TWI814715B - Ａｄａｍ９結合分子及使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及分子，諸如單特異性抗體和雙特異性、三特異性或多特異性結合分子，包括能夠特異性結合至“含有去整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9” (“ADAM9”)的雙抗體、BiTE和抗體。本發明尤其涉及能夠展示對人和非人類ADAM9的高結合親和力的這樣的結合分子。本發明還尤其涉及由此與人ADAM9和與非人靈長類動物(例如，食蟹猴)的ADAM9交叉反應的這類分子。本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子，其包含已經被人源化和/或去免疫化的輕鏈可變(VL)結構域和/或重鏈可變(VH)結構域，從而在將這類ADAM9-結合分子施用至接受受試者後展示降低的免疫原性。本發明還涉及含有任何這類ADAM9-結合分子的藥物組合物，和涉及包括使用任何這類ADAM9-結合分子治療癌症和其它疾病和病況的方法。

Description

ADAM9結合分子及使用其的方法
[相關申請的交叉引用]
本申請案主張美國專利申請案第62/438,516號(2016年12月23日提交；申請中)的優先權，該申請通過引用以其整體併入本文。
[序列表的參考]
根據37 C.F.R. 1.821以及下面的條款，本申請案包括一個或多個序列表，其以電腦-可讀介質(檔案名：1301.0147PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，2017年11月29日創建，並且大小為175,962位元組)公開，該檔通過引用以其整體併入本文。
本發明涉及分子，諸如單特異性抗體和雙特異性、三特異性或多特異性結合分子，包括能夠特異性結合至“含有去整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9”(“ADAM9”)的雙抗體、BiTE和抗體。本發明尤其涉及對人和非人類ADAM9能夠展示高親和力結合的這類結合分子。本發明還尤其涉及由此與人ADAM9和非人靈長類動物(例如食蟹猴)的ADAM9交叉反應的這類分子。本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子，其包含已經被人源化和/或去免疫化的輕鏈可變(VL)結構域和/或重鏈可變(VH)結構域，以便在施用這類ADAM9-結合分子至接受受試者後展示降低的免疫原性。本發明還涉及含有任何這類ADAM9-結合分子的藥物組合物，以及涉及包括使用任何這類ADAM9-結合分子治療癌症和其它疾病和病況的方法。
ADAM是涉及各種生理過程和病理學過程的蛋白質家族(Amendola, R.S.等(2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Edwars, D.R.等(2008) “The ADAM Metalloproteases ,” Molec. Aspects Med. 29:258-289)。已經鑑定了該家族的至少40個基因成員，並且，據信這些成員中的至少21個在人類中是有功能的(Li, J.等(2016) “Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion ,” J. Invest. Surg. 26(3):127-133；Duffy, M.J.等(2011) “The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?,” Clin. Proteomics 8:9:1-13；也見美國專利公開號2013/0045244)。
ADAM家族成員具有含8個結構域的非常保守的結構，在所述8個結構域中有金屬蛋白酶結構域和整合素結合(去整合素)結構域(Duffy, M.J.等(2009) “The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology ,” Clin. Chim. Acta 403:31-36)。ADAM金屬蛋白酶結構域充當脫落酶，並且已經報導其通過切割跨膜蛋白而調節一系列生物過程，其然後可充當可溶性配體並調節細胞信號傳導(Amendola, R.S.等(2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Ito, N.等(2004) “ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008–1013)。
ADAM9是ADAM分子家族的成員。它被合成為失活形式，該失活形式被蛋白水解切割以產生活性酶。在上游位點加工對於酶原的活化特別重要。ADAM9在成纖維細胞(Zigrino, P.等(2011) “The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts ,” J. Biol. Chem. 286:6801-6807)、活化的血管平滑肌細胞(Sun, C.等(2010) “ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling ,” Cardiovasc. Res. 87:348-355)、單核細胞(“Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes ,” Cell. Immunol. 213:104-113)、活化的巨噬細胞(Oksala, N.等(2009) “ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries – Tampere Vascular Study ,” Ann. Med. 41:279-290)中表達。
ADAM9的金屬蛋白酶活性參與基質組分的降解，從而允許腫瘤細胞的遷移(Amendola, R.S.等(2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962)。它的去整合素結構域與許多蛇毒去整合素高度同源，允許ADAM9與整合素之間的相互作用，並使ADAM9能夠正向或負向調節細胞黏附事件(Zigrino, P.等(2011) “The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts ,” J. Biol. Chem. 286:6801-6807；Karadag, A.等(2006) “ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin ,” Blood 107:3271-3278；Cominetti, M.R.等(2009) “Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions ,” Biochimie 91:1045-1052)。已經證明ADAM9去整合素結構域與α6β1、α6β4、αvβ5和α9β1整合素相互作用。
已經發現ADAM9的表達與疾病，尤其是癌症相關。已經發現ADAM9切割並釋放在腫瘤發生和血管生成中具有重要作用的一些分子，諸如TEK、KDR、EPHB4、CD40、VCAM1和CDH5。ADAM9由許多類型的腫瘤細胞表達，所述腫瘤細胞包括乳腺癌、結腸癌、胃癌、神經膠質瘤、肝癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、胰腺癌和前列腺癌的腫瘤細胞(Yoshimasu, T.等(2004) “Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis ,” Cancer Res. 64:4190-4196；Peduto, L. 等(2005) “Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer ,” Cancer Res. 65:9312-9319；Zigrino, P.等(2005) “ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines ,” Int. J. Cancer 116:853-859；Fritzsche, F.R.等(2008) “ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression ,” BMC Cancer 8:179:1-9；Fry, J.L.等(2010) “Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration ,” Cancer Res. 70, 8187-8198；Chang, L.等(2016) “Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer ,” Oncology Letters 11:1242-1250；Fan, X.等(2016) “ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas ,” Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11)。
顯著地，已經發現增加的ADAM9表達與惡性腫瘤和轉移潛能正相關(Amendola, R.S.等(2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fan, X.等(2016) “ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas ,” Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11；Li, J.等(2016) “Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion ,” J. Invest. Surg. 26(3):127-133)。另外，ADAM9及其分泌的可溶性同種型對於癌細胞擴散似乎是重要的(Amendola, R.S.等(2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fry, J.L.等(2010) “Secreted And Membrane-Bound Isoform s Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration ,” Cancer Res. 70, 8187–8198；Mazzocca, A. (2005) “A Secreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions ,” Cancer Res. 65:4728-4738；也見美國專利號9,150,656、7,585,634、7,829,277、8,101,361和8,445,198，以及美國專利公開號2009/0023149)。
許多研究已經因此將ADAM9鑑定為抗癌症治療的潛在靶標(Peduto, L. (2009) “ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer ,” Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287；Duffy, M.J.等(2009) “Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression ,” Clin. Cancer Res. 15:1140-1144；Duffy, M.J. 等(2011) “The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?” Clin. Proteomics 8:9:1-13；Josson, S. 等(2011) “Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy ,” Prostate 71(3):232-240；也見美國專利公開號2016/0138113、2016/0068909、2016/0024582、2015/0368352、2015/0337356、2015/0337048、2015/0010575、2014/0342946、2012/0077694、2011/0151536、2011/0129450、2010/0291063、2010/0233079、2010/0112713、2009/0285840、2009/0203051、2004/0092466、2003/0091568和2002/0068062以及PCT公開號WO 2016/077505、WO 2014/205293、WO 2014/186364、WO 2014/124326、WO 2014/108480、WO 2013/119960、WO 2013/098797、WO 2013/049704和WO 2011/100362)。另外，還已經發現ADAM9的表達與肺部疾病和炎症有關(見例如，美國專利公開號2016/0068909；2012/0149595；2009/0233300；2006/0270618；和2009/0142301)。與ADAM9結合的抗體可從Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich和其它公司商購獲得。
然而，儘管所有先前的進步，仍然需要高親和力的ADAM9-結合分子，其展示與正常組織的最小結合並且能夠以相似的高親和力結合人和非人ADAM9。本發明解決了這種需要和對癌症的改善療法的需要。
本發明涉及分子，諸如單特異性抗體和雙特異性、三特異性或多特異性結合分子，包括能夠特異性結合至“含有去整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9”(“ADAM9”)的雙抗體、BiTE和抗體。本發明尤其涉及這樣的結合分子，所述結合分子能夠展示與人和非人ADAM9的高親和力結合。本發明還尤其涉及這樣的分子，所述分子因此與人ADAM9和非人靈長類動物(例如，食蟹猴)的ADAM9具有交叉反應性。本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子，其包含已經被人源化和/或去免疫化的輕鏈可變(VL)結構域和/或重鏈可變(VH)結構域，以便在施用這類ADAM9-結合分子至接受受試者後展示降低的免疫原性。本發明還涉及含有任意這類ADAM9-結合分子的藥物組合物，以及涉及包括使用任何這類ADAM9-結合分子治療癌症和其它疾病和病況的方法。
詳細地，本發明提供了包含ADAM9-結合結構域的ADAM9-結合分子，其中這類ADAM9-結合結構域包含輕鏈可變(VL)結構域和重鏈可變(VH)結構域，其中這樣的重鏈可變結構域包含CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域，並且，這樣的輕鏈可變結構域包含CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域，其中： (A) 這樣的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域具有MAB-A 的優化變體的重鏈可變(VH)結構域的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域的氨基酸序列；和這樣的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域具有MAB-A 的輕鏈可變(VL)結構域的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域的氨基酸序列；或 (B) 這樣的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域具有MAB-A 的重鏈可變(VH)結構域的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域的氨基酸序列；和這樣的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域具有MAB-A 的優化變體的輕鏈可變(VL)結構域的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域的氨基酸序列；或 (C) 這樣的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域具有MAB-A 的優化變體的重鏈可變(VH)結構域的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域的氨基酸序列；和這樣的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域具有MAB-A 的優化變體的輕鏈可變(VL)結構域的CDRL 1結構域、 CDRL 2結構域和CDRL 3結構域的氨基酸序列。
本發明尤其涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域具有： (A) (1) MAB-A的重鏈可變(VH)結構域的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域；和 (2) MAB-A的人源化變體的VH結構域的FR1、FR2、FR3和FR4；或 (B) (1) MAB-A的輕鏈可變(VL)結構域的CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域；和 (2) MAB-A的人源化變體的VL結構域的FR1、FR2、FR3和FR4；或 (C) (1) MAB-A的優化變體的重鏈可變(VH)結構域的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域；和 (2) MAB-A的人源化變體的VH結構域的FR1、FR2、FR3和FR4；或 (D) (1) MAB-A的優化變體的輕鏈可變(VL)結構域的CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域；和 (2) MAB-A的人源化變體的VL結構域的FR1、FR2、FR3和FR4；或 (E) (1) MAB-A的人源化/優化變體的重鏈可變(VH)結構域；和 (2) MAB-A的人源化/優化變體的VL輕鏈可變(VL)結構域。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中MAB-A 的這類優化變體的這類重鏈可變(VH)結構域包含SEQ ID NO:15 的氨基酸序列： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWX1 H WVRQA PGKGLEWVG E IIPIX2 GHTNY NEX3 FX4 X5 RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY WGQGTTVT VSS 其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 和X6 獨立地被選擇， 其中：X1 是M或I；X2 是N或F；X3 是K或R；X4 是K或Q；X5 是S或G，且X6 是P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 和X11 被選擇以使得： 當X6 是P時，X7 是K或R；X8 是F或M；X9 是G；X10 是W或F；和X11 是M、L或K； 當X6 是F、Y或W時，X7 是N或H；X8 是S或K；X9 是G或A；X10 是T或V；和X11 是M、L或K； 當X6 是I、L或V時，X7 是G；X8 是K；X9 是G或A；X10 是V；和X11 是M、L或K； 當X6 是T時，X7 是G；X8 是K、M或N；X9 是G；X10 是V或T；和X11 是L或M； 當X6 是G時，X7 是G；X8 是S；X9 是G；X10 是V；和X11 是L； 當X6 是D時，X7 是S；X8 是N；X9 是A；X10 是V；和X11 是L。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中MAB-A的這類優化變體的這類重鏈可變(VH)結構域的這類CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域各自具有以下的氨基酸序列： (1)SEQ ID NO:47 (SYWX1 H) 其中：X1 是M或I； (2)SEQ ID NO:48 (EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 ) 其中：X2 、X3 、X4 和X5 被獨立地選擇，和 其中：X2 是N或F；X3 是K或R；X4 是K或Q；和X5 是S或G；和 (3)SEQ ID NO:49 (GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY) 其中：X6 是P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D和X7 、X8 、X9 、X10 和X11 被選擇以使得： (A)當X6 是P時：X7 是K或R；X8 是F或M；X9 是G；X10 是W或F；和X11 是M、L或K； (B)當X6 是F、Y或W時：X7 是N或H；X8 是S或K；X9 是G或A；X10 是T或V；和X11 是M、L或K； (C)當X6 是I、L或V時：X7 是G；X8 是K；X9 是G或A；X10 是V；和X11 是M、L或K； (D)當X6 是T時：X7 是G；X8 是K、M或N；X9 是G；X10 是V或T；和X11 是L或M； (E)當X6 是G時：X7 是G；X8 是S；X9 是G；X10 是V；和X11 是L；和 (F)當X6 是D時：X7 是S；X8 是N；X9 是A；X10 是V；和X11 是L。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中MAB-A的這類優化變體的這類重鏈可變(VH)結構域選自由以下組成的組： (1)hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )； (2)hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )； (3)hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )； (4)hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )； (5)hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )； (6)hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )； (7)hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )； (8)hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )； (9)hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )； (10)hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )； (11)hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )； (12)hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )； (13)hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 )；和 (14)hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 )。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類輕鏈可變(VL)結構域包含SEQ ID NO:53 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC X12 ASQSVD YX13 GDSYX14 N WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSX15 X16 X17 PF T FGQGTKLEI K 其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 和X17 被獨立地選擇，和 其中：X12 是K或R；X13 是D或S；X14 是M或L；X15 是H或Y；X16 是E或S；和X17 是D或T。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中MAB-A的這類優化變體的這類輕鏈可變(VL)結構域的這類CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域各自具有以下的氨基酸序列： (1)SEQ ID NO:66 (X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N) 其中：X12 、X13 、X14 ,被獨立地選擇，和 其中：X12 是K或R；X13 是D或S；和X14 是M或L； (2)SEQ ID NO:13 (AASDLES)；和 (3)SEQ ID NO:67 (QQSX15 X16 X17 PFT) 其中：X15 、X16 和X17 被獨立地選擇，和 其中：X15 是H或Y；X16 是E或S；和X17 是D或T。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中MAB-A的這類優化變體的這類輕鏈可變(VL)結構域選自由以下組成的組： (1)hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )； (2)hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )； (3)hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )； (4)hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )； (5)hMAB-A VL(2A) (SEQ ID NO:20 )。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中ADAM9-結合結構域包含： (A) (1) CDRH 1結構域，其包含氨基酸序列SYWMH (SEQ ID NO:8 )； (2) CDRH 2結構域，其包含氨基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35 )；或 (3) CDRH 3結構域，其包含氨基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45 )； 或 (B) (1) CDRL 1結構域，其包含氨基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62 )； (2) CDRL 2結構域，其包含氨基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:13 )；或 (3) CDRL 3結構域，其包含氨基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14 )；
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中ADAM9-結合結構域包含CDRH 1結構域，其包含氨基酸序列SYWMH (SEQ ID NO:8 )；CDRH 2結構域，其包含氨基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35 )；和CDRH 3結構域，其包含氨基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45 )。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中ADAM9-結合結構域包含CDRL 1結構域，其包含氨基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62 )；CDRL 2結構域，其包含氨基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:13 )；和CDRL 3結構域，其包含氨基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14 )。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含： (A)hMAB-A (2I.2) 的重鏈可變(VH)結構域(SEQ ID NO:28 )；或 (B)hMAB-A (2I.2) 的輕鏈可變(VL)結構域(SEQ ID NO:55 )；或 (C)hMAB-A (2I.2) 的重鏈可變(VH)結構域(SEQ ID NO:28 )和hMAB-A (2I.2) 的輕鏈可變(VL)結構域(SEQ ID NO:55 )。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域，所述結構域其具有選自由以下組成的組的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和10 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (b) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和10 和SEQ ID NO:63 、13 和14 ； (c) 分別為SEQ ID NO:8 、36 和10 和SEQ ID NO:63 、13 和14 ；和 (d) 分別為SEQ ID NO:34 、36 和10 和SEQ ID NO:64 、13 和65 。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其含有與選自由以下組成的組的序列具有至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:55 ； (b) 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:56 ； (c) 分別為SEQ ID NO:18 和SEQ ID NO:56 ；和 (d) 分別為SEQ ID NO:19 和SEQ ID NO:57 。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其具有選自由以下組成的組的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:55 ； (b) 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:56 ； (c) 分別為SEQ ID NO:18 和SEQ ID NO:56 ；和 (d) 分別為SEQ ID NO:19 和SEQ ID NO:57 。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中，與MAB-A相比，這類ADAM9-結合結構域與食蟹猴ADAM9的結合親和力具有至少150倍增強並保持與人ADAM9的高親和力結合。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域，其具有選自由以下組成的組的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和37 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (b) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和38 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (c) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和39 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (d) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和40 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (e) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和41 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (f) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和42 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (g) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和43 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (h) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和44 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ； (i) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和45 和SEQ ID NO:62 、13 和14 ；和 (j) 分別為SEQ ID NO:8 、35 和46 和SEQ ID NO:62 、13 和14 。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其含有與選自由以下組成的組的序列具有至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:55 ； (b) 分別為SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:55 ； (c) 分別為SEQ ID NO:22 和SEQ ID NO:55 ； (d) 分別為SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:55 ； (e) 分別為SEQ ID NO:24 和SEQ ID NO:55 ； (f) 分別為SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:55 ； (g) 分別為SEQ ID NO:26 和SEQ ID NO:55 ； (h) 分別為SEQ ID NO:27 和SEQ ID NO:55 ； (i) 分別為SEQ ID NO:28 和SEQ ID NO:55 ；和 (j) 分別為SEQ ID NO:29 和SEQ ID NO:55 。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其具有選自由以下組成的組的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:55 ； (b) 分別為SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:55 ； (c) 分別為SEQ ID NO:22 和SEQ ID NO:55 ； (d) 分別為SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:55 ； (e) 分別為SEQ ID NO:24 和SEQ ID NO:55 ； (f) 分別為SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:55 ； (g) 分別為SEQ ID NO:26 和SEQ ID NO:55 ； (h) 分別為SEQ ID NO:27 和SEQ ID NO:55 ； (i) 分別為SEQ ID NO:28 和SEQ ID NO:55 ；和 (j) 分別為SEQ ID NO:29 和SEQ ID NO:55 。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子是單特異性ADAM9-結合抗體或其ADAM9-結合片段，或其中這類分子是雙特異性抗體。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子是雙抗體、這類雙抗體是包含兩條、三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物。
本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子是三價結合分子，這類三價結合分子是包含三條、四條、五條或更多條多肽鏈的共價結合的複合物。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子包含白蛋白-結合結構域(ABD)。
本發明另外涉及其中這類分子包含Fc區域的這類ADAM9-結合分子的實施方案，尤其涉及其中這類Fc區域是變異的Fc區域的實施方案，其中所述變異Fc區域包含： (a) 一個或多個氨基酸修飾，其降低變異的Fc區域對FcγR的親和力；和/或 (b) 一個或多個氨基酸修飾，其提高這類ADAM9-結合分子的血清半衰期。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中降低變異的Fc區域對FcγR的親和力的這類一個或多個氨基酸修飾包括： (A) L234A； (B) L235A；或 (C) L234A和L235A； 其中這樣的編號是如Kabat中的EU索引的編號。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中提高這類ADAM9-結合分子的血清半衰期的這類一個或多個氨基酸修飾包括： (A) M252Y； (B) M252Y和S254T； (C) M252Y和T256E； (D) M252Y、S254T和T256E；或 (E) K288D和H435K； 其中這樣的編號是如Kabat中的EU索引的編號。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子是雙特異性的，並且包含能夠與ADAM9的表位免疫特異性結合的表位結合位點和能夠與存在於效應細胞表面上的分子的表位免疫特異性結合的表位結合位點。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子包含能夠與ADAM9的表位免疫特異性結合的兩個表位結合位點和能夠與存在於效應細胞表面上的分子的表位免疫特異性結合的兩個表位結合位點。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子是三特異性的，並且包含： (a) 能夠與ADAM9的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點； (b) 能夠與存在於效應細胞表面上的第一分子的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點；和 (c) 能夠與存在於效應細胞表面上的第二分子的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類分子能夠同時結合至ADAM9和存在於效應細胞表面上的這類分子。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中存在於效應細胞表面上的這類分子是CD2、CD3、CD8、TCR或NKG2D。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類效應細胞是細胞毒性T細胞或自然殺傷(NK)細胞。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中存在於效應細胞表面上的這類第一分子是CD3，和存在於效應細胞表面上的這類第二分子是CD8。
本發明另外涉及這類ADAM9-結合分子的實施方案，其中這類ADAM9-結合分子介導表達ADAM9的細胞和細胞毒性T細胞的協同結合。
本發明另外涉及藥物組合物，其包含有效量的任意上述ADAM9-結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
本發明另外涉及任意上述ADAM9-結合分子、或上述藥物組合物在治療與ADAM9的表達相關或特徵在於ADAM9的表達的疾病或病況中的用途。
本發明尤其涉及這樣的用途，其中與ADAM9的表達相關或特徵在於ADAM9的表達的這類疾病或病況是癌症，尤其地，其中這類癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌(尤其是腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸道間質瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鱗狀細胞癌)、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、非小細胞肺癌(尤其是鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
本發明另外涉及治療受試者的與ADAM9的表達相關或特徵在於ADAM9的表達的疾病或病況的方法，所述方法包括向這類受試者施用有效量的任意上述ADAM9-結合分子或任意上述藥物組合物。
本發明尤其涉及這樣的方法，其中與ADAM9的表達相關或特徵在於ADAM9的表達的這類疾病或病況是癌症，尤其地，其中這類癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌(尤其是腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸道間質瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鱗狀細胞癌)、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、非小細胞肺癌(尤其是鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
