の治療、予防又は管理に特に有用である。本明細書で使用される場合、細胞におけるＦｃγＲ発現は、当業者に既知の通常の方法を用いて測定される、細胞あたりの係る分子の密度の面から定義される。複数のエピトープ結合部位及び所望によりＦｃγＲ（又はその一部）を含む本発明の分子は、標的抗原（例えば、がん抗原）を３０，０００〜２０，０００分子／細胞の密度で、２０，０００〜１０，０００分子／細胞の密度で、１０，０００分子／細胞以下の密度で、５０００分子／細胞以下の密度で、又は１０００分子／細胞以下の密度で発現する細胞において、付与された又は増強された、結合活性及び親和性並びに／又はエフェクター機能も有することが好ましい。本発明の分子は、標的抗原が標的細胞集団において低レベルで発現される、亜集団におけるがん等の疾患又は障害の治療、予防又は管理に特に有用である。
本発明の分子は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症等の疾患の治療又は予防のための、当該技術分野において既知の他の治療薬との併用においても、有利に使用することができる。特定の実施形態では、本発明の分子は、モノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、リンホカイン、又は造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３及びＩＬ−７等）と併用して使用することができ、例えば、これらの分子と相互作用し、免疫応答を増加させるエフェクター細胞の数又は活性を増加させる機能を果たす。本発明の分子は、例えば抗がん剤、抗炎症剤又は抗ウイルス性因子等（例えば、第５．７節で詳細に記述）の、疾患、障害、又は感染を治療するために使用される１つ又は複数の薬剤との併用においても、有利に使用することができる。
５．５．１ がん
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインを含む、治療有効量の１つ又は複数の分子を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療又は予防のための方法及び組成物を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ＦγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ又はＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ対立遺伝子に関してホモ接合性であるような、ＦｃγＲ多形性を有する対象における、がんの治療又は予防のための方法及び組成物を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）と免疫特異的に結合するように、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを設計することを包含する。他の実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）と免疫特異的に結合するように、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを設計することを包含する。
標準的なモノクローナル抗体治療の有効性は、対象のＦｃγＲ多形性に依存する（Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene," Blood 99: 754-758; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J Clin Oncol. 21(21):3940-3947、これら共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの受容体はエフェクター細胞の表面上に発現され、ＡＤＣＣを仲介する。低親和性活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞の、ＡＤＣＣを仲介する能力を向上させる。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用に依存してエフェクター機能に影響を与えることとは対照的に、本発明の方法は、低親和性活性化受容体を免疫特異的に認識するように分子を操作することよって、特定の多形性に対するその分子の設計を可能とすることを包含する。あるいは又はさらに、エフェクター細胞上のＦｃγＲ（野生型Ｆｃドメインと比較して）に対して増強された親和性を示す変異型Ｆｃドメインを含むように、本発明の分子を操作することができる。本発明の操作された分子は、患者に、そのＦｃγＲ多形性にかかわらず、より良い免疫療法試薬を提供する。
本発明に従って操作されたダイアボディ分子を、培養細胞株又は患者由来ＰＭＢＣ細胞を用いるＡＤＣＣによって試験して、ＡＤＣＣを増強するＦｃ変異の能力を決定する。本明細書で開示される方法を用いて標準的なＡＤＣＣを行う。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（ファルマシア社）を用いて、リンパ球を末梢血から採取する。標的細胞、すなわち、培養細胞株又は患者由来細胞にユウロピウム（パーキンエルマー社）を添加し、エフェクターと共に３７℃で４時間インキュベートする。蛍光プレートリーダー（ワラック社（Wallac））を用いて、放出されたユウロピウムを検出する。得られたＡＤＣＣデータは、ＮＫ細胞仲介性細胞毒性を誘発する本発明の分子の有効性を示し、どの分子が患者試料及び単離した単球の両方で試験可能であるかを確立する。ＡＤＣＣ活性を誘発する最も大きな可能性を示すダイアボディ分子を、次に、患者由来ＰＢＭＣを用いるＡＤＣＣアッセイで試験する。健常ドナー由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する。
従って本発明は、ダイアボディ分子が、それ自体細胞傷害性であり（例えば、表面受容体の架橋によりもたらされるアポトーシスの増加又は増殖シグナルの下方制御を介して）、及び／又は本発明に従ってＦｃドメインを含み、及び／又は１つもしくは複数のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、貪食作用）を仲介するように、がん抗原を免疫特異的に認識するようにダイアボディ分子を設計することによる、がん抗原によって特徴付けられたがんを予防又は治療する方法を提供する。本発明に従って設計されたダイアボディは、細胞障害活性（例えば、増強された腫瘍細胞殺傷能及び／又は増強された、例えば、ＡＤＣＣ活性もしくはＣＤＣ活性）を有するために、がんの予防又は治療に有用である。
がん抗原と関連するがんは、がん抗原と結合し、細胞傷害性であり、及び／又はエフェクター機能を示すように本発明の方法に従って設計されたダイアボディの投与によって、治療又は予防することができる。例えば、限定が目的ではないが、以下のがん抗原と関連するがんは、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防可能である：ＫＳ１／４汎癌抗原（pan-carcinoma antigen）（Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker," J. Immunol. 142:3662-3667; Moller et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216）、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2):468-475）、前立腺性酸性ホスファターゼ（Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone," Nucl. Acids Res. 18(16):4928）、前立腺特異抗原（Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Res. 53:227-230）、黒色腫関連抗原ｐ９７（Estin et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97," J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454）、黒色腫抗原ｇｐ７５（Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product," J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）、高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance," Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies," J. Clin. Invest. 86:2136-2144)）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児抗原（ＣＥＡ）（Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine," J. Clin. Invest. 96(1):334-42）、多形上皮性ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、大腸腫瘍関連抗原、例えばＣＥＡ、ＴＡＧ−７２（Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms," Cancer Res. 52:3402-3408）、ＣＯ１７−１Ａ（Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced," Int. J. Cancer 53:751-758）；ＧＩＣＡ１９−９（Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma," J. Clin. Immunol. 2:135-140）、ＣＴＡ−１及びＬＥＡ、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＤ１９（Ghetie et al. (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines インビトロ And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest," Blood 83:1329-1336）、ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０（Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells インビボ By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20," Blood 83:435-445）、ＣＤ３３（Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia," J. Nucl. Med. 34:422-430）、ガングリオシドＧＤ２等の黒色腫特異的抗原（Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen," J.Immunol., 151, 3390-3398）、ガングリオシドＧＤ３（Shitara et al. (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities," Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380）、ガングリオシドＧＭ２（Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside," J. Clin. Oncol. 12:1036-1044）、ガングリオシドＧＭ３（Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers," Cancer Res. 53:5244-5250）、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（tumor-specific transplantation type of cell-surface antigen）（ＴＳＴＡ）（例えば、ＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原、結腸のＣＥＡ、膀胱腫瘍腫瘍胎児抗原等の腫瘍胎児抗原−α−フェトプロテイン）（Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res. 45:2210-2188）、ヒト肺癌抗原Ｌ６、Ｌ２０等の分化抗原（Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res. 46:3917-3923）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７（Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)," J. Immunol. 141:1398-1403）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えばＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）、多形上皮性ムチン（ＰＥＭ））（Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property," Trends in Biochem. Sci. 17:359-363）、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１（Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis," Science 245:301-304）、分化抗原（Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens," Nature 314:53-57）、例えば、胎児赤血球及び初期内胚葉に存在するＩ抗原、胃腺癌に存在するＩ（Ｍａ）、乳房上皮に存在するＭ１８及びＭ３９、骨髄性細胞に存在するＳＳＥＡ−１、結腸直腸がんに存在するＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５、及びＤ１５６−２２、ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）、結腸腺癌に存在するＣ１４、肺腺癌に存在するＦ３、胃がんに存在するＡＨ６、胎生期癌細胞に存在するＹハプテン、Ｌｅｙ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１細胞に存在するＥＧＦ受容体、膵がんに存在するＥ１系列（血液型Ｂ）、胎生期癌細胞、胃腺癌に存在するＦＣ１０．２、腺癌に存在するＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）、腺癌に存在するＮＳ−１０、ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）、Ｇ４９、ＥＧＦ受容体、結腸腺癌に存在する（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）、結腸がん、胃がんムチンに存在する１９．９、骨髄性細胞に存在するＴ５Ａ７、黒色腫に存在するＲ２４、胎生期癌細胞に存在する４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、Ｍ１：２２：２５：８、並びにに存在する４〜８細胞期に存在するＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４が挙げられる。別の実施形態では、抗原は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫から得られたＴ細胞受容体由来のペプチドである（Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy," Cancer J Sci Am. 4:62-71参照）。
本発明の方法及び組成物によって治療又は予防することができるがん及び関連疾患としては、限定はされないが、以下が挙げられる：白血病（例えば、限定はされないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病及び骨髄異形成症候群等）、慢性白血病（例えば、限定はされないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病等））；真性赤血球増加症；リンパ腫（例えば、限定はされないが、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫）；多発性骨髄腫（例えば、限定はされないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；意味未確定の単クローン性高γグロブリン血症；良性の単クローン性高γグロブリン血症；重鎖病；骨肉腫及び結合組織肉腫（例えば、限定はされないが、骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜性骨肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫）；脳腫瘍（例えば、限定はされないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫瘍（nonglial tumor）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫）；乳がん（例えば、限定はされないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、乳腺髄様がん、胸部粘液性がん、胸部管状腺がん、胸部乳頭がん、パジェット病、及び炎症性乳がん）；副腎がん（例えば、限定はされないが、褐色細胞腫及び副腎皮質癌）；甲状腺がん（例えば、限定はされないが、乳頭様又は濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様がん及び組織非形成性甲状腺がん）；膵がん（例えば、限定はされないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン産生腫瘍、及びカルチノイド又は島細胞腫瘍）；下垂体がん（例えば、限定はされないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症）；眼がん（例えば、限定はされないが、眼黒色腫（虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、及び毛様体黒色腫）、及び網膜芽細胞腫）；腟がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮癌、腺癌、及び黒色腫）；外陰がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病）；子宮頸がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮癌、及び腺癌）；子宮がん（例えば、限定はされないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫）；卵巣がん（例えば、限定はされないが、上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞性腫瘍、及び間質性腫瘍）；食道がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌）；胃がん（例えば、限定はされないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在性、拡散性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫）；結腸がん；直腸がん；肝臓がん（例えば、限定はされないが、肝細胞癌及び肝芽腫）、胆嚢がん（例えば、限定はされないが、腺癌）；胆管癌（例えば、限定はされないが、乳頭部、結節性、及び拡散性）；肺がん（例えば、限定はされないが、非小細胞肺がん、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺がん）；精巣がん（例えば、限定はされないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的（典型的）、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍））、前立腺がん（例えば、限定はされないが、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫）；陰茎がん；口腔がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮癌）；基底細胞がん；唾液腺がん（例えば、限定はされないが、腺癌、粘表皮癌、及び腺様嚢胞癌）；咽頭がん（例えば、限定はされないが、扁平上皮がん、及び疣状がん）；皮膚がん（例えば、限定はされないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫）；腎がん（例えば、限定はされないが、腎細胞がん、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮がん（腎盂及び／又は尿管）；ウィルムス腫瘍；膀胱がん（例えば、限定はされないが、移行上皮癌、扁平上皮がん、腺癌、癌肉腫）。さらに、がんとしては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌及び乳頭状腺癌が挙げられる（そのような疾患の総説としては、Fishman et al. (1985) Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia;及びMurphy et al. (1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい）。
従って、本発明の方法及び組成物は、以下を含む（しかしこれらに限定はされない）、種々のがん又は他の異常増殖性疾患の治療又は予防にも有用である：癌（例えば、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頸部、甲状腺及び皮膚の癌）；扁平上皮癌を含む癌；リンパ系の血液系腫瘍（例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）；骨髄系の血液系腫瘍（例えば、急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病）；間葉系由来の腫瘍（例えば、線維肉腫及び横紋筋肉腫）；他の腫瘍（例えば、黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫）；中枢及び末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及びシュワン細胞腫）；間葉系由来の腫瘍（例えば、繊維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫）；並びに他の腫瘍（例えば、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞がん及び奇形癌腫）。アポトーシスの異常により引き起こされるがんを本発明の方法及び組成物によって治療することも企図される。そのようながんとしては、限定はされないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌、乳房、前立腺及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、並びに家族性大腸腺腫症、及び骨髄異形成症候群等の前癌病変が挙げられ得る。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、又は子宮において、悪性もしくは異常増殖性変化（例えば異形成及び形成異常）、又は過剰増殖性疾患が、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、又は白血病が、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防される。
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含むダイアボディ）は、がん細胞の増殖を、前記本発明の分子の非存在下におけるがん細胞の増殖と比べて、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％だけ阻害又は低減する。
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含むダイアボディ）は、親分子よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％より良好に、細胞を殺傷するか又はがん細胞の増殖を阻害もしくは低減する。
５．５．２ 自己免疫疾患及び炎症性疾患
一部の実施形態では、本発明の分子は、ＦｃγＲＩＩＢに対して特異的なエピトープ結合ドメイン、並びに／又は本発明の方法によって操作され、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγＲＩＩＢに対するより大きな親和性並びにＦｃγＲＩＩＩＡ及び／もしくはＦｃγＲＩＩＡに対する低減された親和性を示す変異型Ｆｃドメイン（又はその一部）を含む。そのような結合特徴を有する本発明の分子は、免疫応答の調節（例えば、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する免疫応答の阻害）において有用である。いかなる作用機序にも束縛されることを意図するものではないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する、並びに／又はＦｃγＲＩＩＢに対する増加された親和性並びにＦｃγＲＩＩＩＡ及び／もしくはＦｃγＲＩＩＡに対する低減された親和性を有するＦｃドメインを含む本発明の分子は、ＦｃγＲに対する活性化応答の減弱及び細胞応答性の阻害を引き起こし得るため、自己免疫障害の治療及び／又は予防のための治療効果を有する。
本発明は、治療有効量又は予防有効量の１つ又は複数の抗炎症剤を対象に投与することをさらに含む、対象における炎症性疾患に関連する１つ又は複数の症状を予防、治療、又は管理する方法も提供する。本発明は、治療有効量又は予防有効量の１つ又は複数の免疫調節剤を対象に投与することをさらに含む、自己免疫疾患に関連する１つ又は複数の症状を予防、治療、又は管理する方法も提供する。第５．７節は抗炎症剤及び免疫調節剤の非限定例を提供する。
本発明の分子を投与することにより治療することができる自己免疫障害の例としては、限定はされないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性の卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎（celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎（fibromyalgia-fibromyositis）、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害（IgA neuropathy）、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型又は免疫介在性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎（polychrondritis）、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ様関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば疱疹状皮膚炎型血管炎（dermatitis herpetiformis vasculitis）、白斑、並びにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性疾患の例としては、限定はされないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症、未分化（undifferentitated）脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又は細菌感染から引き起こされる慢性炎症が挙げられる。第２．２．２節で本明細書に記載されるように、いくつかの自己免疫障害は炎症性疾患と関連している。従って、自己免疫障害と見なされているものと炎症性疾患とみなされているものの間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性疾患として特徴付けることもできる。本発明の方法により予防、治療又は管理することができる炎症性疾患の例としては、限定はされないが、喘息、脳炎（encephilitis）、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又は細菌感染から引き起こされる慢性炎症が挙げられる。
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメイン並びに／又はＦｃγＲＩＩＢに対する増強された親和性及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する低減された親和性を有する変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子は、炎症性疾患に罹患した動物、特に哺乳動物によって経験される炎症を低減するために使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は、動物における炎症を、前記分子を投与されていない動物における炎症と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％だけ低減する。
ＦｃγＲＩＩＢに対して特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメイン並びに／又はＦｃγＲＩＩＢに対する増強された親和性及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する低減された親和性を有する変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子は、移植片拒絶を予防するために使用することもできる。
５．５．３ 感染症
本発明は、感染症に関連する感染体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む治療有効量又は予防（prophylatically）有効量の１つ又は複数の本発明の分子を投与することを含む、対象における感染症を治療又は予防する方法も包含する。ある実施形態では、本発明の分子は、感染体に対し毒性があり、前記分子の非存在下における免疫応答と比較して、前記因子に対する免疫応答を増強するか又は前記因子に対するエフェクター機能を増強しする。本発明の分子によって治療又は予防することができる感染症は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、及びウイルスを含むがこれらに限定はされない感染体によって引き起こされる。
本発明の分子を本発明の方法とともに用いて治療又は予防することができるウイルス性疾患としては、限定はされないが、以下によって引き起こされるウイルス性疾患が挙げられる：Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、及びウイルスの髄膜炎、脳炎、デング熱又は天然痘等のウイルス性疾患の因子。
本発明の分子を本発明の方法とともに用いて治療又は予防することができる、細菌によって引き起こされる細菌性疾患としては、限定はされないが、マイコバクテリアリケッチア（mycobacteria rickettsia）、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌（S. pneumonia）、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）（ライム病）、炭疽菌（Bacillus antracis）（炭疽）、テタヌス、連鎖球菌、ブドウ球菌、マイコバクテリウム、テタヌス、ペルチスス（pertissus）、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌（S. aureus）及びレジオネラが挙げられる。
本発明の分子を本発明の方法とともに用いて治療又は予防することができる、原虫によって引き起こされる原虫性疾患としては、限定はされないが、リーシュマニア、コクジディオア（kokzidioa）、トリパノソーマ又はマラリアが挙げられる。
本発明の分子を本発明の方法とともに用いて治療又は予防することができる、寄生虫によって引き起こされる寄生虫性疾患としては、限定はされないが、クラミジア及びリケッチアが挙げられる。
本発明の一態様によれば、感染体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子は、前記因子（例えば、病原性タンパク質）に対して抗体エフェクター機能を示す。感染体の例としては、限定はされないが、細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌（Enterococcus faecials）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、スタフィロコッカス・ビリダンス（Staphylococcus viridans）、及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、病原体（例えば、Ｂリンパ球パポーバウイルス（B-lymphotropic papovavirus）（ＬＰＶ）；ボルダテラ・ペルツッシス（Bordatella pertussis）；ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）；ウシコロナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デングウイルス；ウイルス、大腸菌（E. coli）；エボラ；エコーウイルス１；エコーウイルス−１１（ＥＶ）；内毒素（ＬＰＳ）；腸内細菌；腸内オーファンウイルス（Enteric Orphan virus）；腸内ウイルス；ネコ白血病ウイルス；口蹄疫ウイルス；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）；グラム陰性細菌；ピロリ菌；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；単純ヘルペスウイルス；ＨＩＶ−１；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロナウイルス；インフルエンザＡ、Ｂ＆Ｃ；レジオネラ；メキシコリーシュマニア（Leishmania mexicana）；リステリア菌（Listeria monocytogenes）；麻疹ウイルス；髄膜炎菌；モルビリウイルス；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイルス；マウスガンマヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス；マウスコロナウイルス マウス肝炎ウイルス；マイコバクテリウム・アビウム−Ｍ（Mycobacterium avium-M）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）；ニューカッスル病ウイルス；パルボウイルスＢ１９；熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）；ポックスウイルス；シュードモナス；ロタウイルス；ネズミチフス菌；赤痢菌；連鎖球菌；Ｔリンパ球向性ウイルス１；ワクシニアウイルス）が挙げられる。
５．５．４ 解毒
本発明は、毒性がある薬剤分子に対して特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む、治療有効量又は予防（prophylatically）有効量の１つ又は複数の本発明の分子を投与することを含む、毒素（例えば、毒性がある薬剤分子）に暴露された対象における解毒の方法も包含する。ある実施形態では、本発明の分子の毒素への結合によって、前記毒素の有害な生理作用が低減又は除去される。さらに他の実施形態では、本発明の分子の毒素への結合によって、前記ダイアボディ非存在下における除去、分解又は中和と比較して、毒素の除去、分解又は中和が増加又は増強される。本発明の方法による免疫毒性治療（immunotoxicotherapy）を用いて、ジゴキシン、ＰＣＰ、コカイン、コルヒチン、及び三環系抗うつ薬を含むがこれらに限定はされない薬剤の過剰投与又は暴露を治療することができる。
併用療法
本発明は、現行の標準的及び実験的な化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、又は外科手術を含むがこれらに限定はされない、がん、自己免疫疾患、感染症又は中毒の治療又は予防のための当業者に既知の他の療法と併用して、本発明の分子を投与することをさらに包含する。一部の実施形態では、本発明の分子を、治療有効量又は予防有効量の１つ又は複数の薬剤、抗体医薬又はがん、自己免疫疾患、感染症もしくは中毒の治療及び／もしくは予防のための当業者に既知の他の薬剤と併用して、投与することができる。
ある実施形態では、１つ又は複数の本発明の分子は、がんの治療に有用な１つ又は複数の他の治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。「同時に」という用語は、正確に同一な時間での予防薬又は治療薬の投与に限定はされず、本発明の分子及び他の薬剤が、連続的に、且つ本発明の分子が他の薬剤と共に作用して、それらが別の方法で投与された場合よりも、恩恵を増加させることができるような時間間隔以内で、哺乳動物に投与されることを意味する。例えば、それぞれの予防薬又は治療薬（例えば、化学療法、放射線治療、ホルモン療法又は生物学的療法）を、同時に又は連続的に、任意の順番で、異なる時点で投与することができが；同時に投与しない場合、所望の治療効果又は予防効果を得るために、十分に近い時点で、それらを投与するべきである。各治療薬は、あらゆる適切な形態で、あらゆる適切な経路によって、別々に投与することができる。種々の実施形態では、予防薬又は治療薬は、１時間未満の間隔、約１時間間隔、約１時間〜約２時間間隔、約２時間〜約３時間間隔、約３時間〜約４時間間隔、約４時間〜約５時間間隔、約５時間〜約６時間間隔、約６時間〜約７時間間隔、約７時間〜約８時間間隔、約８時間〜約９時間間隔、約９時間〜約１０時間間隔、約１０時間〜約１１時間間隔、約１１時間〜約１２時間間隔、２４時間間隔以下又は４８時間間隔以下で投与される。好ましい実施形態では、２つ以上の成分が同一の患者診察内に投与される。
他の実施形態では、予防薬又は治療薬は、約２〜４日間間隔、約４〜６日間間隔、約１週間間隔、約１〜２週間間隔、又は２週間以上の間隔で投与される。好ましい実施形態では、予防薬又は治療薬は、両方の薬剤が依然活性である時間枠内に投与される。当業者であれば、投与薬剤の半減期を決定することにより、そのような時間枠を決定することができるであろう。
