TWI773646B - 結合lag-3的分子和其使用方法 - Google Patents
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- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Abstract
本發明涉及抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5和LAG-3 mAb 6,以及涉及這類抗體的人源化和嵌合形式。本發明另外涉及結合LAG-3的分子,其包括這類抗LAG-3抗體的結合LAG-3的片段、免疫連接物,並且涉及包括(i)這類結合LAG-3的片段,和(ii)能夠結合參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位元的結構域的雙特異性分子,包括雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等。本發明也涉及檢測LAG-3的方法,以及使用結合LAG-3的分子用於刺激免疫應答的方法。
Description
相關申請的交叉引用
本申請要求美國專利申請系列號62/255,094(2015年11月13日提交;待決)和62/172,277(2015年6月8日提交;待決)的優先權,每一篇專利申請通過引用以其整體併入本文。
序列表的引用
根據37 C.F.R.1.821以及下面的條款,本申請包括一個或多個序列表,其以電腦可讀的介質公開(檔案名:1301_0121PCT_Sequence_Listing_ST25.txt,2016年5月18日創建,大小為105,774位元組),該檔通過引用以其整體併入本文。
本發明涉及結合LAG-3的分子(LAG-3結合分子),其包括選擇的抗LAG-3抗體:LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的結合LAG-3的結構域(LAG-3結合結構域),所述抗LAG-3抗體能夠結合至食蟹猴(cynomolgus monkey)LAG-3和結合至人LAG-3。本發明尤其涉及這樣的結合LAG-3的分子:其是這類抗體的人源化或嵌合形式或其包括這類抗LAG-3抗體(尤其是免疫連接物、雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等)的結合LAG-3的片段(LAG-3結合片段)。本發明尤其涉及這樣的結合LAG-3的分子:其還能夠結合參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類結合LAG-3的分子檢測LAG-3或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法的方法,其中包括這類選擇的抗LAG-3抗體的一個或多個LAG-3-結合結構域的結合LAG-3的分子與有效刺激免疫應答的一種或
多種另外的分子組合施用,從而進一步增強、刺激或上調受試者中這樣的免疫應答。
I.細胞介導的免疫應答
人和其他哺乳動物的免疫系統負責提供抗感染和疾病的保護。這類保護通過體液免疫應答和細胞介導的免疫應答兩者提供。體液應答導致產生抗體和能夠識別和中和外源靶(抗原)的其他生物分子。相比之下,細胞介導的免疫應答涉及通過T細胞啟動巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)和抗原特異性細胞毒性T-淋巴細胞,和回應抗原的識別而釋放各種細胞因子(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48)。
T細胞最佳介導針對抗原的免疫應答的能力需要兩種不同的信號傳導相互作用(Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675;Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。首先,已經排列在抗原呈遞細胞(APC)的表面上的抗原必須被呈遞至抗原特異性幼稚(naïve)CD4+ T細胞。這類呈遞經T細胞受體(TCR)遞送信號,所述T細胞受體引導T細胞啟動對呈遞的抗原特異性的免疫應答。第二,通過APC和不同的T細胞表面分子之間的相互作用介導的一系列共刺激和抑制信號,首先引發T細胞的啟動和增殖,並最終引發它們的抑制。因此,第一信號為免疫應答提供特異性,而第二信號用於確定應答的性質、量級(magnitude)和持續時間。
免疫系統受共刺激和共抑制配體和受體的嚴格控制。這些分子為T細胞啟動提供第二信號,並且提供正信號和負信號的平衡網路,以使針對感染的免疫應答最大化,同時限制對自身的免疫性(Wang,L.等(2011)“VISTA,A
Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses,”J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16;Lepenies,B.等(2008)“The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,”Endocrine,Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets 8:279-288)。對於保持自身耐受性和調節免疫應答的持續時間和幅度(amplitude)關鍵的抑制途徑統稱為免疫檢查點(immune checkpoint)。尤其重要的是抗原呈遞細胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配體和CD4+ T-淋巴細胞的CD28和CTLA-4受體之間的結合(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126;Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48;Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T細胞啟動;B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這類啟動(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48;Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321;Greenwald,R.J.等(2005)“The B7 Family Revisited,”Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T細胞的表面上組成型表達(Gross,J.,等(1992)“Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse,”J.Immunol.149:380-388),而CTLA-4表達在T細胞啟動之後快速上調(Linsley,P.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535-543)。因為CTLA-4是較高親和力的受體(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126),結合首先啟動T細胞增殖(經CD28),然後抑制它(經CTLA-4的初期表達),從而當不再需要增殖時,抑制該作用。
對CD28受體的配體的進一步研究已經導致鑒定和表徵了一組相關的B7分子(“B7超家族”)(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126;Greenwald,R.J.等(2005)“The B7 Family Revisited,”Ann.Rev.Immunol.23:515-548;Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7;Loke,P.等(2004)“Emerging Mechanisms Of Immune Regulation:The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells.”Arthritis Res.Ther.6:208-214;Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339;Flies,D.B.等(2007)“The New B7s:Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3):251-260;Agarwal,A.等(2008)“The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,”Curr.Opin.Organ Transplant.13:366-372;Wang,S.等(2004)“Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,”Microbes Infect.6:759-766)。目前存在若干已知的家族成員:B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導的共刺激物配體(ICOS-L)、程式化死亡-1配體(PD-L1;B7-H1)、程式化死亡-2配體(PD-L2;B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6(Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7;Flajnik,M.F.等(2012)“Evolution Of The B7 Family:Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30,Identification Of A New B7 Family Member,B7H7,And Of B7’s Historical Relationship With The MHC,”Immunogenetics 64(8):571-90)。
II.淋巴细胞激活基因-3(“LAG-3”)
淋巴細胞啟動基因3編碼細胞表面受體蛋白,其稱為“LAG-3”或CD223(Triebel,F.等(1990)“LAG-3,A Novel Lymphocyte Activation Gene
Closely Related To CD4,”J.Exp.Med.171(5):1393-1405)。LAG-3通過啟動的CD4+和CD8+ T細胞和通過NK細胞被表達,並且通過漿細胞樣樹突細胞組成型表達。LAG-3不被B細胞、單核細胞或測試的任何其他細胞類型表達(Workman,C.J.等(2009)“LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891)。
已經發現LAG-3與T細胞共受體CD4密切相關(Triebel,F.等(1990)“LAG-3,A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4,”J.Exp.Med.171(5):1393-1405;Grosso,J.F.等(2009)“Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells,”J.Immunol.182(11):6659-6669;Huang,C.T.等(2004)“Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells,”Immunity 21:503-513;Workman,C.J.等(2009)“LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891)。如CD4,LAG-3也結合II類MHC分子,但是以明顯更高的親和力結合II類MHC分子(Workman,C.J.等(2002)“Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein,CD223(LAG-3),”Eur.J.Immunol.32:2255-2263;Huard,B.等(1995)“CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4- And Lymphocyte Activation Gene-3(LAG-3)-Ig Fusion Proteins,”Eur.J.Immunol.25:2718-2721;Huard,B.等(1994)“Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3- Encoded Protein,An MHC Class II Ligand,”Immunogenetics 39:213-217)。
研究已經顯示LAG-3在負調節T細胞增殖、功能和穩態中起到重要的作用(Workman,C.J.等(2009)“LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis,”J.Immunol.182(4):1885-1891;Workman,C.J.等(2002)“Cutting Edge:Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte
Activation Gene-3,”J.Immunol.169:5392-5395;Workman,C.J.等(2003)“The CD4-Related Molecule,LAG-3(CD223),Regulates The Expansion Of Activated T-Cells,”Eur.J.Immunol.33:970-979;Workman,C.J.(2005)“Negative Regulation Of T-Cell Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3(CD223),”J.Immunol.174:688-695;Hannier,S.等(1998)“CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling,”J.Immunol.161:4058-4065;Huard,B.等(1994)“Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4+ T Lymphocytes,”Eur.J.Immunol.24:3216-3221)。
研究已經提示通過抗體阻斷抑制LAG-3功能可逆轉LAG-3-介導的免疫系統抑制和部分恢復效應子功能(Grosso,J.F.等(2009)“Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells,”J.Immunol.182(11):6659-6669;Grosso,J.F.等(2007)“LAG-3 Regulates CD8+ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance,”J.Clin.Invest.117:3383-3392)。已經發現LAG-3經抑制TCR-誘導的鈣流負調節T細胞擴展(expansion),並且控制記憶T細胞庫的大小(Matsuzaki,J.等(2010)“Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8+ T-Cells Are Negatively Regulated By LAG-3 and PD-1 In Human Ovarian Cancer,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)107(17):7875-7880;Workman C.J.,等(2004)“Lymphocyte Activation Gene-3(CD223)Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo,”J.Immunol.172:5450-5455)。
然而,儘管所有這些現有技術的進步,仍需要改善的組合物,其能夠更有力地引導身體的免疫系統攻擊癌細胞或病原體感染的細胞,尤其以較低的治療性濃度。儘管適應性免疫系統可以是抵抗癌症和疾病的有力防禦機
制,但是其經常在腫瘤微環境中受到免疫抑制機制的阻礙,比如LAG-3的表達。此外,在腫瘤環境(milieu)中由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可明顯減弱針對癌細胞的T-細胞應答。因此,仍需要有效的結合LAG-3的分子。尤其,需要這樣的結合LAG-3的分子:其具有期望的結合動力學特點,結合不同的LAG-3表位和/或展示單劑活性,其可為遭受癌症或其他疾病和病況的患者提供改善的治療價值。本發明涉及這些和其他目標。
本發明涉及結合LAG-3的分子,其包括選自抗LAG-3抗體:LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的LAG-3-結合結構域,所述結合LAG-3的分子能夠結合食蟹猴LAG-3和人LAG-3。本發明尤其涉及這類結合LAG-3的分子,其是這類抗體的人源化或嵌合形式或其包括這類抗LAG-3抗體的結合LAG-3的片段(尤其是免疫連接物、雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等)。本發明尤其涉及這類結合LAG-3的分子:其還能夠結合參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類結合LAG-3的分子檢測LAG-3或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法的方法,其中包括這類選擇的抗LAG-3抗體的一個或多個LAG-3-結合結構域的結合LAG-3的分子與有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子組合施用,從而進一步增強、刺激或上調受試者中這類免疫應答。
具體地,本發明提供了結合LAG-3的分子,其能夠結合至人LAG-3和結合至食蟹猴LAG-3,其中所述結合LAG-3的分子包括三個重鏈CDR結構域、CDRH1、CDRH2和CDRH3,和三個輕鏈CDR結構域、CDRL1、CDRL2和CDRL3,其中:
(A)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 1的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 1的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15;或(B)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是hLAG-3 mAb 1的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是hLAG-3 mAb 1的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15;或(C)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 2的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 2的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38;或(D)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 3的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43;和
(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 3的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48;或(E)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 4的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 4的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58;或(F)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 5的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 5的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68;或(G)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 mAb 6 VH1的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是LAG-3 mAb 6的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78;
或(H)(1)CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域是LAG-3 hAb 6的重鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73;和(2)CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域是hLAG-3 hAb 6的輕鏈CDR,並且分別具有氨基酸序列:SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。
本發明進一步涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中重鏈可變結構域具有:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中輕鏈可變結構域具有:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中重鏈可變結構域具有:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中輕鏈可變結構域具有:SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
本發明進一步涉及所有這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中分子是抗體,尤其地,其中分子是嵌合抗體或人源化抗體。
本發明進一步涉及其中結合LAG-3的分子是能夠同時結合至人LAG-3和結合至第二表位的雙特異性結合分子的實施方式,並且尤其涉及其中第二表位是參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位元的實施
方式(尤其地,其中第二表位是下述的表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA,和最具體而言,其中第二表位是下述的表位:CD137、OX40、PD-1、TIGIT或TIM-3)。
本發明進一步涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中分子是雙抗體,尤其地,其中雙抗體是共價鍵合的(covalently bonded)複合物,其包括兩條或三條或四條或五條,或大於五條多肽鏈。本發明進一步涉及這類結合抗-LAG-3的分子的實施方式,其中分子是三價結合分子,所述三價結合分子是共價鍵合的複合物,其包括三條、四條、五條或更多條多肽鏈。本發明另外涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中分子包括Fc區。本發明另外涉及這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中分子包括結合白蛋白的結構域(白蛋白結合結構域),尤其是去免疫化的結合白蛋白的結構域。
本發明進一步涉及所有這類結合LAG-3的分子的實施方式,其中分子包括Fc(可結晶部分)區,和其中Fc區是變異的Fc區,其包括一個或多個氨基酸修飾,所述氨基酸修飾減少變異的Fc區對Fc γ R的親和力和/或增強血清半衰期,更具體地,其中修飾包括至少一種氨基酸取代,所述氨基酸取代選自:(1)L234A;(2)L235A;(3)L234A和L235A;(4)M252Y;M252Y和S254T;(5)M252Y和T256E;(6)M252Y、S254T和T256E;或
(7)K288D和H435K;其中編號是根據Kabat的EU索引的編號。
本發明進一步涉及其中任何上述結合LAG-3的分子被用於刺激T細胞介導免疫應答的實施方式。本發明另外涉及其中任何上述結合LAG-3的分子被用於治療與被抑制的免疫系統相關的疾病或病況,尤其是癌症或感染的實施方式。
本發明尤其涉及癌症的治療或診斷或預後的這類用途,其中癌症的特徵在於存在選自由以下的細胞組成的組的癌症細胞:腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤(posterious uveal melanoma)、罕見血液疾病、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
本發明尤其涉及癌症的治療或診斷或預後的這類用途,其中癌症是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤;肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直
腸癌、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、急性漿細胞樣樹突細胞瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL),包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
本發明進一步涉及其中任何上述結合LAG-3的分子被可檢測地標記並且用於檢測LAG-3的實施方式。
圖1提供了具有兩個表位-結合位點的代表性共價鍵合的雙抗體的示意圖,所述雙抗體由兩條多肽鏈組成,每條鏈具有E螺旋或K螺旋異源二聚體-促進結構域。半胱氨酸殘基可存在於連接體和/或異源二聚體-促進結構域中,如圖3B中所顯示。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充式樣顯示。
圖2提供了具有兩個表位-結合位點的代表性共價鍵合的雙抗體分子的示意圖,所述雙抗體分子由兩條多肽鏈組成,每條鏈具有CH2和CH3結構域,以便締合的鏈形成所有或部分Fc區。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。
圖3A-3C提供了顯示具有四個表位元-結合位點的代表性四價雙抗體的示意圖,所述雙抗體由兩對多肽鏈組成(即,總共四條多肽鏈)。每對多肽鏈的一條多肽具有CH2和CH3結構域,以便締合的鏈形成所有或部分Fc區。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。兩對多肽鏈可以相同。在其中VL和VH結構域識別不同的表位元的這類實施方式中(如圖3A-3C中顯示),所得分子具有四個表位-結合位點,並且相對於每個結合的表位而言,是雙
特異性的和二價的。在其中VL和VH結構域識別相同表位元的這類實施方式中(例如,在兩條鏈上使用相同的VL結構域CDR和相同的VH結構域CDR),所得分子具有四個表位-結合位點,並且相對於單表位而言,是單特異性的和四價的。可選地,兩對多肽可以不同。在其中每對多肽的VL和VH結構域識別不同表位元的這類實施方式中(如圖3C中顯示),所得分子具有四個表位-結合位點,並且相對於每個結合的表位而言,是四特異性的和單價的。圖3A顯示包含肽異源二聚體-促進結構域的Fc雙抗體,所述肽異源二聚體-促進結構域包括半胱氨酸殘基。圖3B顯示包含Fc區的雙抗體,其包含E螺旋和K螺旋異源二聚體-促進結構域,所述異源二聚體-促進結構域包括半胱氨酸殘基和連接體(具有任選的半胱氨酸殘基)。圖3C顯示了包含Fc區的雙抗體,其包含抗體CH1和CL結構域。
圖4A和4B提供了具有兩個表位-結合位點的代表性共價鍵合的雙抗體分子的示意圖,所述雙抗體分子由三條多肽鏈組成。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域,以便締合的鏈形成所有或部分Fc區。包括VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體-促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。
圖5提供了具有四個表位-結合位點的代表性共價鍵合的雙抗體分子的示意圖,所述雙抗體分子由五條多肽鏈組成。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域,以便締合的鏈形成包括所有或部分Fc區的Fc區。包括連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體-促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。
圖6A-6F提供了具有三個表位-結合位點的代表性的、包含Fc區的三價結合分子的示意圖。圖6A和6B分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域,其包括具有不同結構域取向的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域,其中雙抗體型結合結構域在Fc區的N-末端或C-末端。圖6A和6B中的分子包括四條
鏈。圖6C和6D分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域,其包括在Fc區的N-末端的兩個雙抗體型結合結構域,和其中輕鏈和重鏈經多肽連接體間隔物連接的Fab型結合結構域,或scFv型結合結構域。圖6E和6F中的三價結合分子分別示意性闡釋了三價結合分子的結構域,其包括在Fc區的C-末端的兩個雙抗體型結合結構域,和連接的Fab型結合結構域或scFv型結合結構域,其中雙抗體型結合結構域是。圖6C-6F中的三價結合分子包括三條鏈。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同陰影或填充式樣顯示。
圖7A-7C顯示LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6與食蟹猴LAG-3的結合特徵。hLAG-3 mAb 6(1.1)(圖7A)、hLAG-3 mAb 1(1.4)(圖7B)和LAG-3 mAb A(圖7C)的Biacore結合曲線表明hLAG-3 mAb 6(1.1)展示與食蟹猴LAG-3更好的結合(RU;回應單元)。
圖8A-8C顯示LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6結合與參考抗體LAG 3 mAb結合的表位不同的表位。標記的LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 6和LAG-3 mAb A在沒有競爭抗體的情況下的結合曲線(圖8A),在存在過多LAG-3 mAb 1(圖8B)、過多LAG-3 mAb 6(圖8C)或LAG-3 mAb A(圖8D)的情況下的結合曲線(RU;回應單元)。
圖9A-9B顯示分離的抗體抑制可溶性人LAG-3(shLAG-3)與II類MHC的結合,如在ELISA試驗中測定的。圖9A顯示了LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4,和LAG-3 mAb 5的抑制曲線。圖9B顯示了LAG-3 mAb A、人源化的hLAG-3 1(1.4)和hLAG-3 6(1.1)的抑制曲線(RLU;相對發光單元)。
圖10A-10C顯示了分離的抗體抑制shLAG-3結合至表達Daudi細胞的II類MHC的表面。圖10A顯示了LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5和參考抗體LAG-3 mAb A的抑制曲線。圖10B
顯示了LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 6和LAG-3 mAb A的抑制曲線。圖10C顯示了LAG-3 mAb 1和人源化的hLAG-3 1(1.4)、hLAG-3 1(1.2)、hLAG-3 1(2.2)、hLAG-3 1(1.1)的抑制曲線。每個圖表示單獨的實驗;MFI,平均螢光強度。
圖11A-11C顯示了在刺激的CD4+ T細胞中LAG-3的表達被上調。在第11和14天,分別對來自兩個不同供體(圖11B和11C)的未刺激的CD4+ T細胞(圖11A)和CD3/CD28珠刺激的CD4+ T細胞的LAG-3表達的流式細胞術分析。所有的細胞與抗CD4抗體共染色。
圖12(圖A-F)顯示分離的抗LAG-3抗體結合刺激的T細胞但是不結合未刺激的T細胞。對標記以LAG-3 mAb 1(圖A和D)、LAG-3 mAb 2(圖B和E)或LAG-3 mAb 3(圖C和F)的CD3/CD28刺激的CD4+ T細胞(圖A-C)和未刺激的CD4+ T細胞(圖D-F)的流式細胞術分析。所有的細胞與抗CD4抗體共染色。
圖13(圖A-D)顯示分離的抗LAG-3抗體結合刺激的T細胞但是不結合未刺激的T細胞。標記以LAG-3 mAb 4(圖A和C)或LAG-3 mAb 5(圖B和D)的CD3/CD28刺激的CD4+ T細胞(圖A-B)和未刺激的CD4+ T細胞(圖C-D)的流式細胞術分析。所有的細胞與抗CD4抗體共染色。
圖14(圖A-D)顯示了LAG-3和PD-1的表達在來自代表性供體D:34765的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)腸毒素B型抗原(SEB)-刺激的外周血液單核細胞(PBMC)上被上調。在標記以抗LAG-3/抗CD3抗體(圖A)或抗PD-1/抗CD3抗體(圖B)的初次刺激(圖A-B)之後48小時,來自代表性供體的SEB-刺激的PBMC的流式細胞術分析,和在二次刺激期間在用SEB單獨(圖C)或用同種型對照抗體(圖D)處理的SEB-刺激(圖C-D)細胞後第5天,標記以抗LAG-3/抗PD-1抗體的流式細胞術分析。
圖15(圖A-D)顯示了LAG-3和PD-1的表達在來自另一代表性供體D:53724的SEB-刺激的PBMC上被上調。在標記以抗LAG-3/抗CD3抗體(圖A)
或抗PD-1/抗CD3抗體(圖B)的初次刺激(圖A-B)之後48小時和標記以抗LAG-3/抗PD-1抗體在單獨用SEB(圖C)或用同種型對照抗體(圖D)處理的SEB-刺激的(圖C-D)細胞之後第5天,來自代表性供體的SEB-刺激的PBMC的流式細胞術分析。
圖16A-16B顯示LAG-3 mAb 1能夠刺激細胞因子產生至與用抗PD-1抗體處理相當的水準。來自用抗LAG-3或抗PD-1抗體處理的SEB-刺激的PBMC的IFN γ(圖16A)和TNF α(圖16B)分泌特徵。
圖17顯示了LAG-3 mAb 1能夠刺激細胞因子產生至與用抗PD-1抗體處理相當的水準,並且用LAG-3 mAb 1聯合抗PD-1處理為細胞因子釋放提供最大的增強。來自用抗LAG-3和抗PD-1抗體單獨和組合處理的SEB-刺激的PBMC的IFN γ分泌特徵。
圖18A-18B顯示了抗LAG-3抗體hLAG-3 mAb 6(1.1)和LAG-3 mAb結合在來自兩個供體的SEB刺激的食蟹猴PBMC上表達的內源LAG-3(圖18A和18B)。包括抗PD-1抗體PD-1 mAb A作為SEB刺激的陽性對照。