本發明涉及分子，諸如單特異性抗體和雙特異性、三特異性或多特異性結合分子，包括能夠特異性結合至“含有去整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9”(“ADAM9”)的雙抗體、BiTE和抗體。本發明尤其涉及這類結合分子，所述結合分子能夠展示與人和非人ADAM9的高親和力結合。本發明還尤其涉及這類分子，所述分子因此與人ADAM9和非人靈長類動物(例如，食蟹猴)的ADAM9具有交叉反應性。本發明另外涉及所有這類ADAM9-結合分子，其包含已經被人源化和/或去免疫化的輕鏈可變(VL)結構域和/或重鏈可變(VH)結構域，以便在施用這類ADAM9-結合分子至接受受試者後展示降低的免疫原性。本發明還涉及含有任意這類ADAM9-結合分子的藥物組合物、以及涉及包括使用任何這類ADAM9-結合分子治療癌症和其它疾病和病況的方法。 I. 抗體及其結合結構域
本發明的抗體是通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一個抗原識別位點能夠特異性結合至靶標的免疫球蛋白分子，所述靶標諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文使用的，術語“抗體(antibody)”和“抗體(antibodies)”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化(camelized)抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fv (sdFv)、胞內抗體以及任何上述抗體或片段的表位-結合片段。具體的，術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性片段，即，包含表位-結合位點的分子。免疫球蛋白分子可屬於任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 )或亞類。最近幾十年，已經見證了對抗體的治療潛力的興趣的復興，並且抗體已經成為一種領先類別的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等, (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。除了它們在診斷學中的應用以外，還證明抗體可用作治療劑。超過200種基於抗體的藥物已經被批准使用或在開發中。
抗體能夠“免疫特異性地結合 ”多肽或蛋白質或非蛋白質分子，是由於在這類分子上存在特定結構域或部分或構象(“表位 ”)。含表位的分子可具有免疫原活性，以使其在動物中引發抗體產生應答；這類分子稱為“抗原 ”。如本文使用的，如果抗體、雙抗體或其它表位結合分子，相對於可選的表位，與另一分子的區域(即，表位元)更經常、更快速、以更長的持久性和/或以更大的親和力反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其它表位結合分子“免疫特異性 ”結合該表位。例如，免疫特異性地結合至病毒表位元的抗體是這樣的抗體，該抗體以比其免疫特異性地結合至其它病毒表位元或非病毒表位元更大的親和力、親合力、更容易和/或以更持久性結合該病毒表位元。通過閱讀該定義也可理解，例如，免疫特異性地結合至第一靶標的抗體(或部分或表位元)可以或可以不特異性地或優先地結合第二靶標。因此，“免疫特異性結合”至特定表位不一定要求(儘管其可包括)專門結合至該表位。一般而言，但是不是必須的，提及結合意指“免疫特異性”結合。如果兩種分子的結合展示受體結合其各自配體的特異性，則認為這兩種分子能夠以“生理 特異性 ”方式彼此結合。
術語“單克隆抗體 ”指同質型抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的或非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，直接針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合至抗原的必要的特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，該術語不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞它們本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi，可用作免疫原(見，例如，Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地有活性。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方案中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。
天然抗體(如天然IgG抗體)由與兩條“重鏈 ”複合的兩條“輕鏈 ”構成。每條輕鏈包含可變結構域(“VL ”)和恆定結構域(“CL ”)。每條重鏈包含可變結構域(“VH ”)、三個恆定結構域(“CH1 ”、“CH2 ”和“CH3 ”)和位於CH1 和CH2 結構域之間的“鉸鏈 ”區(“H ”)。因此，天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常表達為約150,000 Da的糖蛋白。每條鏈的氨基端(“N-末端”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。每條鏈的羧基端(“C-末端”)部分限定了恆定區，其中輕鏈具有單個恆定結構域而重鏈通常具有三個恆定結構域和鉸鏈區。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c而IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。IgG分子的可變結構域由1、2和最常見3個互補決定區（“CDR”，即分別為CDR1，CDR2和CDR3）和稱為框架區（“FR”）的非CDR區段組成，所述CDR含有與表位接觸的殘基，所述非CDR區段通常保持結構並確定CDR區的定位以允許這樣的接觸（儘管某些框架殘基也可以與表位接觸）。因此，VL和VH結構域通常具有以下結構：n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c（其中“n”表示N-末端，“c”表示C-末端）。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二、第三和第四FR的多肽在本文分別命名為：FRL 1 結構域、FRL 2 結構域、FRL 3 結構域和FRL 4 結構域。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二、第三和第四FR的多肽在本文分別命名為：FRH 1 結構域、FRH 2 結構域、FRH 3 結構域和FRH 4 結構域。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為：CDRL 1 結構域、 CDRL 2 結構域和 CDRL 3 結構域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為：CDRH 1 結構域、 CDRH 2 結構域和 CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域指當併入到蛋白質中時使得該蛋白質能夠結合至特異性表位的多肽，無論這樣的蛋白質是具有輕鏈和重鏈的抗體還是雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一類型的蛋白質。
因此，如本文所使用，術語“表位結合片段 ”意為能夠免疫特異性結合至表位的抗體的片段，並且，術語“表位結合位點 ”是指包含表位結合片段的分子的部分。表位結合片段可包含抗體的1、2、3、4或5個CDR結構域，或可包含抗體的所有6個CDR結構域，並且儘管能夠免疫特異性結合這類表位，但可展示對與這樣的抗體的表位不同的表位的特異性、親和力或選擇性。但是，優選地，表位結合片段將包含這類抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單條多肽鏈(例如，scFv)，或可包括兩條或更多條多肽鏈，每條鏈均具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2 片段等)。除非具體指出，否則本文所述的蛋白質分子的結構域的順序是從“N-末端至C-末端”方向。
本發明尤其包括包含本發明的抗ADAM9-VL和/或VH結構域的單鏈可變結構域片段(“scFv ”)以及包含這類抗ADAM9-VL和/或VH結構域的多特異性結合分子。單鏈可變結構域片段包含使用短“連接體”肽連接在一起的VL和VH結構域。可以修飾這類連接體以提供額外的功能，諸如允許藥物的附著或允許附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入適當的宿主細胞中，所述宿主細胞可以是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸埃希氏菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
本發明還尤其包括本發明的抗ADAM9抗體的人源化變體的CDRH 1，CDRH 2，CDRH 3，CDRL 1，CDRL 2和CDRL 3結構域，以及包含任何1、2或3個這類CDRL 的VL結構域和包含任何1、2或3個這類CDRH 的VH結構域，以及包含它們的多特異性結合分子。術語“人源化抗體 ”指具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構的嵌合分子。人源化抗體一般使用重組技術製備。本發明的抗ADAM9抗體包括本文稱為“MAB-A”的抗體的人源化變體、嵌合變體或犬源化變體。編碼MAB-A的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操作生成具有改進或改變特徵(例如親和力、交叉反應性、特異性等)的MAB-A衍生物。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個基本步驟。這些是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪種抗體框架區域；(3)應用實際人源化或犬源化方法/技術；和(4)轉染和表達人源化抗體。見，例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。術語“優化的”抗體是指在輕鏈或重鏈可變區中的至少一個互補決定區(CDR)中具有至少一個不同於親本抗體的氨基酸的抗體，與親本抗體相比，其賦予與人ADAM9和/或食蟹猴ADAM9更高的結合親和力（例如2倍或更多倍）。從本文提供的教導可以理解，本發明的抗體可以是人源化的、優化的或同時是人源化的和優化的。
表位結合位點可以包含與一個或多個恆定結構域融合的完整的可變結構域，或者僅包含移植到適當的框架區的這類可變結構域的CDR。表位結合位點可以是野生型或可以通過一個或多個氨基酸取代、插入或缺失而被修飾。這樣的作用部分地或完全地消除了恆定區作為接受者（例如，人類個體）中的免疫原的能力，然而，對外源可變結構域的免疫應答的可能性得到保留(LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅僅關注提供源自人的恆定區，而且也關注修飾可變結構域，從而重塑它們使其盡可能地與人免疫球蛋白中發現的形式接近。已知抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域都包含三個CDR，側翼是四個框架區，所述CDR對所討論的抗原回應不同並且決定結合能力，所述框架區在給定物種中相對保守並且推定其為CDR提供支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可變結構域。已經報導了該方法應用於各種抗體：Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方案中，人源化抗體保留所有的CDR序列(例如，人源化鼠抗體，其包含鼠抗體中存在的所有六個CDR)。在其他實施方案中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其序列相對於初始抗體的CDR不同。
已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的許多人源化抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恆定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見，例如，Winter等(1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224；Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A 結腸 Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物CDR，其然後與適當的人抗體恆定結構域融合(見，例如，Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR (見，例如，歐洲專利公開號519,596)。這些“人源化的”分子被設計為使得對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。 II. Fcγ受體(FcγR)
抗體的兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用形成“Fc區域”，其是由細胞“Fc受體”識別的結構域，所述Fc受體包括但不限於Fcγ受體(“Fc γ R ”)。如本文所用，術語“Fc區域”用於定義包含IgG重鏈的CH2和CH3結構域的該鏈的C-末端區域。如果Fc結構域的氨基酸序列相對於其它IgG同種型與特定IgG同種型最同源，則認為該Fc結構域屬於該特定IgG同種型、類或亞類。
示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如由在Kabat中闡釋的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2 )： 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如由在Kabat中闡釋的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 如由在Kabat中闡釋的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4 )： 231 240 250 260 270 280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 如由在Kabat中闡釋的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
整個本說明書中，在IgG重鏈的恆定區中的殘基的編號是如Kabat等, Sequences of PROTEINs of Immunological Interest, 第五版, Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat ”)中的EU索引的編號，其通過引用明確併入本文。術語“Kabat 中闡釋的 EU 索引 ”指Kabat中提供的人IgG1 EU抗體的恆定結構域的編號。來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸通過氨基酸在鏈中的位置而命名。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑑定了每個子群的氨基酸共有序列，並且指定了每種氨基酸的殘基編號，並且CDR如通過Kabat定義的被鑑定(應該理解，如通過Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins ,” J. Mol. Biol. 196:901-917)定義的，CDRH 1提前五個殘基開始)。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列中的一條，Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。用於賦予殘基編號的該方法已經成為本領域的標準並且容易鑑定在不同抗體，包括嵌合或人源化的變體中等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸等同的位置。
在抗體恆定區中的許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如在Kabat闡釋的EU索引編號)處已經觀察到了多態性，因此示出的序列和現有技術的序列之間可能存在輕微的差別。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，已知18個Gm同種異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function And Regulation. ”Pergamon, Oxford, 43-78頁(1990)；Lefranc, G. 等1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、同種型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、同種型或單倍型。此外，在一些表達體系中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明的ADAM9-結合分子中的任選的氨基酸殘基。本發明具體包括缺少CH3結構域的C-末端殘基的ADAM9-結合分子。本發明也具體包括包含CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類結構。
如上所述，天然IgG抗體的Fc區域能夠結合細胞Fcγ受體(FcγR)。這類結合導致活化或抑制信號向免疫系統的轉導。這類結合導致截然相反的功能的能力反映了不同FcγR之間的結構差異，尤其反映了結合的FcγR是否具有基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(“ITAM”)還是具有基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(“ITIM”)。不同細胞質酶向這些結構的聚集支配FcγR-介導的細胞應答的結果。含ITAM的FcγR包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，並且當結合至Fc區域(例如，存在於免疫複合物中的聚集的Fc區域)時啟動免疫系統。FcγRIIB是目前唯一已知的含ITIM的天然FcγR；當結合至聚集的Fc區域時，其用來阻抑或抑制免疫系統。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯的FcγRIIA簇用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的停泊位點，Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI3 K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在限定了FcγR的這種抑制性亞類。最近，確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時，FcγRIIB中的ITIM變成磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca++ 的流入。因此，FcγRIIB的交聯阻礙對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。因此，中止B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌。 III. 雙特異性抗體、多特異性抗體和DART®雙抗體
抗體結合抗原表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體的輕鏈和重鏈的相互作用，具體的，其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體如IgG的兩種表位-結合位點中的一種。天然抗體能夠結合至僅一個表位種類(即，它們是單特異性的)，儘管它們可結合該表位元種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。
抗體的功能可通過以下手段得到增強：產生基於多特異性抗體的分子，其可同時結合兩種單獨的且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)；和/或產生基於抗體的分子，其對於相同的表位和/或抗原具有更高價(即，多於兩個結合位點)。
為了提供具有比天然抗體更大能力的分子，已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見，例如，PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用連接肽，所述連接肽將其他表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)融合至抗體核心或融合在抗體核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，或融合多個表位結合片段(例如，兩個Fab片段或scFv)融合。可選的形式使用連接肽，以將表位結合片段(例如，scFv、VL、VH等)與二聚化結構域，比如CH2-CH3結構域，或可選的多肽融合(見例如PCT公開號WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被轉變，並且VL和VH結構域已經被多樣化(見例如PCT公開號WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合至多於一種抗原。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。PCT公開號WO 2010/028797、WO 2010/028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區域已經用另外的VL和VH結構域替換，以形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO 2003/012069公開了重組雙抗體，其單個鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單條多肽鏈被合成，然後經歷蛋白酶解，以產生異源二聚化結構。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。
雙抗體的設計是基於被稱為單鏈可變結構域片段(scFv)的抗體衍生物。這樣的分子通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。Bird, R.E.等(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變結構域的羧基末端和另一可變結構域的氨基末端之間橋接約3.5 nm。已經設計和使用了其他序列的連接體(Bird等(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。連接體進而可被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可重組或合成產生單鏈變體。為了合成產生scFv，可使用自動合成儀。為了重組產生scFv，可將包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入適當的宿主細胞中，所述宿主細胞可以是真核細胞，比如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，或原核細胞，比如大腸埃希氏菌。可通過常規操作比如多核苷酸的連接製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
本領域已經注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即，除了雙價或多價之外還顯示雙特異性或多特異性)方面不同於這樣的天然抗體的雙抗體的能力(見，例如，Holliger, P.等(1993) “’Diabodies’ : Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragment s, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens等)；Alt等, (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等, (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等, (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等, (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody ) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等, (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
雙特異性結合分子(例如，非單特異性雙抗體)的供應提供相比抗體的明顯優勢，包括但不限於足以共連接和/或共定位表達不同表位的不同細胞的“反式(trans)”結合能力和/或足以共連接和/或共定位由相同細胞表達的不同分子的“順式(cis)”結合能力。因此，雙特異性結合分子(例如，非單特異性雙抗體)具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。在各種應用中，雙特異性在設計和工程化雙抗體方面允許大的靈活性，提供對多聚抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的導向靶向，這取決於兩個靶抗原的存在。由於其增加的價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為~50 kDa或以下)，本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225)。
產生雙特異性雙抗體的能力已經導致它們(以“反式”)將兩個細胞共連接在一起的用途，例如，通過共連接在不同細胞表面上存在的受體(例如，交聯細胞毒性T-細胞與腫瘤細胞) (Staerz等, (1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cell ,” Nature 314:628-631；Holliger等, (1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bis pecifc Diabody ,” Protein Eng. 9:299-305；和Marvin等, (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Diabody ,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。可選地(或另外)，雙特異性(或三特異性或多特異性)雙抗體可用於(以“順式”)共連接存在於相同細胞表面上的分子，如受體等。不同細胞和/或受體的共連接可用於調節效應子功能和/或免疫細胞信號轉導。包含表位-結合位點的多特異性分子(例如，雙特異性雙抗體)可被引導至在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞、抗原呈遞細胞或其它單核細胞上表達的任何免疫細胞的表面決定子如CD2、CD3、CD8、CD16、T-細胞受體(TCR)、NKG2D等。具體的，被引導至存在於免疫效應細胞上的細胞表面受體的表位-結合位點可用於產生能夠介導重定向細胞殺傷的多特異性結合分子。
但是，上述優勢以突出的成本為代價。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特且不同的多肽(即，這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體不同，其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致分子失活(Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以防止同源二聚化) (Takemura, S.等, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術已經教導了這類多肽的非共價締合(參見，例如，Olafsen等, (2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等, (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等, (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；和Lu, D.等,( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽構成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(參見，例如，Lu, D.等, (2005) “A Fully Human RecombinantIgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
面對這樣的挑戰，本領域已經成功地開發了穩定的、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱為DART® 雙抗體；見例如，美國專利號9,296,816和9,284,375和美國專利公開號2015/0175697；2014/0255407；2014/0099318；2013/0295121；WO 2012/018687；WO 2012/162068；2010/0174053；WO 2010/080538；2009/0060910；2007-0004909；歐洲專利公開號EP 2714079；EP 2601216；EP 2376109；EP 2158221；EP 1868650；和PCT公開號WO 2012/162068；WO 2012/018687；WO 2010/080538；WO 2006/113665；和Sloan, D.D.等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. Doi: 10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini, M.等, (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform ,” Blood pii: blood-2014-05-575704；Chichili, G.R.等, (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Moore, P.A.等, (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等, (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；和Johnson, S.等, (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion ,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)。這樣的雙抗體包含兩條或多條共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中，其允許形成二硫鍵，從而將一對或多對這類多肽鏈彼此共價結合。例如，將半胱氨酸殘基添加至這樣的構建體的C-末端已經顯示允許涉及的多肽鏈之間的二硫鍵合，穩定了產生的雙抗體，而不干擾雙抗體的結合特性。這類分子可製成雙特異性（或多特異性）並因此可共連接兩個或更多分子。這類共連接允許提供增強的免疫療法。另外，由於這類分子的單個多肽鏈形成了共價結合的複合物，所以該分子表現出比包含非共價結合的多肽鏈的雙抗體更大的穩定性。
最近，已經描述了引入兩個雙抗體型結合結構域和一個非雙抗體型結構域以及Fc區域的三價和多價分子(見，例如，PCT公開號WO 2015/184207和WO 2015/184203)。這類結合分子可用於產生單特異性、雙特異性或三特異性分子。結合三種不同表位的能力提供增強的能力。
本領域已知用於其中需要四價分子但不需要Fc的應用的可選構建體，包括但不限於四價串聯抗體，也稱為“TandAb ” (見，例如，美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)，其通過兩條相同多肽鏈的同源二聚化形成，每條多肽鏈各自具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域。 IV. ADAM9
代表性人ADAM9多肽(NCBI序列NP_003807，其包括以底線顯示的28個氨基酸殘基信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:5 )： MGSGARFPSG TLRVRWLLLL GLVGPVLG AA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR LTRERREAPR PYSKQVSYVI QAEGKEHIIH LERNKDLLPE DFVVYTYNKE GTLITDHPNI QNHCHYRGYV EGVHNSSIAL SDCFGLRGLL HLENASYGIE PLQNSSHFEH IIYRMDDVYK EPLKCGVSNK DIEKETAKDE EEEPPSMTQL LRRRRAVLPQ TRYVELFIVV DKERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIVGGAGDV LGNFVQWREK FLITRRRHDS AQLVLKKGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGQITVET FASIVAHELG HNLGMNHDDG RDCSCGAKSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF EKLTLNKGGN CLLNIPKPDE AYSAPSCGNK LVDAGEECDC GTPKECELDP CCEGSTCKLK SFAECAYGDC CKDCRFLPGG TLCRGKTSEC DVPEYCNGSS QFCQPDVFIQ NGYPCQNNKA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS KAKAAPKDCF IEVNSKGDRF GNCGFSGNEY KKCATGNALC GKLQCENVQE IPVFGIVPAI IQTPSRGTKC WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TKCGAGKICR NFQCVDASVL NYDCDVQKKC HGHGVCNSNK NCHCENGWAP PNCETKGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL VFFFLIVPLI VCAIFIFIKR DQLWRSYFRK KRSQTYESDG KNQANPSRQP GSVPRHVSPV TPPREVPIYA NRFAVPTYAA KQPQQFPSRP PPPQPKVSSQ GNLIPARPAP APPLYSSLT 在ADAM9 (SEQ ID NO:5 )的819個氨基酸殘基中，殘基1-28是信號序列，殘基29-697是細胞外結構域，殘基698-718是跨膜結構域，並且殘基719-819是細胞內結構域。三個結構結構域位於細胞外結構域中：Reprolysin (M12B)家族鋅金屬蛋白酶結構域(在大約殘基212-406處)；去整合素結構域(在大約殘基423-497處)；和EGF樣結構域(在大約殘基644-697處)。已經鑑定了許多翻譯後修飾和同種型，並且蛋白質在順式高爾基網路中被蛋白水解切割，然後到達質膜以產生成熟蛋白質。前結構域(pro-domain)的去除通過在兩個不同位點處的切割發生。最有可能在前結構域和催化結構域(Arg-205/Ala-206)之間的邊界處通過前蛋白質(pro-protein)轉化酶諸如弗林蛋白酶處理。另外的上游裂解前蛋白質轉化酶位點(Arg-56/Glu-57)在ADAM9的啟動中具有重要作用。
代表性食蟹猴ADAM9多肽(NCBI序列XM_005563126.2，包括以底線顯示的可能的28個氨基酸殘基信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:6 )： MGSGVGSPSG TLRVRWLLLL CLVGPVLG AA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR LTRERREAPR PYSKQVSYLI QAEGKEHIIH LERNKDLLPE DFVVYTYNKE GTVITDHPNI QNHCHFRGYV EGVYNSSVAL SNCFGLRGLL HLENASYGIE PLQNSSHFEH IIYRMDDVHK EPLKCGVSNK DIEKETTKDE EEEPPSMTQL LRRRRAVLPQ TRYVELFIVV DKERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIAGGAGDV LGNFVQWREK FLITRRRHDS AQLVLKKGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGHITVET FASIVAHELG HNLGMNHDDG RDCSCGAKSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF EKLTLNKGGN CLLNIPKPDE AYSAPSCGNK LVDAGEECDC GTPKECELDP CCEGSTCKLK SFAECAYGDC CKDCRFLPGG TLCRGKTSEC DVPEYCNGSS QFCQPDVFIQ NGYPCQNNKA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS KAKAAPKDCF IEVNSKGDRF GNCGFSGNEY KKCATGNALC GKLQCENVQE IPVFGIVPAI IQTPSRGTKC WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TKCGADKICR NFQCVDASVL NYDCDIQKKC HGHGVCNSNK NCHCENGWAP PNCETKGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL VFFFLIVPLI VCAIFIFIKR DQLWRRYFRK KRSQTYESDG KNQANPSRQP VSVPRHVSPV TPPREVPIYA NRFPVPTYAA KQPQQFPSRP PPPQPKVSSQ GNLIPARPAP APPLYSSLT 蛋白質的Reprolysin (M12B)家族鋅金屬蛋白酶結構域在大約殘基212-406處)；蛋白質的去整合素結構域在大約殘基423-497處。
在某些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子(例如，scFv、抗體、雙特異性雙抗體等)特徵在於以下標準中的任意一、二、三、四、五、六、七或八個： (1) 免疫特異性結合在癌細胞表面上內源性表達的人ADAM9的能力； (2) 以類似的結合親和力特異性結合人和非人靈長類動物ADAM9(例如，食蟹猴的ADAM9)； (3) 以4 nM或更小的平衡結合常數(KD )特異性結合人ADAM9； (4) 以4 nM或更小的平衡結合常數(KD )特異性結合非人靈長類動物ADAM9； (5) 以5 x 105 M-1 min-1 或更大的結合速率(on rate) (ka)特異性結合人ADAM9； (6) 以1 x 106 M-1 min-1 或更大的結合速率(ka)特異性結合非人靈長類動物ADAM9； (7) 以1 x 10-3 min-1 或更小的解離速率(off rate) (kd)特異性結合人ADAM9； (8) 以9 x 10-4 min-1 或更小的解離速率(kd)特異性結合非人靈長類動物ADAM9； (9) 相比嵌合或鼠親本抗體，被優化為在與食蟹猴ADAM9的結合親和力方面具有至少100-倍增強(例如，至少100-倍、至少150-倍、至少200-倍、至少250-倍、至少300-倍、至少350-倍、至少400-倍、至少450-倍、至少500-倍、至少550-倍或至少600-倍增強) (例如，如通過BIACORE®分析測量的)，並保持與人ADAM9的高親和力結合(例如，如通過BIACORE®分析測量的)。
如本文所述的，可以使用表面等離子體共振，例如通過BIACORE®分析來測定ADAM9-結合分子的結合常數。表面等離子體共振資料可以擬合到1:1朗繆爾結合模型(同步的ka kd)和從速率常數的比kd/ka計算的平衡結合常數KD 。可為單價ADAM9-結合分子(即，包含單個ADAM9表位結合位點的分子)、二價ADAM9-結合分子(即，包含兩個ADAM9表位結合位點的分子)或具有更高價的ADAM9-結合分子(例如，包含三個、四個或更多個ADAM9表位結合位點的分子)測定這類結合常數。
本發明尤其包括ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)，其包含免疫特異性結合至人ADAM9多肽的表位的抗-ADAM9輕鏈可變(VL)結構域(一個或多個)和抗-ADAM9重鏈可變(VH)結構域(一個或多個)。除非另有說明，否則所有這類ADAM9-結合分子均能夠免疫特異性結合至人ADAM9。如本文所使用的，這類ADAM9可變結構域分別被稱為“抗 -ADAM9-VL ”和“抗 -ADAM9-VH ”。 V. 鼠抗-人ADAM9抗體