ある実施形態では、本発明の予防薬又は治療薬は対象に周期的に投与される。周期的治療には、第一薬剤の一定期間の投与、続く第二薬剤及び／又は第三薬剤の一定期間の投与、並びにこの連続投与の繰り返しが含まれる。周期的治療は、療法のうちの１種もしくは複数に対する耐性の進行を減速し、療法のうちの１つの副作用を回避又は低減し、及び／又は治療の有効性を向上させることができる。
ある実施形態では、予防薬又は治療薬は、約３週間未満、およそ２週間に一度、およそ１０日間に一度又はおよそ週に一度の周期で投与される。１回の周期には、周期毎に約９０分間、周期毎に約１時間、周期毎に約４５分間かけて点滴することによる、治療薬又は予防薬の投与が含まれ得る。各周期には少なくとも１週間の休止期間、少なくとも２週間の休止期間、少なくとも３週間の休止期間が含まれ得る。投与を受ける周期数は、約１〜約１２周期、より典型的には約２〜約１０周期、より典型的には約２〜約８周期である。
さらに他の実施形態では、本発明の治療薬又は予防薬は、長期の休止期間をおかない持続点滴又は頻回投与のいずれかによるメトロノーム的な投与計画において投与される。そのようなメトロノーム的投与には、休止期間無しに一定間隔で投与することが含まれ得る。典型的には、治療薬、具体的には細胞毒は、低用量で使用される。そのような投与計画は、長期間の、比較的低用量の長期連日投与を包含する。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を最少にし、休止期間を排除することができる。ある実施形態では、治療薬及び予防薬は、約２４時間から、約２日間まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで、約１ヵ月間まで、約２ヵ月間まで、約３ヵ月間まで、約４ヵ月間まで、約５ヵ月間まで、約６ヵ月間までの範囲の長期低用量点滴又は持続点滴によって送達される。そのような用法のスケジューリングは、熟達した腫瘍学者が最適化することができる。
他の実施形態では、治療コースは哺乳動物に同時に投与さる、すなわち、治療薬の個々の投与量を、別々にではあるが、本発明の分子が１つ又は複数の他の薬剤と共に作用可能なような時間間隔内に、投与する。例えば、ある成分を、２週間毎に１回又は三週間毎に１回投与することができる他の成分との併用で、週１回投与することができる。言い換えれば、たとえ治療薬が同時に又は同一の患者診察内に投与されなくとも、治療薬の投与計画は同時に実行される。
他の予防薬及び／又は治療薬と併用して使用される場合、本発明の分子並びに予防薬及び／又は治療薬は、相加的に、又はより好ましくは相乗的に、作用することができる。一実施形態では、本発明の分子は、同一の医薬組成物内で、１つ又は複数の治療薬と同時に投与される。別の実施形態では、本発明の分子は、別々の医薬組成物において、１つ又は複数の他の治療薬と同時に投与される。さらなる別の実施形態では、本発明の分子は、別の予防薬又は治療薬の投与に先立ち、又はそれに連続して、投与される。本発明は、同一又は異なる投与経路（例えば、経口及び非経口）による、他の予防薬又は治療薬との併用における本発明の分子の投与を企図している。ある実施形態では、本発明の分子が、毒性を含むがこれに限定はされない有害副作用を生じる可能性がある別の予防薬又は治療薬と同時に投与される場合、予防薬又は治療薬は、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で有利に投与することができる。
本明細書で提供される投与量及び投与頻度は、治療効果のある、及び予防効果のあるという用語によって包含される。投与量及び頻度はさらに、典型的には、各患者に特有の要因によって、投与される特定の治療薬又は予防薬、がん重症度及びタイプ、投与経路、並びに患者の年齢、体重、応答性、及び病歴に応じて、変化する。適切な投与計画は、当業者がそのような要因を考慮し、例えば、文献に報告され、Physician's Desk Reference（56th ed., 2002）で推奨される投与量に従うことにより、選択することができる。
５．５．５ 抗がん剤
特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ又は複数の本発明の分子を、がんの治療及び／又は予防に使用される１つ又は複数の治療薬と共に投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害剤を、本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法及び組成物において使用することができる血管新生抑制剤としては、限定はされないが、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）；血管新生抑制アンチトロンビンＩＩＩ；アンギオザイム（Angiozyme）；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ１２−９５６６；ベネフィン；ベバシズマブ；ＢＭＳ−２７５２９１；軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９補体断片；ＣＥＰ−７０５５；Ｃｏｌ３；コンブレタスタチンＡ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）；フィブロネクチン断片；グロβ（Gro-beta）；ハロフジノン；ヘパリナーゼ；ヘパリンヘキササッカライド断片；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ−１０）；インターロイキン−１２；クリングル５（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット（Marimastat）；メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）；モノクローナル抗体ＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット（Neovastat）；ＮＭ−３；パンゼム（Panzem）；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子；血小板因子−４（ＰＦ４）；プリノマスタット（Prinomastat）；プロラクチン１６ｋＤａ断片；プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４；レチノイド；ソリマスタット（Solimastat）；スクアラミン；ＳＳ３３０４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１２４８；テトラヒドロコルチゾル−Ｓ；テトラチオモリブデート；サリドマイド；トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−ｂ）；バスキュロスタチン（Vasculostatin）；バソスタチン（Vasostatin）（カルレティキュリン断片）；ＺＤ６１２６；ＺＤ６４７４；ファルネシル基転移酵素阻害剤（ＦＴＩ）；及びビスホスホネートが挙げられる。
本発明の医薬組成物及び剤形並びにキットを含む本発明の種々の実施形態において本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗がん剤としては、限定はされないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（caracemide）；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デアザグアニン；メシル酸デアザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロールニチン；エルサマイシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン（esorubicin）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（例えば組換えインターロイキンＩＩ、又はｒＩＬ２）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβＩ ａ；インターフェロンγ−Ｉ ｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメテレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン（mitomalcin）；マイトマイシン；ミトスペル（mitosper）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン（simtrazene）；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗がん剤としては、限定はされないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗薬；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドクス（amidox）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；拮抗薬Ｄ；拮抗薬Ｇ；アンタレリクス；抗背方化形態発生タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン（benzochlorin）；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；βアレチン；βクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロルルン（chlorln）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン；シタラビンオクフォスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリズマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（dexifosfamide）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドクス（didox）；ジエチルノルスペニン（diethylnorspennine）；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン（edelfosine）；エドレコロマブ；エフロールニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン（galocitabine）；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（idramantone）；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（imidazoacridone）；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロン作動薬；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセタート（lamellarin-N triacetate）；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻止因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメテレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビンラルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム（myobacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１に基づく治療；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（napavin）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン（nitrullyn）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（oracin）；経口サイトカイン誘導物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（placetin）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫調節薬；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤（微細藻類）；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体；ｒａｆ拮抗薬；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン（retelliptine demethylated）；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化由来阻害物質（senescence derived inhibitor）１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達修飾薬；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプト酸ナトリウム（sodium borocaptate）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；過剰活性型血管作用性小腸ペプチド拮抗薬；スラジスタ（suradista）；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣剤；チマルファシン；サイモポエチン受容体作動薬；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；二塩化チタノセン（titanocene bichloride）；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレソール；ベラミン（veramine）；ベルジン（verdin）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（vinxaltine）；ビタキシン（vitaxin）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましいさらなる抗がん剤は５−フルオロウラシル及びロイコボリンである。
本発明の方法で使用することができる抗体医薬の例としては、限定はされないが、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）（ロシュ社、スイス）（急性腎同種移植片拒絶の予防用の免疫抑制性ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）；ＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（マウス抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体）（グラクソウェルカム社／セントコア社）；ＢＥＣ２（マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体）（イムクローン社）；ＩＭＣ−Ｃ２２５（キメラ抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ抗体）（イムクローン社）；ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体）（アプライド・モレキュラー・エボリューション社（Applied Molecular Evolution）／メドイミューン社（MedImmune））；Ｓｍａｒｔ Ｍ１９５（ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ抗体）（プロテイン・デザイン・ラボ社（Protein Design Lab）／カネボウ社）；ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（ヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ抗体）（イムノメディクス社（Immunomedics））；ＩＣＭ３（ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体）（ＩＣＯＳファーマ社（ICOS Pharm））；ＩＤＥＣ−１１４（霊長類化抗ＣＤ８０抗体）（ＩＤＥＣファーマ社（IDEC Pharm）／三菱社）；ＩＤＥＣ−１３１（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体）（ＩＤＥＣ社／エーザイ社）；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４抗体）（ＩＤＥＣ社）；ＩＤＥＣ−１５２（霊長類化抗ＣＤ２３抗体）（ＩＤＥＣ社／生化学工業社）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（ヒト化抗ＣＤ３ ＩｇＧ）（プロテイン・デザイン・ラボ社（Protein Design Lab））；５Ｇ１．１（ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体）（アレクシオンファーマ社）；Ｄ２Ｅ７（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体）（ＣＡＴ社／ＢＡＳＦ社）；ＣＤＰ８７０（ヒト化抗ＴＮＦ−αＦａｂフラグメント）（セルテック社（Celltech））；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４ ＩｇＧ１抗体）（ＩＤＥＣファーマ社（IDEC Pharm）／スミスクライン・ビーチャム社）；ＭＤＸ−ＣＤ４（ヒト抗ＣＤ４ ＩｇＧ抗体（メダレックス社／エーザイ社／ジェンマブ社（Genmab））；ＣＤＰ５７１（ヒト化抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ４抗体）（セルテック社（Celltech））；ＬＤＰ−０２（ヒト化抗α４β７抗体）（リューコサイト社（LeukoSite）／ジェネンテック社）；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ ＯＫＴ４Ａ（ヒト化抗ＣＤ４ ＩｇＧ抗体）（オルソ・バイオテック社（Ortho Biotech））；ＡＮＴＯＶＡ（商標）（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ ＩｇＧ抗体）（バイオジェン社（Biogen））；ＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）（ヒト化抗ＶＬＡ−４ ＩｇＧ抗体）（エラン社（Elan））；及びＣＡＴ−１５２（ヒト抗ＴＧＦ−β２抗体）（ケンブリッジ・アンチボディ・テクノロジー社（Cambridge Ab Tech））が挙げられる。本発明に従って使用することができる抗体医薬の他の例を表８に記載する。






５．５．６ 免疫調節剤及び抗炎症剤
本発明は、他の治療薬と併用して本発明の分子を投与することを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患に対する治療法を提供する。免疫調節剤の例としては、限定はされないが、メトトレキサート、ＥＮＢＲＥＬ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、及びマクロライド系抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、副腎皮質ステロイド、ステロイド類、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリロアミンデス（malononitriloamindes）（例えば、レフルノミド（leflunamide））、Ｔ細胞受容体修飾薬、及びサイトカイン受容体修飾薬が挙げられる。
抗炎症剤は炎症性障害及び自己免疫障害の治療において成功を示しており、現在では、そのような障害に対する一般的で標準的な治療である。当業者に周知のいかなる抗炎症剤も本発明の方法で使用可能である。抗炎症剤の非制限的な例としては、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症剤、β作動薬、抗コリン剤、及びメチルキサンチンが挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、限定はされないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトロラク（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））及びナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））が挙げられる。そのようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１及び／又はＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症剤の例としては、限定はされないが、糖質コルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、及びエイコサノイド（例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、及びロイコトリエン）が挙げられる。
本発明の分子と併用して炎症性疾患の治療又は予防に使用することができる抗体の非限定的な例を表９に記載し、自己免疫障害の治療又は予防に使用することができる抗体の非限定的な例を表１０に記載する。







５．５．７ 感染症治療に用いるための薬剤
一部の実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療及び／又は予防のための、当業者に既知の、治療有効量又は予防有効量の１種又は追加の治療薬と併用して投与することができる。本発明は、感染症の治療及び／又は予防のための、当業者に既知の抗菌剤との併用における、本発明の分子の使用を企図している。本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗生物質としては、限定はされないが、マクロライド（例えば、トブラマイシン（Ｔｏｂｉ（登録商標）））、セファロスポリン（例えば、セファレキシン（Ｋｅｆｌｅｘ（登録商標））、セフラジン（Ｖｅｌｏｓｅｆ（登録商標））、セフロキシム（Ｃｅｆｔｉｎ（登録商標））、セフプロジル（Ｃｅｆｚｉｌ（登録商標））、セファクロル（Ｃｅｃｌｏｒ（登録商標））、セフィキシム（Ｓｕｐｒａｘ（登録商標））又はセファドロキシル（Ｄｕｒｉｃｅｆ（登録商標）））、クラリスロマイシン（例えば、クラリスロマイシン（Ｂｉａｘｉｎ（登録商標）））、エリスロマイシン（例えば、エリスロマイシン（ＥＭｙｃｉｎ（登録商標）））、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ（Ｖ−Ｃｉｌｌｉｎ Ｋ（登録商標）又はＰｅｎ Ｖｅｅ Ｋ（登録商標）））又はキノロン（例えば、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標））、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（登録商標））又はノルフロキサシン（Ｎｏｒｏｘｉｎ（登録商標）））、アミノグリコシド抗菌剤（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸塩、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、及びスペクチノマイシン）、アンフェニコール抗菌剤（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、及びチアンフェニコール）、アンサマイシン抗菌剤（例えば、リファミド及びリファンピン）、カルバセフェム系薬剤（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム系薬剤（例えば、ビアペネム及びイミペネム）、セファロスポリン系薬剤（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、及びセフピロム）、セファマイシン系薬剤（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、及びセフミノクス）、モノバクタム系薬剤（例えば、アズトレオナム、カルモナム、及びチゲモナン（tigemonam））、オキサセフェム系薬剤（例えば、フロモキセフ、及びモキサラクタム）、ペニシリン系薬剤（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナマクシリン（penamccillin）、ペネタメートヨウ化水素酸塩（penethamate hydriodide）、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリン０、ペニシリンＶ、ベンザチンペニシリンＶ、ヒドラバミンペニシリンＶ、ペニメピサイクリン、及びフェネチシリンカリウム）、リンコマイシン系薬剤（例えば、クリンダマイシン、及びリンコマイシン）、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系薬剤（例えば、アピシクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、及びデメクロサイクリン）、２，４−ジアミノピリミジン系薬剤（例えば、ブロジモプリム）、ニトロフラン系薬剤（例えば、フラルタドン、及び塩化フラゾリウム）、キノロン系薬剤及びそれらの類似体（例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、及びグレパフロキサシン）、スルホンアミド系薬剤（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン（sulfachrysoidine）、及びスルファシチン）、スルホン系薬剤（例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、及びソラスルホン）、シクロセリン、ムピロシン並びにツベリンが挙げられる。
ある実施形態では、本発明の分子は、治療有効量又は予防有効量の１つ又は複数の抗真菌剤と併用して投与することができる。本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗真菌剤としては、限定はされないが、アンホテリシンＢ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル（intrathecal）、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン（haloprogrin）、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレン酸塩、及びグリセオフルビン（griseofuldin）が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の分子は、治療有効量又は予防有効量の１つ又は複数の抗ウイルス剤と併用して投与することができる。本発明の分子と組み合わせて使用することができる有用な抗ウイルス剤としては、限定はされないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤及びヌクレオシド類似体が挙げられる。抗ウイルス剤の例としては、限定はされないが、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、及びリバビリン、並びにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン；アデホビル、クレブジン（clevadine）、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
５．６ ワクチン療法
本発明はさらに、本発明の組成物を使用して、がん抗原及び感染症抗原（これらの例は以下で開示される）を含むがこれらに限定はされない抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘導することを包含する。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる１つ又は複数の抗原又は免疫原を含み、ここで前記１つ又は複数の抗原又は免疫原は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆されている。本発明のワクチン組成物は、抗原又は免疫原に対する、免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘発させるのに特に効果的である。
一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物における抗原又は免疫原は、それに対する免疫応答が望まれるウイルスが含まれる。ウイルスは組換え型であってもキメラであってもよく、好ましくは弱毒化されたウイルスである。組換えウイルス、キメラウイルス、及び弱毒化ウイルスの作製は、当業者に既知の標準方法を用いて行うことができる。本発明は、本発明に従って製剤化される、生きた組換えウイルスワクチン又は不活性化された組換えウイルスワクチンを包含する。宿主中での増殖により、自然感染で生じる刺激と同様の種類及び規模の長い刺激をもたらし、それによってかなり長期にわたる免疫を与えるために、生ワクチンが好ましい場合がある。そのような生きた組換えウイルスワクチン製剤の製造は、細胞培養液中又はニワトリ胚の尿膜中でのウイルスの増殖と、続く精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
特定の実施形態では、組換えウイルスはそれが投与される対象に対して非病原性である。これに関して、ワクチンを目的とする遺伝子改変ウイルスの使用では、これらの株における弱毒化特性の存在が必要とされる場合がある。トランスフェクションに使用される鋳型へ適切な変異（例えば、欠失）を導入することにより、弱毒化特性を有する新規ウイルスを得ることができる。例えば、温度感受性又は低温適応に関連する特定のミスセンス変異を作出して欠失変異を得ることができる。これらの変異は低温又は温度感受性変異体に関連する点変異よりも安定であるはずであり、復帰変異頻度は極めて低いはずである。組換えウイルスを設計するための組換えＤＮＡ技術は当該技術分野において既知であり、本発明に包含される。例えば、マイナス鎖ＲＮＡウイルスを改変するための技術は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１６６，０５７号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
あるいは、本発明の皮内ワクチン製剤に使用するための、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築することができる。そのようなウイルスは宿主内で１回又は数回の複製しか経験しない。ワクチンとして使用される場合、組換えウイルスは限られた複製サイクルを経て十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主内で複製サイクルをさらに経て疾患を引き起こすことはない。あるいは、不活性化された（死滅した）ウイルスを本発明に従って製剤化してもよい。不活性化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための従来技術を用いて作製することができる。不活性化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという意味において「死んでいる」。ウイルスの免疫原性に影響を与えることなくそのの感染性が破壊されることが理想的である。不活性化ワクチンを作製するために、キメラウイルスは、細胞培養液中又はニワトリ胚の尿膜中で増殖せられ、ゾーン超遠心分離で精製され、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトンで不活性化され、プールされ得る。
ある実施形態では、他のウイルス性又は非ウイルス性病原体由来の抗原を含む完全外来エピトープを、本発明の皮内ワクチン製剤で使用するためのウイルスに導入することができる。例えば、ＨＩＶ等の無関係なウイルスの抗原（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）、寄生虫抗原（例えば、マラリア）、細菌もしくは真菌抗原、又は腫瘍抗原を、弱毒化株に導入することができる。
実質的に全ての異種遺伝子配列を、皮内ワクチン製剤に使用するための本発明のキメラウイルスに構築することができる。異種遺伝子配列は、生物学的応答調節物質として作用する部分及びペプチドであることが好ましい。種々の病原体のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープ、又は中和抗体と結合する抗原を、キメラウイルスによって、又はキメラウイルスの一部として発現できることが好ましい。例えば、本発明のキメラウイルス中に構築することができる異種遺伝子配列としては、限定はされないが、インフルエンザ及びパラインフルエンザ赤血球凝集素ノイラミニダーゼ及び融合糖タンパク質（例えばヒトＰＩＶ３のＨＮ及びＦ遺伝子）が挙げられる。さらに別の実施形態では、キメラウイルス中に導入することができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例としては、限定はされないが、サイトカイン、インターフェロン１型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２、−４、−５、−６、−１２、及びこれらの作用物質の拮抗物質が挙げられる。
さらに他の実施形態では、本発明は、その表面上に変異抗体を発現する、病原性の細胞又はウイルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体に抗原又は免疫原が機能的に連結している融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポリペプチドの操作は、通例の組換えＤＮＡ技法を用いて行われ、通常の技術の範囲内である。
本発明はさらに、本発明の組成物を投与することにより、対象において耐性を生じさせる方法を包含する。対象において耐性を生じさせるのに適した組成物は、ＦｃγＲＩＩＢに対するより高い親和性を有する本発明の変異抗体で被覆された抗原又は免疫原を含むことが好ましい。特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、そのような組成物は、ＦｃγＲＩＩＢ仲介性阻害経路を活性化することによって、耐性を生じさせるのに有効である。
５．７ 組成物及び投与方法
本発明は、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりＦｃドメイン（又はその一部）を含む本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）を含む方法及び医薬組成物を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質もしくは結合分子、又は本発明の融合タンパク質もしくは結合分子を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することにより、疾患、障害又は感染に付随する１つ又は複数の症状を治療、予防、及び改善する方法も提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、又は結合分子は、実質的に精製されている（すなわち、その作用を制限する、又は望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない）。特定の実施形態では、対象は動物、好ましくは哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）及び霊長類（例えば、カニクイザル（cynomolgous monkey）等のサル、及びヒト）等である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は対象と同じ種に由来する。
種々の送達系が知られており、本発明の分子を含む組成物を投与するために使用することができる。例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル内封入、抗体又は融合タンパク質を発現可能な組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated インビトロ Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）、レトロウイルスベクター又は他のベクターの一部としての核酸構築等である。本発明の分子を投与する方法としては、限定はされないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、及び粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の分子は筋肉内に、静脈内に、又は皮下に投与される。本組成物はいかなる好都合な経路を介しても、例えば、点滴又はボーラス投与によって、上皮又は粘膜皮膚上皮（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜等）を通じた吸収によって投与することができ、他の生理活性物質と一緒に投与することもできる。投与は全身投与であっても局所投与であってもよい。さらに、例えば、吸入器又は噴霧器の使用により、及びエアゾル化剤を用いた製剤により、肺内投与を採用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，３２０号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号；及び同第４，８８０，０７８号；並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４；ＷＯ９７／３２５７２；ＷＯ９７／４４０１３；ＷＯ９８／３１３４６；及びＷＯ９９／６６９０３（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明は、抗体の量を表示しているアンプル又はサッシェ等の密封容器中にパッケージされた本発明の分子も提供する。一実施形態では、本発明の分子は、密封容器中の乾燥無菌凍結乾燥粉末（dry sterilized lyophilized powder）又は無水濃縮物として提供され、例えば、水又は食塩水を用いて、対象への投与に適切な濃度に再構成することができる。本発明の分子は、密封容器中の乾燥無菌凍結乾燥粉末として、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、又は少なくとも７５ｍｇの単位用量で提供されることが好ましい。凍結乾燥した本発明の分子は、それらの元の容器中で２〜８℃で保存されるべきであり、該分子は再構成から１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内に投与されるべきである。別の実施形態では、本発明の分子は、分子、融合タンパク質、又は結合分子の量及び濃度を表示している密封容器中の液体の形態で提供される。液体形態の本発明の分子は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの該分子として、密封容器中に提供されることが好ましい。