本發明涉及結合LAG-3的分子,其包括選擇的抗LAG-3抗體:LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的LAG-3-結合結構域,所述結合LAG-3的分子能夠結合至食蟹猴LAG-3和結合至人LAG-3。本發明尤其涉及這樣的結合LAG-3的分子:其是這類抗體的人源化或嵌合形式,或其包括這類抗LAG-3抗體的結合LAG-3的片段(尤其是免疫連接物、雙抗體、BiTE、雙特異性抗體等)。本發明尤其涉及這類結合LAG-3的分子,其還能夠結合參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位。本發明也涉及使用這類結合LAG-3的分子檢測LAG-3或刺激免疫應答的方法。本發明也涉及聯合療法的方法,其中包括這類選擇的抗LAG-3抗體的一
個或多個LAG-3-結合結構域的結合LAG-3的分子與有效刺激免疫應答的一種或多種另外的分子組合施用,從而進一步增強、刺激或上調受試者中這類免疫應答。
I.抗體和它們的結合結構域
本發明的抗體是免疫球蛋白分子,其能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一個表位識別位點免疫特異性結合至靶,比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。
如本文所使用,術語“抗體”指免疫球蛋白分子,由於在多肽或蛋白質或非蛋白質分子上存在特定的結構域或部分或構象(“表位”),其能夠免疫特異性結合這類分子。包含表位的分子可具有免疫原活性,使得其在動物中引起抗體產生應答;這類分子稱為“抗原”)。包含表位的分子不一定是免疫原性的。
本發明的結合結構域以“免疫特異性”方式結合表位元。如本文所使用,如果抗體、雙抗體或其他表位結合分子相對於可選的表位,與另一分子的區域(即,表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合,則認為抗體、雙抗體或其他表位結合分子“免疫特異性”結合該表位(或展示與該表位的“特異性”結合)。例如,特異性結合LAG-3表位的抗體是與其結合其他LAG-3表位或結合非LAG-3表位相比,以更大的親和力、親合力(avidity)、更容易,和/或以更長的持久性,結合這類LAG-3表位的抗體。通過閱讀該定義,應理解,例如,免疫特異性結合第一靶的抗體(或部分或表位元)可特異性或非特異性或優選或非優選結合第二靶。因此,“免疫特異性結合”不必要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言,但不是必要的,提及結合意思是“特異性”結合。如果兩個分子的結合展示受體結合它們各自配體的特異性,則認
為兩個分子能夠彼此以“物理特異性”方式結合。抗體結合免疫特異性結合表位的能力可通過例如,免疫試驗測定。
天然抗體(比如IgG抗體)由兩條輕鏈複合兩條重鏈組成。每條輕鏈包含可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)。每條重鏈包含可變結構域(VH),三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3),和位於CH1和CH2結構域之間的“鉸鏈”結構域(“H”)。因此天然產生的免疫球蛋白(例如,IgG)的基本結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體,通常作為約150,000Da的糖蛋白被表達。每條鏈的氨基端(“N-末端”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基端(“C-末端”)部分限定了恒定區,其中輕鏈具有單個恒定結構域而重鏈通常具有三個恒定結構域和鉸鏈結構域。因此,IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c並且IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用,尤其地,其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體的兩個表位結合位點之一。天然抗體能夠結合僅僅一個表位種類(即,它們是單特異性的),儘管它們可結合該種類的多個拷貝(即,展示二價或多價)。IgG分子的可變結構域由互補決定區(CDR)和稱為框架區段(FR)的非CDR區段組成,所述互補決定區(CDR)包含與表位接觸的殘基,所述框架區段一般維持結構和決定CDR環的定位,以便允許這類接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此,VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域。類似地,是(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域。因此,術語CDRL1結構域、CDRL2結構域、CDRL3結構域、CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3
結構域指當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合特異性表位的多肽,無論這樣的蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如,scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。因此,如本文所使用,術語“表位元結合結構域”指負責這樣的分子免疫特異性結合表位的能力的表位元結合分子的部分。表位結合片段可包含這樣的抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR結構域,並且,儘管能夠免疫特異性結合這樣的表位,但可展示對與這樣的抗體的表位不同的這樣的表位的免疫特異性、親和力或選擇性。然而,優選地,表位結合片段包含這樣的抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單多肽鏈(例如,scFv)或可包括兩條或更多條多肽鏈,每條具有氨基末端和羧基末端(例如,雙抗體、Fab片段、F(ab')2片段等)。
如本文所使用,術語“抗體”包括單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、特異性結合抗原等的免疫活性抗體片段(例如,能夠結合表位的抗體片段,例如,Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、包含VL和/或VH結構域或包含這樣的VL結構域的1、2或3個互補決定區(CDR)(即,CDRL1、CDRL2和/或CDRL3)或VH結構域的1、2或3個互補決定區(CDR)(即,CDRH1、CDRH2和/或CDRH3))的片段)、雙功能或多功能抗體、二硫鍵連接的雙特異性Fvs(sdFv)、胞內抗體和雙抗體和任何上述的表位結合片段。尤其地,術語“抗體”旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即,包含表位-結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY),類別(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類別(見,例如,美國專利公開號:20040185045、20050037000、20050064514、20050215767、20070004909、20070036799、20070077246和20070244303)。最近數十年已經看到對抗體的治療潛能的興趣的復興,並且抗體已經成為一種主要
類型的生物技術衍生的藥物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。
本發明的抗LAG-3抗體包括抗體LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3mAb 6的人源化、嵌合或犬源化(caninized)的變體。
術語“嵌合抗體”指這樣的抗體:其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自一個物種(例如,小鼠)的抗體或抗體類別或亞類別一致或同源,而剩餘部分與另一物種(例如,人)的抗體或抗體類別或亞類別一致或同源,只要它們展示期望的生物活性。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長類源化(primatized)”抗體,其包括源自非人靈長類(例如,舊大陸猴(Old World Monkey)、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。
如本文使用的術語“單克隆抗體”指基本上同質型(homogeneous)抗體群的抗體,即,包括該群體的單個抗體是相同的,除了具有可能以較少量出現的天然產生的突變的可能抗體之外,並且如本文使用的術語“多克隆抗體”指獲得自異質型(heterogeneous)抗體群的抗體。術語“單克隆”指示抗體的特徵是基本上同質型的抗體群,並且不應該被解釋為需要通過特定方法產生抗體(例如,通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。一種可採用的方法是Kohler,G.等(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地,在小鼠、大鼠或兔子中開發單克隆抗體。通過用免疫原性量的包含期望表位的細胞、細胞提取物或蛋白質製品免疫動物產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、
蛋白質、肽、核酸或組織。在用作免疫原之前,用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如,至少24小時)。細胞它們本身或與非變性佐劑,比如Ribi組合,可用作免疫原(見,例如,Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,”ILAR J.37(3):119-125)。一般而言,當用作免疫原時,細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞,完整的細胞可允許抗原被免疫動物更好地檢測。使用變性或烈性(harsh)佐劑例如弗氏佐劑可破壞細胞,因此,其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用,諸如兩週一次或一週一次,或者可以維持在動物中的生存力這樣的方式被施用(例如,在組織重組體中)。可選地,可通過本領域已知的任何方式對現有單克隆抗體和對期望的病原性表位免疫特異性的任何其他等價抗體測序並且重組產生它們。在一個實施方式中,對這類抗體測序,然後將多核苷酸序列克隆至載體中用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可以在宿主細胞中被維持在載體中,並且,宿主細胞然後可被擴張和冷凍,用於將來應用。這類抗體的多核苷酸序列可用於遺傳操作,以產生單特異性或多特異性(例如,雙特異性、三特異性和四特異性)的本發明的分子以及親和力優化的、嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化的抗體,以改善抗體的親和力或其他特徵。
術語“scFv”指單鏈可變結構域片段。通過使用短的連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域製備scFv分子。Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了連接肽的例子,其在一個可變結構域的羧基末端和另一可變結構域的氨基末端之間橋接約3.5nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。連接體可進而被修飾用於另外的功能,比如藥物的附著或附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv,可使用自動合成儀。為了重組體產生scFv,可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適
質粒引入到適當的宿主細胞中,所述宿主細胞是真核細胞,比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞,或原核細胞,比如大腸埃希氏菌(E.coli)。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
本發明尤其包括本發明的抗LAG-3抗體的人源化變體和包括其的多特異性結合分子。術語“人源化的”抗體指一般使用重組技術製備的嵌合分子,其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。表位元結合位元點可包括融合在恒定結構域上的完整可變結構域或僅僅包括移植在可變結構域中適當的框架區上的CDRs。表位結合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定結構域,但是仍保留對外源可變區的免疫應答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一方法不僅僅關注提供源自人的恒定區,而且也修飾可變區,以便重塑它們使其盡可能地與人形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變區都包含三個CDR,側翼是四個框架區(FR),所述CDR對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力,所述框架區(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時,可通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上“重塑”或“人源化”可變區。已經報導了該方法應用於各種抗體:Sato,K.(1993)等“Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,”Cancer Res 53:851-856。Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327;Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,Science 239:1534-1536;Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization
Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783;Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134;Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185;Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology 9:266-271;Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873;Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289;和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些實施方式中,人源化抗體保存所有的CDR序列(例如,人源化的小鼠抗體,其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中,人源化抗體具有其氨基酸序列相對於初始抗體被改變的一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個或六個),其也稱為“源自”初始抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR(即,源自這類CDR,源自這類CDR氨基酸序列的認知等)。編碼抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於產生這類衍生物,並且改善這類抗體的親和力或其他特徵。使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列,同時用人抗體序列替換抗體非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化有四個大體的步驟。這些是:(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列(2)設計人源化抗體或犬源化的抗體,即,在人源化或犬源化過程期間,決定使用哪個抗體框架區(3)實際人源化或犬源化方法/技術和(4)人源化抗體的轉染和表達。見,例如,美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
本發明分子的表位結合位點可包括與恒定結構域融合的完整可變結構域或僅僅包括移植至適當框架區的這類可變結構域的互補決定區(CDR)。表位結合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定區,但是仍保留對外源可變結構域的免疫應答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一中方法不僅僅關注提供源自人的恒定區,而且也修飾可變結構域,以便重塑它們使其盡可能地與人形式接近。已知重鏈和輕鏈的可變結構域都包含三個互補決定區(CDR),側翼是四個框架區(FR),所述互補決定區(CDR)對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力,所述框架區(FR)在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時,域通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可變結構。等已經報導了該方法應用於各種抗體:Sato,K.(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327;Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536;Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783;Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134;Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185;Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,Bio/Technology 9:266-271;Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies
For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873;Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289;和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些實施方式中,人源化抗體保存所有的CDR序列(例如,人源化的小鼠抗體,其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中,人源化抗體具有相對於初始抗體序列不同的一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個或六個)。
已經描述了包括源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的許多“人源化的”抗體分子,包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恒定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見,例如,Winter等(1991)“Man-made Antibodies,”Nature 349:293-299;Lobuglio等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224(1989);Shaw等(1987)“Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,”J.Immunol.138:4534-4538,和Brown等(1987)“Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,”Cancer Res.47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物CDR,其然後與適當的人抗體恒定結構域融合(見,例如,Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327;Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536;和Jones等(1986)“Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,”Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述了由重組修飾
的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。見,例如,歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的”分子設計,以使對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化,所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法公開在以下文獻中:Daugherty等(1991)“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,”Nucl.Acids Res.19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
II. Fc γ受體(Fc γ Rs)
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用形成Fc區,其是被包括但不限於Fc γ受體(Fc γ R)的細胞Fc受體識別的結構域。如本文所使用,術語“Fc區”用於限定IgG重鏈的C-末端區。示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1):
如通過根據Kabat的EU索引編號,其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
遍及本說明書,IgG重鏈的恒定區中殘基的編號是根據Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NH1,MD(1991)(“Kabat”)的EU索引的編號,其明確通過引用併入本文。“根據Kabat的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。通過鏈中氨基酸的位置命名來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸,並且如Kabat定義的來鑒定CDR(應當理解,由Chothia,C.& Lesk,A.M.((1987)“Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,”.J.Mol.Biol.196:901-917)定義的CDRH1在之前五個殘基開始)。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列,為每個亞組鑒定了氨基酸共有序列,並且為每個氨基酸賦予殘基編號。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列中的一條,Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。用於賦予殘基編號的該方法已經成為本領域的標準並且容易鑒定在不同抗體,包括嵌合或人源化的變體中等同位置處的氨基酸。例如,在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸的等同位置。
在抗體恒定區中的許多不同位置(例如,Fc位置,包括但不限於如通過根據Kabat的EU索引編號的270、272、312、315、356和358位)已經觀察到了多態性,因此示出的序列和現有技術的序列之間可能存在輕微的差別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前,已知18個Gm同種異型:G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、
g1、c5、u、v、g5)(Lefranc,等,“The Human IgG Subclasses:Molecular Analysis Of Structure,Function And Regulation.”Pergamon,Oxford,pp.43-78(1990);Lefranc,G.等1979,Hum.Genet.:50,199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型、異同種異型或單倍型,並且不限於本文提供的序列的同種異型(allotype)、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)。此外,在一些表達體系中,CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體)可在翻譯後去除。因此,CH3結構域的C-末端殘基是本發明結合LAG-3的分子中的任選的氨基酸殘基。本發明具體考慮缺少CH3結構域的C-末端殘基的結合LAG-3的分子。本發明也具體考慮包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類構建體。
通過將Fc區連接至細胞Fc受體(FcγR)轉換啟動信號和抑制信號。導致正好相反的功能的這類連接的能力是由於不同的受體同種型之間的結構差異造成的。受體的胞質信號傳導結構域中的兩個不同的結構域--稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAMs)和基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMS)--是造成不同應答的原因。募集不同胞質酶到這些結構中控制了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA,然而,含ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯的FcγRIIA聚類用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的停泊位點,Syk激酶的啟動導致下游底物(例如,PI3K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達;其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的,並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在限定了FcγR的這種抑制性亞類。最近,確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時,FcγRIIB中的ITIM變成磷酸化的,並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域,肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的
FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使,從而防止細胞內Ca++的流入。因此,FcγRIIB的交聯抑制對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌因此被中止。
III.雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART®雙抗體
可通過產生可同時結合兩個分開的和不同的抗原(或相同抗原的不同表位)的多特異性抗體系分子和/或通過產生對於相同表位和/或抗原具有更高價(即,大於兩個結合位點)的抗體系分子而提高抗體的功能。
為了提供比天然抗體具有更高能力的分子,已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見,例如,PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565),其大部分使用連接肽,所述連接肽與其他表位結合片段(例如,scFv、VL、VH等)融合或在抗體核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或與多個表位結合片段(例如,兩個Fab片段或scFvs)融合。可選的形式使用連接肽,以將表位結合片段(例如,scFv、VL、VH等)與二聚化結構域,比如CH2-CH3結構域或可選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地,這些方法涉及折中和權衡。例如,PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了使用連接體可造成治療情形中的問題,並且教導了三特異性抗體,其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被轉變,並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127),以允許它們結合大於一種抗原。因此,在這些文檔中公開的分子用結合特異性換取了結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域,以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。文檔指出CH2結構域在介導效應子功能過程中可能僅僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗
體,其Fc區已經用另外的VL和VH結構域替換,以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體,其單個鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子,其作為單多肽鏈被合成,然後經歷蛋白酶解,以產生異源二聚化結構。因此,這些文檔中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能集團至抗體或抗體部分(例如,添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。因此,這些文檔中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
現有技術已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即,除了雙價或多價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不同於這樣的天然抗體的雙抗體的能力(見,例如,Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448;US 2004/0058400(Hollinger et al.);US 2004/0220388/WO 02/02781(Mertens等);Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94;Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672;WO 02/02781(Mertens等);Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Protein Eng.Des.Sel.17(1):21-27;Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A
Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033;Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992;Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588;Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
雙抗體的設計是基於被稱為單鏈可變結構域片段(scFv)的抗體衍生物。這樣的分子通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。連接體進而可被修飾用於另外的功能,比如藥物的附著或附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv,可使用自動合成儀。為了重組體產生scFv,可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入適當的宿主細胞中,所述宿主細胞可以是真核細胞,比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞,或原核細胞,比如大腸埃希氏菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
非單特異性雙抗體的供應提供了相對於抗體的明顯優勢,包括但不限於共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此,雙特異性雙抗體具有寬範圍的應用,包括治療和免疫診斷。在各種應用中,雙特異性在設計和工程化雙抗體方面允許大的靈活性,提供對多聚抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的導向靶向,這取決於兩個靶抗原的存在。由於其增加的價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體,為~50kDa或以下),本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald
等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。