阻斷靶蛋白質對ADAM9的處理活性的鼠抗-ADAM9抗體被內化，並且，鑑定了具有抗-腫瘤活性的鼠抗-ADAM9抗體(見，例如，美國專利號8,361,475)。該抗體在美國專利號7,674,619和8,361,475中被命名為由雜交瘤克隆ATCC PTA-5174產生的“抗-KID24”抗體，其在本文中被命名為“MAB-A ”。MAB-A 表現出對腫瘤超過正常組織的強優先結合(見，圖7A-7C )。MAB-A 在一大組正常細胞類型中表現出很少染色或沒有染色(表 1 )。
如圖8A-8B 所示，MAB-A 以高親和力結合人ADAM9，但是以較小的程度結合非人靈長類動物(例如，食蟹猴)。
MAB-A 的VL和VH結構域的氨基酸序列在下面提供。MAB-A 的VH和VL結構域被人源化，並且，CDR被優化以提高親和力和/或去除潛在的氨基酸不利性(liabilities)。CDRH 3進一步被優化，以增強與非人靈長類動物ADAM9的結合，同時維持其對人ADAM9的高親和力。
本發明的優選的抗-人ADAM9-結合分子具有MAB-A 的優化的變體的VH結構域的1、2或所有3個CDRH 和/或VL結構域的1、2或所有3個CDRL ，並且，優選地進一步具有人源化的MAB-A 的VH和/或VL結構域的人源化的框架區域(“FR ”)。本發明的其它優選的抗-人ADAM9-結合分子具有MAB-A的人源化/優化變體的整個VH和/或VL結構域。這類優選的抗-人ADAM9-結合分子包括抗體、雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合抗體或人源化抗體、BiTe、雙抗體等，以及另外包含天然產生的或變異的Fc區域的這類結合分子。
本發明尤其涉及包含ADAM9結合結構域的ADAM9-結合分子，所述ADAM9結合結構域具有： (A) (1) MAB-A的VH結構域的三個CDRH ；和 (2) MAB-A的人源化變體的VH結構域的四個FR；或 (B) (1) MAB-A的VL結構域的三個CDRL ；和 (2) MAB-A的人源化變體的VL結構域的四個FR；或 (C) MAB-A的優化變體的VH結構域的三個CDRH ；和MAB-A的VL結構域的三個CDRL ；或 (D) MAB-A的VH結構域的三個CDRH ；和MAB-A的優化變體的VL結構域的三個CDRL ；或 (E) MAB-A的優化變體的VH結構域的三個CDRH ；和優化的MAB-A的VL結構域的三個CDRL ；或 (F) (1) MAB-A的優化變體的VH結構域的三個CDRH ；和 (2) MAB-A的人源化變體的VH結構域的四個FR；或 (G) (1)MAB-A 的優化變體的VL結構域的三個CDRL ；和 (2) MAB-A的人源化變體的VL結構域的四個FR；或 (H) (1) MAB-A的人源化/優化變體的VH結構域；和 (2) MAB-A的人源化/優化變體的VL結構域。鼠抗體“MAB-A ”
鼠抗-ADAM9抗體MAB-A 的VH結構域的氨基酸序列是SEQ ID NO:7 (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMH WVKQR PGQGLEWIG E IIPINGHTNY NEKFKS KATL TLDKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTLT VSS
MAB-A 的CDRH 1 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8) ： SYWMH。
MAB-A 的CDRH 2 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9) ： EIIPINGHTNYNEKFKS。
MAB-A 的CDRH 3 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10) ： GGYYYYGSRDYFDY。
鼠抗-ADAM9抗體MAB-A 的VL結構域的氨基酸序列是SEQ ID NO:11 (CDRL 殘基以底線顯示)： DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC KASQSVD YDGDSYMN WY QQIPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YC QQSHEDPF T FGGGTKLEI K
MAB-A 的CDRL 1 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12) ： KASQSVDYDGDSYMN。
MAB-A 的CDRL 2 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13) ： AASDLES。
MAB-A 的CDRL 3 結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14) ： QQSHEDPFT。 VI. 示例性人源化的/優化的抗-ADAM9-VH和VL結構域 1. MAB-A的變異的VH結構域
MAB-A 的某些優選的人源化的/優化的抗-ADAM9-VH結構域的氨基酸序列是MAB-A的ADAM9-VH結構域(SEQ ID NO:7 )的變體，其由SEQ ID NO:15 (CDRH 殘基以底線顯示)表示： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWX1 H WVRQA PGKGLEWVG E IIPIX2 GHTNY NEX3 FX4 X5 RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY WGQGTTVT VSS 其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 和X6 被獨立地選擇， 其中：X1 是M或I；X2 是N或F；X3 是K或R；X4 是K或Q；X5 是S或G和X6 是P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 和X11 被選擇以使得：
MAB-A 的優選的人源化的抗-ADAM9 VH結構域：hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )和MAB-A 的某些優選的人源化的/優化的抗-ADAM9-VH結構域：hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 ) 和hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 ) 的氨基酸序列在下面示出(CDRH 以單底線顯示；相對於hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:7 )的不同以雙底線顯示)。hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPINGHTNY NEKF KSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NE R F QG RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYW I H WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NE R F QG RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FNSGTL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY IGKGVL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY PRFGWL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY TGKGVL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY DSNAVL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FHSGTL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FNKAVL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY GGSGVL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY PRQGFL DY WGQGTTVT VSShMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29) ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY YNSGTL DY WGQGTTVT VSS
MAB-A的人源化的和/或優化的抗-ADAM9-VH結構域的FR的合適的人氨基酸序列是：FRH 1 結構域(SEQ ID NO:30 )：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSFRH 2 結構域 (SEQ ID NO:31 )：WVRQAPGKGLEWVGFRH 3 結構域(SEQ ID NO:32 )：RFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCARFRH 4 結構域(SEQ ID NO:33 )：WGQGTTVTVSS
MAB-A的抗-ADAM9-VH結構域的CDRH 1 結構域的合適的可選氨基酸序列包括：SEQ ID NO:8 : SYWMHSEQ ID NO:34 : SYWIH
MAB-A的抗-ADAM9-VH結構域的CDRH 2 結構域的合適的可選氨基酸序列包括：SEQ ID NO:9 : EIIPINGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:35 : EIIPIFGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:36 : EIIPIFGHTNYNERFQG
MAB-A的抗-ADAM9-VH結構域的CDRH 3 結構域的合適的可選氨基酸序列包括：SEQ ID NO:10 : GGYYYYGSRDYFDYSEQ ID NO:37 : GGYYYYFNSGTLDYSEQ ID NO:38 : GGYYYYIGKGVLDYSEQ ID NO:39 : GGYYYYPRFGWLDYSEQ ID NO:40 : GGYYYYTGKGVLDYSEQ ID NO:41 : GGYYYYDSNAVLDYSEQ ID NO:42 : GGYYYYFHSGTLDYSEQ ID NO:43 : GGYYYYFNKAVLDYSEQ ID NO:44 : GGYYYYGGSGVLDYSEQ ID NO:45 : GGYYYYPRQGFLDYSEQ ID NO:46 : GGYYYYYNSGTLDY
因此，本發明包括具有VH結構域的ADAM9結合分子，所述VH結構域包含： (1) CDR H 1 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:47 : SYWX1 H 其中：X1 是M或I； (2) CDR H 2 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:48 : EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 其中：X2 、X3 、X4 和X5 被獨立地選擇，和 其中：X2 是N或F；X3 是K或R；X4 是K或Q；和X5 是S或G； 和 (3) CDR H 3 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:49 : GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY 其中：X6 ,是P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，和X7 、X8 、X9 、X10 和X11 被選擇以使得：
MAB-A的衍生物/變體的第一示例性人源化的/優化的IgG1重鏈含有hMAB-A VH (2) 結構域(SEQ ID NO:17 )，並具有氨基酸序列(SEQ ID NO:50 )： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
MAB-A的衍生物/變體的第二示例性人源化的/優化的IgG1重鏈含有hMAB-A VH (2C) 結構域(SEQ ID NO:22 )，並具有氨基酸序列(SEQ ID NO:51 )： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRFGWL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
MAB-A的衍生物/變體的第三示例性人源化的/優化的IgG1重鏈含有hMAB-A VH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，並具有氨基酸序列(SEQ ID NO:52 )： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGX 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
如本文提供的，Fc區域的CH2-CH3結構域可以被工程化，以例如降低效應子功能。在某些實施方案中，本發明的示例性人源化的/優化的IgG1重鏈的CH2-CH3結構域包含選自以下的一個或多個取代：L234A和L235A。
因此，MAB-A的衍生物/變體的第四示例性人源化的/優化的IgG1重鏈含有hMAB-A VH (2I)結構域(SEQ ID NO:28)，並且，進一步包含Fc區域的CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:106)中的取代L234A和L235A，下面以底線顯示)，並且，具有氨基酸序列(SEQ ID NO:202)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPE A A GGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。 2. MAB-A的變異的VL結構域
MAB-A的優選的人源化的/優化的抗-ADAM9-VL結構域的氨基酸序列是MAB-A的ADAM9-VL結構域(SEQ ID NO:11 )的變體，並由SEQ ID NO:53 (CDRL 殘基以底線顯示)表示： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC X12 ASQSVD YX13 GDSYX14 N WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSX15 X16 X17 PF T FGQGTKLEI K 其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 和X17 ,被獨立地選擇，和 其中：X12 是K或R；X13 是D或S；X14 是M或L；X15 是H或Y；X16 是E或S；和X17 是D或T。
MAB-A的優選的人源化的抗-ADAM9-VL結構域: hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )和MAB-A的優選的人源化的/優化的抗-ADAM9-VL結構域：hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )、hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )和hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )的氨基酸序列在下麵示出(CDRL 以單底線顯示；相對於hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )的不同以雙底線顯示)。hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC KASQSVD YDGDSYMN WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSHEDPF T FGQGTKLEI KhMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55) ： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC KASQSVD Y S GDSYMN WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSHEDPF T FGQGTKLEI KhMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56) ： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC R ASQSVD Y S GDSYMN WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSHEDPF T FGQGTKLEI KhMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57) ： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC R ASQSVD Y S GDSY L N WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQS YST PF T FGQGTKLEI K
因此，MAB-A的人源化的和/或優化的抗-ADAM9-VL結構域的FR的合適的人氨基酸序列是：FRL 1 結構域(SEQ ID NO:58 )： DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCFRL 2 結構域(SEQ ID NO:59 )：WYQQKPGQPPKLLIYFRL 3 結構域(SEQ ID NO:60 )：GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCFRL 4 結構域(SEQ ID NO:61 )：FGQGTKLEIK
抗-ADAM9-VL結構域的CDRL 1 結構域的合適的可選氨基酸序列包括：SEQ ID NO:12 ：KASQSVDYDGDSYMNSEQ ID NO:62 ：KASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:63 ：RASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:64 ：RASQSVDYSGDSYLN
抗-ADAM9-VL結構域的CDRL 3 結構域的合適的可選氨基酸序列包括：SEQ ID NO:14 ： QQSHEDPFTSEQ ID NO:65 ： QQSYSTPFT
因此，本發明包括抗-ADAM9抗體VL結構域，其包含： (1) CDR L 1 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:66 ：X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N 其中：X12 、X13 、X14 被獨立地選擇，和 其中：X12 是K或R；X13 是D或S；和X14 是M或L； (2) CDR L 2 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:13 ：AASDLES 和 (3) CDR L 3 結構域，其具有氨基酸序列：SEQ ID NO:67 ：QQSX15 X16 X17 PFT 其中：X15 、X16 和X17 被獨立地選擇，和 其中：X15 是H或Y；X16 是E或S；和X17 是D或T。
MAB-A的衍生物/變體的示例性人源化的/優化的IgG1輕鏈含有hMAB-A VL (2) 結構域(SEQ ID NO:55 )，並且，具有氨基酸序列(SEQ ID NO:68 )： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
因此，本發明另外明確考慮這樣的ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)，其免疫特異性結合至人ADAM9多肽的表位，並且其包含上面提供的任意MAB-A CD RH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2或CDRL 3，本發明尤其考慮這樣的ADAM9-結合分子，其包含上面提供的MAB-A CD RH 1之一、上面提供的MAB-A CD RH 2之一、上面提供的MAB-A CD RH 3之一、上面提供的MAB-A CD RL 1之一、上面提供的MAB-A CD RL 2之一和上面提供的MAB-A CD RL 3之一。
本發明進一步考慮這樣的ADAM9-結合分子，其進一步包含上面提供的任意人源化的MAB-A FRH 1、FRH 2,、FRH 3或FRH 4、FRL 1、FRL 2、FRL3或FRL 4，本發明尤其考慮這樣的ADAM9-結合分子，其包含FRH 1、FRH 2、FRH 3和FRH 4和/或其包含FRL 1、FRL 2、FRL 3、FRL 4和FRH 1。
在一些實施方案中，ADAM9-結合分子包括CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域，其具有選自由以下組成的組的序列： (a) 分別為SEQ ID NO:8、35和10和SEQ ID NO:62、13和14； (b) 分別為SEQ ID NO:8、35和10和SEQ ID NO:63、13和14； (c) 分別為SEQ ID NO:8、36和10和SEQ ID NO:63、13和14； (d) 分別為SEQ ID NO:34、36和10和SEQ ID NO:64、13和65 (e) 分別為SEQ ID NO:8、35和37和SEQ ID NO:62、13和14； (f) 分別為SEQ ID NO:8、35和38和SEQ ID NO:62、13和14； (g) 分別為SEQ ID NO:8、35和39和SEQ ID NO:62、13和14； (h) 分別為SEQ ID NO:8、35和40和SEQ ID NO:62、13和14； (i) 分別為SEQ ID NO:8、35和41和SEQ ID NO:62、13和14； (j) 分別為SEQ ID NO:8、35和42和SEQ ID NO:62、13和14； (k) 分別為SEQ ID NO:8、35和43和SEQ ID NO:62、13和14； (l) 分別為SEQ ID NO:8、35和44和SEQ ID NO:62、13和14； (m) 分別為SEQ ID NO:8、35和45和SEQ ID NO:62、13和14；和 (n) 分別為SEQ ID NO:8、35和46和SEQ ID NO:62、13和14。
在具體的實施方案中，ADAM9-結合分子包括CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域和CDRL 3結構域，其分別具有SEQ ID NOs:8 、 35 和45 以及SEQ ID NOs:62 、 13 和14 的序列。
在一些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包括重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其序列與下面的序列具有至少90%、至少95%、至少99%或具有100%同一性： 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:17 和SEQ ID NO:56 ； 分別為SEQ ID NO:18 和SEQ ID NO:56 ； 分別為SEQ ID NO:19 和SEQ ID NO:57 ； 分別為SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:22 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:24 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:26 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:27 和SEQ ID NO:55 ； 分別為SEQ ID NO:28 和SEQ ID NO:55 ；和 分別為SEQ ID NO:29 和SEQ ID NO:55 。
“基本上同一的”或“同一的”是指與參考氨基酸序列（例如，本文所述的任何一種氨基酸序列）顯示出至少50%同一性的多肽。優選地，這樣的序列與用於比較的多肽序列在氨基酸水準是至少60%，更優選至少80%或至少85%，更優選至少90%、至少95%、至少99%或甚至100%同一性的。
序列同一性通常使用序列分析軟體(例如，遺傳學電腦組的序列分析套裝軟體(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)，威斯康辛大學生物技術中心(University of Wisconsin Biotechnology Center)，威斯康辛州，麥迪森，大學路1710號，郵編53705；BLAST；BESTFIT；GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)來測量。這些軟體通過為各種取代、缺失和/或其它修飾指定同源性程度來匹配相同或相似的序列。保守性取代通常包括以下組中的取代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在確定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程式，其中介於e-3和e-100之間的概率評分表示密切相關的序列。
在具體的實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，其序列與SEQ ID NO:28 和SEQ ID NO:55 的序列分別具有至少90%、至少95%、至少99%或具有100%同一性。
在某些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含如下重鏈和輕鏈序列： 分別為SEQ ID NO:50 和SEQ ID NO:68 ； 分別為SEQ ID NO:51 和SEQ ID NO:68 ； 分別為SEQ ID NO:52 和SEQ ID NO:68 ；和 分別為SEQ ID NO:202 和SEQ ID NO:68 。
本發明還明確考慮這樣的ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)，其免疫特異性結合至人ADAM9多肽的表位，並且其包含上面提供的任意人源化的/優化的抗-ADAM9MAB-A VL或VH結構域。本發明尤其考慮這類ADAM9-結合分子，其包含人源化的抗-ADAM9 VL或VH結構域的任意下述組合：
本發明尤其包括這樣的ADAM9-結合分子，其包含(i)上面提供的人源化的/優化的抗-ADAM9-VL和/或VH結構域和(ii)Fc區域。在具體的實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子是單克隆抗體，其包含(i)上面提供的人源化的/優化的抗-ADAM9-VL和/或VH結構域和(ii)Fc區域。在其它實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子選自由以下組成的組：單克隆抗體、多特異性抗體、合成抗體、嵌合抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fv (sdFv)、BiTE、雙抗體和三價結合分子。
儘管上面概述了對抗-ADAM9 VH和VL結構域的具體修飾，並且在圖9A-9B 中比較了所述具體的修飾，但是在工程化本發明的人源化的和/或優化的抗-ADAM9-VH或VL結構域時，不一定要修飾所有這些殘基或這些殘基中的大部分。本發明還包括這些VH和VL序列的微小變化，包括例如可被引入以促進亞克隆的C-末端和/或N-末端氨基酸殘基的氨基酸取代。 VII. 嵌合抗原受體
本發明的ADAM9-結合分子可以是單特異性的單鏈分子，諸如抗-ADAM9單鏈可變片段(“抗 -ADAM9-scFv ”)或抗-ADAM9嵌合抗原受體(“抗 -ADAM9-CAR ”)。如上所述，scFv通過經由短連接肽將輕鏈和重鏈可變結構域連接在一起來製備。第一代嵌合抗原受體(“CAR ”)通常包含來自CD3ζ-鏈的細胞內結構域，其是來自內源性T-細胞受體(“TCR ”)的信號的主要遞質。第二代CAR具有融合至CAR的細胞質尾部的、來自各種共刺激蛋白質受體(例如，CD28、41BB、ICOS等)的另外的細胞內信號轉導結構域，以向T-細胞提供另外的信號。第三代CAR結合多種信號轉導結構域，如CD3ζ-CD28-41BB或CD3ζ-CD28-OX40，以進一步增強其效力(Tettamanti, S.等, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等, (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等, (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola，I.等, (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。在以下文獻中論述了嵌合抗原受體：美國專利號9,447,194；9,266,960；9,212,229；9,074,000；8,822,196；和8,465,743；以及美國專利公開號2016/0272718、2016/0144026、2016/0130357、2016/0081314、2016/0075784、2016/0058857、2016/0046729、2016/0046700、2016/0045551、2016/0015750、2015/0320799、2015/0307623、2015/0307564、2015/0038684、2014/0134142和2013/0280285。
本發明的抗-ADAM9-CAR包含融合至受體的細胞內結構域的抗-ADAM9-scFv。抗-ADAM9-scFv的輕鏈可變(VL)結構域和重鏈可變(VH)結構域選自本文公開的任意人源化的抗-ADAM9-VL和抗-ADAM9-VH結構域。優選地，VH結構域選自由以下組成的組：hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 ),hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )、hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )、hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )、hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )、hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )、hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )、hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )、hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )、hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )、hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )、hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )、hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 )和hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 )，並且，VL結構域選自由以下組成的組：hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )、hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )、hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )和hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )。可用於形成這類嵌合抗原受體的人源化的/優化的抗-ADAM9-VL和抗-ADAM9-VH結構域的組合以及CDRH 和CDRL 的組合在上文示出。
本發明的抗-ADAM9-CAR的細胞內結構域優選選自任意下述的細胞內結構域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、Heregulin-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或Ly49H-CD3ζ (Tettamanti, S.等, (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等, (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等, (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola, I.等, (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。 VIII. 多特異性ADAM9-結合分子
本發明還涉及多特異性(例如，雙特異性、三特異性等) ADAM9-結合分子，其包含表位結合位點(優選包含本發明的抗-ADAM9-VH結構域的1、2或所有3個CDRH 和/或本發明的抗-ADAM9-VL結構域的1、2或所有3個CDRL 或這類抗-ADAM9-VH結構域和/或這類抗-ADAM9-VL結構域)，並且進一步包含免疫特異性結合至第二表位的第二表位結合位點，其中這類第二表位是(i) ADAM9的不同表位，或(ii)不是ADAM9的分子的表位。這類多特異性ADAM9-結合分子優選包含識別對靶細胞或組織類型獨特的一組抗原的表位元結合位元點的組合。尤其地，本發明涉及多特異性ADAM9-結合分子，其能夠結合至ADAM9的表位和存在於效應細胞表面上的分子的表位，所述效應細胞尤其是T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞。例如，本發明的這類ADAM9-結合分子可被構建為包含免疫特異性結合CD2、CD3、CD8、CD16、T-Cell受體(TCR)或NKG2D的表位結合位點。
本發明的一個實施方案涉及能夠結合至“第一表位 ”和“第二表位 ”的雙特異性ADAM9-結合分子，這類表位彼此不同。這類雙特異性分子包含能夠結合至第一表位的“VL1 ”/“VH1 ”結構域，和能夠結合至第二表位的“VL2 ”/“VH2 ”結構域。符號“VL1 ”和“VH1 ”分別表示結合這類雙特異性分子的“第一”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，符號“VL2 ”和“VH2 ”分別表示結合這類雙特異性分子的“第二”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。具體的表位被指定為第一還是第二表位是無關緊要的；這樣的符號僅僅與本發明的結合分子的多肽鏈的結構域的存在和取向相關。在一個實施方案中，這類表位中的一種是人ADAM9的表位，另一種是ADAM9的不同表位，或者為不是ADAM9的分子的表位。在具體的實施方案中，這類表位中的一種是人ADAM9的表位，另一種是存在於效應細胞表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T-Cell受體(TCR)、NKG2D等)的表位，所述效應細胞諸如T淋巴細胞，自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞。在某些實施方案中，雙特異性分子包含多於兩個表位結合位點。這類雙特異性分子將結合至少一個ADAM9的表位和至少一個不是ADAM9的分子的表位，並且，可進一步結合ADAM9的另外的表位和/或不是ADAM9的分子的另外的表位。
本發明尤其涉及雙特異性、三特異性和多特異性ADAM9-結合分子(例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、三價結合分子等)，其具有抗體的表位-結合片段(例如VL和VH結構域)，使它們能夠協調地結合至ADAM9的至少一個表位和不是ADAM9的第二分子的至少一個表位。協調這些分子的多肽結構域的VL和VH結構域的選擇，使得構成這類多特異性ADAM9-結合分子的多肽鏈組裝形成對至少一個ADAM9的表位特異性的至少一個功能性表位結合位點和對非ADAM9分子的至少一個表位特異性的至少一個功能性表位結合位點。優選地，多特異性ADAM9-結合分子包含本發明的抗-ADAM9-VH結構域的1、2或所有3個CDRH 和/或本發明的抗-ADAM9-VL結構域的1、2或所有3個CDRL ，或本文提供的這類抗-ADAM9-VH結構域和/或這類抗-ADAM9-VL結構域。 A. 雙特異性抗體
本發明包括能夠同時結合至ADAM9的表位和不是ADAM9的分子的表位的雙特異性抗體。在一些實施方案中，使用以下文獻中描述的任何方法製備能夠同時結合至ADAM9和不是ADAM9的第二分子的雙特異性抗體：PCT公開號WO 1998/002463、WO 2005/070966、WO 2006/107786 WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 2006/107617、WO 2007/046893、WO 2007/146968、WO 2008/003103、WO 2008/003116、WO 2008/027236、WO 2008/024188、WO 2009/132876、WO 2009/018386、WO 2010/028797、WO2010028796、WO 2010/028795、WO 2010/108127、WO 2010/136172、WO 2011/086091、WO 2011/133886、WO 2012/009544、WO 2013/003652、WO 2013/070565、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2013/174873和WO 2014/022540，其各自由此通過引用以其整體併入本文。 B. 缺少Fc區域的雙特異性雙抗體
本發明的一個實施方案涉及能夠結合至第一表位和第二表位的雙特異性雙抗體，其中第一表位是人ADAM9的表位，且第二表位是非ADAM9的分子的表位，所述非ADAM9的分子優選是存在於效應細胞，諸如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞的表面上的分子(例如，CD2、CD3、CD8、CD16、T-Cell受體(TCR)、NKG2D等)。這類雙抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，並且最優選地由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成，其序列允許多肽鏈彼此共價結合以形成共價締合的雙抗體，其能夠同時結合至ADAM9的表位和第二表位。
雙特異性雙抗體的這類實施方案的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合至第一表位或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即VL抗 -ADAM9-VL 或VL表位 2 )、第一間插間隔體肽(連接體1)、能夠結合至第二表位(如果這樣的第一多肽鏈含有VL抗 -ADAM9-VL )或ADAM9 (如果這樣的第一多肽鏈含有VL表位 2 )的單克隆抗體的VH結構域、任選地含有半胱氨酸殘基的第二間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體-促進結構域和C-末端(圖 1 )。
雙特異性雙抗體的該實施方案的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合至第一表位或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VL抗 -ADAM9-VL 或VL表位 2 ，並且是未被選擇包含在雙抗體的第一多肽鏈中的VL結構域)、間插間隔體肽(連接體1)、能夠結合至第二表位(如果這樣的第二多肽鏈含有VL抗 -ADAM9-VL )或結合至ADAM9 (如果這樣的第二多肽鏈含有VL表位 2 )的單克隆抗體的VH結構域、任選地含有半胱氨酸殘基的第二間插間隔體肽(連接體2)、異源二聚體-促進結構域和C-末端(圖 1 )。
第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用以形成對第一抗原(即ADAM9或含有第二表位的分子)特異性的第一功能性表位結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成對第二抗原(即，包含第二表位的分子或ADAM9)特異性的第二功能性表位結合位點。因此，調節對第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇，使得雙抗體的兩條多肽鏈總共包含能夠結合至ADAM9的表位和結合至第二表位二者的VL和VH結構域(即它們總共包含VL抗 -ADAM9-VL /VH抗 -ADAM9-VH 和VL表位 2 /VH表位 2 )。
最優選地，間插間隔體肽(即，分隔這類VL和VH結構域的“連接體1”)的長度被選擇，以基本上或完全地防止多肽鏈的VL和VH結構域彼此結合(例如由0、1、2、3、4、5、6、7、8或9個間插連接體氨基酸殘基組成)。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:69 )：GGGSGGGG。