ある障害に付随する１つ又は複数の症状の治療、予防又は改善に有効である本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤中に使用される正確な用量は、投与経路、及び状態の重症度によっても異なり、実施者の判断に従って、及び各患者の都合に応じて決定されるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定することができる。
本発明に包含されるダイアボディに関して、患者に投与される投与量は、典型的には、患者の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｍｇ、０．０００１〜２ｍｇ、０．０００１〜１ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．７５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．２５ｍｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ、０．００１〜０．５ｍｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ又は０．０１〜０．１０ｍｇである。例えば脂質化等の改変によるダイアボディの取り込み及び組織透過性を増強することによって、本発明のダイアボディの投与量及び投与頻度を減少又は変更することができる。
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の投与量は、単剤療法として使用される場合、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日であり得る。別の実施形態では、本発明の分子は他の治療用組成物と併用して使用され、前記分子が単剤療法として使用される場合よりも患者に投与される投与量が少ない。
特定の実施形態では、治療を必要としている領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが好ましい場合があり、これは、例えば、限定のつもりではないが、局所注入により、注射により、又は多孔質、非多孔質、もしくはゼラチン質の物質（例えば、シアラスチック膜（sialastic membrane）等の膜、又は繊維）のインプラントにより達成することができる。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、本発明の分子が吸着しない材料を使用するよう注意しなければならない。
別の実施形態では、ベシクル、具体的にはリポソームで組成物を送達することができる（Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, 同書., pp. 3 17-327；全般的に同書を参照）。
さらに別の実施形態では、制御放出系又は持続放出系で本組成物を送達することができる。１つ又は複数の本発明の分子を含む徐放性製剤を製造するために、当業者に既知のいかなる技術も使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５５４８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２０６９８；Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一実施形態では、制御放出系にポンプを使用することができる（Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516;及びSaudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579参照）。別の実施形態では、抗体の制御放出を達成するために高分子材料を使用することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: インビボ Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112参照）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３参照）。徐放性製剤に使用される高分子の例としては、限定はされないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコール酸（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的（例えば、肺）の近位に配置することができ、そのようにすると全身用量の一部分しか必要とされない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照）。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用な高分子組成物がDunn et al.（米国特許第５，９４５，１５５号参照）に従って使用される。この特定の方法は、前記高分子系からの生物活性物質のインサイツ制御放出の治療効果に基づく。埋め込みは、一般的に、治療的処置を必要としている患者の体内のいずれの場所にも行うことができる。別の実施形態では、非高分子持続性送達系が使用され、それによって、対象の体内の非高分子インプラントが薬物送達系として使用される。体内への埋め込み後、インプラントの有機溶剤が組成物から周辺組織液に散逸、分散、又は浸出し、非高分子材料が徐々に凝固又は沈殿して、固体の微小孔性マトリクスが形成される（米国特許第５，８８８，５３３号）。
制御放出系は、Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533)による総説で論じられている。１つ又は複数の本発明の治療薬を含む持続放出製剤を製造するために、当業者に既知のいかなる技術も使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開番号ＷＯ９１／０５５４８及びＷＯ９６／２０６９８；Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（それぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である特定の実施形態では、該核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に移行されるように、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号参照）を用いて、又は直接注射によって、又は微小粒子照射（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン社）を用いて、又は脂質又は細胞表面受容体又は形質移入剤（transfecting agent）で被覆することによって、又は核に移入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与することによって（例えば、Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照）投与することにより、インビボで投与してそのコードされたダイアボディの発現を促進することができる。あるいは、相同組換えによる発現のために、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に挿入することができる。
治療有効量又は予防有効量の本発明の分子を用いた対象の処置は、単回処置も含み得るし、又は、好ましくは、一連の処置も含み得る。好ましい例では、対象は、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の本発明の分子で、週に１回を、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらにより好ましくは約４、５、又は６週間処置される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は１日１回、１日２回、又は１日３回投与される。他の実施形態では、本医薬組成物は、週１回、週２回、２週間毎に１回、月１回、６週間毎に１回、２ヵ月毎に１回、年２回又は年１回投与される。治療に使用される分子の有効投与量が特定の治療過程にわたって増減し得ることも理解される。
５．７．１ 医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物（例えば、不純又は非無菌組成物）及び単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物（すなわち、対象又は患者への投与に適した組成物）を含む。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の、本明細書で開示される予防薬及び／もしくは治療薬、又はそれらの薬剤の組み合わせ、並びに薬剤的に許容できる担体を含む。本発明の組成物は、予防有効量又は治療有効量の１つ又は複数の本発明の分子及び薬剤的に許容できる担体を含むことが好ましい。
本発明は、本発明のダイアボディ分子及び特定のがん抗原に対して特異的な抗体医薬（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）並びに薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物も包含する。
特定の実施形態では、「薬剤的に許容できる」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されている、又は米国薬局方もしくは他の一般に認知される薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液、例えば、落花生油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等の石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む、水及び油剤であり得る。医薬組成物が静脈内に投与される場合は、水が好ましい担体である。液体担体、特に注射剤用の液体担体として、生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液も使用することができる。適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を組成物に含有させることができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤等の形態をとり得る。
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々に、又は単位剤形中に一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を表示しているアンプル又はサッシェ（sachette）等の密封容器中の乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、提供される。本組成物は、点滴によって投与される場合、無菌の製薬等級の水又は食塩水を含有する点滴ボトルで分配することができる。本組成物が注射によって投与される場合、その成分を投与前に混合することができるように、無菌の注射用蒸留水又は食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤化することができる。薬剤的に許容できる塩としては、限定はされないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するような陰イオンと共に形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するような陽イオンと共に形成される塩が挙げられる。
５．７．２ 遺伝子治療
特定の実施形態では、疾患、障害、又は感染に付随する１つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するために、遺伝子治療として、本発明の分子をコードする配列を含む核酸が投与される。遺伝子治療は、発現核酸又は発現可能核酸の対象への投与によって遂行される治療を指す。本発明の本実施形態では、核酸によって、治療効果又は予防効果を媒介する、それらのコード抗体又はコード融合タンパク質が生成される。
当該技術分野において利用可能な遺伝子治療法のいずれをも、本発明に従って使用することができる。例となる方法を以下に記載する。
遺伝子治療法の全般的総説としては、Goldspiel et al. (1993) "Human Gene Therapy," Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al. (1991) "Delivery Systems For Gene Therapy," Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; and Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217を参照されたい。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の当該技術分野において周知の方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);及びKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
好ましい態様では、本発明の組成物は、本発明のダイアボディをコードし、適切な宿主中で抗体を発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。具体的には、そのような核酸は、抗体コード配列に機能的に連結した、誘導型又は構成型、及び所望により組織特異的である、プロモーター、好ましくは異種プロモーターを有する。別の特定の実施形態では、抗体コード配列及びあらゆる他の所望の配列がゲノム内の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接している核酸分子が使用されることによって、抗体をコードする核酸の染色体内発現が提供される（Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; and Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342:435-438）。
別の好ましい態様では、本発明の組成物は、融合タンパク質をコードし、適切な宿主中で該融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。具体的には、そのような核酸は、融合タンパク質のコード配列に機能的に連結した、誘導型又は構成型、及び所望により組織特異的である、プロモーター、好ましくは異種プロモーターを有する。別の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列及びあらゆる他の所望の配列がゲノム内の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接している核酸分子が使用されることによって、融合タンパク質の染色体内発現が提供される。
対象への核酸の送達は、直接的であってもよく、その場合対象は該核酸又は核酸保有ベクターに直接的に暴露され、あるいは間接的であってもよく、その場合まず細胞がインビトロにおいて該核酸で形質転換され、次に対象に移植される。これらの２つのアプローチはそれぞれ、インビボ遺伝子治療又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療として知られている。
特定の実施形態では、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで発現されてコードされた産物を産生する。これは、当該技術分野において既知の多数の方法のいずれかによって、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築し、細胞内に移行するように投与することによって、例えば、欠陥又は弱毒化したレトロウイルスベクター又は他のウイルスベクターを用いる感染によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は裸ＤＮＡの直接注射によって、又は微小粒子照射（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン社）の使用によって、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤（transfecting agent）で被覆することによって、リポソーム、微小粒子、もしくはマイクロカプセル内封入によって、又は核に移入することが知られているペプチドに連結して投与することによって、受容体依存性エンドサイトーシスを受けやすい抗原に連結して投与することによって（例えば、Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated インビトロ Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）（該受容体を特異的に発現する標的細胞型に使用することができる）、達成することができる。別の実施形態では、抗原が融合性ウイルスペプチドを含んでエンドソームを乱すことで、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする、核酸−抗原複合体を形成させることができる。さらに別の実施形態では、特有の受容体を標的とすることにより、細胞特異的な取り込み及び発現に対して、核酸をインビボで標的化することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；Ｗ０９２／２０３１６；Ｗ０９３／１４１８８；ＷＯ９３／２０２２１参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に挿入することができる（Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;及びZijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342:435-438）。
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、ダイアボディ又は融合タンパク質）をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Miller et al. (1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression," Meth. Enzymol. 217:581-599参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要な成分を含有する。遺伝子治療で使用される抗体又は融合タンパク質をコードする核酸配列は、１つ又は複数のベクター中にクローニングされ、それによって対象へのヌクレオチド配列の送達が促進される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細はBoesen et al. (1993) "Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1 Gene," Biotherapy 6:291-302)に見出すことができ、これは、造血幹細胞を化学療法に対しより耐性とすることを目的とした、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は：Clowes et al. (1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes," J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) "Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells," Blood 83:1467-1473; Salmons et al. (1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy," Human Gene Therapy 4:129-141;及びGrossman et al. (1993) "Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver," Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114である。
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮への遺伝子送達においては特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、呼吸上皮に自然感染して、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染可能であるという利点を有する。Kozarsky et al. (1993, "Gene Therapy: Adenovirus Vectors," Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503)は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療について総括している。Bout et al. (1994, "Lung Gene Therapy: インビボ Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium," Human Gene Therapy, 5:3-10）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を論証している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの他の使用例は、Rosenfeld et al. (1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium インビボ," Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) "インビボ Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium," Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For インビボ Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer," J. Clin. Invest. 91:225-234；ＰＣＴ公開番号Ｗ０９４／１２６４９；及びWang et al. (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions," Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を遺伝子治療で使用することが提案されている（例えば、Walsh et al. (1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies," Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300及び米国特許第５，４３６，１４６号参照）。
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、又はウイルス感染等の方法によって、遺伝子を組織培養中の細胞に導入することを含む。通常、導入方法には、細胞への選択可能なマーカーの導入が含まれる。次に細胞を選択にかけて、導入遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離する。次にこれらの細胞を対象に送達する。
本実施形態では、核酸を細胞に導入し、その後、得られた組換え細胞をインビボで投与する。そのような導入は当該技術分野において既知のいかなる方法によっても実行することができ、例えば、これらに限定はされないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小核体を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合等である。外来遺伝子を細胞へ導入するための数多くの技術が当該技術分野で知られており（例えば、Loeffler et al. (1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA," Meth. Enzymol. 217:599-618, Cotten et al. (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells," Meth. Enzymol. 217:618-644参照）、本発明に従って使用することができるが、ただし受容細胞の必要な発生機能及び生理機能は破壊される。前記技術によって、核酸が細胞によって発現可能であるように、好ましくはその細胞の子孫によって遺伝可能且つ発現可能であるように、細胞への核酸の安定な導入が提供されるはずである。
得られた組換え細胞は、当該技術分野において既知の種々の方法によって、対象に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は造血前駆細胞）は、静脈内投与されることが好ましい。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等によって異なり、当業者により決定され得る。
遺伝子治療のために核酸を導入することができる細胞は、あらゆる、望ましい、利用可能な細胞型を包含し、例えば、限定はされないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、具体的には造血幹細胞又は造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝等から得られる）が挙げられる。
好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は対象自身に由来するものである。
遺伝子治療に組換え細胞が使用される実施形態では、抗体又は融合タンパク質をコードする核酸配列を、細胞又はそれらの子孫により発現可能であるように細胞に導入し、その後、治療効果を得るために組換え細胞をインビボで投与する。特定の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞が使用される。インビトロで単離及び維持することができるいかなる幹細胞及び／又は前駆細胞も、潜在的には、本発明の本実施形態に従って使用することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８５９８；Stemple et al. (1992) "Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest," Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) "Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes," Meth. Cell Bio. 21A:229-254;及びPittelkow et al. (1986) "New Techniques For The インビトロ Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns," Mayo Clinic Proc. 61:771-777）。
特定の実施形態では、遺伝子治療を目的として導入される核酸は、適切な転写誘導因子の存在又は非存在を調節することにより核酸の発現が調節可能となるように、コード配列に機能的に連結した誘導性プロモーターを含む。
５．７．３ キット
本発明は、本発明の分子を充填した１つ又は複数の容器を含む医薬パック又は医薬キットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬を、医薬パック又は医薬キットに含ませることもできる。本発明は、本発明の医薬組成物成分のうちの１つ又は複数を充填した１つ又は複数の容器を含む医薬パック又は医薬キットも提供する。所望により、そのような容器に、医薬品又は生物由来物質の製造、使用又は販売を規制する政府当局が規定した形式で注意書きを添付してもよく、この注意書きはヒト投与用の製造、使用又は販売の当局による認可を示すものである。
本発明は上記方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは１つ又は複数の本発明の分子を含む。別の実施形態では、キットは、１つ又は複数の容器中の、がんの治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬をさらに含む。別の実施形態では、キットは、がんに関連する１つ又は複数のがん抗原と結合する１つ又は複数の細胞傷害抗体をさらに含む。ある実施形態では、他の予防薬又は治療薬は化学療法薬である。他の実施形態では、予防薬又は治療薬は生物学的療法薬又はホルモン療法薬である。
５．８ 治療的有用性の特徴付け及び実証
本発明の医薬組成物、予防薬、又は治療薬のいくつかの態様は、ヒトでの使用に先立ち所望の治療的活性について、細胞培養系で、及び動物モデル生物（例えばげっ歯類動物モデル系）でインビトロ試験されることが好ましい。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを決定するのに使用することができるアッセイには細胞培養アッセイが含まれ、細胞培養アッセイでは、患者組織試料が培養液中で増殖せられ、本発明の医薬組成物に暴露されるか又はそれと接触せられ、組織試料に対するそのような組成物の作用が観察される。組織試料は患者から生検により得ることができる。この試験は、個々の患者に対して治療上最も有効な予防用分子又は治療用分子の同定を可能にする。種々の特定の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性疾患に関わる細胞型の代表的細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いてインビトロアッセイを行い、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを決定することができる。
ヒトでの使用に先立ち適切な動物モデル系において、予防薬及び／又は治療薬の組み合わせを試験することができる。そのような動物モデル系としては、限定はされないが、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ等が挙げられる。当該技術分野において周知のいかなる動物系も使用可能である。本発明の特定の実施形態では、予防薬及び／又は治療薬の組み合わせはマウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く使用されており、当業者に周知である。予防的薬及び／又は治療薬は繰り返し投与することができる。手順のいくつかの態様は異なっていてもよい。前記態様には、予防薬及び／又は治療薬を投与する時間的管理、並びにそのような薬剤が別々にされるか混合物として投与されるかが含まれる。
本発明の方法で使用するのに好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上にヒトＦｃγＲを発現している遺伝子導入マウスであり、例えば、米国特許第５，８７７，３９６号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているあらゆるマウスモデルを本発明で使用することができる。本発明の方法で使用するための遺伝子導入マウスとしては、限定はされないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウスが挙げられる。ヒトでの使用に先立ち、上記の機能分析で最も高い活性レベルを示す変異を動物モデル試験での使用に関して試験することが好ましい。上記方法を用いて、例えば、本明細書で開示及び例示される哺乳類発現系及び精製法を用いて、十分な量の抗体を動物モデルでの使用用に調製することができる。
本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性及び特異性、並びにダイアボディの免疫応答誘導能に基づく、腫瘍に特有の標的に対して作製されたマウス抗体の有効性を試験するために、マウス異種移植モデルを使用することができる（Wu et al. (2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis," Trends Cell Biol. 11: S2-9）。マウスエフェクター細胞上にヒトＦｃγＲを発現している遺伝子導入マウスは独特なものであり、ヒトＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の有効性を試験する目的に適った動物モデルである。下記表１１に挙げられるような、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒａｖｅｔｃｈ博士の研究室で作製された（ロックフェラー大学及びスローンケタリングがんセンターとのライセンス契約を通じて）ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウス系統のつがいを、使用することができる。
当該技術分野において既知であり、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993）に記載される、炎症性関節炎の種々の実験動物モデルを用いることにより、本発明の併用療法の抗炎症活性を決定することができる。本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するのに、炎症性関節炎及び自己免疫性リウマチ疾患の実験的動物モデル及び自然発症動物モデルも使用することができる。以下にいくつかのアッセイを記載するが、例としてであって、限定のためではない。
当該技術分野で知られており、広く使用される関節炎又は炎症性疾患の原理的な動物モデルとしては、アジュバント誘発関節炎ラットモデル、コラーゲン誘発関節炎のラットモデル及びマウスモデル、並びに抗原誘発関節炎のラットモデル、ウサギモデル及びハムスターモデルが挙げられ、全て、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
カラゲナン誘発関節炎ラットモデルを用いて本発明の併用療法の抗炎症活性を評価することができる。慢性関節炎又は慢性炎症の研究では、カラゲナン誘発関節炎は、ウサギ、イヌ及びブタにおいても使用されている。治療効果を決定するために、定量的な組織形態計測的評価が使用される。そのようなカラゲナン誘発関節炎モデルの使用法は、Hansra P. et al. (2000) "Carrageenan-Induced Arthritis In The Rat," Inflammation, 24(2): 141-155に記載されている。当該技術分野で知られており、記載されているザイモサン誘発炎症動物モデルも、一般的に使用されている。
本発明の併用療法の抗炎症活性は、Winter C. A. et al. (1962) "Carrageenan-Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-Inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547に記載されている方法の変法を用いて、ラットにおけるカラゲナン誘発足浮腫の阻害を測定することによっても評価することができる。このアッセイは、大部分のＮＳＡＩＤの抗炎症活性に対する主要なインビボスクリーニングとして使用されており、ヒトでの有効性を予測すると考えられている。試験予防薬又は試験治療薬の抗炎症活性は、ビヒクル投与対照群と比較した、試験群の後肢重量増加の抑制％として表される。
さらに、本発明の併用療法の有効性を評価するために、炎症性腸疾患の動物モデルを使用することもできる（Kim et al. (1992) "Experimental Colitis In Animal Models," Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) "Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease--An Overview," Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S)。潰瘍性大腸炎及びクローン病は、動物で誘導することができるヒト炎症性腸疾患である。硫酸化多糖類（例えば、限定はされないが、アミロペクチン、カラゲーン、硫酸アミロペクチン、及びデキストラン硫酸）、又は化学性刺激物（例えば、限定はされないがトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）及び酢酸）を動物に経口投与して、炎症性腸疾患を誘導することができる。
本発明の併用療法の有効性を評価するのに、自己免疫障害の動物モデルを使用することもできる。１型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、及び糸球体腎炎等の自己免疫障害の動物モデルが開発されている（Flanders et al. (1999) "Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health," Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al. (1999) "Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity," Biochimie 81:511-515; Foster (1999) "Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease," Semin. Nephrol. 19:12-24）。
さらに、自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患に対する本明細書で開示される併用療法（combinatorial therapy）の予防的有効性及び／又は治療的有用性を評価するために、当業者に既知のいかなるアッセイをも使用することができる。
本発明の予防プロトコル及び／又は治療プロトコルの毒性及び有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療効果がある用量）を決定するための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手法によって、決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。より大きな治療指数を示す予防薬及び／又は治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬及び／又は治療薬を使用することもできるが、非感染細胞への潜在的損傷を最少にし、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を患部組織部位に標的化する送達系を設計するような注意が必要である。
