JP6145088B2 - 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許出願第61/488,725号(2011年5月21日付で提出;係属中)の利益を主張し、この出願の全体を参照により本明細書に援用する。
本願は、米国特許法施行規則1.821に従う1又は複数の配列表(以下参照)を含み、これは紙及びコンピューターで読取可能な媒体の両方で開示されており、この紙及びコンピューターで読取可能な開示の全体を参照により本明細書に援用する。
本発明は、血清タンパク質に結合できる脱免疫化された血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むポリペプチド(例えば、抗原結合分子)に関する。血清結合タンパク質が存在すると、脱免疫化血清結合タンパク質のポリペプチド部分を有さない場合のポリペプチドの血清半減期と比べて、ポリペプチドの血清半減期が延長される。本発明は更に、そのような分子を用いる方法及び使用に関する。
共有結合型ダイアボディのデザインは単鎖Fvコンストラクト(scFv)(Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448;その全体を参照により本明細書に援用する)に基づく。インタクトの非改変IgGでは、VL及びVHドメインは別個のポリペプチド鎖上、すなわちそれぞれ軽鎖及び重鎖上に位置する。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にVL及びVHドメインの相互作用により、抗体のエピトープ結合部位の1つが形成される。一方、scFvコンストラクトは、抗体のVL及びVHドメインを1つのポリペプチド鎖中に含み、2つのドメインが自己集合して機能的エピトープ結合部位を形成するのに十分な長さの可動性リンカーによりドメインが隔てられている。リンカーの長さが不十分(約12アミノ酸残基未満)であるために自己集合が不可能な場合、scFvコンストラクトの2つが互いに相互作用して、一方の鎖のVLが他方のVHに会合した2価分子を形成する(Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658に概括されている)。更に、コンストラクトのc末端にシステイン残基を加えると、ポリペプチド鎖のジスルフィド結合が可能になり、2価分子の結合特性に干渉することなく、得られる二量体が安定化されることが示されている(例えば、Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27参照)。更に、異なる特異性のVL及びVHドメインが選択された場合、2価であるだけでなく、二特異性の分子が構築され得る。
伝統的な免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用により、例えば抗体依存性細胞傷害、マスト細胞脱顆粒、及び食作用等のエフェクター機能からリンパ球増殖及び抗体分泌の制御等の免疫調節シグナルにわたる幅広い反応が生じる。これらの相互作用は全て、造血細胞上の分化した細胞表面受容体に抗体又は免疫複合体のFcドメインが結合することにより開始される。抗体及び免疫複合体により引き起こされる細胞反応の多様性はFc受容体の構造的異種性によるものである。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達を仲介すると考えられる構造的に関連する抗原結合ドメインを共有している。
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインC2セットに関連する細胞外ドメインである1回膜貫通ドメインと可変長の細胞質内ドメインとを有する内在性膜糖タンパク質である。FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16)と命名された3つのFcγRが知られている。3つの受容体は異なる遺伝子にコードされているが、3つのファミリーメンバー間の広い相同性から、共通の祖先からおそらくは遺伝子重複により生じたことが示唆される。
FcγRIIタンパク質は、単量体Igに対する親和性が低い(106M−1)ので、複合体化しているIgGにだけ結合する、40kDaの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は最も広く発現しているFcγRであり、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、マスト細胞、及び血小板を含む全ての造血細胞上に存在する。FcγRIIは免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域が2つしかないので、IgGへの親和性がFcγRIよりはるかに低い。3つのヒトFcγRII遺伝子(FcγRII−A、FcγRII−B、FcγRII−C)があり、これらは全て凝集体又は免疫複合体の状態のIgGに結合する。
このクラス内の異種性のため、マウス及びヒトにおいてFcγRIIIのサイズは40〜80kDaにわたる。2つのヒト遺伝子が2つの転写産物、すなわち内在性膜糖タンパク質であるFcγRIIIA及びグリコシルホスファチジル−イノシトール(GPI)結合型であるFcγRIIIBをコードしている。1つのマウス遺伝子が、膜貫通ヒトFcγRIIIAに相同なFcγRIIIをコードしている。FcγRIIIは他の2つのFcγRのそれぞれと共通する構造的特徴を有する。FcγRII同様、FcγRIIIはIgGに低親和性で結合し、対応する2つの細胞外Ig様ドメインを含む。FcγRIIIAは、マクロファージ、マスト細胞中で発現し、NK細胞中では孤立したFcγRである。GPI結合FcγRIIIBは現在、ヒト好中球中でのみ発現することが知られている。
活性化シグナル及び抑制シグナルは両方とも、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の違いによるものである。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(ITAM)又は免疫受容体チロシン系抑制モチーフ(ITIM)と呼ばれる2つの異なるドメインがこの異なる反応の原因となる。これらの構造体に異なる細胞質酵素が動員されることでFcγR媒介細胞応答の結果が決まる。ITAM含有FcγR複合体にはFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAが含まれるが、ITIM含有複合体に含まれるのはFcγRIIBだけである。
本発明は特に、共有結合型ダイアボディ及び/又は共有結合型ダイアボディ分子並びに癌、自己免疫障害、アレルギー障害、及び細菌、真菌、又はウイルスによる感染症を含む種々の疾患及び障害の処置におけるその使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは、2つの異なる細胞上の2つの異なるエピトープに結合することができ、第1のエピトープは、ダイアボディが2つの細胞を引き合わせる(bring together)ことができるように第2のエピトープとは異なる細胞型の上で発現されている。
(A)71位におけるバリンからアラニンへの変異、74位におけるバリンからアラニンへの変異、又は79位におけるアスパラギン酸からアラニンへの変異;
(B)64位におけるロイシンからアラニンへの変異、65位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及び71位におけるバリンからアラニンへの変異;又は
(C)66位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、70位におけるスレオニンからセリンへの置換、及び71位におけるバリンからアラニンへの変異
を含む、上記ポリペプチド又は使用の実施形態に関する。
(A)ナチュラルキラー群2D(NKG2D)受容体又はT細胞受容体(TCR);及び
(B)腫瘍関連抗原
に結合する、上記ダイアボディ又は使用の実施形態に関する。
特に断りのない限り、本明細書で使用される当該技術分野の全ての用語、表記法、及びその他の科学的用語又は用語法は本発明が関する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。一部、一般的に理解されている意味の用語を明瞭性のため及び/又は参照し易いように本明細書中で定義するが、明細書中におけるこのような定義の記載は、必ずしも当該技術分野で通常理解されている定義との実質的違いを示すものと解釈されるべきではない。本発明の実施においては、特に断りのない限り、当該技術分野の技術に含まれる分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は文献、例えばCurrent Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, 2001年までの補遺を含む);Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 2001年までの補遺を含む);Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994);The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994);Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996);Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999;及びBeauage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000)に十分に説明されている。
本発明のダイアボディは、一般的には免疫グロブリン又は抗体に由来する抗原結合領域を含む。本発明の方法で使用される結合ドメインが由来する抗体は、鳥類及び哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ)を含む、いかなる動物起源に由来していてもよい。抗体はヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから単離された抗体、又はヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。
特定の実施形態では、本発明のダイアボディの結合ドメインのうち少なくとも1つは、少なくとも1つのFcγRIIB活性を作動させる(agonize)。本発明の一実施形態では、前記活性は、B細胞受容体仲介性シグナル伝達の阻害である。別の実施形態では、結合ドメインは、B細胞の活性化、B細胞増殖、抗体産生、B細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、又はFcγRIIBシグナル伝達経路における1つもしくは複数の下流のシグナル伝達分子の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化又はSHIP動員を増強する。本発明の更なる実施形態では、結合ドメインは、B細胞受容体仲介性シグナル経路におけるMAPキナーゼ活性又はAkt動員を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBを介したFcεRIシグナル伝達の阻害を作動させる。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、FcεRI誘導性肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、又はセロトニン放出を阻害する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの動員を刺激し、SHIPリン酸化及びSHIPのShcとの会合を刺激し、あるいはMAPキナーゼファミリーメンバー(例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38等)の活性化を阻害する。さらに別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、並びにp62dokのSHIP及びrasGAPとの会合を増強する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、単球又はマクロファージにおけるFcγR仲介性貪食作用を阻害する。
以下の節では、共有結合性ダイアボディ作製のための、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の源として使用され得るCD16A結合タンパク質について考察する。本発明では、CD16A結合タンパク質には、抗CD16A抗体のVLドメイン及びVHドメインを含む分子が含まれ、VHドメイン及びVLドメインは本発明のダイアボディの作製において使用される。
本発明の実践に使用され得るCD16A結合タンパク質には、マウスモノクローナル抗体3G8のCDR由来のCDR配列を含む(すなわち、それと同一又は類似の配列を有する)タンパク質が含まれる。CDRコード配列を含む、マウス3G8モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする相補的なcDNAをクローニングし、記載の通りに配列決定した。3G8の核酸配列及びタンパク質配列を以下に記載する。マウスの可変領域及びCDR配列を用いて、3G8のCDRに由来する相補性決定領域を含む多数のキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を分析した。高い親和性でCD16Aと結合し、他の望ましい特性を有するヒト化抗体を同定するために、3G8由来のCDRを有するVH領域を含む抗体重鎖を作製し、3G8由来のCDRを有するVL領域を含む抗体軽鎖と(共発現により)組み合わせることで、分析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の特性を、下記の通りに決定した。下記の通り、本明細書に記載のヒト化抗体タンパク質等の、3G8のCDRを含むCD16A結合タンパク質は、本発明に従って使用することができる。
一態様では、本発明のCD16A結合タンパク質は、少なくとも1つのCDR(通常は3つのCDR)がマウスモノクローナル抗体3G8重鎖のCDR(より典型的には3つ全てのCDR)の配列を有し、結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒト(1つ又は複数のヒト抗体の重鎖可変領域に由来し実質的に類似した)である、重鎖可変ドメインを含み得る。
3及び表4A〜Hに開示されるように、3G8のCD16Aへの結合に影響することが当該技術分野で示され、知られている、1つ又は複数のCDR置換を有することにより、3G8のCDR配列と異なっている。適切なCD16結合タンパク質は、これらの置換を0、1、2、3、もしくは4個、又はより多く含んでいてもよく(しばしば、これらの置換を1〜4個有する)、所望によりさらなる置換を有していてもよい。
