JP2020502233A - Ａｄａｍ９結合分子、およびその使用方法 - Google Patents

Ａｄａｍ９結合分子、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、および「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）と特異的に結合できる抗体を含む、単一特異的抗体および二重特異的、三重特異的または多重特異的結合分子などの分子を対象とする。本発明は特に、ヒトおよび非ヒトＡＤＡＭ９に対して高い親和性結合を示すことができる結合分子に関する。本発明は、さらに詳細には、それによって、ヒトＡＤＡＭ９および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応性である分子に関する。本発明はさらに、レシピエント対象に対してそのようなＡＤＡＭ９結合分子を投与した際に減少した免疫原性を示すようにヒト化および／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むすべてのＡＤＡＭ９結合分子に関する。本発明はまた、そのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを含む医薬組成物、がんならびに他の疾患および状態の治療におけるそのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかの使用を含む方法も対象とする。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許出願第６２／４３８，５１６号（２０１６年１２月２３日出願；係属中）の優先権を主張し、この出願は参照により全体として本明細書中に組み込まれる。
配列表の参照
本願は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１．０１４７ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ，２０１７年１１月２９日作成、１７５，９６２バイトのサイズを有する）で開示された３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１ ｅｔ ｓｅｑ．に準じた１以上の配列表を含み、このファイルは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、および「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）と特異的に結合することができる抗体を含む、分子、例えば単一特異的抗体および二重特異的、三重特異的または多重特異的結合分子に関する。本発明は特に、ヒトおよび非ヒトＡＤＡＭ９に対する高い親和性結合を示すことができる結合分子に関する。本発明はさらに詳細には、それによって、ヒトＡＤＡＭ９および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応する分子に関する。本発明はさらに、レシピエント対象に対するそのようなＡＤＡＭ９結合分子の投与に際して低減した免疫原性を示すようにヒト化および／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むすべてのＡＤＡＭ９結合分子に関する。本発明はまたそのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを含む医薬組成物、ならびにがんや他の疾患及び状態の治療におけるそのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかの使用を含む方法に関する。
ＡＤＡＭは様々な生理学的および病理学的過程に関与するタンパク質のファミリーである（Amendola, R.S. et al. (2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Edwars, D.R. et al. (2008) “The ADAM Metalloproteases,” Molec. Aspects Med. 29:258-289）。ファミリーの少なとも４０の遺伝子メンバーが特定され、そのようなメンバーのうちの少なとも２１がヒトにおいて機能的であると考えられている（Li, J. et al. (2016) “Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion,” J. Invest. Surg. 26(3):127-133; Duffy, M.J. et al. (2011) “The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?,” Clin. Proteomics 8:9:1-13；米国特許公開第２０１３／００４５２４４号も参照）。
ＡＤＡＭファミリーメンバーは８つのドメインを有するよく保存された構造を有し、そのドメインには、メタロプロテアーゼドメインおよびインテグリン結合（ディスインテグリン）ドメインが含まれる（Duffy, M.J. et al. (2009) “The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology,” Clin. Chim. Acta 403:31-36）。ＡＤＡＭメタロプロテアーゼドメインはシェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）として作用し、膜貫通タンパク質を切断することによって一連の生物学的プロセスを調節することが報告されており、これは次に、可溶性リガンドとして作用することができ、また細胞シグナリングを調節できる（Amendola, R.S. et al. (2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Ito, N. et al. (2004) “ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008–1013）。
ＡＤＡＭ９は、分子のＡＤＡＭファミリーのメンバーである。それは、タンパク質分解により切断されて、活性酵素を生成する不活性形態として合成される。上流部位でのプロセッシングは、プロ酵素の活性化に特に重要である。ＡＤＡＭ９は線維芽細胞（Zigrino, P. et al. (2011) “The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts,” J. Biol. Chem. 286:6801-6807）、活性化血管平滑筋細胞（Sun, C. et al. (2010) “ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling,” Cardiovasc. Res. 87:348-355）、単球（Namba, K. et al. (2001) “Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes,” Cell. Immunol. 213:104-113）、活性化マクロファージ（Oksala, N. et al. (2009) “ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries – Tampere Vascular Study,” Ann. Med. 41:279-290）で発現される。
ＡＤＡＭ９のメタロプロテアーゼ活性は、マトリックス成分の分解に関与し、それによって腫瘍細胞の遊走を可能にする（Amendola, R.S. et al. (2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962）。多くのヘビ毒ディスインテグリンと高度に相同性であるそのディスインテグリンドメインは、ＡＤＡＭ９とインテグリンとの間の相互作用を可能にし、ＡＤＡＭ９が細胞接着事象をプラスまたはマイナスに調節することを可能にする（Zigrino, P. et al. (2011) “The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts,” J. Biol. Chem. 286:6801-6807; Karadag, A. et al. (2006) “ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin,” Blood 107:3271-3278; Cominetti, M.R. et al. (2009) “Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions,” Biochimie 91:1045-1052）。ＡＤＡＭ９ディスインテグリンドメインは、α６β１、α６β４、αｖβ５およびα９β１インテグリンと相互作用することが示されている。
ＡＤＡＭ９の発現は疾患、特にがんに関連することが判明している。ＡＤＡＭ９は、腫瘍発生および血管新生において重要な役割を有する多くの分子、例えば、ＴＥＫ、ＫＤＲ、ＥＰＨＢ４、ＣＤ４０、ＶＣＡＭ１およびＣＤＨ５を切断し放出することが判明している。ＡＤＡＭ９は、乳がん、結腸がん、胃がん、神経膠腫、肝臓がん、非小細胞肺がん、黒色腫、骨髄腫、膵臓がんおよび前立腺がんの腫瘍細胞を含む、多くの種類の腫瘍細胞によって発現される（Yoshimasu, T. et al. (2004) “Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis,” Cancer Res. 64:4190-4196; Peduto, L. et al. (2005) “Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer,” Cancer Res. 65:9312-9319; Zigrino, P. et al. (2005) “ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines,” Int. J. Cancer 116:853-859; Fritzsche, F.R. et al. (2008) “ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression,” BMC Cancer 8:179:1-9; Fry, J.L. et al. (2010) “Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration,” Cancer Res. 70, 8187-8198; Chang, L. et al. (2016) “Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer,” Oncology Letters 11:1242-1250; Fan, X. et al. (2016) “ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas,” Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11）。
重要なことに、増大したＡＤＡＭ９発現は腫瘍悪性度および転移能とプラスに相関することが判明している（Amendola, R.S. et al. (2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Fan, X. et al. (2016) “ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas,” Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11; Li, J. et al. (2016) “Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion,” J. Invest. Surg. 26(3):127-133）。さらに、ＡＤＡＭ９およびその分泌された可溶性アイソフォームはがん細胞が散在するのに重要であるようである（Amendola, R.S. et al. (2015) “ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,” J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Fry, J.L. et al. (2010) “Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration,” Cancer Res. 70, 8187–8198; Mazzocca, A. (2005) “A Secreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions,” Cancer Res. 65:4728-4738；米国特許第９，１５０，６５６号；同第７，５８５，６３４号；同第７，８２９，２７７号；同第８，１０１，３６１号；および同第８，４４５，１９８号ならびに米国特許公開第２００９／００２３１４９号も参照）。
したがって、多くの研究によって、ＡＤＡＭ９は抗がん療法の標的候補として特定されている（Peduto, L. (2009) “ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer,” Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287; Duffy, M.J. et al. (2009) “Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression,” Clin. Cancer Res. 15:1140-1144; Duffy, M.J. et al. (2011) “The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?” Clin. Proteomics 8:9:1-13; Josson, S. et al. (2011) “Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy,” Prostate 71(3):232-240；米国特許公開第２０１６／０１３８１１３号、同第２０１６／００６８９０９号、同第２０１６／００２４５８２号、同第２０１５／０３６８３５２号、同第２０１５／０３３７３５６号、同第２０１５／０３３７０４８号、同第２０１５／００１０５７５号、同第２０１４／０３４２９４６号、同第２０１２／００７７６９４号、同第２０１１／０１５１５３６号、同第２０１１／０１２９４５０号、同第２０１０／０２９１０６３号、同第２０１０／０２３３０７９号、同第２０１０／０１１２７１３号、同第２００９／０２８５８４０号、同第２００９／０２０３０５１号、同第２００４／００９２４６６号、同第２００３／００９１５６８号、および同第２００２／００６８０６２号、ならびにＰＣＴ公開番号国際公開第２０１６／０７７５０５号、国際公開第２０１４／２０５２９３号、国際公開第２０１４／１８６３６４号、国際公開第２０１４／１２４３２６号、国際公開第２０１４／１０８４８０号、国際公開第２０１３／１１９９６０号、国際公開第２０１３／０９８７９７号、国際公開第２０１３／０４９７０４号、および国際公開第２０１１／１００３６２号も参照）。さらに、ＡＤＡＭ９の発現はまた、肺疾患および炎症と関連することも判明している（例えば、米国特許公開第２０１６／００６８９０９号；同第２０１２／０１４９５９５号；同第２００９／０２３３３００号；同第２００６／０２７０６１８号；および同第２００９／０１４２３０１を参照）。ＡＤＡＭ９と結合する抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、および他の企業から商業的に入手可能である。
しかしながら、過去のあらゆる進歩にもかかわらず、正常組織に対して最小の結合を示し、ヒトおよび非ヒトＡＤＡＭ９と同様の高い親和性で結合することが可能な高親和性ＡＤＡＭ９結合分子が依然として必要とされている。本発明はこの必要性やがんについての改善された治療法の必要性に取り組む。
本発明は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、および「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）と特異的に結合できる抗体を含む、単一特異的抗体および二重特異的、三重特異的または多重特異的結合分子などの分子を対象とする。本発明は特に、ヒトおよび非ヒトＡＤＡＭ９に対して高い親和性結合を示すことが可能な結合分子に関する。本発明はさらに詳細には、それによってヒトＡＤＡＭ９および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応性である分子に特に関する。本発明は更に、そのようなＡＤＡＭ９結合分子をレシピエント対象に投与した際に減少した免疫原性を示すようにヒト化および／または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）された軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むすべてのそのようなＡＤＡＭ９結合分子に関する。本発明はまた、そのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを含む医薬組成物、がんならびに他の疾患および状態の治療においてそのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを使用することを含む方法も対象とする。
詳細には、本発明はＡＤＡＭ９結合ドメインを含むＡＤＡＭ９結合分子を提供し、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインは軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、そのような重鎖可変ドメインはＣＤＲＨ１ドメインとＣＤＲＨ２ドメインとＣＤＲＨ３ドメインとを含み、そのような軽鎖可変ドメインはＣＤＲＬ１ドメインとＣＤＲＬ２ドメインとＣＤＲＬ３ドメインとを含み：
（Ａ）そのようなＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；そのようなＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する；または
（Ｂ）そのようなＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；そしてそのようなＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する；または
（Ｃ）そのようなＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；そしてそのようなＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する。
本発明は特に、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（Ａ）（１）ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメイン；ならびに
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
（Ｂ）（１）ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメイン；ならびに
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
（Ｃ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメイン；ならびに
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
（Ｄ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメイン；ならびに
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
（Ｅ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体のＶＬ軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を有する、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、そのようなＭＡＢ−Ａの最適化変異体のそのような重鎖可変（ＶＨ）ドメインが配列番号１５：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＸ １ ＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥ ＩＩＰＩＸ ２ ＧＨＴＮＹ ＮＥＸ ３ ＦＸ ４ Ｘ ５ ＲＦＴＩ ＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹ
ＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧ ＹＹＹＹＸ ６ Ｘ ７ Ｘ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１
ＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴ ＶＳＳ
のアミノ酸配列を含み、
ここで：Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６が独立して選択され、
Ｘ１はＭまたはＩである；Ｘ２はＮまたはＦであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＫまたはＱであり；Ｘ５はＳまたはＧであり、Ｘ６はＰ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤである；
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
Ｘ６がＰである場合；Ｘ７がＫまたはＲ；Ｘ８がＦまたはＭ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＷまたはＦ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合；Ｘ７がＮまたはＨ；Ｘ８がＳまたはＫ；Ｘ９がＧまたはＡ；Ｘ１０がＴまたはＶ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合；Ｘ７がＧ；Ｘ８がＫ；Ｘ９がＧまたはＡ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
Ｘ６がＴである場合；Ｘ７がＧであり；Ｘ８がＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＶまたはＴ；Ｘ１１がＬまたはＭ；
Ｘ６がＧである場合；Ｘ７がＧ；Ｘ８がＳ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＬ；
Ｘ６がＤである場合；Ｘ７がＳ；Ｘ８がＮ；Ｘ９がＡ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＬ
となるように選択される、全てのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、そのようなＭＡＢ−Ａの最適化変異体のそのような重鎖可変（ＶＨ）ドメインのそのようなＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインが、それぞれ：
（１）配列番号４７（ＳＹＷＸ１Ｈ）
ここで：Ｘ１はＭまたはＩである；
（２）配列番号４８（ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５）
ここで：Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は独立して選択され、
Ｘ２はＮまたはＦであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＫまたはＱである；そしてＸ５はＳまたはＧである；および
（３）配列番号４９（ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ）
ここで：Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
（Ａ）Ｘ６がＰである場合：
Ｘ７はＫまたはＲ；Ｘ８はＦまたはＭ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＷまたはＦ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｂ）Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合：
Ｘ７はＮまたはＨ；Ｘ８はＳまたはＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＴまたはＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｃ）Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合：
Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｄ）Ｘ６がＴである場合：
Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶまたはＴ；そしてＸ１１はＬまたはＭ；
（Ｅ）Ｘ６がＧである場合：
Ｘ７はＧ；Ｘ８はＳ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ；そして
（Ｆ）Ｘ６がＤである場合：
Ｘ７はＳ；Ｘ８はＮ；Ｘ９はＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ
のアミノ酸配列を有する、すべてのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＭＡＢ−Ａの最適化変異体のそのような重鎖可変（ＶＨ）ドメインが：
（１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号１６）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）（配列番号１８）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）（配列番号１９）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）；
（６）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）；
（７）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）；
（８）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）；
（９）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）；
（１０）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）；
（１１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）；
（１２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）；
（１３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）；および
（１４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）
からなる群から選択される、そのようなＡＤＡＭ９結合分子すべての実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが、配列番号５３のアミノ酸配列：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳ ＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴ ＩＳＣＸ １２ ＡＳＱＳＶＤ
ＹＸ １３ ＧＤＳＹＸ １４ ＮＷＹ ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬ ＬＩＹＡＡＳＤＬＥＳ
ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ ＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹ
ＹＣＱＱＳＸ １５ Ｘ １６ Ｘ １７ ＰＦ ＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩ Ｋ
を含み、ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は、独立して選択され、そして
Ｘ１２はＫまたはＲであり；Ｘ１３はＤまたはＳであり；Ｘ１４はＭまたはＬであり；Ｘ１５はＨまたはＹであり；Ｘ１６はＥまたはＳであり；そしてＸ１７はＤまたはＴである、
アミノ酸配列を含む、すべてのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、ＭＡＢ−Ａのそのような最適化変異体のそのような軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのそのようなＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメインがそれぞれ：
（１）配列番号６６（Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ）
ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は独立して選択され、そして
Ｘ１２はＫまたはＲであり；Ｘ１３はＤまたはＳであり；そしてＸ１４はＭまたはＬである；
（２）配列番号１３（ＡＡＳＤＬＥＳ）；および
（３）配列番号６７（ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ）
ここで：Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７，は独立して選択され、そして
Ｘ１５はＨまたはＹであり；Ｘ１６はＥまたはＳであり；そしてＸ１７はＤまたはＴである
アミノ酸配列を有するすべてのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、ＭＡＢ−Ａのそのような最適化変異体のそのような軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが：
（１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）（配列番号５６）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）（配列番号５７）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２Ａ）（配列番号２０）
からなる群から選択される、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（Ａ）（１）アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含むＣＤＲＨ１ドメイン；
（２）アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ２ドメイン；または
（３）アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含むＣＤＲＨ３ドメイン；
または
（Ｂ）（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含むＣＤＲＬ１ドメイン；
（２）アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲＬ２ドメイン；または
（３）アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ３ドメイン；
を含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、ＡＤＡＭ９結合ドメインは、アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含むＣＤＲＨ１ドメインと、アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ２ドメインと、アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含むＣＤＲＨ３ドメインとを含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、ＡＤＡＭ９結合ドメインが、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含むＣＤＲＬ１ドメインと、アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲＬ２ドメインと、アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ３ドメインとを含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（Ａ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）；または
（Ｂ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）；または
（Ｃ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）およびｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）
を含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６２、１３および１４、
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６３、１３および１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３６および１０ならびに配列番号６３、１３および１４；および
（ｄ）配列番号３４、３６および１０ならびに配列番号６４、１３および６５
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（ａ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８および配列番号５６；および
（ｄ）それぞれ、配列番号１９および配列番号５７
からなる群から選択される配列と少なとも９０％、少なとも９５％、または少なとも９９％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（ａ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８および配列番号５６；ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１９および配列番号５７
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが、ＭＡＢ−Ａと比較して、カニクイザルＡＤＡＭ９に対して結合親和性において少なとも１５０倍の増強を有し、ヒトＡＤＡＭ９に対して高い親和結合を保持する、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５および３７ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５および３８ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３５および３９ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｄ）それぞれ、配列番号８、３５および４０ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｅ）それぞれ、配列番号８、３５および４１ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｆ）それぞれ、配列番号８、３５および４２ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｇ）それぞれ、配列番号８、３５および４３ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｈ）それぞれ、配列番号８、３５および４４ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｉ）それぞれ、配列番号８、３５および４５ならびに配列番号６２、１３および１４；および
（ｊ）それぞれ、配列番号８、３５および４６ならびに配列番号６２、１３および１４
からなる群から選択される配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（ａ）それぞれ、配列番号２０および配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１および配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２および配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３および配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４および配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５および配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６および配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７および配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８および配列番号５５；および
（ｊ）それぞれ、配列番号２９および配列番号５５
からなる群から選択される配列に対して少なとも９０％、少なとも９５％、または少なとも９９％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合ドメインが：
（ａ）それぞれ、配列番号２０および配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１および配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２および配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３および配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４および配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５および配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６および配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７および配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８および配列番号５５；および