ヒトに使用するためのある投与量範囲の予防薬及び／又は治療薬を製剤化する際に、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを使用することができる。そのような薬剤の投与量は、ＥＤ５０を含むが毒性はほとんど有さない血中濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用されるいかなる薬剤に関しても、治療効果のある用量は、細胞培養アッセイから最初に評価することができる。細胞培養で決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状抑制を最大の半分だけ達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を動物モデルで達成するように、ある用量を製剤化することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本発明に従って使用される治療薬の抗がん活性は、ＳＣＩＤマウスモデル又は遺伝子導入マウスもしくはヒト異種移植片を有するヌードマウス、当該技術分野において既知であり、Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd);及びAnticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)（参照によってこれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているハムスター、ウサギ等の動物モデル等の、種々のがん研究用実験動物モデルを使用することによっても決定することができる。
本発明の分子の治療効果を決定するために好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルである。異種移植片腫瘍の供給源として使用することができる腫瘍細胞株としては、限定はされないが、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞が挙げられ、これらは乳腺癌を患う患者に由来するものであり得る。これらの細胞はｅｒｂＢ２及びプロラクチン受容体の両方を有する。ＳＫＢＲ３細胞は、ＡＤＣＣモデル及び異種移植片腫瘍モデルとして当該技術分野において通常用いられている。あるいは、ヒト卵巣腺癌由来のＯＶＣＡＲ３細胞を異種移植片腫瘍の供給源として使用することができる。
本発明のプロトコル及び組成物は、ヒトでの使用に先立って、所望の治療活性又は予防活性について、インビトロで、次にインビボで試験されることが好ましい。治療薬及び方法は、腫瘍又は悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当該技術分野において標準的な多くのアッセイを使用して、そのような生存及び／又は増殖を評価することができる。例えば細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって、直接的な細胞カウントによって、癌原遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）又は細胞周期マーカー等の既知遺伝子の転写活性における変化を検出することによってアッセイすることができる。細胞生存率はトリパンブルー染色によって評価することができ、分化は、形態における変化、軟寒天中での増殖及び／もしくはコロニー形成又は三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物等中での管状ネットワーク形成の減少に基づいて視覚的に評価することができる
治療で使用するための化合物は、ヒトでの試験に先立ち、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ウサギ、ハムスター等を含むがこれらに限定はされない適切な動物モデル系（例えば、上記動物モデル）において試験することができる。化合物はその後に適切な臨床試験で使用することができる。
さらに、がん、炎症性疾患、又は自己免疫疾患の治療又は予防のための、本明細書で開示される併用療法の予防的有用性及び／又は治療的有用性を評価するために、当業者に既知のいかなるアッセイをも使用することができる。
６．実施例
６．１ 共有結合型二特異性ダイアボディのデザイン及び特徴解析
単一特異性共有結合型ダイアボディ及び二特異性共有結合型ダイアボディを構築してそれぞれの組換え産生、精製、及び結合特性を評価した。本明細書に記載の組換え発現系により産生されたアフィニティー精製ダイアボディ分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ分析により単一の二量体分子種からなることが判明した。更にＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ分析により、共有結合型二特異性ダイアボディが両方の標的抗原に対する親和性を示し、両方の抗原に同時に結合できることが示された。
材料及び方法：
ポリペプチド分子の構築及びデザイン：
図２に模式的に示す４つのポリペプチドコンストラクトを生成するための核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト１（配列番号９）は、ＦｃγＲＩＩＢを認識するヒト化２Ｂ６抗体のＶＬドメイン及びＦｃγＲＩＩＩＡを認識するヒト化３Ｇ８抗体のＶＨドメインを含む。コンストラクト２（配列番号１１）はＨｕ３Ｇ８のＶＬドメイン及びＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含む。コンストラクト３（配列番号１２）はＨｕ３Ｇ８のＶＬドメイン及びＨｕ３Ｇ８のＶＨドメインを含む。コンストラクト４（配列番号１３）はＨｕ２Ｂ６のＶＬドメイン及びＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含む。
ＰＣＲ及び発現ベクター構築：
最初のＰＣＲ産物にオーバーラップ配列を含めることによりオーバーラップＰＣＲで所望のポリペプチドコンストラクトのコード配列が作製されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて鋳型ＤＮＡからＶＬ又はＶＨドメインのコード配列を増幅した。
鋳型ＤＮＡの最初のＰＣＲ増幅：
約３５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、例えば関心のある抗体の軽鎖及び重鎖；１μｌの１０μＭフォワード及びリバースプライマー；２．５μｌの１０×ｐｆｕＵｌｔｒａバッファー（ストラタジーン社製）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ；１μｌの２．５ユニット／μｌのｐｆｕＵｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）；及び総体積２５μｌまでの蒸留水を遠心チューブ中で穏やかに混合し、微量遠心機で簡潔にスピンしてチューブの底に反応混合物を集めた。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いて以下の設定で行った：９４℃、２分；２５サイクルの９４℃、各１５秒；５８℃、３０秒；及び７２℃、１分。
それぞれ配列番号５５及び配列番号５６のフォワード及びリバースプライマーを用いてＨｕ２Ｂ６の軽鎖からＨｕ２Ｂ６のＶＬを増幅した。それぞれ配列番号５７及び配列番号５８のフォワード及びリバースプライマーを用いてＨｕ２Ｂ６の重鎖からＨｕ２Ｂ６のＶＨを増幅した。それぞれ配列番号５５及び配列番号５９のフォワード及びリバースプライマーを用いてＨｕ３Ｇ８の軽鎖からＨｕ３Ｇ８のＶＬを増幅した。それぞれ配列番号６０及び配列番号６１のフォワード及びリバースプライマーを用いてＨｕ３Ｇ８の重鎖からＨｕ３Ｇ８のＶＨを増幅した。
１％アガロースゲルを用いて１２０ボルトで３０分間、ＰＣＲ産物の電気泳動を行った。ゲルからＰＣＲ産物を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧＥｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
オーバーラップＰＣＲ：
最初のＰＣＲ産物を後述するように組み合わせ、鋳型ＤＮＡの最初の増幅に記載したのと同じＰＣＲ条件で増幅した。オーバーラップＰＣＲ産物も上記と同様に精製した。
ＶＬ Ｈｕ２Ｂ６及びＶＨ Ｈｕ３Ｇ８のＰＣＲ増幅産物と、それぞれ配列番号５５及び配列番号６１であるフォワード及びリバースプライマーとを組み合わせることにより、コンストラクト１（配列番号９；図２に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。ＶＬ Ｈｕ３Ｇ８及びＶＨ Ｈｕ２Ｂ６のＰＣＲ増幅産物と、それぞれ配列番号５５及び配列番号５８であるフォワード及びリバースプライマーとを組み合わせることにより、コンストラクト２（配列番号１１；図２に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。ＶＬ Ｈｕ３Ｇ８及びＶＨ Ｈｕ３Ｇ８のＰＣＲ増幅産物とそれぞれ配列番号５５及び配列番号６１であるフォワード及びリバースプライマーとを組み合わせることにより、コンストラクト３（配列番号１２；図２に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。ＶＬ Ｈｕ２Ｂ６及びＶＨ Ｈｕ２Ｂ６のＰＣＲ増幅産物とそれぞれ配列番号５５及び配列番号５８であるフォワード及びリバースプライマーとを組み合わせることにより、コンストラクト４（配列番号１３；図２に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。
ＶＬドメインのフォワードプライマー（すなわち、配列番号５５）及びＶＨドメインのリバースプライマー（すなわち、配列番号５８及び配列番号６１）は、最終産物を発現ベクターにクローニングできるように固有の制限部位を含む。精製したオーバーラップＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（プロメガ社製）にクローニングした。コンストラクトをコードするプラスミドを表１２に示すように命名した。
ポリペプチド／ダイアボディ発現：
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００をメーカーの指示書に従って用いて（インビトロジェン社）、コンストラクト１をコードするｐＭＧＸ０６６９を、コンストラクト２をコードするｐＭＧＸ０６６７と、ＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトした。これら２つのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡの両方に免疫特異的な共有結合型二特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ダイアボディ）が発現されるようにデザインした。ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢにそれぞれ免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）（それぞれｈ３Ｇ８ダイアボディ及びｈ２Ｂ６ダイアボディ）を発現させるために、コンストラクト３及び４をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６６及びｐＭＧＸ０６６８を別個にＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。培養３日後、分泌された生成物を条件培地から精製した。
精製：
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂにカップリングさせた関連抗原を用いて条件培地からダイアボディを捕捉した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で平衡化した。ローディング後、溶出前に樹脂を平衡バッファーで洗浄した。洗浄した樹脂から、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いてダイアボディを溶出させた。溶出したダイアボディをすぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、遠心型濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーで更に精製した。
ＳＥＣ：
分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出したダイアボディのおおよそのサイズ及び異種性を分析した。ＰＢＳで平衡化したＧＥヘルスケア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０カラムを用いてＳＥＣ分析を行った。全長ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ）、及び単鎖Ｆｖ（約３０ｋＤａ）の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた）。
ＥＬＩＳＡ：
５．４．２．に記載されているようなＥＬＩＳＡアッセイにより溶出及び精製したダイアボディの結合を特徴解析した。ＣＤ３２Ｂ−Ｉｇの２μｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ／ウェルで用いて９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを炭酸バッファー中４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで室温にて３０分間ブロッキングした。その後、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ、又はｈ３Ｇ８ ＣＭＤをブロッキングバッファー中に２倍希釈で段階希釈して濃度０．５〜０．００１μｇ／ｍｌのダイアボディを調製した。その後、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍｌ ｓＣＤ１６Ａ−ビオチンを５０μｌ／ウェルで各ウェルに添加した。プレートを再度室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：５０００希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を５０μｌ／ウェルで用いて検出した。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。１０分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４を加えることによりＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止した。９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いて結果をプロットした。
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ：
セクション５．４．３に記載されているように、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ １０００、ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）及び付属ソフトウェアを用いて、溶出及び精製したダイアボディの結合の動的パラメーターを分析した。
ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ、又はｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）を、アミンカップリング化学反応（ＮＨＳ／ＥＤＣの混合物によるカルボキシメチル基の修飾による）によりセンサーチップ表面の４つのフローセルの１つ（フローセル２）に固定化し、約１０００反応単位（ＲＵ）の各受容体が表面に固定化されるようにした。その後、１Ｍ Ｅｔ−ＮＨ２を注入して未反応活性エステルを「完全消費（cap off）」した。好適な表面を準備した後、共有結合型二特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ）又は共有結合型単一特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ又はｈ３Ｇ８ ＣＭＢ）を、６．２５〜２００ｎＭ溶液で流速７０ｍＬ／ｍｉｎにて１８０秒間注入することにより表面に通過させた。比較のためにｈ３Ｇ８ ｓｃＦＶも試験した。
全データセットが得られた後、メーカー（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）供給のコンピューターアルゴリズムを用いて、得られた結合曲線の全体的なフィッティングを行った。これらのアルゴリズムにより、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆの両方を計算し、これから見かけの平衡結合定数ＫＤを２つの速度定数の比率（すなわち、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として推定した。個々の速度定数をどのように得るのかについての更に詳細な処理はＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に記載されている。
会合相と解離相を別々にフィッティングした。解離速度定数を、１８０秒の解離相の３２〜３４秒間隔に対して得、会合相のフィッティングは１：１ラングミュアモデルにより得、二特異性ダイアボディ及びｓｃＦｖに関するＲｍａｘ及びχ２に基づいてベースフィットを選択し、２価アナライトのフィッティングをＣＭＤ結合に用いた。
結果
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｈ３Ｇ８ ＣＭＤ、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤ、及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ発現系の精製産物がそれぞれが推定分子量約５０ｋＤａの単一分子種であることが示された（図３、それぞれレーン４、５、及び６）。還元条件下では、ＣＭＤ発現系のいずれかから精製された産物は一本のバンドとして流れ（レーン１及び２）、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ系から精製された産物は２つの別個のタンパク質であることが示された（図３、レーン３）。発現系から精製され、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化された全てのポリペプチドが約２８ｋＤａに泳動した。
発現系産物それぞれのＳＥＣ分析も単一分子種を示し（図４Ｂ）、それぞれがＩｇＧのＦａｂ断片とほぼ同じ時間に溶出した（約５０ｋＤａ）（図４Ａ）。結果は、アフィニティー精製産物がＣＭＤ発現系の場合は同種共有結合型ホモダイマーであり、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤの場合は同種共有結合型ヘテロダイマーであったことを示している。
ＥＬＩＳＡサンドウィッチアッセイを用いて、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６Ａのいずれか又は両方へのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤ結合の特異性を調べた（図５）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原とし、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして用いた。ＥＬＩＳＡの陽性シグナルにより、ヘテロ二量体ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤが両方の抗原に特異性を有することが示された。（ＣＤ３２Ｂに結合しないはずの）ｈ３Ｇ８ ＣＭＤの同様な試験ではシグナルは示されなかった。
ＳＰＲ分析により、ｈ３Ｇ８ ＣＭＤがｓＣＤ１６を免疫特異的に認識するがｓＣＤ３２Ｂは免疫特異的に認識しないこと、ｈ２Ｂ６ ＣＭＤがｓＣＤ３２Ｂを免疫特異的に認識するがｓＣＤ１６は免疫特異的に認識しないこと、並びにｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤがｓＣＤ１６及びｓＣＤ３２Ｂの両方を免疫特異的に認識することが示された（図６Ａ〜Ｂ）。試験したダイアボディのいずれも対照受容体ｓＣＤ３２Ａには結合しなかった（図６Ｃ）。
ＳＰＲ分析を用いてＣＭＤ及びｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤのｓＣＤ１６及び／又はｓＣＤ３２Ｂに対する速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ）及び平衡定数を更に評価した。結果を、ｈ３Ｇ８ ｓｃＦＶで計算された同じ定数と比較した。図７Ａ〜Ｅは、ＳＰＲ分析の結果をグラフで示したものである。図７に示す結果から計算された会合速度定数及び解離速度定数並びに平衡定数を表１３に示す。
ＥＬＩＳＡ分析の結果と合わせ、研究により、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８共有結合型ヘテロ二量体がＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６の両方に対する特異性を保持しており、両方の抗原に同時に結合できることが確認された。分子を図８に模式的に示す。
６．２ Ｆｃドメインを含む共有結合型二特異性ダイアボディのデザイン及び特徴解析
ＩｇＧ様分子（すなわちＦｃドメインを含む）を作製するために、実施例６．１に示したヘテロ二量体ＣＢＤ分子を構成するポリペプチドの１つを、Ｆｃドメインを更に含むように改変した（抗体重鎖及び軽鎖に類似した「重い（heavier）鎖」及び「軽い（lighter）鎖」を作製）。これにより、ヘテロ二量体二特異性分子は、相同な分子と二量体化するＦｃドメインを含み、４価の４量体ＩｇＧ様分子を形成する（すなわち、ヘテロ二量体二特異性分子のＦｃドメインを介した二量体化により形成される）。興味深いことに、このような４量体分子は、機能的アッセイを用いても（例えば標的抗原への免疫特異的結合について条件培地を調べても）、組換え発現系の条件培地中に検出されなかった。その代わり、そのような機能的アッセイ中ではＶＬ、ＶＨ、及びＦｃドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが検出された。理論的４量体構造の安定性が問題なのかどうかを調べるために、Ｆｃドメインを含むポリペプチドをヒンジ領域を更に含むように設計し、一方、「軽い（lighter）」鎖を含むポリペプチドはヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのＣ末端６アミノ酸を更に含むように設計した。そのような再設計された「重い（heavier）」鎖及び「軽い（lighter）」鎖を組換え発現系中で共発現させた場合には、標的抗原及び抗Ｆｃ抗体の両方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が機能的アッセイにより検出された。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及びデザイン：
実施例６．１に示したコンストラクト１及び２の改変型が生成するように核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト１及び２がＦｃドメインを更に含むように設計して、それぞれコンストラクト５（配列番号１４）及び６（配列番号１５）を作製した。コンストラクト１がＣ末端に配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を更に含むように設計することでコンストラクト７（配列番号１６）を作製した。コンストラクト２がヒンジ領域及びＦｃドメイン（Ｖ２１５Ａ変異を含む）を更に含むように設計することでコンストラクト８（配列番号１８）を作製した。コンストラクト５〜８の模式図を図９に示す。
ＰＣＲ及び発現ベクター構築：
全てのＰＣＲ及びＰＣＲ産物精製プロトコールは実施例６．１に記載した通りであり、プラスミドｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０６６７をそれぞれコンストラクト１及び２のコード配列の鋳型とした。ＨｕＩｇＧのＦｃドメイン及び／又はヒンジドメインのコード配列はそれぞれ配列番号５又は配列番号１及び配列番号５である。ＰＣＲ産物にオーバーラップ配列を含めることによりオーバーラップＰＣＲで所望の産物のコード配列を作製できるようにフォワード及びリバースプライマーを用いて鋳型ＤＮＡのコード配列を増幅した。
それぞれ配列番号５５及び６２であるフォワード及びリバースプライマーを用いてｐＭＧＸ０６６９からコンストラクト１のコード配列を増幅した。それぞれ配列番号５５及び配列番号６３であるフォワード及びリバースプライマーを用いてｐＭＧＸ０６６７からコンストラクト２のコード配列を増幅した。それぞれ配列番号６５及び配列番号６６であるフォワード及びリバースプライマーを用いてＨｕＩｇＧヒンジ−Ｆｃを増幅した。それぞれ配列番号５５及び配列番号６７であるフォワード及びリバースプライマーを用いてｐＭＧＸ０６６９からコンストラクト７（配列番号１６）を増幅した。
オーバーラップＰＣＲ：
最初のＰＣＲ産物を後述するように組合せ、実施例６．１と同様に増幅及び精製した。
コンストラクト１及びＨｕＩｇＧ ＦｃのＰＣＲ増幅産物とそれぞれ配列番号５５及び配列番号６４のフォワード及びリバースプライマーを組み合わせて、コンストラクト５（配列番号１４；図９に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。コンストラクト２及びＨｕＩｇＧ ＦｃのＰＣＲ増幅産物とそれぞれ配列番号５５及び配列番号６６のフォワード及びリバースプライマーを組み合わせて、コンストラクト６（配列番号１５；図９に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。コンストラクト２及びＨｕＩｇＧ ヒンジ−ＦｃのＰＣＲ増幅産物とそれぞれ配列番号５５及び配列番号６６のフォワード及びリバースプライマーを組み合わせて、コンストラクト８（配列番号１８；図９に模式的に示す）をコードする核酸配列を増幅した。
最終産物を前述したようにｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（プロメガ社製）にクローニングした。コンストラクトをコードするプラスミドを表１４に示すように命名した。
ポリペプチド／ダイアボディ発現：
セクション６．１に記載したようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてＨＥＫ−２９３細胞への４つの別個のコトランスフェクションを行った：それぞれコンストラクト１及び６をコードするｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０６７４；それぞれコンストラクト２及び５をコードするｐＭＧＸ０６６７及びｐＭＧＸ０６７６；並びにそれぞれコンストラクト７及び８をコードするｐＭＧＸ０６７７及びｐＭＧＸ０６７８。
これらのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡの両方に免疫特異的なＩｇＧ様構造を有する４価の二特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）が発現されるようにデザインした。追加的なコトランスフェクションも行った：コンストラクト６及び５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７４及びｐＭＧＸ０６７６。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、精製Ｆｃを標準とした抗ＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡにより定量した。次いで試料中の産物の濃度を定量に基づいて標準化し、標準化した試料を残りのアッセイに用いた。
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を前述のようにサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。特に断りのない限り、ＣＤ３２Ｂをプレートのコーティングに、すなわち標的タンパク質として用い、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６をプローブとして用いた。
結果
ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａに同時に結合できるダイアボディ分子を発現させるためのコンストラクト１及び６（ｐＭＧＸ６６９−ｐＭＧＸ６７４）、コンストラクト２及び５（ｐＭＧＸ６６７−ｐＮＧＸ６７６）、並びにコンストラクト５及び６（ｐＭＧＸ６７４−ｐＭＧＸ６７６）を含む組換え発現系から得た標準化された試料をＥＬＩＳＡアッセイで調べた（図１０）。ＥＬＩＳＡのデータは、コンストラクト１及び６によるコトランスフェクション又はコンストラクト２及び５によるコトランスフェクションではいずれか又は両方の抗原に結合できる産物を生成できなかったことを示した（図１０、それぞれ□及び▲）。しかし、コンストラクト５及び６のコトランスフェクションではＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６抗原の両方に結合できる産物が分泌された。後者の産物は、図１１に構造を模式的に示す、各抗原に対して１つの結合部位を含むコンストラクト５及び６の二量体であった。
ＩｇＧ様ヘテロ４量体構造を形成させるために、コンストラクト１のＣ末端に追加的６アミノ酸のコード配列を付加してコンストラクト７を作製した（配列番号１６、図９に模式的に示す）。追加的６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）はκ軽鎖のＣ末端に由来し、通常、ＩｇＧ分子重鎖の上側のヒンジドメインと相互作用する。次いで、ヒンジドメインをコンストラクト６中に設計してコンストラクト８を作製した（配列番号１８及び図９）。コンストラクト８は上側ヒンジ領域中のアミノ酸変異Ａ２１５Ｖを更に含む。次いで、それぞれコンストラクト７及び８をコードする発現プラスミドｐＭＧＸ６７７及びｐＭＧＸ６７８を前述のようにＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトして発現させた。
コンストラクト７及び８（ｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７８）を含む組換え発現系から生成したダイアボディ分子を、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａへの結合についてコンストラクト１及び６（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）、コンストラクト１及び８（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８）、並びにコンストラクト６及び７（ｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４）を含む発現系から生成したダイボディ分子とＥＬＩＳＡアッセイで比較した（図１２）。
先程と同様、コンストラクト１及び６（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）を含む発現系から生成した分子はＣＤ３２Ａ及びＣＤ１６Ａの両方に結合できないことが示された（図１０及び図１２）。一方、コンストラクト７及び６（ｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７４）の共発現又はコンストラクト７及び８（ｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８）の共発現からの産物はＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６の両方に結合することができた（図１２）。コンストラクト７は、Ｃ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むことを除いてコンストラクト１と類似しており、コンストラクト８は、ヒンジドメイン及び変異Ａ２１５Ｖを含むことを除いてコンストラクト６と類似していることに留意されたい。データは、Ｆｃを有さない「軽い（lighter）」鎖にＣκ軽鎖のＣ末端から更に６個のアミノ酸（ＦＮＲＧＥＣ；配列番号２３）を付加することが、対応する重い（heavier）鎖がヒンジドメインを含むかどうかに関わらず（すなわち、ｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７４及びｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８、図１２）、４量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の形成の安定化に役立つことを示している。Ｆｃを有する「重い（heavier）」ポリペプチドにヒンジドメインを付加し、対応する「軽い（lighter）」鎖にＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）Ｃ末端配列を付加しないと、明らかに同様な安定化を得ることができなかった（すなわち、コンストラクト２及び８（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８）のコトランスフェクション産物による結合の欠如）。４量体ダイアボディ分子の構造を図１３に模式的に示す。
６．３ ４量体ＩｇＧ様ダイアボディの形成に対するドメインの順番及び更なるジスルフィド結合の影響
ポリペプチド鎖上の選択された残基をシステインで置換することにより、４量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の「軽い（lighter）」及び「重い（heavier）」ポリペプチド鎖間の更なる安定化の影響を調べた。更なるシステイン残基は「重い（heavier）」鎖と「軽い（lighter）」鎖の間に更なるジスルフィド結合をもたらす。更に、Ｆｃドメイン又はヒンジ−Ｆｃドメインをポリペプチド鎖のＣ末端からＮ末端に移動させることにより、結合活性に関してドメインの順番を調べた。更なるジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、前に構築したそのような結合を有しないダイアボディ分子と比べて変化しなかったが、ダイアボディを構成する「重い（heavier）」ポリペプチド鎖のＮ末端へのＦｃ又はヒンジ−Ｆｃドメインの移動は、驚くべきことに、標的抗原の一方又は両方に対する二特異性分子の結合親和性及び／又はアビディティーを向上させた。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及びデザイン：
実施例６．２に示したコンストラクト５、６、及び８の改変型を生成するために核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト９（配列番号１９）及びコンストラクト１０（配列番号２０）（両方とも図１４に模式的に示す）は、それぞれＦｃドメイン又はヒンジ−ＦｃドメインがポリペプチドのＣ末端からＮ末端にシフトされたこと以外はコンストラクト８及び６と同様である。更に、使用した全てのＦｃドメインは野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであった。コンストラクト１２、配列番号２２（図１４に模式的に示す）はＣ末端が配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を更に含むようにデザインしたこと以外は実施利６．１のコンストラクト２と同様である。コンストラクト１１、配列番号２１（図１４に模式的に示す）は、Ｆｃドメインがヒンジ領域を更に含むこと以外は実施例６．２のコンストラクト５と同様である。また、コンストラクト１１及び１２では、２Ｂ６ ＶＬドメイン及び２Ｂ６ ＶＨドメインが１個のアミノ酸修飾（それぞれＧ１０５Ｃ及びＧ４４Ｃ）を含むことにより、各ドメイン中のグリシンがシステインで置換されている。
ＰＣＲ及び発現ベクター構築：
全てのＰＣＲ及びＰＣＲ産物精製プロトコールは実施例６．１及び６．２に記載されている通りである。
オーバーラップＰＣＲ：
実施例６．１及び実施例６．２に記載の方法を用いて最終産物を構築し、増幅し、精製した。
前述したように、最終産物をｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（プロメガ社製）にクローニングした。コンストラクトをコードするプラスミドは表１５に示すように命名した。
ポリペプチド／ダイアボディ発現：
セクション６．１に記載したようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてＨＥＫ−２９３細胞中への３つの別個のコトランスフェクションを行った：それぞれコンストラクト１及び９をコードするｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０７１９；それぞれコンストラクト１及び１０をコードするｐＭＧＸ０６６９及びｐＭＧＸ０７１８；並びにそれぞれコンストラクト１１及び１２をコードするｐＭＧＸ０６１７及びｐＭＧＸ０７１７。これらのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡの両方に免疫特異的なＩｇＧ様構造で４価の二特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）が発現するようにデザインした。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中に分泌された生成物の量を、精製Ｆｃを標準として用いた抗ＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡにより定量した。次いで、定量化に基づいて試料中の生成物の濃度を標準化し、標準化した試料を残りのアッセイに用いた。
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を前述したようにサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。特に断りのない限り、ＣＤ３２Ｂを用いてプレートをコーティングし、すなわち標的タンパク質とし、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６をプローブとして用いた。
ウェスタンブロット：
３つの上記コトランスフェクションの条件培地約１５ｍｌを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。１つのゲルをＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（インビトロジェン社製）で染色し、標準的な転写方法で同一のゲルをＰＶＤＦメンブレン（インビトロジェン社製）に転写した。転写後、メンブレンを５％乾燥スキムミルクを含む１×ＰＢＳでブロッキングした。次いで、メンブレンを、１０ｍｌの１：８，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｈ＋Ｌを含む２％乾燥スキムミルク１×ＸＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中で室温にて１時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。１×ＰＢＳ／０．３％Ｔｗｅｅｎ ２０で５分×２回、次いで室温で２０分洗浄した後、メーカーの取扱説明書に従いＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム・バイオサイエンス社製）でメンブレンを発色させた。Ｘ線処理装置中でフィルムを現像した。