有利な結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を特定するために、同様の研究を行った。一態様では、本発明は、少なくとも1つのCDR(通常は3つのCDR)がマウスモノクローナル抗体3G8の軽鎖のCDR(より典型的には3つ全てのCDR)の配列を有し、結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトである(1つ又は複数のヒト抗体の重鎖可変領域に由来し実質的に類似する)、軽鎖可変ドメインを含むCD16A結合タンパク質を提供する。
当該技術分野において既知であり、本明細書の他の場所に記載されるように、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それらが会合してダイアボディを生成する条件下で組換え発現することが可能であり、あるいは、インビトロでそのように組み合わせることが可能である。従って、本明細書に記載の3G8由来VLドメインを本明細書に記載の3G8由来VHドメインと組み合わせて、CD16A結合ダイアボディを生成できることは明らかであり、すべてのそのような組み合わせは企図されている。
本発明は、Fcドメイン又はその一部(例えば、CH2ドメイン又はCH3ドメイン)を含むダイアボディ分子を包含する。ある実施形態では、Fcドメイン、又はその一部は、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域の1つ又は複数の定常領域(例えば、CH2又はCH3)を含む。他の実施形態では、本発明は、Fcドメイン又はその一部を含み、前記Fcドメイン又はその一部が比較可能な野生型Fcドメイン又はその一部と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば置換)を含む、分子を包含する。変異型Fcドメインは当該技術分野において周知であり、当該技術分野において周知の結合活性アッセイ又はエフェクター機能アッセイのいずれか(例えばELISA、SPR分析、又はADCC)においてアッセイされるように、前記変異型Fcドメインを含む抗体の表現型を変更するために主に使用される。そのような変異型Fcドメイン、又はその一部は、例えば、NK依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるように、Fcドメイン(又はその一部)を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能を与える又は調節することにより、本発明における用途を有する。エフェクター機能を変更することが確認されたFcドメイン変異体は、国際出願WO04/063351、米国特許出願公開第2005/0037000号及び同第2005/0064514号、2004年11月10日に出願された米国仮特許出願第60/626,510号、2004年12月15日に出願された同第60/636,663号、及び2006年3月10日に出願された同第60/781,564号、並びに2005年11月10日に出願された米国特許出願第11/271,140号、及び2005年12月15日に出願された同第11/305,787号、本願発明者らが並行した行った出願(それぞれは参照によってその全体が組み込まれる)に記載されている。
本発明のダイアボディ分子は、異種ポリペプチド(すなわち、非関連ポリペプチド;又はその一部、好ましくは、該ポリペプチドの少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100個のアミノ酸)に組換え的に融合されるか又は化学的に結合して(共有結合及び非共有結合の両方を含む)、融合タンパク質を生成し得る。融合は必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こる場合がある。
FcγRに特異的なFcドメイン(又はその一部)を含む、及び/又はエピトープ結合ドメインを含む分子によるFcγRへの結合の特徴付けは、FcγRの多型変異体を含むがこれに限定はされないいかなるFcγRを用いても行うことができる。一部の実施形態では、158位にフェニルアラニンを有するFcγRIIIAの多型変異体が使用される。他の実施形態では、158位にバリンを有するFcγRIIIAの多型変異体を用いて特徴付けが行われる。FcγRIIIA 158Vは、158Fよりも高いIgG1に対する親和性、及び増加したADCC活性を示し(例えば、Koene et al. (1997) "Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype," Blood, 90:1109-14; Wu et al. (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease," J. Clin. Invest. 100: 1059-70(これらは共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照);IgG1−FcγRIIIA共結晶化試験によって最近示されたように、この残基は実際にIgG1の下部(lower)ヒンジ領域と直接相互作用する(Sondermann et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc gammaRIII complex," Nature, 406(6793):267-273(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照)。いくつかの場合で、抗体医薬が、FcγRIIIA−158Vホモ接合体患者において向上した有効性を有することが研究によって示された。例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体であるリツキシマブは、FcγRIIIA 158Fホモ接合体患者と比較して、FcγRIIIA 158Vホモ接合体患者において治療的により有効であった(例えば、Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene," Blood, 99(3): 754-758を参照)。他の実施形態では、この領域を含む治療的分子は、FcγRIIIA−158V及びFcγRIIIA−158Fに関してヘテロ接合型の患者において、並びにFcγRIIA−131Hを有する患者においてもより有効であり得る。特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、別のアロタイプを有する本発明の分子の選択は、治療的ダイアボディに導入された場合に前記アロタイプに関してホモ接合型の患者患者に対して臨床的により効果的となる、変異体を提供し得る。
本発明は、分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に既知のアッセイを用いる、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりFcドメイン(又はその一部)を含む本発明の分子の特徴付けを包含する。特に、本発明は、FcγR仲介性エフェクター細胞機能に関する本発明の分子の特徴付けを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原のうち少なくとも1つがFcγRである場合、ダイアボディ分子によるFcγRの結合は、FcγR−Fc結合によって活性化される経路に類似したFcγR仲介性経路を活性化するように機能し得る。従って、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがFcγRを認識する場合、ダイアボディ分子は、Fcドメイン(又はその一部)を含むことなしに、又はFc−FcγR結合を伴わずに、FcγR仲介性エフェクター細胞機能を誘発し得る。本発明によってアッセイすることが可能なエフェクター細胞機能の例としては、限定はされないが、抗体依存性細胞傷害、貪食作用、オプソニン作用、オプソニン化貪食作用、C1q結合、及び補体依存性細胞傷害が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を決定するための、当業者に既知の、いかなる細胞に基づくアッセイも無細胞系のアッセイも使用することができる(エフェクター細胞アッセイに関しては、Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al. (1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity," Experientia, 44(10): 841-848; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry," J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "インビトロ Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al. (1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor," J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al. (2002) "Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8:403-411(これら各々の全体は参照することによって本願に組み込まれる)を参照されたい)。
複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりFcドメインを含む本発明の分子は、抗原−結合ドメイン結合又はFc−FcγR結合の反応速度パラメーターを特徴付けるための、当該技術分野において既知のいかなる表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを用いてもアッセイすることができる。販売されているあらゆるSPR装置、例えば、限定はされないが、BiacoreAB社(スウェーデン、ウプサラ)から販売されるBIAcore装置;アフィニティ・センサーズ社(Affinity Sensors)(マサチューセッツ州フランクリン)から販売されるIAsys装置;ウインザー・サイエンティフィック・リミテッド社(Windsor Scientific Limited)(英国、バークシャー)から販売されるIBISシステム、日本レーザー社(Nippon Laser and Electronics Lab)(日本、北海道)から販売されるSPR−CELLIAシステム、及びテキサス・インスツルメンツ社(テキサス州ダラス)から販売されるSPR Detector Spreetaが、本発明で使用可能である。SPRに基づく技術の総説としては、Mullet et al. (2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays," Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) "Some new aspects in biosensors," Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivash et al. (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction," Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al. (2000) "Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis," Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61(これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照されたい。さらに、米国特許第6,373,577号;同第6,289,286号;同第5,322,798号;同第5,341,215号;同第6,268,125号(これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載の、タンパク質間相互作用を測定するためのいかなるSPR装置及びSPRに基づく方法も、本発明の方法において企図されている。
本発明は、ポリペプチド及び抗体を含む、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドも包含する。当該技術分野において既知のいかなる方法によっても、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
本発明の分子(すなわち、抗体)をコードする核酸配列を得た後、当該技術分野において周知の技術を用いる組換えDNA技術によって、その分子を生成するためのベクターを作製することができる。当業者に周知の方法を使用して、本発明の分子のコード配列、並びに適切な転写調節シグナル及び翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ遺伝的組換えが挙げられる。(例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照)。
本発明の分子は、FcγRにより仲介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)が望まれる疾患、障害又は感染症(例えば、がん、感染症)の治療及び/又は予防に特に有用である。上記の通り、本発明のダイアボディは、たとえFcドメインを含まなくても、エフェクター機能を誘発する際に抗体様機能性を示すことができる。FcγRを免疫特異的に認識する少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、ダイアボディ分子は、FcγR結合及びFc−FcγR相互作用と類似した活性を示すことができる。例えば、本発明の分子は、免疫エフェクター細胞(例えば、NK細胞)上の細胞表面抗原及びFcγR(例えば、FcγRIIIA)と結合し、前記細胞に対するエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC、貪食作用、オプソニン作用等)を刺激することができる。
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインを含む、治療有効量の1つ又は複数の分子を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療又は予防のための方法及び組成物を包含する。一部の実施形態では、本発明は、FγRIIIA−158V又はFcγRIIIA−158F対立遺伝子に関してホモ接合性であるような、FcγR多形性を有する対象における、がんの治療又は予防のための方法及び組成物を包含する。一部の実施形態では、本発明は、FcγRIIIA(158F)と免疫特異的に結合するように、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを設計することを包含する。他の実施形態では、本発明は、FcγRIIIA(158V)と免疫特異的に結合するように、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを設計することを包含する。