（ｊ）それぞれ、配列番号２９および配列番号５５
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子が単一特異性ＡＤＡＭ９結合抗体もしくはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであるか、またはそのような分子は二重特異的抗体である、全てのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子がダイアボディであり、そのようなダイアボディが２、３、４または５のポリペプチド鎖を含む共有結合した複合体である、全てのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子が三価結合分子であり、そのような三価結合分子が３、４、５、またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合した複合体である、全てのそのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、、そのような分子がアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関し、ここで、そのような分子がＦｃ領域を含むそのようなＡＤＭＡ）結合分子の実施形態に関し、特に、そのようなＦｃ領域が：
（ａ）ＦｃγＲの変異体Ｆｃ領域の親和性を減少させる１以上のアミノ酸修飾；および／または
（ｂ）そのようなＡＤＡＭ９結合分子の血清半減期を増強する１以上のアミノ酸修飾
を含む変異体Ｆｃ領域である実施形態に関する。
本発明はさらに、ＦｃγＲの変異体Ｆｃ領域の親和性を減少させるそのような１以上のアミノ酸修飾が：
（Ａ）Ｌ２３４Ａ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ａ；または
（Ｃ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ
を含み；
ここで、そのようなナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合分子の血清半減期を増強する１以上のそのようなアミノ酸修飾が：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ；
（Ｂ）Ｍ２５２ＹおよびＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２ＹおよびＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ；または
（Ｅ）Ｋ２８８ＤおよびＨ４３５Ｋ
を含み；
ここで、そのようなナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子が二重特異的であり、ＡＤＡＭ９のエピトープに対して免疫特異的結合可能なエピトープ結合部位と、エフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープに対して免疫特異的結合可能なエピトープ結合部位とを含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子が、ＡＤＡＭ９のエピトープ（複数可）に対して免疫特異的結合可能な２つのエピトープ結合部位と、エフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープ（複数可）に対して免疫特異的結合可能な２つのエピトープ結合部位とを含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態にする。
本発明はさらに、そのような分子が三重特異的であり：
（ａ）ＡＤＡＭ９のエピトープに対して免疫特異的結合可能な１つのエピトープ結合部位と、
（ｂ）第一エフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープに対して免疫特異的結合可能な１つのエピトープ結合部位と、
（ｃ）エフェクター細胞の表面上に存在する第二分子のエピトープに対して免疫特異的結合可能な１つのエピトープ結合部位と、
を含む、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのような分子がＡＤＡＭ９およびエフェクター細胞の表面上に存在するそのような分子と同時に結合することが可能である、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、エフェクター細胞の表面上に祖納するそのような分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲ、またはＮＫＧ２Ｄである、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなエフェクター細胞が細胞毒性Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、エフェクター細胞の表面上に存在するそのような第一分子がＣＤ３であり、エフェクター細胞の表面上に存在するそのような第二分子がＣＤ８である、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、そのようなＡＤＡＭ９結合分子が、ＡＤＡＭ９を発現する細胞および細胞毒性Ｔ細胞の配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）を媒介する、ＡＤＡＭ９結合分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、前記ＡＤＡＭ９結合分子のいずれかの有効量と、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
本発明はさらに、前記ＡＤＡＭ９結合分子のいずれかの使用、あるいはＡＤＡＭ９の発現に関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患もしくは状態の治療における前記医薬組成物の使用に関する。
本発明は特に、ＡＤＡＭ９の発現に関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患もしくは状態ががんであり、特にそのようながんが：膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん（特に、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮癌）、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、非小細胞肺がん（特に、扁平上皮癌、腺癌、または未分化大細胞がん）、骨髄がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、甲状腺がん、睾丸がん、および子宮がんからなる群から選択される使用に関する。
本発明はさらに、対象におけるＡＤＡＭ９の発現に関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患もしくは状態を治療するための方法であって、そのような対象に、有効量の前記ＡＤＡＭ９結合分子のいずれか、または前記医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法に関する。
本発明は、特に、ＡＤＡＭ９の発現に関連するかまたはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患もしくは状態ががんである方法、特にそのようながんが：膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん（特に腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮癌）、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、非小細胞肺がん（特に扁平上皮癌、腺癌、または未分化大細胞がん）、骨髄がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、甲状腺がん、睾丸がん、および子宮がんからなる群から選択される方法に関する。
図１は、各々、ＥコイルまたはＫコイルヘテロダイマー促進ドメイン（代替的ヘテロダイマー促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖から構成される２つのエピトープ結合部位を有する代表的な共有結合したダイアボディの概略図を提供する。システイン残基は、図３Ｂに示すようにリンカー中および／またはヘテロダイマー促進ドメイン中に存在し得る。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。 図２は、結合した鎖がＦｃ領域の全体または一部を形成するように、各々がＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖から構成される２つのエピトープ結合部位を有する代表的な共有結合したダイアボディ分子の概略図を提供する。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。 図３Ａ〜３Ｃは、２対のポリペプチド鎖（すなわち、合計４つのポリペプチド鎖）から構成される４つのエピトープ結合部位を有する代表的な共有結合した四価ダイアボディを示す概略図を提供する。各対の１つのポリペプチドは結合した鎖がＦｃ領域の全体または一部を形成するようにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。２対のポリペプチド鎖は同じであってよい。２対のポリペプチド鎖が同じであり、ＶＬおよびＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態において（図３Ａ〜３Ｂに示すとおり）、結果として得られる分子は４つの結合部位を有し、各結合したエピトープに関して二重特異的かつ二価である。ＶＬおよびＶＨドメインが同じエピトープを認識する実施形態において（例えば、同じＶＬドメインＣＤＲおよび同じＶＨドメインＣＤＲを両鎖に関して使用する）、結果として得られる分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一のエピトープに関して単一特異性かつ四価である。あるいは、２対のポリペプチドは異なっていてもよい。２対のポリペプチド鎖が異なり、各対のポリペプチドのＶＬおよびＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態において（図３Ｃで異なる濃淡およびパターンによって示すとおり）、結果として得られる分子は４つのエピトープ結合部位を有し、各結合したエピトープに関して四重特異的かつ一価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロダイマー促進ドメインを含むＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図３Ｂは、Ｆｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基およびリンカー（任意のシステイン残基を有する）を含むＥコイルおよびＫコイルヘテロダイマー促進ドメインを含む。図３ＣはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは抗体ＣＨ１およびＣＬドメインを含む。 図４Ａ〜４Ｂは、３つのポリペプチド鎖から構成される２つのエピトープ結合部位を有する代表的な共有結合したダイアボディ分子の概略図を提供する。ポリペプチド鎖のうちの２つは、結合した鎖がＦｃ領域の全体または一部を形成するようにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。ＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチド鎖はさらにヘテロダイマー促進ドメインを含む。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。 図５は、５つのポリペプチド鎖から構成される４つのエピトープ結合部位を有する代表的な共有結合したダイアボディ分子の概略図を提供する。ポリペプチド鎖のうちの２つは、結合した鎖がＦｃ領域の全体または一部を含むＦｃ領域を形成するようにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。連結したＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチド鎖はさらにヘテロダイマー促進ドメインを含む。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。 図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合部位を有する代表的なＦｃ領域含有三価結合分子の概略図を提供する。図６Ａおよび６Ｂは、それぞれ、２つのダイアボディ型結合ドメインとダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対してＮ末端またはＣ末端である異なるドメイン配向を有するＦａｂ型結合ドメインとを含む三価結合分子のドメインを概略的に示す。図６Ａおよび６Ｂ中の分子は四本の鎖を含む。図６Ｃおよび６Ｄは、それぞれ、Ｆｃ領域に対してＮ末端の２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖および重鎖がポリペプチドスペーサーを介して連結しているＦａｂ型結合ドメイン、またはｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む三価結合分子のドメインを概略的に示す。図６Ｅおよび６Ｆ中の三価結合分子は、それぞれ、Ｆｃ領域に対してＣ末端の２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖および重鎖がポリペプチドスペーサーを介して連結しているＦａｂ型結合ドメイン、またはｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む三価結合分子のドメインを概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆ中の三価結合分子は三本の鎖を含む。同じエピトープを認識するＶＬおよびＶＨドメインは同じ濃淡または塗りつぶしパターンを用いて示す。 図７Ａ〜７Ｃは、免疫組織化学（ＩＨＣ）研究の結果を提示し、ＭＡＢ−Ａが様々な非小細胞肺がんタイプ（図７Ａ、パネル１〜８）、乳がん細胞、前立腺がん細胞、胃がん細胞（図７Ｂ、パネル１〜６）、および結腸がん細胞（図７Ｃ、パネル１〜８）を特異的に標識できる能力を示し、その一方で、アイソタイプ対照はこれらのがん細胞タイプのいずれも特異的に標識できなかった（図７Ａ〜７Ｃ）。 図８Ａ〜８Ｂは細胞染色研究の結果を提示し、ＭＡＢ−Ａが、２９３−ＦＴおよびＣＨＯ−Ｋ細胞の表面上で一時的に発現された、ヒトＡＤＡＭ９と結合し、それより低い程度でカニクイザルＡＤＡＭ９と結合することを示す（それぞれ図８Ａおよび図８Ｂ）。 図９Ａ〜９Ｂは、ＭＡＢ−Ａのいくつかのヒト化／最適化変異体と整列させたネズミ抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列（図９Ａ、配列番号７、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３および２８）と、ＭＡＢ−Ａのいくつかのヒト化／最適化変異体と整列させたネズミ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメイン（図９Ｂ、配列番号１１、５１、５２、５３および５４）とを示す。最初の最適化の間にＣＤＲ内で置換された位置を以下のように下線で示す：潜在的な脱アミド化および異性化（ｉｓｏｍｅｒａｔｉｏｎ）部位を一重線の下線で示し、リジン残基を二重線の下線で示し、さらなる不安定残基を二重の鎖線の下線で示す。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ＣＤＲＨ３変異体、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、およびアイソタイプ対照抗体を含む、１０の選択された最適化ｈＭＡＢ−ＡクローンのＥＬＩＳＡ結合曲線を提示する。図１０ＡはｃｙｎｏＡＤＡＭ９の結合曲線を提示し、図１０ＢはｈｕＡＤＡＭ９の結合曲線を提示する。
本発明は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、および「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）と特異的に結合できる抗体を含む、単一特異的抗体および二重特異的、三重特異的または多重特異的結合分子などの分子を対象とする。本発明は特に、ヒトおよび非ヒトＡＤＡＭ９に対して高い親和性結合を示すことができる結合分子に関する。本発明はさらに詳細には、それによって、ヒトＡＤＡＭ９および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応性である分子に関する。本発明はさらに、レシピエント対象に対してそのようなＡＤＡＭ９結合分子を投与した際に減少した免疫原性を示すようにヒト化および／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むすべての分子に関する。本発明はまた、そのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを含む医薬組成物、がんならびに他の疾患および状態の治療におけるそのようなＡＤＡＭ９結合分子のいずれかの使用を含む方法に関する。
Ｉ．抗体およびそれれらの結合ドメイン
本発明の抗体は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に対して、少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的結合可能な、イムノグロブリン分子の可変ドメイン中に位置するイムノグロブリン分子である。本明細書中で用いられる場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙおよびａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という語は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ´）フラグメント、ジスルフィド結合した二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。特に、「抗体」という語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、エピトープ結合部位を含む分子を包含する。イムノグロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。この数十年で、治療的に見込みのある抗体への関心が再燃しており、抗体はトップクラスのバイオテクノロジー由来の薬物のうちの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。診断法におけるそれらの使用に加えて、抗体は治療薬として有用であることが証明されている。２００を超える抗体に基づく薬物が、使用について認可されているか、または開発中である。
抗体は、特定のドメインまたは部分またはコンフォメーション（「エピトープ」）がそのような分子上に存在するために、ポリペプチドもしくはタンパク質または非タンパク質分子と「免疫特異的に結合すること」が可能である。エピトープ含有分子は、動物において抗体産生応答を誘発するように、免疫原性活性を有し得る；そのような分子を「抗原」と称する。本明細書中で用いられる場合、抗体、ダイアボディまたは他のエピトープ結合分子は、もう一つの分子の領域（すなわち、エピトープ）と、別のエピトープと比べて当該エピトープとより高頻度に、より迅速に、より長期間および／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、「免疫特異的に」結合するといわれる。例えば、ウイルスエピトープと免疫特異的に結合する抗体は、それが他のウイルスエピトープまたは非ウイルスエピトープと免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）で、より容易に、および／またはより長い期間、当該ウイルスのエピトープと結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第一標的と免疫特異的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第二標的と特異的または優先的に結合してもよいし、しなくてもよいということも理解される。したがって、特定のエピトープに対する「免疫特異的結合」は当該エピトープに対する排他的結合を（含み得るが）必ずしも必要としない。概して、必ずしもそうとは限らないが、結合に対する言及は、「免疫特異的」結合を意味する。２つの分子は、受容体がそれら各々のリガンドに結合する特異性をそのような結合が示す場合、「生理特異的（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」な方法で互いに結合することができるといわれる。
「モノクローナル抗体」という用語は、モノクローナル抗体が抗原の選択的結合に関与するアミノ酸（自然発生的または非自然発生的）から構成される均一抗体集団を指す。モノクローナル抗体は高度に特異性であり、単一のエピトープ（または抗原部位）に対するものである。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体や完全長モノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原認識部位および抗原と結合する能力を含むイムノグロブリン分子の任意の他の修飾立体配置を包含する。この用語は、抗体の供給源またはそれが作製される方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定されることを意図しない。この語は、「抗体」の定義の下で前記の全イムノグロブリンならびにフラグメントなどを包含する。モノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。採用できる一方法はKohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法またはその変形である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラットまたはウサギで発生する。抗体は、所望のエピトープを含む免疫原性量の細胞、細胞抽出物、またはタンパク質調製物で動物を免疫化することによって産生される。免疫原は、限定されるものではないが、初代細胞、培養細胞株、がん性細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、または組織であり得る。免疫化のために使用される細胞は、免疫原としてのそれらの使用に先立ってある期間（例えば、少なとも２４時間）培養することができる。細胞は単独で、またはＲｉｂｉなどの非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用することができる（例えば、Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125を参照）。概して、細胞は、インタクトで保持すべきであり、好ましくは免疫原として使用する場合、生存可能である。インタクトな細胞は、抗原が免疫化動物によって破裂細胞よりも良好に検出されることを可能にできる。変性または過酷な（ｈａｒｓｈ）アジュバント、例えばフロイドアジュバントの使用は、細胞を破裂させる可能性があり、したがって推奨されない。免疫原は、複数回、定期的な間隔で、例えば週に２回、もしくは毎週投与することができるか、または動物において（例えば、組織組換え体において）生存能力を維持するような方法で投与することができる。別法として、既存のモノクローナル抗体および所望の病原性エピトープについて免疫特異的である任意の他の等価な抗体を配列決定することができ、当該技術分野において公知の任意の手段によって組換え的に産生することができる。一実施形態において、そのような抗体は配列決定され、ポリヌクレオチド配列を次いで発現または増殖のためにベクター中にクローニングする。関心対象の抗体をコード化する配列は宿主細胞においてベクター中に維持することができ、宿主細胞を次いで膨張させ、将来の使用のために凍結させることができる。そのような抗体のポリヌクレオチド配列を遺伝子操作のために使用して、本発明の単一特異性または多重特異的（例えば、二重特異的、三重特異的および四重特異的）分子ならびに親和性最適化、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／またはイヌ化（ｃａｎｉｎｉｚｅｄ）抗体を生成して、抗体の親和性、または他の特性を改善することができる。抗体をヒト化する際の一般的原則は、抗体の抗原結合部分の基本配列を保持し、その一方で、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換することを含む。
自然抗体（例えば自然ＩｇＧ抗体）は、２つの「重鎖」と複合体形成した２つの「軽鎖」から構成される。各軽鎖は可変ドメイン（「ＶＬ」）と定常ドメイン（「ＣＬ」）とを含む。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨ」）と３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」）とＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）とを含む。自然発生的なイムノグロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本構造単位は、したがって、２つの軽鎖と２つの重鎖とを有するテトラマーであり、通常、約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として表される。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメインとヒンジ領域とを有する。したがって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃである（式中、ｎおよびｃは、各々、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端を表す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、１つ、２つ、そして最も一般的には３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」、すなわち、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）からなり、これらは、エピトープと接触した残基と非ＣＤＲセグメントとを含み、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれ、これらは概して構造を維持し、（ある特定のフレームワーク残基はエピトープとも接触し得るが）そのような接触を可能とするようにＣＤＲ領域の位置を決定する。したがって、ＶＬおよびＶＨドメインは、典型的には構造：ｎ−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−ｃ（式中、「ｎ」はＮ末端を意味し、「ｃ」はＣ末端を意味する）を有する。抗体の軽鎖の第１、第２、第３、および第４ＦＲである（または抗体の軽鎖の第１、第２、第３、および第４ＦＲとして機能し得る）ポリペプチドを、本明細書中では各々：ＦＲＬ１ドメイン、ＦＲＬ２ドメイン、ＦＲＬ３ドメイン、およびＦＲＬ４ドメインと指定する。同様に、抗体の重鎖の第１、第２、第３、および第４ＦＲである（または抗体の重鎖の第１、第２、第３、および第４ＦＲとして機能し得る）ポリペプチドを、本明細書中では各々：ＦＲＨ１ドメイン、ＦＲＨ２ドメイン、ＦＲＨ３ドメインおよびＦＲＨ４ドメインと指定する。抗体の軽鎖の第一、第二および第三ＣＤＲである（または抗体の軽鎖の第１、第２および第３ＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドを、本明細書中では各々：ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインと指定する。同様に、抗体の重鎖の第１、第２および第３ＣＤＲである（または抗体の重鎖の第１、第２および第３ＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドを、それぞれ本明細書では：ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインとして指定する。したがって、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、ＣＤＲＬ３ドメイン、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインという用語は、タンパク質中に組み込まれた場合に、そのようなタンパク質が軽鎖および重鎖を有する抗体であるか、またはダイアボディもしくは単鎖結合分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＢｉＴｅなど）であるか、または別の種類のタンパク質であるかにかかわらず、そのタンパク質が特定のエピトープに結合することができるようにするポリペプチドを対象とする。
したがって、本明細書中で用いられる場合、「エピトープ結合フラグメント」という語は、エピトープと免疫特異的に結合することが可能な抗体のフラグメントを意味し、「エピトープ結合部位」という語は、エピトープ結合フラグメントを含む分子の部分を指す。エピトープ結合フラグメントは抗体のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのＣＤＲドメインを含み得るか、または抗体のＣＤＲドメインの６つ全てを含み得、そのようなエピトープに免疫特異的に結合することが可能であるが、そのような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対して免疫特異性、親和性または選択性を示し得る。しかしながら、好ましくは、エピトープ結合フラグメントはそのような抗体のＣＤＲドメインの６つ全てを含む。抗体のエピトープ結合フラグメントは単一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）であってもよいし、または、各々がアミノ末端とカルボキシ末端とを有する２以上のポリペプチド鎖を含んでもよい（例えば、ダイアボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントなど）。特に記載しない限り、本明細書中で記載するタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端へ」の方向である。
本発明は特に、本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む単鎖可変ドメインフラグメント（「ｓｃＦｖ」）ならびにそのような抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む多重特異的結合分子を包含する。単鎖可変ドメインフラグメントは、短い「リンカー」ペプチドを使用して一緒に連結されるＶＬおよびＶＨドメインを含む。そのようなリンカーは、例えば、薬物の結合を可能にする、または固体担体の結合を可能にするなど、さらなる機能を提供するように修飾することができる。単鎖変異体は、組換えによるかまたは合成によるかのいずれかで産生することができる。ｓｃＦｖの合成的産生には自動合成器を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物のいずれかの好適な宿主細胞に導入することができる。関心対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通例の操作によって作製することができる。結果として得られるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的タンパク質精製技術を使用して単離することができる。
本発明はまた、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体のヒト化変異体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３ドメイン、ならびにそのようなＣＤＲＬのいずれか１、２、または３つを含むＶＬドメインおよびそのようなＣＤＲＨのいずれか１、２、または３つを含むＶＨドメインならびにそれを含む多重特異的結合分子も特に包含する。「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト種からのイムノグロブリンのエピトープ結合部位とヒトイムノグロブリンの構造および／または配列に基づく残りのイムノグロブリン構造とを有するキメラ分子を指す。ヒト化抗体は概して組換え技術を使用して調製される。本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体には、本明細書中で「ＭＡＢ−Ａ」と指定される抗体のヒト化、キメラまたはイヌ化変異体が含まれる。ＭＡＢ−Ａの可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作のために使用して、改善または変更された特徴（例えば、親和性、交差反応性、特異性など）を有するＭＡＢ−Ａ誘導体を生成することができる。抗体をヒト化する際の一般的原則は、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換する一方で、抗体のエピトープ結合部分の基本配列を保持することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するための４つの一般的ステップがある。これらは：（１）出発抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定し；（２）ヒト化抗体またはイヌ化抗体を設計し、すなわち、ヒト化またはイヌ化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定し；（３）実際のヒト化またはイヌ化方法／技術を採用し；そして（４）ヒト化抗体をトランスフェクトし発現することである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，８０７，７１５号；同第５，８６６，６９２号；および同第６，３３１，４１５号を参照。「最適化」抗体という語は、親抗体と比べてヒトＡＤＡＭ９および／またはカニクイザルＡＤＡＭ９に対してより高い結合親和性、（例えば、２倍以上）高い結合親和性を付与する、軽または重鎖可変領域において少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）で親抗体と異なる少なくとも１つのアミノ酸を有する抗体を指す。本明細書中で提示される教示から、本発明の抗体がヒト化、最適化、またはヒト化且つ最適化されてもよいことが理解されるであろう。
エピトープ結合部位は、１以上の定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または適切なフレームワーク領域にグラフトしたそのような可変ドメインのＣＤＲのみのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもよいし、または１以上のアミノ酸置換、挿入もしくは欠失によって修飾されてもよい。そのような作用は、定常領域がレシピエント（例えば、ヒト個人）において免疫原として機能する能力を部分的または完全に排除するが、外来可変ドメインに対する免疫応答の可能性が残っている（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチはヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変ドメインを修飾してヒトイムノグロブリンにおいて見出される形態に可能な限り近くそれらを再成形することにも同様に焦点を当てる。抗体の軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、４つのフレームワーク領域に隣接する、問題となる抗原に応答して変化し結合能を決定する３つのＣＤＲを含み、それらは所与の種において比較的保存され、推定上ＣＤＲの足場を提供することが知られている。非ヒト抗体を特定の抗原に関して調製する場合、可変ドメインは、修飾されるヒト抗体中に存在するＦＲ上に非ヒト抗体から誘導されるＣＤＲをグラフトすることによって「再形成」または「ヒト化」することができる。このアプローチを様々な抗体に適用することが、Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列（例えば、ネズミ抗体中に存在するＣＤＲの６つ全てを含むヒト化ネズミ抗体）を保存する。他の実施形態において、ヒト化抗体は、もとの抗体のＣＤＲに対して配列が異なる１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６）を有する。
齧歯類または修飾された齧歯類可変ドメインおよびヒト定常ドメインと融合したそれらの関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体を含む非ヒトイムノグロブリン由来のエピトープ結合部位を含む多数のヒト化抗体分子が記載されている（例えば、Winter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538; and Brown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前にヒト担持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされた齧歯類ＣＤＲを記載している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の文献は、組換えベニヤ化（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｖｅｎｅｅｒｅｄ）齧歯類フレームワーク領域によって担持された齧歯類ＣＤＲを記載している（例えば、欧州特許公開第５１９，５９６号を参照）。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療応用の期間および有効性を限定する、齧歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫応答を最小限に抑えるように設計される。さらに利用できるヒト化抗体の他の方法が、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 ならびに米国特許第６，１８０，３７７号；同第６，０５４，２９７号；同第５，９９７，８６７号；および同第５，８６６，６９２号で開示されている。