雙抗體的雙特異性使得它們用於共連接不同的細胞,例如,將細胞毒性T細胞與腫瘤細胞交聯((Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,”Nature 314:628-631;和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305;Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。可選地,或另外,雙特異性雙抗體可用於共連接不同細胞或單個細胞表面上的受體。不同細胞和/或受體的共連接可用於調節效應子功能和/或免疫細胞信號傳導。包括表位結合位點的多特異性分子(例如,雙特異性雙抗體)可被引導至在T淋巴細胞、天然殺傷細胞(NK)細胞、抗原呈遞細胞或其他單核細胞上表達的任何免疫細胞的表面決定簇,所述免疫細胞比如B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32,CD40、CD40L、CD47、CD64、CD70(CD27L)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD94(KLRD1)、CD137(4-1BB)、CD137L(4-1BBL)、CD226、CTLA-4(CD152)、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS(CD278)、ICOSL(CD275)、殺傷啟動受體(KIR)、LAG-3(CD223)、LIGHT(TNFSF14、CD258)、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40(CD134)、OX40L(CD134L)、PD1H、PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1、CD274)、PD-L2(B7-CD、CD273)、PVR(NECL5、CD155)、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3(HAVCR2)和/或VISTA(PD-1H)。尤其地,被引導至參與調節免疫檢查點的細胞表面受體(或其配體)的表位結合位點可用於產生雙特異性或多特異性結合分子,所述雙特異性或多特異性結合分子對抗或阻斷免疫檢查點分子的抑制信號傳導,從而刺激、上調或增強受試者中免疫應答。參與調節免疫檢查點的分子包括但不限於
B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H,PD-1,PD-L1,PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3和/或VISTA。
但是,上述優勢需要突出的成本。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特和不同的多肽(即,這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體不同,其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即,兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致失活分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588),這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價鍵合的方式完成(即,以便防止同源二聚化)(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。所以,現有技術已經教導了非共價締合這樣的多肽(見,例如,Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27;Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683,J.Biochem.76(8):992;Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588;Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And
The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
但是,現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成雙特異性雙抗體是不穩定的並且容易解離成非功能單體(見,例如,Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
面對這樣的挑戰,本領域已經成功地開發了穩定的、共價鍵合的異源二聚非單特異性雙抗體,稱為DART®(雙親和力重靶向試劑)雙抗體;見,例如,美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910、歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2008/157379、WO 2006/113665和Sloan,D.D.等(2015)“Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,”PLoS Pathog.11(11):e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233;Al Hussaini,M.等(2015)“Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting(DART®)Platform,”Blood 127(1):122-131;Chichili,G.R.等(2015)“A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia:Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,”Sci.Transl.Med.7(289):289ra82;Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551;Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific
Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943;Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449;Marvin,J.S.等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658;Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27;Holliger,P.等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448。這樣的雙抗體包括兩個或多個共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中,其允許形成二硫鍵,從而共價鍵合兩條多肽鏈。例如,將半胱氨酸殘基添加至這樣的構建體的c-末端已經被證明允許多肽鏈之間的二硫鍵合,穩定了產生的異源二聚體,而不干擾二價分子的結合特性。
最簡單的雙特異性DART®雙抗體的兩條多肽的每一條包括三個結構域。第一條多肽包括(在N-末端至C-末端方向):(i)第一結構域,其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區;(ii)第二結構域,其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區;和(iii)第三結構域,其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和異源二聚體促進結構域,其用於促進與雙抗體的第二多肽的異源二聚化和彼此共價鍵合雙抗體的第一和第二多肽。第二多肽含有(在N-末端至C-末端方向):(i)第一結構域,其包括第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL2)的結合區;(ii)第二結構域,其包括第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH1)的結合區;和(iii)第三結構域,其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和互補性異源二聚體促進結構域,其與第一多肽鏈的異源二聚體促進結構域複合,以促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱
氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價鍵合。這樣的分子是穩定的、有潛力的,並且具有同時結合兩個或多個抗原的能力。在一個實施方式中,第一和第二多肽的第三結構域各含半胱氨酸殘基,其用於經二硫鍵將多肽結合在一起。圖1提供了這樣的雙抗體的示意圖,其使用E螺旋/K螺旋異源二聚體-促進結構域和包含半胱氨酸的連接體用於共價鍵合。如圖2和圖3A-3C中所提供的,多肽中的一條或兩條可另外具有CH2-CH3結構域的序列,以便兩條雙抗體多肽之間的複合形成能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc區。如在下面更詳細提供的,這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列一致,並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。
已經描述了這類分子的許多變型(見,例如,美國專利公開號2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053和2009/0060910;歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221;和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。這些包含Fc區的DART®雙抗體可包括兩對多肽鏈。第一多肽鏈包括(在N-末端至C-末端方向):(i)第一結構域,其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區,(ii)第二結構域,其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區,(iii)第三結構域,其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)並且用於促進與雙抗體的第二多肽的異源二聚化並且使雙抗體的第一和第二多肽彼此共價鍵合,和(iv)CH2-CH3結構域。第二多肽包含(在N-末端至C-末端方向):(i)第一結構域,其包括第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL2)的結合區,(ii)第二結構域,其包括第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH1)的結合區,和(iii))第三結構域,其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚體-促進結
構域,所述異源二聚體-促進結構域促進與第一多肽鏈的異源二聚化。在本文中,兩條第一多肽彼此複合,以形成Fc區。圖3A-3C提供了利用不同的異源二聚體-促進結構域的這類雙抗體的三個變型的示意圖。
其他包含Fc區的DART®雙抗體可包括三條多肽鏈。這類DART®雙抗體的第一多肽包含三個結構域:(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類DART®雙抗體的第二多肽包含:(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域、和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價鍵合的結構域。這類DART®雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此,這類DART®雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點,以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類更複雜的DART®分子也具有包含半胱氨酸的結構域,其用於形成共價鍵合的複合物。因此,第一和第二多肽通過涉及在它們各自第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此鍵合。值得注意的是,第一和第三多肽鏈彼此複合,以形成經二硫鍵穩定的Fc區。圖4A-4B提供了包括三條多肽鏈的這類雙抗體的示意圖。
其他包含Fc區的DART®雙抗體可包括五條多肽鏈,其可包括來自多達三種不同免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變結構域的結合區(稱為VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3)。例如,這類雙抗體的第一多肽鏈可包含:(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈可包含:(i)包含VL1的結構域、和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第三多肽鏈可包含:(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域、和(vi)異源二聚體-促進結構域,其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽可包含:(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2
的結構域、和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價鍵合的結構域。在本文中,第一和第三多肽彼此複合,以形成Fc區。這類更複雜的DART®分子也具有包含半胱氨酸的結構域,其用於形成共價鍵合的複合物,以便每條多肽鏈通過涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵鍵合至少一種另外的多肽鏈。優選地,這類結構域在N-末端至C-末端方向上排列。圖5提供了包括五條多肽鏈的這類雙抗體的示意圖
用於期望四價分子而不需要Fc的應用的可選的構建體在本領域中是已知的,包括但不限於四價串聯抗體,也稱為“TandAbs”(見,例如美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263、歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514、PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700),其通過每個具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域的兩條相同鏈的同源二聚化而形成。
最近,已經描述了合併兩個雙抗體型結合結構域和一個非雙抗體型結構域和Fc區的三價結構(見,例如,2015年5月29日提交的PCT申請號PCT/US15/33076,名稱“Tri-Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof,”和2015年5月29日提交的PCT/US15/33081,名稱“Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof”)。這類三價分子可用於產生單特異性、雙特異性或三特異性分子。圖6A-6F提供了包括3條或4條多肽鏈的這類三價分子的示意圖。
IV.本發明的結合LAG-3的分子
本發明的優選的結合LAG-3的分子包括抗體、雙抗體、BiTEs等,其能夠結合人LAG-3的連續或不連續(例如,構象的)部分(表位元)。本發明的結合LAG-3的分子優選地也展示結合一個或多個非人物種,尤其地,靈長類物種(尤
其地,靈長類物種,比如食蟹猴)的LAG-3分子的能力。代表性人LAG-3多肽(NCBI序列NP_002277.4;包括22個氨基酸殘基信號序列(以底線顯示)和503個氨基酸殘基成熟蛋白質)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:5):
在某些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子特徵在於任何(一個或多個)下述標準:(1)特異性結合在刺激的人T細胞表面上內源表達的人LAG-3;(2)特異性結合人LAG-3,平衡結合常數(KD)為40nM或更小;(3)特異性結合人LAG-3,平衡結合常數(KD)為0.5nM或更小;(4)特異性結合非人靈長類LAG-3(例如,食蟹猴的LAG-3);(5)特異性結合非人靈長類LAG-3,平衡結合常數(KD)為50nM或更小;(6)特異性結合非人靈長類LAG-3,平衡結合常數(KD)為5nM或更小;(7)抑制(即,阻斷或干擾)LAG-3與II類MHC的結合;(8)刺激免疫應答;
(9)作為單劑刺激抗原特異性T-細胞應答;(10)與抗PD-1抗體協同,以刺激抗原特異性T-細胞應答;(11)結合與抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1或LAG-3 mAb 6相同的LAG-3的表位和/或(12)不與抗LAG-3抗體257F(BMS 986016,Medarex/BMS)競爭LAG-3結合(例如,通過Biacore分析測量的)。
如本文所使用,術語“抗原特異性T-細胞應答”指通過用對T細胞特異性的抗原刺激T細胞而導致的T細胞的應答。在抗原特異性刺激時,通過T細胞應答的非限制性例子包括增殖和細胞因子產生(例如,TNF-α、IFN-γ產生)。分子刺激抗原特異性T-細胞應答的能力可使用例如本文所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B型抗原(“SEB”)刺激的PBMC試驗來測定。
本發明的優選的結合LAG-3的分子具有鼠抗LAG-3單克隆抗體“LAG-3 mAb 1”、“LAG-3 mAb 2”、“LAG-3 mAb 3”、“LAG-3 mAb 4”、“LAG-3 mAb 5”和/或“LAG-3 mAb 6”的VH和/或VL結構域,更優選地。具有這類抗LAG-3單克隆抗體的VH結構域的1、2或所有3個CDRH和/或VL結構域的1、2或所有3個CDRL。這類優選的結合LAG-3的分子包括雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合抗體或人源化抗體、BiTes、雙抗體等,並且這類結合分子具有變異的Fc區。
本發明尤其涉及包括LAG-3結合結構域的結合LAG-3的分子,其具有:(A)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1或hLAG-3 mAb 1 VL4的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的VL結構域的三個CDRL;
(3)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 1的VH結構域;(5)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 1的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的VH和VL結構域;(B)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 2的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 2的VL結構域的三個CDRL;(3)抗LAG-3抗體LAG- 3mAb 2的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 2的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 2的VH結構域;(5)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 2的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 2的VH和VL結構域;(C)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 3的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 3的VL結構域的三個CDRL;(3)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 3的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 3的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 3的VH結構域;(5)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 3的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 3的VH和VL結構域;(D)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 4的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 4的VL結構域的三個CDRL;(3)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 4的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 4的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 4的VH結構域;
(5)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 4的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 4的VH和VL結構域;(E)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VL結構域的三個CDRL;(3)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VH結構域;(5)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 5的VH和VL結構域;(F)(1)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6的VH結構域的三個CDRH;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6的VL結構域的三個CDRL;(3)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6的VL結構域的三個CDRL;(4)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 6的VH結構域;(5)抗LAG-3抗體LAG-3mAb 6的VL結構域;(6)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6的VH和VL結構域,(G)(1)抗LAG-3抗體hLAG-3 mAb 1 VL4的VL結構域的三個CDRL;(2)抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1的VH結構域的三個CDRH和抗LAG-3抗體hLAG-3 mAb 1 VL4的VL結構域的三個CDR;或結合,或競爭結合LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6免疫特異性結合的表位。
A.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 1
1.鼠抗人抗體LAG-3 mAb 1
LAG-3 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)顯示在下方(CDRH殘基以底線顯示)。
LAG-3 mAb 1的CDRH1(SEQ ID NO:8):NYGMN
LAG-3 mAb 1的CDRH2(SEQ ID NO:9):WINTYTGESTYADDFEG
LAG-3 mAb 1的CDRH3(SEQ ID NO:10):ESLYDYYSMDY
LAG-3mAb 1的CDRL1(SEQ ID NO:13):KSSQSLLHSDGKTYLN
LAG-3mAb 1的CDRL2(SEQ ID NO:14):LVSELDS
LAG-3mAb 1的CDRL3(SEQ ID NO:15):WQGTHFPYT
2.人源化抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1以形成“hLAG-3 mAb 1”
將上述鼠抗LAG-3抗體LAG-3mAb 1人源化,以便表明人源化抗LAG-3抗體的能力,以便當施用至人接受者時降低其抗原性。人源化產生兩個人源化的VH結構域,本文命名為“hLAG-3mAb 1 VH-1”和“hLAG-3 mAb 1 VH-2”,以及四個人源化的VL結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 1 VL-1”、“hLAG-3 mAb 1 VL-2”、“hLAG-3 mAb 1 VL-3”和“hLAG-3 mAb 1 VL-4”。任何人源化的VL結構域可與人源化的VH結構域配對。因此,包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“hLAG-3 mAb 1”,並且人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定的VH/VL結構域命名,例如包括hLAG-3 mAb 1 VH-1和hLAG-3 mAb 1 VL-2的人源化抗體具體稱為“hLAG-3 mAb 1(1.2)”。
hLAG-3 mAb 1 VL-4的VL結構域的CDRL1包括甘氨酸到丙氨酸氨基酸取代並且具有氨基酸序列:KSSQSLLHSDAKTYLN(SEQ ID NO:28),取代的丙氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入任何上述LAG-3 mAb 1 CDRL1結構域中。
B.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 2
LAG-3 mAb 2的CDRH1(SEQ ID NO:31):DYNIH
LAG-3 mAb 2的VH CDRH2(SEQ ID NO:32):YIYPYSGDIGYNQKFKN
LAG-3 mAb 2的VH CDRH3(SEQ ID NO:33):WHRNYFGPWFAY
LAG-3mAb 2的CDRL1(SEQ ID NO:36):KASQSVDYDGESYMN
LAG-3mAb 2的CDRL2(SEQ ID NO:37):VVSNLES
LAG-3mAb 2的CDRL3(SEQ ID NO:38):QQSSEDPLT
C.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 3
LAG-3 mAb 3的CDRH1(SEQ ID NO:41):DYNIH
LAG-3mAb 3的CDRH2(SEQ ID NO:42):YIYPYNGDTGYNQKFKT
LAG-3 mAb 3的CDRH3(SEQ ID NO:43):WSRNYFGPWFAY
LAG-3 mAb 3的CDRL1(SEQ ID NO:46):KASQSVDYDGDSYMN
LAG-3 mAb 3的CDRL2(SEQ ID NO:47):AASNLES
LAG-3 mAb 3的CDRL3(SEQ ID NO:48):QQSSEDPLT
D.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 4
LAG-3 mAb 4的CDRH1(SEQ ID NO:51):DYNIH
LAG-3mAb 4的CDRH2(SEQ ID NO:52):YIYPYNGDAGYNQNFKT
LAG-3 mAb 4的CDRH3(SEQ ID NO:53):WNMNYFGPWFAY
LAG-3 mAb 4的CDRL1(SEQ ID NO:56):KASQSVDYDGVTYIN
LAG-3 mAb 4的CDRL2(SEQ ID NO:7570):AASNLES
LAG-3 mAb 4的CDRL3(SEQ ID NO:58):QQSNEDPLT
E.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 5
LAG-3 mAb 5的CDRH1(SEQ ID NO:61):DYNIH
LAG-3mAb 5的CDRH2(SEQ ID NO:62):YIYPYSGDFGYNQKFKS
LAG-3 mAb 5的CDRH3(SEQ ID NO:63):WHRNYFGPWFAY
LAG-3 mAb 5的CDRL1(SEQ ID NO:66):KASQSVDYDGESYMN
LAG-3 mAb 5的CDRL2(SEQ ID NO:67):VVSNLES
LAG-3 mAb 5的CDRL3(SEQ ID NO:68):QQSSEDPLT
F.抗LAG-3抗體LAG-3mAb 6
1.鼠抗人抗體LAG-3 mAb 6
LAG-3 mAb 6的CDRH1(SEQ ID NO:71):DYNMD
LAG-3mAb 6的CDRH2(SEQ ID NO:72):DINPDNGVTIYNQKFEG
LAG-3 mAb 6的CDRH3(SEQ ID NO:72):EADYFYFDY
LAG-3 mAb 6的CDRL1(SEQ ID NO:76):KASQDVSSVVA
LAG-3 mAb 6的CDRL2(SEQ ID NO:77):SASYRYT
LAG-3 mAb 6的CDRL3(SEQ ID NO:78):QQHYSTPWT
2.人源化抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 6,以形成“hLAG-3 mAb 6”
使上述鼠抗LAG-3抗體LAG-3mAb 6人源化,以便表明人源化抗LAG-3抗體的能力,以便當施用至人接受者時降低其抗原性。人源化產生兩個人源化的VH結構域,本文命名為“hLAG-3mAb 6 VH-1”和“hLAG-3 mAb 6 VH-2”和兩個人源化的VL結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 6 VL-1”和“hLAG-3 mAb 6 VL-2”。任何人源化的VL結構域可與人源化的VH結構域配對。因此,包括與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域之一的任何抗體一般稱為“hLAG-3 mAb 6”,並且,人源化的VH/VL結構域的具體組合通過參考特定VH/VL結構域命名,例如包括hLAG-3 mAb 6 VH-1和hLAG-3 mAb 6 VL-2的人源化抗體具體稱為“hLAG-3 mAb 6(1.2)”。
hLAG-3mAb 6 VH-1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)顯示在下方(CDRH殘基以底線顯示):QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMD WVRQA PGQGLEWMG D I NPDNGVTIY NQKFEG RVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS
hLAG-3 mAb 6 VH-2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)顯示在下方(CDRH殘基以底線顯示):EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DY NMD WVRQA PGKGLEWVS D INPDNGVTIY NQKFEG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS
hLAG-3 mAb 6 VL-1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)顯示在下方(CDRL殘基以底線顯示):DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYSTPWT FGG GTKLEIK
hLAG-3 mAb 6 VL-2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:85)顯示在下方(CDRL殘基以底線顯示):DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYC QQ HYSTPWT FGG GTKLEIK
hLAG-3 mAb 2 VL-1和VL-2的VL結構域的CDRL1包括賴氨酸至精氨酸的氨基酸取代並且具有氨基酸序列: RASQDVSSVVA(SEQ ID NO:87),取代的精氨酸以底線顯示)。考慮類似的取代可併入任何上述LAG-3 mAb 6 CDRL1結構域中。
本文考慮為VH和/或VL結構域的氨基酸序列提供的微小改變。例如,本文所述的任何VH和/或VL結構域的C-末端氨基酸殘基可被取代,以利於亞克隆。
V.抗LAG-3抗體LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5,和/或LAG-3 mAb 6以及它們具有工程化的Fc區的衍生物
在傳統的免疫功能中,抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用產生各種各樣的應答,範圍從效應子功能,比如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬,到免疫調節信號,比如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合物的Fc區與造血細胞上專用細胞表面受體的結合來啟動。由抗體和免疫複合物引發的細胞應答的多樣性由三個Fc受體:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的結構異質性造成。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是啟動(即,免疫系統增強)受體;FcγRIIB(CD32B)是抑制(即,免疫系統抑制)受體。另外,與新生Fc受體(FcRn)的相互作用介導IgG分子從內體至細胞表面的再迴圈並且釋放至血液。上面呈現了示例性IgG1(SEQ ID NO:1)、IgG2(SEQ ID NO:2)、IgG3(SEQ ID NO:3)和IgG4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
Fc區的修飾通常導致改變的表型,例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。就效應子功能而言,可期望修飾本發明的抗體或其他結合分子,例如,以便增強這樣的分子在治療癌中的有效性。在某些情況下,期望降低或消除效應子功能,例如在抗體的作用機制涉及阻斷或對抗但不是殺傷攜帶靶抗原的細胞的情況下。當被引導至不期望的細胞諸如其中FcγR以低水準表達的腫瘤和外源細胞時,例如具有低水準FcγRIIB的腫瘤-特異性B細胞(例如,非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤),提高的效應子功能通常是期望的。在所述實施方式中,具有賦予的或改變的效應子功能活性的本發明的分子可用於治療和/或預防疾病、病症或感染,其中增強的效應子功能活性的功效是期望的。