一部の実施形態では、本発明の分子は、FcγRIIBに対して特異的なエピトープ結合ドメイン、並びに/又は本発明の方法によって操作され、野生型Fcドメインと比較してFcγRIIBに対するより大きな親和性並びにFcγRIIIA及び/もしくはFcγRIIAに対する低減された親和性を示す変異型Fcドメイン(又はその一部)を含む。そのような結合特徴を有する本発明の分子は、免疫応答の調節(例えば、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する免疫応答の阻害)において有用である。いかなる作用機序にも束縛されることを意図するものではないが、FcγRIIBに対する親和性を有する、並びに/又はFcγRIIBに対する増加された親和性並びにFcγRIIIA及び/もしくはFcγRIIAに対する低減された親和性を有するFcドメインを含む本発明の分子は、FcγRに対する活性化応答の減弱及び細胞応答性の阻害を引き起こし得るため、自己免疫障害の治療及び/又は予防のための治療効果を有する。
本発明は、感染症に関連する感染体に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む治療有効量又は予防(prophylatically)有効量の1つ又は複数の本発明の分子を投与することを含む、対象における感染症を治療又は予防する方法も包含する。ある実施形態では、本発明の分子は、感染体に対し毒性があり、前記分子の非存在下における免疫応答と比較して、前記因子に対する免疫応答を増強するか又は前記因子に対するエフェクター機能を増強しする。本発明の分子によって治療又は予防することができる感染症は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、及びウイルスを含むがこれらに限定はされない感染体によって引き起こされる。
本発明は、毒性がある薬剤分子に対して特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む、治療有効量又は予防(prophylatically)有効量の1つ又は複数の本発明の分子を投与することを含む、毒素(例えば、毒性がある薬剤分子)に暴露された対象における解毒の方法も包含する。ある実施形態では、本発明の分子の毒素への結合によって、前記毒素の有害な生理作用が低減又は除去される。さらに他の実施形態では、本発明の分子の毒素への結合によって、前記ダイアボディ非存在下における除去、分解又は中和と比較して、毒素の除去、分解又は中和が増加又は増強される。本発明の方法による免疫毒性治療(immunotoxicotherapy)を用いて、ジゴキシン、PCP、コカイン、コルヒチン、及び三環系抗うつ薬を含むがこれらに限定はされない薬剤の過剰投与又は暴露を治療することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、1つ又は複数の本発明の分子を、がんの治療及び/又は予防に使用される1つ又は複数の治療薬と共に投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害剤を、本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法及び組成物において使用することができる血管新生抑制剤としては、限定はされないが、アンジオスタチン(プラスミノーゲン断片);血管新生抑制アンチトロンビンIII;アンギオザイム(Angiozyme);ABT−627;Bay12−9566;ベネフィン;ベバシズマブ;BMS−275291;軟骨由来阻害剤(CDI);CAI;CD59補体断片;CEP−7055;Col3;コンブレタスタチンA−4;エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片);フィブロネクチン断片;グロβ(Gro-beta);ハロフジノン;ヘパリナーゼ;ヘパリンヘキササッカライド断片;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);IM−862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導タンパク質(IP−10);インターロイキン−12;クリングル5(プラスミノーゲン断片);マリマスタット(Marimastat);メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP);2−メトキシエストラジオール;MMI270(CGS27023A);モノクローナル抗体IMC−1C11;ネオバスタット(Neovastat);NM−3;パンゼム(Panzem);PI−88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害因子;血小板因子−4(PF4);プリノマスタット(Prinomastat);プロラクチン16kDa断片;プロリフェリン関連タンパク質(PRP);PTK787/ZK222594;レチノイド;ソリマスタット(Solimastat);スクアラミン;SS3304;SU5416;SU6668;SU11248;テトラヒドロコルチゾル−S;テトラチオモリブデート;サリドマイド;トロンボスポンジン−1(TSP−1);TNP−470;トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−b);バスキュロスタチン(Vasculostatin);バソスタチン(Vasostatin)(カルレティキュリン断片);ZD6126;ZD6474;ファルネシル基転移酵素阻害剤(FTI);及びビスホスホネートが挙げられる。
オシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体;raf拮抗薬;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras−GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン(retelliptine demethylated);レニウムRe186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチンアミド;ログレチミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi1模倣剤;セムスチン;老化由来阻害物質(senescence derived inhibitor)1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達修飾薬;一本鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ボロカプト酸ナトリウム(sodium borocaptate);フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール(solverol);ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンジスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン;過剰活性型血管作用性小腸ペプチド拮抗薬;スラジスタ(suradista);スラミン;スウェインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム(tecogalan sodium);テガフール;テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣剤;チマルファシン;サイモポエチン受容体作動薬;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;エチルエチオプルプリンスズ;チラパザミン;二塩化チタノセン(titanocene bichloride);トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキサート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チロホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来増殖阻害因子;ウロキナーゼ受容体拮抗薬;バプレオチド;バリオリンB;ベクター系、赤血球遺伝子治療;ベラレソール;ベラミン(veramine);ベルジン(verdin);ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン(vinxaltine);ビタキシン(vitaxin);ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましいさらなる抗がん剤は5−フルオロウラシル及びロイコボリンである。
本発明は、他の治療薬と併用して本発明の分子を投与することを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患に対する治療法を提供する。免疫調節剤の例としては、限定はされないが、メトトレキサート、ENBREL、REMICADE(商標)、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、及びマクロライド系抗生物質(例えば、FK506(タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、副腎皮質ステロイド、ステロイド類、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン(シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリロアミンデス(malononitriloamindes)(例えば、レフルノミド(leflunamide))、T細胞受容体修飾薬、及びサイトカイン受容体修飾薬が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療及び/又は予防のための、当業者に既知の、治療有効量又は予防有効量の1種又は追加の治療薬と併用して投与することができる。本発明は、感染症の治療及び/又は予防のための、当業者に既知の抗菌剤との併用における、本発明の分子の使用を企図している。本発明の分子と組み合わせて使用することができる抗生物質としては、限定はされないが、マクロライド(例えば、トブラマイシン(Tobi(登録商標)))、セファロスポリン(例えば、セファレキシン(Keflex(登録商標))、セフラジン(Velosef(登録商標))、セフロキシム(Ceftin(登録商標))、セフプロジル(Cefzil(登録商標))、セファクロル(Ceclor(登録商標))、セフィキシム(Suprax(登録商標))又はセファドロキシル(Duricef(登録商標)))、クラリスロマイシン(例えば、クラリスロマイシン(Biaxin(登録商標)))、エリスロマイシン(例えば、エリスロマイシン(EMycin(登録商標)))、ペニシリン(例えば、ペニシリンV(V−Cillin K(登録商標)又はPen Vee K(登録商標)))又はキノロン(例えば、オフロキサシン(Floxin(登録商標))、シプロフロキサシン(Cipro(登録商標))又はノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、アミノグリコシド抗菌剤(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸塩、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、及びスペクチノマイシン)、アンフェニコール抗菌剤(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、及びチアンフェニコール)、アンサマイシン抗菌剤(例えば、リファミド及びリファンピン)、カルバセフェム系薬剤(例えば、ロラカルベフ)、カルバペネム系薬剤(例えば、ビアペネム及びイミペネム)、セファロスポリン系薬剤(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、及びセフピロム)、セファマイシン系薬剤(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、及びセフミノクス)、モノバクタム系薬剤(例えば、アズトレオナム、カルモナム、及びチゲモナン(tigemonam))、オキサセフェム系薬剤(例えば、フロモキセフ、及びモキサラクタム)、ペニシリン系薬剤(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナマクシリン(penamccillin)、ペネタメートヨウ化水素酸塩(penethamate hydriodide)、ペニシリンo−ベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ベンザチンペニシリンV、ヒドラバミンペニシリンV、ペニメピサイクリン、及びフェネチシリンカリウム)、リンコマイシン系薬剤(例えば、クリンダマイシン、及びリンコマイシン)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系薬剤(例えば、アピシクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、及びデメクロサイクリン)、2,4−ジアミノピリミジン系薬剤(例えば、ブロジモプリム)、ニトロフラン系薬剤(例えば、フラルタドン、及び塩化フラゾリウム)、キノロン系薬剤及びそれらの類似体(例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、及びグレパフロキサシン)、スルホンアミド系薬剤(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン(sulfachrysoidine)、及びスルファシチン)、スルホン系薬剤(例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、及びソラスルホン)、シクロセリン、ムピロシン並びにツベリンが挙げられる。
本発明はさらに、本発明の組成物を使用して、がん抗原及び感染症抗原(これらの例は以下で開示される)を含むがこれらに限定はされない抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘導することを包含する。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる1つ又は複数の抗原又は免疫原を含み、ここで前記1つ又は複数の抗原又は免疫原は、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆されている。本発明のワクチン組成物は、抗原又は免疫原に対する、免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘発させるのに特に効果的である。