ＩＩ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
抗体の２つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは相互作用して「Ｆｃ領域」を形成し、これは、限定されるものではないが、Ｆｃγ受容体（「ＦｃγＲ」）をはじめとする細胞性「Ｆｃ受容体」によって認識されるドメインである。本明細書中で用いられる場合、「Ｆｃ領域」は、当該鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が特定のＩｇＧアイソタイプ、クラスまたはサブクラスに対して、他のＩｇＧアイソタイプと比較して最も相同性であるならば、その特定のＩｇＧアイソタイプ、クラスまたはサブクラスのものであるとされる。
例示的ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔで記載されるようなＥＵ指数でナンバリングされた（配列番号１）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
例示的ヒトＩｇＧ２のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔで記載されるＥＵ指数によってナンバリングされた、（配列番号２）：
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
例示的ヒトＩｇＧ３のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔで記載されるようなＥＵ指数でナンバリングされた（配列番号３）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
例示的ヒトＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔで記載されるようなＥＵ指数でナンバリングされた（配列番号４）：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本明細書全体にわたって、ＩｇＧ重鎖の定常領域における残基のナンバリングは、参照により明確に本明細書中に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」）におけるようにＥＵ指数のナンバリングである。「Ｋａｂａｔで記載されるようなＥＵ指数」という語は、Ｋａｂａｔで提供されるヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の定常ドメインのナンバリングを指す。イムノグロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖におけるアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体の多くのアミノ酸配列を記載し、各サブグループについてアミノ酸コンセンサス配列を特定し、各アミノ酸に対して残基数を割りあて、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されるように特定される（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ． ＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲＨ１は５残基前で開始すると理解される）。Ｋａｂａｔのナンバリングスキームは、保存されたアミノ酸を参照することによってＫａｂａｔにおけるコンセンサス配列のうちの１つと問題の抗体を整列することによって彼の一覧表に含まれない抗体に拡張可能である。残基番号を割り当てるためのこの方法は、当該分野で標準的になっており、キメラまたはヒト化変異体を含む、異なる抗体における同等の位置におけるアミノ酸を容易に特定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の位置５０におけるアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の位置５０におけるアミノ酸と同等な位置を占める。
多形性は抗体定常領域内の多数の異なる位置で観察され（例えば、限定されるものではないが、Ｋａｂａｔで記載されているようなＥＵ指数によってナンバリングすると、位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８を含むＦｃ位置）、したがって、提示した配列と先行技術における配列との間に若干の差が存在し得る。ヒトイムノグロブリンの多形相は充分に特徴づけられている。現在のところ、１８Ｇｍアロタイプが知られている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ３、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Lefranc, et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function And Regulation.” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。本発明の抗体は、任意のイムノグロブリン遺伝子の任意のアロタイプ、イソアロタイプ、またはハプロタイプを組み入れてもよく、本明細書中で提供される配列のアロタイプ、イソアロタイプまたはハプロタイプに限定されないことが特に想定される。さらに、いくつかの発現系において、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記では太字）は翻訳後に除去することができる。したがって、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基は本発明のＡＤＡＭ９結合分子中の任意のアミノ酸残基である。本発明に特に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基を欠いたＡＤＡＭ９結合分子である。ＣＨ３ドメインのＣ末端リジン残基を含むそのような構築物も本発明に特に包含される。
前述の様に、天然のＩｇＧ抗体のＦｃ領域は細胞Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対して結合が可能である。そのような結合の結果、免疫系への活性化または阻害シグナルの変換がもたらされる。そのような結合が正反対の機能をもたらす能力は、異なるＦｃγＲ間の構造的差異を反映し、特に結合するＦｃγＲが免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）または免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（「ＩＴＩＭ」）を有するか否かを反映する。異なる細胞質酵素のこれらの構造への動員は、ＦｃγＲで媒介される細胞応答の成果を決定する。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、Ｆｃ領域（例えば、免疫複合体中に存在する凝集Ｆｃ領域）と結合した場合、免疫化を活性化する。ＦｃγＲＩＩＢは、現在公知の唯一の天然のＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり；それは凝集Ｆｃ領域と結合した場合に免疫系を抑制または阻害する働きをする。ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体を介したＦｃγＲＩＩＡクラスタリングまたは特異抗体架橋は、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼを用いてＩＴＡＭを凝集させる役割を果たし、ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼのドッキング部位としての役割を果たし、その活性化の結果、下流基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）が活性化される。細胞の活性化は炎症誘発性メディエータの放出に至る。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上で発現され；その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡに対して９６％同一であり、識別不可能な方法でＩｇＧ複合体と結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメインにおけるＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲのこの阻害サブクラスを規定する。近年、この阻害の分子基盤が確立された。活性化ＦｃγＲとともに共ライゲートされた場合、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化されるようになり、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ媒介性チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解するイノシトールポリホスフェート５’−ホスファターゼのＳＨ２ドメイン（ＳＨＩＰ）を引き付け、結果として、細胞内Ｃａ＋＋の流入を防止する。したがって、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化応答を抑制し、細胞応答性を阻害する。Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌はこのように消失する。
ＩＩＩ．二重特異的抗体、多重特異的ダイアボディおよびＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープと結合する能力は、抗体のＶＬおよびＶＨドメインの存在およびアミノ酸配列に依存する。抗体の軽鎖および重鎖の相互作用、および特に、そのＶＬおよびＶＨドメインの相互作用は、ＩｇＧなどの天然抗体の２つのエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。自然抗体は１つのエピトープ種だけと結合することが可能（すなわち、それらは単一特異性）であるが、それらはそのエピトープ種の複数のコピーと結合することができる（すなわち、二価性または多価性を示す）。
抗体の機能性は、２つの別個の独立した抗原（または同じ抗原の異なるエピトープ）と同時に結合できる多重特異的抗体に基づく分子を生成することにより、および／または同じエピトープおよび／または抗原に対してより高い価数（すなわち、２つより多い結合部位）を有する抗体に基づく分子を生成することにより、増強することができる。
自然抗体よりも高い能力を有する分子を提供するために、様々な組換え二重特異的抗体フォーマットが開発され（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／０７０５６５号を参照）、そのほとんどはさらなるエピトープ結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨなど）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）とまたはその内部に融合するために、または複数のエピトープ結合フラグメント（例えば、２つのＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ）を融合するためにリンカーペプチドを使用する。別のフォーマットは、エピトープ結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨなど）をＣＨ２−ＣＨ３ドメインなどのダイマー化ドメインまたは別のポリペプチドと融合するためにリンカーペプチドを使用する（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６Ａ国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号、国際公開第２００７／０４６８９３号を参照）。ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号および国際公開第２０１０／１３６１７２号は、ＣＬおよびＣＨ１ドメインがそれら各々の自然な位置から切り替えられ、ＶＬおよびＶＨドメインが多様化されて（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号を参照）、それらが１つより多い抗原と結合することが可能になっている三重特異的抗体を開示している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１３／１６３４２７号および国際公開第２０１３／１１９９０３号は、結合ドメインを含む融合タンパク質付加物を含むようにＣＨ２ドメインを修飾することを開示している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１０／０２８７９６号および国際公開第２０１０／０２８７９５号は、そのＦｃ領域がさらなるＶＬおよびＶＨドメインで置換されて三価結合分子を形成している組換え抗体を開示している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２００３／０２５０１８号および国際公開第２００３／０１２０６９号は、その個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含む組換えダイアボディを開示している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１３／００６５４４号は、ポリペプチド単鎖として合成され、その後、タンパク質分解されてヘテロダイマー構造を形成する多価Ｆａｂ分子を開示している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号および国際公開第１９９１／００３４９３号は、さらなる結合ドメインまたは官能基を抗体または抗体部分に付加すること（例えば、ダイアボディを抗体の軽鎖に付加すること、またはさらなるＶＬおよびＶＨドメインを抗体の軽鎖および重鎖に付加すること、または異種融合タンパク質を付加することまたは複数のＦａｂドメインを互いに鎖状に連結すること）を開示している。
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメインフラグメント（ｓｃＦｖ）として知られる抗体誘導体に基づく。そのような分子は短い連結ペプチドを用いて軽および／または重鎖可変ドメインを連結することによって作製される。Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）（“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）は、一つの可変ドメインのカルボキシ末端と他の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーが設計され、使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは次に、薬物の結合または固体担体への結合などのさらなる機能のために修飾することができる。単鎖変異体は、組換えによるかまたは合成によるかのいずれかで産生することができる。ｓｃＦｖの合成的産生には、自動合成器を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物のいずれかの好適な宿主細胞に導入することができる。関心対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通例の操作によって作製することができる。結果として得られるｓｃＦｖは当該技術分野で公知の標準的タンパク質精製技術を用いて単離することができる。
当該技術者は、そのような自然抗体とは２以上の異なるエピトープ種と結合可能である（すなわち、二価性または多価性に加えて二重特異性または多重特異性を示す）点で異なるダイアボディを産生できることが分かっている（例えば、Holliger, P. et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
二重特異的結合分子（例えば、非単一特異性ダイアボディ）の提供は、限定されるものではないが、異なるエピトープを発現する異なる細胞を共ライゲートおよび／もしくは共局在化させるために十分な「トランス」結合能ならびに／または同じ細胞によって発現される異なる分子を共ライゲートおよび／もしくは共局在化させるために十分な「シス」結合能をはじめとする、抗体よりも優れた顕著な利点を提供する。二重特異的結合分子（例えば、非単一特異性ダイアボディ）は、したがって、療法および免疫診断をはじめとする広範囲にわたって応用される。二重特異性によって、様々な応用におけるダイアボディの設計およびエンジニアリングにおいて高い柔軟性が可能になり、マルチマー抗原に対する増強された結合活性、異なる抗原の架橋、および両標的抗原の存在に依存した特定の細胞型に対する定方向ターゲティングを提供する。それらの増大した価数、低解離速度および循環からの迅速なクリアランスに起因して（約５０ｋＤａ以下の小さなサイズのダイアボディについて）、当該技術分野で公知のダイアボディ分子はまた、腫瘍イメージングの分野における特定の使用が示されている（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225）。
二重特異的ダイアボディを産生する能力は、例えば、異なる細胞の表面上に存在する受容体を共ライゲートすることによって、２つの細胞をあわせて共ライゲート（例えば、細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞と架橋）する（「トランス」での）それらの使用に至る（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631; Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; and Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。代替的に（または付加的に）、二重特異的（または三重特異的もしくは三重特異的多重特異的）ダイアボディを、同じ細胞の表面上に存在する受容体などの分子を共ライゲートするために（「シス」において）使用することができる。異なる細胞および／または受容体の共ライゲーションは、エフェクター機能および／または免疫細胞シグナリングを調整するために有用である。エピトープ結合部位を含む多重特異的分子（例えば、二重特異的ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞または他の単核細胞上で発現されるＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなどなどの任意の免疫細胞の表面決定因子に向けることができる。特に、免疫エフェクター細胞上に存在する細胞表面受容体に向けられたエピトープ結合部位は、再指示された細胞殺滅を媒介することが可能な多重特異的結合分子の生成において有用である。
しかしながら、前記利点はかなりの費用を伴う。そのような非単一特異性ダイアボディの形成は、２以上の別個の異なるポリペプチドのアセンブリの成功を必要とする（すなわち、そのような形成は、ダイアボディが異なるポリペプチド鎖種のヘテロダイマー化を通して形成されることを必要とする）。この事実は、同じポリペプチド鎖のホモダイマー化により形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するためには少なとも２つの異なるポリペプチド（すなわち、２つのポリペプチド種）が提供されなければならないので、また、そのようなポリペプチドのホモダイマー化は不活性な分子をもたらすので（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）、そのようなポリペプチドの産生は、同じ種のポリペプチド間の共有結合を防止する方法で（すなわち、ホモダイマー化を防止するように）行われなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。当該技術分野ではそのようなポリペプチドの非共有結合性会合を教示されている（例えば、Olafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; and Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
しかしながら、当該技術者は、非共有結合ポリペプチドから構成された二重特異的ダイアボディが不安定で、容易に解離して非機能的モノマーになることを認識している（例えば、Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
この課題に直面して、当該技術者は、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディと称する安定な共有結合したヘテロダイマー性非単一特異性ダイアボディの開発に成功している；例えば、米国特許第９，２９６，８１６号および同第９，２８４，３７５号ならびに米国特許公開第２０１５／０１７５６９７号；同第２０１４／０２５５４０７号；同第２０１４／００９９３１８号；同第２０１３／０２９５１２１；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；同第２０１０／０１７４０５３号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；同第２００９／００６０９１０号；同第２００７−０００４９０９号；欧州特許公開番号ＥＰ２７１４０７９；ＥＰ２６０１２１６；ＥＰ２３７６１０９；ＥＰ２１５８２２１；ＥＰ１８６８６５０；ならびにＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２００６／１１３６６５号；ならびにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; and Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449を参照）。そのようなダイアボディは、２以上の共有結合的に複合体形成したポリペプチドを含み、１以上のシステイン残基を操作して、ジスルフィド結合が形成されるのを可能にする採用されたポリペプチドの各々を得、それによりそのようなポリペプチド鎖の１以上の対が互いに共有結合することを含む。例えば、システイン残基をそのような構築物のＣ末端に付加することは、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能にし、ダイアボディの結合特性を妨害することなく、結果として得られるダイアボディを安定化することが示されている。そのような分子は二重特異的（または多重特異的）にすることができ、したがって、２以上の分子を共ライゲートさせることができる。そのような共ライゲーションにより増強された免疫療法を提供することが可能になる。さらに、そのような分子の個々のポリペプチド鎖は共有結合した複合体を形成するので、分子は非共有結合したポリペプチド鎖を含むダイアボディよりもはるかに高い安定性を示す。
近年、２つのダイアボディ型結合ドメインおよび１つの非ダイアボディ型ドメインおよびＦｃ領域を組み入れた三価および多価分子が記載されている（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１５／１８４２０７号および国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。そのような結合分子を利用して単一特異的、二重特異的または三重特異的分子を生成することができる。３つの異なるエピトープと結合する能力は増強された能力を提供する。
別の構築物は、限定されるものではないが、各々がＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、およびＶＬ２ドメインを有する２つの同一のポリペプチド鎖のホモダイマー化によって形成される、「ＴａｎｄＡｂ」とも称する四価直列型抗体を含む、四価分子が望ましいがＦｃは必要とされない用途について当該技術分野で公知である（例えば、米国特許公開第２００５−００７９１７０号、同第２００７−００３１４３６号、同第２０１０−００９９８５３号、同第２０１１−０２０６６７号、同第２０１３−０１８９２６３号；欧州特許公開番号ＥＰ１０７８００４号、ＥＰ２３７１８６６号、同第ＥＰ２３６１９３６号およびＥＰ１２９３５１４号；ＰＣＴ公開番号国際公開第１９９９／０５７１５０号、国際公開第２００３／０２５０１８号、および国際公開第２０１３／０１３７００号を参照）。
ＩＶ．ＡＤＡＭ９
代表的なヒトＡＤＡＭ９ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００３８０７、２８アミノ酸残基シグナル配列を含む、下線で示す）はアミノ酸配列（配列番号５）：
MGSGARFPSG TLRVRWLLLL GLVGPVLGAA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR LTRERREAPR PYSKQVSYVI
QAEGKEHIIH LERNKDLLPE DFVVYTYNKE GTLITDHPNI QNHCHYRGYV EGVHNSSIAL SDCFGLRGLL
HLENASYGIE PLQNSSHFEH IIYRMDDVYK EPLKCGVSNK DIEKETAKDE EEEPPSMTQL LRRRRAVLPQ
TRYVELFIVV DKERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIVGGAGDV
LGNFVQWREK FLITRRRHDS AQLVLKKGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGQITVET FASIVAHELG
HNLGMNHDDG RDCSCGAKSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF EKLTLNKGGN CLLNIPKPDE AYSAPSCGNK
LVDAGEECDC GTPKECELDP CCEGSTCKLK SFAECAYGDC CKDCRFLPGG TLCRGKTSEC DVPEYCNGSS
QFCQPDVFIQ NGYPCQNNKA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS KAKAAPKDCF IEVNSKGDRF GNCGFSGNEY
KKCATGNALC GKLQCENVQE IPVFGIVPAI IQTPSRGTKC WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TKCGAGKICR
NFQCVDASVL NYDCDVQKKC HGHGVCNSNK NCHCENGWAP PNCETKGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL
VFFFLIVPLI VCAIFIFIKR DQLWRSYFRK KRSQTYESDG KNQANPSRQP GSVPRHVSPV TPPREVPIYA
NRFAVPTYAA KQPQQFPSRP PPPQPKVSSQ GNLIPARPAP APPLYSSLT
を有する。
ＡＤＡＭ９（配列番号５）の８１９のアミノ酸残基のうち、残基１〜２８はシグナル配列であり、残基２９〜６９７は細胞外ドメインであり、残基６９８〜７１８は膜貫通ドメインであり、そして残基７１９〜８１９は細胞内ドメインである。３つの構造ドメインは細胞外ドメイン内に位置する：Ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ（Ｍ１２Ｂ）ファミリー亜鉛メタロプロテアーゼドメイン（およそ残基２１２〜４０６）；ディスインテグリンドメイン（およそ残基４２３〜４９７）；およびＥＧＦ様ドメイン（およそ残基６４４〜６９７）。多数の翻訳後修飾およびアイソフォームが特定されており、タンパク質はそれが原形質膜に到達して成熟タンパク質を生成する前にトランス−Ｇｏｌｇｉネットワーク中でタンパク質分解的に切断される。プロドメインの除去は２つの異なる部位での切断により起こる。プロドメインと触媒ドメインとの間の境界（Ａｒｇ−２０５／Ａｌａ−２０６）でフリンなどの前駆タンパク質転換酵素によって処理される可能性が高い。さらなる上流切断前駆タンパク質転換酵素部位（Ａｒｇ−５６／Ｇｌｕ−５７）はＡＤＡＭ９の活性化において重要な役割を有する。
代表的なカニクイザルＡＤＡＭ９ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＸＭ＿００５５６３１２６．２、可能な２８アミノ酸残基シグナル配列を含む、下線で示す）はアミノ酸配列（配列番号６）：
MGSGVGSPSG TLRVRWLLLL CLVGPVLGAA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR LTRERREAPR PYSKQVSYLI
QAEGKEHIIH LERNKDLLPE DFVVYTYNKE GTVITDHPNI QNHCHFRGYV EGVYNSSVAL SNCFGLRGLL
HLENASYGIE PLQNSSHFEH IIYRMDDVHK EPLKCGVSNK DIEKETTKDE EEEPPSMTQL LRRRRAVLPQ
TRYVELFIVV DKERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIAGGAGDV
LGNFVQWREK FLITRRRHDS AQLVLKKGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGHITVET FASIVAHELG
HNLGMNHDDG RDCSCGAKSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF EKLTLNKGGN CLLNIPKPDE AYSAPSCGNK
LVDAGEECDC GTPKECELDP CCEGSTCKLK SFAECAYGDC CKDCRFLPGG TLCRGKTSEC DVPEYCNGSS
QFCQPDVFIQ NGYPCQNNKA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS KAKAAPKDCF IEVNSKGDRF GNCGFSGNEY
KKCATGNALC GKLQCENVQE IPVFGIVPAI IQTPSRGTKC WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TKCGADKICR
NFQCVDASVL NYDCDIQKKC HGHGVCNSNK NCHCENGWAP PNCETKGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL
VFFFLIVPLI VCAIFIFIKR DQLWRRYFRK KRSQTYESDG KNQANPSRQP VSVPRHVSPV TPPREVPIYA
NRFPVPTYAA KQPQQFPSRP PPPQPKVSSQ GNLIPARPAP APPLYSSLT
を有する。
タンパク質のレプロリシン（Ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）（Ｍ１２Ｂ）ファミリー亜鉛メタロプロテアーゼドメインはおよそ残基２１２〜４０６である；タンパク質のディスインテグリンドメインはおよそ残基４２３〜４９７である。
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子（例えば、ｓｃＦｖ、抗体、二重特異的ダイアボディなど）は、以下の範疇のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つによって特徴づけられる：
（１）がん細胞の表面上に内在的に発現されたヒトＡＤＡＭ９と免疫特異的に結合する能力；
（２）類似の結合親和性でヒトおよび非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９（例えば、カニクイザルのＡＤＡＭ９）と特異的に結合する；
（３）４ｎＭ以下の平衡結合定数（ＫＤ）でヒトＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（４）４ｎＭ以下の平衡結合定数（ＫＤ）で非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（５）５×１０５Ｍ−１ｍｉｎ−１以上のオンレート（ｋａ）でヒトＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（６）１×１０６Ｍ−１ｍｉｎ−１以上のオンレート（ｋａ）で非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（７）１×１０−３ｍｉｎ−１以下のオフレート（ｋｄ）でヒトＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（８）９×１０−４ｍｉｎ−１以下のオフレート（ｋｄ）で非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９と特異的に結合する；
（９）キメラまたはネズミ親抗体と比較して、カニクイザルＡＤＡＭ９に対する結合親和性（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析によって測定）において少なとも１００倍の増強（例えば、少なとも１００倍、少なとも１５０倍、少なとも２００倍、少なとも２５０倍、少なとも３００倍、少なとも３５０倍、少なとも４００倍、少なとも４５０倍、少なとも５００倍、少なとも５５０倍、または少なとも６００倍の増強）を有し、ヒトＡＤＡＭ９（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析によって測定）に対して高い親和性結合を保持するように最適化されている。
本明細書中で記載するように、ＡＤＡＭ９結合分子の結合定数は、表面プラズモン共鳴を用いて、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析により決定することができる。表面プラズモン共鳴データを１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（連立ｋａｋｄ）にフィッティングすることができ、レート定数ｋｄ／ｋａの比から平衡結合定数ＫＤを算出することができる。そのような結合定数は、一価ＡＤＡＭ９結合分子（すなわち、単一ＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）、二価ＡＤＡＭ９結合分子（すなわち、２つのＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）、またはより高い価数を有するＡＤＡＭ９結合分子（例えば、３つ、４つ、またはそれ以上のＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）について決定することができる。
本発明は特に、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープと免疫特異的に結合する抗ＡＤＡＭ９軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（複数可）および抗ＡＤＡＭ９重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（複数可）を含むＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）を特に包含する。特に記載しない限り、そのようなＡＤＡＭ９結合分子はすべてヒトＡＤＡＭ９と免疫特異的に結合することが可能である。本明細書中で使用する場合、そのようなＡＤＡＭ９可変ドメインは、それぞれ「抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ」および「抗ＡＤＡＭ９−ＶＨ」と称する。
Ｖ．ネズミ抗ヒトＡＤＡＭ９抗体
ＡＤＡＭ９の標的タンパク質プロセッシング活性をブロックし、インターナライズされ、抗腫瘍活性を有するネズミ抗ＡＤＡＭ９抗体が特定された（例えば、米国特許第８，３６１，４７５号を参照）。米国特許第７，６７４，６１９号および同第８，３６１，４７５号でハイブリドーマクローンＡＴＣＣ ＰＴＡ−５１７４によって産生される「抗ＫＩＤ２４」抗体として指定されているこの抗体を、本明細書中では「ＭＡＢ−Ａ」と指定する。ＭＡＢ−Ａは、正常組織よりも腫瘍に対して強力な優先的結合を示す（図７Ａ〜７Ｃを参照）。ＭＡＢ−Ａは、正常細胞型の大パネル全体にわたってほとんどまたは全く染色を示さなかった（表１）。
図８Ａ〜８Ｂで示すように、ＭＡＢ−ＡはヒトＡＤＡＭ９と高親和性で結合するが、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＡＤＡＭ９とはそれよりも低い程度で結合する。
ＭＡＢ−ＡのＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を以下で提示する。ＭＡＢ−ＡのＶＨおよびＶＬドメインをヒト化し、ＣＤＲを最適化して、親和性を改善および／または潜在的なアミノ酸傾向を除去した。ＣＤＲＨ３をさらに最適化して、ヒトＡＤＡＭ９に対するその高親和性を維持しつつ、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に対する結合を増強した。
本発明の好ましい抗ヒトＡＤＡＭ９結合分子は、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体のＶＨドメインのＣＤＲＨの１つ、２つもしくは３つ全ておよび／またはＶＬドメインのＣＤＲＬの１つ、２つもしくは３つ全てを有し、好ましくはさらに、ヒト化ＭＡＢ−ＡのＶＨおよび／またはＶＬドメインのヒト化フレームワーク領域（「ＦＲ」）を有する。本発明の他の好ましい抗ヒトＡＤＡＭ９結合分子は、ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体の全ＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する。そのような好ましい抗ヒトＡＤＡＭ９結合分子には、抗体、二重特異的（または多重特異的）抗体、キメラまたはヒト化抗体、ＢｉＴｅ、ダイアボディなど、ならびに自然発生的なＧまたはＡ変異体Ｆｃ領域をさらに含むそのような結合分子が含まれる。
本発明は特に：
（Ａ）（１）ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインの３つのＣＤＲＨ；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインの４つのＦＲ；または
（Ｂ）（１）ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３つのＣＤＲＬ；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインの４つのＦＲ；または
（Ｃ）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体のＶＨドメインの３つのＣＤＲＨ；およびＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３つのＣＤＲＬ；または
（Ｄ）ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインの３つのＣＤＲＨ；および最適化変異体ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３つのＣＤＲＬ；または