基於促進這類二聚化的一個或多個多肽結構域(即，“異源二聚體 - 促進結構域 ”)的選擇來選擇第二間插間隔體肽(連接體2)的長度和組成。典型地，第二間插間隔體肽(連接體2)包含3-20個氨基酸殘基。尤其地，當採用的異源二聚體-促進結構域(一個或多個)包含/不包含半胱氨酸殘基時，使用包含半胱氨酸的第二間插間隔體肽(連接體2)。包含半胱氨酸的第二間插間隔體肽(連接體2)將包含1、2、3或更多個半胱氨酸。優選的含半胱氨酸的間隔體肽(連接體2)具有序列GGCGGG (SEQ ID NO:70 )。可替代地，連接體2不包含半胱氨酸(例如GGG、GGGS (SEQ ID NO:71 )、LGGGSG (SEQ ID NO:72 )、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:73 )、ASTKG (SEQ ID NO:74 )、LEPKSS (SEQ ID NO:75 )、APSSS (SEQ ID NO:76 )等)，並且使用如下所描述的含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。任選地，使用含半胱氨酸的連接體2和含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。
異源二聚體促進結構域在一條多肽鏈上可以是GVEPKSC (SEQ ID NO:77 )或VEPKSC (SEQ ID NO:78 )或AEPKSC (SEQ ID NO:79 )，並且，在另一條多肽鏈上可以是GFNRGEC (SEQ ID NO:80 )或FNRGEC (SEQ ID NO:81 ) (見，美國專利號9,296,816)。
在優選的實施方案中，異源二聚體促進結構域包含具有相反電荷的串聯重複的螺旋結構域，例如，“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:82 )： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，和“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:83 )： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這類帶電結構域的存在促進了第一和第二多肽之間的締合，因此有助於異源二聚體形成。可以使用包含上述E-螺旋和K-螺旋序列的修飾的異源二聚體-促進結構域，以便包含一個或多個半胱氨酸殘基。這類半胱氨酸殘基的存在允許在一條多肽鏈上存在的螺旋與另一多肽鏈上存在的互補螺旋成為共價結合的，從而彼此共價結合多肽鏈並且增加雙抗體的穩定性。這樣的尤其優選的例子是異源二聚體-促進結構域，其包含具有下述氨基酸序列的修飾的E-螺旋： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:84 )，和具有下述氨基酸序列的修飾的K-螺旋： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:85 )。
如PCT公開號WO 2012/018687中所公開的，為了提高雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，雙抗體可被修飾，以在雙抗體的一個或多個末端處包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，血清結合蛋白的這類多肽部分設置在雙抗體的多肽鏈的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子結合位點，這允許其非共價結合其它蛋白，從而延長它們的血清半衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3)由形成穩定的三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U.等(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120)。因此，對於改善雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)，更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (SEQ ID NO:86 )：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如PCT公開號WO 2012/162068 (通過引用併入本文)中公開的，SEQ ID NO:86 的“去免疫化 ” 的變體具有減弱或消除II類MHC結合的能力。基於組合突變結果，對於形成這樣的去免疫化的ABD，如下取代的組合被認為是優選的取代：66D/70S +71A；66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變異的ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有如下氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66 NAK S 70 A 71 EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:87 )、 或具有下述氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65 NNAKT VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:88) 、 或具有下述氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66 NAK S 70 VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:89) 的變異的去免疫化的ABD是尤其優選的，因為這類去免疫化的ABD展示基本上野生型的結合，同時提供減弱的II類MHC結合。因此，具有ABD的這類雙抗體的第一多肽鏈包含第三連接體(連接體3)，其優選地位於這類多肽鏈的E螺旋(或K螺旋)結構域的C-末端，以便插在E螺旋(或K螺旋)結構域和ABD (其優選地是去免疫化的ABD)之間。用於這類連接體3的優選的序列是GGGS (SEQ ID NO:71 )。 C. 包含Fc區域的多特異性雙抗體
本發明的一個實施方案涉及能夠同時結合至ADAM9的表位和結合至第二表位(即，ADAM9的不同表位或非ADAM9的分子的表位)的多特異性雙抗體，其包含Fc區域。添加IgG CH2-CH3結構域至雙抗體多肽鏈之一或兩條中，以便雙抗體鏈的複合導致形成Fc區域、延長生物半衰期和/或改變雙抗體的價。此類雙抗體包含兩條或更多條多肽鏈，其序列允許多肽鏈彼此共價結合以形成能夠同時結合至ADAM9的表位和第二表位的共價締合的雙抗體。將IgG CH2-CH3結構域併入到兩條雙抗體多肽上允許形成包含Fc-區域的雙鏈雙特異性雙抗體(圖 2 )。
可選地，僅僅在一條雙抗體多肽上併入IgG CH2-CH3結構域允許形成更複雜的、包含Fc區域的四鏈雙特異性雙抗體(圖 3A -3C )。圖 3C 顯示具有恆定輕鏈(CL)結構域和恆定重鏈CH1結構域的代表性四鏈雙抗體，然而，可選地，可採用這類結構域的片段以及其它多肽(見，例如，圖 3A 和 3B ，美國專利公開號2013-0295121；2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079；EP 2601216；EP 2376109；EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068；WO 2012/018687；WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1結構域，可採用源自人IgG的鉸鏈區域的、具有氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO:77 )、VEPKSC (SEQ ID NO:78 )或AEPKSC (SEQ ID NO:79 )的肽，並且代替CL結構域，可採用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸GFNRGEC (SEQ ID NO:80 )或FNRGEC (SEQ ID NO:81 )。包含代表性肽的四鏈雙抗體顯示在圖 3A 中。可選地，或另外，可採用包含具有相反電荷的串聯螺旋結構域的肽，所述串聯螺旋結構域例如“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:82 )： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K或SEQ ID NO:84 )： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)；和“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:83 )： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E或SEQ ID NO:85 )： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)。代表性的、包含螺旋結構域的四鏈雙抗體顯示在圖 3B 中。
本發明的含有Fc區域的分子可以包含另外的間插間隔體肽(連接體)，通常這類連接體將被併入在異源二聚體-促進結構域(例如E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間和/或在CH2-CH3結構域和可變結構域(即VH或VL)之間。通常，另外的連接體包含3-20個氨基酸殘基，並且可任選地包含IgG鉸鏈區域的全部或一部分(優選IgG鉸鏈區域的包含半胱氨酸的部分)。可用於本發明的含Fc區域的雙特異性雙抗體分子中的連接體包括：GGGS (SEQ ID NO:71 )、LGGGSG (SEQ ID NO:72 )、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:73 )、ASTKG (SEQ ID NO:74 )、LEPKSS (SEQ ID NO:75 )、APSSS (SEQ ID NO:76 )、APSSSPME (SEQ ID NO:90 )、VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:91 )、LEPKSADKTHTCPPC (SEQ ID NO:92 )、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:93 )、GGC和GGG。為了便於克隆，可以使用LEPKSS (SEQ ID NO:75 )代替GGG或GGC。另外，氨基酸GGG或LEPKSS (SEQ ID NO:75 )之後緊接著可以是DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:93) ，以形成可替代的連接體：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:94 )；和LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:95 )。除了連接體之外或者替代連接體，本發明的含Fc區域的雙特異性分子可以併入IgG鉸鏈區域。示例性鉸鏈區域包括：來自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:96 )、來自IgG2的ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:97 )、來自IgG3的ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP (SEQ ID NO:206 )、來自IgG4的ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:98 )和ESKYGPPCP P CP (SEQ ID NO:99 )，SEQ ID NO:99 是IgG4鉸鏈變體，包含穩定化S228P取代(以底線顯示) (如由在Kabat中闡釋的EU索引所編號)以減少鏈交換。
如圖 3A-3C 中提供的，本發明的包含Fc區域的雙抗體可包含四條鏈。這類雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域、和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，從而允許單特異性、雙特異性或四特異性的四價結合。符號“VL3 ”和“VH3 ”分別表示結合這類雙抗體的“第三”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，符號“VL4 ”和“VH4 ”分別表示結合這類雙抗體的“第四”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。本發明的代表性的包含Fc區域的四鏈雙特異性雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 2 中： HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方案中，本發明的雙抗體是雙特異性的、四價(即，具有四個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體，其由總共四條多肽鏈構成(圖 3A-3C )。本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包含對於ADAM9免疫特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合至ADAM9相同的表位或結合至ADAM9不同的表位)，和對於第二分子免疫特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合至第二分子的相同表位或第二分子的不同表位)。優選地，第二分子是存在於效應細胞，諸如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞的表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T-細胞受體(TCR)、NKG2D等)。
在另一個實施方案中，本發明的包含Fc區域的雙抗體可包含三條多肽鏈。這類雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類雙抗體的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。這類雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，這類雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合至第一抗原(即，ADAM9或包含第二表位的分子)的VL1/VH1表位結合位點，以及能夠結合至第二抗原(即，包含第二表位的分子或ADAM9)的VL2/VH2表位結合位點。第一和第二多肽通過涉及在它們各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵穩定化的Fc區域。這類雙特異性雙抗體具有增強的效力。圖 4A 和 4B 闡釋了這類雙抗體的結構。這類包含Fc區域的雙抗體可具有兩個取向之一(表 3 )： HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方案中，本發明的雙抗體是雙特異性、二價(即，具有兩個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體，其由總共三條多肽鏈構成(圖 4A-4B )。本發明的包含Fc的、雙特異性二價雙抗體包含對ADAM9免疫特異性的一個表位結合位點和對第二分子免疫特異性的一個表位結合位點。優選地，第二分子是存在於效應細胞，例如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T-細胞受體(TCR)、NKG2D等)。
在進一步的實施方案中，包含Fc區域的雙抗體可包含總共五條多肽鏈。在具體的實施方案中，所述五條多肽鏈中的兩條具有相同的氨基酸序列。這類雙抗體的第一多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是抗體的重鏈，其包含VH1和重鏈恆定區域。這類雙抗體的第二和第五條多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域和(ii)包含CL的結構域。這類雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是抗體的輕鏈，其包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1。第一、第二和/或第五多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可以經重組構建。這類雙抗體的第三多肽鏈包含：(i)包含VH1的結構域、(ii)包含CH1的結構域、(iii)包含CH2-CH3序列的結構域、(iv)包含VL2的結構域、(v)包含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這類雙抗體的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH2的結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。
因此，這類雙抗體的第一和第二，以及第三和第五多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1表位結合位點。這類雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2表位結合位點，以及能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過涉及在它們各自恆定區中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成Fc區域。這類多特異性雙抗體具有增強的效力。圖 5 圖解了這類雙抗體的結構。應當理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，從而允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。如本文所提供的，優選地選擇這些結構域以結合ADAM9的表位、第二分子的表位和任選地第三分子的表位。
選擇多肽鏈的VL和VH結構域，從而形成對於期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，從而允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。尤其地，可選擇VL和VH結構域，以便多價雙抗體可包含針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或針對第一表位的三個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的兩個結合位點，針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點(如圖 5 中所描繪)。本發明的代表性的包含Fc區域的五鏈雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 4 中： HPD =異源二聚體促進結構域
在具體的實施方案中，本發明的雙抗體是雙特異性、四價(即，具有四個表位結合位點)、包含Fc的雙抗體，其由總共五條多肽鏈構成，具有對於ADAM9免疫特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合至ADAM9的相同表位或ADAM9的不同表位)，和對於第二分子特異性的兩個表位結合位點(其可能夠結合至第二分子的相同表位或第二分子的不同表位)。在另一實施方案中，本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包含對於ADAM9免疫特異性的三個表位結合位點(其可能夠結合至ADAM9的相同的表位或ADAM9的兩個或三個不同的表位)，和對於第二分子特異性的一個表位結合位點。在另一實施方案中，本發明的雙特異性、四價、包含Fc的雙抗體包含對於ADAM9免疫特異性的一個表位結合位點，和對於第二分子特異性的三個表位結合位點(其可能夠結合至第二分子的相同的表位或第二分子的兩個或三個不同的表位)。如上所提供的，可以選擇VL和VH結構域以允許三特異性結合。因此，本發明還包括三特異性、四價、含Fc的雙抗體。本發明的三特異性、四價、含Fc的雙抗體包含對ADAM9免疫特異性的兩個表位結合位點、對第二分子免疫特異性的一個表位結合位點和對第三分子免疫特異性的一個表位結合位點。在某些實施方案中，第二分子是存在於效應細胞例如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T細胞受體(TCR)、NKG2D等)。在某些實施方案中，第二分子是CD3且第三分子是CD8。 D. 含有Fc區域的三價結合分子
本發明的另一個實施方案涉及包含Fc區域的三價結合分子，其能夠同時結合第一表位、第二表位和第三表位，其中至少一個這樣的表位與另一個不同。這類三價結合分子包含三個表位結合位點，其中兩個表位結合位點是雙抗體型結合結構域，其提供結合位點A和結合位點B，並且其中一個表位結合位點是Fab型結合結構域或scFv型結合結構域，其提供結合位點C (見，例如，圖 6A-6F ，和PCT公開號：WO 2015/184207；和WO 2015/184203)。這類三價結合分子因此包含這類三價結合分子的能夠結合至第一表位的“VL1 ”/“VH1 ”結構域和能夠結合至第二表位的“VL2 ”/“VH2 ”結構域和能夠結合至“第三”表位的“VL3 ”和“VH3 ”結構域。“雙抗體型結合結構域”是雙抗體，尤其是DART®雙抗體中存在的表位結合位點的類型，如上所述。每個“Fab型結合結構域”和“scFv型結合結構域”是通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補VH結構域相互作用形成的表位-結合位點。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的差異在於形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅僅包含單個表位結合位點，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包含至少兩個表位結合位點。類似地，scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域的差異也在於它們僅僅包含單個表位-結合位點。因此，如本文使用的Fab型和scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域不同。
通常，本發明的三價結合分子包含四條不同的多肽鏈(見圖 6A -6B )，但是，例如，通過彼此融合這類多肽鏈(例如，經肽鍵)或通過分開這類多肽鏈以形成另外的多肽鏈，或通過經二硫鍵締合更少的或另外的多肽鏈，分子可包含更少或更多數量的多肽鏈。圖 6C-6F 通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這類分子闡釋了本發明的這一方面。如圖 6A -6F 中提供的，本發明的三價結合分子可具有可選的取向，其中雙抗體型結合結構域在Fc區域的N-末端(圖 6A 、6C 和6D )或C-末端(圖 6B 、6E 和6F )。
在某些實施方案中，本發明的這類三價結合分子的第一多肽鏈包含：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。VL1和VL2結構域位於包含CH2-CH3的結構域的N-末端或C-末端，如表 4 (也見圖 6A 和6B )中所顯示。這類實施方案的第二多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這類實施方案的第三多肽鏈包含：(i)包含VH3的結構域、(ii)包含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以是包含VH3和重鏈恆定區的抗體的重鏈，或包含這樣的結構域的多肽。這類實施方案的第四多肽包含：(i)包含VL3的結構域和(ii)包含CL的結構域。第四多肽鏈可以是包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3的抗體的輕鏈，或包含這樣的結構域的多肽。第三或第四多肽鏈可分離自天然產生的抗體。可選地，它們可經重組、合成通過其方式而構建。
第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域通過間插間隔體肽與這類多肽鏈的重鏈可變結構域分開，所述間插間隔體肽長度太短而不允許它們的VL1/VH2 (或它們的VL2/VH1)結構域締合在一起形成能夠結合第一或第二表位的表位結合位點。用於該目的的優選間插間隔體肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO: 69 )：GGGSGGGG。三價結合分子的其它結構域可通過任選地包含半胱氨酸殘基的一個或多個間插間隔體肽(連接體)分開。尤其地，如上面提供，這類連接體通常被併入在可變結構域(即，VH或VL)和肽異源二聚體促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)之間和這類肽異源二聚體促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間。上面提供了用於產生三價結合分子的示例性連接體，並且其也提供在PCT申請案號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，這類三價結合分子的第一和第二多肽鏈締合在一起，形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。這類三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起而形成能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。
如上所述，本發明的三價結合分子可包含三條多肽。包含三條多肽鏈的三價結合分子可通過將第四多肽的結構域連接至第三多肽的包含VH3的結構域的N-末端(例如，使用間插間隔體肽(連接體 4 ))而獲得。可選地，使用包含下述結構域的本發明的三價結合分子的第三多肽鏈：(i)包含VL3的結構域、(ii)包含VH3的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域，其中VL3和VH3通過間插間隔體肽彼此間隔開，所述間插間隔體肽足夠長(至少9個或更多個氨基酸殘基)，從而允許這些結構域締合形成表位結合位點。對於該目的，一個優選的間插間隔體肽具有序列：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:100 )。
應當理解，這類三價結合分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。尤其地，可以選擇VL和VH結構域，使得三價結合分子包含針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的一個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點，或者針對第一表位的一個結合位點，針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點。
然而，如本文所提供的，優選地選擇這些結構域，以便結合ADAM9的表位、第二分子的表位和第三分子的表位。在某些實施方案中，第二分子是存在於效應細胞例如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T細胞受體(TCR)、NKG2D等)。在某些實施方案中，第三分子是CD8。
本發明的代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構被提供在圖 6A-6F 和表 5 中； HPD =異源二聚體促進結構域
本發明的一個實施方案涉及三價結合分子，其包含針對ADAM9的兩個表位結合位點和針對第二分子的一個表位結合位點。針對ADAM9的兩個表位結合位點可結合相同的表位或不同的表位。本發明的另一實施方案涉及三價結合分子，其包含針對ADAM9的一個表位結合位點和針對第二分子的兩個表位結合位點。針對第二分子的兩個表位結合位點可結合第二分子的相同的表位或不同的表位。本發明的另一個實施方案涉及三特異性三價結合分子，其包含針對ADAM9的一個表位結合位點，針對第二分子的一個表位結合位點和針對第三分子的一個表位結合位點。在某些實施方案中，第二分子是存在於效應細胞例如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其它單核細胞表面上的分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T細胞受體(TCR)、NKG2D等)。在某些實施方案中，第二分子是CD3，第三分子是CD8。如上所述，這樣的三價結合分子可以包含三條、四條、五條或更多條多肽鏈。 IX. 恆定結構域和變異的Fc區域
本文提供的是可用於產生本發明的ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)的抗體“恆定結構域 ”。
優選的CL結構域是人IgG CL κ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:101 )： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可選地，示例性CL結構域是人IgG CL λ結構域。示例性人CL λ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102 )： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
如本文提供的，本發明的ADAM9-結合分子可包含Fc區域。本發明這類分子的Fc區域可以屬於任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本發明的ADAM9-結合分子還可包含CH1結構域和/或鉸鏈區域。當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈區域可以屬於任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，並且優選與期望的Fc區域屬於相同的同種型。
示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性CH1結構域是人IgG3 CH1結構域。示例性人IgG3 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:207 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:105 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
一個示例性鉸鏈區域是人IgG1鉸鏈區域。示例性人IgG1鉸鏈區域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:96 )：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性鉸鏈區域是人IgG2鉸鏈區域。示例性人IgG2鉸鏈區域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:97 )：ERKCCVECPPCP。
另一示例性鉸鏈區域是人IgG4鉸鏈區域。示例性人IgG4鉸鏈區域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:98 )：ESKYGPPCPSCP。如上所述，IgG4鉸鏈區域可包含穩定化突變，諸如S228P取代。示例性穩定化IgG4鉸鏈區域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:99 )：ESKYGPPCPPCP。
本發明的含Fc區域的分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)的Fc區域可以是完整的Fc區域(例如，完整的IgG Fc區域)或僅僅是Fc區域的片段。任選地，本發明的含Fc區域的分子的Fc區域缺少C-末端賴氨酸氨基酸殘基。
在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合體與免疫系統的細胞的相互作用產生各種各樣的應答，範圍從效應子功能例如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬，到免疫調節信號例如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合體的Fc區域與造血細胞上特化的細胞表面受體的結合來啟動。由抗體和免疫複合體引發的細胞應答的多樣性由三種Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性造成。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動(即，免疫系統增強)性受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制(即，免疫系統阻礙)性受體。另外，與新生的Fc受體(FcRn)的相互作用介導IgG分子從內體到細胞表面的迴圈並且釋放進入血液中。上面呈現了示例性野生型IgG1 (SEQ ID NO:1 )、IgG2 (SEQ ID NO:2 )、IgG3 (SEQ ID NO:3 )和IgG4 (SEQ ID NO:4 )的氨基酸序列。
Fc區域的修飾可以導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。因此，就效應子功能而言，可期望修飾本發明的包含Fc區域的ADAM9-結合分子，例如，以便增強這類分子治療癌症的效力。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗，但是不殺傷攜帶靶抗原的細胞的抗體的情況下，期望降低或消除效應子功能。當針對不期望的細胞，比如腫瘤和外源細胞時，其中FcγRs以低水準表達，例如，具有低水準的FcγRIIB腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，一般期望增加的效應子功能。本發明的分子具有這樣的賦予的或改變的效應子功能活性，可用於治療和/或預防其中期望增強的效應子功能活性效力的疾病、病症或感染。
因此，在某些實施方案中，本發明的包含Fc區域的分子的Fc區域可以是工程化的變異的Fc區域。儘管本發明的包含Fc區域的雙特異性分子的Fc區域可以具有結合至一個或多個Fc受體(例如，FcγR)的能力，但是更優選地這類變異的Fc區域具有對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)改變的結合(相對於野生型Fc區域顯示的結合)，例如，具有與啟動性受體增強的結合和/或具有對抑制性受體基本上減少的結合能力或沒有結合抑制性受體的能力。因此，本發明的包含Fc區域的分子的Fc區域可包括完整的Fc區域的一些或所有CH2結構域和/或一些或所有CH3結構域，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其相對於完整的Fc區域的CH2或CH3結構域，可包含，例如一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這類Fc區域可包含非Fc多肽部分，或可包含非天然完整Fc區域的部分，或可包含非天然存在的取向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或者在N-末端至C-末端方向上，CH3結構域連接至CH2結構域等)。
被鑑定為改變效應子功能的Fc區域修飾是本領域已知的，包括增加與啟動性受體(例如，FcγRIIA (CD16A)的結合的修飾和減少與抑制性受體(例如，FcγRIIB (CD32B)的結合的修飾(例如，FcγRIIB (CD32B) (見，例如，Stavenhagen, J.B.等(2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。表 6 列舉了示例性修飾的示例性單、雙、三、四和五取代(編號是如Kabat中的EU索引的編號，並且，取代是相對於SEQ ID NO:1 的氨基酸序列)，其增加了與啟動性受體的結合和/或降低了與抑制性受體的結合。
具有與CD32B減少的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc區域的示例性變異包括F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L取代，其中編號是如Kabat中的EU索引的編號。這些氨基酸取代可以以任何組合存在於人IgG1 Fc區域中。在一個實施方案中，變異的人IgG1 Fc區域包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方案中，變異的人IgG1 Fc區域包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L取代。
在某些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子的Fc區域優選地顯示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)減少的(或基本上沒有)結合(相對於野生型IgG1 Fc區域(SEQ ID NO: 1 )顯示的結合)。在具體的實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含顯示減少的ADCC效應子功能的IgG Fc區域。在優選的實施方案中，這類ADAM9-結合分子的CH2-CH3結構域包含下述的任何1、2、3或4個取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G，其中編號是如Kabat中的EU索引的編號。在另一實施方案中，CH2-CH3結構域包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除了FcR結合。可選地，使用固有地顯示出對FcγRIIIA (CD16a)減少的(或基本上沒有)結合和/或減少的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc區域(SEQ ID NO: 1 )顯示的結合和效應子功能)的天然存在的Fc區域的CH2-CH3結構域。在具體的實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含IgG2 Fc區域(SEQ ID NO:2 )或IgG4 Fc區域(SEQ ID:NO:4 )。當使用IgG4 Fc區域時，本發明也包括引入穩定化突變，比如上述的鉸鏈區域S228P取代(見，例如，SEQ ID NO: 99 )。因為N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效應子功能，在期望效應子功能的情況下，優選地將不採用這些取代。
對於具有減少的或消除的效應子功能的本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，優選的IgG1序列包含取代L234A/L235A (以底線顯示) (SEQ ID NO:106 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，第二優選的IgG1序列包含S442C取代(以底線顯示)，以允許兩個CH3結構域經二硫鍵彼此共價結合，或允許與藥物部分綴合。這類分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:107 )： APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，第三優選的IgG1序列包含減少或消除效應子功能的L234A/L235A取代(以底線顯示)和允許兩個CH3結構域經二硫鍵彼此共價結合或允許與藥物部分綴合的S442C取代(以底線顯示)。這類分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:108 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
可通過增加Fc區域對於FcRn的結合親和力而延長包含Fc區域的蛋白質的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學性質，是施用之後分子的平均生存時間的度量。半衰期可表示為從受試者(例如，人患者或其他哺乳動物)的身體或其特定區室消除已知量的百分之五十(50%)的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即，迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含變異的Fc區域，所述變異的Fc區域相對於野生型Fc區域包含至少一個氨基酸修飾，以便所述分子具有延長的半衰期(相對於包含野生型Fc區域的分子)。在一些實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子包含變異的IgG Fc區域，其中所述變異的Fc區域在選自下述的一個或多個位置處包含延長半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436，其中編號是如Kabat中的EU索引的編號。能夠延長包含Fc區域的分子的半衰期的許多突變是本領域已知的，包括，例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如，見美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美國公開號2002/0147311、2007/0148164；和PCT公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279中描述的突變，其通過引用以它們的整體併入本文。具有延長的半衰期的B7-H3-結合分子也包括具有在Fc區域殘基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436中的兩處或更多處包含取代的變異的Fc區域的那些。尤其地，兩個或更多個取代選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I，其中編號是如Kabat中的EU索引的編號。