在某些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括Fc區,所述Fc區具有對野生型Fc區的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:1)的一個或多個修飾(例如,取代、缺失或插入),其降低了Fc區的親和力和親合力,因此降低本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中,本發明的分子包括Fc區,所述Fc區具有對野生型Fc區的氨基酸的一個或多個修飾,其增加了Fc區的親和力和親合力,因此,增加本發明的分子對一個或多個FcγR受體的親和力和親合力。在其他實施方式中,分子包括變異的Fc區,其中相對於不包括Fc區或包括野生型Fc區的分子,所述變體賦予或介導增加的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性和/或與FcγRIIA增加的結合。在可選的實施方式中,分子包括變異的Fc區,其中相對於不包括Fc區或包括野生型Fc區的分子,所述變體賦予或介導降低的ADCC活性(或其他效應子功能)和/或與FcγRIIB增加的結合。在一些實施方式中,本發明包括結合LAG-3的分子,其包括變異的Fc區,該變異的Fc區相對於包括野生型Fc區的相當的分子,不顯示與任何FcγR可檢測的結合。在其他實施方式中,本發明包括結合LAG-3的分子,其包括變異的Fc區,該變異的Fc區僅僅結合單個FcγR,優選地FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA中的一個。任意這樣的增加的親和力和/或親和力均優選通過在細胞中體外測量對FcγR可檢測的結合程度或FcγR相關活性而評估,所述細胞在親本分子(沒有修飾的Fc區)的結合活性不能在細胞中被檢測到時表達低水準FcγR,或者所述細胞以以下密度表達非FcγR受體靶抗原:30,000至20,000個分子/細胞、20,000至10,000個分子/細胞、10,000至5,000個分子/細胞、5,000至1,000個分子/細胞、1,000至200個分子/細胞或200個分子/細胞或更少(但是至少10、50、100或150個分子/細胞)。
本發明的結合LAG-3的分子可包括變異的Fc區,其具有改變的親合力,用於啟動和/或抑制Fcγ受體。在一個實施方式中,結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,相對於具有野生型Fc區的相當的分子,其對於FcγRIIB具有增加的
親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另一實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,相對於具有野生型Fc區的相當的分子,其具有對於FcγRIIB降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA增加的親和力。在仍另一實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,相對於具有野生型Fc區的相當的分子,其具有對於FcγRIIB降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親和力。在仍另一實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,相對於具有野生型Fc區的相當的分子,其具有對於FcγRIIB不變的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的(或增加的)親和力。
在某些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其具有對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA改變的親和力,使得免疫球蛋白具有增強的效應子功能。效應細胞功能的非限制性例子包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性、抗體依賴性吞噬、吞噬、調理、調理吞噬、細胞結合、玫瑰花結(rosetting)、C1q結合和補體依賴性細胞介導的細胞毒性。
在優選的實施方式中,相對於包括野生型Fc區的相當的分子,親和力或效應子功能的改變是至少2倍,優選地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本發明的其他實施方式中,相對於包括野生型Fc區的分子,變異的Fc區以至少65%,優選地至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%、至少225%或至少250%更大的親和力免疫特異性結合一個或多個FcR。這類測量可以是體內或體外試驗,在優選的實施方式中是體外試驗,比如ELISA或表面等離子共振試驗。
在不同的實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其中所述變體激動(agonize)FcγR受體的至少一種活性或對抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中,分子包括這樣的變體:其對抗FcγRIIB的一
種或多種活性,例如,B細胞受體-介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入、細胞週期進程、FcγRIIB-介導的對FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合或一個或多個下游分子(例如,MAP激酶、JNK、p38或Akt)在FcγRIIB信號轉導途徑中的活性。在另一實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變體,其激動FcεRI的一種或多種活性,例如,肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因子產生或5-羥色胺釋放。
在某些實施方式中,分子包括Fc區,其包括來自兩個或更多個IgG同種型(例如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的區域。如本文所使用,相對於其他IgG同種型,如果Fc區的氨基酸序列與特定的IgG同種型最同源,則認為Fc區屬於該IgG同種型。由於它們的鉸鏈和/或Fc區的氨基酸序列的差異,各種IgG同種型展示不同的物理和功能特性,包括血清半衰期、補體結合、FcγR結合親合力和效應子功能活性(例如,ADCC、CDC等),例如在Flesch and Neppert(1999)J.Clin.Lab.Anal.14:141-156;Chappel等(1993)J.Biol.Chem.33:25124-25131;Chappel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:9036-9040;或Brüggemann等(1987)J.Exp.Med 166:1351-1361中描述。該中類型的變異的Fc區可單獨使用或組合氨基酸修飾使用,以影響Fc-介導的效應子功能和/或結合活性。在組合中,相對包括野生型Fc區的本發明分子,氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區可展示類似的功能(例如,對FcγRIIA提高的親和力)並可另外或更優選協同作用,以修飾本發明分子中的效應子功能。在其他實施方式中,相對於不包括Fc區或包括相同同種型的野生型Fc區的本發明分子,氨基酸修飾和IgG Fc區可展示相反的功能(例如,分別對FcγRIIA提高的和降低的親和力)並可發揮作用,以選擇減輕和或降低本發明分子的特異性功能。
在優選的具體實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其中所述變異的Fc區相對於野生型Fc區包括至少一個氨基酸的修飾,以便所述分子具有對FcR改變的親和力,條件是基於諸如由Sondermann等(2000)Nature 406:267-73公開的Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析,所述變異Fc區在直接接觸FcγR的位置不具有取代。Fc區中直接接觸FcγR的位置的實例是氨基酸殘基234-239(鉸鏈區)、氨基酸殘基265-269(B/C環)、氨基酸殘基297-299(C’/E環)和氨基酸殘基327-332(F/G環)。在一些實施方式中,本發明的分子包括變異的Fc區,其包括至少一個殘基的修飾,所述殘基基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR,例如不在Fc-FcγR結合位點內。
變異的Fc區是本領域熟知的,並且可在本發明中使用任何已知的變異的Fc區,以賦予或修飾包括Fc區(或其部分)的本發明的分子展示的效應子功能,如在例如NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中功能測定的。例如,PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707和WO 2008/140603中公開了鑒定為改變效應子功能的Fc區變體,並且,其中公開的任何合適的變體均可用於本發明的分子中。
在某些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其在一個或多個區中具有一個或多個氨基酸修飾,相對於抑制性FcγR(諸如FcγRIIB),所述修飾(一個或多個)改變(相對於野生型Fc區)變異的Fc區與啟動FcγR(諸如FcγRIIA或FcγRIIIA)的親和力比:
尤其優選的是本發明的結合LAG-3的分子,其具有變異的Fc區(相對於野生型Fc區),其中變異的Fc區的親合力比例大於1。這樣的分子在提供
其中期望由FcγR介導的效應細胞功能(例如,ADCC)的增強的功效的疾病、病症或感染的療法或預防療法或其症狀的改善方面具有特別的用途,例如癌或感染性疾病。相比之下,親合力比例小於1的變異的Fc區介導降低的效應細胞功能的效力。根據其親和力比是否大於或小於1,表1列出了示例性單、雙、三、四和五突變。
在具體的實施方式中,在變異的Fc區中,任何氨基酸修飾(例如,取代)在任何下述位置:235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330,優選地下述殘基的一個或多個:A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的特定實施方式中,在變異的Fc區,任何氨基酸修飾(例如,取代)在任何下述位置:268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439,優選地一個或多個下述殘基:H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在優選的實施方式中,在以改變的親和力結合FcγR的變異的Fc區中,任何氨基酸修飾(例如,取代)在任何下述位置:255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地,變異的Fc區具有任何下
述殘基:A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的實施方式中,在以降低的親和力結合FcγR(經其Fc區)的變異的Fc區中,任何氨基酸修飾(例如,取代)在下述任何位置:252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的實施方式中,在以增強的親和力結合FcγR(經其Fc區)的變異的Fc區中,任何氨基酸修飾(例如,取代)在下述任何位置:280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。在不同的實施方式中,在以增強的親和力結合FcγRIIA的變異的Fc區中,任何下述殘基:A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
優選的變體包括在任何下述位置的一個或多個修飾:228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
在一個實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括Fc區中具有至少一個修飾的變異的Fc區。在某些實施方式中,變異的Fc區包括選自L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一個取代,其中所述編號是根據Kabat的EU索引的編號。
在具體的實施方式中,變異的Fc區包括:(A)選自F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L的至少一個取代;(B)選自下述的至少兩個取代:(1)F243L和P396L;(2)F243L和R292P;和
(3)R292P和V305I;(C)選自下述的至少三個取代:(1)F243L、R292P和Y300L;(2)F243L、R292P和V305I;(3)F243L、R292P和P396L;和(4)R292P、V305I和P396L;(D)選自下述的至少四個取代:(1)F243L、R292P、Y300L和P396L;和(2)F243L、R292P、V305I和P396L;或(E)選自下述的至少五個取代:(1)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L;和(2)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具體的實施方式中,變異的Fc區包括下述取代:(A)F243L、R292P和Y300L;(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L;或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在一個實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其展示對FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1)展示的結合)。在一個實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其展示對FcγR(例如,FcγRIIIA)降低的(或基本上沒有)結合和降低的(或基本上沒有)ADCC效應子功能。在某些實施方式中,變異的Fc區包括選自L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G的至少一個取代。在具體的實
施方式中,變異的Fc區包括L234A;L235A;L234A和L235A;D265A;N297Q或N297G的取代。
在不同的實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括Fc區,其(相對於野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1)展示的結合)固有地展示對FcγRIIIA(CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能。在具體的實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括IgG2 Fc區(SEQ ID NO:2)或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:4)。當使用IgG4 Fc區時,本發明也包括引入穩定化突變,比如IgG4鉸鏈區S228P取代(見,例如,SEQ ID NO:117:ESKYGPPCP P CP,(Lu等(2008)“The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,”J.Pharmaceutical Sciences 97:960-969)以減少鏈交換的發生率。本領域已知的其他穩定化突變可引入到IgG4 Fc區中(Peters,P等(2012)“Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,”J.Biol.Chem.,287:24525-24533、PCT專利公開號:WO 2008/145142)。
在其他實施方式中,本發明包括本領域已知的任何Fc變體,比如下述文獻中公開的那些,的用途:Jefferis,B.J.等(2002)“Interaction Sites On Human IgG-FcFor FcgammaR:Current Models,”Immunol.Lett.82:57-65;Presta,L.G.等(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,”Biochem.Soc.Trans.30:487-90;Idusogie,E.E.等(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement,”J.Immunol.166:2571-75;Shields,R.L.等(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI,Fc Gamma RII,Fc Gamma RIII,And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R,”J.Biol.Chem.276:6591-6604;Idusogie,E.E.等(2000)“Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan,A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc,”J.Immunol.164:4178-84;Reddy,M.P.等(2000)“Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,”J.Immunol.164:1925-1933;Xu,D.等(2000)“In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,”Cell.Immunol.200:16-26;Armour,K.L.等(1999)“Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,”Eur.J.Immunol.29:2613-24;Jefferis,R.等(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,”Immunol.Lett.54:101-04;Lund,J.等(1996)“Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,”J.Immunol.157:4963-4969;Hutchins等(1995)“Improved Biodistribution,Tumor Targeting,And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92:11980-84;Jefferis,R.等(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors:The Role Of Glycosylation,”Immunol.Lett.44:111-17;Lund,J.等(1995)“Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,”FASEB J.9:115-19;Alegre,M.L.等(1994)“A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,”Transplantation 57:1537-1543;Lund等(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11,”Mol.Immunol.29:53-59;Lund等(1991)“Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,”J.Immunol.147:2657-2662;Duncan,A.R.等(1988)“Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,”Nature 332:563-564、美國專利號5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586和7,317,091和PCT公開WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
在一些實施方式中,本發明的分子進一步包括一個或多個糖基化位點,從而一個或多個碳水化合物部分被共價連接至分子。優選地,與未修飾的抗體相比,在Fc區中具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個修飾的本發明的分子賦予或具有增強的抗體介導的效應子功能,例如,增強的ADCC活性。在一些實施方式中,本發明進一步包括這樣的分子:所述分子包括已知直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸的一個或多個修飾,所述氨基酸包括但不限於在位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299或301的氨基酸。直接或間接與Fc區的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本領域已知的,見,例如,Jefferis等,1995 Immunology Letters,44:111-7,其通過引用以其整體併入本文。
在另一實施方式中,本發明包括這樣的分子:所述分子已經通過在分子的一個或多個位點中引入一個或多個糖基化位點被修飾,優選不改變分子的功能,例如,與靶抗原或FcγR的結合活性。糖基化位點可被引入到本發明分子的可變結構域和/或恒定結構域中。如本文所使用,“糖基化位點”包括與寡糖(即,碳水化合物,其含有兩個或多個連接在一起的單糖)特異性和共價結合的抗體中的任何特定氨基酸序列。寡糖側鏈通常經N-或O-鍵而連接至抗體的骨架。N-連接的糖基化指寡糖部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指寡糖部分連接至羥基氨基酸,例如,絲氨酸、蘇氨酸。本發明的分子可包括一個或多個糖基化位點,包括N-連接的和O-連接的糖基化位點。本領域已知的用於N-連接的或O-連接的糖基化的任何糖基化位元點可根據本發明使用。根據本發明的方法可用的示例性N-連接的糖基化位點是氨基酸序列:Asn-X-Thr/Ser,其中X可以是任何氨基酸和Thr/Ser指示蘇氨酸或絲氨酸。這類位點可使用本發明
所屬領域熟知的方法引入到本發明的分子中(見例如,In vitro Mutagenesis,Recombinant DNA:A Short Course,J.D.Watson,等W.H.Freeman and Company,New York,1983,第8章,pp.106-116,其通過引用以其整體併入本文。用於將糖基化位點引入本發明分子中的示例性方法可包括:修飾或突變分子的氨基酸序列,從而獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。
在一些實施方式中,本發明包括通過添加或刪除糖基化位點修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。修飾抗體(和包括抗體結構域,例如,Fc區的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域熟知的並且包括在本發明中,見,例如,美國專利號6,218,149、EP 0 359 096 B1、美國公開號US 2002/0028486、WO 03/035835、美國公開號2003/0115614、美國專利號6,218,149、美國專利號6,472,511,其所有通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中,本發明包括通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分,修飾本發明分子的碳水化合物含量的方法。在具體的實施方式中,本發明包括通過修飾與297相鄰的位置而轉變抗體Fc區的糖基化位點。在具體的實施方式中,本發明包括修飾296位,從而296位而不是297位被糖基化。
也可通過技術,比如通過在Fc區中引入一個或多個半胱氨酸殘基,修飾效應子功能,從而允許在該區域內發生鏈間二硫鍵形成,導致產生可具有改善的內化能力和/或提高的補體-介導的細胞殺傷和ADCC的同源二聚化抗體(Caron,P.C.等(1992)“Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies,”J.Exp.Med.176:1191-1195;Shopes,B.(1992)“A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity,”J.Immunol.148(9):2918-2922。也可使用如Wolff,E.A.等(1993)“Monoclonal Antibody Homodimers:Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,”Cancer Research 53:2560-2565中描述的異源雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同源二
聚化抗體。可選地,抗體可被工程化,其具有雙Fc區並且從而可具有增強的補體分解和ADCC能力(Stevenson,G.T.等(1989)“A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions(bisFabFc)Prepared By Manipulations At The IgG Hinge,”Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)。
可通過增加Fc區對FcRn的結合親合力而增加包括Fc區的本發明分子的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學性質,是對在其施用之後分子的平均生存時間的衡量。半衰期可表示為從受試者的身體(例如,人患者或其他哺乳動物)或其特定區室消除百分之五十(50%)的已知量的分子需要的時間,例如,如在血清中測量的,即,迴圈半衰期,或在其他組織中測量的。一般而言,半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其相對於野生型Fc區包括至少一種氨基酸修飾並且(相對於野生型Fc區)展示增加的半衰期。
在一些實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子包括變異的Fc區,其在選自下述的一個或多個位置處包括延長半衰期的氨基酸取代:238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436,如通過根據Kabat的EU索引編號。能夠增加包含Fc區的分子的半衰期的許多特異性突變是本領域已知的並且包括,例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如,見下述中描述的突變:美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376、美國公開號2002/0147311、2007/0148164和國際公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279,其通過引用以它們的整體併入本文。具有增強的半衰期的包含Fc區的分子也包括在下述的兩個
或更多個Fc區殘基處具有取代的分子:250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436。尤其地,兩個或更多個取代選自:T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I。
在具體的實施方式中,變異的Fc區包括下述取代:(A)252Y、254T和256E;(B)M252Y和S254T;(C)M252Y和T256E;(D)250Q和428L;(E)T307Q和N434A;(F)A378V和N434A;(G)N434A和Y436I;(H)V308P和N434A;或(I)K288D和H435K。
本發明進一步包括變異的Fc區,其包括:(A)改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變;和(B)延長的血清半衰期的一個或多個突變。
VI.本發明的結合LAG-3的雙特異性分子
本發明的一個實施方式涉及能夠結合“第一表位”和“第二表位”的雙特異性結合分子,其中第一表位是人LAG-3的表位和第二表位是與LAG-3相同的或不同的表位,或是存在於免疫細胞(比如T淋巴細胞)的表面上並且參與調節免疫檢查點的另一分子的表位。在某些實施方式中,第二表位元優選地不是LAG-3的表位。在一個實施方式中,第二表位元是下述的表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD3、CD8、CD16、CD27、CD32、CD40、CD40L、CD47、
CD64、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA。在具體的實施方式中,第二表位元是CD137、PD-1、OX40、TIGIT或TIM-3。在某些實施方式中,這類雙特異性分子包括大於兩個表位結合位點。這類雙特異性分子可例如結合LAG-3的兩個或更多個不同的表位和不是LAG-3的分子的至少一個表位。
本發明包括能夠同時結合LAG-3和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、I或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)的雙特異性抗體。在一些實施方式中,使用下述文獻描述的任何方法產生能夠同時結合PD-1和第二表位的雙特異性抗體:PCT公開號WO 1998/002463、WO 2005/070966、WO 2006/107786WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 2006/107617、WO 2007/046893、WO 2007/146968、WO 2008/003103、WO 2008/003116、WO 2008/027236、WO 2008/024188、WO 2009/132876、WO 2009/018386、WO 2010/028797、WO2010028796、WO 2010/028795、WO 2010/108127、WO 2010/136172、WO 2011/086091、WO 2011/133886、WO 2012/009544、WO 2013/003652、WO 2013/070565、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2013/174873,和WO 2014/022540,其每一篇通過引用以其整體併入本文。
1.缺少Fc區的雙特異性雙抗體
本發明的一個實施方式涉及雙特異性單價雙抗體,其包括第一多肽鏈和第二多肽鏈,最優選地由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成,第一多肽鏈和第二多肽鏈的序列允許多肽鏈彼此共價結合,以形成共價締合的雙抗體,其能夠同時結合第一表位(“表位1”)和第二表位(“表位2”),這類表位彼此不同。
這類雙特異性雙抗體因此包括能夠結合第一表位(VL 表位1 /VH 表位1 )的“VL1”/“VH1”結構域和能夠結合第二表位(VL 表位2 /VH 表位2 )的“VL2”/“VH2”結構域。符號“VL1”和“VH1”分別表示結合這類雙特異性雙抗體的“第一”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似地,符號“VL2”和“VH2”分別表示結合這類雙特異性雙抗體的“第二”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。在一個實施方式中,這類雙抗體分子的表位1是LAG-3的表位和這類雙抗體分子的表位2不是LAG-3的表位(例如,其是下述的表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、I或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
這類結合LAG-2的雙抗體的第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用,以形成對第一抗原(即,LAG-3或包含第二表位的抗原)特異性的第一功能表位結合位點。同樣地,第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用,以便形成對於第二抗原(即,包含第二表位的抗原或LAG-3)特異性的第二功能表位結合位點。因此,協調第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇,以便雙抗體的兩條多肽鏈總體地包括能夠結合LAG-3的表位和結合第二表位二者的VL和VH結構域(即,它們總體地包括VLLAG-3/VHLAG-3和VL表位2/VH表位元2結構域)。具體的結合結構域對(即,VL 表位1 /VH 表位1 或VL 表位2 /VH 表位2 )具有表位1的抗原表位或具有表位2的抗原的表位)是否被命名為雙抗體的第一或第二表位元無關緊要,這種符號僅僅與本發明結合分子的多肽鏈的結構域的存在和取向有關。
這類雙特異性單價雙抗體的實施方式的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合第一表位的單克隆抗體的VL結構域或能夠結合第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即,VLLAG-3或VL表位2)、第一間插間隔肽(連接體1)、能夠結合第二表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第一多肽鏈
包含VLLAG-3)或能夠結合第一表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第一多肽鏈包含VL表位2)、第二間插間隔肽(連接體2),任選地包括半胱氨酸殘基、異源二聚體-促進結構域和C-末端(圖1)。
雙特異性單價雙抗體的該實施方式的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VL結構域或能夠結合第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即,VLLAG-3或VL表位2,並且是不為包括在雙抗體的第一多肽鏈中選擇的VL結構域)、間插連接肽(連接體1)、能夠結合第二表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第二多肽鏈包含VLLAG-3)或能夠結合LAG-3的單克隆抗體的VH結構域(如果這類第二多肽鏈包含VL表位2)、第二間插間隔肽(連接體2),任選地包含半胱氨酸殘基、異源二聚體-促進結構域和C-末端(圖1)。