本発明は、複数のエピトープ結合ドメイン及び所望によりFcドメイン(又はその一部)を含む本発明の分子(すなわち、ダイアボディ)を含む方法及び医薬組成物を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質もしくは結合分子、又は本発明の融合タンパク質もしくは結合分子を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することにより、疾患、障害又は感染に付随する1つ又は複数の症状を治療、予防、及び改善する方法も提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、又は結合分子は、実質的に精製されている(すなわち、その作用を制限する、又は望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない)。特定の実施形態では、対象は動物、好ましくは哺乳動物、例えば、非霊長類(例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等)及び霊長類(例えば、カニクイザル(cynomolgous monkey)等のサル、及びヒト)等である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は対象と同じ種に由来する。
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物(例えば、不純又は非無菌組成物)及び単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物(すなわち、対象又は患者への投与に適した組成物)を含む。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の、本明細書で開示される予防薬及び/もしくは治療薬、又はそれらの薬剤の組み合わせ、並びに薬剤的に許容できる担体を含む。本発明の組成物は、予防有効量又は治療有効量の1つ又は複数の本発明の分子及び薬剤的に許容できる担体を含むことが好ましい。
特定の実施形態では、疾患、障害、又は感染に付随する1つ又は複数の症状を治療、予防又は改善するために、遺伝子治療として、本発明の分子をコードする配列を含む核酸が投与される。遺伝子治療は、発現核酸又は発現可能核酸の対象への投与によって遂行される治療を指す。本発明の本実施形態では、核酸によって、治療効果又は予防効果を媒介する、それらのコード抗体又はコード融合タンパク質が生成される。
本発明は、本発明の分子を充填した1つ又は複数の容器を含む医薬パック又は医薬キットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な1つ又は複数の他の予防薬又は治療薬を、医薬パック又は医薬キットに含ませることもできる。本発明は、本発明の医薬組成物成分のうちの1つ又は複数を充填した1つ又は複数の容器を含む医薬パック又は医薬キットも提供する。所望により、そのような容器に、医薬品又は生物由来物質の製造、使用又は販売を規制する政府当局が規定した形式で注意書きを添付してもよく、この注意書きはヒト投与用の製造、使用又は販売の当局による認可を示すものである。
本発明の医薬組成物、予防薬、又は治療薬のいくつかの態様は、ヒトでの使用に先立ち所望の治療的活性について、細胞培養系で、及び動物モデル生物(例えばげっ歯類動物モデル系)でインビトロ試験されることが好ましい。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを決定するのに使用することができるアッセイには細胞培養アッセイが含まれ、細胞培養アッセイでは、患者組織試料が培養液中で増殖せられ、本発明の医薬組成物に暴露されるか又はそれと接触せられ、組織試料に対するそのような組成物の作用が観察される。組織試料は患者から生検により得ることができる。この試験は、個々の患者に対して治療上最も有効な予防用分子又は治療用分子の同定を可能にする。種々の特定の実施形態では、自己免疫性疾患又は炎症性疾患に関わる細胞型の代表的細胞(例えば、T細胞)を用いてインビトロアッセイを行い、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを決定することができる。
6.1 共有結合型二特異性ダイアボディのデザイン及び特徴解析
単一特異性共有結合型ダイアボディ及び二特異性共有結合型ダイアボディを構築してそれぞれの組換え産生、精製、及び結合特性を評価した。本明細書に記載の組換え発現系により産生されたアフィニティー精製ダイアボディ分子は、SDS−PAGE及びSEC分析により単一の二量体分子種からなることが判明した。更にELISA及びSPR分析により、共有結合型二特異性ダイアボディが両方の標的抗原に対する親和性を示し、両方の抗原に同時に結合できることが示された。
ポリペプチド分子の構築及びデザイン:
図2に模式的に示す4つのポリペプチドコンストラクトを生成するための核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト1(配列番号9)は、FcγRIIBを認識するヒト化2B6抗体のVLドメイン及びFcγRIIIAを認識するヒト化3G8抗体のVHドメインを含む。コンストラクト2(配列番号11)はHu3G8のVLドメイン及びHu2B6のVHドメインを含む。コンストラクト3(配列番号12)はHu3G8のVLドメイン及びHu3G8のVHドメインを含む。コンストラクト4(配列番号13)はHu2B6のVLドメイン及びHu2B6のVHドメインを含む。
最初のPCR産物にオーバーラップ配列を含めることによりオーバーラップPCRで所望のポリペプチドコンストラクトのコード配列が作製されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて鋳型DNAからVL又はVHドメインのコード配列を増幅した。
約35ngの鋳型DNA、例えば関心のある抗体の軽鎖及び重鎖;1μlの10μMフォワード及びリバースプライマー;2.5μlの10×pfuUltraバッファー(ストラタジーン社製)、1μlの10mM dNTP;1μlの2.5ユニット/μlのpfuUltra DNAポリメラーゼ(ストラタジーン社製);及び総体積25μlまでの蒸留水を遠心チューブ中で穏やかに混合し、微量遠心機で簡潔にスピンしてチューブの底に反応混合物を集めた。PCR反応はGeneAmp PCR System 9700(PEアプライドバイオシステム社製)を用いて以下の設定で行った:94℃、2分;25サイクルの94℃、各15秒;58℃、30秒;及び72℃、1分。
最初のPCR産物を後述するように組み合わせ、鋳型DNAの最初の増幅に記載したのと同じPCR条件で増幅した。オーバーラップPCR産物も上記と同様に精製した。
Lipofectamine 2000をメーカーの指示書に従って用いて(インビトロジェン社)、コンストラクト1をコードするpMGX0669を、コンストラクト2をコードするpMGX0667と、HEK−293細胞にコトランスフェクトした。これら2つのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIB及びFcγRIIIAの両方に免疫特異的な共有結合型二特異性ダイアボディ(CBD)(h2B6−h3G8ダイアボディ)が発現されるようにデザインした。FcγRIIIA及びFcγRIIBにそれぞれ免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ(CMD)(それぞれh3G8ダイアボディ及びh2B6ダイアボディ)を発現させるために、コンストラクト3及び4をそれぞれコードするpMGX0666及びpMGX0668を別個にHEK−293細胞にトランスフェクトした。培養3日後、分泌された生成物を条件培地から精製した。
CNBr活性化セファロース4Bにカップリングさせた関連抗原を用いて条件培地からダイアボディを捕捉した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を20mM Tris/HCl(pH8.0)中で平衡化した。ローディング後、溶出前に樹脂を平衡バッファーで洗浄した。洗浄した樹脂から、50mMグリシン(pH3.0)を用いてダイアボディを溶出させた。溶出したダイアボディをすぐに1M Tris/HCl(pH8.0)で中和し、遠心型濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディを、PBSで平衡化したSuperdex 200カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーで更に精製した。
分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出したダイアボディのおおよそのサイズ及び異種性を分析した。PBSで平衡化したGEヘルスケア社製Superdex 200HR 10/30カラムを用いてSEC分析を行った。全長IgG(約150kDa)、Fab断片(約50kDa)、及び単鎖Fv(約30kDa)の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた)。
5.4.2.に記載されているようなELISAアッセイにより溶出及び精製したダイアボディの結合を特徴解析した。CD32B−Igの2μg/ml溶液を50μl/ウェルで用いて96ウェルMaxisorpプレートを炭酸バッファー中4℃で一晩コーティングした。プレートをPBS−T(PBS、0.1% Tween 20)で3回洗浄し、0.5% BSAを含むPBS−Tで室温にて30分間ブロッキングした。その後、h2B6−h3G8 CBD、h2B6 CMD、又はh3G8 CMDをブロッキングバッファー中に2倍希釈で段階希釈して濃度0.5〜0.001μg/mlのダイアボディを調製した。その後、プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS−Tで3回洗浄した後、0.2μg/ml sCD16A−ビオチンを50μl/ウェルで各ウェルに添加した。プレートを再度室温で1時間インキュベートした。PBS−Tで3回洗浄した後、1:5000希釈したHRPコンジュゲートストレプトアビジン(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社)を50μl/ウェルで用いて検出した。HRP−ストレプトアビジンを室温で45分間インキュベートした。プレートをPBS−Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質を用いて発色させた。10分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1%H2SO4を加えることによりHRP−TMB反応を停止した。96ウェルプレートリーダー及びSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取り、GraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いて結果をプロットした。
セクション5.4.3に記載されているように、BIAcoreアッセイ(BIAcore instrument 1000、ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)及び付属ソフトウェアを用いて、溶出及び精製したダイアボディの結合の動的パラメーターを分析した。
IgG様分子(すなわちFcドメインを含む)を作製するために、実施例6.1に示したヘテロ二量体CBD分子を構成するポリペプチドの1つを、Fcドメインを更に含むように改変した(抗体重鎖及び軽鎖に類似した「重い(heavier)鎖」及び「軽い(lighter)鎖」を作製)。これにより、ヘテロ二量体二特異性分子は、相同な分子と二量体化するFcドメインを含み、4価の4量体IgG様分子を形成する(すなわち、ヘテロ二量体二特異性分子のFcドメインを介した二量体化により形成される)。興味深いことに、このような4量体分子は、機能的アッセイを用いても(例えば標的抗原への免疫特異的結合について条件培地を調べても)、組換え発現系の条件培地中に検出されなかった。その代わり、そのような機能的アッセイ中ではVL、VH、及びFcドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが検出された。理論的4量体構造の安定性が問題なのかどうかを調べるために、Fcドメインを含むポリペプチドをヒンジ領域を更に含むように設計し、一方、「軽い(lighter)」鎖を含むポリペプチドはヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのC末端6アミノ酸を更に含むように設計した。そのような再設計された「重い(heavier)」鎖及び「軽い(lighter)」鎖を組換え発現系中で共発現させた場合には、標的抗原及び抗Fc抗体の両方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が機能的アッセイにより検出された。
実施例6.1に示したコンストラクト1及び2の改変型が生成するように核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト1及び2がFcドメインを更に含むように設計して、それぞれコンストラクト5(配列番号14)及び6(配列番号15)を作製した。コンストラクト1がC末端に配列FNRGEC(配列番号23)を更に含むように設計することでコンストラクト7(配列番号16)を作製した。コンストラクト2がヒンジ領域及びFcドメイン(V215A変異を含む)を更に含むように設計することでコンストラクト8(配列番号18)を作製した。コンストラクト5〜8の模式図を図9に示す。
全てのPCR及びPCR産物精製プロトコールは実施例6.1に記載した通りであり、プラスミドpMGX0669及びpMGX0667をそれぞれコンストラクト1及び2のコード配列の鋳型とした。HuIgGのFcドメイン及び/又はヒンジドメインのコード配列はそれぞれ配列番号5又は配列番号1及び配列番号5である。PCR産物にオーバーラップ配列を含めることによりオーバーラップPCRで所望の産物のコード配列を作製できるようにフォワード及びリバースプライマーを用いて鋳型DNAのコード配列を増幅した。
最初のPCR産物を後述するように組合せ、実施例6.1と同様に増幅及び精製した。
セクション6.1に記載したようにLipofectamine 2000を用いてHEK−293細胞への4つの別個のコトランスフェクションを行った:それぞれコンストラクト1及び6をコードするpMGX0669及びpMGX0674;それぞれコンストラクト2及び5をコードするpMGX0667及びpMGX0676;並びにそれぞれコンストラクト7及び8をコードするpMGX0677及びpMGX0678。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を前述のようにサンドウィッチELISAによりアッセイした。特に断りのない限り、CD32Bをプレートのコーティングに、すなわち標的タンパク質として用い、HRPコンジュゲートCD16をプローブとして用いた。
ポリペプチド鎖上の選択された残基をシステインで置換することにより、4量体IgG様ダイアボディ分子の「軽い(lighter)」及び「重い(heavier)」ポリペプチド鎖間の更なる安定化の影響を調べた。更なるシステイン残基は「重い(heavier)」鎖と「軽い(lighter)」鎖の間に更なるジスルフィド結合をもたらす。更に、Fcドメイン又はヒンジ−Fcドメインをポリペプチド鎖のC末端からN末端に移動させることにより、結合活性に関してドメインの順番を調べた。更なるジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、前に構築したそのような結合を有しないダイアボディ分子と比べて変化しなかったが、ダイアボディを構成する「重い(heavier)」ポリペプチド鎖のN末端へのFc又はヒンジ−Fcドメインの移動は、驚くべきことに、標的抗原の一方又は両方に対する二特異性分子の結合親和性及び/又はアビディティーを向上させた。