結果
コンストラクト１及び９、コンストラクト１及び１０、並びにコンストラクト１１及び１２を含む組換え発現系の条件培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件）分析及びウェスタンブロッティング（抗ＩｇＧをプローブとして使用）により分析した。ウェスタンブロットにより、コンストラクト１１及び１２を含む又はコンストラクト９及び１を含む系の産物が約１５０ｋＤａの単一分子種を主に形成することが示された（図１５、それぞれレーン３及び２）。これらの産物は両方とも、ダイアボディを構成する「軽い（lighter）」鎖と「重い（heavier）」鎖との間に設計された内部ジスルフィド結合を有する。一方、コンストラクト１０及び１で形成された「軽い（lighter）」鎖と「重い（heavier）」鎖との間に設計された内部ジスルフィド結合を有さない分子は分子量約７５ｋＤａ及び約１００ｋＤａの少なくとも２つの分子種を形成した（図１５Ｂ、レーン１）。
ウェスタンブロットの結果にも関わらず、３つの産物のそれぞれはＣＤ３２Ａ及びＣＤ１６の両方に結合できることが見出された（図１６）。驚くべきことに、Ｃ末端ヒンジ−Ｆｃドメインを含む産物（コンストラクト１１及び１２で形成）と比べ、Ｆｃ（又はＦｃ−ヒンジ）ドメインがＦｃ含有ポリペプチド鎖（すなわち、「重い（heavier）」鎖）のアミノ末端にある系の両産物（コンストラクト９＋１及びコンストラクト１０＋１）は標的ペプチドの一方又は両方（すなわち、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６）に対して親和性及び／又はアビディティーの増大を示した。
６．４ ポリタンパク質前駆体のプロセシング及び共有結合型二特異性ダイアボディの発現への内部／外部切断部位の影響；ヒトＩｇＧλ鎖及びヒンジドメインの部分を含む二特異性ダイアボディのデザイン及び特徴解析
本明細書に記載されているように、本発明のダイアボディ又はダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は単一のポリタンパク質前駆体分子として発現され得る。実施例６．１〜６．３に記載の組換え系がそのようなポリタンパク質前駆体から機能的ＣＤＢをプロセシング及び発現する能力を、内部切断部位、特にフューリン切断部位により隔てられたＣＢＤの第１及び第２のポリペプチド鎖の両方をコードするように核酸を設計することにより調べた。機能的ＣＢＤはポリタンパク質前駆体分子を含む組換え系から単離した。
実施例６．３に記載したように、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）の付加はダイアボディ形成を安定化することが見出され、これはおそらく配列番号２３を含むドメインとＦｃドメイン又はヒンジ−Ｆｃドメインを含むドメインとの間の鎖間相互作用の増大によるものである。このλ鎖／Ｆｃ様相互作用の安定化効果を、いずれのポリペプチド鎖もＦｃドメインを含まないＣＢＤで試験した。ダイアボディの１つのポリペプチド鎖を、Ｃ末端に配列番号２３を含むように設計し、パートナーとなるポリペプチド鎖を、ＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含むように設計した。このＣＢＤと（実施例６．１の）コンストラクト１及び２を含むＣＢＤとの比較により、ヒンジドメイン及びλ鎖に由来するドメインを含むＣＢＤが標的エピトープの一方又は両方に対してわずかに大きな親和性を示すことが示された。
材料及び方法
ポリペプチド分子の構築及びデザイン：
ポリタンパク質前駆体：
図１７に模式的に示す２つのポリタンパク質前駆体分子を生成するための核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト１３（配列番号９５）は、ポリペプチド鎖のＮ末端から、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、及び３Ｇ８のＶＨドメインを含む。コンストラクト１３をコードするヌクレオチド配列を配列番号９６に示す。コンストラクト１４（配列番号９７）（図１７）は、ポリペプチド鎖のＮ末端から、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、及び３Ｇ８のＶＨドメインを含む。コンストラクト１４をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に示す。
実施例６．１に示したコンストラクト１及び２の改変型を生成するための核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト１５（配列番号９９）（ＦＩＧ．１７）は、Ｃ末端にアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むこと以外は実施例６．１に示したコンストラクト１（配列番号９）と同様である。コンストラクト１５をコードする核酸配列を配列番号１００に示す。コンストラクト１６（配列番号１０１）（図１７）は、Ｃ末端がアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含むこと以外は実施例６．１に示したコンストラクト２と同様である。コンストラクト１６をコードする核酸配列を配列番号１０２に示す。
ＰＣＲ及び発現ベクター構築：
全てのＰＣＲ及びＰＣＲ産物精製プロトコールは実施例６．１及び６．２に記載した通りである。
オーバーラップＰＣＲ：
適切なプライマーを用いて、実施例６．１及び実施例６．２に記載の方法で最終産物を構築し、増幅し、精製した。
前述したように、最終産物をｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（プロメガ社製）にクローニングした。コンストラクトをコードするプラスミドを表１６に示すように命名した。
ポリペプチド／ダイアボディ発現：
セクション６．１に記載したように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてＨＥＫ−２９３細胞への１つのトランスフェクション及び１つのコトランスフェクションを行った：単一トランスフェクション：コンストラクト１３をコードするｐＭＧＸ０７５０；コトランスフェクション：それぞれコンストラクト１５及び１６をコードするｐＭＧＸ０７５２及びｐＭＧＸ０７５３。培養３日後、条件培地を回収し、記載したように、分泌された産物をアフィニティー精製した。
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、前述したようにサンドウィッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。コンストラクト１５及び１６のコトランスフェクション産物では、マウスＣＤ３２Ｂを用いてプレートをコーティングし、すなわち標的タンパク質とし、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６Ａをプローブとして用いた。コンストラクト１３を含む組換え系では、ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用い、ビオチン−コンジュゲートＣＤ１６Ａをプローブとして用いた。
結果
コンストラクト１３を含む組換え発現系から得られた条件培地をサンドウィッチＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｍＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ１６のいずれか又は両方へのＣＢＤ結合の特異性を調べた（図１８）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原とし、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして用いた。ＥＬＩＳＡの陽性シグナルから、ポリタンパク質前駆体から生成したヘテロ二量体ｈ２．４Ｇ２−ｈ３Ｇ８ ＣＢＤが両方の抗原に対する特異性を有することが示された。
同様に、コンストラクト１５及び１６をコードするベクターのコトランスフェクションにより得られた精製産物をＥＬＩＳＡアッセイで試験し、コンストラクト１及び２で構成される産物（実施例６．１）と比較した。ＣＤ３２Ｂを標的抗原とし、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして用いた。コンストラクト１及び２で構成された産物同様、コンストラクト１５及び１６の産物はＣＤ３２Ｂ及びＣＤ１６Ａに同時に結合することができることが見出された。実際、コンストラクト１５及び１６の産物は標的抗原、すなわちＣＤ３２Ｂ又はＣＤ１６Ａの一方又は両方に対してわずかに向上したアフィニティーを示した。これはおそらく、コンストラクト１及び２を含む産物にはないλ鎖領域ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）及びヒンジ領域ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）の相互作用による鎖間会合の安定性又はフィデリティーの増大（野生型ＶＨ−ＶＬドメイン相互作用と比べて）によるものである。
６．５ 複数の親和性を結びつけるための二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）の使用
本発明の一態様は、新規な二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）及び複数の親和性を結びつける新規な方法に関する。「ＤＡＲＴ」は単一特異性、二特異性、三特異性等であり得るので、１、２、３、又はそれ以上の異なるエピトープ（同じ抗原のものであってもよく、異なる抗原のものであってもよい）に同時に結合することができる。「ＤＡＲＴ」は更に、１価、２価、３価、４価、５価、６価等であり得るので、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の分子に同時に結合することができる。図３５に示すように、例えば４価の二特異性ダイアボディを生成するように、ＤＡＲＴのこれら２つの特性が組み合わされ得る。
原型の免疫受容体ｈｕＣＤ３２Ｂに対する親和性に加えてハプテンであるフルオレセインに対する親和性を有するＤＡＲＴの開発は１つの進展である。「２Ｂ６／４４２０」と呼ばれるこのＤＡＲＴは、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とｈｕＣＤ３２Ｂとをコライゲートさせることができる万能アダプターとしての役目を果たす。ＣＤ３２Ｂは、活性化シグナル伝達免疫複合体とのクラスター化により活性化シグナルを抑制することができるＦｃ受容体である。最初の実装形態において、この技術は、新規なＤＡＲＴコンストラクトの作製を必要とせずに、ｈｕＣＤ３２Ｂとのクラスター化について複数の生物学的標的の迅速なスクリーニングを可能にする。２Ｂ６／４４２０は、細胞表面受容体に対するフルオレセイン化された抗体と混合することで、該受容体に対する親和性を有するＤＡＲＴの作用を簡単に模倣することができる（図２０）。更に、この試薬は、容易に発現又は生成しない親和性試薬の効率的な連結を可能とし、これにより、技術的な限界を克服することができる。２Ｂ６／４４２０含有ＤＡＲＴは研究ツールとして、また、臨床用候補物質としても有用であることが明らかである。ＨＥＫ２９３細胞から生成した２Ｂ６／４４２０は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＤ３２Ｂ及びフルオレセインに同時に結合することができる。更に、２Ｂ６／４４２０は、ＣＤ７９とのコライゲーションを介してＣＤ３２ＢをＢＣＲ複合体へと動員することにより、細胞増殖を阻害し得る。ＤＡＲＴの２Ｂ６アームは、異なる抗体配列又は他の関連する特異性を有する結合配列により置換することができる。
材料及び方法：
プラスミドコンストラクト：
２Ｂ６／４４２０は、ヒト化２Ｂ６ ＭＡｂ（ｈｕ２Ｂ６、ＭＧＡ３２１）と、キメラマウスＦｖ／ヒトＦｃ型の抗フルオレセインＭＡｂである４４２０との配列に由来する。完全に構築されたＤＡＲＴは２つのポリペプチドからなり、その結果、２つのＦｖ領域が共有結合により連結される。第１のポリペプチドは、分泌シグナル配列と、これに後続する、アミノ酸残基ＧＧＧＳＧＧＧＧからなるリンカーによって隔てられた４４２０ＶＨとの融合タンパク質として生成されるｈｕ２Ｂ６ＶＬとからなる。κ軽鎖のＣ末端に由来する配列ＦＮＲＧＥＣがこのポリペプチドのＣ末端に付加されている。他方のポリペプチドは、シグナル配列−４４２０ＶＬ−ＧＧＧＳＧＧＧＧ−ｈｕ２Ｂ６ＶＨからなり、ヒトＩｇＧ１ Ｆｄ断片のＣ末端に由来する配列ＶＥＰＫＳＣがＣ末端に付加されている。２つの鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、２つのポリペプチドを共有結合により連結する（図２０）。説明したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を既存のプラスミドからＰＣＲ増幅し、オーバーラップＰＣＲにより組み合わせ、ＮｈｅＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社製）にクローニングした。最後に、上述した方法と同様の方法を用いて既に構築しておいた、ｈｕＣＤ３２ＢとｈｕＣＤ１６とに対する親和性を有するＤＡＲＴ（２Ｂ６／３Ｇ８）を、対照として用いた。
抗体：
マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７９ｂ体抗ＣＢ３．１及びＣＢ３．２（ハイブリドーマ）は、アラバマ州、バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のＤｒ．Ｃｏｏｐｅｒ ＭＤから入手した。メーカーの指示書（ピアース社（Pierce）製、イリノイ州、ロックフォード）に従い、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でＣＢ３．１及びＣＢ３．２を標識した。Ｆｃ断片特異的ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧのＦ（ａｂ'）２断片をジャクソン・ラボラトリーズ社（Jackson Laboratories；ウェストグローブ、ペンシルベニア州）から入手した。抗ｈｕＣＤ３２ＢマウスＭＡｂである３Ｈ７は自社で作製及び精製した。ヤギ抗２Ｂ６Ｆｖは、ｈｕ２Ｂ６全抗体でヤギを免疫化し、ｈｕ２Ｂ６のＦｖ領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。ＨｕＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧ、及びＨＲＰ−抗マウスＩｇＧはジャクソン・イムノリサーチ社（Jackson Immunoresearch）から入手した。ＨＲＰ−抗ヤギはサザンバイオテック社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手した。
ＤＡＲＴの発現：
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社製）をメーカーの指示書に従って用いて、各鎖をコードするプラスミドを２９３Ｈ細胞（インビトロジェン社製）にコトランスフェクションした。分泌タンパク質を３日間隔で３〜４回にわたり回収し、固定化可溶性形態のＣＤ３２Ｂに対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
ＥＬＩＳＡ：
ＦＩＴＣ標識プロテインＳ（ノバジェン社製）、ヒトＩｇＧ、又はＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧでコーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製）上において２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８ ＤＡＲＴを捕捉した。可溶性ＣＤ３２Ｂ外部ドメイン、次いで３Ｈ７（ＣＤ３２Ｂに特異的なマウスモノクローナル抗体）、最後に抗マウス−ＨＲＰを結合させることにより検出を行った。あるいは、フィニティー精製したヤギ抗２Ｂ６ Ｆｖポリクローナル抗血清、次いで抗ヤギ抗体−ＨＲＰを結合させることにより検出を行った。比色分析ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ社製）を用いてＨＲＰ活性を検出し、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。
Ｂ細胞精製及び増殖アッセイ：
健康なドナー由来の血液を用いたＦｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製、英国）勾配法により末梢血液単核細胞を分離した。Ｄｙｎａｌ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ダイナル・バイオテクノロジー社（Dynal Biotechnology Inc.）製、ニューヨーク州）をメーカーの指示書に従って用いてＢリンパ球を単離した。単離されたＢ細胞（ＣＤ２０＋）の純度はＦＡＣＳ分析による推定で９０％を超えていた。増殖アッセイでは、精製されたＢ細胞を、平底９６ウェルマイクロタイタープレート中の完全ＲＰＭＩ １６４０培地中に細胞密度１×１０５細胞／ウェル、最終体積２００μｌで播種し、５％のＣＯ２中３７℃で抗体及びダイアボディの存在下又は非存在下において４８時間インキュベートした。次いで、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（パーキンエルマー社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）を加え、回収前に更に１６〜１８時間インキュベーションを続けた。液体シンチレーションカウント法により［３Ｈ］チミジン取込みを測定した。
結果
２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴが活性且つ特異的であることを示すため、２つのＥＬＩＳＡ実験を行った。まず、２Ｂ６／４４２０又は２Ｂ６／３Ｇ８（陰性対照として）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしておいたフルオレセインコンジュゲートタンパク質（Ｓタンパク質）に結合させた。次に、ＤＡＲＴの２Ｂ６アームを可溶性ＣＤ３２Ｂと結合させた。エピトープが２Ｂ６のエピトープと重複しないＣＤ３２Ｂに対する別の抗体、次いでＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体を用いて結合を検出した。２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴはフルオレセイン及びＣＤ３２Ｂに同時に結合することができるが、２Ｂ６／３Ｇ８はできない（図２１、パネルＡ）。可溶性ＣＤ３２Ｂでコーティングしたプレート上でＤＡＲＴを捕捉し、ｈｕ２Ｂ６ Ｆｖに特異的な抗体で結合を検出すると、いずれのＤＡＲＴも良好な結合を示す。ヒトＩｇＧにコンジュゲートさせたフルオレセインに２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴが結合できることを示すために（これが本試薬の最初の実装形態の場面であるとする）、非標識の又はフルオレセイン標識されたＨｕＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、２Ｂ６／４４２０の捕捉に用いた。ここでもまた、２Ｂ６／３Ｇ８を陰性対照として用いた。Ｈｕ２Ｂ６ Ｆｖに特異的な抗体を用いて結合を検出した。２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴは明らかにＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧに結合するが、非標識ＨｕＩｇＧには結合せず、ことことは、このＤＡＲＴが、抗体にコンジュゲートしたフルオレセインに結合でき、抗体単独に対しては顕著な結合がないことを示している。予想通り、これらのいずれにおいても、２Ｂ６／３Ｇ８ ＤＡＲＴによる結合は検出されなかった。
細胞ベースのアッセイで２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴがシグナル伝達に影響を与えることができる二重親和性試薬として機能できることを示すための実験を行った。ＣＤ３２ＢとＢＣＲとの共凝集はＢ細胞活性化を阻害することが示されている。２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴを、フルオレセイン標識αＣＤ７９ｂ抗体でコーティングされたＢＣＲとＣＤ３２Ｂとを共に会合させて細胞増殖阻害を引き起こす能力について調べた。Ｂ細胞をヒト血液から陰性選択し、固定濃度（５μｇ／ｍＬ）の２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴ又はフルオレセインを標的としないため対照として用いられる分子である同等量の２Ｂ６／３Ｇ８ ＤＡＲＴと共に、種々の濃度のＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ７９ｂクローンＣＢ３．１及びＣＢ３．２で処理することにより活性化し、Ｆｃ特異的ＧＡＭのＦ（ａｂ'）２断片をＢＣＲを架橋するための二次試薬として加えた。［３Ｈ］−チミジン取込みとして測定される細胞増殖は、ＤＡＲＴ非存在下又は対照２Ｂ６／３Ｇ８ ＤＡＲＴの存在下ではモノクローナル抗ＣＤ７９ｂ−ＦＩＴＣ活性化因子の濃度上昇と共に増大した。２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴが存在すると全濃度の抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＦＩＴＣでＢ細胞増殖が大幅に低下した（図２２、パネルＡ及びＢ並びに図２３、パネルＡ）。
非標識ＣＢ３．２でコーティングして同じ実験条件を用いて活性化させたＢ細胞を２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴで処理した時に増殖の阻害が観察されなかったことが、その標的特異性を証明している（図２３、パネルＢ）。これらのデータは、２Ｂ６／４４２０ ＤＡＲＴがＣＤ３２ＢとＢＣＲを架橋し、抗原受容体に誘導される細胞活性化をブロックできる抑制性シグナルを送達できることを示している。
６．６ ＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞悪性腫瘍に対するＤＡＲＴ免疫治療薬
現在、Ｂ細胞悪性腫瘍は抗ＣＤ２０抗体リツキサン（登録商標）を用いて処置されている。しかし、一部のＢ細胞悪性腫瘍はＣＤ２０を発現しないか、リツキサン耐性になる。本発明のＤＡＲＴは、抗ＣＤ２０抗体リツキサン（登録商標）に関連する問題を克服できる代替的免疫治療薬を提供する。
ＭＧＤ２６１は、ｈＣＤ３２Ｂ（ｈ２Ｂ６抗体を介して）並びにｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ１６Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体を介して）に結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
ＭＧＤ２６１の有効性（Ｂ細胞枯渇）及び安全性をｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、及びｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６で調べた。この反復投与実験において、マウスは６回の静脈内（ＩＶ）注射（週２回、３週間）を受けた。Ｂ細胞枯渇はＦＡＣＳによりモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。
データ：
データはＭＧＤ２６１が二重トランスジェニックマウスにおいて顕著な副作用を誘導することなくＢ細胞を枯渇できることを示している。
マクロジェニックス社（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）製繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、及びｍＣＤ３２−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ３２Ｂ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、０、３、７、１０、１４、及び１７日目にＭＧＤ２６１（１０、３、１、又は０．３ｍｇ／ｋｇ）又は無関係の抗体（１０ｍｇ／ｋｇのｈＥ１６）をＩＶ注射した。−１９（出血前）、４、１１、１８、２５、及び３２日目にＦＡＣＳ分析用の血液を採取した。動物の健康及び活動を週３回記録した。
ＦＡＣＳ分析：
ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８投与の１８日前、並びに処置の４、１１、１８、２５、及び３２日後に全血試料を採取した。Ｂ細胞数へのｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８の影響を決定するためにＦＡＣＳベースのアッセイで血液試料を分析した。ベックマン・コールター社から入手したＦｌｏｗＣｏｕｎｔビーズを用いることにより、洗浄なしのプロトコールを用いてＢ細胞、Ｔ細胞、及びＰＭＮをカウントした。分析に用いた抗体のパネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、総白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
結果
ｈＥ１６又はＭＧＤ２６１（全濃度）で処置したマウスは実験期間中のいずれの時点においても不快感の徴候を示さなかった。
ｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ３２Ｂの二重トランスジェニックマウスでＢ細胞枯渇が観察された。ダイアボディｈ２Ｂ６−３Ｇ８はｈＣＤ１６Ａを発現するエフェクター細胞とｈＣＤ３２Ｂを発現するＢ細胞とを会合させ、この会合はＢ細胞殺作用に必要であった。Ｂ細胞枯渇は単一トランスジェニックマウスでは観察されなかった（図２４）。研究中、Ｔ細胞及びＰＭＮレベルに有意な変化はなかった。
本発明の代替的免疫治療薬の更なる実証として、「２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢ」と名付けたＭＧＤ２６１の代替物を構築した。２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢは、ｍＣＤ３２Ｂ（２．４Ｇ２抗体を介して）並びにｈＣＤ１６Ａ及びｈＣＤ１６Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体を介して）に結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
ｍＣＤ１６−／−、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ｂ＋、及びｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスを用いて２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢの有効性（Ｂ細胞枯渇）及び安全性を調べた。本反復投与実験では、９回の腹腔（ＩＰ）内注射（週３回、３週間）をマウスに行った。Ｂ細胞枯渇はＦＡＣＳでモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。
データは２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢがｈＣＤ１６トランスジェニックマウスにおいて顕著な副作用を誘導することなくＢ細胞を枯渇させることができることを示している。
データ：
マクロジェニック社製繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ Ｃ５７Ｂｌ／６、ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ｂ＋、及びｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、０、２、４、７、９、１１、１４、１６、及び１８日目に２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢ（７５μｇ／マウス）又はＰＢＳをＩＰ注射した。−１０（出血前）、４、１１、及び１８日目にＦＡＣＳ分析用の血液を採取した。動物の健康及び活性を週３回記録した。
ＦＡＣＳ分析：
２．４Ｇ２−３Ｇ８投与の１０日前並びに処置開始の４、１１、及び１８日後に全血試料を採取した。Ｂ細胞数への２．４Ｇ２−３Ｇ８の影響を決定するためにＦＡＣＳベースのアッセイで血液試料を分析した。ＢＤイムノサイトメトリーシステム社から入手したＴｒｕＣＯＵＮＴチューブを用いることにより、洗浄なしのプロトコールを用いてＢ細胞、Ｔ細胞、及びＰＭＮをカウントした。分析に用いた抗体のパネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、全白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
結果
ｈＥ１６又は２．４Ｇ２−３Ｇ８ ＤＢで処置したマウスは実験期間中のいずれの時点においても不快感の徴候を示さなかった。
ｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋又はｍＣＤ１６−／− ｈＣＤ１６Ａ＋ ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスではＢ細胞枯渇が観察されたが、ｍＣＤ１６−／−マウスではＢ細胞枯渇は観察されなかった。これらのデータは、ｈＣＤ１６Ａを有するエフェクター細胞がＢ細胞殺作用に必要であったことを示している（図２５）。研究中、Ｔ細胞及びＰＭＮレベルに有意な変化はなかった。
静脈内（ＩＶ）モデル：
ヒト腫瘍細胞系Ｒａｊｉの静脈内（ＩＶ）モデルを用いてＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性を調べた。ＲａｊｉはｈＣＤ３２Ｂを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞系である。腫瘍細胞は、ｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−マウスに静脈内注射されると脊椎に局在して後肢を麻痺させる。
データは、ｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／−マウスにおいてＲａｊｉ腫瘍細胞の成長をインビボでＭＧＤ２６１がブロックできることを示している。データはヒトにおいてＣＤ３２Ｂを発現するＢ細胞悪性腫瘍の処置にＭＧＤ２６１を用いることができることを示している。
データ：
マクロジェニックス社製繁殖コロニーの１２〜２０週齢のｍＣＤ１６−／−、ｈＣＤ１６Ａ＋、ＲＡＧ１−／− Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに５×１０６Ｒａｊｉ細胞を０日目にＩＶ注射した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７、及び３０日目に、マウスを更に２５０、２５又は２．５μｇのＭＧＤ２６１又はＰＢＳ（陰性対照）で腹腔内（ＩＰ）処置した。その後、マウスを毎日観察し、体重を週２回記録した。後肢の麻痺を発症したマウスは屠殺した。
結果：
ＰＢＳで処置したマウスは２５〜５０日目の間に死亡した。ＭＧＤ２６１で処置したマウスは少なくとも９０日目まで生存した（図２６）。生存率増加は統計的に有意であった。ログ・ランク検定を用いた生存曲線を比較した結果、χ２は９６．４６（ｄｆ＝９；Ｐ値＜０．０００１）であった。
６．７ 原核生物におけるＤＡＲＴ発現
非哺乳動物宿主中でＤＡＲＴを産生する能力を実証するために実験を行った。したがって、大腸菌をＤＡＲＴ発現プラスミドで形質転換し、ＤＡＲＴの発現をモニタリングした。
材料及び方法：
プラスミド構築：
３Ｇ８はＨｕＣＤ１６に対するヒト化モノクローナル抗体である。ここで説明するＤＡＲＴは２つの共有結合により連結された鎖からなり、各鎖は、ＶＬ、その後ろにスペーサー、次いでＶＨ、その後ろに対向鎖とジスルフィド結合を形成するのに良好な前後関係でＣｙｓを有する。３Ｇ８ＶＬ−ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１０）−３Ｇ８ＶＨ−ＬｅｕＧｌｙＧｌｙＣｙｓをコードするＤＡＲＴ配列を、既存の真核生物用発現コンストラクトからＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。標的ベクターはｐＥＴ２５ｂ（＋）（ノバジェン社製）であり、これは大腸菌内での分泌のためのｐｅｌＢリーダー配列を含む。３Ｇ８／３Ｇ８ ＤＡＲＴ配列を挿入する前にベクターを以下のように改変した：まず、その制御下で低レベルであっても可溶性のタンパク質発現を促すために、Ｔ７プロモーターをより活性の低いｌａｃプロモーターで置換した。更に、ｐｅｌＢリーダーの開始部に存在するＭｅｔでの開始が起こりやすいように、２つの点変位を導入してマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の開始部に存在する２つの内部Ｍｅｔコドンを除去した。このコンストラクトにより生成するＤＡＲＴは、同じ特異性、すなわちＨｕＣＤ１６に対する特異性を有する２つのＶ領域アームからなる。
発現：
ＢＬ２１ＤＥ３細胞（ノバジェン社製）をｐＥＴ２５ｂ（＋） Ｔ７−ｌａｃ＋ ３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、ａｍｐ耐性コロニーをブロス培養液に播種した。培養液のＯＤ６００単位が０．５に達した時に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて発現を誘導した。培養を３０℃で２時間成長させ、無細胞培地を回収した。
精製：
アフィニティー及び分子ふるいクロマトグラフィーを用いた２ステッププロセスで３Ｇ８／３Ｇ８ ＤＡＲＴを精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて条件培地からＤＡＲＴを捕捉した。具体的には、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）にＣＤ１６Ａをカップリングさせた。ローディング前にＣＤ１６Ａ−セファロース樹脂を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した。ローディング完了後、樹脂を平衡バッファーで洗浄した後、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いて、結合したＤＡＲＴを溶出させた。溶出したＤＡＲＴをすぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、遠心型濃縮装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０、１０ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ、ビバサイエンス社（VivaScience Inc.）製）を用いて濃縮した。濃縮したＤＡＲＴを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた分子ふるいクロマトグラフィーで更に精製した。
結果
大腸菌を培養した条件培地１．７リットルをＣＤ１６Ａセファロースカラムで処理した。ＤＡＲＴの収量は０．１２ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによる精製ＤＡＲＴの分析により、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）発現対照ＤＡＲＴとの同等性が示された（図２７）。
大腸菌により発現したｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ ＤＡＲＴ結合のＥＬＩＳＡ：
大腸菌内におけるｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ ＤＡＲＴの発現をＥＬＩＳＡで測定した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に、炭酸バッファー中４℃で一晩、５０μｌ／ウェルで２μｇ／ｍｌの抗ｈ３Ｇ８ Ｆｖ特異的抗体２Ｃ１１をコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、試験対象のＤＡＲＴを添加する前に、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔを用いて室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング中、大腸菌発現ｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８ ＤＡＲＴ、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ ＤＡＲＴ、及びｈ２Ｂ６−ｈ２Ｂ６ ＤＡＲＴ（陰性対照）を１μｇ／ｍｌ及び０．３μｇ／ｍｌでＰＢＳＴ／ＢＳＡ中に希釈した。希釈ＤＡＲＴを５０μｌ／ウェルで各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化ｓＣＤ１６−Ｆｃ融合体を５０μｌ／ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：５０００希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を５０μｌ／ウェルで検出に用い、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いて読み取った。読取値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした（図２８）。
６．８ ＤＡＲＴにより誘導されるヒトＢ細胞死
ヒトＰＢＭＣを、ＣＤ１６−ＣＤ３２Ｂ（ｈｕ３Ｇ８−ｈｕ２ｂ６；前述）；ｃｈ２Ｂ６−ａｇｌｙｃ（非グリコシル化キメラ２Ｂ６抗体；参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／０２６０２１３号として公開されている同時係属中の米国特許出願第１１／１０８，１３５号に記載されている）、及びＣＤ１６−ＣＤ７９と共に一晩インキュベートした。ＣＤ１６−ＣＤ７９のＤＮＡ及びコードされているタンパク質配列は以下の通りである。
Ｈ３Ｇ８ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２６）：
アミノ酸配列（配列番号２２７）：
ＣＢ３．１ＶＬ−ｈ３Ｇ８ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２８）：
アミノ酸配列（配列番号２２９）：
ＦＡＣＳ分析により、ＦＳＣ／ＳＳＣのゲーティングされていない全集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシンＶ＋集団の百分率として、アポトーシスをアッセイした（図２９）。