最優選地,選擇間插連接肽(例如,分開這類VL和VH結構域的連接體1))的長度,以基本上或完全防止多肽鏈的VL和VH結構域彼此結合。因此,第一多肽鏈的這類VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣地,第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:88):GGGSGGGG。
基於異源二聚體-促進結構域的選擇而選擇第二間插連接肽(連接體2)的長度和組成。典型地,第二間插連接肽(連接體2)包括3-20個氨基酸殘基。尤其地,在異源二聚體-促進結構域不包括半胱氨酸殘基的情況下,使用包含半胱氨酸的第二間插連接肽(連接體2)。包含半胱氨酸的第二間插間隔肽(連接體2)包含1、2、3或大於3個半胱氨酸殘基。優選的包含半胱氨酸的間隔肽(連接體2)具有序列SEQ ID NO:89:GGCGGG。可選地,連接體2不包括半胱氨酸(例如,GGG、GGGS(SEQ ID NO:90)、LGGGSG(SEQ ID NO:91)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:92)、ASTKG(SEQ ID NO:93)、LEPKSS(SEQ ID NO:94)、APSSS(SEQ ID NO:95)等),並且使用如下描述的包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。任選地,使用包含半胱氨酸的連接體2和包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。
在一條多肽鏈上,異源二聚體-促進結構域可以是GVEPKSC(SEQ ID NO:96)或VEPKSC(SEQ ID NO:97)或AEPKSC(SEQ ID NO:98),在另一多肽鏈上是GFNRGEC(SEQ ID NO:99)或FNRGEC(SEQ ID NO:100)(US2007/0004909)。
但是,更優選地,這類雙抗體的異源二聚體-促進結構域由具有相反電荷的一個、兩個、三個或四個串聯重複的螺旋結構域形成,所述螺旋結構域包括至少六個、至少七個或至少八個氨基酸殘基的序列,以便異源二聚體-促進結構域具有淨電荷(Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9:3173-3180;Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments:Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312:221-228;Arndt,K.M.等(2002)“Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,”Structure 10:1235-1248;Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,”Analytical Biochemistry 399:138-140;Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development:Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,”J.Mol.Recognit.17:540-557;De Crescenzo,G.D.等(2003)“Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils:Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,”Biochemistry 42:1754-1763;Fernandez-Rodriquez;J.等(2012)“Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,”Protein Science 21:511-519;Ghosh,T.S.等(2009)“End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions:New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,”Acta Crystallographica D65:1032-1041;Grigoryan,G.等(2008)“Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,”Curr.Opin.Struc.Biol.18:477-483;Litowski,J.R.等(2002)“Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils:The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding,Stability,And Specificity,”J.Biol.Chem.277:37272-37279;Steinkruger,J.D.等(2012)“The d′--d--d′Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,”J.Amer.Chem.Soc.134(5):2626-2633;Straussman,R.等(2007)“Kinking the Coiled Coil-Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,”J.Molec.Biol.366:1232-1242;Tripet,B.等(2002)“Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,”J.Molec.Biol.323:345-362;Woolfson,D.N.(2005)“The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,”Adv.Prot.Chem.70:79-112;Zeng,Y.等(2008)“A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,”J.Gene Med.10:355-367)。
這樣的重複的螺旋結構域可以是準確的重複或可具有取代。例如,第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域的螺旋結構域可包括選擇為這類異源二聚體-促進結構域提供負電荷的八個氨基酸殘基的序列,並且第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域的螺旋結構域可包括選擇為這類異源二聚體-促進結構域提供正電荷的八個氨基酸殘基的序列。哪個螺旋被提供給第一或第二多肽鏈是
不重要的,前提是當兩條多肽鏈被提供以這類異源二聚體-促進結構域時,另一多肽鏈使用具有相反電荷的螺旋。帶正電的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電的氨基酸可以是谷氨酸,天冬氨酸等。帶正電的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電的氨基酸優選地是谷氨酸。僅僅使用單個異源二聚體-促進結構域是可能的(因為這類結構域將抑制同源二聚化,從而促進異源二聚化),但是,優選本發明雙抗體的第一和第二多肽鏈都包含異源二聚體-促進結構域。
在優選的實施方式中,異源二聚體-促進結構域之一包括四個串聯的“E螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:101: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K),其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷,而另一個異源二聚體-促進結構域包括四個串聯的“K螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:102: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E),其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這類帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合,因此促進異源二聚體形成。尤其優選的是這樣的異源二聚體-促進結構域:其中SEQ ID NO:101的四個串聯的“E螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾,以包含半胱氨酸殘基: E VAA E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:103)。同樣地,尤其優選的是這樣的異源二聚體-促進結構域:其中SEQ ID NO:102的四個串聯的“K螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾,以包含半胱氨酸殘基: K VAA K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:104)。
如在WO 2012/018687中公開,為了提高雙抗體的體內藥物代謝動力學特性,雙抗體可被修飾,以在雙抗體的一個或多個末端處包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地,血清結合蛋白的這類多肽部分設置在雙抗體的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子結合位點,這允許其非共價結合其他蛋白,從而延長它們的血清半
衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)由形成穩定的三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction For BacterialAlbumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120。因此,對於改善雙抗體的體內藥物代謝動力學特性,尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD),更優選地,鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3(ABD3)(SEQ ID NO:105):LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP。
如在WO 2012/162068中公開的(通過引用併入本文),SEQ ID NO:105的“去免疫化的”變體具有削弱或消除II類MHC結合的能力。基於組合突變結果,對於形成這樣的去免疫化的ABD,如下取代的組合被認為是優選的取代:66D/70S +71A、66S/70S +71A、66S/70S +79A、64A/65A/71A、64A/65A/71A+66S、64A/65A/71A+66D、64A/65A/71A+66E、64A/65A/79A+66S、64A/65A/79A+66D、64A/65A/79A+66E。變異的ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有氨基酸序列:LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66NAK S 70 A 71EGVKALIDE ILAALP(SEQ ID NO:106),或氨基酸序列:LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO:107),或氨基酸序列:LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO:108)的變異的去免疫化的ABD是尤其優選的,因為這類去免疫化的ABD展示基本上野生型結合,同時提供削弱的II類MHC結合。因此,具有
ABD的這類雙抗體的第一多肽鏈包含第三連接體(連接體3),其優選地位於這類多肽鏈的E螺旋(或K螺旋)結構域的C-末端,以便插在E螺旋(或K螺旋)結構域和ABD(其優選地是去免疫化的ABD)之間。用於這類連接體3的優選的序列是SEQ ID NO:90:GGGS。
2.包含Fc區的雙特異性雙抗體
本發明的一個實施方式涉及包含Fc區的雙特異性雙抗體,其能夠同時結合LAG-3和第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、I或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。添加IgG CH2-CH3結構域至雙抗體多肽鏈中的一條或兩條,以便雙抗體鏈的複合導致形成Fc區,增加生物半衰期和/或改變雙抗體的價。在兩條雙抗體多肽上併入IgG CH2-CH3結構域允許形成雙鏈雙特異性包含Fc區的雙抗體(圖2)。
可選地,僅僅在一條雙抗體多肽上併入IgG CH2-CH3結構域允許形成更複雜的四鏈雙特異性包含Fc區的雙抗體(圖3A-3C)。圖3C顯示具有恒定輕鏈(CL)結構域和恒定重鏈CH1結構域的代表性四鏈雙抗體,然而,可以可選地採用這類結構域的片段以及其他多肽(見,例如,圖3A和3B,美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910、歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此,例如,一條可應用源自人IgG的鉸鏈結構域的肽替代CH1結構域,所述肽具有氨基酸序列GVEPKSC(SEQ ID NO:96)VEPKSC(SEQ ID NO:97)或AEPKSC(SEQ ID NO:98),和一條可使用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸,GFNRGEC(SEQ ID NO:99)或FNRGEC(SEQ ID NO:100)替代CL結構域。包含四鏈雙抗體的代表性肽顯示在圖3A中。可選地,或另外,一條可使用包括具有相反電荷的串聯螺旋結構域的肽,比如“E螺旋”螺旋結構
域(SEQ ID NO:101: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K或SEQ ID NO:103:E VAA E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K);和“K螺旋”結構域(SEQ ID NO:102: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E或SEQ ID NO:104:K VAA K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)。包含四鏈雙抗體的代表性螺旋結構域顯示在圖3B中。
本發明包含Fc區的雙抗體分子一般包括另外的間插連接肽(連接體)。典型地,另外的連接體包括3-20個氨基酸殘基。可在本發明的包含Fc區的雙抗體分子中使用的另外的或可選的連接體包括:GGGS(SEQ ID NO:90)、LGGGSG(SEQ ID NO:91)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:92)、ASTKG(SEQ ID NO:93)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:109),LEPKSS(SEQ ID NO:94)、APSSS(SEQ ID NO:95)和APSSSPME(SEQ ID NO:110)、LEPKSADKTHTCPPC(SEQ ID NO:111)、GGC,和GGG。為了克隆方便,可使用SEQ ID NO:94代替GGG或GGC。另外,氨基酸GGG或SEQ ID NO:94可緊隨SEQ ID NO:109之後,以形成交替的連接體:GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:112);和LEPKSSDKTHTCPPCP;(SEQ ID NO:113)。除了連接體以外或代替連接體,本發明包含Fc區的雙抗體分子可併入IgG鉸鏈區。示例性鉸鏈區包括:來自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:114)、來自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:115)、來自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:116),和ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:117)、包括穩定化取代以減少鏈交換的IgG4鉸鏈變體。
如圖3A-3C中提供的,本發明的雙抗體可包括四條不同的鏈。這類雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域:(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域、和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含:(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源
二聚體-促進結構域,其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域,以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同,以便允許單特異性、雙特異性或四特異性的四價結合。符號“VL3”和“VH3”分別表示結合這類雙抗體的“第三”表位(“表位3”)的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似地,符號“VL4”和“VH4”分別表示結合這類雙抗體的“第四”表位(“表位4”)的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。本發明的包含Fc區的、代表性四鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表2中:
HPD=異源二聚體-促進結構域
在具體的實施方式中,本發明的雙抗體是雙特異性、四價(即,具有四個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體(圖3A-3C),其由總共四條多肽鏈組成。本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於LAG-3免疫特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合LAG-3的相同表位或結合與LAG-3的不同表位),和對於第二表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、
CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、I或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的兩個表位結合位點。
在進一步的實施方式中,雙特異性包含Fc區的雙抗體可包括三條多肽鏈。這類雙抗體的第一多肽包含三個結構域:(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二多肽包含:(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價鍵合的結構域。這類雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此,這類雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點,以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過涉及在它們各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此鍵合。值得注意的是,第一和第三多肽鏈彼此複合,以形成經二硫鍵穩定的Fc區。這類雙抗體具有增強的效價。圖4A和4B闡釋了這類雙抗體的結構。這類包含Fc區的雙特異性的雙抗體可具有兩個取向之一(表3):
HPD=異源二聚體-促進結構域
在具體的實施方式中,本發明的雙抗體是雙特異性、二價(即,具有兩個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體(圖4A-4B),其由總共三條多肽鏈組
成。本發明的雙特異性、二價、包含Fc的雙抗體包括對於LAG-3免疫特異性的一個表位結合位點,和對於第二表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的一個表位結合位點。
在進一步的實施方式中,雙特異性包含Fc區的雙抗體可包括總共五條多肽鏈。在具體的實施方式中,所述五條多肽鏈的兩條具有相同的氨基酸序列。這類雙抗體的第一多肽鏈包含:(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是抗體的重鏈,其包含VH1和重鏈恒定結構域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈包含:(i)包含VL1的結構域和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是抗體的輕鏈,其包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1。第一、第二和/或第五多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地,它們可以是重組構建的。這類雙抗體的第三多肽鏈包含:(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域,其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽包含:(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價鍵合的結構域。
因此,這類雙抗體的第一和第二以及第三和第五多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1結合位點。這類雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點,以及能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過涉及在它們各自恒定區中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此鍵合。值得注意的是,第一和第三多肽鏈彼此複合,以形成Fc區。這類雙抗體具有增強的效價。圖5圖解了這類雙抗體的結構。應當理解,VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同,
以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。但是,如本文提供的,優選地選擇這些結構域,以便結合LAG-3和第二表位(或第二和第三表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。第二和第三表位可以是相同抗原分子的不同表位或可以是不同抗原分子的表位。下面詳細討論本發明的這些方面。
因此,選擇多肽鏈的VL和VH結構域,以便形成對於期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同,以便允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。尤其地,可選擇VL和VH結構域,以便雙特異性雙抗體可包括針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點,或針對第一表位的三個結合位點和針對第二表位的一個結合位點,或針對第一表位的兩個結合位點,針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點(如圖5中所描繪)。本發明的代表性包含Fc區的五鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表4中:
HPD=異源二聚體-促進結構域
在具體的實施方式中,本發明的雙抗體是雙特異性、四價(即,具有四個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體,其由總共五條多肽鏈組成,具有針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點。在一個實施方式中,本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於LAG-3免疫特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合LAG-3的相同表位或結合LAG-3的不同表位),和對於第二表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的兩個表位結合位點。在另一實施方式中,本發明雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於LAG-3免疫特異性三個表位結合位點(其可能夠結合LAG-3的相同表位或結合LAG-3的不同表位),和對於第二表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的一個表位結合位點。在另一實施方式中,本發明雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包括對於LAG-3免疫特異性的一個表位結合位點,和對於第二表位(例如,B7-H3、B7-H4、BTLA、
CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)特異性的三個表位結合位點。
3.包含Fc區的雙特異性三價結合分子
本發明進一步的實施方式涉及包括Fc區並且能夠同時結合第一表位、第二表位和第三表位的雙特異性、三價結合分子,其中這類表位中的至少一個與這類表位中的另一個不同。這類雙特異性雙抗體因此包括能夠結合第一表位的“VL1”/“VH1”結構域,能夠結合第二表位的“VL2”/“VH2”結構域和能夠結合第三表位的“VL3”/“VH3”結構域。在一個實施方式中,這類表位中的一個或兩個是LAG-3的表位並且這類表位中的另一個(或其他)不是LAG-3的表位(例如,下述的表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4,ICOS、KIR、LAG-3、I或II類MHC、OX40、PD-1、PD-L1、TCR、TIM-3等)。這類雙特異性三價結合分子包括三個表位結合位點,其中兩個是雙抗體型結合結構域,其提供了結合位點A和結合位點B,和其中一個是非雙抗體型結合結構域,其提供了結合位點C(見,例如,圖6A-6F,和PCT申請號PCT/US15/33081和PCT/US15/33076)。
典型地,本發明的三價結合分子包括四條不同的多肽鏈(見圖6A-6B),但是,例如,通過彼此融合這類多肽鏈(例如,經肽鍵)或通過“分開”這類多肽鏈,以形成另外的多肽鏈,或通過經二硫鍵締合更少的或另外的多肽鏈,分子可包括更少或更多數量的多肽鏈。圖6B-6F通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這類分子闡釋了本發明的這個方面。如圖6A-6F中提供的,本發明的三價結合分子可具有可選的取向,其中雙抗體型結合結構域在Fc區的N-末端(圖6A、6C和6D)或C-末端(圖6B、6E和6F)。
在某些實施方式中,本發明的這類三價結合分子的第一多肽鏈包含:(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和
(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。VL1和VL2結構域位於包含CH2-CH3的結構域的N-末端或C-末端,如表5(圖6A和6B)中所顯示。這類實施方式的第二多肽鏈包含:(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這類實施方式的第三多肽鏈包含:(i)包含VH3的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以是抗體的重鏈,其包含VH3和重鏈恒定區。這類實施方式的第四多肽包含:(i)包含VL3的結構域和(ii)包含CL的結構域。第四多肽鏈可以是抗體的輕鏈,其包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3。第三或第四多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地,它們可經重組、合成通過其方式而構建。
第一和第二多肽鏈的可變輕鏈結構域通過長度過短的間插間隔連接體與這類多肽鏈的可變重鏈結構域分開,以允許它們的VL1/VH2(或它們的VL2/VH1)結構域締合在一起,以形成能夠結合第一或第二表位的表位結合位點。用於該目的的優選間插間隔肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:14):GGGSGGGG。三價結合分子的其他結構域可通過任選地包括半胱氨酸殘基的一個或多個間插間隔肽分開。本文提供了用於產生三價結合分子的示例性連接體,其也提供在PCT申請號:PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此,這類三價結合分子的第一和第二多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點,以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起,以形成能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。
如上述,本發明的三價結合分子可包括三條多肽。可通過將第四多肽N-末端的結構域連接至第三多肽的包含VH3的結構域獲得包括三條多肽鏈的三價結合分子。可選地,使用包含下述三個結構域的本發明的三價結合分子的第三多肽鏈:(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH3的結構域和(iii)包含CH2-CH3
序列的結構域,其中VL3和VH3通過足夠長(至少9個或更多個氨基酸殘基)的間插間隔肽彼此分開,以便允許這些結構域締合,以形成表位結合位點。
應當理解這類雙抗體分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同,以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。但是,如本文提供的,優選地選擇這些結構域,以便結合LAG-3和第二表位(或第二和第三表位)(優選地,這類表位是下述表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4、ICOS、KIR、LAG-3 I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)。
尤其地,可選擇VL和VH結構域,以便三價結合分子包括針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的一個結合位點,或針對第一表位的一個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點,或針對第一表位的一個結合位點、針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點。本發明的代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構提供在圖6A-6F和表5中:
HPD=異源二聚體-促進結構域
本發明的一個實施方式涉及雙特異性三價結合分子,其包括針對LAG-3的兩個表位結合位點和針對LAG-3之外的分子上存在的第二表位(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4,ICOS、KIR、LAG-3、I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)的一個表位結合位點。針對LAG-3的兩個表位結合位點可結合相同的表位或不同的表位。本發明的另一實施方式涉及雙特異性三價結合分子,其包括針對LAG-3的一個表位結合位點和結合LAG-3之外的分子上存在的第二抗原(例如B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD80、CD86、CD137、CTLA-4,ICOS、KIR、LAG-3、I或II類MHC、OX40、PD-L1、TCR、TIM-3等)的兩個表位結合位點。針對第二抗原的兩個表位結合位點可結合抗原的相同表位或不同表位(例如,LAG-3的相同表位或不同表位)。如上面所提供的,這類雙特異性三價結合分子可包括三條或四條多肽鏈。
VII.恒定結構域和Fc區
本文提供了可用於產生本發明結合LAG-3的分子(例如,抗體、雙抗體、三價結合分子等)的抗體恒定結構域。
如本文提供的,本發明的結合LAG-3的分子可包括Fc區。本發明這類分子的Fc區可以屬於任何同種型(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本發明的結合LAG-3的分子可進一步包括CH1結構域和/或鉸鏈區。當存在時,CH1結構域和/或鉸鏈區可以屬於任何同種型(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4),並且優選地屬於與期望的Fc區相同的同種型。
示例性CH1結構域是人IgG1 CH結構域。示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:120):ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG2 CH結構域。示例性人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:121):ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:122):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
一個示例性鉸鏈區是人IgG1鉸鏈區。示例性人IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:114):EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性鉸鏈區是人IgG2鉸鏈區。示例性人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:115):ERKCCVECPPCP。