（Ｅ）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体のＶＨドメインの３つのＣＤＲＨ；および最適化ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３つのＣＤＲＬ；または
（Ｆ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体のＶＨドメインの３つのＣＤＲＨ；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインの４つのＦＲ；または
（Ｇ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体のＶＬドメインの３つのＣＤＲＬ；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインの４つのＦＲ；または
（Ｈ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体のＶＨドメイン；および
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体のＶＬドメインを有するＡＤＡＭ９結合ドメインを含むＡＤＡＭ９結合分子に関する。ネズミ抗体「ＭＡＢ−Ａ」
ネズミ抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列は配列番号７（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMHWVKQR PGQGLEWIGE IIPINGHTNY NEKFKSKATL
TLDKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTLT VSS
である。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号８）：ＳＹＷＭＨである。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ２ドメインのアミノ酸配列は（配列番号９）：ＥＩＩＰＩＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳである。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０）：ＧＧＹＹＹＹＧＳＲＤＹＦＤＹである。
ネズミ抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号１１（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQIPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSHEDPF TFGGGTKLEI K
である。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１２）：ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮである。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ２ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１３）：ＡＡＳＤＬＥＳである。
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１４）：ＱＱＳＨＥＤＰＦＴである。
ＶＩ．例示的ヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＨおよびＶＬドメイン
１．ＭＡＢ−Ａの変異ＶＨドメイン
ＭＡＢ−Ａのある特定の好ましいヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列はＡＤＡＭ９−ＭＡＢ−ＡのＶＨドメイン（配列番号７）の変異体であり、配列番号１５（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）で表される：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWX 1 HWVRQA
PGKGLEWVGE IIPIX 2 GHTNY NEX 3 FX 4 X 5 RFTI SLDNSKNTLY
LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYX 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 DYWGQGTTVT
VSS
ここで：Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６が独立して選択され、
Ｘ１はＭまたはＩである；Ｘ２はＮまたはＦであり；
Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＫまたはＱであり；
Ｘ５はＳまたはＧであり、Ｘ６はＰ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
（Ａ）Ｘ６がＰである場合：Ｘ７はＫまたはＲ；Ｘ８はＦまたはＭ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＷまたはＦ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｂ）Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合：Ｘ７はＮまたはＨ；Ｘ８はＳまたはＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＴまたはＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｃ）Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｄ）Ｘ６がＴである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶまたはＴ；そしてＸ１１はＬまたはＭ；
（Ｅ）Ｘ６がＧである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＳ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ；
（Ｆ）Ｘ６がＤである場合：Ｘ７はＳ；Ｘ８はＮ；Ｘ９はＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ
となるように選択される。
ＭＡＢ−Ａの好ましいヒト化抗ＡＤＡＭ９ＶＨドメイン：ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号１６）およびＭＡＢ−Ａのある特定の好ましいヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列：
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）（配列番号１８）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）（配列番号１９）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）および
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）
を以下に提示する（ＣＤＲＨ残基は一重線の下線で示す；ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号７）に対する差異は二重線の下線で示す）。
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号１６）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPINGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）（配列番号１８）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NERFQGRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）（配列番号１９）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWIHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NERFQGRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYFNSGTL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYIGKGVL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRFGWL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYTGKGVL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYDSNAVL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYFHSGTL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYFNKAVL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGGSGVL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSS

ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYYNSGTL DYWGQGTTVT VSS
ヒト化および／または最適化ＭＡＢ−Ａの抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＦＲの好適なヒトアミノ酸配列は：
ＦＲＨ１ドメイン（配列番号３０）：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ
ＦＲＨ２ドメイン（配列番号３１）：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ
ＦＲＨ３ドメイン（配列番号３２）：ＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＦＲＨ４ドメイン（配列番号３３）：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
である。
ＭＡＢ−Ａの抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ１ドメインの好適な別のアミノ酸配列には：
配列番号８：ＳＹＷＭＨ
配列番号３４：ＳＹＷＩＨ
が含まれる。
ＭＡＢ−Ａの抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ２ドメインの好適な別のアミノ酸配列には：
配列番号９：ＥＩＩＰＩＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ
配列番号３５：ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ
配列番号３６：ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＲＦＱＧ
が含まれる。
ＭＡＢ−Ａの抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ３ドメインの好適な別のアミノ酸配列には：
配列番号１０：ＧＧＹＹＹＹＧＳＲＤＹＦＤＹ
配列番号３７：ＧＧＹＹＹＹＦＮＳＧＴＬＤＹ
配列番号３８：ＧＧＹＹＹＹＩＧＫＧＶＬＤＹ
配列番号３９：ＧＧＹＹＹＹＰＲＦＧＷＬＤＹ
配列番号４０：ＧＧＹＹＹＹＴＧＫＧＶＬＤＹ
配列番号４１：ＧＧＹＹＹＹＤＳＮＡＶＬＤＹ
配列番号４２：ＧＧＹＹＹＹＦＨＳＧＴＬＤＹ
配列番号４３：ＧＧＹＹＹＹＦＮＫＡＶＬＤＹ
配列番号４４：ＧＧＹＹＹＹＧＧＳＧＶＬＤＹ
配列番号４５：ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ
配列番号４６：ＧＧＹＹＹＹＹＮＳＧＴＬＤＹ
が含まれる。
したがって、本発明は：
（１）アミノ酸配列：
配列番号４７：ＳＹＷＸ１Ｈ：Ｘ１はＭまたはＩである；
を有するＣＤＲＨ１ドメイン
（２）アミノ酸配列：
配列番号４８：ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５：Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は独立して選択され：Ｘ２はＮまたはＦであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＫまたはＱであり；Ｘ５はＳまたはＧである
を有するＣＤＲＨ２ドメイン
ならびに
（３）アミノ酸配列：
配列番号４９：ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ：Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤ、そしてＸ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
（Ａ）Ｘ６がＰである場合：Ｘ７はＫまたはＲ；Ｘ８はＦまたはＭ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＷまたはＦ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｂ）Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合：Ｘ７はＮまたはＨ；Ｘ８はＳまたはＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＴまたはＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｃ）Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
（Ｄ）Ｘ６がＴである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶまたはＴ；そしてＸ１１はＬまたはＭ；
（Ｅ）Ｘ６がＧである場合：Ｘ７はＧ；Ｘ８はＳ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ；そして
（Ｆ）Ｘ６がＤである場合：Ｘ７はＳ；Ｘ８はＮ；Ｘ９はＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬとなるように選択される
を有するＣＤＲＨ３ドメイン
を含むＶＨドメインを有するＡＤＡＭ９結合分子を包含する。
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第一の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）ドメイン（配列番号１７）を含み、アミノ酸配列（配列番号５０）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS
TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第二の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１重鎖はｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）ドメイン（配列番号２２）を含み、アミノ酸配列（配列番号５１）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRFGWL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS
TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第三の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含み、アミノ酸配列（配列番号５２）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS
TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本明細書中で提示するように、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを操作して、例えば、エフェクター機能を低減することができる。ある特定の実施形態において、本発明の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１重鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは：Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａから選択される１以上の置換を含む。
したがって、ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第四の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含み、さらに、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインにおいて置換Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ（配列番号１０６）、以下の下線）を含み、アミノ酸配列（配列番号２０２）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI
SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS
TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
２．ＭＡＢ−Ａの変異体ＶＬドメイン
ＭＡＢ−Ａの好ましいヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのアミノ酸配列はＡＤＡＭ９−ＭＡＢ−ＡのＶＬドメイン（配列番号１１）の変異体であり、配列番号５３（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCX 12 ASQSVD YX 13 GDSYX 14 NWY
QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS
SLEPEDFATY YCQQSX 15 X 16 X 17 PF TFGQGTKLEI K
によって表され、ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は独立して選択され、そして：Ｘ１２はＫまたはＲであり； Ｘ１３はＤまたはＳであり；Ｘ１４はＭまたはＬであり；Ｘ１５はＨまたはＹであり；Ｘ１６はＥまたはＳであり；そしてＸ１７はＤまたはＴである。
好ましいヒト化抗ＡＤＡＭ９−ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインのアミノ酸配列：ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）、およびＭＡＢ−Ａ： ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）（配列番号５６）、およびｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）（配列番号５７）のある特定の好ましいヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのアミノ酸配列を以下で提示する（ＣＤＲＬ残基は一重の下線で示し；ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）に対する差異を二重の下線で示す）。
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI K
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI K
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）（配列番号５６）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCRASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI K
ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）（配列番号５７）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCRASQSVD YSGDSYLNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSYSTPF TFGQGTKLEI K
したがって、ヒト化および／または最適化抗ＡＤＡＭ９−ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインのＦＲの好適なヒトアミノ酸配列は：
ＦＲＬ１ドメイン（配列番号５８）： ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣ
ＦＲＬ２ドメイン（配列番号５９）： ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ
ＦＲＬ３ドメイン（配列番号６０）： ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＹＣ
ＦＲＬ４ドメイン（配列番号６１）： ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
である。
抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬ１ドメインの好適な別のアミノ酸配列は：
配列番号１２： ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ
配列番号６２： ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ
配列番号６３： ＲＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ
配列番号６４： ＲＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＬＮ
を含む。
抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬ３ドメインの好適な別のアミノ酸配列は：
配列番号１４： ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ
配列番号６５： ＱＱＳＹＳＴＰＦＴ
を含む。
したがって、本発明は：
（１）アミノ酸配列：配列番号６６：Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ
ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は独立して選択され、そして
Ｘ１２はＫまたはＲ；Ｘ１３はＤまたはＳ；そしてＸ１４はＭまたはＬである
を有するＣＤＲＬ１ドメイン；
（２）アミノ酸配列：配列番号１３：ＡＡＳＤＬＥＳ
を有するＣＤＲＬ２ドメイン
および
（３）アミノ酸配列：配列番号６７：ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ
ここで：Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は独立して選択され、そしてＸ１５はＨまたはＹ；Ｘ１６はＥまたはＳ；そしてＸ１７はＤまたはＴである
を有するＣＤＲＬ３ドメイン
を含む抗ＡＤＡＭ９抗体ＶＬドメインを包含する。
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の例示的ヒト化／最適化ＩｇＧ１軽鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）ドメイン（配列番号５５）を含み、アミノ酸配列（配列番号６８）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG
SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL
NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT
KSFNRGEC
を有する。
したがって、本発明はさらに、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープと免疫特異的に結合し、前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３のうちのいずれかを含むＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）を明確に想定し、前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＨ１のうちの１つ、および前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＨ２のうちの１つ、および前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＨ３のうちの１つ、および前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＬ１のうちの１つ、および前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＬ２のうちの１つおよび前記ＭＡＢ−Ａ ＣＤＲＬ３のうちの１つを含むＡＤＡＭ９結合分子を特に想定する。
本発明は、前記ヒト化ＭＡＢ−Ａ ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、またはＦＲＨ４、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、またはＦＲＬ４のいずれかをさらに含むＡＤＡＭ９結合分子をさらに想定し、特にＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４を含む、ならびに／またはＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、ＦＲＬ４およびＦＲＨ１を含むＡＤＡＭ９結合分子を想定する。
いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭ９結合分子が：
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６２、１３、および１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６３、１３、および１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３６および１０ならびに配列番号６３、１３および１４；
（ｄ）それぞれ、配列番号３４、３６および１０ならびに配列番号６４、１３および６５
（ｅ）それぞれ、配列番号８、３５および３７ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｆ）それぞれ、配列番号８、３５および３８ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｇ）それぞれ、配列番号８、３５および３９ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｈ）それぞれ、配列番号８、３５および４０ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｉ）それぞれ、配列番号８、３５および４１ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｊ）それぞれ、配列番号８、３５および４２ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｋ）それぞれ、配列番号８、３５および４３ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｌ）それぞれ、配列番号８、３５および４４ならびに配列番号６２、１３および１４；
（ｍ）それぞれ、配列番号８、３５および４５ならびに配列番号６２、１３および１４；および
（ｎ）それぞれ、配列番号８、３５および４６ならびに配列番号６２、１３および１４
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＡＤＡＭ９結合分子は、それぞれ、配列番号８、３５および４５ならびに配列番号６２、１３および１４の配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、以下の配列と少なとも９０％、少なとも９５％、少なとも９９％、または１００％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む：
それぞれ、配列番号１７および配列番号５５；
それぞれ、配列番号１７および配列番号５６；
それぞれ、配列番号１８および配列番号５６；
それぞれ、配列番号１９および配列番号５７；
それぞれ、配列番号２０および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２１および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２２および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２３および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２４および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２５および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２６および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２７および配列番号５５；
それぞれ、配列番号２８および配列番号５５；ならびに
それぞれ、配列番号２９および配列番号５５。
「実質的に同一」または「同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書中で記載するアミノ酸配列のいずれか１つ）に対して少なとも５０％の同一性を示すポリペプチドを意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用されるポリペプチド配列に対してアミノ酸レベルで少なとも６０％、さらに好ましくは少なとも８０％または少なとも８５％、そしてさらに好ましくは少なとも９０％、少なとも９５％、少なとも９９％、またはさらには１００％同一である。
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｃｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定する。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチングさせる。保存的置換は、典型的には以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。同一性の程度を決定するための例示的アプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、確率スコアはｅ−３〜ｅ−１００であり、密接に関連した配列を意味する。
特定の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、それぞれ配列番号２８および配列番号５５に対して少なとも９０％、少なとも９５％、少なとも９９％、または１００％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、以下のような重鎖および軽鎖配列を含む：
それぞれ、配列番号５０および配列番号６８；
それぞれ、配列番号５１および配列番号６８；
それぞれ、配列番号５２および配列番号６８；ならびに
それぞれ、配列番号２０２および配列番号６８。
本発明はまた、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープと免疫特異的に結合し、前記のヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９ＭＡＢ−Ａ ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）も明確に想定する。本発明は特に、ヒト化抗ＡＤＡＭ９ＶＬまたはＶＨドメインの以下の組み合わせのいずれかを含むＡＤＡＭ９結合分子を想定する：
本発明は具体的には、（ｉ）前記のヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインと、（ｉｉ）Ｆｃ領域とを含むＡＤＡＭ９結合分子を包含する。特定の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、（ｉ）前記のヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインと、（ｉｉ）Ｆｃ領域とを含むモノクローナル抗体である。他の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は：モノクローナル抗体、多重特異的抗体、合成抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合した二重特異的Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、および三価結合分子からなる群から選択される。
抗ＡＤＡＭ９ＶＨおよびＶＬドメインに対する特定の修飾は前記でまとめられ、図９Ａ〜９Ｂで比較されているが、本発明のヒト化および／または最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＨまたはＶＬドメインを操作する場合に、これらの残基のほとんどまたはすべてを修飾する必要はない。本発明はまた、例えば、サブクローニングを促進するために導入することができるＣ末端のおよび／またはＮ末端アミノ酸残基のアミノ酸置換を含む、これらのＶＨおよびＶＬ配列のわずかな変化も含み得る。
ＶＩＩ．キメラ抗原受容体
本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、抗ＡＤＡＭ９単鎖可変フラグメント（「抗ＡＤＡＭ９−ｓｃＦｖ」）または抗ＡＤＡＭ９キメラ抗原受容体（「抗ＡＤＡＭ９−ＣＡＲ」）などの単一特異性単鎖分子であってよい。前述のように、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽および重鎖可変ドメインを一緒に連結することによって作製される。第一世代キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）は典型的にはＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを含み、これは内在性Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）からのシグナルの第一トランスミッターである。第二世代ＣＡＲは、Ｔ細胞に更なるシグナルを提供するためにＣＡＲの細胞質側末端に融合した様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）からのさらなる細胞内シグナリングドメインを有する。第三世代ＣＡＲは、それらの効力をさらに増強するために、ＣＤ３ζ−ＣＤ２８−４１ＢＢまたはＣＤ３ζ−ＣＤ２８−ＯＸ４０などの複数のシグナリングドメインを結合する（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。キメラ抗原受容体は、米国特許第９，４４７，１９４号；同第９，２６６，９６０号；同第９，２１２，２２９号；同第９，０７４，０００号；同第８，８２２，１９６号；および同第８，４６５，７４３号、ならびに米国特許公開第２０１６／０２７２７１８号、同第２０１６／０１４４０２６号、同第２０１６／０１３０３５７号、同第２０１６／００８１３１４号、同第２０１６／００７５７８４号、同第２０１６／００５８８５７号、同第２０１６／００４６７２９号、同第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００４５５５１号、同第２０１６／００１５７５０号、同第２０１５／０３２０７９９号、同第２０１５／０３０７６２３号、同第２０１５／０３０７５６４号、同第２０１５／００３８６８４号、同第２０１４／０１３４１４２号および同第２０１３／０２８０２８５号で考察されている。
本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＣＡＲは受容体の細胞内ドメインに融合した抗ＡＤＡＭ９−ｓｃＦｖを含む。抗ＡＤＡＭ９−ｓｃＦｖの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインは本明細書中で開示されるヒト化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのいずれかから選択される。好ましくは、ＶＨドメインは：ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号１６）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）（配列番号１８）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）（配列番号１９）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）、およびｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）からなる群から選択され、ＶＬドメインは：ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）（配列番号５６）、およびｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）（配列番号５７）からなる群から選択される。そのようなキメラ抗原受容体を形成するために使用することができるヒト化／最適化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインの組み合わせならびにＣＤＲＨｓおよびＣＤＲＬｓの組み合わせは上述されている。