ポリペプチド分子の構築及びデザイン:
実施例6.2に示したコンストラクト5、6、及び8の改変型を生成するために核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト9(配列番号19)及びコンストラクト10(配列番号20)(両方とも図14に模式的に示す)は、それぞれFcドメイン又はヒンジ−FcドメインがポリペプチドのC末端からN末端にシフトされたこと以外はコンストラクト8及び6と同様である。更に、使用した全てのFcドメインは野生型IgG1 Fcドメインであった。コンストラクト12、配列番号22(図14に模式的に示す)はC末端が配列FNRGEC(配列番号23)を更に含むようにデザインしたこと以外は実施利6.1のコンストラクト2と同様である。コンストラクト11、配列番号21(図14に模式的に示す)は、Fcドメインがヒンジ領域を更に含むこと以外は実施例6.2のコンストラクト5と同様である。また、コンストラクト11及び12では、2B6 VLドメイン及び2B6 VHドメインが1個のアミノ酸修飾(それぞれG105C及びG44C)を含むことにより、各ドメイン中のグリシンがシステインで置換されている。
全てのPCR及びPCR産物精製プロトコールは実施例6.1及び6.2に記載されている通りである。
実施例6.1及び実施例6.2に記載の方法を用いて最終産物を構築し、増幅し、精製した。
セクション6.1に記載したようにLipofectamine 2000を用いてHEK−293細胞中への3つの別個のコトランスフェクションを行った:それぞれコンストラクト1及び9をコードするpMGX0669及びpMGX0719;それぞれコンストラクト1及び10をコードするpMGX0669及びpMGX0718;並びにそれぞれコンストラクト11及び12をコードするpMGX0617及びpMGX0717。これらのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIB及びFcγRIIIAの両方に免疫特異的なIgG様構造で4価の二特異性ダイアボディ(CBD)が発現するようにデザインした。培養3日後、条件培地を回収した。条件培地中に分泌された生成物の量を、精製Fcを標準として用いた抗IgG Fc ELISAにより定量した。次いで、定量化に基づいて試料中の生成物の濃度を標準化し、標準化した試料を残りのアッセイに用いた。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を前述したようにサンドウィッチELISAによりアッセイした。特に断りのない限り、CD32Bを用いてプレートをコーティングし、すなわち標的タンパク質とし、HRPコンジュゲートCD16をプローブとして用いた。
3つの上記コトランスフェクションの条件培地約15mlを非還元条件下でSDS−PAGEにより分析した。1つのゲルをSimply Blue Safestain(インビトロジェン社製)で染色し、標準的な転写方法で同一のゲルをPVDFメンブレン(インビトロジェン社製)に転写した。転写後、メンブレンを5%乾燥スキムミルクを含む1×PBSでブロッキングした。次いで、メンブレンを、10mlの1:8,000希釈HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1 H+Lを含む2%乾燥スキムミルク1×XPBS/0.1%Tween 20中で室温にて1時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。1×PBS/0.3%Tween 20で5分×2回、次いで室温で20分洗浄した後、メーカーの取扱説明書に従いECLウェスタンブロッティング検出システム(アマシャム・バイオサイエンス社製)でメンブレンを発色させた。X線処理装置中でフィルムを現像した。
本明細書に記載されているように、本発明のダイアボディ又はダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は単一のポリタンパク質前駆体分子として発現され得る。実施例6.1〜6.3に記載の組換え系がそのようなポリタンパク質前駆体から機能的CDBをプロセシング及び発現する能力を、内部切断部位、特にフューリン切断部位により隔てられたCBDの第1及び第2のポリペプチド鎖の両方をコードするように核酸を設計することにより調べた。機能的CBDはポリタンパク質前駆体分子を含む組換え系から単離した。
ポリペプチド分子の構築及びデザイン:
ポリタンパク質前駆体:
図17に模式的に示す2つのポリタンパク質前駆体分子を生成するための核酸発現ベクターをデザインした。コンストラクト13(配列番号95)は、ポリペプチド鎖のN末端から、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン(mCD32Bに結合する)、フューリン切断部位、2.4G2のVLドメイン、及び3G8のVHドメインを含む。コンストラクト13をコードするヌクレオチド配列を配列番号96に示す。コンストラクト14(配列番号97)(図17)は、ポリペプチド鎖のN末端から、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン(mCD32Bに結合する)、フューリン切断部位、FMD(口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3)部位、2.4G2のVLドメイン、及び3G8のVHドメインを含む。コンストラクト14をコードするヌクレオチド配列を配列番号98に示す。
全てのPCR及びPCR産物精製プロトコールは実施例6.1及び6.2に記載した通りである。
適切なプライマーを用いて、実施例6.1及び実施例6.2に記載の方法で最終産物を構築し、増幅し、精製した。
セクション6.1に記載したように、Lipofectamine 2000を用いてHEK−293細胞への1つのトランスフェクション及び1つのコトランスフェクションを行った:単一トランスフェクション:コンストラクト13をコードするpMGX0750;コトランスフェクション:それぞれコンストラクト15及び16をコードするpMGX0752及びpMGX0753。培養3日後、条件培地を回収し、記載したように、分泌された産物をアフィニティー精製した。
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、前述したようにサンドウィッチELISAによりアッセイした。コンストラクト15及び16のコトランスフェクション産物では、マウスCD32Bを用いてプレートをコーティングし、すなわち標的タンパク質とし、HRPコンジュゲートCD16Aをプローブとして用いた。コンストラクト13を含む組換え系では、mCD32Bを標的タンパク質として用い、ビオチン−コンジュゲートCD16Aをプローブとして用いた。
コンストラクト13を含む組換え発現系から得られた条件培地をサンドウィッチELISAにより分析した。ELISAアッセイにより、mCD32B及び/又はCD16のいずれか又は両方へのCBD結合の特異性を調べた(図18)。CD32Bを標的抗原とし、CD16Aを二次プローブとして用いた。ELISAの陽性シグナルから、ポリタンパク質前駆体から生成したヘテロ二量体h2.4G2−h3G8 CBDが両方の抗原に対する特異性を有することが示された。
本発明の一態様は、新規な二重親和性再標的化試薬(「DART」)及び複数の親和性を結びつける新規な方法に関する。「DART」は単一特異性、二特異性、三特異性等であり得るので、1、2、3、又はそれ以上の異なるエピトープ(同じ抗原のものであってもよく、異なる抗原のものであってもよい)に同時に結合することができる。「DART」は更に、1価、2価、3価、4価、5価、6価等であり得るので、1、2、3、4、5、6、又はそれ以上の分子に同時に結合することができる。図35に示すように、例えば4価の二特異性ダイアボディを生成するように、DARTのこれら2つの特性が組み合わされ得る。
プラスミドコンストラクト:
2B6/4420は、ヒト化2B6 MAb(hu2B6、MGA321)と、キメラマウスFv/ヒトFc型の抗フルオレセインMAbである4420との配列に由来する。完全に構築されたDARTは2つのポリペプチドからなり、その結果、2つのFv領域が共有結合により連結される。第1のポリペプチドは、分泌シグナル配列と、これに後続する、アミノ酸残基GGGSGGGGからなるリンカーによって隔てられた4420VHとの融合タンパク質として生成されるhu2B6VLとからなる。κ軽鎖のC末端に由来する配列FNRGECがこのポリペプチドのC末端に付加されている。他方のポリペプチドは、シグナル配列−4420VL−GGGSGGGG−hu2B6VHからなり、ヒトIgG1 Fd断片のC末端に由来する配列VEPKSCがC末端に付加されている。2つの鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、2つのポリペプチドを共有結合により連結する(図20)。説明したポリペプチドをコードするDNA配列を既存のプラスミドからPCR増幅し、オーバーラップPCRにより組み合わせ、NheI部位とEcoRI部位との間でpCIneo(プロメガ社製)にクローニングした。最後に、上述した方法と同様の方法を用いて既に構築しておいた、huCD32BとhuCD16とに対する親和性を有するDART(2B6/3G8)を、対照として用いた。
マウスモノクローナル抗ヒトCD79b体抗CB3.1及びCB3.2(ハイブリドーマ)は、アラバマ州、バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のDr.Cooper MDから入手した。メーカーの指示書(ピアース社(Pierce)製、イリノイ州、ロックフォード)に従い、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)でCB3.1及びCB3.2を標識した。Fc断片特異的ヤギ抗マウス(GAM)IgGのF(ab')2断片をジャクソン・ラボラトリーズ社(Jackson Laboratories;ウェストグローブ、ペンシルベニア州)から入手した。抗huCD32BマウスMAbである3H7は自社で作製及び精製した。ヤギ抗2B6Fvは、hu2B6全抗体でヤギを免疫化し、hu2B6のFv領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。HuIgG、FITC−huIgG、及びHRP−抗マウスIgGはジャクソン・イムノリサーチ社(Jackson Immunoresearch)から入手した。HRP−抗ヤギはサザンバイオテック社(Southern Biotech)から入手した。
Lipofectamine 2000(インビトロジェン社製)をメーカーの指示書に従って用いて、各鎖をコードするプラスミドを293H細胞(インビトロジェン社製)にコトランスフェクションした。分泌タンパク質を3日間隔で3〜4回にわたり回収し、固定化可溶性形態のCD32Bに対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
FITC標識プロテインS(ノバジェン社製)、ヒトIgG、又はFITC−huIgGでコーティングしたMaxiSorpプレート(Nalge Nunc社製)上において2B6/4420又は2B6/3G8 DARTを捕捉した。可溶性CD32B外部ドメイン、次いで3H7(CD32Bに特異的なマウスモノクローナル抗体)、最後に抗マウス−HRPを結合させることにより検出を行った。あるいは、フィニティー精製したヤギ抗2B6 Fvポリクローナル抗血清、次いで抗ヤギ抗体−HRPを結合させることにより検出を行った。比色分析TMB基質(BioFX社製)を用いてHRP活性を検出し、VersaMax ELISAプレートリーダーで読み取った。
健康なドナー由来の血液を用いたFicoll/Paque Plus(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製、英国)勾配法により末梢血液単核細胞を分離した。Dynal B Cell Negative Isolation Kit(ダイナル・バイオテクノロジー社(Dynal Biotechnology Inc.)製、ニューヨーク州)をメーカーの指示書に従って用いてBリンパ球を単離した。単離されたB細胞(CD20+)の純度はFACS分析による推定で90%を超えていた。増殖アッセイでは、精製されたB細胞を、平底96ウェルマイクロタイタープレート中の完全RPMI 1640培地中に細胞密度1×105細胞/ウェル、最終体積200μlで播種し、5%のCO2中37℃で抗体及びダイアボディの存在下又は非存在下において48時間インキュベートした。次いで、1μCi/ウェルの[3H]チミジン(パーキンエルマー社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州)を加え、回収前に更に16〜18時間インキュベーションを続けた。液体シンチレーションカウント法により[3H]チミジン取込みを測定した。
2B6/4420 DARTが活性且つ特異的であることを示すため、2つのELISA実験を行った。まず、2B6/4420又は2B6/3G8(陰性対照として)を、ELISAプレート上にコーティングしておいたフルオレセインコンジュゲートタンパク質(Sタンパク質)に結合させた。次に、DARTの2B6アームを可溶性CD32Bと結合させた。エピトープが2B6のエピトープと重複しないCD32Bに対する別の抗体、次いでHRP−コンジュゲート二次抗体を用いて結合を検出した。2B6/4420 DARTはフルオレセイン及びCD32Bに同時に結合することができるが、2B6/3G8はできない(図21、パネルA)。可溶性CD32Bでコーティングしたプレート上でDARTを捕捉し、hu2B6 Fvに特異的な抗体で結合を検出すると、いずれのDARTも良好な結合を示す。ヒトIgGにコンジュゲートさせたフルオレセインに2B6/4420 DARTが結合できることを示すために(これが本試薬の最初の実装形態の場面であるとする)、非標識の又はフルオレセイン標識されたHuIgGをELISAプレートに結合させ、2B6/4420の捕捉に用いた。ここでもまた、2B6/3G8を陰性対照として用いた。Hu2B6 Fvに特異的な抗体を用いて結合を検出した。2B6/4420 DARTは明らかにFITC−HuIgGに結合するが、非標識HuIgGには結合せず、ことことは、このDARTが、抗体にコンジュゲートしたフルオレセインに結合でき、抗体単独に対しては顕著な結合がないことを示している。予想通り、これらのいずれにおいても、2B6/3G8 DARTによる結合は検出されなかった。
現在、B細胞悪性腫瘍は抗CD20抗体リツキサン(登録商標)を用いて処置されている。しかし、一部のB細胞悪性腫瘍はCD20を発現しないか、リツキサン耐性になる。本発明のDARTは、抗CD20抗体リツキサン(登録商標)に関連する問題を克服できる代替的免疫治療薬を提供する。
データはMGD261が二重トランスジェニックマウスにおいて顕著な副作用を誘導することなくB細胞を枯渇できることを示している。