在具體實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子具有包含以下取代的變異的IgG Fc區域： (A) M252Y, S254T和T256E； (B) M252Y和S254T； (C) M252Y和T256E； (D) T250Q和M428L； (E) T307Q和N434A； (F) A378V和N434A； (G) N434A和Y436I； (H) V308P和N434A；或 (I) K288D和H435K。
在優選的實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子具有包含M252Y、S254T和T256E中的任何1、2或3個取代的變異的IgG Fc區域。本發明還包括具有變異的Fc區域的ADAM9-結合分子，所述變異的Fc區域包含： (A) 改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變；和 (B) 延長血清半衰期的一個或多個突變。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，第四優選的IgG1序列包含M252Y、S254T和T256E取代(以底線顯示)，以延長血清半衰期。這類分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:200 )： APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，第五優選的IgG1序列包含減少或消除效應子功能的L234A/L235A取代(以底線顯示)和M252Y、S254T和T256E取代(以底線顯示)，以延長血清半衰期。這類分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:201 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的包含Fc區域的分子的CH2和CH3結構域，第六優選的IgG1序列包含減少或消除效應子功能的L234A/L235A取代(以底線顯示)；和M252Y、S254T和T256E取代(以底線顯示) ，以延長血清半衰期；以及S442C取代(以底線顯示)，以允許兩個CH3結構域經二硫鍵彼此共價結合或允許與藥物部分綴合。這類分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:203 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於其含有Fc區域的第一和第三多肽鏈不一致的某些抗體、雙抗體和三價結合分子，期望減少或阻止兩個第一多肽鏈的CH2-CH3結構域之間或兩個第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間發生同源二聚化。這類多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要序列相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包含形成“杵(knob)”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域中，使得空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配對。這樣的突變組可被工程化進任意對的、包含形成Fc區域的CH2-CH3結構域的多肽中，以促進異源二聚化。蛋白質工程化以相對於同源二聚化有利於異源二聚化的方法在本領域中是熟知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(見例如，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文)。
通過修飾IgG Fc區域以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾IgG Fc區域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於從最終的雙特異性的、異源二聚化的、包含Fc區域的分子中純化含臼的第三多肽鏈同源二聚體，優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)突變第三多肽鏈的含臼的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點。因此，含臼的第三多肽鏈同源二聚體不結合蛋白質A，而雙特異性的異源二聚體經在第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點而保持其結合蛋白質A的能力。在可選的實施方案中，含臼的第三多肽鏈可併入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
對於本發明包含Fc區域的分子的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域，優選的IgG氨基酸序列具有“包含杵的 ”序列(SEQ ID NO:109 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於具有兩條多肽鏈的本發明的包含Fc區域的分子的第二多肽鏈(或具有三、四或五條多肽鏈的包含Fc區域的分子的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域，優選的IgG氨基酸序列具有“包含臼的 ”序列(SEQ ID NO:110 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
如將注意到，SEQ ID NO: 109 和SEQ ID NO: 110 的CH2-CH3結構域包含在234位用丙氨酸和在235位用丙氨酸的取代，並且因此形成顯示與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合的Fc區域(相對於野生型Fc區域(SEQ ID NO: 1 )顯示的結合)。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其包含野生型丙氨酸殘基，修飾Fc區域的效應子功能和/或FγR結合活性的可選的和/或另外的取代。
本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其進一步包含一個或多個延長半衰期的氨基酸取代。尤其地，本發明包括這類包含臼的和這類包含杵的CH2-CH3結構域，其進一步包含M252Y/S254T/T256E取代。
包含L234A和L235A取代和進一步包含M252Y、S254T和T256E取代的、示例性包含杵的CH2和CH3結構域在下面提供(SEQ ID NO:204 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
包含L234A和L235A取代和進一步包含M252Y、S254T和T256E取代的、示例性包含臼的CH2和CH3結構域在下面提供(SEQ ID NO:205 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中X 是賴氨酸(K)或不存在。
優選地，第一多肽鏈具有“包含杵的”CH2-CH3序列，諸如SEQ ID NO:109 的序列。然而，如將被認識到的，“包含臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:110 可用於第一多肽鏈中，在這種情況下，“包含杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:109 )可用於本發明具有兩條多肽鏈的、包含Fc區域的分子的第二多肽鏈中(或用於具有三、四或五條多肽鏈的包含Fc區域的分子的第三多肽鏈中)。
在其他實施方案中，本發明包括ADAM9-結合分子，其包含使用本領域已知的突變已經被工程化成相對於同源二聚化有利於異源二聚化的CH2和/或CH3結構域，比如PCT公開號WO 2007/110205；WO 2011/143545；WO 2012/058768；和WO 2013/06867中公開的那些，其所有通過引用以其整體併入本文。 X. 效應細胞結合能力
如本文所提供的，本發明的ADAM9-結合分子可以被工程化，以包含識別對靶細胞或組織類型獨特的一組抗原的表位元結合位元點的組合。尤其地，本發明涉及能夠結合至ADAM9的表位和存在於效應細胞(例如T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞)表面上的分子的表位的多特異性ADAM9-結合分子。例如，本發明的ADAM9-結合分子可以構建成包含免疫特異性結合CD2、CD3、CD8、CD16、T細胞受體(TCR)或NKG2D的表位結合位點。本發明還涉及能夠結合至CD3的表位和CD8的表位的三特異性ADAM9-結合分子(見例如PCT公開號WO 2015/026894)。 A. CD2結合能力
在一個實施方案中，本發明的雙特異性、三特異性或多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和CD2的表位。CD2是在T細胞和自然殺傷(NK)細胞的表面上發現的細胞黏附分子。CD2提高NK細胞細胞毒性，可能作為NK細胞納米管形成的啟動子(Mace, E.M.等(2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity ,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255；Comerci, C.J.等(2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation ,” PLoS One 7(10):e47664:1-12)。特異性結合CD2的分子包括抗-CD2抗體“Lo-CD2a ”。
Lo-CD2a的VH結構域的氨基酸序列(ATCC登錄號：11423)；SEQ ID NO:111 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS
Lo-CD2a的VL結構域的氨基酸序列(ATCC登錄號：11423；SEQ ID NO:112 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK B. CD3結合能力
在一個實施方案中，本發明的雙特異性、三特異性或多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和CD3的表位。CD3是由四條不同的鏈組成的T-細胞共同受體(Wucherpfennig, K.W.等(2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; 第1-14頁)。在哺乳動物中，複合體包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與稱為T-細胞受體(TCR)的分子締合，以在T淋巴細胞中產生啟動信號。在不存在CD3的情況下，TCR不能正確組裝並且被降解(Thomas, S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170–177)。發現CD3結合於所有成熟T-細胞的膜，並且幾乎不與其他細胞類型的膜結合(見，Janeway, C.A.等(2005), 在以下中: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 第六版, Garland Science Publishing, NY, 214- 216頁；Sun, Z. J.等(2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3 ε : γ Heterodimer ,” Cell 105(7):913-923；Kuhns, M.S.等(2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139)。特異性結合CD3的分子包括抗CD3抗體“CD3 mAb 1 ”和“OKT3 ”。抗CD3抗體CD3 mAb 1能夠結合非人靈長類動物(例如食蟹猴)。
CD3 mAb-1 VH(1) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:113 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
CD3 mAb-1 VH(2) 的可選VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:114 )在下面顯示(CDRH 以單底線顯示；相對於CD3 mAb-1 VH(1) 的VH結構域(SEQ ID NO:92 )的不同以雙底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTF N TYAMN WVRQA PGKGLEWV A R IRSKYNNYAT YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
CD 3 mAb-1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:115 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG
CD3 mAb-1 VH(1) 的VH結構域(SEQ ID NO: )可以與CD 3 mAb-1的VL結構域(SEQ ID NO: )一起用於形成根據本發明的功能性CD3-結合分子。類似地，CD3 mAb-1 VH(2) 的VH結構域(SEQ ID NO: )可以與CD3 mAb-1的VL結構域(SEQ ID NO: )一起用於形成根據本發明的功能性CD3-結合分子。
如下面所討論的，為了闡釋本發明，產生了雙特異性ADAM9 x CD3-結合分子。在一些ADAM9 x CD3構建體中，應用了CD3 mAb-1的變體。變異的“CD3 mAb-1 (D65G) ”包含CD3 mAb-1的VL結構域(SEQ ID NO:115 )和具有D65G取代(Kabat位置65，對應於SEQ ID NO:113 的殘基68) 的VH CD3 mAb-1結構域。
CD3 mAb-1 (D65G) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:116 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示，取代的位置(D65G)以雙底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
可選地，可以引入CD3 mAb-1的親和力變體。變體包括命名為“CD3 mAb-1 Low ” 的低親和力變體和命名為“CD3 mAb-1 Fast ”的具有較快解離速率的變體。CD mAb1的VL結構域(SEQ ID NO:115 )對於CD3 mAb-1 low和CD3 mAb1 Fast是共有的，其在上面提供。CD3 mAb-1 Low和CD3 mAb-1 Fast各自的VH結構域的氨基酸序列在下面提供。
抗-人CD3 mAb-1 Low的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示；相對於CD3 mAb-1 VH(1) 的VH結構域(SEQ ID NO:113 )的不同以雙底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYV T WFAY WGQGTL VTVSS
抗-人CD3 mAb-1 Fast的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:118 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示；相對於CD3 mAb-1 VH(1) 的VH結構域(SEQ ID NO:113 )的不同以雙底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNSYV T WFAY WGQGTL VTVSS
可以使用的另一種抗CD3抗體是抗體莫羅單抗(Muromonab)-CD3“OKT3 ” (Xu等(2000)“In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26；Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3 ,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620；Canafax, D.M.等(1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) TreatmentOf Acute Renal Allograft Rejection ,” Pharmacotherapy 7(4):121-124；Swinnen, L.J.等(1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation ,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678)。
OKT3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:119 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPSRGYTNY NQKFKD KATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR YY DDHYCL DYWG QGTTLTVSS
OKT3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:120 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWIY DT SKLAS GVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYC QQW SSNPFTF GSG TKLEINR
可使用的另外的抗-CD3抗體包括但不限於PCT公開號WO 2008/119566；和WO 2005/118635中描述的那些。 C. CD8結合能力
在一個實施方案中，本發明的雙特異性、三特異性或多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和CD8的表位。CD8是由兩條不同的鏈組成的T-細胞共同受體(Leahy, D.J., (1995) “A Structural View of CD4 and CD8 ,” FASEB J., 9:17-25)，其在細胞毒性T-細胞上表達。已經發現CD8+ T-細胞的啟動是通過排列在靶細胞表面上的抗原：主要組織相容性I類(MHC I )分子複合體和排列在CD8+ T-細胞的表面上的CD8和T-細胞受體的複合體之間的共刺激相互作用來介導的(Gao, G.和Jakobsen, B., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor ". Immunol Today 21: 630–636)。與僅由某些免疫系統細胞表達的MHC II分子不同，MHC I分子被非常廣泛地表達。因此，細胞毒性T-細胞能夠結合多種細胞類型。啟動的細胞毒性T-細胞通過其釋放細胞毒素穿孔蛋白、粒酶和粒溶素而介導細胞殺傷。特異性結合CD8的抗體包括抗CD8抗體“OKT8 ”和“TRX2 ”。
OKT8的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:121 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKA SGYTFT DYNMH WVKQS HGKSLEWIG Y IYPYTGGTGY NQKFKN KATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
OKT8的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:122 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMH WY QQKPGQPPKV LIY LASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YC QQNNEDPY T FGGGTKLEI KR
TRX2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:123 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMN WVRQA PGKGLEWVA L IYYDGSNKFY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK PH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
TRX2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:124 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KGSQDIN NYLA WYQQKP GKAPKLLIY N TDILHT GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC YQ YNNGYT FGQG TKVEIK D. CD16結合能力
在一個實施方案中，本發明的多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和CD16的表位。CD16是FcγRIIIA受體。CD16由嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷(NK)細胞和組織巨噬細胞表達，其結合聚集的但不是單體的人IgG(Peltz, G.A.等(1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017；Bachanova, V.等(2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer ,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141；Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic ,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253；Youinou, P.等(2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases ,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19；Peipp, M.等(2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells ,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511)。特異性結合CD16的分子包括抗CD16抗體“3G8 ”和“A9 ”。人源化的A9抗體在PCT公開號WO 03/101485中被描述。
3G8的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:125 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVG WIR QPSGKGLEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSA
3G8的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:126 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QQSNEDPY T FGGGTKLEI K
A9的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLG WVKQR PGHGLEWIG D IYPGGGYTNY NEKFKG KATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCAR SA SWYFD VWGAR TTVTVSS
A9的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:128 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTC RSNTGT VTTSNYAN WV QEKPDHLFTG LIG HTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FC ALWYNNHW V FGGGTKLTVL
可以使用的另外的抗-CD16抗體包括但不限於PCT公開號WO 03/101485；和WO 2006/125668中描述的那些。 E. TCR結合能力
在一個實施方案中，本發明的雙特異性、三特異性或多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和T-細胞受體(TCR)的表位。T-細胞受體由CD4+ 或CD8+ T細胞天然表達，並且允許這樣的細胞識別由抗原提呈細胞的I類或II類MHC蛋白結合和呈現的抗原肽。通過TCR識別pMHC(肽–MHC)複合體啟動細胞免疫應答的傳播，其導致細胞因數的產生和抗原提呈細胞的裂解(見例如，Armstrong, K.M.等(2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes ,” Biochem. J. 415(Pt 2):183–196；Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy ,” Cytometry A. 73(11):1093-1099；Beier, K.C.等(2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation ,” Eur. Respir. J. 29:804-812；Mallone, R.等(2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes ,” Am. J. Ther. 12(6):534–550)。CD3是結合TCR的受體(Thomas, S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170-177；Guy, C.S.等(2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1):7-21；St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity ,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657；Baeuerle, P.A.等(Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944；Smith-Garvin, J.E.等(2009) “T Cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619；Renders, L.等(2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression ,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309)。
特異性結合至T細胞受體的分子包括抗TCR抗體“BMA 031 ” (EP 0403156；Kurrle, R.等(1989) “BMA 031 – A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application ,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019；Nashan, B.等(1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex, ” Transplant Proc. 19(5):4270-4272；Shearman, C.W.等(1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α / β T Cell, ” J. Immunol. 146(3):928-935；Shearman, C.W. 等(1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor ,” J. Immunol. 147(12):4366-4373；和PCT公開號WO 2010/027797)。
BMA 031的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:129 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMH WVRQA PGQGLEWIG Y INPYNDVTKY NEKFKG RVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCAR GS YYDYDGFVY W GQGTLVTVSS
BMA 031的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:130 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SATSSVS YMH WYQQKPG KAPKRWIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SSNPLT FGQG TKLEIK F. NKG2D結合能力
在一個實施方案中，本發明的多特異性ADAM9-結合分子能夠結合至ADAM9的表位和NKG2D受體的表位。NKG2D受體在所有的人(和其他哺乳動物)自然殺傷細胞上表達(Bauer, S.等(1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428):727-729；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)，也在所有CD8+ T細胞上表達(Groh, V.等(2001) “Costimulation Of CD8 αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3):255-260；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)。這樣的結合配體，尤其是那些不在正常細胞上表達的結合配體，包括組織相容性60(H60)分子、視黃酸早期誘導基因-1(RAE-1)的產物和鼠UL16-結合蛋白樣轉錄物1 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790；Coudert, J.D.等(2005)“Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells ,” Blood 106:1711-1717)。特異性結合NKG2D受體的分子包括抗NKG2D抗體“KYK-1.0 ”和“KYK-2.0 ”(Kwong, KY等(2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156。
KYK-1.0的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:131 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR FGYYLDY WGQ GTLVTVSS
KYK-1.0的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QPVLTQPSSV SVAPGETARI PC GGDDIETK SVH WYQQKPG QAPVLVIY DD DDRPS GIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYC QVW DDNNDEWV FG GGTQLTVL
KYK-2.0的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:133 )在下面顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
KYK-2.0的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:134 )在下面顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： QSALTQPASV SGSPGQSITI SC SGSSSNIG NNAVN WYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPS GVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYC A AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL XI. 多特異性ADAM9-結合分子 A. ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體
上述優化的人源化的抗-ADAM9MAB-A 抗體的VL和VH結構域用於構建ADAM9 x CD3雙特異性雙抗體，其由兩條共價連接的多肽鏈組成，並包含上述MAB-A 的優化的人源化的VL和VH結構域。下面提供了這類ADAM9 x CD3雙特異性雙抗體的一般結構和氨基酸序列。
一個示例性ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端；抗-ADAM9抗體的VL結構域(例如，hMAB-A VL (2) (SEQ ID NO:55 )；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))；抗-CD3抗體的VH結構域(例如，CD3 mAb 1 (D65G) (SEQ ID NO:116 ))；含半胱氨酸的間插間隔體肽(連接體 2: GGCGGG (SEQ ID NO:70 ))；異源二聚體促進(例如，E-螺旋)結構域(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:82 ))；和C-末端。
這類示例性ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端；相應抗-CD3抗體的VL結構域(例如與第一多肽鏈的VH結構域締合形成CD3結合位點的VL結構域，例如CD3 mAb-1 的VL結構域(SEQ ID NO: 115 )；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))；相應抗-ADAM9抗體的VH結構域(例如，與第一多肽鏈的VL結構域締合形成ADAM9-結合位點的VH結構域，例如，hMAB-A VH (2) (SEQ ID NO:17 )；含半胱氨酸的間插間隔體肽(連接體 2: GGCGGG (SEQ ID NO:70 ))；異源二聚體促進(例如，K-螺旋)結構域 (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:83 ))；和C-末端。
如本文提供的，可選的連接體和/或可選的異源二聚體-促進結構域可用於產生這樣的雙抗體。例如，可選的示例性ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體的第一多肽鏈在N末端至C末端方向可包含：N-末端；抗-ADAM9抗體的VL結構域；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))；抗-CD3抗體或相應抗-CD3抗體的VH結構域；間插間隔體肽(連接體 2: ASTKG (SEQ ID NO:74 ))；含半胱氨酸的異源二聚體促進(例如，K-螺旋)結構域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:85 ))；和C-末端。這類可選示例性雙抗體的第二多肽鏈在N末端至C末端方向可包含：N-末端；相應抗-CD3抗體的VL結構域；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))；相應抗-ADAM9抗體的VH結構域；間插間隔體肽(連接體 2: ASTKG (SEQ ID NO:74 ))；含半胱氨酸的異源二聚體促進(例如，E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:84 ))；和C-末端。
構建了代表性ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體(“DART-1 ”)，其包含hMAB-A (2.2) 的VH和VL結構域和CD3 mAb-1 的VH和VL結構域。
DART‑1 的第一多肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:135 )在下面顯示(hMAb-A VL(2) 結構域的序列(SEQ ID NO:55 )加底線；CD3 mAb-1 (D65G) VH 結構域的序列(SEQ ID NO:116 )以斜體表示)： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD Y S GDSYMN WY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF T FGQGTKLEI K GGGSGGGG E VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSS GGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEK
DART‑1 的第二多肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:136 )在下面顯示(hMAB-A VH (2) 結構域的序列(SEQ ID NO:17 )加底線；CD3 mAb-1 VL 結構域的序列(SEQ ID NO:115 )以斜體表示)： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVL G GGGSGGGG EV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSSY WMHWVRQAPG KGLEWVGEII PIFGHTNYNE KFKSRFTISL DNSKNTLYLQ MGSLRAEDTA VYYCARGGYY YYGSRDYFDY WGQGTTVTVS S GGCGGGKVA ALKEKVAALK EKVAALKEKV AALKE B. ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體
產生具有三條鏈並具有Fc區域的ADAM9 x CD3雙抗體，其具有對ADAM9特異性的一個結合位點(包含人源化的/優化的hMAB-A 的VH和VL結構域)和對CD3特異性的一個結合位點(包含CD3 mAb 1 (D65G)的VL和VH結構域)。雙抗體被命名為“DART-2 ”。
示例性ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端；抗-ADAM9抗體的VL結構域(例如，hMAB-A VL (2) (SEQ ID NO:55 ))；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))； CD3 mAb 1 (D65G)的VH結構域(SEQ ID NO:116 )；間插間隔體肽(連接體 2: ASTKG (SEQ ID NO:74 ))；含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:82 ))；間插間隔體肽(連接體 3: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:94 ))；包含杵的IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:109 )；和C-末端。編碼該多肽鏈的多核苷酸可以編碼SEQ ID NO:109 的C末端賴氨酸殘基(即，SEQ ID NO:109 的X )，但是，如上所述，在一些表達系統中，該賴氨酸殘基可以被翻譯後去除。因此，本發明包括含有這類賴氨酸殘基的這樣的第一多肽鏈(即，SEQ ID NO:109 ，其中 X 為賴氨酸)，也包括缺少這類賴氨酸殘基的第一多肽鏈(即，SEQ ID NO:109 ，其中 X 不存在)。DART-2 的這類第一多肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:137 )在下面提供(hMAB-A VL (2) 結構域的序列(SEQ ID NO:55 )加底線；CD3 mAb-1 (D65G) VH 結構域的序列(SEQ ID NO:116 )以斜體表示)： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI K GGGSGGGG E VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSS ASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端；CD3 mAb 1的VL結構域(SEQ ID NO:115 )；間插間隔體肽(連接體 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:69 ))；抗-ADAM9抗體的VH結構域(例如，hMAB-A VH (2) (SEQ ID NO:17 ))；間插間隔體肽(連接體 2: ASTKG (SEQ ID NO:74 ))；含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:85 ))；和C-末端。DART-2 的這類第二多肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:138 )在下面提供給(hMAB-A VH (2) 結構域的序列(SEQ ID NO:17 )加底線；CD3 mAb-1 VL 結構域的序列(SEQ ID NO:115 )以斜體表示)： QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVL G GGGSGGGG EV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSSY WMHWVRQAPG KGLEWVGEII PIFGHTNYNE KFKSRFTISL DNSKNTLYLQ MGSLRAEDTA VYYCARGGYY YYGSRDYFDY WGQGTTVTVS S ASTKGKVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