本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＣＡＲの細胞内ドメインは、好ましくは：４１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｂ２ｃ−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８−ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８ｍｕｔ−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８−ＯＸ４０−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８−ＯＸ４０−ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４−ＣＤ３ζ、ＣＤ４−ＦｃεＲＩγ、ＣＤ８−ＣＤ３ζ、ＦｃeＲＩγ、ＦｃεＲＩγＣＡＩＸ、ヘレグリン−ＣＤ３ζ、ＩＬ−１３−ＣＤ３ζ、またはＬｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζのいずれかの細胞内ドメインから選択される（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
ＶＩＩＩ．多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子
本発明はまた、エピトープ結合部位（好ましくは本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨの１つ、２つもしくは３つ全部および／または本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬの１つ、２つもしくは３つ全部またはそのような抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインおよび／もしくはそのような抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインを含む）を含み、第二エピトープに対して免疫特異的に結合する第二エピトープ結合部位をさらに含む多重特異的（例えば、二重特異的、三重特異的など）ＡＤＡＭ９結合分子も対象とし、そのような第二エピトープは（ｉ）ＡＤＡＭ９の異なるエピトープ、または（ｉｉ）ＡＤＡＭ９でない分子のエピトープである。そのような多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子は、好ましくは、標的細胞または組織タイプにとって特有の抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組み合わせを含む。特に、本発明は、ＡＤＡＭ９のエピトープおよびエフェクター細胞、特にＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞の表面上に存在する分子のエピトープと結合することが可能な多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子に関する。例えば、そのような本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはＮＫＧ２Ｄと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むように構築することができる。
本発明の一実施形態は、「第一エピトープ」および「第二エピトープ」と結合することが可能な二重特異的ＡＤＡＭ９結合分子に関し、そのようなエピトープは互いに同一でない。そのような二重特異的分子は、第一エピトープと結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメインと、第二エピトープと結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインとを含む。「ＶＬ１」および「ＶＨ１」という表記は、それぞれ、そのような二重特異的分子の「第一」エピトープと結合する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを意味する。同様に、「ＶＬ２」および「ＶＨ２」という表記は、それぞれ、そのような二重特異的分子の「第二」エピトープと結合する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを意味する。特定のエピトープが第一対第二エピトープとして指定されているか否かには無関係であり；そのような表記は本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在および配向にのみに関連する。一実施形態において、そのようなエピトープのうちの一方はヒトＡＤＡＭ９のエピトープであり、他方はＡＤＡＭ９の異なるエピトープであるか、またはＡＤＡＭ９でない分子のエピトープである。特定の実施形態では、そのようなエピトープの一方はヒトＡＤＡＭ９のエピトープであり、他方はＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）のエピトープである。ある特定の実施形態において、二重特異的分子は、２つよりも多いエピトープ結合部位を含む。そのような二重特異的分子は、ＡＤＡＭ９の少なくとも１つのエピトープおよびＡＤＡＭ９ではない分子の少なくとも１つのエピトープを結合し、ＡＤＡＭ９のさらなるエピトープおよび／またはＡＤＡＭ９ではない分子のさらなるエピトープとさらに結合することができる。
本発明は特に、それらがＡＤＡＭ９の少なくとも１つのエピトープおよびＡＤＡＭ９ではない第二分子の少なくとも１つのエピトープに配位結合することを可能にする抗体のエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＬおよびＶＨドメイン）を有する二重特異的、三重特異的および多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子（例えば、二重特異的抗体、二重特異的ダイアボディ、三価結合分子など）に関する。そのような分子のポリペプチドドメインのＶＬおよびＶＨドメインの選択は、そのような多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子を構成するポリペプチド鎖が集合して、ＡＤＡＭ９の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つの機能的エピトープ結合部位と、ＡＤＡＭ９ではない分子の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つの機能的エピトープ結合部位とを形成するように調整される。好ましくは、多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子は、本明細書中で提供するような、本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨの１つ、２つもしくは３つ全ておよび／または本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬの１つ、２つもしくは３つ全て、またはそのような抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインおよび／もしくはそのような抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインを含む。
Ａ．二重特異的抗体
本発明は、ＡＤＡＭ９のエピトープおよびＡＤＡＭ９ではない分子のエピトープと同時に結合することができる二重特異的抗体を包含する。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭ９およびＡＤＡＭ９ではない第二分子と同時に結合することができる二重特異的抗体は、各々その全体が参照により本明細書中に組み入れられる、ＰＣＴ公開番号国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１０／０２８７９６号、国際公開第２０１０／０２８７９５号、国際公開第２０１０／１０８１２７号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１３／０７０５６５号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１３／１７４８７３号、および国際公開第２０１４／０２２５４０号で記載される方法のいずれかを用いて産生される。
Ｂ．Ｆｃ領域を欠く二重特異的ダイアボディ
本発明の一実施形態は、第一エピトープおよび第二エピトープと結合することが可能な二重特異的ダイアボディに関し、第一エピトープはヒトＡＤＡＭ９のエピトープであり、第二エピトープはＡＤＡＭ９ではない分子、好ましくはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）のエピトープである。そのようなダイアボディは、それらの配列によってポリペプチド鎖が互いに共有結合してＡＤＡＭ９のエピトープおよび第二エピトープと同時に結合することができる共有結合したダイアボディを形成することが可能になる第一ポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とを含み、最も好ましくはそのような第一ポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とから構成される。
二重特異的ダイアボディのそのような実施形態の第一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端、第一または第二エピトープ（すなわち、ＶＬ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬまたはＶＬエピトープ２のいずれか）と結合することが可能なモノクローナル抗体のＶＬドメイン、第一の介在するスペーサーペプチド（リンカー１）、第二エピトープ（そのような第一ポリペプチド鎖がＶＬ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬを含む場合）またはＡＤＡＭ９（そのような第一ポリペプチド鎖がＶＬエピトープ２を含む場合）のいずれかと結合することが可能なモノクローナル抗体のＶＨドメイン、場合によってシステイン残基を含んでもよい第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）、ヘテロダイマー促進ドメインおよびＣ末端を含む（図１）。
二重特異的ダイアボディのこの実施形態の第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端、第一または第二エピトープの各々と結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬまたはＶＬエピトープ２のいずれかであり、ダイアボディの第一ポリペプチド鎖中に含まれるために選択されないＶＬドメインである）、介在するスペーサーペプチド（リンカー１）、第二エピトープ（そのような第二のポリペプチド鎖がＶＬ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬを含む場合）またはＡＤＡＭ９（そのような第二のポリペプチド鎖がＶＬエピトープ２を含む場合）のいずれかと結合することが可能なモノクローナル抗体のＶＨドメイン、場合によってシステイン残基を含んでもよい第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）、ヘテロダイマー促進ドメイン、およびＣ末端を含む（図１）。
第一ポリペプチド鎖のＶＬドメインは第二のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第一の抗原（すなわち、ＡＤＡＭ９または第二エピトープを含む分子のいずれか）について特異的な第一の機能的エピトープ結合部位を形成する。同様に、第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第二の抗原について特異的な第二の機能的エピトープ結合部位（すなわち、第二エピトープを含む分子またはＡＤＡＭ９を含む分子のいずれか）を形成するために、第一ポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用する。したがって、第一および第二のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインの選択は、ダイアボディの２つのポリペプチド鎖があわせて、ＡＤＡＭ９のエピトープおよび第二エピトープの両方と結合することが可能なＶＬおよびＶＨドメインを含む（すなわち、それらがあわせて、ＶＬ抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ／ＶＨ抗ＡＤＡＭ９−ＶＨとＶＬエピトープ２／ＶＨエピトープ２とを含む）ように、調整される。
最も好ましくは、介在するスペーサーペプチド（すなわち、そのようなＶＬおよびＶＨドメインを離間する「リンカー１」）の長さは、ポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインが互いに結合するのを実質的または完全に防止するように選択される（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８または９の介在するリンカーアミノ基残基から構成される）。したがって、第一ポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、実質的または完全に互いに結合できない。同様に、第二のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは実質的または完全に互いに結合できない。好ましい介在するスペーサーペプチド（リンカー１）は配列（配列番号６９）：ＧＧＧＳＧＧＧＧを有する。
第二の介在するスペーサーペプチド（「リンカー２」）の長さおよび組成は、そのようなダイマー化を促進する１以上のポリペプチドドメイン（すなわち、「ヘテロダイマー促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）は３〜２０のアミノ酸残基を含む。特に、採用されたヘテロダイマー促進ドメイン（複数可）がシステイン残基を含まない場合、システインを含有する第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）を利用する。システインを含有する第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）は１、２、３またはそれ以上のシステインを含む。好ましいシステインを含有するスペーサーペプチド（リンカー２）は配列ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７０）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＳ（配列番号７１）、ＬＧＧＧＳＧ（配列番号７２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号７３）、ＡＳＴＫＧ（配列番号７４）、ＬＥＰＫＳＳ（配列番号７５）、ＡＰＳＳＳ（配列番号７６）など）、後述するようなシステインを含有するヘテロダイマー促進ドメインを使用する。任意に、システインを含有するリンカー２およびシステインを含有するヘテロダイマー促進ドメインの両方を使用する。
ヘテロダイマー促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上のＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）またはＶＥＰＫＳＣ（配列番号７８）またはＡＥＰＫＳＣ（配列番号７９）と他方のポリペプチド鎖上のＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号８０）またはＦＮＲＧＥＣ（配列番号８１）であり得る（米国特許第９，２９６，８１６号を参照）。
好ましい実施形態において、ヘテロダイマー促進ドメインは、反対の電荷のタンデム型反復コイルドメイン、例えば、そのグルタメート残基がｐＨ７で負電荷を形成する「Ｅコイル」らせんドメイン（配列番号８２）：ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ）、およびそのリジン残基がｐＨ７で正電荷を形成する「Ｋコイル」ドメイン（配列番号８３）：ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ）を含む。そのような荷電ドメインの存在は、第一および第二ポリペプチド間の結合を促進し、したがってヘテロダイマー形成を助長する。１以上のシステイン残基を含むような前記ＥコイルおよびＫコイル配列の修飾を含むヘテロダイマー促進ドメインを利用することができる。そのようなシステイン残基の存在により、１つのポリペプチド鎖上に存在するコイルが別のポリペプチド鎖上に存在する相補的コイルと共有結合するようになり、それによってポリペプチド鎖を互いに共有結合させ、ダイアボディの安定性を増大させることが可能になる。そのような特に好ましいヘテロダイマー促進ドメインの例としては、アミノ酸配列ＥＶＡＡＣＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号８４）を有する修飾Ｅコイルと、アミノ酸配列ＫＶＡＡＣＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号８５）を有する修飾Ｋコイルとを含む。
ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／０１８６８７号で開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディは、ダイアボディの１以上の末端で血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むように修飾することができる。最も好ましくは、血清結合タンパク質のそのようなポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に設置される。アルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトでは１９日の半減期を有する。アルブミンは、他のタンパク質との非共有結合を可能にし、それによってそれらの血清半減期を延長するいくつかの小分子結合部位を有する。ストレプトコッカス株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定な三重らせんバンドルを形成する４６のアミノ酸残基から構成され、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。したがって、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）であり、より好ましくは、ストレプトコッカス株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号８６）：ＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹ ＹＫＮＬＩＤＮＡＫＳ ＡＥＧＶＫＡＬＩＤＥ ＩＬＡＡＬＰである。
ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本明細書中に組み込まれる）で開示されるように、配列番号８６の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異体はＭＨＣクラスＩＩ結合を減弱または除去する能力を有する。組み合わせ変異結果に基づいて、以下の置換の組み合わせがそのような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５ＡおよびＤ７９Ａまたは修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０ＳおよびＤ７９Ａを有する変異体ＡＢＤ。そのような脱免疫化ＡＢＤは実質的に野生型結合を示す一方で、減弱したＭＨＣクラスＩＩ結合を提供するので、アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP（配列番号８７）、
またはアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号８８）、
またはアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号８９）
を有する変異体脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。したがって、ＡＢＤを有するそのようなダイアボディの第一ポリペプチド鎖は、好ましくはそのようなポリペプチド鎖のＥコイル（またはＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置する第三のリンカー（リンカー３）を含み、Ｅコイル（またはＫコイル）ドメインとＡＢＤ（好ましくは脱免疫化ＡＢＤであるもの）との間に介在する。そのようなリンカー３の好ましい配列はＧＧＧＳ（配列番号７１）である。
Ｃ．Ｆｃ領域を含む多重特異的ダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃ領域を含むＡＤＡＭ９のエピトープおよび第二エピトープ（すなわち、異なるＡＤＡＭ９のエピトープまたはＡＤＡＭ９でない分子のエピトープ）に同時に結合することが可能な多重特異的ダイアボディに関する。ダイアボディ鎖の複合体形成がＦｃ領域の形成をもたらすように、ダイアボディポリペプチド鎖の一方または両方にＩｇＧ ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを付加することで、生物学的半減期が延長される、および／またはダイアボディの価数が変わる。そのようなダイアボディは、それらの配列によって、ポリペプチド鎖が互いに共有結合して、ＡＤＡＭ９のエピトープおよび第二エピトープに同時に結合することが可能な共有結合したダイアボディを形成することを可能にする２以上のポリペプチド鎖を含む。ＩｇＧ ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをダイアボディポリペプチドの両方に組み込むことで、二本鎖二重特異的Ｆｃ領域含有ダイアボディを形成するのが可能になる（図２）。
別法として、ダイアボディポリペプチドのうちの１つだけの上にＩｇＧ ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを組み入れることで、より複雑な四本鎖二重特異的Ｆｃ領域含有ダイアボディを形成することが可能になる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽（ＣＬ）ドメインおよび定常重ＣＨ１ドメインを有する代表的な四本鎖ダイアボディを示すが、そのようなドメインのフラグメントならびに他のポリペプチドを代替的に用いることができる（例えば、図３Ａおよび３Ｂ、米国特許公開第２０１３−０２９５１２１号；同第２０１０−０１７４０５３号および同第２００９−００６０９１０号；欧州特許公開番号ＥＰ２７１４０７９号；ＥＰ２６０１２１６号；ＥＰ２３７６１０９号；ＥＰ２１５８２２１号およびＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。したがって、例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジ領域由来のアミノ酸配列ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）、ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７８）、またはＡＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を有するペプチドを用いることができ、ＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号８０）またはＦＮＲＧＥＣ（配列番号８１）を用いることができる。四本鎖ダイアボディを含む代表的なペプチドを図３Ａに示す。代替的または付加的に、「Ｅコイル」らせんドメイン（配列番号８２）：ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫまたは配列番号８４）：ＥＶＡＡＣＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ）；および「Ｋコイル」ドメイン（配列番号８３）：ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥまたは配列番号８５）：ＫＶＡＡＣＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ）などの反対の電荷のタンデム型コイルドメインを含むペプチドを用いることができる。四本鎖ダイアボディを含む代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
本発明のＦｃ領域含有分子はさらなる介在するスペーサーペプチド（リンカー）を含んでもよく、概してそのようなリンカーは、ヘテロダイマー促進ドメイン（例えば、ＥコイルまたはＫコイル）とＣＨ２−ＣＨ３ドメインとの間および／またはＣＨ２−ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、さらなるリンカーは３〜２０のアミノ酸残基を含み、場合によって、ＩｇＧヒンジ領域（好ましくはＩｇＧヒンジ領域のシステイン含有部分）の全部または一部を含んでもよい。本発明の二重特異的Ｆｃ領域含有ダイアボディ分子で用いることができるリンカーには：ＧＧＧＳ（配列番号７１）、ＬＧＧＧＳＧ（配列番号７２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号７３）、ＡＳＴＫＧ（配列番号７４）、ＬＥＰＫＳＳ（配列番号７５）、ＡＰＳＳＳ（配列番号７６）、ＡＰＳＳＳＰＭＥ（配列番号９０）、ＶＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９１）、ＬＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号９２）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９３）、ＧＧＣ、およびＧＧＧが含まれる。クローニングを容易にするために、ＧＧＧまたはＧＧＣの代わりにＬＥＰＫＳＳ（配列番号７５）を使用してもよい。さらに、アミノ酸ＧＧＧ、またはＬＥＰＫＳＳ（配列番号７５）の直後にＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９３）が続いて別のリンカー：ＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９４）；およびＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９５）を形成してもよい。本発明の二重特異的Ｆｃ領域含有分子は、リンカーに加えて、またはリンカーの代わりにＩｇＧヒンジ領域を組み入れてもよい。例示的ヒンジ領域には以下のものが含まれる：ＩｇＧ１からのＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９６）、ＩｇＧ２からのＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号９７）、ＩｇＧ３からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ ＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫ ＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰ ＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫ ＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ ＣＰ（配列番号２０６）、ＩｇＧ４からのＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号９８）、およびＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号９９）、これは、安定化Ｓ２２８Ｐ置換（下線）（Ｋａｂａｔで記載されているＥＵ指数によってナンバリング）を含んで鎖交換を低減するＩｇＧ４ヒンジ変異体である。
図３Ａ〜３Ｃで提示するように、本発明のＦｃ領域含有ダイアボディは四本の鎖を含み得る。そのようなダイアボディの第一および第三のポリペプチド鎖は３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン、（ｉｉｉ）ヘテロダイマー促進ドメイン、および（ｉｖ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む。第二および第四のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン、および（ｉｉｉ）ヘテロダイマー促進ドメインを含み、ヘテロダイマー促進ドメインは第一／第三のポリペプチド鎖と第二／第四のポリペプチド鎖のダイマー化を促進する。第三および第四のポリペプチド鎖のＶＬおよび／またはＶＨドメイン、ならびに第一および第二のポリペプチド鎖のＶＬおよび／またはＶＨドメインは、同一または異なっていてもよく、単一特異性、二重特異的または四重特異的のいずれかである四価結合を可能にする。「ＶＬ３」および「ＶＨ３」という表記は、それぞれ、そのようなダイアボディの「第三」エピトープと結合する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを意味する。同様に、「ＶＬ４」および「ＶＨ４」という表記は、それぞれ、そのようなダイアボディの「第四」エピトープと結合する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを意味する。本発明の代表的な四本鎖二重特異的Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般的構造を表２に提示する：
ＨＰＤ＝ヘテロダイマー促進ドメイン
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディは４つの全ポリペプチド鎖から構成される二重特異的、四価（すなわち、４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異的、四価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＡＤＡＭ９について免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（ＡＤＡＭ９の同じエピトープまたはＡＤＡＭ９の異なるエピトープに結合することが可能であり得るもの）と、第二分子に対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位（第二分子の同じエピトープまたは第二分子の異なるエピトープと結合することが可能であり得るもの）とを含む。好ましくは、第二分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）である。
さらなる実施形態において、本発明のＦｃ領域含有ダイアボディは３つのポリペプチド鎖を含み得る。そのようなダイアボディの第一ポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメインおよび（ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む。そのようなダイアボディの第二のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメインおよび（ｉｉｉ）ヘテロダイマー化とダイアボディの第一ポリペプチド鎖との共有結合とを促進するドメインを含む。そのようなダイアボディの第三のポリペプチドはＣＨ２−ＣＨ３配列を含む。したがって、そのようなダイアボディの第一および第二のポリペプチド鎖は一緒に結合して、第一の抗原と結合可能なＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合部位（すなわち、ＡＤＡＭ９または第二エピトープを含む分子のいずれか）、ならびに第二の抗原と結合可能なＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位（すなわち、第二エピトープを含む分子またはＡＤＡＭ９のいずれか）を形成する。第一および第二ポリペプチドは、それら各々の第三ドメインにおいてシステイン残基を含むジスルフィド結合を介して互いに結合する。特に、第一および第三のポリペプチド鎖は互いに複合体形成して、ジスルフィド結合を介して安定化するＦｃ領域を形成する。そのような二重特異的ダイアボディは増強した効力を有する。図４Ａおよび４Ｂはそのようなダイアボディの構造を示す。そのようなＦｃ領域含有ダイアボディは２つの配向のいずれかを有し得る（表３）：
ＨＰＤ＝ヘテロダイマー促進ドメイン
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖から構成される二重特異的、二価（すなわち、２つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異的、二価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＡＤＡＭ９について免疫特異的な１つのエピトープ結合部位と、第二分子について免疫特異的な１つのエピトープ結合部位とを含む。好ましくは、第二分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）である。
さらなる実施形態において、Ｆｃ領域含有ダイアボディは合計で５つのポリペプチド鎖を含み得る。特定の実施形態において、前記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは同じアミノ酸配列を有する。そのようなダイアボディの第一ポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン、（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン、および（ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む。第一ポリペプチド鎖は、ＶＨ１と重鎖定常領域とを含む抗体の重鎖であり得る。そのようなダイアボディの第二および第五ポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメインと（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインとを含む。そのようなダイアボディの第二および／または第五ポリペプチド鎖は、第一／第三のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含む抗体の軽鎖であり得る。第一、第二および／または第五ポリペプチド鎖は自然発生的な抗体から単離することができる。別法として、それらは組換え的に構築することができる。そのようなダイアボディの第三のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメインと、（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメインと、（ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインと、（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメインと、（ｖ）ＶＨ３含有ドメインと、（ｖｉ）ヘテロダイマー促進ドメインとを含み、ヘテロダイマー促進ドメインは第三鎖と第四鎖とのダイマー化を促進する。そのようなダイアボディの第四のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメインと、（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメインと、（ｉｉｉ）ヘテロダイマー化およびダイアボディの第三のポリペプチド鎖との共有結合を促進するドメインとを含む。
したがって、そのようなダイアボディの第一と第二および第三と第五のポリペプチド鎖は一緒に結合して、第一エピトープと結合することが可能な２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合部位を形成する。そのようなダイアボディの第三および第四のポリペプチド鎖は一緒に結合して、第二エピトープと結合することが可能なＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位、ならびに第三エピトープと結合することが可能なＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。第一および第三のポリペプチドは、それら各々の定常領域においてシステイン残基を含むジスルフィド結合によって互いに結合する。特に、第一および第三のポリペプチド鎖は互いに複合体形成してＦｃ領域を形成する。そのような多重特異的ダイアボディは増強された効力を有する。図５はそのようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２、およびＶＬ３／ＶＨ３ドメインは同一または異なってもよく、単一特異的、二重特異的または三重特異的である結合を可能にすると理解される。本明細書中で提示するように、これらのドメインは好ましくはＡＤＡＭ９のエピトープ、第二分子のエピトープおよび任意に第三分子のエピトープと結合するように選択される。
ポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは所望のエピトープに対して特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するように選択される。ポリペプチド鎖の会合によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、単一特異性、二重特異的、三重特異的または四重特異的である四価結合を可能にするように、同一または異なっていてもよい。特に、ＶＬおよびＶＨドメインは、多価ダイアボディが第一エピトープの２つの結合部位および第二エピトープの２つの結合部位、また第一エピトープの３つの結合部位および第二エピトープの１つの結合部位、または第一エピトープの２つの結合部位、第二エピトープの１つの結合部位および第三エピトープの１つの結合部位を含み得るように選択することができる（図５に示す通り）。本発明の代表的な五本鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般的構造を表４に提示する：
ＨＰＤ＝ヘテロダイマー促進ドメイン