h2B6−h3G8投与の18日前、並びに処置の4、11、18、25、及び32日後に全血試料を採取した。B細胞数へのh2B6−h3G8の影響を決定するためにFACSベースのアッセイで血液試料を分析した。ベックマン・コールター社から入手したFlowCountビーズを用いることにより、洗浄なしのプロトコールを用いてB細胞、T細胞、及びPMNをカウントした。分析に用いた抗体のパネルは、PMNが1A8−FITC、T細胞がCD3−PE、B細胞がCD19−APC、総白血球がCD45−PerCPであった。
hE16又はMGD261(全濃度)で処置したマウスは実験期間中のいずれの時点においても不快感の徴候を示さなかった。
マクロジェニック社製繁殖コロニーのmCD16−/−、mCD16−/− hCD16A+ C57Bl/6、mCD16−/− hCD16B+、及びmCD16−/− hCD16A+ hCD16B+マウスに、0、2、4、7、9、11、14、16、及び18日目に2.4G2−3G8 DB(75μg/マウス)又はPBSをIP注射した。−10(出血前)、4、11、及び18日目にFACS分析用の血液を採取した。動物の健康及び活性を週3回記録した。
2.4G2−3G8投与の10日前並びに処置開始の4、11、及び18日後に全血試料を採取した。B細胞数への2.4G2−3G8の影響を決定するためにFACSベースのアッセイで血液試料を分析した。BDイムノサイトメトリーシステム社から入手したTruCOUNTチューブを用いることにより、洗浄なしのプロトコールを用いてB細胞、T細胞、及びPMNをカウントした。分析に用いた抗体のパネルは、PMNが1A8−FITC、T細胞がCD3−PE、B細胞がCD19−APC、全白血球がCD45−PerCPであった。
hE16又は2.4G2−3G8 DBで処置したマウスは実験期間中のいずれの時点においても不快感の徴候を示さなかった。
ヒト腫瘍細胞系Rajiの静脈内(IV)モデルを用いてMGD261の抗腫瘍活性を調べた。RajiはhCD32Bを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞系である。腫瘍細胞は、mCD16−/−、hCD16A+、RAG1−/−マウスに静脈内注射されると脊椎に局在して後肢を麻痺させる。
マクロジェニックス社製繁殖コロニーの12〜20週齢のmCD16−/−、hCD16A+、RAG1−/− C57Bl/6マウスに5×106Raji細胞を0日目にIV注射した。6、9、13、16、20、23、27、及び30日目に、マウスを更に250、25又は2.5μgのMGD261又はPBS(陰性対照)で腹腔内(IP)処置した。その後、マウスを毎日観察し、体重を週2回記録した。後肢の麻痺を発症したマウスは屠殺した。
PBSで処置したマウスは25〜50日目の間に死亡した。MGD261で処置したマウスは少なくとも90日目まで生存した(図26)。生存率増加は統計的に有意であった。ログ・ランク検定を用いた生存曲線を比較した結果、χ2は96.46(df=9;P値<0.0001)であった。
非哺乳動物宿主中でDARTを産生する能力を実証するために実験を行った。したがって、大腸菌をDART発現プラスミドで形質転換し、DARTの発現をモニタリングした。
プラスミド構築:
3G8はHuCD16に対するヒト化モノクローナル抗体である。ここで説明するDARTは2つの共有結合により連結された鎖からなり、各鎖は、VL、その後ろにスペーサー、次いでVH、その後ろに対向鎖とジスルフィド結合を形成するのに良好な前後関係でCysを有する。3G8VL−GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly(配列番号10)−3G8VH−LeuGlyGlyCysをコードするDART配列を、既存の真核生物用発現コンストラクトからPCR増幅し、NcoI及びEcoRIで消化した。標的ベクターはpET25b(+)(ノバジェン社製)であり、これは大腸菌内での分泌のためのpelBリーダー配列を含む。3G8/3G8 DART配列を挿入する前にベクターを以下のように改変した:まず、その制御下で低レベルであっても可溶性のタンパク質発現を促すために、T7プロモーターをより活性の低いlacプロモーターで置換した。更に、pelBリーダーの開始部に存在するMetでの開始が起こりやすいように、2つの点変位を導入してマルチクローニングサイト(MCS)の開始部に存在する2つの内部Metコドンを除去した。このコンストラクトにより生成するDARTは、同じ特異性、すなわちHuCD16に対する特異性を有する2つのV領域アームからなる。
BL21DE3細胞(ノバジェン社製)をpET25b(+) T7−lac+ 3G8/3G8プラスミドで形質転換し、amp耐性コロニーをブロス培養液に播種した。培養液のOD600単位が0.5に達した時に0.5mM IPTGを加えて発現を誘導した。培養を30℃で2時間成長させ、無細胞培地を回収した。
アフィニティー及び分子ふるいクロマトグラフィーを用いた2ステッププロセスで3G8/3G8 DARTを精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて条件培地からDARTを捕捉した。具体的には、CNBr活性化セファロース4B(GEヘルスケア社製)にCD16Aをカップリングさせた。ローディング前にCD16A−セファロース樹脂を20mM Tris/HCl(pH8.0)で平衡化した。ローディング完了後、樹脂を平衡バッファーで洗浄した後、50mMグリシン(pH3.0)を用いて、結合したDARTを溶出させた。溶出したDARTをすぐに1M Tris/HCl(pH8.0)で中和し、遠心型濃縮装置(Vivaspin 20、10k MWCO PES、ビバサイエンス社(VivaScience Inc.)製)を用いて濃縮した。濃縮したDARTを、PBSで平衡化したSuperdex 200カラム(GEヘルスケア社製)を用いた分子ふるいクロマトグラフィーで更に精製した。
大腸菌を培養した条件培地1.7リットルをCD16Aセファロースカラムで処理した。DARTの収量は0.12mgであった。SDS−PAGE及びSECによる精製DARTの分析により、哺乳動物細胞(CHO)発現対照DARTとの同等性が示された(図27)。
大腸菌内におけるh3G8−h3G8 DARTの発現をELISAで測定した。96ウェルMaxisorpプレート上に、炭酸バッファー中4℃で一晩、50μl/ウェルで2μg/mlの抗h3G8 Fv特異的抗体2C11をコーティングした。プレートをPBS−T(PBS、0.1% Tween 20)で3回洗浄した後、試験対象のDARTを添加する前に、0.5%BSAを含むPBS−Tを用いて室温で30分間ブロッキングした。ブロッキング中、大腸菌発現h3G8−h3G8 DART、h2B6−h3G8 DART、及びh2B6−h2B6 DART(陰性対照)を1μg/ml及び0.3μg/mlでPBST/BSA中に希釈した。希釈DARTを50μl/ウェルで各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS−Tで3回洗浄した後、0.1μg/mlのビオチン化sCD16−Fc融合体を50μl/ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS−Tで3回洗浄した後、1:5000希釈したHRPコンジュゲートストレプトアビジン(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を50μl/ウェルで検出に用い、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS−Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質を用いて発色させた。5分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1%H2SO4で反応を停止させた。OD450nmを96ウェルプレートリーダー及びSOFTmaxソフトウェアを用いて読み取った。読取値をGraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてプロットした(図28)。
ヒトPBMCを、CD16−CD32B(hu3G8−hu2b6;前述);ch2B6−aglyc(非グリコシル化キメラ2B6抗体;参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第2005/0260213号として公開されている同時係属中の米国特許出願第11/108,135号に記載されている)、及びCD16−CD79と共に一晩インキュベートした。CD16−CD79のDNA及びコードされているタンパク質配列は以下の通りである。
ヌクレオチド配列(配列番号226):
ヌクレオチド配列(配列番号228):
8B5VL−CB3.1VH−VEPKSC
H9及びlgh630Rをプライマー、ch8B5Lcを鋳型として用いて、8B5VLを増幅した。lgh628F及びlgh629Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いて、CB3.1VHを増幅した。プライマーlgh630R及びlgh628F中にリンカー配列を組み込んだ。c末端リンカー及び終止コドンをlgh629Rプライマー中に組み込んだ。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、H9及びlgh629Rをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
8B5VLと同じ配列をFR4に共有するH9及びlgh630Rをプライマー、chCB3.1Lcを鋳型として用いてCB3.1VLを増幅した。lgh631F及びlgh640Rをプライマー、ch8B5Hcを鋳型として用いて、8B5VHを増幅した。リンカー配列をプライマーlgh630R及びlgh631F中に組み込んだ。c末端リンカー及び終止コドンをlgh640Rプライマー中に組み込んだ。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、H9及びlgh640Rをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
オーバーラップPCRによりシグナル配列と8B5VLの間に抗Flagタグを挿入した。H9及びlgh647Rをプライマー、ch8B5Lcを鋳型として用いて、シグナル配列及びFlagタグを増幅した。lgh647F及びlgh629Rをプライマー、8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCを鋳型として用いて8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCを再度増幅した。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、H9及びlgh629Rをプライマーとして用いて増幅した。次いで、このオーバーラップPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCコンストラクト中に異なるC末端リンカーを作製するために、H9及びlgh646Rをプライマーとして用いてコンストラクトを再度増幅した。C末端LGGCリンカーをlgh646Rプライマー中に組み込んだ。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
同じ戦略を用いてCB3.1VL−8B5VH−LGGCを作製した。C末端LGGCリンカーをlgh648Rプライマー中に組み込み、CB3.1VL−8B5VH−FNRGECを鋳型として用いた。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
これも同じ戦略を用いて、抗Flagタグ−8B5VL−CB3.1VH−LGGCを作製した。C末端LGGCリンカーをlgh648Rプライマー中に組み込み、抗Flagタグ−8B5VL−CB3.1VH−VEPKSCを鋳型として用いた。次いで、PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。
コンストラクト5及び6、6及び7、8及び9、又は9及び10によりコードされる発現プラスミド(図30)を、Lipofectamine 2000(インビトロジェン社製)を用いてHEK−293細胞にコトランスフェクトして抗flagタグの付いた又は付かない8B5−CB3.1 DARTを発現させた。3日毎に3回にわたり条件培地を回収した。次いで、CD32Bアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
ELISAを以下のように行った:炭酸バッファー中4℃で一晩にわたり、96ウェルMaxisorpプレート上に2μg/mlのCD32B−Fcを50μl/ウェルでコーティングした。PBS−T(PBS、0.1%Tween 20)でプレートを3回洗浄し、次いで、試験対象の単鎖Fc融合タンパク質を添加する前に、0.5%BSAを含むPBS−Tで室温にて30分間ブロッキングした。ブロッキング中、8B5−CB3.1 DARTを、2μg/mlに始まる2倍希釈系列で希釈した。25μl/ウェルの50ng/ml ch8B5と混合した25μl/ウェルの希釈DARTを希釈プレートからELISAプレートに移した。プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS−Tで3回洗浄した後、1:10,000希釈HRPコンジュゲートF(ab')2ヤギ抗ヒトIgGF(ab')2(ジャクソン・イムノリサーチ社製)を50μl/ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS−Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質で発色させた。5分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1%H2SO4で反応を停止させた。96ウェルプレートリーダー及びSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読取った。読取結果をGraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてプロットした(図31)。
4つのポリペプチド鎖を用いて、4価の抗原結合部位を有するIg様DART分子種を作製した(図32、図33)。Ig様DART分子種は、そのドメインが同じエピトープに結合するように(4個の同一の抗原分子に結合できる4価の単一エピトープ特異的Ig様DARTを形成するように)又は異なるエピトープ若しくは抗原に結合するようにデザインされ得るので、固有の特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の2個のエピトープに結合するように(単一の抗原に特異的であり、2つのエピトープに特異的な、4価のIg様DARTを形成するように)又は異なる抗原分子のエピトープに結合するように(第1の抗原に特異的な結合部位の対と、第2の抗原に特異的な第2の結合部位の対とを有する4価のIg様DARTを形成するように)デザインすることができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子は容易に作製することができる。