６．９ ８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
Ｈ９及びｌｇｈ６３０Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いて、８Ｂ５ＶＬを増幅した。ｌｇｈ６２８Ｆ及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いて、ＣＢ３．１ＶＨを増幅した。プライマーｌｇｈ６３０Ｒ及びｌｇｈ６２８Ｆ中にリンカー配列を組み込んだ。ｃ末端リンカー及び終止コドンをｌｇｈ６２９Ｒプライマー中に組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣ
８Ｂ５ＶＬと同じ配列をＦＲ４に共有するＨ９及びｌｇｈ６３０Ｒをプライマー、ｃｈＣＢ３．１Ｌｃを鋳型として用いてＣＢ３．１ＶＬを増幅した。ｌｇｈ６３１Ｆ及びｌｇｈ６４０Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いて、８Ｂ５ＶＨを増幅した。リンカー配列をプライマーｌｇｈ６３０Ｒ及びｌｇｈ６３１Ｆ中に組み込んだ。ｃ末端リンカー及び終止コドンをｌｇｈ６４０Ｒプライマー中に組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６４０Ｒをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
オーバーラップＰＣＲによりシグナル配列と８Ｂ５ＶＬの間に抗Ｆｌａｇタグを挿入した。Ｈ９及びｌｇｈ６４７Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いて、シグナル配列及びＦｌａｇタグを増幅した。ｌｇｈ６４７Ｆ及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマー、８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを鋳型として用いて８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを再度増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣコンストラクト中に異なるＣ末端リンカーを作製するために、Ｈ９及びｌｇｈ６４６Ｒをプライマーとして用いてコンストラクトを再度増幅した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４６Ｒプライマー中に組み込んだ。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ
同じ戦略を用いてＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣを作製した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマー中に組み込み、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣを鋳型として用いた。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
これも同じ戦略を用いて、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣを作製した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマー中に組み込み、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを鋳型として用いた。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣヌクレオチド配列（配列番号２３０）：
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣアミノ酸配列（配列番号２３１）：
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣヌクレオチド配列（配列番号２３２）：
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣアミノ酸配列（配列番号２３３）：
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
Ｈ９及びｌｇｈ６９４Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いて８Ｂ５ＶＬを増幅した。ｌｇｈ６９５Ｆ及びｌｇｈ６９６Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いて、８Ｂ５ＶＨを増幅した。リンカー配列をプライマーｌｇｈ６９４Ｒ及びｌｇｈ６９５Ｆ中に組み込んだ。ｌｇｈ３５５Ｆ及びｌｇｈ３６６Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いて、ＨｕＩｇＧ１Ｆｃを増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、Ｈ９及びｌｇｈ３６６Ｒをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３４）：
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３５）：
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３６）：
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３７）：
プライマー：
発現：
コンストラクト５及び６、６及び７、８及び９、又は９及び１０によりコードされる発現プラスミド（図３０）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社製）を用いてＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトして抗ｆｌａｇタグの付いた又は付かない８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴを発現させた。３日毎に３回にわたり条件培地を回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡを以下のように行った：炭酸バッファー中４℃で一晩にわたり、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に２μｇ／ｍｌのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃを５０μｌ／ウェルでコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でプレートを３回洗浄し、次いで、試験対象の単鎖Ｆｃ融合タンパク質を添加する前に、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで室温にて３０分間ブロッキングした。ブロッキング中、８Ｂ５−ＣＢ３．１ ＤＡＲＴを、２μｇ／ｍｌに始まる２倍希釈系列で希釈した。２５μｌ／ウェルの５０ｎｇ／ｍｌ ｃｈ８Ｂ５と混合した２５μｌ／ウェルの希釈ＤＡＲＴを希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：１０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ'）２ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ'）２（ジャクソン・イムノリサーチ社製）を５０μｌ／ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読取った。読取結果をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした（図３１）。
６．１０ Ｉｇ様４価ＤＡＲＴのデザイン及び特徴解析
４つのポリペプチド鎖を用いて、４価の抗原結合部位を有するＩｇ様ＤＡＲＴ分子種を作製した（図３２、図３３）。Ｉｇ様ＤＡＲＴ分子種は、そのドメインが同じエピトープに結合するように（４個の同一の抗原分子に結合できる４価の単一エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）又は異なるエピトープ若しくは抗原に結合するようにデザインされ得るので、固有の特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の２個のエピトープに結合するように（単一の抗原に特異的であり、２つのエピトープに特異的な、４価のＩｇ様ＤＡＲＴを形成するように）又は異なる抗原分子のエピトープに結合するように（第１の抗原に特異的な結合部位の対と、第２の抗原に特異的な第２の結合部位の対とを有する４価のＩｇ様ＤＡＲＴを形成するように）デザインすることができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子は容易に作製することができる。
このようなＩｇ様ＤＡＲＴ分子種の特性を例示するため、ＣＤ３２に特異的な結合部位の対と、ＣＤ１６Ａに特異的な第２の結合部位の対とを有する、例示的な４価Ｉｇ様ＤＡＲＴ分子種を作製した。このＩｇ様ＤＡＲＴ分子種は以下の４つのポリペプチド鎖を用いて作製した。
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκヌクレオチド配列
（配列番号２４７）：
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκにコードされるアミノ酸配列
（配列番号２４８）：
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１ヌクレオチド配列
（配列番号２４９）：
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１にコードされるアミノ酸配列
（配列番号２５０）：
上記配列を有するＩｇ様ＤＡＲＴ分子の調製物を異なるプラスミド単離物から得、「Ｉｇ ＤＡＲＴ１」及び「Ｉｇ ＤＡＲＴ２」と命名した。ＥＬＩＳＡにおいてこれらのＩｇ様ＤＡＲＴ分子種がｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａに結合する能力を、培地単独、単一のＣＤ３２結合部位を有するＤＡＲＴ、単一のＣＤ１６Ａ結合部位を有するＤＡＲＴ（「ＤＡＲＴ」）、及び対照の抗ｃｈ−ｍＣＤ３２ ｍＡｂと比較した（図３４）。本発明のＩｇ様ＤＡＲＴは、ＤＡＲＴ又は対照抗体のいずれよりも遙かに大きな抗原結合親和性を有することが判明した。
６．１１ 二特異性ダイアボディＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２のデザイン及び特徴解析
ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨ（配列１）、ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１（配列２）、及びＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２（配列３）をコードする遺伝子を発現ベクターｐＥＥ１３にクローニングして、それぞれ発現コンストラクト１、２、及び３を得た。コンストラクト１発現プラスミドを、発現プラスミド２又は３のいずれかと一緒にＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクトしてそれぞれ二特異性ダイアボディＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２を作製した。条件培地を３日毎に３回にわたり回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
ＥＬＩＳＡを以下の通りに行った：４℃の炭酸バッファー中で一晩にわたり、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に２μｇ／ｍｌのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃを５０μｌ／ウェルでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、試験対象の単鎖Ｆｃ融合タンパク質を加える前に、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで室温にて３０分間ブロッキングした。ブロッキング中、二特異性ダイアボディＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１又はＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２を２μｇ／ｍｌに始まる２倍希釈系列で希釈した。希釈した二特異性ダイアボディ２５μｌ／ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２Ｂ抗体２５μｌ／ウェルと混合し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：１０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ'）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）２（ジャクソン・イムノリサーチ社製）を５０μｌ／ウェルでプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダー及びＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いて読取結果をプロットした。この実験により、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１及びＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２二特異性ダイアボディが抗ＣＤ３２Ｂ対照抗体の親和性と同等の親和性でＣＤ３２−Ｆｃに免疫特異的に結合できることが示された。上記コンストラクトのヌクレオチド及びコードされるアミノ酸配列を以下に示す。
配列１−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨヌクレオチド配列
（配列番号２５１）：
配列２−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨアミノ酸配列
（配列番号２５２）：
配列３−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１ヌクレオチド配列
（配列番号２５３）：
配列４−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１アミノ酸配列
（配列番号２５４）：
配列５−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２ヌクレオチド配列
（配列番号２５５）：
配列６−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２アミノ酸配列
（配列番号２５６）：
６．１２ ｈ８Ｂ５−ｈＢＣＲＣ生体機能性ダイアボディの構築及び最適化
ＣＤ３２及びＢ細胞受容体複合体（「ＢＣＲＣ」）に結合できる可変領域を含むダイアボディを構築した。
クローニング
標準的なＰＣＲ／オーバーラップＰＣＲを用いてコンストラクトを構築した。
ｈ８Ｂ５ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣ：
ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８８Ｒをプライマーとして用いて、完全にヒト化された８Ｂ５ ＶＬ（ＣＤ３２を認識する）を増幅した。ｌｇｈ７８４Ｆ及びｌｇｈ３８６Ｒをプライマーとして用いてｈＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉを増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、混合し、ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ３８６Ｒを用いて増幅した。次いで、このオーバーラップＰＣＲ断片をｐＥＥ６にＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位でクローニングした。「Ｇ３ＳＧ４」は配列：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を有するリンカーである。
ｈＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−Ｇ３ＳＧ４−ｈ８Ｂ５ＶＨ −ＬＧＧＣ：
ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８５Ｒをプライマーとして用いてｈＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎを増幅した。ｌｇｈ７８７Ｆ及びｌｇｈ７８６Ｒをプライマーとして用いてｈ８Ｂ５ＶＨを増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、混合し、ｌｇｈ３２１Ｆ及びｌｇｈ７８６Ｒを用いて増幅した。次いで、このオーバーラップＰＣＲ断片をｐＥＥ１３にＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位でクローニングした。
単一ベクターの構築
ｐＥＥ６ｈＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨをＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位で消化し、３．３ｋｂの断片を精製し、ｐＥＥ１３ ｈＨＢＣＲＣＶＬ ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨにＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位で挿入した。ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩは適合する付着末端を有する。ＤＡＲＴ及びＤＡＲＴの構築に用いたプライマーの配列を以下に示す。
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列
（配列番号２５７）：
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列
（配列番号２５８）：
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列
（配列番号２５９）：
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣアミノ酸配列
（配列番号２６０）：
プライマー：
Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ １−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ ４−ＬＧＧＣ発現プラスミドをＨｕ２Ｂ６ＶＬ ５−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ ５−ＬＧＧＣと一緒にＨＥＫ−２９３細胞中にコトランスフェクトして、ＣＤ３２及びＣＤ７９を認識するＨｕ２Ｂ６ ４．５−Ｈｕ３Ｇ８ ５．１二特異性ダイアボディを作製した。同時に、Ｈｕ２Ｂ６ＶＬ ５−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ ４−ＬＧＧＣ及びＨｕ３Ｇ８ＶＬ １−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ ５−ＬＧＧＣを個々にＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトしてＨｕ２Ｂ６ ４．５及びＨｕ３Ｇ８ ５．１ダイアボディを作製した。培養３日後、条件培地を回収し、結合ＥＬＩＳＡにより特徴解析した。この実験の結果を図３６に示す。
実験デザイン：
炭酸バッファー中４０℃で一晩、可溶性ＦｃＲＩＩｂ−Ｇ２−Ａｇｌｙを１００ｎｇ／ウェルで９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ダイボディを加える前に、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で室温にて３０分間ブロッキングした。Ｈｕ２Ｂ６ ４．５−Ｈｕ３Ｇ８ ５．１生体特異的ダイアボディ、Ｈｕ２Ｂ６ ４．５ダイアボディ、及びｈｕ３Ｇ８ ５．１ダイアボディの条件培地の２５ｎｇ／ウェルに始まる２倍希釈系列を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＦｃＲＩＩＩａ−Ｇ２−ビオチンを１０ｎｇ／ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、５０μｌの１：５０００希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて検出した。室温で４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて発色させた。１０分間インキュベートした後、１％Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。ＳＯＦＴｍａｘプログラムでＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ３．０３ソフトウェアを用いて読取結果をプロットした。
６．１３ ＩｇＤＡＲＴダイアボディの構築
ＣＤ３２及びＢ細胞受容体複合体（「ＢＣＲＣ」）に結合できる可変領域を含むＩｇＤＡＲＴダイアボディを構築した。第１のダイアボディでは、分子のＶＨ配列とＦｃ配列の間にＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）リンカーを用いた。第２のダイアボディでは、配列：ＬＥＩＫ（配列番号２６８）を有するＬＥＩＫリンカー又は配列ＴＶＳＳ（配列番号２６９）を有するＴＶＳＳリンカーのいずれかを用いた。これらのダイアボディの鎖及びコードするポリヌクレオチドの配列を以下に示す。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ
（配列番号２７０）：
１０８〜１１５位のリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によりＨ８Ｂ５ＶＬ配列がｈＢＣＲＣＶＨ配列に融合している。２２９〜２３６位のリンカーＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）によりｈＢＣＲＣＶＨ配列がＦｃ配列に融合している（どちらも上記において下線で示されている）。Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ配列をコードするポリヌクレオチドは、
（配列番号２７１）：
であって、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）をコードする配列はそれぞれ３２２〜３４５及び６８５〜７０８位に位置する（どちらも上記において下線で示されている）。
ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧ１
（配列番号２７２）：
１１３〜１２０位のリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によりｈＢＣＲＣＶＬ配列がＨ８Ｂ５ＶＨ配列に融合している。２３７〜２４４位のリンカーＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）によりＨ８Ｂ５ＶＨ配列がＦｃ配列に融合している（どちらも上記において下線で示されている）。ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧ１配列をコードするポリヌクレオチドは、
（配列番号２７３）：
であって、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）をコードする配列はそれぞれ３３７〜３６０位及び７０９〜７３２位に位置する（どちらも上記において下線で示されている）。
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ
（配列番号２７４）：
１０８〜１１５位のリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によりＨ８Ｂ５ＶＬ配列がＨＢＣＲＣＶＨ配列に融合している。２２５〜２２８位のリンカーＬＥＩＫ（配列番号２６８）によりＨＢＣＲＣＶＨ配列がＦｃ配列に融合している（どちらも上記において下線で示されている）。Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ配列をコードするポリヌクレオチドは、
（配列番号２７５）：
であって、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＬＥＩＫ（配列番号２６８）をコードする配列はそれぞれ３２２〜３４５位及び６７３〜６８４位に位置する（どちらも上記において下線で示されている）。
ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧ１＝ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿−ｈＧ１
（配列番号２７６）：
１１３〜１２０位のリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によりＨＢＣＲＣＶＬ配列がｈ８Ｂ５ＶＨ配列に融合している。２３３〜２３６位のリンカーＴＶＳＳ（配列番号２６９）によりｈ８Ｂ５ＶＨ配列がＦｃ配列に融合している（どちらも上記において下線で示されている）。ＨＢＣＲＣＶＬ Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧ１をコードするポリヌクレオチドは、
（配列番号２７７）：
であって、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）及びＴＶＳＳ（配列番号２６９）をコードする配列はそれぞれ３３７〜３６０位及び６９７〜７０８位に位置する（どちらも上記において下線で示されている）。
６．１４ リンカーの最適化
前述の通り、本発明のＩｇＤＡＲＴダイアボディは分子のＶＨ配列とＦｃ配列の間にリンカーを含むことが好ましい。収率及び活性を最大化するために、リンカーを最適化する実験を行った。以下のリンカーを用いた。
異なる組合せのリンカーを有するＩｇＤＡＲＴダイアボディセットを作製するために上記リンカーをプラスミドに導入した：
生成したＩｇＤＡＲＴの凝集特性を調べた。
データは、予想されなかったことに、９１０Ａ／９１１Ｂ等のリンカーを有するコンストラクトよりも９０１Ａ／９０１Ｂ、９０３Ａ／９０３Ｂ、及び９０８Ａ／９０８Ｂで用いたようなリンカーを有するコンストラクトで劇的に優れた結果（少ないオリゴマー化及び／又は少ない断片生成）が得られることを示した。
６．１５ Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴ
上記に鑑みて理解されるように、二特異性ＤＡＲＴの個々のポリペプチドは２種類のホモ二量体及び１種類のヘテロ二量体を形成し得る。本発明の一実施形態では、一方又はより好ましくは両方のＤＡＲＴポリペプチドのＣ末端に荷電ポリペプチドを付加することができる。二特異性ＤＡＲＴの個々のポリペプチドに反対の電荷の荷電ポリペプチドを選択することにより、そのような荷電ポリペプチドを含めることでヘテロ二量体の形成が増え、ホモ二量体の形成が減る。好ましくは、正に帯電したポリペプチドは実質的な量のアルギニン、グルタミン、ヒスチジン、及び／又はリジン（又はこのようなアミノ酸の混合物）を含み、負に帯電したポリペプチドは実質的な量のアスパラギン酸又はグルタミン酸（又はこのようなアミノ酸の混合物）を含む。実質的な量のリジンを含む正に帯電したポリペプチド及び実質的な量のグルタミン酸を含む負に帯電したポリペプチドが特に好ましい。このような逆に帯電したポリペプチド間の静電引力を最大にするために、へリックスコンホメーションを自然に形成できるポリペプチドを用いることが好ましい。
したがって、好ましい実施形態では、正に帯電した「Ｅコイル」が、二特異性ＤＡＲＴを形成するために用いられるポリペプチドの１つに付加され、負に帯電した「Ｋコイル」が、ＤＡＲＴの第２のポリペプチドに付加される（図３７）。
特に好ましいＥコイルは以下の配列を有する：（ＥＶＡＡＬＥＫ）４：
特に好ましいＫコイルは以下の配列を有する（ＫＶＡＡＬＫＥ）４：
そのようなＥコイルを有する好ましいＤＡＲＴポリペプチドの一般的配列は以下の通りである：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧＮＳ（式中、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの可変重Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号２９９であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１である。そのようなＫコイルを有する好ましいＤＡＲＴポリペプチドの一般的配列は以下の通りである：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］−ＧＧＧＮＳ（式中、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの可変重Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号３００であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１である。
６．１６ Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ
別の実施形態では、Ｅコイル又はＫコイルＤＡＲＴのＥ及び／又はＫコイルにＦｃ領域が連結され得る。
Ｆｃ含有ＤＡＲＴのＦｃ領域とＤＡＲＴ ＶＨドメインとの隔たりが少ない配置のためにこのようなドメインとその結合リガンドとの間の相互作用が減少するかＤＡＲＴの組立が干渉を受ける場合、これらのドメインの間の隔たりを大きくすることが望ましい。任意のアミノ酸配列のセパレーターが用いられ得るが、αへリックスコイルを形成するセパレーターを用いることによりＦｃドメインが可変ドメインから最大限離れて延びる又は突出するようにすることが好ましい（図３７）。逆に帯電した上記コイル状のポリペプチドは更にヘテロ二量体形成を促進するように機能するため、このような分子は特に好ましいセパレーターである。このようなコイル含有Ｆｃ−ＤＡＲＴ分子は、血清半減期の向上及びエフェクター機能の動員を含むＦｃ−ＤＡＲＴと同様な利点をもたらす。上記Ｅコイル及びＫコイルポリペプチドは本目的のために特に好ましい。
したがって、好ましい実施形態では、ＥコイルＦｃ含有ＤＡＲＴの一般的配列は以下の通りである：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（Ｋａｂａｔのナンバリング）から始まるＦｃドメイン（式中、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの可変重Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号２９９である）。
同様に、好ましい実施形態では、ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴの一般的配列は以下の通りである：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（Ｋａｂａｔのナンバリング）から始まるＦｃドメイン（式中、ＶＬはＤＡＲＴの可変軽Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの可変重Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号３００である）。
前述の通り、コイル含有ＤＡＲＴ分子又はコイル含有Ｆｃ含有ＤＡＲＴ分子はそのようなコイルセパレーターを１個だけ含んでもよく、あるいはそのようなセパレーターを２個以上（例えば、好ましくは逆に帯電した、２個のセパレーター；そのうちの１つがＤＡＲＴのポリペプチドの各ＶＨドメインに連結されている）を含んでもよい。Ｆｃ領域をそのようなセパレーター分子に連結することにより、鎖交換により２価、４価等のＦｃ−ＤＡＲＴ分子を作製する能力が向上する（図３９）。図３９に示すように、ＦｃドメインがＤＡＲＴ ＶＨドメインの一方に連結されるか、両方に連結されるかによって、単量体又は二量体を形成するＦｃ−ＤＡＲＴ分子が形成され得る。
６．１７ Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴの機能的活性
（１）ＣＤ７９ｂ（ＢＣＲ複合体）反応性抗体ＣＢ３の可変軽及び重領域並びに（２）ＣＤ３２Ｂ反応性抗体２Ｂ６の低親和性変異体（「ＹＡ」と呼ばれる変異体）の可変軽及び重領域を有する二特異性ＤＡＲＴ分子からＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ−ＤＡＲＴ分子種を作製した。この抗体のこの軽鎖可変領域は変異Ｎ５０Ｙ及びＶ５１Ａを含む点で抗体２Ｂ６のそれと異なる。したがって、抗体ＹＡ２Ｂ６は以下の軽鎖可変領域配列を有する：
この抗体の重鎖可変領域の配列は、
又はである。
ＣＤ７９ｂを発現する細胞（Ｂ細胞）上のシスのＣＤ３２Ｂに優先的に結合することから、この低親和性抗体を選択した。したがって、この立体構造は、他のＣＤ３２Ｂ発現細胞（単球、内皮細胞、肝臓）との相互作用及び望ましくないトランス相互作用を低減する。
そのようなｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴのＥコイル及び／又はＫコイル誘導体並びにＥコイル及び／又はＫコイルＦｃ含有誘導体を作製した。分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、生成した分子のおおよそのサイズ及び異種性を分析した。図４０に示されるように、Ｋコイルドメインに１個のＦｃ領域が連結されたＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴ及びＥコイルドメインに１個のＦｃドメインが連結されたＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴの二量体が形成された。形成した主な生成物が単量体である、同じＤＡＲＴ分子のＥ及びＫコイルの両方にＦｃ領域が連結された調製物から、所望の単量体及び二量体分子を回収した。生成した二量体分子の可能な構造を図４１に示す。
分子ふるいクロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析して生成した分子の構造を更に分析した（図４２）。Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴ誘導体（Ｆｃ領域なし）はそれぞれが約２８ｋＤである２つの主要なバンド（ＫＦｃ含有ポリペプチド及びわずかに小さいＥＦｃ含有ポリペプチドに対応する）及びさほど目立たない約４９ｋＤのバンド（Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴに対応する）として泳動した。Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体の単量体画分（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）は、分子ふるいクロマトグラフィーで、約２８ｋＤにより大きな分子量又はより小さな分子量のバンドのみを示した（ＤＡＲＴがＫＦｃ含有ＤＡＲＴ（より大きな分子量のバンド）であるか、ＥＦｃ含有ＤＡＲＴ（より小さな分子量のバンド）であるかに対応する）。材料は主に約４９ｋＤに泳動した（Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴに対応）。かなり大きな分子量のバンドも観察された。
二特異的結合ＥＬＩＳＡを行って、生成した分子の特徴を分析した。ＣＤ７９をＥＬＩＳＡプレートに入れた。次いで、ＤＡＲＴをプレートに結合させた。次いで、ｓＣＤ３２Ｂ−ビオチンを用いた後、ストレプトアビジン−ＨＲＰとインキュベートして、ＤＡＲＴ結合を検出した。図４３に示されるように、Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／Ｋ又はＥ／ＫＦｃ）は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴと比べて、又はＥＦｃ／ＫＦｃ ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体と比べて、結合の有意な上昇を示した。
ＣＤ７９ｂに結合した抗体の架橋はＢ細胞を活性化させる（Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-Β (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells," Clin. Exp. Immunol. 110:509-515）。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３ ＤＡＲＴ分子はＣＤ７９ｂ及びＣＤ３２Ｂ抑制性受容体の両方に結合できるので、ＣＤ７９ｂ結合部位にＣＤ３２Ｂを「動員」して、これによりＢ細胞増殖をブロックする能力がある。この能力を実証するために、ＤＡＲＴを、結合した抗ＣＤ７９ｂ抗体を架橋できる抗体にさらしたＢ細胞とインキュベートした。この実験の結果を図４４に示す。結果は、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ３２Ｂ単独に対する抗体（それぞれＣｈ２Ｂ６Ｎ２９７Ｑ及びＣｈＣＢ３．１Ｎ２９７Ｑ）がＢ細胞増殖を阻害できなかったことを示している。ＥＦｃ／ＫＦｃ ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体は、ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ ＤＡＲＴ自体及びｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ ＶＦ対照同様、Ｂ細胞増殖の阻害に実質的により効果的であった。連結されたＦｃ領域が１個だけのＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴ（Ｅ／ＫＦｃ ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体及びＥＦｃ／Ｋ ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３ ＤＡＲＴ誘導体）が最も強くＢ細胞増殖を阻害することが見出された。
６．１８ インビボ血清半減期を変更するためのＤＡＲＴの改変
前述の通り、二特異性単鎖分子等の小さな組換え抗体分子（例えば、約５５ｋＤａの分子量）は迅速に循環からクリアランスされる。マウスにおけるＤＡＲＴ分子のインビボ薬物動態研究は、予想通り、約２時間という短い終末半減期を示した。