示例性ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包含：N-末端；間隔體肽(DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:93 ))；包含臼的IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:110 )；和C-末端。編碼該多肽鏈的多核苷酸可編碼SEQ ID NO:110 的C-末端賴氨酸殘基(即，SEQ ID NO:110 的 X )，但是，如上所述，該賴氨酸殘基在一些表達系統中可被翻譯後去除。因此，本發明包括含有這類賴氨酸殘基的這樣的第三多肽鏈(即，SEQ ID NO:110 ，其中 X 是賴氨酸)，以及包括缺少這類賴氨酸殘基的第三多肽鏈(即，SEQ ID NO:110 ，其中 X 不存在)。這類第三多肽鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:139 )在下面提供： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
應當理解，根據本文提供的教導，可以利用不同的結構域取向、VH結構域、VL結構域、連接體和/或異源二聚體-促進結構域來生成可選的ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體。尤其地，可利用不同hMAB-A 變體 的VH結構域和VL結構域。 C. ADAM9 x CD3 x CD8三價結合分子
示例性三價“ADAM9 x CD3 x CD8 ”結合分子具有對ADAM9特異性的一個結合位點(包含親本的和/或人源化的抗-ADAM9-VL結構域和相應的抗-ADAM9-VH結構域，如上所述)，對CD3特異性的一個結合位點(包含例如CD3 mAb-1 的VL結構域(SEQ ID NO: 115 )和抗CD3抗體的VH結構域(例如CD3 mAb 1 (D65G) (SEQ ID NO: 116 ))，和對CD8特異性的一個結合位點(包含例如TRX2 的VH和VL結構域(分別為SEQ ID NOs: 123 和 124 )。這類的三價結合分子可以具有兩條多肽鏈(見例如圖 6E 和圖 6F )、具有三條多肽鏈(見例如圖 6C 和圖 6D )、具有四條多肽鏈(見例如圖 6A 和圖 6B )、或具有五條多肽鏈(見例如圖 5 )。 XII. 生產方法
如本領域所熟知的，本發明的ADAM9-結合分子最優選通過編碼這類多肽的核酸分子的重組表達而生產。
本發明的多肽可以使用固相肽合成方法被方便地製備(Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
在可選的方案中，可使用本領域已知的任何方法重組製備和表達抗體。可如下經重組製備抗體：首先從宿主動物分離製備的抗體，獲得基因序列，並使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法已經被公開(見，例如Peeters等(2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol Methods 231:147-157)。製備抗體衍生物，例如人源化抗體、單鏈抗體等的適當的方法是本領域已知的，並且已經在上面描述了。在另一可選的方案中，可通過噬菌體展示技術重組製備抗體(見，例如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter, G.等(1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
可以通過許多合適的方法中的任何一種將含有感興趣的多核苷酸(例如，編碼本發明的ADAM9-結合分子的多肽鏈的多核苷酸)的載體引入到宿主細胞中，所述適當手段包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂質轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇常常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可用於表達感興趣的多肽或蛋白質的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。
本發明包括包含本發明的ADAM9-結合分子的氨基酸序列的多肽。可通過本領域已知的程式製備本發明的多肽。可通過抗體的蛋白水解或其他降解、通過如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或通過化學合成來產生多肽。抗體的多肽，尤其地，多至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成被常規製備。化學合成方法在本領域中是已知的，並且是商業上可得到的。
本發明包括ADAM9-結合分子的變體，包括不顯著影響這類分子的特性的功能上等同的多肽以及具有增強的或降低的活性的變體。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽：其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯或有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶聯技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如連接標籤用於免疫分析，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。
本發明包括融合蛋白，所述融合蛋白包含本發明的抗-ADAM9-VL和/或VH中的一種或多種。在一個實施方案中，提供了融合多肽，其包含輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈二者。在另一實施方案中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恆定區。在另一實施方案中，融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含特異性結合至ADAM9的一個或多個多肽結構域和在天然分子中未連接的另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列例如，異源序列或來自另一區的同源序列。
本發明尤其包括與診斷或治療部分綴合的ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)。出於診斷目的，本發明的ADAM9-結合分子可以與可檢測物質偶聯。這類ADAM9-結合分子可用於監測和/或預測疾病的發展或進展，作為臨床檢測程式的一部分，例如確定特定治療的效力。可檢測物質的實例包含各種酶(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、輔基(例如鏈酶抗生物素/生物素)、螢光物質(例如7-羥基香豆素、螢光素或藻紅素)、發光物質(例如發光氨)、生物發光物質(例如螢光素酶或水母發光蛋白)、放射性物質(例如碳-14、錳-54、鍶-85或鋅-65)、正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。可檢測物質可以使用本領域已知的技術與ADAM9-結合分子直接偶聯或綴合，或通過中間體(例如，連接體)與ADAM9-結合分子間接偶聯或綴合。
出於治療目的，本發明的ADAM9-結合分子可以與治療部分如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)綴合。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害的任何試劑，例如假單胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒桿菌毒素A至F、蓖麻毒蛋白相思豆毒蛋白、肥皂草毒蛋白和這些試劑的細胞毒性片段。治療劑包括具有預防性或治療性治療病症的治療效果的任何試劑。這樣的治療劑可以是化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，並且包括具有所需生物活性和/或改變給定生物應答的治療劑。治療劑的實例包括烷化劑、血管生成抑制劑、抗有絲分裂劑、激素治療劑和用於治療細胞增殖性病症的抗體。治療部分可以使用本領域已知的技術與ADAM9-結合分子直接偶聯或綴合，或通過中間體(例如，連接體)與ADAM9-結合分子或間接偶聯或綴合。 XIII.本發明的ADAM9-結合分子的用途
本發明包括組合物，所述組合物包含藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明的ADAM9-結合分子(例如抗體、雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、三價結合分子等)、來源於這些分子的多肽、包含編碼此類分子或多肽的序列的多核苷酸和本文所述的其它試劑。
如本文所提供的，包含本文提供的抗-ADAM9-VL結構域和/或VH結構域的本發明的ADAM9-結合分子具有結合存在於細胞表面上的ADAM9並誘導抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或介導重定向細胞殺傷(例如重定向T-細胞細胞毒性)的能力。
因此，包含本文提供的抗-ADAM9-VL結構域和/或VH結構域的本發明的ADAM9-結合分子具有治療與ADAM9的表達相關或特徵在於ADAM9的表達的任何疾病或病況的能力。如上所述，ADAM9是在許多血液和實體惡性腫瘤中表達的癌-胚抗原，其與表現出較低分化形態的高級腫瘤相關，並且與差的臨床結果相關。因此，不受限制地，本發明的ADAM9-結合分子可用於診斷或治療癌症，尤其是以ADAM9的表達為特徵的癌症。
尤其地，本發明的ADAM9-結合分子可用於治療膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、淋巴癌、非小細胞肺癌、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
在進一步的實施方案中，本發明的ADAM-9-結合分子可用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)和結直腸癌(腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸道間質瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鱗狀細胞癌)。
本發明的雙特異性ADAM9-結合分子通過促進對表達此類分子(例如CD2、CD3、CD8、CD16、T細胞受體(TCR)、NKG2D等)的第二特異性的腫瘤細胞的重定向殺傷來增強由ADAM9提供的癌症治療。這樣的ADAM9-結合分子尤其可用於癌症的治療。
除了它們在治療中的實用性，本發明的ADAM9-結合分子可以被可檢測地標記並用於癌症的診斷或用於腫瘤和腫瘤細胞的成像。 XIV. 藥物組合物
本發明的組合物包含原料藥物組合物，其可用於製造藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥物組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)。這類組合物包含預防上或治療上有效量的本發明的ADAM9-結合分子，或這類劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包含預防上或治療上有效量的本發明的ADAM9-結合分子和藥學上可接受的載體。本發明也包含這類藥物組合物，其另外包含對特定的癌症抗原特異性的第二治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，和藥學上可接受的載體。
在具體的實施方案中，術語“藥學上可接受的 ”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體 ”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。
本發明也提供藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明的ADAM9-結合分子，單獨地或與這類藥學上可接受的載體一起。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包含在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的公告，所述公告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
本發明提供了可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可以包含本發明的任何ADAM9-結合分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包含可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑。 XV. 施用方法
通過向受試者施用有效量的本發明的ADAM9-結合分子(例如，抗體、雙特異性抗體、雙抗體、三價結合分子、融合蛋白等)或綴合的ADAM9-結合分子或包含本發明的ADAM9-結合分子或綴合的ADAM9-結合分子的藥物組合物，可以提供本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方案中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方案中，受試者是人。
各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用本發明的組合物，例如包封於脂質體中、微粒、微膠囊、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞(見，例如，Wu等(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, ” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用本發明的ADAM9-結合分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及黏膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方案中，本發明的ADAM9-結合分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
本發明還提供本發明的ADAM9-結合分子的製劑包裝在密封容器中，比如指示分子的量的安瓿或小袋中。在一個實施方案中，這樣的分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。優選地，本發明的ADAM9-結合分子作為無菌凍幹粉末提供在密封容器中。
本發明的ADAM9-結合分子的凍幹製劑應在它們的初始容器中儲存在2°C和8°C之間，並且分子應該在重構之後12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方案中，這樣的分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，這類ADAM9-結合分子在以液體形式提供時，被供應在密封容器中。
如本文所使用的，藥物組合物的“有效量 ”是足夠實現有益或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，比如減少源自疾病的症狀、減少感染的症狀(例如，病毒量、發燒、疼痛、敗血症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾病的患者的生命品質，降低治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、例如經靶向和/或內化增強另一藥物的作用、延遲疾病的進展，和/或延長個體的生存。
有效量可以在一次或多次給藥中被施用。為了本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以實現以下各項的量：殺死癌症細胞和/或降低癌症細胞增殖和/或消除、降低和/或延遲從癌症原發部位發生轉移。在一些實施方案中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可聯合或不聯合另一藥物、化合物或藥物組合物實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如果聯合一種或多種其他劑，可實現或實現期望的結果，則單劑可視為以有效量施用。
對於本發明包括的ADAM9-結合分子，施用於患者的劑量優選基於接受受試者的體重(kg)確定。
可通過修飾例如脂質化而增強分子的吸收和組織滲透，來減少或改變本發明的ADAM9-結合分子的施用劑量和頻率。
對於用作單劑療法，可計算向患者施用的本發明的ADAM9-結合分子的劑量。可選地，分子可與其他治療組合物聯合使用，並且向患者施用的劑量小於當所述分子用作單劑療法時的劑量。
本發明的藥物組合物可被局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射、或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，例如SILASTIC®膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。
本發明的組合物可以在囊泡，尤其是脂質體中遞送(見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等,在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (編輯)，Liss, New York，353- 365頁(1989)中；Lopez-Berestein, 同上，3 17-327頁)。
在本發明的組合物是編碼本發明的ADAM9-結合分子的核酸的情況下，核酸可體內施用，以通過如下方式促進其編碼的ADAM9-結合分子的表達：將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic), Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑塗覆，或通過與已知進入核的同源框樣(box-like)肽聯合施用(見例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad.Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。實施例
現在已經大體上描述了本發明，通過參考下述實施例本發明將更容易被理解。下述實施例闡釋了組合物在本發明的診斷或治療方法中的各種方法。實施例旨在闡釋但決不限制本發明的範圍。 實施例1抗 -ADAM9 抗體 MAB-A 的腫瘤細胞特異性
鑑定鼠抗-ADAM9抗體(本文命名為MAB-A )，其：(1)阻斷靶蛋白對ADAM9的加工活性；(2)被內化；和(3)具有抗腫瘤活性(見，例如，美國專利號8361475)。通過IHC研究腫瘤細胞對MAB-A 的特異性。使腫瘤組織與MAB-A (0.4 μg/mL)或同種型對照(0.4 μg/mL)接觸，並且使染色的程度可見。發現MAB-A 強烈地標記各種大細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌、非小細胞肺癌細胞類型(圖 7A ，小圖 1-8 )、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞(圖 7B ，小圖 1-6 )以及結腸癌樣品(圖 7C ，小圖 1-8 )。使正常組織與MAB-A (1.25 μg/mL)接觸，並且使染色的程度可見。如上面表 1 所總結的，MAB-A 顯示對許多正常組織很少染色或沒有染色。應該注意，這些研究中使用的MAB-A 的濃度幾乎是用於對腫瘤細胞染色的濃度的3倍。這些IHC研究的結果表明，MAB-A 展示與腫瘤細胞超過正常細胞的強優先結合。 實施例2 物種交叉反應性
檢驗了MAB-A與人ADAM9（huADAM9）和食蟹猴ADAM9 (cynoADAM9)的結合。簡而言之，暫態表達huADAM9、cynoADAM9、一種不相關的抗原或未轉染的親本細胞的293-FT和CHO-K細胞與MAB-A一起孵育，然後用山羊抗鼠-PE二抗孵育，並通過FACS分析。如圖8A-8B所示，MAB-A與在兩種細胞類型上暫態表達的huADAM9顯示強結合。MAB-A顯示對cynoADAM9的弱結合。MAB-A不結合親本細胞或表達無關抗原的細胞。在ELISA測定中也觀察到與cynoADAM相似的弱結合。 實施例2 人源化和初始優化
人源化MAB-A 產生了人源化的VH結構域，本文命名為“hMAB-A VH(1) ”，和人源化的VL結構域，本文命名為“hMAB-A VL(1) ”。然後，優化人源化的可變結構域，以增強結合活性和/或去除下面更詳細描述的潛在不穩定的氨基酸殘基。該第一輪優化產生了三種另外的人源化的VH結構域，本文命名為“hMAB-A VH(2) ”、“hMAB-A VH(3) ”和“hMAB-A VH(4) ”，和三種另外的人源化的VL結構域，本文命名為“hMAB-A VL(2) ”、“hMAB-A VL(3) ”和“hMAB-A VL(4) ”。此外，產生了具有鼠VH和VL結構域和人恆定區的嵌合形式的MAB-A (“chMAB-A ”)。鼠和人源化的/優化的VH和VL結構域的氨基酸序列在上面提供，在圖9A 和9B 中提供了比對。這些人源化的/優化的VH和VL結構域的共有序列在上面提供。在產生多個人源化的可變結構域的情況下，特定抗-ADAM9抗體(例如，MAB-A )的人源化的重鏈和輕鏈可變結構域可以任何組合被使用，並且，通過參考具體VH/VL結構域命名人源化鏈的特定組合，例如包含hMAB-A VH(1) 和hMAB-A VL(2) 的分子(例如，抗體或雙抗體)具體稱為“hMAB-A (1.2) ”。
產生具有來源於人種系VH3-21和VH3-64的框架區的hMAB-A VH(1) ，並產生具有來源於人種系B3和L6的框架區的hMAB-A VL(1) 。將鼠CDR保留在這些人源化的可變結構域中。
在CDRH 2中鑑定了潛在的脫醯胺位點(在圖 9A 中以單底線表示)，並且在CDRL 1中鑑定了潛在的天冬氨酸異構化位點(在圖 9B 中以單底線顯示)。檢驗了在這些位置處的氨基酸取代，以鑑定去除這些位點同時維持結合親和力的取代。選擇了在CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(2) 中)的54位處的苯丙氨酸取代(N54F)和CDRL 1 (存在於hMAB-A VL(2) 中)的28位處的絲氨酸取代(D28S)，其中編號對應於Kabat。鑑定的取代可單獨或組合使用。令人驚訝的是，發現包含N54F取代的抗體對人ADAM9表現出親和力約2倍的增加，和對食蟹猴ADAM9表現出略微改善的結合。
另外，產生優化的變體以最小化CDR中存在的賴氨酸殘基的數目。在CDRH 2中存在兩個賴氨酸殘基(在圖 9A 中用雙底線表示)，並且在CDRL 1中存在一個賴氨酸(在圖 9B 中以雙底線表示)。檢驗這些位置處的氨基酸取代，以鑑定維持結合親合力的取代。對CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(3) 中)選擇在62位的精氨酸取代(K62R)、在64位的穀氨醯胺取代(K64Q)和在65位的絲氨酸取代(S65G)，其中編號對應於Kabat。對CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(3) 中)選擇24位的精氨酸取代(K24R)。鑑定的取代可以單獨或組合使用。
鑑定了CDR中存在的其它潛在不穩定的殘基(在圖9A-9B 中用虛線底線表示)，在CDRH 1內34位置的一個甲硫氨酸殘基(M34)、在CDRL 1內33位置的一個甲硫氨酸殘基(M33)和在CDRL 3 內的位置92 (H93)、93 (E93)和94 (D94)處的組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸殘基，其中編號對應於Kabat。檢驗在這些位置處的氨基酸取代，以鑑定維持結合親合力的取代。對CDRH 1選擇34位處的異亮氨酸取代(M34I)，並且，對CDRL 3選擇位置33 (M33L)、92 (H93Y)、93 (E93S)和94 (D94T)處的亮氨酸、酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸取代，其中編號對應於Kabat。這些位置中的每一個可以容易地聯合上面詳述的全部取代進行取代，以產生hMAB-A VH(4) 和 hMAB-A VL(4) ，當配對在一起時其產生這樣的抗體：與親本鼠抗體相比保持親合力的小的改善，並且，對脫醯胺或氧化具有大大降低的潛力，以及在CDR中沒有賴氨酸殘基。
人源化的/優化的抗體hMAB-A (1.1)、hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (3.3)、hMAB-A (4.4)和嵌合chMAB-A (具有鼠VH/VL結構域)對huADAM的相對結合親和力利用BIACORE®分析進行研究，在BIACORE®分析中，使His-標記的可溶性人ADAM9 (“shADAM9-His ”，含有與包含組氨酸的肽融合的人ADAM9的細胞外部分)經過塗布有固定抗體的表面。簡言之，將每種抗體捕獲到Fab2 山羊抗人Fc-塗布的表面上，然後在存在不同濃度(6.25-100 nM)的shADAM9-His肽的情況下孵育。通過BIACORE®分析結合(歸一化的1:1朗繆爾結合模型)測定結合的動力學。表 7 中列出了這些研究中計算的ka 、kd 和KD 。如上所述通過FACS和通過ELISA檢驗與cynoADAM9的結合。
這些研究的結果表明，相比親本鼠抗體，人源化的/優化的抗體對人ADAM9具有相同或更高的結合親和力。尤其地，觀察到在人源化抗體中引入N54F突變導致與huADAM9 (即，hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)和hMAB-A (3.3))的改善的結合。這一突變還提供了與cynoADAM9的結合的輕微改善，如通過FACS和ELISA所測定的，但是這些抗體繼續表現出與cynoADAM9的弱結合。這些研究還鑑定了另外的取代，其可以被引入以從CDR中除去賴氨酸殘基，而不降低親和力。鑑定另外的取代，以去除其它潛在的不穩定殘基，同時對親和力影響最小。 實施例4 優化與非人靈長類動物ADAM9的結合
使用隨機誘變在hMAB-A (2.2)的重鏈CDRH 2 (Kabat位置53-58)和CDRH 3 (Kabat位置95-100和100a-100f)結構域內引入取代。篩選突變體，以鑑定與非人靈長類動物ADAM9 (例如，cynoADAM9)具有增強的結合並且保持與huADAM9的高親合力結合的克隆。從CDRH 3 (Kabat位置100a-100f)內的兩個獨立的突變篩選中選擇了48個克隆。表 8 提供了從兩個獨立篩選中針對與cynoADAM9增強的結合而被選擇的hMAB-A (2.2) 克隆的CDRH 3 Kabat殘基100a-f的氨基酸序列的比對。另外的克隆比對在表 9 中提供。如在這些表中所示，在每個實驗中出現類似的克隆，這些克隆屬於離散的取代模式。
對於所有檢驗的克隆，Gly和Ala是位置4 (P4)處的優選氨基酸殘基，並且，Leu、Met和Phe是位置6 (P6)處的優選氨基酸殘基。在其它位置(例如位置2 (P2)、位置3 (P3)和位置5 (P5))處的優選的氨基酸殘基取決於在P1處發現的氨基酸殘基。對於在位置1 (P1)處具有Pro殘基的克隆，Lys和Arg在P2處是優選的，在P3處是Phe和Met，在P4處是Gly，在P5處是Trp或Phe。對於在P1處具有Phe、Tyr或Trp的克隆，Asn和His在P2處是優選的，在P3處是Ser和His，和在P6處是Leu。對於在P1處具有Ile、Leu或Val的克隆，Gly在P2處是優選的，在P3處是Lys，在P5處是Val，和在P6處是疏水的。另外，如表 8 所示，對於在P1處具有Thr殘基的克隆，Gly在P2處是優選的，Lys、Met和Asn在P3處是優選的，Gly在P4處是優選的，Val或Thr在P5處是優選的，和Leu和Met在P6處是優選的。在P1處具有Asp、Gly、Arg、His或Ser殘基的另外的克隆也以較低的頻率被鑑定到(見表 8 和表 9 )。
使用表 9 中所示的10個克隆的VH結構域來產生hMAB-A (2.2) 的進一步優化的變體，命名為hMAB-A (2A.2) 。通過ELISA測定檢驗選擇的克隆的結合。簡言之，使用與含有組氨酸的肽結合並且已經被塗布到微量滴定板上的抗體來捕獲His肽-標記的可溶性cynoADAM9 (“cynoADAM9-His ”) (1 μg/mL)或His肽-標記的可溶性huADAM9 (1 μg/mL)，並且，檢驗親本hMAB-A (2.2) 的連續稀釋物和十個CDRH 3hMAB-A (2A.2) 變體的結合。cynoADAM9和huADAM9的結合曲線分別在圖 10A 和圖 10B 中示出。包含每個選擇的VH結構域的hMAB-A (2A.2) 變體顯示出與cynoADAM9改善的結合，其中MAB-A VH(2B)、MAB-A VH(2C)、MAB-A VH(2D)和MAB-A VH(2I)在cynoADAM9結合方面顯示最大的增強同時維持與huADAM9類似於親本hMAB-A (2.2)抗體的結合。
基本上如上所述，使用BIACORE®分析研究人源化的/進一步優化的抗體MAB-A VH(2B.2)、MAB-A VH(2C.2)、MAB-A VH(2D.2)和MAB-A VH(2I.2)和親本hMAB-A (2.2)與huADAM9-His和cynoADAM9-His的相對結合親和力。從這些研究計算的ka 、kd 和KD 在中表 10 示出。
結合研究表明，前四個克隆顯示在與cynoADAM9的結合親和力方面150-550倍之間的增強，同時維持與親本抗體相同的對huADAM9的高親和力結合。選擇hMAB-A (2C.2) 和hMAB-A (2I.2) 用於進一步研究。 實施例5 抗體hMAB-A (2I.2)的免疫組織化學研究
通過IHC研究hMAB-A (2I.2) 的細胞特異性。使陽性和陰性對照細胞，以及正常人和食蟹猴組織與hMAB-A (2I.2) (2.5 μg/mL)或同種型對照(2.5 μg/mL)接觸，並且使染色的程度可見。研究的結果總結在表 11 中。
還進行IHC研究以評估濃度為12.5 μg/mL (5x最佳染色濃度)的人源化的/優化的hMAB-A (2I.2) 的結合。在該研究中應用陽性和陰性對照細胞、正常人組織和食蟹猴組織。研究的結果總結在表 12 中。
進行比較IHC研究，以評估hMAB-A (2.2) 、hMAB-A (2.3) 、hMAB-A (2C.2) 和hMAB-A (2I.2) 在2.5 μg/mL或5 μg/mL結合的差異。在該研究中應用陽性和陰性對照細胞、正常人組織和食蟹猴組織。研究的結果總結在表 13 中。
進行進一步的比較IHC研究，以評估hMAB-A (2.2) 、hMAB-A (2.3) 、hMAB-A (2C.2) 和hMAB-A (2I.2) 和鼠MAB-A 在2.5 μg/mL、5 μg/mL或12.5 μg/mL時結合的差異。在該研究中應用陽性和陰性對照細胞、正常人組織和食蟹猴組織。研究的結果總結在表 14 中。
因此，結果表明hMAB-A (2.2) 在最佳濃度處顯示出對人肝細胞和腎小管的總的低水準的染色，其中在陰性對照中觀察到在肝細胞和腎小管中的反應性的較低染色強度/頻率。hMAB-A (2.2) 在最佳濃度處顯示出對食蟹猴肝細胞和腎小管的類似的低水準染色，其中在陰性對照中觀察到在腎小管中的反應性的較低染色強度/頻率。
結果還表明，hMAB-A (2C.2) 在最佳濃度處顯示出對人肝細胞和腎小管的總的低水準的染色，其中在陰性對照中觀察到在肝細胞和腎小管中的反應性的較低染色強度/頻率。hMAB-A (2C.2) 在最佳濃度處顯示出在食蟹猴肝細胞和腎小管中類似的低水準染色。對於hMAB-A (2C.2) ，在相應的人組織中沒有觀察到食蟹猴肺上皮細胞、胰腺胰島/上皮細胞和膀胱上皮細胞的另外的最小發現；在陰性對照中在肺上皮細胞、腎小管、膀胱上皮細胞中觀察到反應性的較低染色強度/頻率。
結果還表明，hMAB-A (2I.2) 在最佳濃度處顯示出對人或食蟹猴組織沒有染色，具有罕見的+/-膀胱移行上皮細胞染色。hMAB-A (2I.2) 在5x最佳濃度處也顯示出對人肺肺泡細胞、胰腺導管上皮細胞、腎小管、膀胱移行上皮細胞的總的低水準和頻率的染色，並且在5x最佳濃度處顯示出對食蟹猴支氣管上皮細胞和膀胱移行上皮細胞的總的低水準的染色。hMAB-A (2I.2) 顯示出對測試的人正常組織的總的有利的IHC特徵，以及對相應的食蟹猴組織類似的特徵。
本說明書中提到的所有公開案和專利案通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個公開案或專利申請案通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方案描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。
無
圖 1 提供具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體的示意圖，所述雙抗體由兩條多肽鏈組成，每條多肽鏈各具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體促進結構域(下面提供可選的異源二聚體促進結構域)。如圖3B所示，半胱氨酸殘基可以存在於連接體中和/或異源二聚體促進結構域中。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 2 提供具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子由兩條多肽鏈組成，每條多肽鏈各具有CH2和CH3結構域，這樣締合的鏈形成全部或一部分Fc區域。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖3A-3C 提供的示意圖顯示具有四個表位元結合位點的代表性共價結合的四價雙抗體，所述雙抗體由兩對多肽鏈組成(即，總計四條多肽鏈)。每對多肽中的一條多肽具有CH2和CH3結構域，這樣締合的鏈形成全部或一部分Fc區域。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。這兩對多肽鏈可以是相同的。在其中兩對多肽鏈相同且VL和VH結構域識別不同的表位（如圖3A-3B所示）的這類實施方案中，得到的分子具有四個表位結合位點，並且就每個結合的表位而言是雙特異性和二價的。在其中VL和VH結構域識別相同的表位（例如，相同的VL結構域CDR和相同的VH結構域CDR在兩條鏈上使用）的這類實施方案中，得到的分子具有四個表位結合點，並且相對於單個表位而言是單特異性和四價的。可選地，兩對多肽可以不同。在其中兩對多肽鏈不同且每對多肽的VL和VH結構域識別不同的表位（如圖3C中不同陰影和圖案所示）的這類實施方案中，得到的分子具有四個表位結合位點，並且對於每個結合的表位而言是四特異性的和單價的。圖3A顯示含Fc區域的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基的肽異源二聚體促進結構域；圖3B顯示含Fc區域的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體促進結構域和連接體（具有可選的半胱氨酸殘基）。圖3C顯示了含有Fc區域的雙抗體，其含有抗體CH1和CL結構域。
圖4A-4B 提供具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子由三條多肽鏈組成。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，這樣締合的鏈形成全部或一部分Fc區域。包含VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體促進結構域。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 5 提供具有四個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，所述雙抗體分子由五條多肽鏈組成。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，這樣締合的鏈形成包含全部或一部分Fc區域的Fc區域。包含連接的VL和VH結構域的多肽鏈還包含異源二聚體促進結構域。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖6A-6F 提供含Fc區域的代表性三價結合分子的示意圖，其具有三個表位結合位點。圖6A 和6B 分別示意性地闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包含具有不同結構域取向的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域，其中雙抗體型結合結構域在Fc區域的N-末端或C-末端。圖6A和6B中的子分子包含四條鏈。圖6C和6D分別示意性地闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包含在Fc區域的N-末端的兩個雙抗體型結構域，和其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔子或scFv型結合結構域連接的Fab型結合結構域。圖6E和6F中的三價結合子分別示意性地闡釋了三價結合分子的結構域，所述三價結合分子包含在Fc區域的C-末端的兩個雙抗體型結合結構域，和其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔子或scFv型結合結構域連接的Fab型結合結構域。圖6C-6F中的三價結合分子包含三條鏈。識別相同表位的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖7A-7C 呈現免疫組織化學（IHC）研究的結果，並顯示MAB-A特異性標記多種非小細胞肺癌類型（圖7A，小圖1-8）、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞（圖7B，小圖1-6）和結腸癌細胞（圖7C，小圖1-8）的能力，而同種型對照未能特異性標記任何這些癌症細胞類型（圖7A-7C）。
圖8A-8B 呈現細胞染色研究的結果，並且顯示MAB-A與人ADAM9結合和以較低的程度與食蟹猴ADAM9結合，所述ADAM9在293-FT和CHO-K細胞表面上暫態表達（分別見圖8A和圖8B）。
圖9A-9B 描繪了與MAB-A的幾個人源化/優化的變體比對的鼠抗ADAM9-VH結構域的氨基酸序列(圖 9A ， SEQ ID NO:7 、 16 、 17 、 18 、 19 、 21 、 22 、 23 和 28 )和與MAB-A的幾個人源化/優化的變體比對的鼠抗ADAM9-VL結構域的氨基酸序列(圖 9B ， SEQ ID NO:11 、 51 、 52 、 53 和 54 )。在初始優化過程中，在CDR中取代的位置如下以底線表示：潛在的脫醯胺和異構化位點用單底線表示，賴氨酸殘基用雙底線表示，另外的不穩定殘基用雙點底線表示。
圖10A-10B 呈現包括CDRH 3變體的10個選擇的優化hMAB-A 克隆、親本hMAB-A (2.2)和同種型對照抗體的ELISA結合曲線。圖10A呈現食蟹猴ADAM9的結合曲線，並且圖10B呈現人ADAM9的結合曲線。
<110> 美商宏觀基因有限公司MacroGenics,Inc.
<120> ADAM9結合分子及使用其的方法
<130> 1301.0147PCT
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<150> US 62/438,516
<151> 2016-12-23
<160> 207
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> 人IgG1的CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (200)..(200)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (217)..(217)
<223> Xaa可以是任何天然產生的氨基酸
<400> 1
Figure 106145169-A0305-02-0143-1
Figure 106145169-A0305-02-0144-2
Figure 106145169-A0305-02-0145-3
<210> 2
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(216)
<223> 人IgG2的CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (216)..(216)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 2
Figure 106145169-A0305-02-0145-4
Figure 106145169-A0305-02-0146-5
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 人IgG3的CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 3