另一示例性鉸鏈區是人IgG4鉸鏈區。示例性人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:116):ESKYGPPCPSCP。如本文所描述,IgG4鉸鏈區可包括穩定化的突變,比如S228P取代。示例性穩定化的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:117):ESKYGPPCP P CP。
本發明包含Fc區的分子(例如,抗體、雙抗體和三價分子)的Fc區可以是完整的Fc區(例如,完整的IgG Fc區)或僅僅Fc區的片段。任選地,本發明包含Fc區的分子的Fc區缺少C-末端賴氨酸氨基酸殘基。尤其地,本發明包含Fc區的分子的Fc區可以是工程化的變異的Fc區。儘管本發明雙特異性包含Fc區的分子的Fc區可以具有結合一個或多個Fc受體(例如,FcγR)的能力,但是更優選地這類變異的Fc區具有對FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)改變的結合(相對於野生型Fc區展示的結合),或具有對抑制受體基本上降低的或不能結合抑制受體。因此,本發明包含Fc區的分子的Fc區可包括完整的Fc區的一些或所有CH2結構域和/或一些或所有CH3結構域,或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其相對於完整的Fc區的CH2或CH3結構域,可包括,例如,一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這類Fc區可包括非Fc多肽部分,或可包括非天然完整Fc區的部分,或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(比如,例如,兩個CH2結構域或兩個CH3結構域,或者在N-末端至C-末端方向上,連接至CH2結構域的CH3結構域等)。
鑒定為改變效應子功能的Fc區修飾是本領域已知的,包括增加與啟動受體(例如,FcγRIIA(CD16A)的結合的修飾和減少與抑制受體(例如,FcγRIIB(CD32B)結合的修飾(見,例如,Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,”Cancer Res.57(18):8882-8890)。具有與CD32B降低的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc區的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以以任何組合或亞組合存在於人IgG1 Fc區中。在一個實施方式中,人IgG1 Fc區變體包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方式中,人IgG1 Fc區變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。
尤其地,本發明包含Fc區的分子的多肽鏈的CH2-CH3結構域優選地展示對FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1)展示的結合)。上面敘述了能夠介導這類改變的結合的變異的Fc區和突變體形式。在具體的實施方式中,本發明的包含Fc區的分子包括展示降低的ADCC效應子功能的IgG Fc區。在優選的實施方式中,這類分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括下述的任何1、2或3個取代:L234A、L235A、N297Q和N297G。在另一實施方式中,人IgG Fc區變體包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代,因為這些突變消除了FcR結合。可選地,使用固有地展示對FcγRIIIA(CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1)展示的結合)的Fc區的CH2-CH3結構域。在具體的實施方式中,本發明包含Fc區的分子包括IgG2 Fc區(SEQ IDNO:2)或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:4)。當使用IgG4 Fc區時,本發明也包
括引入穩定化突變,比如上述的鉸鏈區S228P取代(見,例如,SEQ ID NO:117)。因為N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效應子功能,在期望效應子功能的情況下,優選地將不採用這些取代。
其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
尤其地,本發明包含Fc區的分子的多肽鏈的Fc區優選地展示增加的血清半衰期(相對於相應的野生型Fc展示的半衰期)。上面敘述了展示延長的血清半衰期的變異的Fc區和突變體形式。在優選的實施方式中,這類包含Fc區的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括下述任何1、2或3個取代:M252Y、S254T和T256E。本發明進一步包括本發明包含Fc區的分子,其包括變異的Fc區,所述Fc區包括:(A)改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變;和(B)延長血清半衰期的一個或多個突變。
其中,X是賴氨酸(K)或不存在
其中,X是賴氨酸(K)或不存在
對於第一和第三多肽鏈不同的雙抗體和三價結合分子,期望減少或防止兩個第一多肽鏈的CH2-CH3結構域之間或兩個第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間發生同源二聚化。這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列相同,並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如,氨基酸取代(優選以包括形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3結構域中,以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域--即“臼(hole)”(例如,用甘氨酸取代)--配對。這樣的突變組可被工程化到任意對的包括形成Fc區的CH2-CH3結構域的多肽中。蛋白質工程化以相對於同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的,尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言,這些都包括在本文中(見例如,Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr.9:617-621;Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35;和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor Cell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101;其每一篇通過引用以其整體併入本文)。優選地“杵”被工程化至包括三條多肽鏈的雙抗體的第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化至第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此,“杵”有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。因為第三多肽鏈優選地包含“臼”取代,其將與第一多肽鏈異源二聚化以及和本身同源二聚化。該策略可用於上面詳述的包括三條、四條或五條鏈的雙抗體和三價結合分子,其中“杵”被工程化至第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化至第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。
經修飾IgG Fc區以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾IgG Fc區以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從最終的雙特異性的異源二聚化的包含Fc區的分子中純化含臼的第三多肽鏈同源二聚體,優選地通過在435位氨基酸取代(H435R)突變第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此,含臼的第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A,而雙特異性的異源二聚體經在第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點保持其結合蛋白質A的能力。在可選的實施方式中,含臼的第三多肽鏈可併入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
具有兩條多肽鏈的本發明包含Fc區的分子的第二多肽鏈(或具有三條、四條或五條多肽鏈的包含Fc區的分子的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域的優選的IgG1氨基酸序列具有“含臼的”序列(SEQ ID NO:127):
其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
如將認識到,SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127的CH2-CH3結構域包括在234位元用丙氨酸的取代和235位用丙氨酸的取代,因此形成展示對FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上沒有)結合的Fc區(相對於野生型Fc區(SEQ ID NO:1)展示的結合)。本發明也包括這類CH2-CH3結構域,其在234和/或235位包括丙氨酸殘基和/或修飾Fc區的效應子功能和/或FγR結合活性的可選的和/或另外的取代。本發明也包括這類CH2-CH3結構域,其進一步包括一個或多個半衰期延長的氨基酸取代。尤其地,本發明包括這類含臼的和這類含杵的CH2-CH3結構域,其進一步包括M252Y/S254T/T256E。
優選地第一多肽鏈具有“含杵的”CH2-CH3序列,比如SEQ ID NO:126的序列。但是,如將認識到的,“含臼的”CH2-CH3結構域(例如,SEQ ID NO:127)可用在第一多肽鏈中,在該情況下,“含杵的”CH2-CH3結構域(例如,
SEQ ID NO:126)將用在具有兩條多肽鏈的本發明包含Fc區的分子的第二多肽鏈(或具有三條、四條或五條多肽鏈的包含Fc區的分子的第三多肽鏈)中。
如上面詳述的,本發明包括包含Fc區的分子(例如,抗體和包含Fc區的雙抗體),其具有野生型CH2和CH3結構域,或具有包括上述取代組合的CH2和CH3結構域。包括這類變異的IgG1 CH2-CH3結構域的示例性氨基酸序列是(SEQ ID NO:128):
其中:(a)X1和X2都是L(野生型)或都是A(降低的FcγR結合);(b)X3、X4和X5各自是M、S和T(野生型)或Y、T和E(延長的半衰期),(c)X6、X7和X8各自是T、L和Y(野生型)或W、L和Y(杵)或S、A和V(臼);(d)X9和X10各自是N和H(野生型)或N和R(沒有蛋白質A結合)或A和K(沒有蛋白質A結合);和(e)X11是K或不存在。
在其他實施方式中,本發明包括結合LAG-3的分子,其包括已經使用本領域已知的突變被工程化以相對於同源二聚化利於異源二聚化的CH2和/或CH3結構域,比如PCT公開號WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中公開的那些,其所有通過引用以其整體併入本文。
VIII.參考抗體
A.參考抗LAG-3抗體
為了評估和表徵本發明新的結合抗-LAG-3的分子,使用下述參考抗體:25F7(BMS-986016,Medarex/BMS,本文命名為“LAG-3mAb A”)。
1. 25F7(“LAG-3 mAb A”)
B.參考抗PD-1抗體
為了評估和表徵本發明的新的結合LAG-3的分子組合抗PD-1抗體的活性,可使用參考抗體。對於PD-1免疫特異性的抗體是已知的(見,例如,美國專利號8,008,449、8,552,154、PCT專利公開WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668),其包括:尼魯單抗(nivolumab)(也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106,並且由Bristol-Myers Squibb以OPDIVO®售賣),本文命名為“PD-1 mAb 1”;派姆單抗(pembrolizumab)(之前稱為lambrolizumab,也稱為MK-3475、SCH-900475、並且由Merck以KEYTRUDA®
售賣),本文命名為“PD-1 mAb 2”;EH12.2H7(Dana Farber),本文命名為“PD-1 mAb 3”;皮地珠單抗(也稱為CT-011,CureTech),本文命名為“PD-1 mAb 4”。
1.尼魯單抗(“PD-1 mAb 1”)
2.派姆單抗(“PD-1 mAb 2”)
3. EH12.2H7(“PD-1 mAb 3”)
4.皮地珠單抗(Pidilizumab)(“PD-1 mAb 4”)
I.生產方法
可通過本領域已知的方法,例如,經合成或重組由LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體的多核苷酸和/或序列產生抗LAG-3多肽和其他LAG-3激動劑、拮抗劑和調節劑。產生這類肽激動劑、拮抗劑和調節劑的一種方法涉及多肽的化學合成,隨後在適於獲得天然構象,即,正確的二硫鍵連接的氧化條件下處理。這可使用本領域技術人員熟知的方法完成(見,例如,Kelley,R.F.等(1990),在以下中:Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.Ed.,Plenum Press,N.Y.,vol.12,pp 1-19;Stewart,J.M等(1984)Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL;也見美國專利號4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925)。
可使用固相肽合成常規製備本發明的多肽(Merrifield,B.(1986)“Solid Phase Synthesis,”Science 232(4748):341-347;Houghten,R.A.(1985)“General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135;Ganesan,A.(2006)“Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
在仍另一可選方式中,可通過使用商業上可得的已經被工程化而表達特異性人免疫球蛋白蛋白質的小鼠獲得完全人抗體或其可溶性形式,其具有LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的一個或多個CDR,或其與LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6競爭結合人LAG-3。設計為產生更期望的(例如,完全人抗體)或更強力免疫應答的轉基因動物也可用於產生人源化抗體或人抗體。這類技術的例子是XenoMOUSETM(Abgenix,Inc.,
Fremont,CA)和HuMAb-MOUSE®和TCMOUSETM(都來自Medarex,Inc.,Princeton,NJ)。
在可選方案中,可重組製備抗體和使用本領域已知的任何方法表達。可如下經重組製備抗體:首先從宿主動物分離製備的抗體,獲得基因序列,和使用基因序列在宿主細胞(例如,CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如,煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法已經被公開了(見,例如,Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,”Vaccine 19:2756;Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13:65-93;和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,”J.Immunol Methods 231:147-157)。製備抗體衍生物,例如,人源化抗體、單鏈抗體等的適當的方法是本領域已知的。在另一可選方案中,可通過噬菌體展示技術重組製備抗體(見,例如,美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter,G.等(1994)“Making Antibodies By Phage Display Technology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
可通過Edman降解對感興趣的抗體或蛋白質進行測序,其是本領域技術人員熟知的。從質譜或Edman降解產生的肽資訊可用於設計用於克隆感興趣的蛋白質的探針或引物。
克隆感興趣的蛋白質的可選方法是通過使用純化的LAG-3或其部分“淘選”這樣的細胞,所述細胞表達感興趣的抗體或蛋白質,所述感興趣的抗體或蛋白質具有AG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的一個或多個CDRL或與LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6競爭結合人LAG-3。可如下進行“淘洗”程式:從表達LAG-3的組織或細胞獲得cDNA文庫、
在第二細胞類型中過表達cDNA,和在存在或沒有LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6的情況下針對特異性結合LAG-3篩選轉染的第二細胞類型的細胞。用於通過“淘選”克隆編碼細胞表面蛋白的哺乳動物基因的方法的詳細描述可見於現有技術(見,例如,Aruffo,A.等(1987)“Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:8573-8577和Stephan,J.等(1999)“Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development:Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,”Endocrinol.140:5841-5854)。
含有感興趣的多核苷酸的載體可通過一些適當手段中的任意手段被引入到宿主細胞中,所述適當手段包括電穿孔;採用氯化鈣、銣氯化物、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染;微彈轟擊(microprojectile bombardment);脂轉染;和感染(例如,在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇常常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被使用,用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非的限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地,相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質(如果存在),宿主細胞以約5-倍,更優選10-倍,甚至更優選20-倍的水準表達cDNA。通過免疫試驗或FACS實現篩選特異性結合LAG-3的宿主細胞。可鑒定過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。
本發明包括含有本發明抗體的氨基酸序列的多肽。本發明的多肽可通過本領域中已知的方法製備。通過上述重組方法(即,單一或融合多肽)或通過化學合成,可經蛋白水解或抗體的其他降解產生多肽。抗體的多肽,尤其地,上至約50個氨基酸的較短的多肽,通過化學合成被常規製備。化學合成方法在
本領域中是已知的,並且是商業上可得到的。例如,抗LAG-3多肽可通過採用固相方法的自動多肽合成儀產生。
本發明包括LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體的變體和它們的結合LAG-3的多肽片段,包括功能上等同的抗體和不明顯影響這類分子性質的融合多肽以及具有增強的或降低的活性的變體。多肽的修飾在本領域中是常規操作,因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽:其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加,或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於:甘氨酸/丙氨酸;絲氨酸/蘇氨酸;纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸;天冬醯胺/穀氨醯胺;天冬氨酸/谷氨酸;賴氨酸/精氨酸;和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽,所述其它翻譯後修飾,諸如例如,用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地,氨基酸取代應該是保守的,即,取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的,並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計(redesign)。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術,包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如,連接標籤用於免疫分析,諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備,並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。
本發明包括融合蛋白,其包括本發明的一個或多個多肽或LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體。在一個實施方式中,提供的融合多肽包括輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈二者。在另一實施方式中,融合多肽包含異源免疫球蛋白恒定區。在另一實施方式中,
融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。為了本發明的目的,抗體融合蛋白包含特異性結合LAG-3的一個或多個多肽結構域和其在天然分子中未連接的另外的氨基酸序列,所述另外的氨基酸序列例如,來自另一區域的異源序列或同源序列。
X.本發明的結合LAG-3的分子的用途
本發明包括組合物,包括藥物組合物,其包括本發明的結合LAG-3的分子(例如,抗LAG-3抗體、抗LAG-3雙特異性雙抗體等),由這類分子衍生的多肽,包括編碼這類分子或多肽的序列的多核苷酸,和如本文所描述其他試劑。
如上所討論,LAG-3在負調節T細胞增殖、功能和穩態中起到重要的作用。本發明的結合LAG-3的分子具有抑制LAG-3功能的能力,並且因此逆轉LAG-3-介導的免疫系統抑制。因此,LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5和LAG-3 mAb 6、它們的人源化衍生物和包括它們的結合LAG-3的片段的分子(例如,雙特異性雙抗體等)或競爭結合這類抗體的分子可用於阻斷LAG-3-介導的免疫系統抑制,並且從而促進免疫系統的啟動。
本發明的結合LAG-3的雙特異性分子,其結合LAG-3和參與調節細胞表面上存在的免疫檢查點的另一分子(例如,PD-1),通過阻斷由LAG-3和這類免疫檢查點分子介導的免疫系統抑制而增強免疫系統。因此,本發明的結合LAG-3的分子可用於增強受試者的免疫應答(例如,T細胞介導免疫應答)。尤其地,本發明的結合LAG-3的分子可用於治療與非期望的被抑制的免疫系統相關的任何疾病或病況,包括與病原體(例如,細菌、真菌、病毒或原生動物感染)的存在相關的癌症和疾病。
可通過本發明的結合LAG-3的分子治療的癌症包括特徵在於存在選自由下述細胞組成的組的癌症細胞的癌症:腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、
軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
尤其地,本發明的結合LAG-3的分子可用於治療結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤;肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌。
可由本發明的結合LAG-3的分子治療的病原體相關的疾病包括慢性病毒、細菌、真菌和寄生蟲感染。可由本發明的結合LAG-3的分子治療的慢性感染包括愛潑斯坦-巴爾病毒、甲肝病毒(HAV);乙肝病毒(HBV);丙肝病毒(HCV);皰疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、霍亂(Cholera)、白喉(Diphtheria)、腸桿菌屬(Enterobacter)、淋球菌(Gonococci)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、軍團菌屬(Legionella)、腦膜炎球菌(Meningococci)、分歧桿菌(mycobacteria)、假單胞菌屬
(Pseudomonas)、Pneumonococci、rickettsiabacteria、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Streptococci)、破傷風(Tetanus)、曲黴菌屬(Aspergillus)(煙麯黴(A.fumigatus)、黑麯黴(A.niger)等),皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis),念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(C.albicans)、克柔假絲酵母(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、熱帶念珠菌(C.tropicalis)等)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、毛黴目(Mucorales)的屬(毛黴屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis),粗球黴菌(Coccidioides immitis)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、細螺旋體病(Leptospirosis)、包柔氏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、蠕蟲寄生蟲(鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁形蟲(例如血吸蟲(Schistosomia))、藍氏賈第蟲(Giardia lambia)、旋毛蟲(trichinella)、脆雙核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼蟲(Leishmania donovani)。
本發明的結合LAG-3的分子可與免疫原性試劑,比如腫瘤疫苗組合。這類疫苗可包括純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子),自體或異源的腫瘤細胞。已經描述了許多腫瘤疫苗策略(見例如,Palena,C.,等(2006)“Cancer vaccines:preclinical studies and novel strategies,”Adv.Cancer Res.95,115-145;Mellman,I.等(2011)“Cancer immunotherapy comes of age,”Nature 480,480-489;Zhang,X.M.等(2008)“The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides,”Oncol.Rep.20,245-252;Disis,M.L.等(2002)“Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines,”J.Clin.Oncol.20:2624-2632;Vermeij,R.等(2012)“Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide In Ovarian Cancer:A Single-Arm Phase II Study.”Int.J.Cancer
131:E670-E680)。本發明的結合LAG-3的分子可與化療方案組合。在這些情況下,可能降低施用的化療試劑的劑量(Mokyr.M.B.等(1998)“Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA-4 Blockade In Low-Dose Chemotherapy-Treated Tumor-Bearing Mice,”Cancer Research 58:5301-5304)。
本發明的結合LAG-3的分子可與其他免疫刺激分子,比如啟動宿主免疫應答以提供增加水準的T細胞啟動的抗體,組合。尤其地,已經證明抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體和/或抗CTLA-4抗體啟動免疫系統(見,例如,del Rio,M-L.等(2005)“Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation,”Eur.J.Immunol 35:3545-3560;Barber,D.L.等(2006)“Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection,”Nature 439,682-687;Iwai,Y.等(2002)“Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade,”Proc.Natl Acad.Sci.USA 99,12293-12297;Leach,D.R.,等(1996)“Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade,”Science 271,1734-1736)。可與本發明的結合LAG-3的分子組合的另外免疫刺激分子包括啟動樹突細胞(DC)功能和抗原呈遞的針對樹突細胞表面上的分子的抗體、能夠代替T細胞助細胞活性的抗CD40抗體、和針對T細胞共刺激分子的啟動抗體,比如PD-L1、CTLA-4、OX-40 4-1BB和ICOS(見,例如,Ito等(2000)“Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies,”Immunobiology 201:527-40、美國專利號5,811,097;Weinberg等(2000)“Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity,”Immunol 164:2160-2169;Melero等(1997)“Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,”Nature Medicine 3:
682-685;Hutloff等(1999)“ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28,”Nature 397:263-266;和Moran,A.E.等(2013)“The TNFRs OX40,4-1BB,and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy,”Curr Opin Immunol.2013 Apr;25(2):10.1016/j.coi.2013.01.004),和/或刺激性嵌合抗原受體(CAR),其包括針對與來自各種共刺激蛋白質受體(例如,CD28、4-1BB、ICOS、OX40等)的一個或多個細胞內信號傳導結構域融合的疾病抗原的抗原結合結構域,其用於在抗原結合時刺激T細胞(見,例如,Tettamanti,S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,”Br.J.Haematol.161:389-401;Gill,S.等(2014)“Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,”Blood 123(15):2343-2354;Mardiros,A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,”Blood 122:3138-3148;Pizzitola,I.等(2014)“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,”Leukemia 28(8):1596-1605)。
本發明的結合LAG-3的分子可與抑制性嵌合抗原受體(iCAR)組合,以轉移(divert off)靶向免疫療法應答。iCAR抗原結合結構域,其針對與來自各種抑制性蛋白質受體(例如,CTLA-4、PD-1等)的一個或多個細胞內信號傳導結構域融合的疾病抗原,其用於在抗原結合時約束T-細胞應答(見,例如,Fedorov V.D.(2013)“PD-1- and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs)Divert Off-Target Immunotherapy Responses,”Sci Tranl Med.5(215):215ra172)。
尤其地,本發明的抗LAG-3抗體與抗CD137抗體、抗OX40抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和/或癌症疫苗組合使用。
除了它們在療法中的用途,本發明的結合LAG-3的分子可被可檢測地標記並且用於檢測樣品中的LAG-3或用於細胞上LAG-3的成像。
XI.藥物組合物