急性炎症性状態の処置等の一部の実施形態ではこのような短い半減期が望まれるが、癌及び慢性的な疾患及び状態の処置におけるような別の実施形態では、本発明のＤＡＲＴ分子の半減期はより長い方が好ましい。
そのような用途のためのＤＡＲＴ分子のインビボ薬物動態特性を改善するために、ＤＡＲＴ分子を改変して、ＤＡＲＴ分子の１又は複数の末端に血清結合タンパク質のポリペプチド部分が含まれるようにしてもよい。最も好ましくは、そのような血清結合タンパク質のポリペプチド部分はＤＡＲＴ分子のＣ末端に組み込まれる。この目的に特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。ストレプトコッカスＧ１４８株のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が特に好ましい。
ストレプトコッカスＧ１４８株のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定な３へリックスバンドルを形成する４６アミノ酸残基からなり、広いアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。ヒトにおいて、アルブミンは血漿中に最も豊富なタンパク質であり、半減期は１９日である。アルブミンは、他のタンパク質に非共有結合的に結合することにより血清半減期を延ばすことを可能にする複数の小分子結合部位を有する。
血清タンパク質のポリペプチド部分がＤＡＲＴの半減期を延ばす能力を実証するために、ストレプトコッカスプロテインＧのＡＢＤ３ドメインを組換え二特異性ＤＡＲＴ（ｈＣＤ１６及びｈＣＤ３２Ｂ抗原に免疫反応性）に融合して組換え抗体分子ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを作製した（図４５）。このＡＢＤ−ＤＡＲＴは、両方の抗原及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する特異的結合を示し、インビトロでエフェクター細胞を再標的化することができた。対照ＤＡＲＴと比べて、このＡＢＤ−ＤＡＲＴはマウスにおいて血清半減期の大幅な延長を示した。このアプローチは、ＤＡＲＴのような重要な可能性のある医薬品の半減期を９０分超、２時間超、５時間超、１０時間超、２０時間超、最も好ましくは３０時間超に延長させる実行可能な手段として用いることができる。
材料及び方法：
ＡＢＤ ＤＡＲＴのデザイン及び構築：
鎖１として
ｈＣＤ１６ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ３２ＢＶＨ−Ｋコイル［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］
（式中、ＣＤ１６ＶＬは３Ｇ８ ＣＤ１６ＶＬを表し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を表し、ｈＣＤ３２ＢＶＨは２Ｂ６ ＣＤ３２ＢＶＨを表し、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号３００を表す）を用い、
鎖２として
ｈＣＤ３２ＢＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ１６ＶＨ−ＧＧＣＧＧＧ−Ｅコイル［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ
（式中、ＣＤ３２ＢＶＬはＣＤ３２ＢＶＬを表し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を表し、ｈＣＤ１６ＶＨはＣＤ１６ＶＨを表し、ＧＧＣＧＧＧは配列番号２６７の残基２〜７であり、Ｅコイル［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］は配列番号２９９であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１であり、ＡＢＤは
を用いて、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴを作製した。
したがって、鎖１（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ）の配列は、
である。
鎖１（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ）をコードする好ましいポリヌクレオチドは、
である。
したがって、鎖２（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ）の配列は、
である。
鎖２（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ）をコードする好ましいポリヌクレオチドは、
である。
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴを鋳型として用いたＰＣＲにより各ＶＬ及びＶＨセグメントを増幅した。鎖２では、プライマー二量体によりＥコイル及びＡＢＤを含むヌクレオチド配列を形成した後、制限消化及びライゲーションを用いてｈＣＤ１６のＶＨ領域のＣ末端にサブクローニングした。どちらの鎖もｐＣＩｎｅｏベクター（プロメガ社製）にＮｈｅＩ−ＮｏｔＩＩ部位でクローニングした。次いで、ＮｇｏＭＩＶ−ＮｈｅＩで消化した鎖１及びＢｓｔＢＩ−ＰｍｅＩで消化した鎖２の発現カセットそれぞれを有する個々のプラスミドを１つのプラスミドにクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトして安定な細胞系を作製した。
タンパク質の発現及び精製：
安定なトランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｓ細胞をｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＥＫ ＡＢＤ−ＤＡＲＴプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂにカップリングした可溶型のＦｃＲＩＩＢ抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質を精製した。濃縮したタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０を用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより更に精製した。
ＥＬＩＳＡによる結合アッセイ：
ＣＤ１６を用いて捕捉するために、濃度２μｇ／ｍＬのＦｃＲＩＩＢ抗原を用いて４℃で一晩プレートをコーティングした。次いで、プレートを０．５％ペプトンを含むＰＢＳ−Ｔでブロッキングした。２倍希釈系列で希釈した精製タンパク質をプレートに室温で１時間結合させた。最後に、ビオチン化ＣＤ３２Ｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）、次いでＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（１／１０００、ＢＤ−Ｐｈａｒｍ社製）を用いて検出を行った。ＴＭＢを加えてＨＲＰ活性を測定し、プレートリーダーを用いてプレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）捕捉のために、濃度２μｇ／ｍＬのＨＳＡを用いて４℃で一晩プレートをコーティングした。その後、二重親和性ＥＬＩＳＡを行ったのと同じ手順を行った。
末梢血液単核細胞仲介ＡＤＣＣアッセイ：
ＬＤＨ放出アッセイで細胞傷害性を測定した。メーカーの指示書に従ったＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（アマシャム・バイオサイエンス社製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）密度勾配遠心により、ヒト全血（ロンザ・ウォーカーズビル社（Lonza Walkersville,Inc）製、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。２×１０４標的細胞を丸底９６ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレーティングする。異なるＤＡＲＴ又は抗体分子の１〜４つの希釈系列をプレート中の細胞に添加する。その後、６×１０５ＰＢＭＣを同じウェルに加える。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で一晩インキュベートする。次いで、プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心し、５０μｌの上清を平底ＥＬＩＳＡプレートに移す。５０μｌのＬＤＨ基質溶液（プロメガ社製）を各ウェルに加え、プレートを室温、暗黒下で３０分間インキュベートする。次いで、５０μｌの停止溶液を各ウェルに加え、１時間以内にプレートを４９０ｎｍで読み取る。生のＯ．Ｄ．読取値を用いて、
（試料ＡＩＣＣ）／（標的Ｍａｘ−標的Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）×１００
（式中、ＡＩＣＣは抗体非依存性細胞性細胞傷害である）として各ウェルの細胞傷害性のパーセントを算出する。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量反応曲線を作製する。
薬物動態研究：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴを５ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した。投与前、２、３０分；１、３、６、２４、及び７２時間目にマウス血清を採取した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴの血清濃度を定量した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴの薬物動態学的計算は、薬物動態用ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ５．１（ファーサイト社（Pharsight Corporation）製、米国）を用いて行った。パラメーターはノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）により決定した。ノンコンパートメント分析は、薬物の静脈内注射を必要とするモデル（Ｍｏｄｅｌ ２０１）に基づいて行った。線形台形法を用いてパラメーターを計算した。
結果
ＥＬＩＳＡによる発現及び結合実験：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴを哺乳動物ＣＨＯ−Ｓ細胞中で６．５ｍｇ／リットルの濃度で効率的に発現させた。各抗原に対する精製ＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質の結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。その結果、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴが両方の抗原、すなわちＣＤ１６及びＣＤ３２Ｂに同時に結合することが示された（図４６Ａ）。この結合プロファイルは対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴタンパク質の結合と一致している。精製ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性もＥＬＩＳＡにより示された（図４６Ｂ）。この結果は、ＡＢＤ融合ＤＡＲＴのＨＳＡへの強力な結合を示しており、一方、対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴでは結合は観察されなかった。ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及びＨＳＡに同時に結合できることを示すために、ＨＳＡを固定化した表面にＡＢＤ−ＤＡＲＴを注入し、次いで２００ｎＭ ＣＤ３２Ｂ及び２００ｎＭ ＣＤ１６Ａ（Ｆ１５８）を注入した（図４６Ｃ、実線）。対照実験では（図４６Ｃ、破線）、抗原の代わりにバッファーを用いた。その結果、ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及びＨＳＡに同時に結合できることが示された。
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴ及びそのＡＢＤ融合誘導体は、可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）及び可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に同等な結合を示すことが見出され、このＤＡＲＴは、ＤＡＲＴ ＡＢＤ融合体がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する能力によって容易に識別することができた（図４６Ｄ〜４６Ｉ）。ＤＡＲＴをＣＤ１６Ａコーティングプレート上でインキュベートし、３ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡの存在下又は非存在下でビオチン化ｓＣＤ３２Ｂを用いて結合を検出した（ブロッキングは０．５％ペプトンを含むＰＢＳ−Ｔで行った）。ＤＡＲＴ ＡＢＤ融合体は親ＤＡＲＴの二特異的結合を保持しており、ヒト血清アルブミンの存在に影響を受けないｓＣＤ１６Ａ及びＣＤ３２Ｂへの結合を示すことが見出された（図４６Ｊ）。
ＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビトロにおける細胞傷害性
１つがエフェクター細胞上、１つが標的細胞上にある２つの抗原へのこの二特異性ＡＢＤ−ＤＡＲＴの同時結合を実証するために、再標的化細胞殺作用アッセイを行った。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いて、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴで、ＣＤ３２Ｂ陽性Ｂ細胞系Ｄａｕｄｉに対して強力且つ用量依存的な細胞傷害性を誘導した（図４７Ａ）。その結果、ＡＢＤ−ＤＡＲＴの効力が親ＤＡＲＴと同等であることが示された。ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴは、ＣＤ１６Ｂ発現エフェクター細胞に結合することができ、これにより、そのような細胞を動員してＣＤ３２Ｂを発現する細胞を（再標的化された殺作用により）殺すことができる。このようにして、ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ ＤＡＲＴはＲａｊｉ細胞に対して強力な殺を示すことが見出された（図４７Ｂ）。
ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに単回ｉ．ｖ．注射した後の血清試料のＥＬＩＳＡにより、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性を分析した（図４８）。ＤＡＲＴ及びＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質は両方とも循環中からの２相的除去を示した。ＡＢＤ−ＤＡＲＴのＰＫ研究により循環時間の延長が示され、終末半減期は通常のＤＡＲＴの１．２時間と比べて３５．１時間に延長されていた（図４８、表１７）。薬物動態特性の改善は曲線下面積（ＡＵＣ）の比較でも示された。コンストラクトＡＢＤ−ＤＡＲＴでは、ＡＢＤとの融合後にＡＵＣがほぼ３０倍に増大した（表１７）。
ＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビボにおける生物学的活性：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴがインビボで生物学的活性を保持していることを実証するために、ＡＢＤ−ＤＡＲＴ又はその親ＤＡＲＴをＴｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスに単回投与し、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＰＭ細胞の濃度をモニタリングした。結果は、ＤＡＲＴがＢ細胞の濃度を抑制できることを示しており（図４９Ａ）、これはＤＡＲＴがマウス循環中から除去されるまでインビボでＢ細胞へと再標的化された標的化殺作用が達成されたことを示していると解釈される。Ｔ細胞（図４９Ｂ）及びＰＭ細胞（図４９Ｃ）の濃度はＤＡＲＴにより抑制されず、ＤＡＲＴの特異性が確認された。
総合すると、アルブミン結合ドメイン融合ＤＡＲＴタンパク質（ＡＢＤ−ＤＡＲＴと呼ぶ）のデザイン及び生産に成功した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、その２つの認識される抗原決定基ＣＤ１６及びＣＤ３２Ｂへの特異性を保持していた。ＡＢＤ−ＤＡＲＴはヒト血清アルブミンと高い親和性を示すことが見出された。ＡＢＤの融合は生物学的活性（すなわち、再標的化された腫瘍細胞殺作用におけるＤＡＲＴの効力）を低減しなかった。ＤＡＲＴ分子とＡＢＤの融合は、インビボ半減期をかなり改善（延長）し、サイズを劇的に大きくすることなくこの目的を達成した。小さいサイズを維持できることは、ＤＡＲＴの腫瘍組織中に拡散する能力を促進するので、重要且つ有利である。
６．１９ Ｈｅｒ２／Ｂ細胞受容体ＤＡＲＴ
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及びＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合できる可変領域を含むＩｇＤＡＲＴダイアボディを構築した。
前述の通り、ＴＣＲはＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Ｔ細胞によって自然に発現されており、抗原提示細胞であるＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩタンパク質が結合及び提示している抗原性ペプチドをそのような細胞が認識することを可能にしている。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド−ＭＨＣ）複合体の認識は、細胞性免疫応答の伝播を開始させ、サイトカインの生成及び抗原提示細胞の溶解を引き起こす。ＥｒｂＢファミリーの重要な一員であるＨＥＲ２／ｎｅｕは、複数のヒト細胞癌及び哺乳動物の発達におけるその役割から、広く研究されてきた（Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184；Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123；及びLee et al. (1995) Nature 378:394-398）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子及びＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質はSemba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501及びYamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234に記載されており、配列はアクセッション番号Ｘ０３３６３としてＧｅｎＢａｎｋで入手可能である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは４つのドメイン、すなわちリガンドが結合する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化され得る複数のチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む（Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞外（ＥＣＤ）ドメインの配列はFranklin et al. (2004) Cancer Cell. 5(4):317-328に記載されており、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ Ｒｅｃｏｒｄ １Ｓ７８（２００４）で入手可能である。
ＨＥＲ２／ｎｅｕは成長因子受容体として機能し、しばしば、乳癌、結腸癌、膀胱細胞癌、卵巣癌、肺癌等の腫瘍によって発現される。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、ヒト乳癌及び卵巣癌の２５〜３０％で過剰発現し、これらの患者における侵襲的な臨床進行及び予後不良に関連する（Slamon et al. (1987) Science 235:177-182；Slamon et al. (1989) Science 244:707-712）。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、及び膀胱細胞癌を含むその他の細胞癌でも観察されている（例えば、King et al. (1985) Science 229:974；McCann et al. (1990) Cancer 65:88-92；Yonemura et al. (1991) Cancer Research 51:1034参照）。
ＨＥＲ−１又はＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とする複数のモノクローナル抗体及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤が開発されており、それには具体的には、タンパク質の膜貫通領域の非常に近くにあるＨＥＲ２／ｎｅｕのシステインリッチＩＩドメイン中の細胞外エピトープ（アミノ酸５２９〜６２７）を認識する４Ｄ５（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ジェネンティック社（Genentech,Inc.）製）として知られるマウスモノクローナル抗体のヒト化変異体が含まれる。研究により、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌細胞において、化学療法剤（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソール）と組み合せたＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的な抗体による処置が化学療法単独の処置よりも強い細胞傷害反応を誘導することが示されている（Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cancer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が化学療法剤への反応を強め得る機構の可能性の１つは、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質発現の調節又はＤＮＡ修復への干渉を介するものである（Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cancer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cancer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s）。特定の場合にはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）等の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が患者に治療的効果をもたらすが、乳癌及び他の患者の大部分はそのような抗体に対して抵抗性の反応を示す。これらの反応には、患者の癌細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現の程度の差が一部反映されている。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及びＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合できる可変領域を含めることで、ＤＡＲＴは、ＨＥＲ２発現細胞に結合することによりそのような細胞にＴ細胞受容体に結合できるドメインを結合させる能力を有するようになる。そのようなＴ細胞がこのドメインに結合する時、それらは活性化してＨＥＲ２発現細胞の殺作用を引き起こす免疫反応を開始させる。
そのようなＤＡＲＴのアミノ酸及び核酸配列を以下に示す。ＶＬ及びＶＨ配列をプレーンテキストで示し、ＶＬ−ＶＨリンカーを下線を引いたテキストで示し、Ｃ末端ヘテロ二量体化モチーフ（配列番号３１３：ＧＦＮＲＧＥＣ又は配列番号３１４：ＧＶＥＰＫＳＣ）をコードする配列を太字及びイタリックで示す。
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨアミノ酸配列（配列番号３１５）
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨをコードする核酸配列（配列番号３１６）
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨアミノ酸配列（配列番号３１７）
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨをコードする核酸配列（配列番号３１８）
好ましい実施形態では、このようなコンストラクトは、ヘテロ二量体（すなわち、ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ×ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ二量体）の形成を容易化するＥコイル又はＫコイルドメインを含むように改変されている。そのようなＤＡＲＴのアミノ酸及び核酸配列を以下に示す。ＶＬ及びＶＨ配列をプレーンテキストで示し、ＶＬ−ＶＨリンカーを下線を引いたテキストで示し、二量体化のためのＣｙｓ含有リンカーをコードする配列（ＧＧＣＧＧＧ；配列番号２６７の残基２〜７）をイタリックで示す。Ｅコイル又はＫコイルヘテロ二量体化ドメインを二重下線で示す（好ましい「Ｅコイル」配列はＥＶＡＡＬＥＫの４回リピート（配列番号２９９）であり、好ましい「Ｋコイル」配列はＫＶＡＡＬＫＥの４回リピート（配列番号３００）である）。Ｅコイル又はＫコイルに続く配列には何の機能も与えられていない。

ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルアミノ酸配列（配列番号３１９）
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルをコードする核酸配列（配列番号３２０）
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルアミノ酸配列（配列番号３２１）
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルをコードする核酸配列（配列番号３２２）
Ｈｅｒ２及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するドメインを有するＤＡＲＴ分子を、低レベルのＨＥＲ２発現を示すものとして以前に特徴付けられている（したがって、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による処置に抵抗性である）複数の乳癌、結腸癌、及び膀胱癌細胞系における細胞傷害性を媒介する能力について調べた。試験した乳癌細胞系はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２ ２＋）（図５０Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２ １＋）（図５０Ｂ）、及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図５０Ｃ）である。試験した非乳癌細胞系はＨＴ−２９（結腸癌細胞系）（図５０Ｄ）及びＳＷ７８０（膀胱癌細胞系）（図５０Ｅ）である。図５０Ａ〜Ｅに示されるように、このようなＤＡＲＴ分子は、腫瘍由来細胞系の細胞傷害性の媒介において、同等の細胞傷害性を達成するのに必要な濃度の点及び観察される細胞傷害性の最高レベルの点の両方で、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）よりもかなり効果的であった。
６．２０ Ｅコイル及びＫコイルを介したＤＡＲＴとＡＢＤのインビトロ融合
前述の通り、本発明のＤＡＲＴ分子は、ハプテンであるフルオレセインに対する親和性と同様にＮＫＧ２Ｄ受容体に二特異性結合を示すようにデザインして、ＮＫＧ２Ｄ受容体をフルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とコライゲートさせることができる万能アダプターとして機能するようにすることができる。ＡＢＤの使用を更に示すために、以下のポリペプチド鎖を用いてＤＡＲＴを構築した：
（１）ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイル：このポリペプチドは前述のＫＹＫ２．０抗体のＶＬドメイン（Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１号）及び前述の抗フルオレセインＭＡｂ４４２０のＶＨドメインを用いて構築した。
（２）４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）：このポリペプチドは、前述の抗フルオレセインＭＡｂ４４２０のＶＬドメイン及びＫＹＫ２．０抗体のＶＨドメインを用いて構築した。「Ｅコイル」は、ＥＶＡＡＬＥＫの４回リピートのＥコイルアミノ酸配列（配列番号２９９）を表す。
ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイル及び４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして「ＫＹＫ２ ４４２０ ＶＦ Ｅコイル」と命名したＤＡＲＴを発現させた。これらの分子の精製を図５１Ａ及び５１Ｂに示す。捕捉したＦＩＴＣ抗原へのＤＡＲＴの結合をＮＫＧ２Ｄ Ｆｃ ０１２２１０で検出することによりＫＹＫ２ ４４２０ ＶＦ ＥコイルＤＡＲＴの親和性を決定した。実験結果は、ＤＡＲＴが両方の分子に結合できることを示している（図５２）。
更に、Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ（配列番号３０１）−ＡＢＤ融合体を作製した。ここで、「Ｋコイル」はＫＶＡＡＬＫＥの４回リピートのＫコイルアミノ酸配列（配列番号３００）を表す。図５３は、プラスミドｐＰＡＬ７の制限マップを示しており、また、精製を容易にするＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）（バイオ・ラッド社製、ヘラクレス、カリフォルニア州）タグを用いたＫコイル−ＡＢＤ融合体を発現するプラスミドｐＰＡＬ７ Ｋコイル ＡＢＤの構築を示している。ｐＰＡＬ７ ＫコイルＡＢＤベクターを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３細胞に形質転換した。２ｍＭ ＩＰＴＧを添加して４時間にわたりタグ化ＫコイルＡＢＤの発現を誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はウェスタンブロットのいずれかでタンパク質の発現を検証した。簡潔に述べると、ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）融合タグシステムでは、細胞溶解を仲介し、放出されたタンパク質をスブチリシンプロテアーゼが固定化されたアフィニティーカラムに結合させ、カラムを洗浄して非結合タンパク質を溶出させ、フッ化物含有溶出バッファーをアプライしてスブチリシンの作用を開始させて迅速かつ正確に切断認識配列の後ろで融合タンパク質からタグを切断し、そのような切断後にタグを有さないタンパク質をカラムから洗浄し、溶出したタンパク質をＰＢＳ中に透析する。図５４は、ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂により精製されたＫコイルＡＢＤタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である（１０ｍｌ培養からの小スケール）。
ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂から得られたＫコイル−ＡＭＤタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで更に精製した（図５５）。２５０ｍｌの大腸菌培養液から６．５２３ｍｇの精製タンパク質が得られた（表１８）。
ＫＹＫ２ ４４２０ ＶＦ ＥコイルＤＡＲＴ及びＫコイルＡＢＤタンパク質を室温で３０分間ＰＢＳ中でインキュベートして、特性の向上したＥコイル−ＫコイルＡＢＤ ＤＡＲＴを形成させた。ＥＬＩＳＡの結果は、複合体の全てのドメインがそれらのそれぞれのリガンドに結合できることを示している（図５６Ａ〜５６Ｃ）。所望であれば、抗ＥＫカラムを用いてＫＹＫ２ ４４２０ ＶＦ Ｅコイル及びＫ−ＡＢＤ複合体を更に精製することができる。
複合体の形成は、ＤＡＲＴの特定の結合ドメインに依存していないので、上記方法を用いて、（例えば、ＣＤ３２Ｂ（例えば、抗体２Ｂ６）／ＣＤ１６Ａ（例えば、抗体３Ｇ８）ＶＦ Ｅ ＤＡＲＴをＫコイルＡＢＤと複合体形成させることにより）他の結合特異性を有するＥコイル−Ｋコイル ＡＢＤ ＤＡＲＴを作製することができる。
したがって、上記で示したように、本発明の一実施形態では、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの両方が、ヘテロ二量体を形成させる付加的配列（例えば、Ｋコイル又はＥコイル）を含み得、場合により、そのようなポリペプチドの１つが、血清タンパク質に結合できる血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含み得る（例えば、図４５）。別の実施形態では、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの１つ、好ましくは１つだけが、ヘテロ二量体を形成させるそのような付加的配列（例えば、Ｋコイル又はＥコイルのいずれか）を含んでもよく、ＤＡＲＴは、抗原結合部位を含まないがヘテロ二量体形成を促進するための相補的配列を有するポリペプチドを含む更なる（例えば、第３の）ポリペプチド（例えば、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがＥコイルを含む場合のＫコイル；又はＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがＫコイルを含む場合のＥコイル）との複合体と、場合により、血清タンパク質に結合できる血清結合タンパク質のポリペプチド部分とを含んでもよい。そのような更なる（例えば、第３の）ポリペプチドのそのような血清結合タンパク質ポリペプチド部分は、そのような相補的配列を有するポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側のいずれにも位置し得る。
６．２１ アルブミン結合ドメインの脱免疫化
前述の通り、本発明のＤＡＲＴ分子は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、例えばストレプトコッカスプロテインＧのＡＢＤ、より好ましくはストレプトコッカスＧ１４８株のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）を含むようにデザインすることができる。
ＡＢＤの免疫原性を低下させるために、ＡＢＤ３のアミノ酸配列の残基６０〜７９にアミノ酸の改変を導入し（配列番号３０４）：
ＨＳＡ結合へのそのような変化の影響を測定した（表１９）。
ＡＢＤを更に改善するために、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減弱又は削除することが望ましかった。Ｙ６０及びＹ６１からのペプチドはＮ６６に共通のポケット残基を有し（Ｐ６／Ｐ７）、また、Ｌ６４及びＩ６５もＴ７０でＰ６／Ｐ７ポケット残基を有する。そこで、Ｎ６６からＤ又はＥへの変異とＴ７０Ｄの組合せはＭＨＣクラスＩＩ結合を効率的に除くことができるという仮説を立てた。あるいは、４個のｐ１アンカーＹ６０、Ｙ６１、Ｌ６４、及びＩ６５を標的とすることでＭＨＣクラスＩＩ結合を除くことができるという仮説を立てた。そこで、２ラウンドの変異分析プロセスを行った。表２０に第１ラウンドの変異分析の結果を示す。
結果は、ｐ１アンカーＶ７１のＡへの変異が最も効果的な選択肢であることを示しており、（１＋３）の組合せ又は（２＋３）の組合せを示唆している。Ｔ７０Ｄ及びＹ６０Ｇを除く試験した全ての組合せが効果を有した。
第２ラウンドの変異分析の結果を表２１及び２２に示す。
表２３に、２ラウンドの変異分析から得られた結果の要約を示す。
組合せ変異の結果に基づき、以下の置換の組合せが、脱免疫化アルブミン結合ドメインの形成に好ましい置換であると考えられる：６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。アスタリスク（「＊」）は７１位→Ｐ１及び７９位→Ｐ９を表す。
図５７に示されるように、改変Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ、及びＤ７９Ａ又は改変Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ、及びＤ７９Ａを有する変異体ＡＢＤ
は実質的に野生型と同じ結合を示した。
ＡＢＤ変異体６１Ａ／６５Ａ、６１Ａ／６６Ｄ、６４Ａ／６５Ａ＊、及び６４Ａ／６６Ｄを野生型と共にアルブミンへの結合能力について評価した。そのアッセイの結果を図５８に示す。ＡＢＤ変異体６４Ｇ／６６Ｄ、６５Ａ／６６Ｄ、６６Ｓ／７０Ｓ＊、及び６１Ａ／６６Ｓ／７０Ｓを野生型と共にアルブミンへの結合能力について評価した。そのアッセイの結果を図５９に示す。図６０は、ＡＢＤ変異体Ｙ６０Ａ／Ｙ６１Ａ、Ｙ６０Ｔ／Ｙ６１Ａ、Ｉ６５Ａ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６１Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ａ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、及び野生型（配列番号３０４）のアルブミン結合アッセイの結果を示している。図６１は、ＡＢＤ変異体Ｙ６０Ａ／Ｙ６１Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６０Ｔ／Ｙ６１Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、及び野生型のアルブミン結合活性の結果を示している。図６２は、ＡＢＤ変異体Ｌ６４Ｇ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ、Ｌ６４Ｇ／Ｎ６６Ｄ／Ｖ７１Ａ、Ｙ６１Ａ／Ｔ７０Ｓ、Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ、Ｙ６１Ａ／Ｎ６６Ｓ、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ、及び野生型のアルブミン結合活性の結果を示している。
６．２２ アルブミン結合ドメインの脱免疫化の証拠