Figure 106145169-A0305-02-0147-6
Figure 106145169-A0305-02-0148-7
<210> 4
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 人IgG4的CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 4
Figure 106145169-A0305-02-0148-8
Figure 106145169-A0305-02-0149-9
Figure 106145169-A0305-02-0150-10
<210> 5
<211> 819
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(819)
<223> 代表性人ADAM9多肽(NCBI序列NP 003807)
<220>
<221> 信號
<222> (1)..(28)
<223> 信號序列
<400> 5
Figure 106145169-A0305-02-0150-11
Figure 106145169-A0305-02-0151-12
Figure 106145169-A0305-02-0152-13
Figure 106145169-A0305-02-0153-14
Figure 106145169-A0305-02-0154-15
Figure 106145169-A0305-02-0155-16
<210> 6
<211> 819
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(819)
<223> 代表性食蟹猴ADAM9多肽(NCBI序列XM 005563126.2)
<220>
<221> 信號
<222> (1)..(28)
<223> 可能的信號序列
<400> 6
Figure 106145169-A0305-02-0155-17
Figure 106145169-A0305-02-0156-18
Figure 106145169-A0305-02-0157-19
Figure 106145169-A0305-02-0158-20
Figure 106145169-A0305-02-0159-21
Figure 106145169-A0305-02-0160-22
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(123)
<223> 鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的VH結構域
<400> 7
Figure 106145169-A0305-02-0160-23
Figure 106145169-A0305-02-0161-24
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRH1結構域
<400> 8
Figure 106145169-A0305-02-0161-25
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRH2結構域
<400> 9
Figure 106145169-A0305-02-0161-26
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRH3結構域
<400> 10
Figure 106145169-A0305-02-0162-27
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> 鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的VL結構域
<400> 11
Figure 106145169-A0305-02-0162-28
Figure 106145169-A0305-02-0163-29
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRL1結構域
<400> 12
Figure 106145169-A0305-02-0163-30
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRL2結構域
<400> 13
Figure 106145169-A0305-02-0163-31
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的CDRL3結構域
<400> 14
Figure 106145169-A0305-02-0164-32
<210> 15
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的人源化的/優化的VH結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> XAA是甲硫氨酸(M)或異亮氨酸(I)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> XAA是天冬酰胺(N)或苯丙氨酸(F)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> XAA是賴氨酸(K)或精氨酸(R)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> XAA是賴氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> XAA是絲氨酸(S)或甘氨酸(E)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> XAA是脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)、甘氨酸(G)或天冬氨酸(D)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> XAA是賴氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、組氨酸(H)或絲氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (107)..(107)
<223> XAA是苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)、賴氨酸(K)或天冬酰胺(N)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (108)..(108)
<223> XAA是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (109)..(109)
<223> XAA是纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (109)..(109)
<223> XAA是甲硫氨酸(M)、亮氨酸(L)或賴氨酸(K)
<220>
<221> misc_feature
<222> (110)..(110)
<223> Xaa可以是任何天然產生的氨基酸
<400> 15
Figure 106145169-A0305-02-0166-33
<210> 16
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(1)結構域(hMAB-A VH(1))
<400> 16
Figure 106145169-A0305-02-0166-34
Figure 106145169-A0305-02-0167-35
<210> 17
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2)結構域(hMAB-A VH(2))
<400> 17
Figure 106145169-A0305-02-0167-36
Figure 106145169-A0305-02-0168-37
<210> 18
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(3)結構域(hMAB-A VH(3))
<400> 18
Figure 106145169-A0305-02-0168-38
Figure 106145169-A0305-02-0169-39
<210> 19
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(4)結構域(hMAB-A VH(4))
<400> 19
Figure 106145169-A0305-02-0169-40
Figure 106145169-A0305-02-0170-41
<210> 20
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2A)結構域(hMAB-A VH(2A))
<400> 20
Figure 106145169-A0305-02-0170-42
Figure 106145169-A0305-02-0171-43
<210> 21
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2B)結構域(hMAB-A VH(2B))
<400> 21
Figure 106145169-A0305-02-0171-44
Figure 106145169-A0305-02-0172-45
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2C)結構域(hMAB-A VH(2C))
<400> 22
Figure 106145169-A0305-02-0172-46
Figure 106145169-A0305-02-0173-47
<210> 23
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2D)結構域(hMAB-A VH(2D))
<400> 23
Figure 106145169-A0305-02-0173-48
Figure 106145169-A0305-02-0174-49
<210> 24
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2E)結構域(hMAB-A VH(2E))
<400> 24
Figure 106145169-A0305-02-0174-50
Figure 106145169-A0305-02-0175-51
<210> 25
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2F)結構域(hMAB-A VH(2F))
<400> 25
Figure 106145169-A0305-02-0175-52
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2G)結構域(hMAB-A VH(2G))
<400> 26
Figure 106145169-A0305-02-0176-53
<210> 27
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2H)結構域(hMAB-A VH(2H))
<400> 27
Figure 106145169-A0305-02-0177-54
<210> 28
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2I)結構域(hMAB-A VH(2I))
<400> 28
Figure 106145169-A0305-02-0178-55
<210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VH(2J)結構域(hMAB-A VH(2J))
<400> 29
Figure 106145169-A0305-02-0179-56
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRH1結構域
<400> 30
Figure 106145169-A0305-02-0180-57
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRH2結構域
<400> 31
Figure 106145169-A0305-02-0180-58
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRH3結構域
<400> 32
Figure 106145169-A0305-02-0180-59
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRH4結構域
<400> 33
Figure 106145169-A0305-02-0181-60
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH1結構域
<400> 34
Figure 106145169-A0305-02-0181-61
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH2結構域
<400> 35
Figure 106145169-A0305-02-0181-62
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH2結構域
<400> 36
Figure 106145169-A0305-02-0182-63
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 37
Figure 106145169-A0305-02-0182-64
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 38
Figure 106145169-A0305-02-0182-65
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 39
Figure 106145169-A0305-02-0183-66
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 40
Figure 106145169-A0305-02-0183-67
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 41
Figure 106145169-A0305-02-0183-68
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 42
Figure 106145169-A0305-02-0184-69
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 43
Figure 106145169-A0305-02-0184-70
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 44
Figure 106145169-A0305-02-0184-71
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 45
Figure 106145169-A0305-02-0185-72
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的可選的CDRH3結構域
<400> 46
Figure 106145169-A0305-02-0185-73
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的共有CDRH1結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是甲硫氨酸(M)或絲氨酸(S)
<400> 47
Figure 106145169-A0305-02-0185-74
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的共有CDRH2結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是天冬酰胺(N)或苯丙氨酸(F)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或精氨酸(R)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是絲氨酸(S)或甘氨酸(G)
<400> 48
Figure 106145169-A0305-02-0186-75
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9-抗體MAB-A的共有CDRH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)、甘氨酸(G)或天冬氨酸(Asparatate)(D)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是賴氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、組氨酸(H)或絲氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)、賴氨酸(K)或天冬酰胺(N)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是甲硫氨酸(M)、亮氨酸(L)或賴氨酸(K)
<400> 49
Figure 106145169-A0305-02-0187-76
<210> 50
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有hMAB-A VH(2)結構域的MAB-A的衍生物/變體的示例性人源化的/優化的IgG1重鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (453)..(453)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 50
Figure 106145169-A0305-02-0188-77
Figure 106145169-A0305-02-0189-78
Figure 106145169-A0305-02-0190-79
<210> 51
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有hMAB-A VH(2C)結構域的MAB-A的衍生物/變體的示例性人源化的/優化的IgG1重鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (453)..(453)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 51
Figure 106145169-A0305-02-0191-80
Figure 106145169-A0305-02-0192-81
Figure 106145169-A0305-02-0193-82
<210> 52
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有hMAB-A VH(2I)結構域的MAB-A的衍生物/變體的示例性人源化的/優化的IgG1重鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (453)..(453)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 52
Figure 106145169-A0305-02-0193-83
Figure 106145169-A0305-02-0194-84
Figure 106145169-A0305-02-0195-85
Figure 106145169-A0305-02-0196-86
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的人源化的/優化的VL結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或精氨酸(R)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是天冬氨酸(D)或絲氨酸(S))
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa是甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (96)..(96)
<223> Xaa是組氨酸(H)或酪氨酸(Y)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa是谷氨酸(E)或絲氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa是天冬氨酸(Aspattate)(D)或蘇氨酸(T)
<400> 53
Figure 106145169-A0305-02-0197-87
Figure 106145169-A0305-02-0198-88
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VL(1)結構域(hMAB-A VL(1))
<400> 54
Figure 106145169-A0305-02-0198-89
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VL(2)結構域(hMAB-A VL(2))
<400> 55
Figure 106145169-A0305-02-0199-90
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VL(3)結構域(hMAB-A VL(3))
<400> 56
Figure 106145169-A0305-02-0200-91
<210> 57
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的抗-ADAM9抗體hMAB-A的VL(4)結構域(hMAB-A VL(4))
<400> 57
Figure 106145169-A0305-02-0200-92
Figure 106145169-A0305-02-0201-93
<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRL1結構域
<400> 58
Figure 106145169-A0305-02-0201-94
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRL2結構域
<400> 59
Figure 106145169-A0305-02-0202-95
<210> 60
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRL3結構域
<400> 60
Figure 106145169-A0305-02-0202-96
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的/優化的鼠抗-ADAM9抗體MAB-A的FRL4結構域
<400> 61
Figure 106145169-A0305-02-0202-97
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的可選的CDRL1結構域
<400> 62
Figure 106145169-A0305-02-0203-98
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的可選的CDRL1結構域
<400> 63
Figure 106145169-A0305-02-0203-99
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的可選的CDRL1結構域
<400> 64
Figure 106145169-A0305-02-0203-295
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的可選的CDRL2結構域
<400> 65
Figure 106145169-A0305-02-0204-100
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的共有CDRL1結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或精氨酸(R)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是天冬氨酸(D)或絲氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)
<400> 66
Figure 106145169-A0305-02-0204-101
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ADAM9抗體MAB-A的共有CDRL3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是組氨酸(H)或酪氨酸(Y)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是谷氨酸(E)或絲氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是天冬氨酸(D)或蘇氨酸(T)
<400> 67
Figure 106145169-A0305-02-0205-102
<210> 68
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有hMAB-A VL(2)結構域的MAB-A的衍生物/變體的示例性人源化的/優化的IgG1輕鏈
<400> 68
Figure 106145169-A0305-02-0205-103
Figure 106145169-A0305-02-0206-104
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 優選的間插間隔體肽(連接體1)
<400> 69
Figure 106145169-A0305-02-0207-105
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 優選的含半胱氨酸的間隔體肽(連接體2)
<400> 70
Figure 106145169-A0305-02-0207-106
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 71
Figure 106145169-A0305-02-0207-107
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 72
Figure 106145169-A0305-02-0208-108
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 73
Figure 106145169-A0305-02-0208-109
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 74
Figure 106145169-A0305-02-0208-110
<210> 75
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 75
Figure 106145169-A0305-02-0209-111
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可選的間隔體肽(連接體2)
<400> 76
Figure 106145169-A0305-02-0209-112
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<400> 77
Figure 106145169-A0305-02-0209-113
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<400> 78
Figure 106145169-A0305-02-0209-114
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<400> 79
Figure 106145169-A0305-02-0210-115
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<400> 80
Figure 106145169-A0305-02-0210-116
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 異源二聚體促進結構域
<400> 81
Figure 106145169-A0305-02-0210-117
<210> 82
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-螺旋異源二聚體促進結構域
<400> 82
Figure 106145169-A0305-02-0211-118
<210> 83
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K-螺旋異源二聚體促進結構域
<400> 83
Figure 106145169-A0305-02-0211-119
<210> 84
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體促進結構域
<400> 84
Figure 106145169-A0305-02-0211-120
Figure 106145169-A0305-02-0212-121
<210> 85
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體促進結構域
<400> 85
Figure 106145169-A0305-02-0212-122
<210> 86
<211> 46
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(46)
<223> 鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的白蛋白結合結構域3(ABD3)
<400> 86
Figure 106145169-A0305-02-0212-123
Figure 106145169-A0305-02-0213-124
<210> 87
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的去免疫化的白蛋白結合結構域3(ABD3)
<400> 87
Figure 106145169-A0305-02-0213-125
<210> 88
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的去免疫化的白蛋白結合結構域3(ABD3)
<400> 88
Figure 106145169-A0305-02-0213-126
Figure 106145169-A0305-02-0214-127
<210> 89
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的去免疫化的白蛋白結合結構域3(ABD3)
<400> 89
Figure 106145169-A0305-02-0214-128
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 90
Figure 106145169-A0305-02-0214-129
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 91
Figure 106145169-A0305-02-0215-130
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 92
Figure 106145169-A0305-02-0215-131
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 93
Figure 106145169-A0305-02-0215-132
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 94
Figure 106145169-A0305-02-0216-133
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接體
<400> 95
Figure 106145169-A0305-02-0216-134
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> IgG1鉸鏈結構域
<400> 96
Figure 106145169-A0305-02-0216-135
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> IgG2鉸鏈結構域
<400> 97
Figure 106145169-A0305-02-0217-136
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> IgG4鉸鏈結構域
<400> 98
Figure 106145169-A0305-02-0217-137
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異的IgG4鉸鏈結構域
<400> 99
Figure 106145169-A0305-02-0217-138
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 間插間隔體肽
<400> 100
Figure 106145169-A0305-02-0218-139
<210> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 人IgG CL κ結構域
<400> 101
Figure 106145169-A0305-02-0218-140
Figure 106145169-A0305-02-0219-141
<210> 102
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> 人IgG CL λ結構域
<400> 102
Figure 106145169-A0305-02-0219-142
Figure 106145169-A0305-02-0220-143
<210> 103
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG1 CH1結構域
<400> 103
Figure 106145169-A0305-02-0220-144
<210> 104
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG2 CH1結構域
<400> 104
Figure 106145169-A0305-02-0221-145
<210> 105
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG4 CH1結構域
<400> 105
Figure 106145169-A0305-02-0222-146
<210> 106
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A和L235A取代的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 106
Figure 106145169-A0305-02-0223-147
Figure 106145169-A0305-02-0224-148
<210> 107
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有S442C取代的IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 107
Figure 106145169-A0305-02-0224-149
Figure 106145169-A0305-02-0225-150
<210> 108
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A、L235A和S442C取代的IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 108
Figure 106145169-A0305-02-0226-151
Figure 106145169-A0305-02-0227-152
<210> 109
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A和L235A取代的〞含有杵的〞變異的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 109
Figure 106145169-A0305-02-0227-153
Figure 106145169-A0305-02-0228-154
Figure 106145169-A0305-02-0229-155
<210> 110
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A和L235A取代的〞含有臼的〞變異的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 110
Figure 106145169-A0305-02-0229-156
Figure 106145169-A0305-02-0230-157
<210> 111
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lo-CD2a抗-人CD2抗體的VH結構域(ATCC登錄號：11423)
<400> 111
Figure 106145169-A0305-02-0231-158
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lo-CD2a抗-人CD2抗體的VL結構域(ATCC登錄號：11423)
<400> 112
Figure 106145169-A0305-02-0231-159
Figure 106145169-A0305-02-0232-160
<210> 113
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3抗體CD3 mAb-1的VH(1)結構域(CD3 mAb-1VH(1))
<400> 113
Figure 106145169-A0305-02-0232-161
Figure 106145169-A0305-02-0233-162
<210> 114
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3抗體CD3 mAb-1的VH(2)結構域(CD3 mAb-1VH(2))
<400> 114
Figure 106145169-A0305-02-0233-163
Figure 106145169-A0305-02-0234-164
<210> 115
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3抗體CD3 mAb-1的VL結構域
<400> 115
Figure 106145169-A0305-02-0234-168
Figure 106145169-A0305-02-0235-169
<210> 116
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3抗體CD3 mAb-1(D65G)的VH結構域
<400> 116
Figure 106145169-A0305-02-0235-170
Figure 106145169-A0305-02-0236-171
<210> 117
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb-1 Low的VH結構域
<400> 117
Figure 106145169-A0305-02-0236-172
Figure 106145169-A0305-02-0237-173
<210> 118
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb-1 Fast的VH結構域
<400> 118
Figure 106145169-A0305-02-0237-174
Figure 106145169-A0305-02-0238-175
<210> 119
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb-1 OKT3的VH結構域
<400> 119
Figure 106145169-A0305-02-0238-176
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb-1 OKT3的VL結構域
<400> 120
Figure 106145169-A0305-02-0239-177
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD8 mAb-1 OKT8的VH結構域
<400> 121
Figure 106145169-A0305-02-0240-178
<210> 122
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD8 mAb-1 OKT8的VL結構域
<400> 122
Figure 106145169-A0305-02-0241-179
<210> 123
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD8 mAb-1 TRX2的VH結構域
<400> 123
Figure 106145169-A0305-02-0241-180
Figure 106145169-A0305-02-0242-181
<210> 124
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD8 mAb-1 TRX2的VL結構域
<400> 124
Figure 106145169-A0305-02-0242-182
Figure 106145169-A0305-02-0243-183
<210> 125