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディは、ＡＤＡＭ９に対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（ＡＤＡＭ９の同じエピトープまたはＡＤＡＭ９の異なるエピトープと結合可能であり得る）と、第二分子に対して特異的な２つのエピトープ結合部位（第二分子の同じエピトープまたは第二分子の異なるエピトープと結合可能であり得る）とを有する合計５つのポリペプチド鎖から構成される、二重特異的、四価（すなわち、４つの結合部位を有する）のＦｃ含有ダイアボディである。別の実施形態において、本発明の二重特異的四価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＡＤＡＭ９に対して免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（ＡＤＡＭ９の同じエピトープまたはＡＤＡＭ９の２つもしくは３つの異なるエピトープと結合可能であり得る）と、第二分子に対して特異的な１つのエピトープ結合部位とを含む。別の実施形態において、本発明の二重特異的四価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＡＤＡＭ９について免疫特異的な１つのエピトープ結合部位と、第二分子について特異的な３つのエピトープ結合部位（第二分子の同じエピトープまたは第二分子の２つもしくは３つの異なるエピトープと結合可能であり得る）とを含む。前記提示のように、ＶＬおよびＶＨドメインは三重特異的結合を可能にするように選択することができる。したがって、本発明はまた、三重特異的四価Ｆｃ含有ダイアボディも含み得る。本発明の三重特異的四価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＡＤＡＭ９について免疫特異的な２つのエピトープ結合部位と、第二分子について免疫特異的な１つのエピトープ結合部位と、第三分子について免疫特異的な１つのエピトープ結合部位とを含む。ある特定の実施形態において、第二分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）である。ある特定の実施形態において、第二分子はＣＤ３であり、第三分子はＣＤ８である。
Ｄ．Ｆｃ領域を含む三価結合分子
本発明のさらなる実施形態は、第一エピトープ、第二エピトープおよび第三エピトープと同時に結合することができるＦｃ領域を含む三価結合分子に関し、そのようなエピトープの少なくとも１つは互いに同一ではない。そのような三価結合分子は３つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの２つはダイアボディ型結合ドメインであり、これは結合部位Ａおよび結合部位Ｂを提供し、そのうちの１つはＦａｂ型結合ドメイン、またはｓｃＦｖ型結合ドメインであり、これは結合部位Ｃを提供する（例えば、図６Ａ〜６Ｆ、ならびにＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１５／１８４２０７号；および国際公開第２０１５／１８４２０３を参照）。そのような三価結合分子は、したがって、第一エピトープと結合することができる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメインと、第二エピトープと結合することができる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインと、そのような三価結合分子の「第三」エピトープと結合することができる「ＶＬ３」および「ＶＨ３」ドメインとを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は前述のように、ダイアボディ、特にＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ中に存在するエピトープ結合部位の一種である。「Ｆａｂ型結合ドメイン」および「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」の各々は、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインおよびイムノグロブリン重鎖の相補ＶＨドメインの相互作用によって形成されるエピトープ結合部位である。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合部位のみを含むのに対し、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が少なとも２つのエピトープ結合部位を含む点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、単一のエピトープ結合部位のみを含む点でダイアボディ型結合ドメインとは異なる。したがって、本明細書中で使用する場合、Ｆａｂ型、およびｓｃＦｖ型結合ドメインはダイアボディ型結合ドメインとは異なる。
典型的には、本発明の三価結合分子は４つの異なるポリペプチド鎖を含むが（図６Ａ〜６Ｂ参照）、分子は、例えば、そのようなポリペプチド鎖を（例えば、ペプチド結合を介して）互いに融合させることによるか、またはそのようなポリペプチド鎖を分割してさらなるポリペプチド鎖を形成することによるか、またはジスルフィド結合を介してより少ないもしくはさらなるポリペプチド鎖を結合させることによって、それよりも少ないかもしくは多い数のポリペプチド鎖を含んでいてもよい。図６Ｃ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有するそのような分子を概略的に描画することによって本発明のこの態様を示す。図６Ａ〜６Ｆで提示するように、本発明の三価結合分子は、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対してＮ末端（図６Ａ、６Ｃおよび６Ｄ）またはＣ末端（図６Ｂ、６Ｅおよび６Ｆ）である別の配向を有し得る。
ある特定の実施形態において、本発明のそのような三価結合分子の第一ポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン、（ｉｉｉ）ヘテロダイマー促進ドメイン、および（ｉｖ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む。ＶＬ１およびＶＬ２ドメインは、表４で提示するようにＣＨ２−ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置する（図６Ａおよび６Ｂも参照）。そのような実施形態の第二のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン、および（ｉｉｉ）ヘテロダイマー促進ドメインを含む。そのような実施形態の第三のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン、（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメインおよび（ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む。第三のポリペプチド鎖は、ＶＨ３および重鎖定常領域を含む抗体の重鎖、またはそのようなドメインを含むポリペプチドであってもよい。そのような実施形態の第四のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメインおよび（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含む。第四のポリペプチド鎖は、第三のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補性であるＶＬ３を含む抗体の軽鎖、またはそのようなドメインを含むポリペプチドであってよい。第三または第四のポリペプチド鎖は、自然発生的な抗体から単離することができる。別法として、それらは組換えによるか、合成によるか、または他の手段によって構築することができる。
第一および第二のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、それらのＶＬ１／ＶＨ２（またはそれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインが一緒に結合して、第一または第二エピトープのいずれかと結合できるエピトープ結合部位を形成するのを可能にするには短すぎる長さを有する介在するスペーサーペプチドによって、そのようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから離間されている。この目的のために好ましい介在するスペーサーペプチド（リンカー１）は配列（配列番号６９）：ＧＧＧＳＧＧＧＧを有する。三価結合分子の他のドメインは、場合によってシステイン残基を含んでいてもよい、１以上の介在するスペーサーペプチド（リンカー）によって離間されていてもよい。特に、上記のように、そのようなリンカーは、典型的には、可変ドメイン（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）とペプチドヘテロダイマー促進ドメイン（例えば、ＥコイルまたはＫコイル）との間、およびそのようなペプチドヘテロダイマー促進ドメイン（例えば、ＥコイルまたはＫコイル）とＣＨ２−ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。三価結合分子の生成に有用な例示的リンカーは上記で提示され、またＰＣＴ出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１；およびＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６でも提示されている。したがって、そのような三価結合分子の第一および第二のポリペプチド鎖は一緒に結合して、第一エピトープと結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、ならびに第二エピトープと結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。そのような三価結合分子の第三および第四のポリペプチド鎖は一緒に結合して、第三エピトープと結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
前述のように、本発明の三価結合分子は３つのポリペプチドを含み得る。３つのポリペプチド鎖を含む三価結合分子は、場合によって、第四のポリペプチドＮ末端のドメインを第三のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインと連結させることによって得ることができる（例えば、介在するスペーサーペプチド（リンカー４）を使用）。別法として、以下のドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン、および（ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３配列を含むドメインを含む本発明の三価結合分子の第三のポリペプチド鎖が利用され、ここで、ＶＬ３およびＶＨ３は、これらのドメインを結合させてエピトープ結合部位を形成するために充分長い（少なとも９アミノ酸残基以上）介在するスペーサーペプチドによって互いに離間されている。この目的のために好ましい一つの介在するスペーサーペプチドは、配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１００）を有する。
そのような三価結合分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２、およびＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、単一特異的、二重特異的または三重特異的である結合を可能にするように異なっていてもよいと理解される。特に、ＶＬおよびＶＨドメインは、三価結合分子が第一エピトープについての２つの結合部位と第二エピトープについての１つの結合部位とを含むか、または第一エピトープについての１つの結合部位と第二エピトープについての２つの結合部位とを含むか、または第一エピトープについての１つの結合部位と第二エピトープについての１つの結合部位と第三エピトープについての１つの結合部位とを含むように、選択することができる。
しかしながら、本明細書中で提示するように、これらのドメインは、好ましくはＡＤＡＭ９のエピトープ、第二分子のエピトープ、および第三分子のエピトープと結合するように選択される。ある特定の実施形態において、第二分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）である。ある特定の実施形態において、第三分子はＣＤ８である。
本発明の三価結合分子のポリペプチド鎖の一般的構造を図６Ａ〜６Ｆおよび表５に提示する：
ＨＰＤ＝ヘテロダイマー促進ドメイン
本発明の一実施形態は、ＡＤＡＭ９の２つのエピトープ結合部位と第二分子の１つのエピトープ結合部位とを含む三価結合分子に関する。ＡＤＡＭ９の２つのエピトープ結合部位は同じエピトープまたは異なるエピトープと結合し得る。本発明の別の実施形態は、ＡＤＡＭ９の１つのエピトープ結合部位と第二分子の２つのエピトープ結合部位とを含む三価結合分子に関する。第二分子の２つのエピトープ結合部位は第二分子の同じエピトープまたは異なるエピトープと結合し得る。本発明のさらなる実施形態は、ＡＤＡＭ９の１つのエピトープ結合部位と、第二分子の１つのエピトープ結合部位と、第三分子の１つのエピトープ結合部位とを含む三重特異的三価結合分子に関する。ある特定の実施形態において、第二分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）である。ある特定の実施形態において、第二分子はＣＤ３であり、第三分子はＣＤ８である。前記提示のように、そのような三価結合分子は３、４、５、またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
ＩＸ．定常ドメインおよび変異体Ｆｃ領域
本明細書中で提供するのは、本発明のＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）の生成において有用な抗体「定常ドメイン」である。
好ましいＣＬドメインはヒトＩｇＧ ＣＬκドメインである。例示的ヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS
TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
である。
別法として、例示的ＣＬドメインはヒトＩｇＧ ＣＬλドメインである。例示的ヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL
SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
である。
本明細書中で提示するように、本発明のＡＤＡＭ９結合分子はＦｃ領域を含み得る。本発明のそのような分子のＦｃ領域は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のものであり得る。本発明のＡＤＡＭ９結合分子はＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をさらに含み得る。存在する場合、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃ領域と同じアイソタイプのものである。
例示的ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。例示的ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。例示的ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
例示的ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインである。例示的ヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号２０７）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである。例示的ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１０５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
１つの例示的なヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は（配列番号９６）：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰである。
別の例示的ヒンジ領域はヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は（配列番号９７）：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰである。
別の例示的ヒンジ領域はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は（配列番号９８）：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰである。前述のように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換などの安定化変異を含み得る。例示的安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は（配列番号９９）：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰである。
本発明のＦｃ領域含有分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）のＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域（例えば、完全ＩｇＧ Ｆｃ領域）またはＦｃ領域のフラグメントのみのいずれかであってもよい。任意に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域はＣ末端リジンアミノ酸残基を欠いている。
伝統的な免疫機能において、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒、および食作用などのエフェクター機能からリンパ球増殖および抗体分泌の調節などの免疫調節シグナルまで及ぶ、幅広い応答が得られる。これらの相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のＦｃ領域の造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体および免疫複合体によって引き起こされる様々な細胞応答は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造的不均一性に起因する。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（すなわち、免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害（すなわち、免疫系抑制）受容体である。さらに、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環および血液中への放出を媒介する。例示的野生型ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）、およびＩｇＧ４（配列番号４）のアミノ酸配列は上記で提示している。
Ｆｃ領域の修飾は、変更された表現型、例えば変更された血清半減期、変更された安定性、細胞酵素に対する変更された感受性または変更されたエフェクター機能をもたらし得る。したがって、本発明のＦｃ領域含有ＡＤＡＭ９結合分子をエフェクター機能に関して修飾して、例えばがんの治療におけるそのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。エフェクター機能の減弱または除去が、ある場合では、例えば、その作用機序が遮断または拮抗作用に関与するが、標的抗原を有する細胞の殺滅には関与しない抗体の場合では望ましい。増大したエフェクター機能は概して、望ましくない細胞、例えば、ＦｃγＲが低レベルで発現される場合、例えば、低レベルのＦｃγＲＩＩＢを有する腫瘍特異的Ｂ細胞である腫瘍および異質細胞に向けられる場合に望ましい（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ、およびバーキットリンパ腫）。そのような付与または変更されたエフェクター機能活性を有する本発明の分子は、エフェクター機能活性の増強された有効性が望ましい疾患、障害または感染の治療および／または予防に有用である。
したがって、ある特定の実施形態において、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は操作された変異体Ｆｃ領域であり得る。本発明の二重特異的Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は１以上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）と結合する能力を有し得、さらに好ましくはそのような変異体Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対して変更された結合を有し（野生型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）、例えば活性化受容体に対する結合が増強されている、および／または阻害受容体（複数可）に対して結合する能力が実質的に減少しているかまたはない。したがって、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの一部もしくは全部および／またはＣＨ３ドメインの一部もしくは全部を含み得るか、あるいは変異ＣＨ２および／または変異ＣＨ３配列（例えば、完全Ｆｃ領域のＣＨ２またはＣＨ３ドメインに関して１以上の挿入および／または１以上の欠失を含み得るもの）を含み得る。そのようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を含み得るか、または非天然完全Ｆｃ領域の部分を含み得るか、またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインの非自然発生的な配向（例えば、２つのＣＨ２ドメインもしくは２つのＣＨ３ドメイン、またはＮ末端からＣ末端への方向でＣＨ２ドメインに連結したＣＨ３ドメインなど）を含み得る。
活性化受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する結合を増大させ、阻害受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合を減少させる修飾をはじめとする、エフェクター機能を変更するとして特定されているＦｃ領域修飾は当該技術分野で公知である（例えば、Stavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表６は、活性化受容体に対する結合を増大させる、および／または阻害受容体に対する結合を減少させる例示的修飾の例示的単一、二重、三重、四重および五重置換を列挙する（ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数であり、置換は配列番号１のアミノ酸配列に対するものである）。
ＣＤ３２Ｂに対する結合が低減した、および／またはＣＤ１６Ａに対する結合が増大したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩまたはＰ３９６Ｌ置換を含み、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである。これらのアミノ酸置換は、任意の組み合わせでヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域中に存在し得る。一実施形態において、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域はＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２ＰおよびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態において、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ置換を含む。
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子のＦｃ領域にとって、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する減少した結合を示す（または実質的に示さない）ことが好ましい（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号１）によって示される結合に対して）。具体的な実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は減少したＡＤＣＣエフェクター機能を示すＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態において、そのようなＡＤＡＭ９結合分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、およびＮ２９７Ｇのいずれか１、２、３、または４つを含み、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである。別の実施形態において、これらの変異はＦｃＲ結合を消失させるので、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換またはＤ２６５Ａ置換を含む。別法として、（野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号１）によって示される結合およびエフェクター機能に比べて）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対して本質的に減少した（または実質的にない）結合および／または減少したエフェクター機能を示す自然発生的なＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを利用する。具体的な実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、ＩｇＧ２Ｆｃ領域（配列番号２）またはＩｇＧ４Ｆｃ領域（配列番号４）を含む。ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を利用する場合、本発明はまた、前述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換などの安定化変異の導入も含む（例えば、配列番号９９を参照）。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＤ２６５Ａ置換はエフェクター機能を消失させるので、エフェクター機能が望ましい状況においては、これらの置換は好ましくは用いられない。
エフェクター機能が減少または消失した本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの好ましいＩｇＧ１配列は、置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（下線で示す）を含み（配列番号１０６）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS
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ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの第二の好ましいＩｇＧ１配列は、Ｓ４４２Ｃ置換（下線で示す）を含むので、２つのＣＨ３ドメインがジスルフィド結合を介して互いに共有結合することが可能になるか、または薬物部分のコンジュゲーションが可能になる。そのような分子のアミノ酸配列は（配列番号１０７）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
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であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの第三の好ましいＩｇＧ１配列は、エフェクター機能を減少または消失させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示す）と２つのＣＨ３ドメインが薬物部分のジスルフィド結合またはコンジュゲーションにより互いに共有結合することを可能にするＳ４４２Ｃ置換（下線で示す）とを含む。そのような分子のアミノ酸配列は（配列番号１０８）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
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であり、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎのＦｃ領域の結合親和性を増大させることによって増大させることができる。「半減期」という用語は、本明細書中で使用する場合、それらの投与後の分子の平均生存時間の尺度である分子の薬物動態学的特性を意味する。半減期は、例えば、血清中で測定される、すなわち、循環半減期、または他の組織において測定されるような、対象の（例えば、ヒト患者または他の哺乳類）身体またはその特定の区画から既知量の分子の５０パーセント（５０％）を除去するために必要な時間として表すことができる。概して、半減期の増加は、投与された分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体Ｆｃ領域を含むので、前記分子が（野生型Ｆｃ領域を含む分子と比べて）増大して半減期を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異体Ｆｃ領域は２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５、および４３６からなる群から選択される１以上の位置で半減期延長アミノ酸置換を含み、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである。Ｆｃ領域含有分子の半減期を増大させることが可能な多くの変異が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，２７７，３７５号、同第７，０８３，７８４号；同第７，２１７，７９７号、同第８，０８８，３７６号；米国公開第２００２／０１４７３１１号；同第２００７／０１４８１６４号；およびＰＣＴ公開番号国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；および国際公開第２０１０／０３３２７９号に記載されている変異を参照。増大した半減期を有するＡＤＡＭ９結合分子はまた、Ｆｃ領域残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５および４３６のうちの２つ以上で置換を含む変異体Ｆｃ領域を有するものも含む。特に、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ、およびＹ４３６Ｉから選択される２以上の置換であり、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである。
具体的な実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、置換：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２ＹおよびＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２ＹおよびＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８ＶおよびＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４ＡおよびＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８ＰおよびＮ４３４Ａ；または
（Ｉ）Ｋ２８８ＤおよびＨ４３５Ｋ
を含む変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を有する。
好ましい実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅのいずれか１つ、２つ、または３つを含む変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を有する。本発明はさらに：
（Ａ）エフェクター機能および／またはＦｃγＲを変更する１以上の変異；ならびに
（Ｂ）血清半減期を延長する１以上の変異
を含む変異体Ｆｃ領域を有するＡＤＡＭ９結合分子を包含する。
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの第四の好ましいＩｇＧ１配列は、血清半減期を延長するように、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換（下線で示す）を含む。そのような分子のアミノ酸配列（配列番号２００）は：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
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であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの第五の好ましいＩｇＧ１配列は、エフェクター機能を低減するかまたは消失させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示す）と、血清半減期を延長するようなＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換（下線で示す）とを含む。そのような分子のアミノ酸配列（配列番号２０１）は：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
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であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの第六の好ましいＩｇＧ１配列は、エフェクター機能を低減するかまたは消失させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示す）と、血清半減期を増強するようなＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換（下線で示す）と、２つのＣＨ３ドメインがジスルフィド結合を介して互いに共有結合することを可能にするかまたは薬物部分のコンジュゲーションを可能にするようにＳ４４２Ｃ置換（下線で示す）とを含む。そのような分子のアミノ酸配列（配列番号２０３）は：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
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であり、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
そのＦｃ領域含有第一および第三のポリペプチド鎖が同一でないある特定の抗体、ダイアボディおよび三価結合分子について、２つの第一ポリペプチド鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン間または２つの第三のポリペプチド鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン間でホモダイマー化が起こるのを低減または防止することが望ましい。そのようなポリペプチド鎖のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には、２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を助長するように修飾される。例えば、立体障害が同様に変異したドメインとの相互作用を防止し、変異ドメインを相補的または適応（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｎｇ）変異が操作されたドメイン、すなわち、「ホール」（例えば、グリシンでの置換）と対合させるように、アミノ酸置換（好ましくは、例えばトリプトファンなどの、「こぶ」を形成するかさ高い側基を含むアミノ酸での置換）をＣＨ２またはＣＨ３ドメインに導入することができる。そのような変異セットを、ヘテロダイマー化を助長するＦｃ領域を形成するＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドの任意の対に操作することができる。ホモダイマー化よりもヘテロダイマー化を選択するタンパク質操作の方法は、当該技術分野において、特にイムノグロブリン様分子の操作に関して公知であり、本明細書中に含まれる（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる、Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35; and Xie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；を参照）。
好ましいこぶは、修飾Ｔ３６６Ｗを含むようにＩｇＧ Ｆｃ領域を修飾することによって作製される。好ましいホールは、修飾Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むようにＩｇＧ Ｆｃ領域を修飾することによって作製される。最終の二重特異的ヘテロダイマーＦｃ領域含有分子からホール保有第三ポリペプチド鎖ホモダイマーを精製するのを支援するために、第三ポリペプチド鎖のホール保有ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、好ましくは位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。したがって、ホール保有第三ポリペプチド鎖ホモダイマーはタンパク質Ａと結合しないのに対して、二重特異的ヘテロダイマーは第一ポリペプチド鎖上のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａと結合する能力を保持する。別の実施形態において、ホール保有第三ポリペプチド鎖は位置４３４および４３５においてアミノ酸置換（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）を組み入れることができる。
本発明のＦｃ領域含有分子の第一ポリペプチド鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの好ましいＩｇＧアミノ酸配列は「こぶ保有」配列（配列番号１０９）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS
LSLSPGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第二のポリペプチド鎖（または３つ、４つ、もしくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第三のポリペプチド鎖）のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの好ましいＩｇＧアミノ酸配列は「ホール保有」配列（配列番号１１０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS
LSLSPGX
を有し、ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
わかるように、配列番号１０９および配列番号１１０のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、位置２３４におけるアラニンでの、２３５におけるアラニンでの置換を含み、したがってＦｃ領域を形成し、これはは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合が（野生型Ｆｃ領域（配列番号１によって示される結合にと比べて）減少している（または実質的にない）。本発明はまた、そのようなＣＨ２−ＣＨ３ドメインも包含し、これはＦｃ領域のエフェクター機能および／またはＦγＲ結合活性を修飾する野生型アラニン残基、代替的および／または付加的置換を含む。
本発明はまた、１以上の半減期を延長するアミノ酸置換をさらに含むそのようなＣＨ２−ＣＨ３ドメインも包含する。特に、本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換をさらに含むそのようなホール保有およびそのようなこぶ保有ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを包含する。
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換を含み、またＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ置換をさらに含む例示的こぶ保有ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを以下に提示する（配列番号２０４）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS
LSLSPGX
ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換を含み、さらにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ置換を含む例示的ホール保有ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを以下に提示する（配列番号２０５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS
LSLSPGX
ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
第一ポリペプチド鎖が「こぶ保有」ＣＨ２−ＣＨ３配列、例えば配列番号１０９のものを有するのが好ましい。しかしながら、わかるように、「ホール保有」ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（例えば、配列番号１１０を第一ポリペプチド鎖で使用することができ、この場合、「こぶ保有」ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（例えば、配列番号１０９）は２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第二のポリペプチド鎖において（または３つ、４つ、もしくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第三のポリペプチド鎖において）用いられる。
他の実施形態において、本発明は、全て参照により全体として本明細書中に組み込まれるＰＣＴ公開番号国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；および国際公開第２０１３／０６８６７号で開示されているものなどの、当該技術分野で公知の変異を用いたホモダイマー化よりもヘテロダイマー化を選択するように操作されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むＡＤＡＭ９結合分子を包含する。
Ｘ．エフェクター細胞結合能
本明細書中で提示するように、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、標的細胞または組織タイプにとって独特の抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組み合わせを含むように操作することができる。特に、本発明は、ＡＤＡＭ９のエピトープおよびＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞などのエフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープと結合することができる多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子に関する。例えば、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはＮＫＧ２Ｄと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むような構造であり得る。本発明はまた、ＣＤ３のエピトープおよびＣＤ８のエピトープと結合することができる三重特異的ＡＤＡＭ９結合分子にも関する（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照）。
Ａ．ＣＤ２結合能
一実施形態において、本発明の二重特異的、三重特異的または多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子はＡＤＡＭ９のエピトープおよびＣＤ２のエピトープと結合することができる。ＣＤ２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に見られる細胞接着分子である。ＣＤ２はおそらくはＮＫ細胞ナノチューブ形成のプロモータとしてＮＫ細胞の細胞毒性を増強する（Mace, E.M. et al. (2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation,” PLoS One 7(10):e47664:1-12）。ＣＤ２と特異的に結合する分子は抗ＣＤ２抗体「Ｌｏ−ＣＤ２ａ」を含む。
Ｌｏ−ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受入番号１１４２３）；配列番号１１１）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR IDPEDGSIDY VEKFKKKATL
TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
Ｌｏ−ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受入番号１１４２３；配列番号１１２）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS
GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP YTFGAGTKLE LK
Ｂ．ＣＤ３結合能
一実施形態において、本発明の二重特異的、三重特異的または多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子はＡＤＡＭ９のエピトープおよびＣＤ３のエピトープと結合することができる。ＣＤ３は４つの異なる鎖から構成されるＴ細胞コレセプターである（Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14）。哺乳類では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成するために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と結合する。ＣＤ３の非存在下で、ＴＣＲは適切に集合せず、分解する（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170–177）。ＣＤ３は全ての成熟Ｔ細胞の膜と結合し、実質的に他の細胞型においては結合しないことが判明している（Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139を参照）。ＣＤ３と特異的に結合する分子には抗ＣＤ３抗体「ＣＤ３ ｍＡｂ−１」および「ＯＫＴ３」が含まれる。抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｍＡｂ−１は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）と結合することが可能である。
ＣＤ３ｍＡｂ−１ ＶＨ（１）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１３）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF
TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（２）の別のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は一重の下線で示し；ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（１）のＶＨドメイン（配列番号９２）に対する差異を二重の下線で示す）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF
TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１５）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG
GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（１）のＶＨドメイン（配列番号）をＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメイン（配列番号）とともに使用して、本発明よる機能的ＣＤ３結合分子を形成することができる。同様に、ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（２）のＶＨドメイン（配列番号）をＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメイン（配列番号）とともに使用して、本発明による機能的ＣＤ３結合分子を形成することができる。
以下で考察するように、本発明を説明するために、二重特異的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３結合分子を産生した。ＡＤＡＭ９×ＣＤ３構築物の一部では、ＣＤ３ ｍＡｂ−１の変異体を用いることができる。変異体「ＣＤ３ ｍＡｂ−１（Ｄ６５Ｇ）」は、ＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１１５）と、Ｄ６５Ｇ置換を有するＶＨ ＣＤ３ ｍＡｂ−１ドメイン（Ｋａｂａｔ位置６５、配列番号１１３の残基６８に相当）とを含む。
ＣＤ３ ｍＡｂ−１（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１６）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示し、置換された位置（Ｄ６５Ｇ）を二重の下線）で示す：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF
TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
別法として、ＣＤ３ ｍＡｂ−１の親和性変異体を組み入れることができる。変異体は、「ＣＤ３ ｍＡｂ−１ Ｌｏｗ」と指定される低親和性変異体と「ＣＤ３ ｍＡｂ−１ Ｆａｓｔ」と指定されるより速いオフレート（ｆａｓｔｅｒ ｏｆｆ ｒａｔｅ）を有する変異体とを含む。ＣＤ ｍＡｂ１のＶＬドメイン（配列番号１１５）はＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＬｏｗおよびＣＤ３ ｍＡｂ１ Ｆａｓｔに共通であり、前記で提示している。ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＬｏｗおよびＣＤ３ ｍＡｂ−１ Ｆａｓｔの各々のＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に提示する。
抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＬｏｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１７）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す；ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（１）のＶＨドメイン（配列番号１１３）に関する差異を二重の下線で示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF
TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ−１ ＦａｓｔのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１８）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す；ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＨ（１）のＶＨドメイン（配列番号１１３）と比較しての差異を二重の下線で示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF
TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
利用することができるもう１つの抗ＣＤ３抗体は抗体Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３「ＯＫＴ３」である（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26; Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678）。
ＯＫＴ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１９）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSRGYTNY NQKFKDKATL
TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２０）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAH FRGSGSGTSY
SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEINR
利用することができるさらなる抗ＣＤ３抗体には、限定されるものではないが、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００８／１１９５６６号；国際公開第２００５／１１８６３５号で記載されているものが含まれる。
Ｃ．ＣＤ８結合能
一実施形態において、本発明の二重特異的、三重特異的または多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子はＡＤＡＭ９のエピトープおよびＣＤ８のエピトープと結合することが可能である。ＣＤ８は、細胞毒性Ｔ細胞上で発現される、２つの異なる鎖から構成されるＴ細胞コレセプターである（Leahy, D.J., (1995) “A Structural View of CD4 and CD8,” FASEB J., 9:17-25）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、標的細胞の表面上に配置された抗原：主要組織適合（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙ）クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子複合体と、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に配置されたＣＤ８およびＴ細胞受容体の複合体との間の共刺激相互作用によって媒介されることが見いだされている（Gao, G., and Jakobsen, B., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor". Immunol Today 21: 630–636）。ある特定の免疫系細胞のみによって発現されるＭＨＣ ＩＩ分子とは異なって、ＭＨＣ Ｉ分子は非常に広範に発現される。したがって、細胞毒性Ｔ細胞は多種多様の細胞型と結合することが可能である。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は細胞毒素パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンのそれらの放出により細胞殺滅を媒介する。ＣＤ８と特異的に結合する抗体には抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」および「ＴＲＸ２」が含まれる。
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY IYPYTGGTGY NQKFKNKATL
TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２２）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV LIYLASNLES GVPARFSGSG
SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI KR
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２３）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２４）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS RFSGSGSGTD
FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIK
Ｄ．ＣＤ１６結合能
一実施形態において、本発明の多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子は、ＡＤＡＭ９のエピトープおよびＣＤ１６のエピトープと結合することができる。ＣＤ１６はＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。ＣＤ１６は、凝集ヒトＩｇＧと結合するがモノマーヒトＩｇＧとは結合ない、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および組織マクロファージによって発現される（Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511）。ＣＤ１６に特異的に結合する分子は、抗ＣＤ１６抗体「３Ｇ８」および「Ａ９」を含む。ヒト化Ａ９抗体はＰＣＴ公開番号国際公開第０３／１０１４８５号で記載されている。
３Ｇ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２５）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT
ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
３Ｇ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２６）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GIPARFSASG
SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY TFGGGTKLEI K
Ａ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD IYPGGGYTNY NEKFKGKATV
TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA SWYFDVWGAR TTVTVSS
Ａ９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２８）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG LIGHTNNRAP GVPARFSGSL
IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW VFGGGTKLTVL
利用できるさらなる抗ＣＤ１６抗体としては、限定されるものではないが、ＰＣＴ公開番号国際公開第０３／１０１４８５号；および国際公開第２００６／１２５６６８号で記載されているものが挙げられる。
Ｅ．ＴＣＲ結合能
一実施形態において、本発明の二重特異的、三重特異的または多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子は、ＡＤＡＭ９のエピトープおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープと結合することが可能である。Ｔ細胞受容体はＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞によって自然に発現され、そのような細胞が抗原提示細胞のクラスＩクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質によって結合され提示された抗原ペプチドを認識することを可能にする。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド–ＭＨＣ）複合体の認識は、サイトカインの産生および抗原提示細胞の溶解をもたらす細胞性免疫応答の伝播を開始する（例えば、Armstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183–196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534–550を参照）。ＣＤ３はＴＣＲに結合する受容体である（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309）。
Ｔ細胞受容体に対して特異的に結合する分子には抗ＴＣＲ抗体「ＢＭＡ０３１」が含まれる（ＥＰ０４０３１５６；Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 – A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366-4373；およびＰＣＴ公開番号国際公開第２０１０／０２７７９７号）。
ＢＭＡ０３１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY INPYNDVTKY NEKFKGRVTI
TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
ＢＭＡ０３１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF
TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIK
Ｆ．ＮＫＧ２Ｄ結合能
一実施形態において、本発明の多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子はＡＤＡＭ９のエピトープおよびＮＫＧ２Ｄ受容体のエピトープと結合することが可能である。ＮＫＧ２Ｄ受容体は全てのヒト（および他の哺乳類）ナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29)ならびに全てのＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現される（Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）。そのような結合リガンド、特に正常細胞上で発現されないものには、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸早期誘導性遺伝子−１（ＲＡＥ−１）の産物、およびネズミＵＬ１６結合タンパク質様転写物１（ＭＵＬＴ１）が含まれる（Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,” Blood 106:1711-1717)）。ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して特異的に結合する分子には、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体「ＫＹＫ−１．０」および「ＫＹＫ−２．０」が含まれる（Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156）。
ＫＹＫ−１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３１）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI
SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
ＫＹＫ−１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD DDRPSGIPER FFGSNSGNTA
TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG GGTQLTVL
ＫＹＫ−２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３３）を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は下線で示す）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
ＫＹＫ−２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３４）を以下に示す（ＣＤＲＬ残基は下線で示す）：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT
SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL
ＸＩ．多重特異的ＡＤＡＭ９結合分子
Ａ．ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的２本の鎖のダイアボディ
前記最適化ヒト化抗ＡＤＡＭ９ＭＡＢ−Ａ抗体のＶＬおよびＶＨドメインを使用して、２つの共有結合的に連結したポリペプチド鎖から構成され、ＭＡＢ−Ａの前記最適化ヒト化ＶＬおよびＶＨドメインを含むＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的ダイアボディを構築する。そのようなＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的ダイアボディの一般的構造およびアミノ酸配列を以下に提示する。
１つの例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な２本鎖のダイアボディの第一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＬドメイン（例えば、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン（例えば、ＣＤ３ ｍＡｂ１（Ｄ６５Ｇ）（配列番号１１６））；システインを含有する介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７０））；ヘテロダイマー促進（例えば、Ｅコイル）ドメイン（ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号８２））；およびＣ末端を含む。
そのような例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な２本鎖のダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；対応する抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン（例えば、第一ポリペプチド鎖のＶＨドメインと一緒になってＣＤ３結合部位を形成するＶＬドメイン、例えばＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１１５）；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；対応する抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＨドメイン（例えば、第一ポリペプチド鎖のＶＬドメインと一緒になってＡＤＡＭ９結合部位を形成するＶＨドメイン、例えばｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）；システインを含有する介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７０））；ヘテロダイマー促進（例えば、Ｋコイル）ドメイン（ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号８３））；およびＣ末端を含む。
本明細書中で提示するように、別のリンカーおよび／または別のヘテロダイマー促進ドメインはそのようなダイアボディの生成で利用され得る。例えば、別の例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な２本鎖のダイアボディの第一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＬドメイン；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；抗ＣＤ３抗体または対応する抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン；介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＡＳＴＫＧ（配列番号７４））；システインを含有するヘテロダイマー促進（例えば、Ｋコイル）ドメイン（ＫＶＡＡＣＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号８５））；およびＣ末端を含み得る。そのような別の例示的ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；対応する抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；対応する抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＨドメイン；介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＡＳＴＫＧ（配列番号７４））；システインを含有するヘテロダイマー促進（例えば、Ｅコイル）ドメイン（ＥＶＡＡＣＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号８４））；およびＣ末端を含み得る。
ｈＭＡＢ−ＡのＶＨおよびＶＬドメイン（２．２）ならびにＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＨおよびＶＬドメインを含む代表的なＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な２本の鎖のダイアボディ（「ＤＡＲＴ−１」）を構築する。
ＤＡＲＴ‑１の第一ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１３５）を以下に示す（ｈＭＡｂ−Ａ ＶＬ（２）ドメインの配列（配列番号５５）に下線を引き；ＣＤ３ｍＡｂ−１（Ｄ６５Ｇ）ＶＨドメインの配列（配列番号１１６）はイタリック体表記である）：
ＤＡＲＴ‑１の第二のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１３６）を以下に示す（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）ドメインの配列（配列番号１７）に下線を引き；ＣＤ３ｍＡｂ−１ＶＬドメインの配列（配列番号１１５）はイタリック体表記である）：
Ｂ．ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な三本鎖のダイアボディ
ＡＤＡＭ９について特異的な１つの結合部位（ｈＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化ＶＨおよびＶＬドメインを含む）およびＣＤ３について特異的な１つの結合部位（ＣＤ３ ｍＡｂ１のＶＬおよびＶＨドメインを含む（Ｄ６５Ｇ））を有する、三本鎖を有しＦｃ領域を有するＡＤＡＭ９×ＣＤ３ダイアボディが生成される。ダイアボディは「ＤＡＲＴ−２」と指定される。
例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的三本の鎖ダイアボディの第一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＬドメイン（例えば、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５））；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；ＣＤ３ ｍＡｂ１のＶＨドメイン（Ｄ６５Ｇ）（配列番号１１６）；介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＡＳＴＫＧ（配列番号７４））；システインを含有するヘテロダイマー促進（Ｅコイル）ドメイン（ＥＶＡＡＣＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ−ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号８２））；介在するスペーサーペプチド（リンカー３：ＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９４））；こぶ保有ＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号１０９）；およびＣ末端を含む。このポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０９のＣ末端リジン残基（すなわち、配列番号１０９のＸ）をコードし得るが、上記のように、このリジン残基は、一部の発現系では翻訳後に除去することができる。したがって、本発明は、そのようなリジン残基（すなわち、Ｘがリジンである配列番号１０９）、ならびにそのようなリジン残基を欠いた第一ポリペプチド鎖（すなわち、Ｘが存在しない配列番号１０９）を含む第一ポリペプチド鎖を包含する。ＤＡＲＴ−２のそのような第一ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１３７）を以下に提示する（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）ドメインの配列（配列番号５５）に下線を引き；ＣＤ３ ｍＡｂ−１（Ｄ６５Ｇ）ＶＨドメインの配列（配列番号１１６）はイタリック体表記である）：
ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的な三本の鎖ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；ＣＤ３ ｍＡｂ１のＶＬドメイン（配列番号１１５）；介在するスペーサーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９））；抗ＡＤＡＭ９抗体のＶＨドメイン（例えば、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７））；介在するスペーサーペプチド（リンカー２：ＡＳＴＫＧ（配列番号７４））；システインを含有するヘテロダイマー促進（Ｋコイル）ドメイン（ＫＶＡＡＣＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ−ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号８５））；およびＣ末端を含む。ＤＡＲＴ−２のそのような第二のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１３８）を以下に提示する（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）ドメインの配列（配列番号１７）に下線を引き；ＣＤ３ ｍＡｂ−１ ＶＬドメインの配列（配列番号１１５）はイタリック体表記である）：
例示的ＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的三本鎖ダイアボディの第三のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向で：Ｎ末端；スペーサーペプチド（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号９３））；ホール保有ＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（配列番号１１０）；およびＣ末端を含む。このポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１０のＣ末端リジン残基（すなわち、配列番号１１０のＸ）をコードすることができるが、上記のように、このリジン残基は一部の発現系においては翻訳後に除去され得る。したがって、本発明は、そのようなリジン残基を含む第三のポリペプチド鎖（すなわち、配列番号１１０、式中、Ｘはリジンである）、ならびにそのようなリジン残基を欠いた第三のポリペプチド鎖（すなわち、配列番号１１０、式中、Ｘは存在しない）を包含する。そのような第三のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１３９）を以下に提示する：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK
NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX
ここで、Ｘはリジン（Ｋ）であるかまたは存在しない。