特にＶ７１位における変異体（例えば、Ｖ７１Ａ）を含むＡＢＤ変異体が免疫原性の低下を示す。そのような脱免疫化を実証するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）タイムコースＴ細胞アッセイを用いて３つのペプチド試料の潜在的免疫原性を評価した。以下の試料を評価した：
・野生型ＡＢＤペプチド（配列番号３０４）：
の２１マー断片（Ｙ６０−Ｅ８０））であるＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０ｗｔ（「試料１」）（配列番号３２５）：
・ＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ（「試料２」）（配列番号３２６）：
・ＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ（「試料３」）（配列番号３２７）：
健康なコミュニティーのドナーのバフィーコート（２４時間以内に採った血液に由来）から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（アクシス・シールド社（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ）製、ダンディー、英国）密度遠心を用いてバフィーコートからＰＢＭＣを単離し、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ステムセルテクノロジーズ社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）製、ロンドン、英国）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲベースの組織適合試験キット（バイオテスト社（Ｂｉｏｔｅｓｔ）製、ソリハル、英国）を用いてＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを特定することによりドナーを特徴付けた。対照抗原（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ）社製、クラムリングトン（Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ）、英国）並びにインフルエンザＡ及びエプスタイン・バーウイルスに由来するペプチドに対するＴ細胞反応を測定した。その後、必要時までＰＢＭＣを液体窒素中で凍結保存した。５０ドナーのコホートを用い、これらのアロタイプは、世界中のアロタイプの８０％超を網羅しており、全ての主要なＨＬＡ−ＤＲアロタイプ（世界の人口中、５％を超える頻度で発現されている個々のアロタイプ）をよく代表している。
各ドナーのＰＢＭＣを解凍し、計数し、生存率を評価した。細胞を室温のＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地中で生き返らせ、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中に４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌで再懸濁した。各ドナーについて、２４ウェルプレートの適切なウェルに１ｍｌの増殖細胞ストックを加えたバルク培養を確立した。培養培地（０．５ｍｌ）及び被験ペプチド（０．５ｍｌ）をＰＢＭＣに加えて終濃度を５μＭにした。各ドナーについて、再現性対照（１００μｇ／ｍｌ ＫＬＨとインキュベートした細胞）及び「培養培地単独」のウェルも含めた。培養液を３７℃、５％ＣＯ２で合計８日間インキュベートした。５、６、７、及び８日目に、各ウェルの細胞を穏やかに再懸濁し、３×１００μｌを丸底９６ウェルプレートの各ウェルに移した。培養液を、１００μｌのＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地中で０．７５μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（パーキンエルマー（登録商標）社製、ビーコンズフィールド、英国）でパルスし、更に１８時間インキュベートした後、ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩ（商標）細胞ハーベスターを用いてフィルターマット（パーキンエルマー社製）上に回収した。１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマー（登録商標）社製）上、低バックグラウンドのｐａｒａｌｕｘ測定モードで、Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（パーキンエルマー（登録商標）社製）シンチレーション測定により各ウェルのカウント毎分（ｃｐｍ）を測定した。
そのような処置の細胞生存率への影響を評価するために、７日目に、バルク培養を穏やかに再懸濁し、全てのドナーから各試料を２０μｌ取り、２０μｌのトリパンブルーと混合した。次いで、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（インビトロジェン社製）を用いて、トリパンブルー色素の排除を利用してこれらの試料の生存率について評価することができる。生存率は、好ましくは、トリパンブルー排除細胞数／全細胞数の百分率として表される。試料１（ｗｔ）、及び試料２又は試料３以外の種々の被験ペプチドで行った実験では、培養細胞は、試験した全てのドナーで生存率が平均して８７％を超えることが判明した。培地のみとインキュベートした細胞の平均生存率は９０％と算出され、一方、被験ペプチドとインキュベートした細胞の平均生存率はそれぞれ８８、８８、及び８７％であった。ＫＬＨ処置細胞の生存率は８３％であり、これはペプチド処置細胞の生存率と有意な差がない。したがって、細胞（ＰＢＭＣ）とペプチドのインキュベーションは細胞培養期間中に明白な毒性を何ら生じないと結論付けられる。
増殖アッセイで用いたのと同一のドナーをＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）アッセイに用いた。上記のように、細胞を解凍し、生き返らせた。ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ミリポア社製、ウォットフォード、英国）を予め湿らせ、１００μｌ／ウェルのＩＬ−２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、アビンドン、英国）を含むＰＢＳで一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ社製）を含むＰＢＳ）中で一晩インキュベートし、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地で洗浄した。各ドナーの細胞密度は、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培養培地中４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌに調整し、１００μｌの細胞を各ウェルに加えた。５０μｌの被験ペプチド及び対照を適切なウェルに加えた。
ペプチド（ＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０（「試料１」）、ＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ（「試料２」）（配列番号３２６）、又はＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ（「試料３」）（配列番号３２７））をＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣのバルク培養に加えた。試料とインキュベートした後、種々の時点で［３Ｈ］−チミジンを取り込ませることによりＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を測定し、更に並行してＥＬＩＳｐｏｔ（商標）を用いてＩＬ−２分泌を測定した（ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）アッセイは、分泌型サイトカインに結合する捕捉抗体をプレコーティングされたメンブレンを含む）。ペプチドを使用直前にＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地（インビトロジェン社製、ペイズリー、英国）で希釈し、最終アッセイ濃度は５μＭとした。ＫＬＨを再現性対照として用い、１０ｍｇ／ｍｌストック水溶液として−２０℃で保存した。実験では、ＫＬＨを解凍した直後にＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中に４００μｇ／ｍｌで希釈した（終濃度１００μｇ／ｍｌ）。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、シグマ社製、プール、英国）を陽性対照としてＥＬＩＳｐｏｔ（商標）中で用い、１ｍｇ／ｍｌストックを−２０℃で保存した後、細胞体溶液中に終濃度２．５μｇ／ｍｌで希釈した。
被験ペプチドを６連培養で試験し、各ドナーについて、陰性対照（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地のみ）、無細胞対照、及びマイトジェン陽性対照（ＰＨＡ、２．５μｇ／ｍｌ；ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）機能及び細胞生存率の内部試験として使用；シグマ社製）も各プレートに含めた。８日間インキュベートした後、ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）プレートを、ｄＨ２Ｏ及びＰＢＳ（×３）で順番に洗浄した後、１００μｌのろ過済みビオチン化検出抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡを加えることにより発色させた。３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートを更にＰＢＳ（×３）で洗浄し、１００μｌのろ過したストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡを室温で１．５時間加えた。ストレプトアビジン−ＡＰを捨て、プレートをＰＢＳ（×４）で洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）（１００μｌ）を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ウェル及びウェルの裏をｄＨ２Ｏで３回洗浄することによりスポットの発色を停止した。乾燥させたプレートをＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（登録商標） Ａｎａｌｙｓｅｒでスキャンし、Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ ４ ソフトウェアを用いてウェル当たりのスポット数（ｓｐｗ）を決定した。
増殖及びＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）アッセイでは、刺激指数（ＳＩ）の実験的閾値の２倍以上の反応を誘導した試料（ＳＩ≧２．００）を陽性と見なした。増殖（ｎ＝３）及びＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔデータ（ｎ＝６）のセットの両方で、統計的及び実験的閾値、すなわち、二標本独立スチューデントｔ検定を用いた試験ウェルのｃｐｍ又はｓｐｗを培地対照ウェルと比較することによる反応の有意性（ｐ＜０．０５）及び２以上の刺激指数（ＳＩ≧２．００）（ここで、ＳＩ＝試験ウェルの平均値（ｃｐｍ又はｓｐｗ）／ベースライン（ｃｍｐ又はｓｐｗ））により陽性反応を定義した。この方法で表されたデータはＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５として示される。更に、複製培養から得た生データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより、アッセイ内のばらつきを評価した。
野生型ペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）タイムコースＴ細胞増殖アッセイにおいて陽性の増殖反応を誘導することが見出され、境界域の反応（ＳＩ≧１．９０（ｐ＜０．０５））１つを含む７ドナーにおいてＳＩ≧２．００（ｐ＜０．０５）であり、１４％の陽性反応頻度であった。ｗｔペプチドでの陽性（ＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５）Ｔ細胞増殖反応の平均的大きさ（ＳＩ）はＳＩ２．５５であり、２つの脱免疫化ペプチドよりわずかに大きかった（表２４）。表２４に、被験ペプチド及びＫＬＨに対する陽性Ｔ細胞増殖反応の大きさ（±ＳＤ）の要約を示す。平均ＳＩは、全タイムコース（５〜８日目）中に観察された全陽性ドナー反応の平均から計算した。データは境界域の増殖反応（ＳＩ≧１．９０、ｐ＜０．０５）を含む。
したがって、増殖アッセイから、研究コホート中のＴ細胞反応の大きさ（ＳＩ）及び反応ドナーの頻度（％）は、ｗｔペプチドの全体的な免疫原性ポテンシャルが中程度であり、脱免疫化ペプチドの免疫原性ポテンシャルは低いと考えられることを示している。これらのデータは、Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａの変異によるｗｔ特異的Ｔ細胞エピトープの除去の成功を裏付けている。
増殖反応の全体的タイミングは、Ｔ細胞反応の潜在的種類（ナイーブ又は記憶）に関する指標となり得る。最大のＴ細胞増殖が５日目に検出されれば、存在するＴ細胞前駆体の頻度が高いことを示しており、一方、最大増殖が８日目であれば、存在するＴ細胞前駆体頻度が低いことを示している。高い免疫原性ポテンシャルは、タイムコースの初期におけるＴ細胞の刺激と一致するであろう。被験ペプチドＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ（「試料２」）（配列番号３２６）は、５、６、７、及び８日目にそれぞれ１、０、１、及び１の反応を生じさせた。被験ペプチドＡＢＤ Ｙ６０−Ｅ８０変異体Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ（「試料３」）（配列番号３２７）は、５、６、７、及び８日目にそれぞれ０、１、２、及び１の反応を生じさせた。Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａで観察された反応ドナーの数が少ないため、Ｔ細胞増殖反応のこの種のキネティクス分析の解釈は困難であるが、これらの試料で観察された数少ない反応は、タイムコースの後半に起こっており、健康個体がこれらの配列でのＴ細胞エピトープによる初回刺激を受けていないことを裏付けている。
増殖アッセイ同様、被験ｓｐｗとバックグラウンド（非処置培地対照）の間で有意（ｐ＜０．０５）な差が観察された、ＳＩ≧２．００を示したドナーにおいて陽性反応を記録した。ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＮ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａペプチドはドナーの６％で陽性反応を誘導し、Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａペプチドは４％の陽性反応を誘導した。これは、ドナーコホートの２０％で陽性ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ反応が検出されたｗｔ配列で見られた結果と対照的である。両方の脱免疫化ペプチドの陽性Ｔ細胞反応の平均的大きさはそれぞれ２．０２及び２．４３（表２５）と低く、これはｗｔペプチドで見られた大きさと同様であった。表２５に、被験ペプチド及びＫＬＨに対する陽性Ｔ細胞ＩＬ−２分泌反応（ＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５）の大きさ（±ＳＤ）の要約を示す。観察した全陽性ドナー反応の平均から平均ＳＩを算出した。データは境界域の増殖反応（ＳＩ≧１．９０、ｐ＞０．０５）を含む。
２つの被験ペプチドでは、増殖アッセイとＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）アッセイのデータ間の全体的相関が高く、増殖アッセイで陽性の反応を示したドナーの１００％及び６７％がＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでも反応した。２つのアッセイ間のこの高い相関は再現性対照ＫＬＨでも観察され、増殖アッセイに反応したドナーの９８％がＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）アッセイでも反応を示した（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）タイムコースＴ細胞アッセイの典型的な範囲は８５〜１００％）。したがって、増殖アッセイ及びＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ（商標）アッセイの両方において、Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａペプチドに対するＴ細胞反応の頻度及び大きさから、これらの両方が、ｗｔペプチドの高リスクな臨床的免疫原性と比べて臨床的免疫原性のポテンシャルが低いと見なすことができることが示唆される。
増殖及びＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのデータは、複数のドナーで被験ペプチドに対して陽性Ｔ細胞反応が検出されたことを示している。増殖アッセイとＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイとの間の全体的相関はＫＬＨで９８％、ｗｔペプチドで７０％、Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７４Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７４Ａでそれぞれで１００％及び６７％あった。したがって、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ及び増殖アッセイの両方において各試料に陽性反応を開始させたものを反応性ドナーと定義した。全ドナーがＰＨＡに対して陽性のＴ細胞反応を生じ、このことは、ｅｘ ｖｉｖｏ培養中の細胞が機能的であったことを示している。これら２つのアッセイの合わせたデータセットの分析から、増殖及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイの両方における反応の全体的頻度及び大きさが２つの脱免疫化ペプチドで低いことが示され、ドナーの４％がＮ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ両方に対して反応した。これはｗｔペプチドで得られた研究結果（有意に多数の陽性反応を示した（ドナーの１４％がＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ及び増殖アッセイの両方で反応した））と対照的である。ＨＬＡ分析は、２つの被験ペプチドに対する反応がその種の分析の最低閾値より低かったので行わなかった。
総合すると、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）タイムコースＴ細胞アッセイを用いて、２つの被験ペプチドの臨床的免疫原性のポテンシャルを決定した。増殖及びＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔにより測定したペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導する能力を、ＨＬＡ検査した５０ドナーのパネルに対して試験した。ｗｔペプチドの研究から得られたデータは、増殖及びＩＬ−２反応を合わせた頻度が研究コホートの１４％であったことから、ｗｔペプチドの免疫原性の全体的な潜在リスクが中程度であることを示した。しかし、本研究における２つの脱免疫化ペプチドに対する増殖及びＩＬ−２反応を合わせた頻度は低く、ドナーの４％がＮ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａに対して反応し、ドナーの６％がＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａに対して反応した。
市販されている複数の生物製剤のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）タイムコースＴ細胞アッセイで、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおけるドナーＴ細胞反応の百分率と臨床において観察される免疫原性のレベル（抗タンパク質治療抗体反応）との間に明確な相関が示されている。キャンパス等の免疫原性抗体のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイでは高頻度のドナー反応が観察され、一方、ゾレア、ハーセプチン等の非免疫原性抗体では比較的低い頻度のドナー反応が観察されている。一般的に、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイで１０％を超える陽性反応を誘導するタンパク質治療薬は、臨床における重大な免疫原性リスクを伴う。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイで試験されたタンパク質治療薬と比較して、データは、脱免疫化ペプチドＮ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ及びＬ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａにより生じたＣＤ４＋Ｔ細胞反応がゾレア、ハーセプチン、及びアバスチンと同じ範囲に含まれ、免疫原性の潜在的リスクが低いと考えられることを示している。したがって、脱免疫化ペプチドはＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）免疫原性アッセイにおいて好ましい免疫原性プロファイルを示すと結論付けることができる。
６．２３ ＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビボ薬物動態特性の改善
前述の通り、ＤＡＲＴのインビボ薬物動態特性を改善するために、ストレプトコッカスプロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）をＤＡＲＴのＣ末端（抗原結合部位から離れている）に融合した（「ＡＢＤ−ＤＡＲＴ」）。そのようなＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態学的研究により循環時間の延長が示され、終末半減期が通常のＤＡＲＴ（ＡＢＤを欠く）の１．２時間と比べて３５．１時間に延長されていた。イン・シリコ分析により、ＡＢＤ配列中にＭＨＣクラスＩＩ結合ポテンシャルの高い５個のｐ１アンカー部位があることが明らかとなった。脱免疫化型のＡＢＤを作製するために、イン・シリコ分析により得られた予測に基づいて部位特異的変異を行った。複数ラウンドの単一及び組合せ変異の後、血清アルブミンとの親和性が野生型ＡＢＤと同様であるかそれより低い２つのＡＢＤ変異体、「ＡＢＤ（ＡＡＡ）」及び「ＡＢＤ（ＤＳＡ）」が得られた。

Ｌ６４Ａ／Ｉ６５Ａ／Ｖ７１Ａ（「ＡＢＤ（ＡＡＡ）」）（配列番号３２８）：

Ｎ６６Ｄ／Ｔ７０Ｓ／Ｖ７１Ａ（「ＡＢＤ（ＤＳＡ）」）（配列番号３２９）：
これら２つの変異体はＭＨＣクラスＩＩペプチドとの結合スコアの減少が最大であった（表２６）。
これら２つのＡＢＤ変異体の血清半減期を観察するために、タンパク質を５ｍｇ／ｋｇで単回ＩＶ注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスでインビボ薬物動態（ＰＫ）研究を行った。ＰＫ研究により、変異体ＡＢＤ（ＤＳＡ）の循環時間が野生型ＡＢＤと同様に延長されていることが示された（図６３）。もう一方の変異体、ｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ（ＡＡＡ） ＤＡＲＴは、基本のｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ ＥＫ ＤＡＲＴより数時間長く血清中に留まった。したがって、この研究は、アルブミンとの親和性がより低いにも関わらず、脱免疫化型ＡＢＤ（すなわち、ＡＢＤ（ＤＳＡ））の融合がＤＡＲＴタンパク質の血清半減期を劇的に延長することを示している。このような延長された血清半減期のため、このより低い免疫原性のＡＢＤ−ＤＡＲＴは、特により少ない頻度及び／又はより少ない投薬で、有望な治療薬候補として用いるのに有利である。ｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ ＡＢＤ ＤＡＲＴのＰＫプロファイルを表２７に示す。
６．２４ 組換えＡＢＤ−ＤＡＲＴのインビボ半減期に対するＡＢＤの結合価増大の影響
両方の鎖の末端にＡＢＤを融合することにより（図６４Ａ）又は１つの鎖の末端にタンデムＡＢＤを融合することにより（図６４Ｂ）、異なるＡＢＤ ＤＡＲＴタンパク質を構築した。更に、両方の鎖のＣ末端にＡＢＤ（ＡＡＡ）を融合することにより１つのコンストラクトを作製した。この研究では、血清半減期を比較するためにｈＣＤ１６×ｈＣＤ３２Ｂ Ｆｃ ＤＡＲＴを作製した。全てのＡＢＤ変異体が抗原の両方に二特異的結合を示した（図６５）。これらＡＢＤ ＤＡＲＴ及びＦｃ ＤＡＲＴの全ての血清半減期を観察するために、タンパク質を５ｍｇ／ｋｇで単回ＩＶ注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてインビボＰＫ研究を行った。その結果、ＡＢＤの半減期延長特性がアルブミン結合価の影響を受けることが示された（図６６）。２つのＡＢＤと融合したＤＡＲＴの終末半減期は、予想されなかったことに、ＡＢＤが１個のＤＡＲＴの３倍であった（表２８）。
当業者にとって明らかなように、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変例及び変更例が作製可能である。本明細書中で説明した具体的実施形態は単なる例として記載するものであり、本発明は添付の特許請求の範囲及びその権利が付与される均等の範囲によってのみ限定されるべきである。そのような改変例は添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書中で引用した全ての参照文献、特許、及び非特許文献の全内容を、それぞれの個々の刊行物又は特許若しくは特許出願の全体を個々に具体的にあらゆる目的のために参照により援用すると示した場合と同じ程度に、あらゆる目的のために本明細書に援用する。

Claims (27)

  1. 血清アルブミンに結合できる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含むポリペプチドであって、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、配列番号３０４に示されるアミノ酸配列を有するストレプトコッカスのプロテインＧの野生型アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の変異体であり、前記変異体ＡＢＤが次のいずれかの変異を含むことにより配列番号３０４とは異なるアミノ酸配列を有しており、
    （Ａ）ＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、前記ＡＢＤの７１位における変異位置が、配列番号３０４の３１位である変異
    （Ｂ）ＡＢＤの６４位におけるロイシンからアラニンへの変異、ＡＢＤの６５位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのＡＢＤの６４位、６５位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４の２４位、２５位、及び３１位である変異、又は
    （Ｃ）ＡＢＤの６６位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ＡＢＤの７０位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのＡＢＤの６６位、７０位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４の２６位、３０位及び３１位である変異
    前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を有さない場合の前記ポリペプチドの血清半減期と比べて前記ポリペプチドの血清半減期を延長する、ポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、更なる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含み、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分がどちらも前記血清アルブミンに結合できる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、前記ＡＢＤの７１位における変異位置が、配列番号３０４における３１位である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの６４位におけるロイシンからアラニンへの変異、ＡＢＤの６５位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、これらのＡＢＤの６４位、６５位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４における２４位、２５位及び３１位である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  5. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの６６位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ＡＢＤの７０位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、これらのＡＢＤの６６位、７０位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４における２６位、３０位及び３１位である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  6. 前記変異体ＡＢＤが、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、又は配列番号３２９のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドが抗原結合分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記抗原結合分子が、互いに相互作用して２つの抗原結合部位を形成する少なくとも第１及び第２のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディであって、前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 前記ダイアボディの前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖の両方が、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 前記ダイアボディの前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖が互いに共有結合により連結されている、請求項８又は９に記載のポリペプチド。
  11. 前記ダイアボディが、
    （Ａ）ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；及び
    （Ｂ）腫瘍関連抗原
    に結合する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 前記抗原結合分子が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する、請求項７に記載のポリペプチド。
  13. 前記ダイアボディが、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する抗原結合部位を有する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 共有結合により連結されたポリペプチドの血清半減期を延長する、血清アルブミンに結合できる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分であるポリペプチドの使用であって、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、配列番号３０４に示されるアミノ酸配列を有するストレプトコッカスのプロテインＧの野生型アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の変異体であり、前記変異体ＡＢＤが次のいずれかの変異を含むことにより配列番号３０４とは異なるアミノ酸配列を有しており、
    （Ａ）ＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、前記ＡＢＤの７１位における変異位置が、配列番号３０４の３１位である変異
    （Ｂ）ＡＢＤの６４位におけるロイシンからアラニンへの変異、ＡＢＤの６５位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのＡＢＤの６４位、６５位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４の２４位、２５位、及び３１位である変異、又は
    （Ｃ）ＡＢＤの６６位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ＡＢＤの７０位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びＡＢＤの７１位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのＡＢＤの６６位、７０位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４の２６位、３０位及び３１位である変異
    前記血清半減期の延長が、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を有さない場合の前記共有結合により連結されたポリペプチドの血清半減期との比較によるものである、使用。
  15. 前記ポリペプチドが、更なる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含み、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分の両方が前記血清アルブミンに結合できる、請求項１４に記載のポリペプチドの使用。
  16. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの７１位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、前記ＡＢＤの７１位における変異位置が、配列番号３０４における３１位である、請求項１４又は１５に記載のポリペプチドの使用。
  17. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの６４位における前記ロイシンからアラニンへの変異、ＡＢＤの６５位における前記イソロイシンからアラニンへの変異、及びＡＢＤの７１位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、これらのＡＢＤの６４位、６５位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４における２４位、２５位及び３１位である、請求項１４又は１５に記載のポリペプチドの使用。
  18. 前記変異体ＡＢＤが、ＡＢＤの６６位における前記アスパラギンからアスパラギン酸への変異、ＡＢＤの７０位における前記スレオニンからセリンへの変異、及びＡＢＤの７１位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、これらのＡＢＤの６６位、７０位及び７１位における変異位置が、それぞれ配列番号３０４における２６位、３０位及び３１位である、請求項１４又は１５に記載のポリペプチドの使用。
  19. 前記変異体ＡＢＤが、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、又は配列番号３２９のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のポリペプチドの使用。
  20. 前記ポリペプチドが抗原結合分子を含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  21. 前記抗原結合分子が、互いに相互作用して２つの抗原結合部位を形成する少なくとも第１及び第２のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディであって、前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項２０に記載のポリペプチドの使用。
  22. 前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖の両方が、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項２１に記載のポリペプチドの使用。
  23. 前記ダイアボディの前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖が互いに共有結合により連結されている、請求項２１又は２２に記載のポリペプチドの使用。
  24. 前記ダイアボディが、
    （Ａ）ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；及び
    （Ｂ）腫瘍関連抗原
    に結合する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  25. 前記抗原結合分子が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する、請求項２０に記載のポリペプチドの使用。
  26. 前記ダイアボディが、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する抗原結合部位を有する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  27. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬剤的に許容できる担体とを含む組成物。
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