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD16抗體3G8的VH結構域
<400> 125
Figure 106145169-A0305-02-0243-184
Figure 106145169-A0305-02-0244-185
<210> 126
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD16抗體3G8的VL結構域
<400> 126
Figure 106145169-A0305-02-0244-186
Figure 106145169-A0305-02-0245-187
<210> 127
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD16抗體A9的VH結構域
<400> 127
Figure 106145169-A0305-02-0245-188
Figure 106145169-A0305-02-0246-189
<210> 128
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD16抗體A9的VL結構域
<400> 128
Figure 106145169-A0305-02-0246-190
<210> 129
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人TCR抗體BMA 031的VH結構域
<400> 129
Figure 106145169-A0305-02-0247-191
<210> 130
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人TCR抗體BMA 031的VL結構域
<400> 130
Figure 106145169-A0305-02-0248-192
<210> 131
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人NKG2D抗體KYK-1.0的VH結構域
<400> 131
Figure 106145169-A0305-02-0248-193
Figure 106145169-A0305-02-0249-194
<210> 132
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人NKG2D抗體KYK-1.0的VL結構域
<400> 132
Figure 106145169-A0305-02-0249-195
Figure 106145169-A0305-02-0250-196
<210> 133
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人NKG2D抗體KYK-2.0的VH結構域
<400> 133
Figure 106145169-A0305-02-0250-197
Figure 106145169-A0305-02-0251-198
<210> 134
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人NKG2D抗體KYK-2.0的VL結構域
<400> 134
Figure 106145169-A0305-02-0251-199
Figure 106145169-A0305-02-0252-200
<210> 135
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體(〞DART-1〞)的第一多肽鏈
<400> 135
Figure 106145169-A0305-02-0252-201
Figure 106145169-A0305-02-0253-202
Figure 106145169-A0305-02-0254-203
<210> 136
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAM9 x CD3雙特異性雙鏈雙抗體(〞DART-1〞)的第二多肽鏈
<400> 136
Figure 106145169-A0305-02-0254-204
Figure 106145169-A0305-02-0255-205
<210> 137
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體(〞DART-2〞)的第一多肽鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (507)..(507)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 137
Figure 106145169-A0305-02-0256-206
Figure 106145169-A0305-02-0257-207
Figure 106145169-A0305-02-0258-208
Figure 106145169-A0305-02-0259-209
<210> 138
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體(〞DART-2〞)的第二多肽鏈
<400> 138
Figure 106145169-A0305-02-0259-210
Figure 106145169-A0305-02-0260-211
<210> 139
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAM9 x CD3雙特異性三鏈雙抗體(〞DART-2〞)的第三多肽鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (227)..(227)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 139
Figure 106145169-A0305-02-0261-212
Figure 106145169-A0305-02-0262-213
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體MAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分
<400> 140
Figure 106145169-A0305-02-0262-214
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 141
Figure 106145169-A0305-02-0263-215
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 142
Figure 106145169-A0305-02-0263-216
<210> 143
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 143
Figure 106145169-A0305-02-0263-217
<210> 144
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 144
Figure 106145169-A0305-02-0264-218
<210> 145
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 145
Figure 106145169-A0305-02-0264-219
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 146
Figure 106145169-A0305-02-0264-220
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 147
Figure 106145169-A0305-02-0265-221
<210> 148
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 148
Figure 106145169-A0305-02-0265-222
<210> 149
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 149
Figure 106145169-A0305-02-0265-223
<210> 150
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 150
Figure 106145169-A0305-02-0266-224
<210> 151
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 151
Figure 106145169-A0305-02-0266-225
<210> 152
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 152
Figure 106145169-A0305-02-0266-226
<210> 153
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 153
Figure 106145169-A0305-02-0266-227
<210> 154
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 154
Figure 106145169-A0305-02-0267-228
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 155
Figure 106145169-A0305-02-0267-229
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 156
Figure 106145169-A0305-02-0267-230
<210> 157
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體抗-人ADAM9
<400> 157
Figure 106145169-A0305-02-0268-231
<210> 158
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 158
Figure 106145169-A0305-02-0268-233
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 159
Figure 106145169-A0305-02-0268-234
<210> 160
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 160
Figure 106145169-A0305-02-0269-235
<210> 161
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 161
Figure 106145169-A0305-02-0269-236
<210> 162
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 162
Figure 106145169-A0305-02-0269-237
<210> 163
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 163
Figure 106145169-A0305-02-0270-238
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 164
Figure 106145169-A0305-02-0270-239
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 165
Figure 106145169-A0305-02-0270-240
<210> 166
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 166
Figure 106145169-A0305-02-0270-241
Figure 106145169-A0305-02-0271-242
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 167
Figure 106145169-A0305-02-0271-243
<210> 168
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 168
Figure 106145169-A0305-02-0271-244
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 169
Figure 106145169-A0305-02-0271-245
<210> 170
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 170
Figure 106145169-A0305-02-0272-246
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 171
Figure 106145169-A0305-02-0272-247
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 172
Figure 106145169-A0305-02-0272-249
<210> 173
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 173
Figure 106145169-A0305-02-0273-250
<210> 174
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 174
Figure 106145169-A0305-02-0273-251
<210> 175
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 175
Figure 106145169-A0305-02-0273-252
<210> 176
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 176
Figure 106145169-A0305-02-0274-253
<210> 177
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 177
Figure 106145169-A0305-02-0274-254
<210> 178
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 178
Figure 106145169-A0305-02-0274-255
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 179
Figure 106145169-A0305-02-0275-256
<210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 180
Figure 106145169-A0305-02-0275-257
<210> 181
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 181
Figure 106145169-A0305-02-0275-258
<210> 182
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體MAB-A的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 182
Figure 106145169-A0305-02-0275-259
<210> 183
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體MAB-A的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 183
Figure 106145169-A0305-02-0276-260
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 184
Figure 106145169-A0305-02-0276-261
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 185
Figure 106145169-A0305-02-0276-262
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 186
Figure 106145169-A0305-02-0277-263
<210> 187
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 187
Figure 106145169-A0305-02-0277-264
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 188
Figure 106145169-A0305-02-0277-265
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 189
Figure 106145169-A0305-02-0278-266
<210> 190
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 190
Figure 106145169-A0305-02-0278-267
<210> 191
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 191
Figure 106145169-A0305-02-0278-268
<210> 192
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 192
Figure 106145169-A0305-02-0279-269
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 193
Figure 106145169-A0305-02-0279-270
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A(2.2)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 194
Figure 106145169-A0305-02-0279-271
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A VH(2E)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 195
Figure 106145169-A0305-02-0280-272
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A VH(2F)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 196
Figure 106145169-A0305-02-0280-273
<210> 197
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A VH(2H)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 197
Figure 106145169-A0305-02-0280-274
<210> 198
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A VH(2I)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 198
Figure 106145169-A0305-02-0280-275
<210> 199
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人ADAM9抗體hMAB-A VH(2J)的CDRH3結構域的亞結構域部分的變體
<400> 199
Figure 106145169-A0305-02-0281-276
<210> 200
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有M252Y/S254T/T256E取代的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 200
Figure 106145169-A0305-02-0281-277
Figure 106145169-A0305-02-0282-278
<210> 201
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E取代的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 201
Figure 106145169-A0305-02-0283-279
Figure 106145169-A0305-02-0284-280
<210> 202
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A/L235A取代的hMAB-A VH(2I)的人源化的/優化的IgG1重鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (453)..(453)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 202
Figure 106145169-A0305-02-0284-281
Figure 106145169-A0305-02-0285-282
Figure 106145169-A0305-02-0286-283
Figure 106145169-A0305-02-0287-284
<210> 203
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A、L235A、M252Y、S254T、T256E和S442C取代的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 203
Figure 106145169-A0305-02-0287-285
Figure 106145169-A0305-02-0288-286
Figure 106145169-A0305-02-0289-287
<210> 204
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A、L235A、M252Y、S254T及T256E取代的〞含有杵的〞變異的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 204
Figure 106145169-A0305-02-0289-288
Figure 106145169-A0305-02-0290-289
<210> 205
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有L234A、L235A、M252Y、S254T及T256E取代的〞含有臼的〞變異的人IgG1 CH2-CH3結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是賴氨酸(K)或不存在
<400> 205
Figure 106145169-A0305-02-0291-290
Figure 106145169-A0305-02-0292-291
<210> 206
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(52)
<223> IgG3鉸鏈結構域
<400> 206
Figure 106145169-A0305-02-0292-292
<210> 207
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG3結構域
<400> 207
Figure 106145169-A0305-02-0293-293

Claims (42)

  1. 一種ADAM9-結合分子，所述ADAM9-結合分子包含人源化的ADAM9-結合結構域，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含重鏈可變(VH)結構域，所述重鏈可變結構域包含CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域；和輕鏈可變(VL)結構域，所述輕鏈可變(VL)結構域包含CDRL1結構域、CDRL2結構域和CDRL3結構域，其中：(A)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和45的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(B)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和37的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(C)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和38的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(D)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和39的氨基酸序列組成；並且 所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(E)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和40的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(F)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和41的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(G)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和42的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(H)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和43的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(I)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和44的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或 (J)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和46的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成；或(K)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域分別由SEQ ID NO：8、35和10的氨基酸序列組成；並且所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域分別由SEQ ID NO：62、13和14的氨基酸序列組成。
  2. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含：(A)(1)所述CDRH1結構域，其由SEQ ID NO：8的氨基酸序列組成；(2)所述CDRH2結構域，其由SEQ ID NO：35的氨基酸序列組成；和(3)所述CDRH3結構域，其由SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42、43、44、45或46的氨基酸序列組成；和(B)(1)所述CDRL1結構域，其由SEQ ID NO：62的氨基酸序列組成；(2)所述CDRL2結構域，其由SEQ ID NO：13的氨基酸序列組成；和(3)所述CDRL3結構域，其由SEQ ID NO：14的氨基酸序列組成。
  3. 如請求項2所述的ADAM9-結合分子，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含：(A)(1)所述CDRH1結構域，其由氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO：8)組成； (2)所述CDRH2結構域，其由氨基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS(SEQ ID NO：35)組成；或(3)所述CDRH3結構域，其由氨基酸序列GGYYYYPRQGFLDY(SEQ ID NO：45)組成；和(B)(1)所述CDRL1結構域，其由氨基酸序列KASQSVDYSGDSYMN(SEQ ID NO：62)組成；(2)所述CDRL2結構域，其由氨基酸序列AASDLES(SEQ ID NO：13)組成；或(3)所述CDRL3結構域，其由氨基酸序列QQSHEDPFT(SEQ ID NO：14)組成。
  4. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含：(A)所述重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列；和(B)所述輕鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：55的的氨基酸序列。
  5. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含：所述VH結構域，其包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列；和所述VL結構域，其包括SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
  6. 如請求項4所述的ADAM9-結合分子，其中所述人源化的ADAM9-結合結構域包含SEQ ID NO：28的重鏈可變結構域。
  7. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是單特異性ADAM9-結合抗體或其ADAM9-結合片段。
  8. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是雙特異性抗體。
  9. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是雙抗體，所述雙抗體是包含兩條、三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物。
  10. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是三價結合分子，所述三價結合分子是包含三條、四條、五條或更多條多肽鏈的共價結合的複合物。
  11. 如請求項7所述的ADAM9-結合分子，其中所述ADAM9-結合分子包含Fc區域，所述Fc區域選自由以下組成的組：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
  12. 如請求項11所述的ADAM9-結合分子，其中所述Fc區域是變異的Fc區域，其相對於野生型Fc區域包含一個或多個氨基酸修飾，其：(a)相對於野生型Fc區域所具備的對FcγR的親和力，降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力；和/或(b)相對於包括野生型Fc區域的相當分子，提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期。
  13. 如請求項12所述的ADAM9-結合分子，其中降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)L234A；(B)L235A；或(C)L234A和L235A；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  14. 如請求項12所述的ADAM9-結合分子，其中提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)M252Y；(B)M252Y和S254T；(C)M252Y和T256E；(D)M252Y、S254T和T256E；或(E)K288D和H435K；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  15. 如請求項8所述的ADAM9-結合分子，其中所述ADAM9-結合分子包含Fc區域，所述Fc區域選自由以下組成的組：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
  16. 如請求項15所述的ADAM9-結合分子，其中所述Fc區域是變異的Fc區域，其相對於野生型Fc區域包含一個或多個氨基酸修飾，其：(a)相對於野生型Fc區域所具備的對FcγR的親和力，降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力；和/或 (b)相對於包括野生型Fc區域的相當分子，提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期。
  17. 如請求項16所述的ADAM9-結合分子，其中降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)L234A；(B)L235A；或(C)L234A和L235A；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  18. 如請求項16所述的ADAM9-結合分子，其中提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)M252Y；(B)M252Y和S254T；(C)M252Y和T256E；(D)M252Y、S254T和T256E；或(E)K288D和H435K；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  19. 如請求項9所述的ADAM9-結合分子，其中所述ADAM9-結合分子包含Fc區域，所述Fc區域選自由以下組成的組：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
  20. 如請求項19所述的ADAM9-結合分子，其中所述Fc區域是變異的Fc區域，其相對於野生型Fc區域包含一個或多個氨基酸修飾，其： (a)相對於野生型Fc區域所具備的對FcγR的親和力，降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力；和/或(b)相對於包括野生型Fc區域的相當分子，提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期。
  21. 如請求項20所述的ADAM9-結合分子，其中降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)L234A；(B)L235A；或(C)L234A和L235A；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  22. 如請求項20所述的ADAM9-結合分子，其中提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)M252Y；(B)M252Y和S254T；(C)M252Y和T256E；(D)M252Y、S254T和T256E；或(E)K288D和H435K；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  23. 如請求項10所述的ADAM9-結合分子，其中所述ADAM9-結合分子包含Fc區域，所述Fc區域選自由以下組成的組：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
  24. 如請求項23所述的ADAM9-結合分子，其中所述Fc區域是變異的Fc區域，其相對於野生型Fc區域包含一個或多個氨基酸修飾，其：(a)相對於野生型Fc區域所具備的對FcγR的親和力，降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力；和/或(b)相對於包括野生型Fc區域的相當分子，提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期。
  25. 如請求項24所述的ADAM9-結合分子，其中降低所述變異的Fc區域對FcγR的親和力的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)L234A；(B)L235A；或(C)L234A和L235A；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  26. 如請求項24所述的ADAM9-結合分子，其中提高所述ADAM9-結合分子的血清半衰期的所述一個或多個氨基酸修飾包括：(A)M252Y；(B)M252Y和S254T；(C)M252Y和T256E；(D)M252Y、S254T和T256E；或(E)K288D和H435K；其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  27. 如請求項1所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子進一步包括人IgG恆定CL κ結構域，其具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
  28. 如請求項27所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子包括：(a)所述CDRH1結構域、所述CDRH2結構域和所述CDRH3結構域，其分別由SEQ ID NO：8、35和45的氨基酸序列組成；和所述CDRL1結構域、所述CDRL2結構域和所述CDRL3結構域，其分別由SEQ ID NO：62,13和14的氨基酸序列組成；(b)IgG1的Fc區域，其中所述Fc區域是變異的Fc區域，其包括氨基酸修飾M252Y、S254T和T256E，其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號。
  29. 如請求項1-9、11-22或27-28任一項所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是雙特異性的，並且包含能夠與ADAM9的表位免疫特異性結合的表位結合位點和能夠與效應細胞表面上存在的分子的表位免疫特異性結合的表位結合位點。
  30. 如請求項29所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子包含能夠免疫特異性結合ADAM9的表位的兩個表位結合位點和能夠與效應細胞表面上存在的分子的表位免疫特異性結合的兩個表位結合位點。
  31. 如請求項1-6、10或23-28任一項所述的ADAM9-結合分子，其中所述分子是三特異性的，並包含： (a)能夠與ADAM9的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點；(b)能夠與效應細胞表面上存在的第一分子的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點；和(c)能夠與效應細胞表面上存在的第二分子的表位免疫特異性結合的一個表位結合位點。
  32. 如請求項29所述的ADAM9-結合分子，其中效應細胞表面上存在的所述分子是CD2、CD3、CD8、TCR或NKG2D。
  33. 如請求項31所述的ADAM9-結合分子，其中效應細胞表面上存在的所述分子是CD2、CD3、CD8、TCR或NKG2D。
  34. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的如請求項1-28任一項所述的ADAM9-結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
  35. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的如請求項29所述的ADAM9-結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
  36. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的如請求項31所述的ADAM9-結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
  37. 一種如請求項1-28任一項所述的ADAM9-結合分子在製備用於治療與ADAM9的表達相關的疾病或病況的藥物中的用途。
  38. 如請求項37所述的用途，其中與ADAM9的表達相關的所述疾病或病況是癌症，所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
  39. 一種如請求項29所述的ADAM9-結合分子在製備用於治療與ADAM9的表達相關的疾病或病況的藥物中的用途。
  40. 如請求項39所述的用途，其中與ADAM9的表達相關的所述疾病或病況是癌症，所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
  41. 一種如請求項31所述的ADAM9-結合分子在製備用於治療與ADAM9的表達相關的疾病或病況的藥物中的用途。
  42. 如請求項41所述的用途，其中與ADAM9的表達相關的所述疾病或病況是癌症，所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨髓癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、睾丸癌和子宮癌。
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