(配列番号247):
(配列番号248):
(配列番号249):
(配列番号250):
CD79VL−CD32BVH(配列1)、CD32BVL−CD79VH−1(配列2)、及びCD32BVL−CD79VH−2(配列3)をコードする遺伝子を発現ベクターpEE13にクローニングして、それぞれ発現コンストラクト1、2、及び3を得た。コンストラクト1発現プラスミドを、発現プラスミド2又は3のいずれかと一緒にHEK−293細胞にコトランスフェクトしてそれぞれ二特異性ダイアボディCD32B−CD79−1及びCD32B−CD79−2を作製した。条件培地を3日毎に3回にわたり回収した。次いで、CD32Bアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
(配列番号251):
(配列番号252):
(配列番号253):
(配列番号254):
(配列番号255):
(配列番号256):
CD32及びB細胞受容体複合体(「BCRC」)に結合できる可変領域を含むダイアボディを構築した。
標準的なPCR/オーバーラップPCRを用いてコンストラクトを構築した。
h8B5VL−G3SG4−hBCRCVH M48I−LGGC:
lgh321F及びlgh788Rをプライマーとして用いて、完全にヒト化された8B5 VL(CD32を認識する)を増幅した。lgh784F及びlgh386Rをプライマーとして用いてhBCRCVH M48Iを増幅した。PCR産物をゲル精製し、混合し、lgh321F及びlgh386Rを用いて増幅した。次いで、このオーバーラップPCR断片をpEE6にXbaI−EcoRI部位でクローニングした。「G3SG4」は配列:GGGSGGGG(配列番号10)を有するリンカーである。
hBCRCVL R45N−G3SG4−h8B5VH −LGGC:
lgh321F及びlgh785Rをプライマーとして用いてhBCRCVL R45Nを増幅した。lgh787F及びlgh786Rをプライマーとして用いてh8B5VHを増幅した。PCR産物をゲル精製し、混合し、lgh321F及びlgh786Rを用いて増幅した。次いで、このオーバーラップPCR断片をpEE13にXbaI−EcoRI部位でクローニングした。
pEE6hHBCRCVL R45N−h8B5VHをBglII−SalI部位で消化し、3.3kbの断片を精製し、pEE13 hHBCRCVL 45N−h8B5VHにBamHI−SalI部位で挿入した。BglII及びBamHIは適合する付着末端を有する。DART及びDARTの構築に用いたプライマーの配列を以下に示す。
(配列番号257):
(配列番号258):
(配列番号259):
(配列番号260):
炭酸バッファー中40℃で一晩、可溶性FcRIIb−G2−Aglyを100ng/ウェルで96ウェルMaxisorpプレートにコーティングした。プレートをPBS/0.1%Tween20で3回洗浄した後、ダイボディを加える前に、0.5%BSAを含むPBS/0.1%Tween 20で室温にて30分間ブロッキングした。Hu2B6 4.5−Hu3G8 5.1生体特異的ダイアボディ、Hu2B6 4.5ダイアボディ、及びhu3G8 5.1ダイアボディの条件培地の25ng/ウェルに始まる2倍希釈系列を各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1% Tween20で3回洗浄した後、FcRIIIa−G2−ビオチンを10ng/ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1%Tween20で3回洗浄した後、50μlの1:5000希釈したHRPコンジュゲートストレプトアビジン(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を用いて検出した。室温で45分間インキュベートした後、プレートをPBS/0.1%Tween20で3回洗浄し、TMB基質を用いて発色させた。10分間インキュベートした後、1%H2SO4で反応を停止させた。SOFTmaxプログラムでOD450nmを読み取った。GraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いて読取結果をプロットした。
CD32及びB細胞受容体複合体(「BCRC」)に結合できる可変領域を含むIgDARTダイアボディを構築した。第1のダイアボディでは、分子のVH配列とFc配列の間にLGGCGGGS(配列番号267)リンカーを用いた。第2のダイアボディでは、配列:LEIK(配列番号268)を有するLEIKリンカー又は配列TVSS(配列番号269)を有するTVSSリンカーのいずれかを用いた。これらのダイアボディの鎖及びコードするポリヌクレオチドの配列を以下に示す。
(配列番号270):
(配列番号271):
(配列番号272):
(配列番号273):
(配列番号274):
(配列番号275):
(配列番号276):
(配列番号277):
前述の通り、本発明のIgDARTダイアボディは分子のVH配列とFc配列の間にリンカーを含むことが好ましい。収率及び活性を最大化するために、リンカーを最適化する実験を行った。以下のリンカーを用いた。
上記に鑑みて理解されるように、二特異性DARTの個々のポリペプチドは2種類のホモ二量体及び1種類のヘテロ二量体を形成し得る。本発明の一実施形態では、一方又はより好ましくは両方のDARTポリペプチドのC末端に荷電ポリペプチドを付加することができる。二特異性DARTの個々のポリペプチドに反対の電荷の荷電ポリペプチドを選択することにより、そのような荷電ポリペプチドを含めることでヘテロ二量体の形成が増え、ホモ二量体の形成が減る。好ましくは、正に帯電したポリペプチドは実質的な量のアルギニン、グルタミン、ヒスチジン、及び/又はリジン(又はこのようなアミノ酸の混合物)を含み、負に帯電したポリペプチドは実質的な量のアスパラギン酸又はグルタミン酸(又はこのようなアミノ酸の混合物)を含む。実質的な量のリジンを含む正に帯電したポリペプチド及び実質的な量のグルタミン酸を含む負に帯電したポリペプチドが特に好ましい。このような逆に帯電したポリペプチド間の静電引力を最大にするために、へリックスコンホメーションを自然に形成できるポリペプチドを用いることが好ましい。
別の実施形態では、Eコイル又はKコイルDARTのE及び/又はKコイルにFc領域が連結され得る。
(1)CD79b(BCR複合体)反応性抗体CB3の可変軽及び重領域並びに(2)CD32B反応性抗体2B6の低親和性変異体(「YA」と呼ばれる変異体)の可変軽及び重領域を有する二特異性DART分子からEコイル及び/又はKコイルFc−DART分子種を作製した。この抗体のこの軽鎖可変領域は変異N50Y及びV51Aを含む点で抗体2B6のそれと異なる。したがって、抗体YA2B6は以下の軽鎖可変領域配列を有する:
前述の通り、二特異性単鎖分子等の小さな組換え抗体分子(例えば、約55kDaの分子量)は迅速に循環からクリアランスされる。マウスにおけるDART分子のインビボ薬物動態研究は、予想通り、約2時間という短い終末半減期を示した。
ABD DARTのデザイン及び構築:
鎖1として
hCD16VL−G3SG4−hCD32BVH−Kコイル[(KVAALKE)4]
(式中、CD16VLは3G8 CD16VLを表し、G3SG4は配列番号10を表し、hCD32BVHは2B6 CD32BVHを表し、(KVAALKE)4は配列番号300を表す)を用い、
鎖2として
hCD32BVL−G3SG4−hCD16VH−GGCGGG−Eコイル[(EVAALEK)4]−GGGNS−ABD
(式中、CD32BVLはCD32BVLを表し、G3SG4は配列番号10を表し、hCD16VHはCD16VHを表し、GGCGGGは配列番号267の残基2〜7であり、Eコイル[(EVAALEK)4]は配列番号299であり、GGGNSは配列番号301であり、ABDは
安定なトランスフェクションのために、CHO−S細胞をhCD16−hCD32B EK ABD−DARTプラスミドDNAでトランスフェクトした。CNBr活性化セファロース4Bにカップリングした可溶型のFcRIIB抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりABD−DARTタンパク質を精製した。濃縮したタンパク質を、Superdex 200HR 10/30を用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより更に精製した。
CD16を用いて捕捉するために、濃度2μg/mLのFcRIIB抗原を用いて4℃で一晩プレートをコーティングした。次いで、プレートを0.5%ペプトンを含むPBS−Tでブロッキングした。2倍希釈系列で希釈した精製タンパク質をプレートに室温で1時間結合させた。最後に、ビオチン化CD32B(50ng/mL)、次いでHRPコンジュゲートストレプトアビジン(1/1000、BD−Pharm社製)を用いて検出を行った。TMBを加えてHRP活性を測定し、プレートリーダーを用いてプレートをOD450nmで読み取った。
LDH放出アッセイで細胞傷害性を測定した。メーカーの指示書に従ったFicoll−Hypaque(アマシャム・バイオサイエンス社製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)密度勾配遠心により、ヒト全血(ロンザ・ウォーカーズビル社(Lonza Walkersville,Inc)製、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)から末梢血液単核細胞(PBMC)を精製した。2×104標的細胞を丸底96ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレーティングする。異なるDART又は抗体分子の1〜4つの希釈系列をプレート中の細胞に添加する。その後、6×105PBMCを同じウェルに加える。次いで、プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター中で一晩インキュベートする。次いで、プレートを1200rpmで5分間遠心し、50μlの上清を平底ELISAプレートに移す。50μlのLDH基質溶液(プロメガ社製)を各ウェルに加え、プレートを室温、暗黒下で30分間インキュベートする。次いで、50μlの停止溶液を各ウェルに加え、1時間以内にプレートを490nmで読み取る。生のO.D.読取値を用いて、
(試料AICC)/(標的Max−標的Spontaneous)×100
(式中、AICCは抗体非依存性細胞性細胞傷害である)として各ウェルの細胞傷害性のパーセントを算出する。Prismソフトウェアを用いて用量反応曲線を作製する。
C57Bl/6マウスにhCD16−hCD32B DARTを5mg/kgで単回静脈内注射した。投与前、2、30分;1、3、6、24、及び72時間目にマウス血清を採取した。hCD16−hCD32B DARTの血清濃度を定量した。hCD16−hCD32B DARTの薬物動態学的計算は、薬物動態用ソフトウェアパッケージWinNonlin Professional 5.1(ファーサイト社(Pharsight Corporation)製、米国)を用いて行った。パラメーターはノンコンパートメント分析(NCA)により決定した。ノンコンパートメント分析は、薬物の静脈内注射を必要とするモデル(Model 201)に基づいて行った。線形台形法を用いてパラメーターを計算した。
ELISAによる発現及び結合実験:
hCD16−hCD32B ABD−DARTを哺乳動物CHO−S細胞中で6.5mg/リットルの濃度で効率的に発現させた。各抗原に対する精製ABD−DARTタンパク質の結合活性をELISAで評価した。その結果、hCD16−hCD32B ABD−DARTが両方の抗原、すなわちCD16及びCD32Bに同時に結合することが示された(図46A)。この結合プロファイルは対照hCD16−hCD32B DARTタンパク質の結合と一致している。精製hCD16−hCD32B ABD−DARTのヒト血清アルブミン(HSA)に対する親和性もELISAにより示された(図46B)。この結果は、ABD融合DARTのHSAへの強力な結合を示しており、一方、対照hCD16−hCD32B DARTでは結合は観察されなかった。ABD−DART分子がCD32B、CD16A、及びHSAに同時に結合できることを示すために、HSAを固定化した表面にABD−DARTを注入し、次いで200nM CD32B及び200nM CD16A(F158)を注入した(図46C、実線)。対照実験では(図46C、破線)、抗原の代わりにバッファーを用いた。その結果、ABD−DART分子がCD32B、CD16A、及びHSAに同時に結合できることが示された。
1つがエフェクター細胞上、1つが標的細胞上にある2つの抗原へのこの二特異性ABD−DARTの同時結合を実証するために、再標的化細胞殺作用アッセイを行った。ヒトPBMCをエフェクター細胞として用いて、hCD16−hCD32B ABD−DARTで、CD32B陽性B細胞系Daudiに対して強力且つ用量依存的な細胞傷害性を誘導した(図47A)。その結果、ABD−DARTの効力が親DARTと同等であることが示された。CD16×CD32B DARTは、CD16B発現エフェクター細胞に結合することができ、これにより、そのような細胞を動員してCD32Bを発現する細胞を(再標的化された殺作用により)殺すことができる。このようにして、CD16×CD32B DARTはRaji細胞に対して強力な殺を示すことが見出された(図47B)。
C57Bl/6マウスに単回i.v.注射した後の血清試料のELISAにより、hCD16−hCD32B ABD−DARTの薬物動態特性を分析した(図48)。DART及びABD−DARTタンパク質は両方とも循環中からの2相的除去を示した。ABD−DARTのPK研究により循環時間の延長が示され、終末半減期は通常のDARTの1.2時間と比べて35.1時間に延長されていた(図48、表17)。薬物動態特性の改善は曲線下面積(AUC)の比較でも示された。コンストラクトABD−DARTでは、ABDとの融合後にAUCがほぼ30倍に増大した(表17)。
hCD16−hCD32B ABD−DARTがインビボで生物学的活性を保持していることを実証するために、ABD−DART又はその親DARTをTg(mCD16−/−hCD16A+32B+)マウスに単回投与し、B細胞、T細胞、及びPM細胞の濃度をモニタリングした。結果は、DARTがB細胞の濃度を抑制できることを示しており(図49A)、これはDARTがマウス循環中から除去されるまでインビボでB細胞へと再標的化された標的化殺作用が達成されたことを示していると解釈される。T細胞(図49B)及びPM細胞(図49C)の濃度はDARTにより抑制されず、DARTの特異性が確認された。
Her2/neu及びT細胞受容体(「TCR」)に結合できる可変領域を含むIgDARTダイアボディを構築した。
TCRVL−HER2VHアミノ酸配列(配列番号315)
TCRVL−HER2VH−Eコイルアミノ酸配列(配列番号319)
前述の通り、本発明のDART分子は、ハプテンであるフルオレセインに対する親和性と同様にNKG2D受容体に二特異性結合を示すようにデザインして、NKG2D受容体をフルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とコライゲートさせることができる万能アダプターとして機能するようにすることができる。ABDの使用を更に示すために、以下のポリペプチド鎖を用いてDARTを構築した:
(1)KYK2VL−4420VH−GFNRGEC(配列番号313)−Eコイル:このポリペプチドは前述のKYK2.0抗体のVLドメイン(Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156及び国際出願第PCT/US09/54911号)及び前述の抗フルオレセインMAb4420のVHドメインを用いて構築した。
(2)4420VL−KYK2VH−GVEPKSC(配列番号314):このポリペプチドは、前述の抗フルオレセインMAb4420のVLドメイン及びKYK2.0抗体のVHドメインを用いて構築した。「Eコイル」は、EVAALEKの4回リピートのEコイルアミノ酸配列(配列番号299)を表す。
前述の通り、本発明のDART分子は、アルブミン結合ドメイン(ABD)、例えばストレプトコッカスプロテインGのABD、より好ましくはストレプトコッカスG148株のプロテインGのアルブミン結合ドメイン3(ABD3)を含むようにデザインすることができる。
特にV71位における変異体(例えば、V71A)を含むABD変異体が免疫原性の低下を示す。そのような脱免疫化を実証するために、EpiScreen(商標)タイムコースT細胞アッセイを用いて3つのペプチド試料の潜在的免疫原性を評価した。以下の試料を評価した:
・野生型ABDペプチド(配列番号304):
前述の通り、DARTのインビボ薬物動態特性を改善するために、ストレプトコッカスプロテインGのアルブミン結合ドメイン(ABD)をDARTのC末端(抗原結合部位から離れている)に融合した(「ABD−DART」)。そのようなABD−DARTの薬物動態学的研究により循環時間の延長が示され、終末半減期が通常のDART(ABDを欠く)の1.2時間と比べて35.1時間に延長されていた。イン・シリコ分析により、ABD配列中にMHCクラスII結合ポテンシャルの高い5個のp1アンカー部位があることが明らかとなった。脱免疫化型のABDを作製するために、イン・シリコ分析により得られた予測に基づいて部位特異的変異を行った。複数ラウンドの単一及び組合せ変異の後、血清アルブミンとの親和性が野生型ABDと同様であるかそれより低い2つのABD変異体、「ABD(AAA)」及び「ABD(DSA)」が得られた。
L64A/I65A/V71A(「ABD(AAA)」)(配列番号328):
N66D/T70S/V71A(「ABD(DSA)」)(配列番号329):
両方の鎖の末端にABDを融合することにより(図64A)又は1つの鎖の末端にタンデムABDを融合することにより(図64B)、異なるABD DARTタンパク質を構築した。更に、両方の鎖のC末端にABD(AAA)を融合することにより1つのコンストラクトを作製した。この研究では、血清半減期を比較するためにhCD16×hCD32B Fc DARTを作製した。全てのABD変異体が抗原の両方に二特異的結合を示した(図65)。これらABD DART及びFc DARTの全ての血清半減期を観察するために、タンパク質を5mg/kgで単回IV注射したC57Bl/6マウスにおいてインビボPK研究を行った。その結果、ABDの半減期延長特性がアルブミン結合価の影響を受けることが示された(図66)。2つのABDと融合したDARTの終末半減期は、予想されなかったことに、ABDが1個のDARTの3倍であった(表28)。
Claims (27)
- 血清アルブミンに結合できる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含むポリペプチドであって、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、配列番号304に示されるアミノ酸配列を有するストレプトコッカスのプロテインGの野生型アルブミン結合ドメイン(ABD)の変異体であり、前記変異体ABDが次のいずれかの変異を含むことにより配列番号304とは異なるアミノ酸配列を有しており、
(A)ABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、前記ABDの71位における変異位置が、配列番号304の31位である変異
(B)ABDの64位におけるロイシンからアラニンへの変異、ABDの65位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのABDの64位、65位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304の24位、25位、及び31位である変異、又は
(C)ABDの66位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ABDの70位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのABDの66位、70位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304の26位、30位及び31位である変異
前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を有さない場合の前記ポリペプチドの血清半減期と比べて前記ポリペプチドの血清半減期を延長する、ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、更なる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含み、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分がどちらも前記血清アルブミンに結合できる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記変異体ABDが、ABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、前記ABDの71位における変異位置が、配列番号304における31位である、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記変異体ABDが、ABDの64位におけるロイシンからアラニンへの変異、ABDの65位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、これらのABDの64位、65位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304における24位、25位及び31位である、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記変異体ABDが、ABDの66位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ABDの70位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異を含み、これらのABDの66位、70位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304における26位、30位及び31位である、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記変異体ABDが、配列番号326、配列番号327、配列番号328、又は配列番号329のアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが抗原結合分子を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合分子が、互いに相互作用して2つの抗原結合部位を形成する少なくとも第1及び第2のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディであって、前記ポリペプチド鎖の少なくとも1つが、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記ダイアボディの前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖の両方が、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項8に記載のポリペプチド。
- 前記ダイアボディの前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖が互いに共有結合により連結されている、請求項8又は9に記載のポリペプチド。
- 前記ダイアボディが、
(A)ナチュラルキラー群2D(NKG2D)受容体又はT細胞受容体(TCR);及び
(B)腫瘍関連抗原
に結合する、請求項8〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記抗原結合分子が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記ダイアボディが、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する抗原結合部位を有する、請求項8〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 共有結合により連結されたポリペプチドの血清半減期を延長する、血清アルブミンに結合できる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分であるポリペプチドの使用であって、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分が、配列番号304に示されるアミノ酸配列を有するストレプトコッカスのプロテインGの野生型アルブミン結合ドメイン(ABD)の変異体であり、前記変異体ABDが次のいずれかの変異を含むことにより配列番号304とは異なるアミノ酸配列を有しており、
(A)ABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、前記ABDの71位における変異位置が、配列番号304の31位である変異
(B)ABDの64位におけるロイシンからアラニンへの変異、ABDの65位におけるイソロイシンからアラニンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのABDの64位、65位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304の24位、25位、及び31位である変異、又は
(C)ABDの66位におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異、ABDの70位におけるスレオニンからセリンへの変異、及びABDの71位におけるバリンからアラニンへの変異であって、これらのABDの66位、70位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304の26位、30位及び31位である変異
前記血清半減期の延長が、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を有さない場合の前記共有結合により連結されたポリペプチドの血清半減期との比較によるものである、使用。 - 前記ポリペプチドが、更なる脱免疫化アルブミン結合タンパク質の部分を含み、前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分の両方が前記血清アルブミンに結合できる、請求項14に記載のポリペプチドの使用。
- 前記変異体ABDが、ABDの71位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、前記ABDの71位における変異位置が、配列番号304における31位である、請求項14又は15に記載のポリペプチドの使用。
- 前記変異体ABDが、ABDの64位における前記ロイシンからアラニンへの変異、ABDの65位における前記イソロイシンからアラニンへの変異、及びABDの71位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、これらのABDの64位、65位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304における24位、25位及び31位である、請求項14又は15に記載のポリペプチドの使用。
- 前記変異体ABDが、ABDの66位における前記アスパラギンからアスパラギン酸への変異、ABDの70位における前記スレオニンからセリンへの変異、及びABDの71位における前記バリンからアラニンへの変異を含み、これらのABDの66位、70位及び71位における変異位置が、それぞれ配列番号304における26位、30位及び31位である、請求項14又は15に記載のポリペプチドの使用。
- 前記変異体ABDが、配列番号326、配列番号327、配列番号328、又は配列番号329のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載のポリペプチドの使用。
- 前記ポリペプチドが抗原結合分子を含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 前記抗原結合分子が、互いに相互作用して2つの抗原結合部位を形成する少なくとも第1及び第2のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディであって、前記ポリペプチド鎖の少なくとも1つが、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項20に記載のポリペプチドの使用。
- 前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖の両方が、前記血清アルブミンに結合できる前記脱免疫化アルブミン結合タンパク質の前記部分を含む、請求項21に記載のポリペプチドの使用。
- 前記ダイアボディの前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖が互いに共有結合により連結されている、請求項21又は22に記載のポリペプチドの使用。
- 前記ダイアボディが、
(A)ナチュラルキラー群2D(NKG2D)受容体又はT細胞受容体(TCR);及び
(B)腫瘍関連抗原
に結合する、請求項21〜23のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。 - 前記抗原結合分子が、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する、請求項20に記載のポリペプチドの使用。
- 前記ダイアボディが、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸部癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ球性白血病に関連する抗原に結合する抗原結合部位を有する、請求項21〜24のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬剤的に許容できる担体とを含む組成物。
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