本發明的組合物包括原料藥組合物(bulk drug composition),其可用於製備藥學組合物(例如,不純或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即,適於施用給受試者或患者的組合物)。這樣的組合物包括預防有效量的或治療有效量的本發明的結合LAG-3的分子或這類劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地,本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的結合LAG-3的分子和藥學上可接受的載體。本發明尤其包括這類藥物組合物,其中結合LAG-3的分子是:LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體;人源化的LAG-3 mAb 1;LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體;任何這類抗體的結合LAG-3的片段;或其中結合LAG-3的分子是雙特異性LAG-3雙抗體(例如,LAG-3xPD-1雙特異性的雙抗體)。尤其包括這類分子,其包括LAG-3 mAb 1的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 2的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 3的3個CDRL和3個CDRH;或包括LAG-3 mAb 4的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 5的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 6的3個CDRL和3個CDRH。
本發明還包括這樣的藥學組合物,其另外包括對特定癌抗原是特異性的第二治療抗體(例如,腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學上可接受的載體。
在具體實施方式中,術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中,供用於動物,特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體,如水和油,包括石油、動物油、植物油或合成來源的油,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時,水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液體載體,特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要,組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。
通常,本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起,例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物,所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時,其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物,則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水,以便可以在施用前混合所述成分。
可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽,所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子,並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。
本發明也提供了藥物包裝或試劑盒,其包括一個或多個容器,所述容器填充本發明的結合LAG-3的分子(更優選地,LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb
2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體;人源化的LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體;任何這類抗體的結合LAG-3的片段;或其中結合LAG-3的分子是雙特異性LAG-3雙抗體(例如,LAG-3xPD-1雙特異性雙抗體))。尤其包括這類分子,其包括LAG-3 mAb 1的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 2的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 3的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 4的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 5的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 6的3個CDRL和3個CDRH,單獨地或與這類藥學上可接受的載體一起。另外,用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒,其包括一個或多個容器,所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice),所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
本發明提供了可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可包括本發明的任何結合LAG-3的分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑;和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一種或多種癌症抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施方式中,其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中,預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。
XII.施用方法
通過向受試者施用有效量的本發明的融合蛋白或綴合分子或包括本發明的融合蛋白或綴合分子的藥學組合物,可以提供本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面,
這類組合物基本上是純的(即,基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中,受試者是動物,優選哺乳動物,如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如,猴子,如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中,受試者是人。
各種送遞系統是已知的,並且可以用於施用本發明的組合物,例如封裝於脂質體中、微粒、微膠囊、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見,例如,Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用本發明的分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中,本發明的結合LAG-3的分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用,例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining)(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收,並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外,也可以應用肺給藥,例如通過使用吸入器或噴霧器,並且與霧化劑一起配製。見,例如,美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078;和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903,其每一篇通過參考以其整體併入本文。
本發明也使得本發明的結合LAG-3的分子包裝在密封容器中,比如指示分子的數量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中,這樣的分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中,並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度,用於施用於受試者。優選地,本發明的結合LAG-3的分子作為凍幹無菌粉提供於密封容器中。
本發明的凍幹的結合LAG-3的分子應在它們的初始容器中儲存在2℃和8℃之間,並且分子應該在重構之後12小時內,優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中,這樣的分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地,這類結合LAG-3的分子在液體形式提供時,被供應在密封容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的路徑和病況的嚴重性,並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
如本文所使用,在一個實施方式中,“有效量”的藥物組合物是足夠實現有益的期望的結果的量,所述結果包括但不限於臨床結果比如減少源自疾病的症狀、減少感染的症狀(例如,病毒量、發燒、疼痛、敗血症等)或癌症的症狀(例如,癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等),從而提高遭受疾的患者的生命品質,降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、比如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展,和/或延長個體的生存。
可在一次或多次施用中施加有效量。為了本發明的目的,有效量的藥物、化合物或藥物組合物是足夠減少病毒存在的增殖(或影響)和直接或間接減少和/或延遲病毒疾病的發展的量。在一些實施方式中,藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此,“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮,並且如聯合一種或多種其他劑,可實現或實現期望的結果,則單劑可視為以有效量施用。儘管個體的需要不同,但是測定每種組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員已知的。
對於本發明包括的結合LAG-3的分子(例如,抗體、雙抗體等),向患者施用的劑量優選地基於接受受試者的體重(kg)確定。對於本發明包括的
LAG結合分子,向患者施用的劑量通常是至少約0.01μg/kg體重、至少約0.05μg/kg體重、至少約0.1μg/kg體重、至少約0.2μg/kg體重、至少約0.5μg/kg體重、至少約1μg/kg體重、至少約2μg/kg體重、至少約3μg/kg體重、至少約5μg/kg體重、至少約10μg/kg體重、至少約20μg/kg體重、至少約30μg/kg體重、至少約50μg/kg體重、至少約100μg/kg體重、至少約250μg/kg體重、至少約750μg/kg體重、至少約1.5mg/kg體重、至少約3mg/kg體重、至少約5mg/kg體重或至少約10mg/kg,至少約30mg/kg、至少約50mg/kg、至少約75mg/kg、至少約100mg/kg、至少約125mg/kg、至少約150mg/kg體重或更多。基於患者在基線時的體重施用計算的劑量。體重由基線或確定的穩定狀態(plateau)重量的顯著(10%)改變將提示重新計算劑量。
在一些實施方式中,對於本發明包括的結合LAG-3的雙特異性分子(例如,雙抗體和三價結合分子),向患者施用的劑量通常是至少約0.3ng/kg每天至約0.9ng/kg每天、至少約1ng/kg每天至約3ng/kg每天、至少約3ng/kg每天至約9ng/kg每天、至少約10ng/kg每天至約30ng/kg每天、至少約30ng/kg每天至約90ng/kg每天、至少約100ng/kg每天至約300ng/kg每天、至少約200ng/kg每天至約600ng/kg每天、至少約300ng/kg每天至約900ng/kg每天、至少約400ng/kg每天至約800ng/kg每天、至少約500ng/kg每天至約1000ng/kg每天、至少約600ng/kg每天至約1000ng/kg每天、至少約700ng/kg每天至約1000ng/kg每天、至少約800ng/kg每天至約1000ng/kg每天、至少約900ng/kg每天至約1000ng/kg每天或至少約1,000ng/kg每天。基於患者在基線時的體重施用計算的劑量。體重由基線或確定的穩定狀態重量的顯著(10%)改變將提示重新計算劑量。
在另一實施方式中,患者施用的治療方案包括一個或多個劑量的這類預防或治療有效量的本發明的結合LAG-3的分子,其中治療方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施方式中,治療方案包括間歇地施
用預防或治療有效量的本發明的結合LAG-3的分子的劑量(例如,在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量,並且不施用預防或治療有效量的結合LAG-3的分子(尤其地,LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5,LAG-3 mAb 6抗體;人源化的LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5或LAG-3 mAb 6抗體;任何這類抗體的結合LAG-3的片段;或其中結合LAG-3的分子是雙特異性LAG-3雙抗體(例如,LAG-3xPD-1雙特異性的Fc雙抗體)的劑量。尤其包括的是(在同一周的第5天、第6天和第7天)施用分子,所述分子包括LAG-3 mAb 1的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 2的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 3的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 4的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 5的3個CDRL和3個CDRH;或其包括LAG-3 mAb 6的3個CDRL和3個CDRH。典型地,有1、2、3、4、5或更多個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。
在另一實施方式中,施用劑量在方案的前四分之一、前一半或前三分之二或四分之三(例如,4個療程治療的第一、第二或協力廠商案)中上升,直到實現日預防或治療有效量的結合LAG-3的分子。針對用雙抗體治療的典型療程,表6提供了上述5個不同給藥方案的例子。
可通過修飾,比如例如脂質化,提高分子的吸收和組織滲透,從而減少或改變本發明的結合LAG-3的分子的施用劑量和頻率。
可計算向患者施用的本發明的結合LAG-3的分子的劑量,用作單劑療法。可選地,分子可與其他治療性組合物聯合使用,並且向患者施用的劑量比當所述分子用作單劑療法時更低。
本發明的藥物組合物可被局部施用至需要治療的區域;這可通過例如,但不限於下述方式實現:局部注入、通過注射、或通過植入物的手段,所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料,包括膜,比如矽橡膠膜或纖維。優選地,當施用本發明的分子時,必須注意使用不吸收該分子的材料。
本發明的組合物可在泡狀體(vesicle),尤其是脂質體中遞送(見Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533);Treat等,在以下中:Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,同上,pp.3 17-327)。
本發明的組合物可以在控釋或緩釋系統中遞送。本領域技術人員已知的任何技術均可用於產生包括本發明的一個或多個結合LAG-3的分子的緩釋製劑。見,例如,美國專利號4,526,938;PCT公開WO 91/05548;PCT公開WO 96/20698;Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179-189;Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854;和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其每一篇通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中,泵可用於控釋系統(見Langer,上文;Sefton,(1987)“Implantable Pumps,”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240;Buchwald等(1980)“Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88:507-516;和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一個實施方式中,聚合材料可用於實現分子的控釋(見,例如Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Releade Diphosphonate,”Science 228:190-192;During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In Vivo Characterization,”Ann.Neurol.25:351-356;Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112);美國專利號5,679,377;美國專利號5,916,597;美國專利號5,912,015;美國專利號5,989,463;美國專利號5,128,326;PCT公開號WO 99/15154;和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑中所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控釋系統可接近治療靶(例如,肺)佈置,因此僅僅需要全身劑量的一部分(見,例如,Goodson,在以下中:Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp.115-138(1984))。根據Dunn等(見U.S.5,945,155),使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。該特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植可通常發生於患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統,由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中,移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織流中,並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱,形成固體微孔基質(見U.S.5,888,533)。
Langer的綜述中討論了控釋系統(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見,例如,美國專利號4,526,938;國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698;Ning等(1996)“Intratumoral Radiaimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39:179-189;Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal
of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854;和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其每一篇通過引用以其整體併入本文。
在本發明的組合物是編碼本發明的結合LAG-3的分子的核酸的情況下,核酸可被體內施用,以通過如下方式促進其編碼的結合LAG-3的分子的表達:將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其成為細胞內的,例如,通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286),或通過直接注射,或通過使用微粒轟擊(例如,基因槍;生物彈道技術(Biolistic),Dupont),或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑包被,或通過與已知進入核的同源框樣肽聯合施用(見例如,Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等。可選地,可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中,以進行表達。
用治療或預防有效量的本發明的結合LAG-3的分子治療受試者可包括單治療,或優選地,可包括一系列治療。在優選的實施例中,用這類雙抗體治療受試者每週一次,持續約1至10周,優選地2至8周,更優選地約3至7周,和甚至更優選地持續約4、5或6周。本發明的藥物組合物可每天施用一次、每天施用兩次或每天施用三次。可選地,藥物組合物可每週施用一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次。也將認識到,用於治療的分子的有效劑量可隨著具體治療的療程而增加或降低。
實施例
現已經一般性描述了本發明,通過參考下述實施例本發明將更容易理解,所述實施例以示例的方式提供而不旨在限制本發明,除非指出。在不背離本公開範圍的情況下可對材料和方法的進行許多修飾,這對本領域技術人員顯而易見的。
I.實施例1:抗LAG-3單克隆抗體LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5,和LAG-3 mAb 6的表徵
分離六個鼠單克隆抗體,其能夠免疫特異性結合人和食蟹猴兩者的LAG-3,並且命名為“LAG-3mAb 1”、“LAG-3mAb 2”、“LAG-3 mAb 3”、“LAG-3 mAb 4”、“LAG-3 mAb 5”和“LAG-3 mAb 6”。發現這些抗體的CDR不同並且在上文提供。LAG-3 mAb 1被人源化,產生兩個人源化的VH結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 1 VH-1”和“hLAG-3 mAb 1 VH-2”,以及四個人源化的VL結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 1 VL-1”、“hLAG-3 mAb 1 VL-2”、“hLAG-3 mAb 1 VL-3”和“hLAG-3 mAb 1 VL-4”。LAG-3 mAb 6也被人源化,產生兩個人源化的VH結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 6 VH-1”和“hLAG-3 mAb 6VH-2”,以及兩個人源化的VL結構域,本文命名為“hLAG-3 mAb 6 VL-1”和“hLAG-3 mAb 6 VL-2”。如上面提供的,給定抗體的人源化的重鏈和輕鏈可變結構域可以以任何組合使用,並且人源化的可變結構域的具體組合通過參考特定VH/VL結構域命名,例如包括hLAG-3 mAb 1 VH-1和hLAG-3 mAb 1 VL-2的人源化抗體具體稱為“hLAG-3 mAb 1(1.2)”。
如下構建人源化的全長mAb:人源化的VL結構域的C-末端與人輕鏈κ區的N-末端融合,以產生輕鏈,並且每條輕鏈與包括與人IgG1恒定區或人IgG4恒定區的N-末端融合的相同抗體的人源化的VH結構域的重鏈配對,所述人IgG1恒定結構域包括L234A/L235A(AA)取代,所述人IgG4恒定結構域包括S228P取代。
其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
在SEQ ID NO:139中,氨基酸殘基1-98對應於IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:120),氨基酸殘基99-113對應於IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:114)和氨基酸殘基114-329對應於包括L234A/L235A取代(加底線的)的IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:123)。
其中,X是賴氨酸(K)或不存在。
在SEQ ID NO:140中,氨基酸殘基1-98對應於IgG4 CH1結構域(SEQ ID NO:122),氨基酸殘基99-110對應於包括S228P取代(加底線的)的穩定
化的IgG4鉸鏈區(SEQ ID NO:117)並且氨基酸殘基111-326對應於IgG4 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:4)。
使用Biacore分析研究抗體LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5、LAG-3 mAb 6、若干人源化的抗體和參考抗體LAG-3 mAb A的結合動力學。捕獲抗LAG-3抗體並且用標記His的可溶性人LAG-3(shLAG-3-His)溫育以及提供Biacore分析測定結合的動力學。計算的ka、kd和KD呈現在表7中。
a=在固定的Fab2山羊抗小鼠Fc上捕獲的
b=在固定的蛋白質G上捕獲的
c=在固定的Fab2山羊抗人Fc上捕獲的
d=在固定的蛋白質A上捕獲的
e=人IgG1(AA)f=IgG4(S228P)。
在另外的研究中,使用Biacore分析研究了人源化抗體hLAG-3 mAb 1(1.4)和hLAG-3 mAb 6(1.1),和參考抗體LAG-3 mAb A對人和食蟹猴LAG-3的結合動力學。在這些研究中,在Fab2山羊抗小鼠Fc表面上捕獲可溶性LAG-3融合蛋白(與鼠IgG2a融合的人或食蟹猴LAG-3的細胞外結構域),並且用抗LAG-3抗體孵育,以及經Biacore分析測定結合的動力學。LAG-3 mAb A、hLAG-3 mAb 1(1.4)和hLAG-3 mAb 6(1.1)結合食蟹猴LAG-3的結合曲線分別顯示在圖7A-7C中,並且計算的ka、kd和KD呈現在表8中。在單獨的研究中,使用Biacore分析研究了包括hLAG-3 mAb 6(1.1)的雙特異性包含Fc區的雙抗體與人和食蟹猴LAG-3的結合。在該研究中,在Fab2山羊抗人Fc表面上捕獲包含hLAG-3 mAb 6(1.1)的雙抗體,並且用可溶性LAG-3融合蛋白(與His標籤融合的人或食蟹猴LAG-3的細胞外結構域)孵育,以及經Biacore分析測定結合的動力學。計算的ka、kd和KD呈現在表8中。
a=固定的人或食蟹猴LAG-3-鼠IgG2融合蛋白
b=固定的包括hLAG-3 mAb 6(1.1)表位元-結合結構域的包含Fc區的雙抗體
結果表明LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6展示比參考抗體LAG-3 mAb A更好的結合動力學。另外,人源化的LAG-3 mAb 6展示與食蟹猴LAG-3更好的交叉活性結合動力學。
使用Biacore分析檢驗LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 6和參考抗體LAG-3 mAb A的表位特異性。為了確定抗體是否結合不同的LAG-3表位,通過固定在CM5感測器晶片上的小鼠抗PentaHis抗體,根據製造商推薦的程式,捕獲shLAG-3-His。簡言之,通注入包含0.2M N-乙基-N-(3二乙氨基-丙基)碳二亞胺和0.05M N-羥基-琥珀醯亞胺的溶液啟動感測器晶片表面上的羧基。在啟動的CM5表面上,在10mM醋酸鈉中,pH 5.0,注入抗PentaHis抗體,流速為5μL/min,隨後注入1M乙醇胺,用於使剩餘的胺-活性基團失活。在HBS-EP緩衝液中進行結合實驗,所述緩衝液包含10mM HEPES,pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、和0.005% P20表面活性劑。在捕獲的hLAG3-His上預先注入每種抗體(LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 6和LAG-2 mAb A),達180秒,流速為5μL/min,濃度為1μM,隨後使緩衝液流動,並且在相同條件下注入競爭抗體。將競爭抗體的結合應答與其對預先注入緩衝液的hLAG3-His的結合應答相比較,以鑒定競爭相同表位的抗體。通過脈衝注入10mM甘氨酸,pH 1.5,進行固定的抗PentaHis表面的再生。通過在沒有固定的蛋白質的處理的表面上注入分析物,獲得參考曲線。通過BIAevaluation軟體v4.1從即時傳感圖(sensogram)資料產生結合曲線。
該實驗的結果顯示在圖8A-8D中。該實驗的結果指示生物素化的抗體LAG3 mAb A能夠結合shLAG-3-His,即使在存在過量的非生物素化的抗體
LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6的情況下。相比之下,LAG-3 mAb 1阻斷LAG-3 mAb 6的結合。因此,結果顯示,LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6可能結合LAG-3的相同表位或重疊的表位,並且彼此競爭結合LAG-3。發現LAG-3 mAb 1和LAG-3 mAb 6均結合與LAG-3 mAb A結合的表位不同的表位。
為了進一步表徵抗LAG3抗體,在兩個不同的試驗中評估它們阻斷LAG-3和II類MHC之間結合的能力。在一個試驗中,檢驗抗體阻斷可溶性人LAG3-Fc融合蛋白與固定在表面上的II類MHC的結合的能力。為了該試驗,LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4和LAG-3 mAb 5(為0-67nM,2倍連續稀釋)各自與可溶性人LAG-3-Fc融合蛋白(5μg/mL)混合,並且分別與固定的II類MHC(1μg/mL)孵育。使用山羊抗人Fcγ-HRP二抗評估與固定的II類MHC結合的LAG-3的量。在另外的實驗中,LAG-3 mAb A和人源化抗體hLAG-3 mAb 1(1.4)和hLAG-3 mAb 6(1.1)(為0.0096-7.0nM,三倍連續稀釋)與可溶性人LAG-3-His融合蛋白(0.2μg/ml)混合,並且如上述評估與固定的II類MHC的結合。這些試驗的結果顯示在圖9A和圖9B中。
在另一試驗中,檢驗本發明的抗LAG-3抗體阻斷可溶性人LAG3-Fc融合蛋白(shLAG-3-Fc)與細胞表面上的天然II類MHC的結合的能力。為了該試驗,LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 2、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 5,和參考抗體LAG-3 mAb A(0.1-26.7ng/ml,2倍連續稀釋)各自與生物素化的可溶性人LAG-3-Fc融合蛋白(0.5μg/ml)混合,並且分別與MHC II-陽性Daudi細胞孵育。使用PE綴合的鏈黴抗生物素二抗,通過FACS分析,測定與Daudi細胞的表面結合的LAG-3的量。在另外的單獨實驗中,如上述評估LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 6和LAG-3 mAb A;或LAG-3 mAb 1和人源化抗體hLAG-3 mAb 1(1.4)、hLAG-3 mAb 1(1.2)、hLAG-3 mAb 1(2.2)和hLAG-3 mAb 1(1.1)。這些實驗的結果分別顯示在圖10A-10C中。
這些抑制試驗的結果(圖9A-9B和圖10A-10C)顯示,所有測試的抗LAG-3抗體均阻斷shLAG-3-Fc融合蛋白與結合II類MHC的結合。
II.實施例2:流式細胞法
確定細胞上的檢查點抑制劑:PD-1和LAG-3在下述實驗中的表達水準的實驗使用下述適當螢光標記的商業抗體(藻紅素-花菁7(PE-Cy7)綴合的抗CD4[克隆SK3]或螢光素異硫氰酸酯(FITC)綴合的抗CD4[克隆RPA-T4]、藻紅素(PE)綴合的抗LAG-3[克隆3DS223H]、藻紅素(PE)綴合的抗PD-1[克隆EH12.2H7]或別藻藍素(APC)綴合的(eBiosciences或BioLegend))和適當的同種型對照。以製造商推薦的濃度使用所有的抗體。在FACS緩衝液(10% FCS在PBS中)中,在冰上在暗處進行細胞染色30分鐘,用於添加初始抗體。在兩次洗滌之後,細胞或者用適當的第二試劑在冰上在暗處染色30分鐘,或者立即在流式細胞分析儀上分析。為了排除死細胞,所有的樣品與生存力染料(viability dye):7-氨基放線菌素D(7-AAD)(BD Biosceinces或BioLegend)或4',6-雙脒基-2-苯基吲哚、二鹽氫氯化物(DAPI)(Life Technologies)共染色。在FACS Calibur或Fortessa流式細胞分析儀(BD Biosciences)上分析所有的樣品並且使用FlowJo軟體(TreeStar,Ashland,OR)進行分析。
III.實施例3:LAG-3表達和結合刺激的T細胞的抗體
檢驗LAG-3表達和分離的LAG-3抗體特異性結合CD3/CD28-刺激的T細胞表面上LAG-3的能力。從外周血液單核細胞(PBMC)獲得T細胞,簡言之,使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度離心方法,根據製造商的指導,從健康供體在知情同意下獲得的全血(Biological Specialty Corporation)純化PBMC,然後使用Dynabeads® Untouched Human T Cells Kit(Dynabeads®未接觸的人T細胞試劑盒)(Life Technologies)根據製造商的指導純化T細胞。為了刺激,在存在重組人IL-2 30U/ml](Peprotech)和Dynabeads® Human T cell
Activator(Dynabeads®人T細胞啟動劑)珠(Life Technilogies)的情況下,根據製造商的指導,培養分離的T細胞10-14天。通過如上述的流式細胞術,使用FITC綴合的抗CD4和PE綴合的抗LAG-3,檢驗在新鮮分離的未刺激的CD4+ T細胞和刺激的CD4+ T細胞(在第11或14天從培養物取出)上的LAG-3表達。
這些研究的結果顯示在圖11A-11C中。在未刺激的CD4+ T細胞上沒有觀察到LAG-3表達(圖11A)。但是,來自兩個不同供體(D:58468和D:43530)的CD3/CD8刺激的CD4+ T細胞展示LAG-3表達顯著增加(圖11B和11C)。
研究LAG-3 mAb 1(圖12,圖A和D)、LAG-3 mAb 2(圖12,圖B和E)、LAG-3 mAb 3(圖12,圖C和F)、LAG-3 mAb 4(圖13,圖A和C)和LAG-3 mAb 5(圖13,圖B和D)特異性結合刺激的CD4+ T細胞的能力。在第14天從培養物中取出的刺激的T細胞(如上述從供體D:58468製備)和新鮮未刺激的細胞(如上述從供體D:43530製備)使用分離的抗LAG-3抗體和下述適當的螢光標記的第二試劑(PC綴合的抗小鼠-IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Labs))和FITC綴合的抗CD4進行流式細胞術分析。如圖12,圖A-F,和圖13,圖A-D中顯示,每種檢驗的抗LAG-3抗體僅僅結合刺激的CD4+ T細胞,但不不結合未刺激的CD4+ T細胞。
這些研究的結果表明LAG-3在刺激的T細胞上被上調,並且本發明的抗LAG-3抗體僅僅特異性結合刺激的T細胞。
IV.實施例4:抗LAG抗體的功能活性
金黃色葡萄球菌腸毒素B型(SEB)是能夠啟動大部分T細胞(5-30%)的微生物超級抗原。SEB結合肽結合槽(peptide binding grove)之外的MHC II,因此是MHC II依賴性的,但是不受限制的和TCR介導的。T細胞的SEB-刺激使得寡克隆T細胞增殖和細胞因子產生(儘管可觀察到供體變化性)。檢驗單獨或組合的抗LAG-3和抗PD-1抗體在SEB-刺激的PMBC上的表達。
在T-25容量瓶中,在RPMI-培養基+10%熱失活的FBS+1%青黴素/鏈黴素中,單獨或與0.1ng/ml(初始刺激)的SEB(Sigma-Aldrich)一起,培養如上述純化的PBMC,達2-3天。在第一輪SEB-刺激結束時,用PBS洗滌PBMC兩次,並且立即在96孔組織培養板中以1-5 x 105細胞/孔的濃度在僅僅養基中、在具有0.1ng/ml的SEB(二次刺激)並且沒有抗體的培養基中,或在具有SEB和對照IgG抗體的培養基中,鋪平板,並且培養另外的2-3天。在初次大量SEB-刺激之後48小時,通過流式細胞術,使用PE綴合的抗LAG-3和FITC綴合的抗CD3;或APC綴合的抗PD-1和FITC綴合的抗CD3,檢驗細胞的PD-1和LAG-3表達。在具有SEB-刺激的96-孔板中二次培養之後第5天,使用流式細胞術,使用PE綴合的抗LAG-3和APC綴合的抗PD-1,檢驗沒有用抗體處理的孔或用對照抗體處理的孔的PD-1和LAG-3表達。
來自兩個代表性供體(D:34765和D:53724)的流式細胞術結果顯示在圖14,圖A-D(D:34765)和圖15,圖A-D(D:53724)中。這些結果表明LAG-3和PD-1在SEB刺激後48小時被上調,在用SEB-刺激培養後第5天看到進一步增強。在這些研究中,SEB-刺激之後,供體1具有更多的LAG-3/PD-1雙陽性細胞。SEB-刺激後添加對照抗體不改變LAG-3或PD-1表達(比較圖14,圖C和D,和圖15,圖C和D)。
SEB-刺激PBMC之後的免疫檢查點蛋白質LAG-3和PD-1的上調在再刺激時限制細胞因子釋放。檢驗了LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4、LAG-3 mAb 6、命名為“PD-1 mAb 5”的PD-1單克隆抗體和參考抗體PD-1 mAb 1(包括235A/235A Fc變體(AA))、PD-1 mAb 2、LAG-3 mAb A和商業抗LAG3抗體17B4(#LS-C1B692,LS Bio,命名為“LAG-3 mAb B”)通過檢查點抑制而增強細胞因子釋放的能力。
如上用SEB述刺激PBMC,除了在二次刺激期間不用抗體、用同種型對照抗體、或用抗LAG-3和抗PD-1抗體單獨或其組合,將細胞鋪平板。在二次刺激結束時,收穫上清液,使用針對IFNγ、TNFα、IL-10和IL-4的人DuoSet ELISA試劑盒(R&D Systems),根據製造商的說明,測量細胞因子分泌。圖16A-16B顯示IFNγ(圖16A)和TNFα(圖16B),SEB-刺激的來自代表性供體(D:38166)的PBMC的分泌特徵,所述PBMC不用抗體處理或用下述抗體之一處理:同種型對照、PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、LAG-3 mAb A、LAG-3 mAb B、LAG-3 mAb 1、LAG-3 mAb 3、LAG-3 mAb 4或LAG-3 mAb 6。對於該研究,使用0.009、0.039、0.156、0.625、2.5、10和40μg/ml的抗體。圖17顯示SEB-刺激的來自另一代表性供體(D:58108)的PBMC的IFNγ分泌特徵,所述PBMC:不用抗體處理;用同種型對照抗體處理;用PD-1 mAb 2和/或LAG-3 mAb A處理;用PD-1 mAb 5和/或LAG-3 mAb 1處理;或用PD-1 mAb 5和/或LAG-3 mAb 3處理。對於該研究,使用10μg/ml的抗體。
這些研究結果表明,抗PD-1抗體顯著增強免疫系統功能,如通過再刺激時從SEB-刺激的PBMC增加的IFNγ(圖16A和圖17),和TNFα(圖16B)產生例證的。令人吃驚地,也看到LAG-3 mAb 1在多個供體中增加細胞因子產生,達到與抗PD-1抗體相當的水準,而參考抗LAG-3 mAbs、LAG-3 mAb A和LAG-3 mAb B和若干分離的抗體(LAG-3 mAb 3、LAG-4和LAG-6)僅僅提供了稍微增強的細胞因子釋放。另外,抗LAG-3抗體與抗PD-1的組合使得當再次刺激時從SEB-刺激的PBMC的細胞因子釋放進一步增強(圖17)。LAG-3 mAb 1在與抗PD-1抗體組合時,與LAG-3 mAb 3和參考抗體LAG-3 mAb A相比,提供了細胞因子釋放的最大增強。
V.實施例5:與內源食蟹猴LAG-3的結合
通過FACS研究人源化抗體hLAG-3 mAb 6(1.1)和參考抗體LAG-3 mAb A結合在食蟹猴PBMC上表達的內源LAG-3的能力。對於該研究,從供體食蟹猴全血分離PBMC,並且將其單獨培養或結合SEB刺激(500ng/mL)培養,基本上如上所述。在SEB-刺激後66小時,用hLAG-3 mAb 6(1.1)、LAG-3 mAb A或PD-1 mAb 1抗體(10倍連續稀釋)對細胞(未刺激的和刺激的)染色。用山羊抗人Fc-APC標記的二抗檢測抗體。對於兩個食蟹猴供體,結合繪製在圖18A-18B中。
如用抗PD-1抗體PD-1 mAb 1檢測的,通過增強的PD-1表達確認了SEB刺激。這些研究的結果表明,hLAG-3 mAb 6(1.1)結合在刺激的食蟹猴PBMC表面上表達的內源LAG-3。
本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文,達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明,但是應當理解,其能夠被進一步修改,並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變,只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
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<221> misc_feature
<223> 編碼LAG-3 mAb 5 VH的多核苷酸
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> LAG-3 mAb 5 VH CDR 1
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> LAG-3 mAb 5 VH CDR2
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> LAG-3 mAb 5 VH CDR3
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> LAG-3 mAb 5 VL
<210> 65
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 編碼LAG-3 mAb 5 VL的多核苷酸
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> LAG-3 mAb 5 VL CDR1
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 5 VL CDR2
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> LAG-3 mAb 5 VL CDR3
<210> 69
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> LAG-3 mAb 6 VH
<210> 70
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 編碼LAG-3 mAb 6 VH的多核苷酸
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> LAG-3 mAb 6 VH CDR 1
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> LAG-3 mAb 6 VH CDR2
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> LAG-3 mAb 6 VH CDR3
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> LAG-3 mAb 6 VL
<210> 75
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 編碼LAG-3 mAb 6 VL的多核苷酸
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> LAG-3 mAb 6 VL CDR1
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 6 VL CDR2
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> LAG-3 mAb 6 VL CDR3
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VH-1
<210> 80
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼hLAG-3 mAb 6 VH-1的多核苷酸
<210> 81
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VH-2
<210> 82
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼hLAG-3 mAb 6 VH-2的多核苷酸
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL-1
<210> 84
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼hLAG-3 mAb 6 VL-1的多核苷酸
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL-2
<210> 86
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼hLAG-3 mAb 6 VL-2的多核苷酸
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG-3 mAb 6 VL-1/VL-2 CDRL1
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體1
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys連接體2
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ABD連接體
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<210> 97
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<210> 101
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-螺旋
<210> 102
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K-螺旋
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修飾的E-螺旋
<210> 104
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修飾的K-螺旋
<210> 105
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ABD
<210> 106
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> deimm ABD
<210> 107
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> deimm ABD
<210> 108
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> deimm ABD
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈連接體
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cys連接體
<210> 112
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> IgG1鉸鏈
<210> 115
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> IgG2鉸鏈
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> IgG4鉸鏈
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> IgG4鉸鏈(S228P)
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> LC kappa(κ)
<210> 119
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> LC lambda(λ)
<210> 120
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> IgG1 CH1
<210> 121
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> IgG2 CH1
<210> 122
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> IgG4 CH1
<210> 123
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> IgG1(AA)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是賴氨酸(K)或不存在
<210> 124
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> IgG1 Fc(AA/YTE)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是賴氨酸(K)或不存在
<210> 125
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> IgG4 Fc(YTE)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是賴氨酸(K)或不存在
<210> 126
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 杵Fc結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是賴氨酸(K)或不存在
<210> 127
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 臼Fc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217是賴氨酸(K)或不存在
<210> 128
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> IgG1 Fc通用
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa4(X1)和Xaa5(X2)都是L(野生型),或都是A(降低的FcR結合)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(26)
<223> Xaa22(X3)、Xaa24(X4)和Xaa26(X5)分別是M、S和T(野生型),或Y、T和E(延長的半衰期)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (136)..(138)
<223> Xaa136(X6)和Xaa138(X7)分別是T和L(野生型),或W和L(杵),或S和A(臼)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (177)..(177)
<223> 當Xaa136(X6)是T和Xaa138(X7)是L時,Xaa177(X8)是Y(野生型),當Xaa136(X6)是W和Xaa138(X7)是L時,Xaa177(X8)是Y(杵),或當Xaa136(X6)是S和Xaa138(X7)是A時,Xaa177(X8)是V(臼)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (204)..(205)
<223> Xaa204(X9)和Xaa205(X10)分別是N和H(野生型),或是N和R(沒有蛋白質A結合),或是A和K(沒有蛋白質A結合)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa217(X11)是K或不存在
<210> 129
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> LAG-3 mAb A VH
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> LAG-3 mAb A VL
<210> 131
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(113)
<223> PD-1 mAb 1 VH
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> PD-1 mAb 1 VL
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<210> 134
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb 2 VL
<210> 135
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> PD-1 mAb 3 VH
<210> 136
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> PD-1 mAb 3 VL
<210> 137
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(117)
<223> PD-1 mAb 4 VH
<210> 138
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> PD-1 mAb 4 VL
<210> 139
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(330)
<223> IgG1整個恒定區(AA)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (330)..(330)
<223> Xaa330是賴氨酸(K)或不存在
<210> 140
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(327)
<223> IgG4整個恒定區(P)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (327)..(327)
<223> Xaa327是賴氨酸(K)或不存在
Claims (56)
- 一種結合LAG-3的分子,其能夠結合至人LAG-3和結合至食蟹猴LAG-3,其中所述結合LAG-3的分子包括:(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的重鏈可變結構域,和包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的輕鏈可變結構域;或(B)包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的重鏈可變結構域,和包含氨基酸序列SEQ ID NO:83的輕鏈可變結構域;並且其中所述LAG-3結合結構域特異性結合人LAG-3的平衡結合常數(KD)為0.05nM或更小。
- 如請求項1所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子是抗體。
- 如請求項2所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子是嵌合抗體或人源化抗體。
- 如請求項1所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的重鏈可變結構域,和氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示的輕鏈可變結構域。
- 如請求項1所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示的重鏈可變結構域,和氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示的輕鏈可變結構域。
- 如請求項1至5任一項所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子是能夠同時結合至人LAG-3和結合至第二表位的雙特異性結合分子。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述第二表位是參與調節免疫細胞的表面上存在的免疫檢查點的分子的表位。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述第二表位是下述的表位:B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CD40L、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、CTLA-4、半乳凝素-9、GITR、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、KIR、LAG-3、LIGHT、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX40、OX40L、PD1H、PD-1、PD-L1、PD-L2、PVR、SIRPa、TCR、TIGIT、TIM-3或VISTA。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子是:(a)雙抗體,所述雙抗體是括兩條或三條或四條不同多肽鏈的共價結合的複合物;或(b)三價結合分子,所述三價結合分子是包括三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物。
- 如請求項1-5任一項所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子包括Fc區。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子包括Fc區。
- 如請求項9所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子包括Fc區。
- 如請求項10所述的結合LAG-3的分子,其中所述Fc區是變異的Fc區,其包括:(a)減少所述變異的Fc區對FcγR親和力的一個或多個氨基酸修飾;和/或(b)延長所述變異的Fc區的血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾。
- 如請求項13所述的結合LAG-3的分子,其中:(a)減少所述變異的Fc區對FcγR的親和力的所述修飾包括下述取代:(1)L234A;(2)L235A;或(3)L234A和L235A;並且(b)延長所述變異的Fc區的血清半衰期的所述修飾包括下述取代:(1)M252Y;M252Y和S254T;(2)M252Y和T256E;(3)M252Y、S254T和T256E;或(4)K288D和H435K,其中所述編號是根據Kabat的EU索引的編號。
- 如請求項11所述的結合LAG-3的分子,其中所述Fc區是變異的Fc區,其包括:(a)減少所述變異的Fc區對FcγR親和力的一個或多個氨基酸修飾;和/或(b)延長所述變異的Fc區的血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾。
- 如請求項15所述的結合LAG-3的分子,其中:(a)減少所述變異的Fc區對FcγR的親和力的所述修飾包括下述取代:(1)L234A;L235A;或(2)L234A和L235A;並且(b)延長所述變異的Fc區的血清半衰期的所述修飾包括下述取代:(1)M252Y;M252Y和S254T; (2)M252Y和T256E;(3)M252Y、S254T和T256E;或(4)K288D和H435K,其中所述編號是根據Kabat的EU索引的編號。
- 如請求項1至5任一項所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於刺激需要其的受試者的T-細胞介導的免疫應答。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於刺激需要其的受試者的T-細胞介導的免疫應答。
- 如請求項1至5任一項所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於治療與被抑制的免疫系統相關的疾病或病況。
- 如請求項6所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於治療與被抑制的免疫系統相關的疾病或病況。
- 如請求項19所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是癌症或感染。
- 如請求項21所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的癌症:腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌、脊髓癌、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、脊索瘤、結直腸癌、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、膽囊癌或膽管癌、生殖細胞瘤、頭頸癌、胰島細胞腫瘤、腎癌、白血病、惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、橫紋肌樣瘤、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的肉瘤:軟組織腺泡狀肉瘤、軟骨肉瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、滑膜肉瘤。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是轉移性腦瘤。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的腎癌:嫌色細胞腎細胞癌和透明細胞癌。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結腸癌。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是肝細胞癌。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是葡萄膜黑色素瘤。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是鱗狀細胞皮膚癌。
- 如請求項21所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、急性漿細胞樣樹突細胞瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套細胞白血病(MCL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
- 如請求項20所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是癌症或感染。
- 如請求項31所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的癌症:腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌、脊髓癌、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、脊索瘤、結直腸癌、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、膽囊癌或膽管癌、生殖細胞瘤、頭頸癌、胰島細胞腫瘤、腎癌、白血病、惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、橫紋肌樣瘤、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的肉瘤:軟組織腺泡狀肉瘤、軟骨肉瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、滑膜肉瘤。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是轉移性腦瘤。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的腎癌:嫌色細胞腎細胞癌和透明細胞癌。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結腸癌。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是肝細胞癌。
- 如請求項32所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是葡萄膜黑色素瘤。
- 如請求項22所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是鱗狀細胞皮膚癌。
- 如請求項31所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、急性漿細胞樣樹突細胞瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套細胞白血病(MCL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
- 如請求項1至5任一項所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子被可檢測地標記並且用於檢測LAG-3。
- 如請求項9所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於刺激需要其的受試者的T-細胞介導的免疫應答。
- 如請求項9所述的結合LAG-3的分子,其中所述分子用於治療與被抑制的免疫系統相關的疾病或病況。
- 如請求項43所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是癌症或感染。
- 如請求項44所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的癌症:腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌、脊髓癌、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、脊索瘤、結直腸癌、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏 瘤、膽囊癌或膽管癌、生殖細胞瘤、頭頸癌、胰島細胞腫瘤、腎癌、白血病、惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、橫紋肌樣瘤、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的肉瘤:軟組織腺泡狀肉瘤、軟骨肉瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、滑膜肉瘤。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是轉移性腦瘤。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是選自由以下組成的組的腎癌:嫌色細胞腎細胞癌和透明細胞癌。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結腸癌。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是肝細胞癌。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是葡萄膜黑色素瘤。
- 如請求項45所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是鱗狀細胞皮膚癌。
- 如請求項44所述的結合LAG-3的分子,其中所述疾病或病況是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、 膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、急性漿細胞樣樹突細胞瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套細胞白血病(MCL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症或伯基特淋巴瘤。
- 一種藥物組合物,其包括預有效量的請求項1至5任一項所述的結合LAG-3的分子和藥學上可接受的載體。
- 一種藥物組合物,其包括預有效量的請求項6所述的結合LAG-3的分子和藥學上可接受的載體。
- 一種藥物組合物,其包括預有效量的請求項9所述的結合LAG-3的分子和藥學上可接受的載體。
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