本明細書中で提示する教示を考慮すると、異なるドメイン配向、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、リンカー、および／またはヘテロダイマー促進ドメインを利用して、別のＡＤＡＭ９×ＣＤ３二重特異的三本鎖ダイアボディを生成することができることが理解されよう。特に、異なるｈＭＡＢ−Ａ変異体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを利用することができる。
Ｃ．ＡＤＡＭ９×ＣＤ３×ＣＤ８三価結合分子
ＡＤＡＭ９に対して特異的な１つの結合部位と、ＣＤ３に対して特異的な１つの結合部位（例えば、ＣＤ３ ｍＡｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１１５）と、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＣＤ３ ｍＡｂ１（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン（配列番号１１６）とを含む）、ならびにＣＤ８に対して特異的な１つの結合部位（例えば、ＴＲＸ２のＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれ配列番号１２３および１２４）を有する例示的三価「ＡＤＡＭ９×ＣＤ３ｘＣＤ８」結合分子（前述の様に、親および／またはヒト化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインと対応する抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインとを含む）。そのような三価結合分子は、２つのポリペプチド鎖（例えば、図６Ｅ、および図６Ｆを参照）、３つのポリペプチド鎖（例えば、図６Ｃおよび図６Ｄを参照）、４つのポリペプチド鎖（例えば、図６Ａおよび図６Ｂを参照）、または５つのポリペプチド鎖（例えば、図５を参照）を有し得る。
ＸＩＩ．産生方法
本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、最も好ましくは、当該技術分野で周知のように、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子の組換え発現によって産生される。
本発明のポリペプチドは固相ペプチド合成を用いて都合よく調製することができる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
別法として、抗体は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて組換え的に作製することができ、発現することができる。抗体は、宿主動物から作製される抗体をまず単離し、遺伝子配列を得、そして遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において組換え的に抗体を発現することによって、組換え的に作製することができる。用いることができる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニックミルクにおいて抗体配列を発現することである。植物またはミルクにおいて組換え的に抗体を発現するために適した方法が開示されている（例えば、Peeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al. (1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol Methods 231:147-157を参照）。抗体の誘導体を作製するために適した方法、例えば、ヒト化、単鎖などは当該技術分野で公知であり、前述した。別法として、抗体は、ファージディスプレイ技術によって組換え的に作製することができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；同第６，２６５，１５０号；およびWinter, G. et al. (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
関心対象のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＡＤＡＭ９結合分子のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド）を含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染病原体である場合）を含む多数の適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。
異種ＤＮＡを過剰発現することが可能な任意の宿主細胞は、関心対象のポリペプチドまたはタンパク質を発現する目的で使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定例としては、限定されるものではないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。
本発明は、本発明のＡＤＡＭ９結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野で公知の手順によって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、前記のような組換え法によって（すなわち、単一または融合ポリペプチド）または化学合成によって、産生することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０までのアミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成によって都合よく産生される。化学合成の方法は、当該技術分野で公知であり、商業的に入手可能である。
本発明は、そのような分子ならびに活性が増大または減少した変異体の特性に著しい影響を及ぼさない機能的に等価なポリペプチドをはじめとする、ＡＤＡＭ９結合分子の変異体を含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野の通常の業務であり、本明細書中で詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を著しくまたは有害に変更しないアミノ酸の１以上の欠失もしくは付加を有するポリペプチド、または化学的アナログの使用が挙げられる。互いに保存的に置換することができるアミノ酸残基としては、限定されるものではないが：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシンが挙げられる。これらのペプチドには、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖を用いたグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、すなわち、置換アミノ酸は、もとのアミノ酸と類似した化学的特性を有する。そのような保存的置換は当該技術分野で公知であり、例は上記で提示している。アミノ酸修飾は、１以上のアミノ酸を変更または修飾することから、可変ドメインなどの領域の再設計を完成することまで多岐に及び得る。可変ドメインにおける変更は、結合親和性および／または特異性を変更することができる。修飾の他の方法には、限定されるものではないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化をはじめとする当該技術分野で公知のカップリング技術を使用することが含まれる。修飾は、例えば、イムノアッセイのための標識を取り付けるため、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の取り付けのために使用することができる。修飾ポリペプチドは、当該技術分野で確立された手順を使用して作製され、当該技術分野で公知の標準的アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
本発明は、１以上の本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨを含む融合タンパク質を含む。一実施形態では、軽鎖、重鎖または軽および重鎖の両方を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、異種イムノグロブリン定常領域を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＡＤＡＭ９および天然の分子においては結合しない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域からの異種配列または相同性配列と特異的に結合する１以上のポリペプチドドメインを含む。
本発明は特に、診断または治療部分とコンジュゲートしたＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、三価結合分子など）を含む。診断目的で、本発明のＡＤＡＭ９結合分子を検出可能な物質とカップリングさせることができる。そのようなＡＤＡＭ９結合分子は、特定の療法の有効性の決定など、臨床試験手順の一部として、疾患の発生または進行のモニタリングおよび／または余地のために有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、補欠分子族（例えば、アビジン／ビオチン）、蛍光体（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、またはフィコエリトリン）、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼまたはエクオリン）放射性物質（例えば、炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５または亜鉛６５）、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、ＡＤＡＭ９結合分子と直接的に、または当該技術分野で公知の技術を用いて中間体（例えば、リンカー）を介して間接的に、カップリングまたはコンジュゲートさせることができる。
治療目的で、本発明のＡＤＡＭ９結合分子を、細胞毒素、（例えば、細胞分裂阻害または細胞破壊剤）、治療薬または放射性金属イオン、例えばα放射体などの治療部分とコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞毒性薬としては、細胞に対して有害な任意の薬剤、例えば、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシンアブリン、サポリン、およびそのような薬剤の細胞毒性フラグメントが挙げられる。治療薬には、障害を予防的または治療的に処置する治療効果を有する任意の薬剤が含まれる。そのような治療薬は、化学的治療薬、タンパク質またはポリペプチド治療薬であってよく、所望の生物学的活性を有する、および／または所与の生物学的応答を修飾する治療薬が挙げられる。治療薬の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤および細胞増殖性障害の治療に有用な抗体が挙げられる。治療部分は、ＡＤＡＭ９結合分子と直接的に、または当該技術分野で公知の技術を用いて中間体（例えば、リンカー）を介して間接的に、カップリングもしくはコンジュゲートすることができる。
ＸＩＩＩ．本発明のＡＤＡＭ９結合分子の使用
本発明は、本発明のＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、二重特異的抗体、二重特異的ダイアボディ、三価結合分子など）、そのような分子由来のポリペプチド、そのような分子またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、および本明細書中で記載する他の薬剤を含む医薬組成物をはじめとする組成物を包含する。
本明細書中で提示するように、本明細書中で提示する抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、細胞の表面上に存在するＡＤＡＭ９と結合する能力を有し、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導する、および／または再指示された細胞殺滅（例えば、再指示されたＴ細胞毒性）を媒介する。
したがって、本明細書中で提供する抗ＡＤＡＭ９−ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、ＡＤＡＭ９の発現と関連するかまたはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる任意の疾患または状態を治療する能力を有する。前述のように、ＡＤＡＭ９は、あまり分化していない形態を示す高等級の腫瘍と関連し、不良な臨床成績と相関する多くの血液および固形悪性腫瘍中で発現される腫瘍胚性（ｏｎｃｏ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）抗原である。したがって、制限なく、本発明のＡＤＡＭ９結合分子を、がん、特にＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられるがんの診断または治療で用いることができる。
特に、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、リンパ球がん、非小細胞肺がん、骨髄がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、甲状腺がん、睾丸がん、および子宮がんの治療で使用することができる。
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＡＭ−９結合分子は、非小細胞肺がん（扁平上皮細胞、腺癌、または未分化大細胞がん）および結腸直腸がん（腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮癌）の治療において有用であり得る。
本発明の二重特異的ＡＤＡＭ９結合分子は、そのような分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄなど）の二次的特異性を発現する腫瘍細胞の再指示された殺滅を促進することによりＡＤＡＭ９によって提供されるがん療法を増進する。そのようなＡＤＡＭ９結合分子はがんの治療に特に有用である。
療法におけるそれらの有用性に加えて、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は、検出可能に標識することができ、がんの診断または腫瘍および腫瘍細胞の画像化で使用することができる。
ＸＩＶ．医薬組成物
本発明の組成物には、医薬組成物の製造において有用なバルク薬物組成物（例えば、不純または非滅菌組成物）および単位投与形態の調製において使用できる医薬組成物（すなわち、対象または患者への投与に適した組成物）が含まれる。そのような組成物は、予防もしくは治療有効量の本発明のＡＤＡＭ９結合分子、またはそのような薬剤の組み合わせと、医薬的に許容される担体とを含む。好ましくは、本発明の組成物は予防もしくは治療有効量の本発明のＡＤＡＭ９結合分子と医薬的に許容される担体とを含む。本発明は更に、特定のがん抗原に対して特異的な第二の治療抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、医薬的に許容される担体とをさらに含む医薬組成物も包含する。
具体的な実施形態において、「医薬的に許容される」という語は、連邦もしくは合衆国政府の規制機関によって認可されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用についての他の一般的に認知されている薬局方で記載されていることを意味する。「担体」という語は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイドアジュバント（完全および不完全）、賦形剤、またはビヒクルを指す。概して、本発明の組成物の成分は、別々に、または単位投与形態中に合わせて混合して、例えば、活性剤の量を表示するアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として去給される。組成物が注入によって投与される場合は、滅菌医薬等級水または食塩水を含む注入ビンで分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、成分を投与前に混合し得るように提供することができる。
本発明はまた、本発明のＡＤＡＭ９結合分子を単独またはそのような他の医薬的に許容される担体とともに充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１以上の他の予防または治療薬も医薬パックまたはキット中に含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定された形態の注意書を任意にそのような容器（複数可）に添付することができ、当該注意書は、ヒト投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映する。
本発明は前記方法で使用することができるキットを提供する。キットは本発明のＡＤＡＭ９結合分子のいずれかを含み得る。キットは、１以上の容器中に、がんの治療に有用な１以上の他の予防および／または治療薬を含むことができる。
ＸＶ．投与方法
本発明の組成物は、好ましくはＡＤＡＭ９結合分子（例えば、抗体、二重特異的抗体、ダイアボディ、三価結合分子、融合タンパク質など）もしくは本発明のコンジュゲートしたＡＤＡＭ９結合分子、またはＡＤＡＭ９結合分子もしくは本発明のコンジュゲートしたＡＤＡＭ９結合分子を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することにより、疾患、障害または感染に関連する１以上の症状を治療、予防、および減弱するために提供することができる。好ましいい態様において、そのような組成物は実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。具体的な実施形態において、対象は動物であり、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類など）または霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、ヒトなど）などの哺乳類である。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
例えば、リポソーム中への封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスなどの様々な送達系が公知であり、本発明の組成物を投与するために使用できる（例えば、Wu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）。レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など。
本発明のＡＤＡＭ９結合分子を投与する方法としては、限定されるものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻内および経口経路）が挙げられる。具体的な実施形態において、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は筋肉内、静脈内、または皮下投与される。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収によって投与することができ、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は全身的または局所的であり得る。さらに、例えば吸入具またはネブライザー、およびエアゾル化剤（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む処方物の使用により、肺投与も採用することができる。例えば、各々がその全体として参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，３２０号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号；および同第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開番号国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；および国際公開第９９／６６９０３号を参照。
本発明はまた、本発明のＡＤＡＭ９結合分子の調製物を、分子の量を表示するアンプルまたはサシェなどの密閉容器中に密封容器中に包装することとする。一実施形態において、そのような分子を密閉容器中で乾燥滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として提供し、例えば水または食塩水で対象への投与に適切な濃度に復元することができる。好ましくは、本発明のＡＤＡＭ９結合分子は乾燥滅菌凍結乾燥粉末として密閉容器中で供給される。
本発明のＡＤＡＭ９結合分子の凍結乾燥調製物は、２℃〜８℃にてそれらの元の容器中で保存しなければならず、分子は復元した後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与されなければならない。別の実施形態において、そのような分子は、分子、融合タンパク質、またはコンジュゲートした分子の量および濃度を表示した密閉容器中の液体形態で供給される。好ましくは、そのようなＡＤＡＭ９結合分子は液体形態で提供される場合、密閉容器中で供給される。
本明細書中で使用する場合、医薬組成物の「有効量」とは、例えば、制限なく、疾患から生じる症状の低減、感染の症状（例えば、ウイルスの負荷、熱、疼痛、敗血症など）またはがんの症状（例えば、がん細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移など）の減弱などの臨床結果を含む有益または所望の結果をもたらし、それによって疾患に苦しむ人の生活の質を向上させ、疾患を治療するために必要な他の薬物の用量を減少させ、ターゲティングおよび／またはインターナライゼーションによるなど他の薬物療法の効果を増強し、疾患の進行を遅らせ、および／または個体の生存を延長するために充分な量である。
有効量は１回以上の投与で投与することができる。本発明に関して、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量とは：がん細胞の殺滅および／もしくはがん細胞の増殖の低減、ならびに／またはがんの原発部位からの転移の発生の除去、低減および／もしくは遅延のために充分な量である。いくつかの実施形態において、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物との併用で達成されても、達成されなくてもよい。したがって、「有効量」は、１以上の化学療法薬を投与するという状況で投与することができ、また１以上の他の薬剤と併用して望ましい結果が達成され得るかまたは達成される場合は、単剤が有効量で投与されるとみなすことができる。
本発明に含まれるＡＤＡＭ９結合分子に関して、患者に投与される投薬量は、好ましくはレシピエント対象の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。
本発明のＡＤＡＭ９結合分子の投薬量および投与頻度は、例えば脂質化などの修飾により、分子の摂取および組織透過性を増強することによって、低減または変更することができる。
患者に投与される本発明のＡＤＡＭ９結合分子投薬量は、単剤療法としての使用について算出することができる。別法として、分子は他の治療組成物と組み合わせて使用することができ、患者に投与される投薬量は、前記分子が単剤療法として使用される場合よりも少ない。
本発明の医薬組成物は、治療の必要がある部分に局所的に投与することができ；これは例えば限定されるものではないが、局所注入、注射により、またはインプラントを用いて達成することができ、前記インプラントは、ＳＩＬＡＳＴＩＣ（登録商標）膜などの膜、または線維を含む、多孔質、非多孔質、またはゼリー状材料のものである。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、分子が吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。
本発明の組成物は、ベシクル中、特定のリポソーム中で送達することができる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327を参照）。
本発明の組成物が本発明のＡＤＡＭ９結合分子をコードする核酸である場合、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それが細胞内となるように投与することによって、例えばレトロウイルスのベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射により、またはマイクロパーティクルボンバードメント（ｍｉｃｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体または形質導入剤でコーティングすることによって、または核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドへの結合にそれを投与することによって核酸をインビボで投与してそのコードされるＡＤＡＭ９結合分子の発現を促進することができる（例えば、Joliot et al. (1991) “Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868を参照）など。別法として、核酸を細胞内に導入し、相同性組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れることができる。
本発明を概して記載してきたが、以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の診断または治療法における組成物のさまざまな方法を説明する。実施例は本発明の範囲を説明することを意図し、何ら限定するものではない。
実施例１
抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−Ａの腫瘍細胞特異性
（１）ＡＤＡＭ９の標的タンパク質プロセッシング活性をブロックする；（２）インターナライズされる；そして（３）抗腫瘍活性を有するネズミ抗ＡＤＡＭ９抗体（本明細書中ではＭＡＢ−Ａと指定する）が特定された（例えば、米国特許第８３６１４７５号を参照）。ＭＡＢ−Ａの腫瘍細胞特異性をＩＨＣによって調査した。腫瘍組織をＭＡＢ−Ａ（０．４μｇ／ｍＬ）またはアイソタイプ対照（０．４μｇ／ｍＬ）と接触させ、そして着色の程度は可視化された。ＭＡＢ−Ａは様々な大細胞がん、扁平上皮癌、および腺癌非小細胞肺がん細胞型（図７Ａ、パネル１〜８）、乳がん細胞、前立腺がん細胞、胃がん細胞（図７Ｂ、パネル１〜６）、ならびに結腸がんサンプル（図７Ｃ、パネル１〜８）を強力に標識することが判明した。正常組織をＭＡＢ−Ａ（１．２５μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を可視化した。前記表１にまとめるように、ＭＡＢ−Ａは様々な正常組織の染色をほとんどまたは全く示さなかった。これらの研究で使用したＭＡＢ−Ａの濃度は、腫瘍細胞の染色のために使用したもののほぼ３倍であったことに留意されたい。これらのＩＨＣ研究の結果から、ＭＡＢ−Ａが正常細胞よりも腫瘍細胞に対して強力に優先的な結合を示すことがわかる。
実施例２
種交差反応性
ＭＡＢ−ＡのヒトＡＤＡＭ９（ｈｕＡＤＡＭ９）およびカニクイザルＡＤＡＭ９（ｃｙｎｏＡＤＡＭ９）に対する結合を調べた。簡単に説明すると、ｈｕＡＤＡＭ９、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９、無関係の抗原、または非形質導入親細胞を一時的に発現する２９３−ＦＴおよびＣＨＯ−Ｋ細胞をＭＡＢ−Ａとともに、続いてヤギ抗ネズミ−ＰＥ二次抗体とともにインキュベートし、ＦＡＣＳによって分析した。図８Ａ〜８Ｂに示すように、ＭＡＢ−Ａは、両細胞タイプ上で一時的に発現されたｈｕＡＤＡＭ９に対して強力な結合を示した。ＭＡＢ−ＡはｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対して不十分な結合を示した。ＭＡＢ−Ａは親細胞または無関係の抗原を発現する細胞と結合しなかった。ｃｙｎｏＡＤＡＭに対する同様の不十分な結合がＥＬＩＳＡアッセイで見られた。
実施例３
ヒト化および初期最適化
ＭＡＢ−Ａのヒト化によってヒト化ＶＨドメインが生じ、これを本明細書中で「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）」と指定し、ヒト化ＶＬドメインを本明細書中で「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）」と指定した。ヒト化可変ドメインを次いで最適化して、結合活性を増強し、および／または以下でさらに詳細に記載するような潜在的に不安定なアミノ酸残基を除去した。最適化の第一ラウンドによって、本明細書中で「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）」、「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）」、および「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）」と指定される３つのさらなるヒト化ＶＨドメインと、本明細書中で「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）」、「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）」、および「ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）」と指定する３つのさらなるヒト化ＶＬドメインとが得られた。さらに、ネズミＶＨおよびＶＬドメインとヒト定常領域とを有するＭＡＢ−Ａ（「ｃｈＭＡＢ−Ａ」）のキメラバージョンを生成した。ネズミならびにヒト化／最適化ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列は先に提示し、アライメントを図９Ａおよび９Ｂに提示する。これらのヒト化／最適化ＶＨおよびＶＬドメインのコンセンサス配列は先に提示している。複数のヒト化可変ドメインが生成した場合、特定の抗ＡＤＡＭ９抗体（例えば、ＭＡＢ−Ａ）ヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインを任意の組み合わせで用いることができ、ヒト化鎖の特定の組み合わせは特異的ＶＨ／ＶＬドメインを参照することによって言及され、例えばｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）およびｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）を含む分子（例えば、抗体またはダイアボディ）は具体的に「ｈＭＡＢ−Ａ（１．２）」と称される。
ヒト生殖細胞系列ＶＨ３−２１およびＶＨ３−６４由来のフレームワーク領域を有するｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）が生成され、ヒト生殖細胞系列Ｂ３およびＬ６由来のフレームワーク領域を有するｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）が生成された。ネズミＣＤＲはこれらのヒト化可変ドメイン中に保持されていた。
潜在的な脱アミド化部位はＣＤＲＨ２で特定され（図９Ａ中、一重下線で示す）、そして潜在的なアスパラギン酸異性化部位はＣＤＲＬ１で特定された（図９Ｂ中、一重下線で示す）。これらの位置におけるアミノ酸置換を調べて、結合親和性を維持しつつ、これらの部位を除去する置換を特定した。ＣＤＲＨ２（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）の中に存在）の位置５４（Ｎ５４Ｆ）におけるフェニルアラニンの置換およびＣＤＲＬ１（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）中に存在）の位置２８（Ｄ２８Ｓ）におけるセリンの置換が選択され、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔに準ずる。特定された置換は、別々に用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。意外にも、Ｎ５４Ｆ置換を含む抗体は、ヒトＡＤＡＭ９に対する親和性において約２倍の増加を示し、カニクイザルＡＤＡＭ９に対して若干改善された結合を示すことが判明した。
さらなる最適化変異体を生成させて、ＣＤＲ中に存在するリジン残基の数を最小限に抑えた。２つのリジン残基はＣＤＲＨ２中に存在し（図９Ａ中二重の下線で示す）、１つのリジンはＣＤＲＬ１中に存在する（図９Ｂ中二重の下線で示す）。これらの位置におけるアミノ酸置換を調べて結合親和性を維持する置換を特定した。位置６２におけるアルギニンの置換（Ｋ６２Ｒ）、位置６４におけるグルタミンの置換（Ｋ６４Ｑ）、および位置６５におけるセリンの置換（Ｓ６５Ｇ）をＣＤＲＨ２について選択し（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）中に存在）、ナンバリングはＫａｂａｔに従う。位置２４におけるアルギニンの置換（Ｋ２４Ｒ）をＣＤＲＬ１について選択した（ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）中に存在）。特定された置換は別々に使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
ＣＤＲ中に存在する他の潜在的に不安定な残基（図９Ａ〜９Ｂ中、点線の下線で示す）、位置３４のＣＤＲＨ１内で１つのメチオニン残基（Ｍ３４）、位置３３のＣＤＲＬ１内で１つのメチオニン残基（Ｍ３３）、ならびにＣＤＲＬ３内の、位置９２（Ｈ９３）、９３（Ｅ９３）、および９４（Ｄ９４）でヒスチジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸残基が特定され、ナンバリングはＫａｂａｔにしたがう。これらの位置でのアミノ酸置換を調べて結合親和性を維持する置換を特定した。位置３４でのイソロイシンの置換（Ｍ３４Ｉ）をＣＤＲＨ１について選択し、ロイシン、チロシン、セリンおよびトレオニンの置換をＣＤＲＬ３の位置３３（Ｍ３３Ｌ）、９２（Ｈ９３Ｙ）、９３（Ｅ９３Ｓ）、および９４（Ｄ９４Ｔ）について選択し、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔに従う。これらの位置の各々は、詳細に上述した置換のすべてと組み合わせて容易に置換して、ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）およびｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）を得ることができ、これらはあわせて対にした場合、親ネズミ抗体と比べて親和性において若干の改善を保持し、脱アミド化または酸化の可能性が大きく減少し、ＣＤＲにおいてリジン残基を有さない、抗体を生成する。
ヒト化／最適化抗体であるｈＭＡＢ−Ａ（１．１）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（３．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（４．４）およびキメラｃｈＭＡＢ−Ａ（ネズミＶＨ／ＶＬドメインを有する）のｈｕＡＤＡＭに対する相対的結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を使用して調査し、この分析では、Ｈｉｓ標識された可溶性ヒトＡＤＡＭ９（ヒスチジン含有ペプチドと融合したヒトＡＤＡＭ９の細胞外部分を含む「ｓｈＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ」）は固定化抗体で被覆された表面上を通過させた。簡単に言うと、各抗体をＦａｂ２ヤギ抗ヒトＦｃで被覆された表面上に捕捉させ、次いで異なる濃度（６．２５〜１００ｎＭ）のｓｈＡＤＡＭ９−Ｈｉｓペプチドの存在下でインキュベートした。結合の動力学をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析結合（１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルで正規化）により決定した。これらの研究から算出されたｋａ、ｋｄおよびＫＤを表７に提示する。ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合は、前述のようなＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによって調べた。
これらの研究の結果は、ヒト化／最適化抗体が親ネズミ抗体と同じかまたはより高いヒトＡＤＡＭ９に対する結合親和性を有することを示す。特に、ヒト化抗体中にＮ５４Ｆ変異を導入した結果、ｈｕＡＤＡＭ９（すなわち、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）およびｈＭＡＢ−Ａ（３．３））に対する結合が改善されたことが観察された。この変異はまた、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによって決定されるようなｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合において若干の改善を提供するが、これらの抗体は引き続きｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対して不十分な結合を示す。これらの研究はまた、親和性を低減することなくＣＤＲからリジン残基を除去するために導入することができるさらなる置換を特定した。親和性に対する影響が最小で他の潜在的に不安定な残基を除去するさらなる置換が特定された。
実施例４
非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に対する結合の最適化
ランダム変異誘発を使用して、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）の重鎖ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔ位置５３〜５８）およびＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ位置９５〜１００および１００ａ〜１００ｆ）ドメイン内に置換を導入した。突然変異体をスクリーニングして、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９（例えば、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９）に対して増強された結合を有し、ｈｕＡＤＡＭ９に対して高い親和性結合を保持するクローンを特定した。４８のクローンを、ＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ位置１００ａ〜１００ｆ）内の変異の２つの独立したスクリーンから選択した。表８は、２つの独立したスクリーンからｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する増強した結合について選択されたｈＭＡＢ−Ａ（２．２）クローンからのＣＤＲＨ３Ｋａｂａｔ残基１００ａ〜ｆのアミノ酸配列のアライメントを提示する。さらなるクローンアライメントを表９に提示する。そのような表中に示すように、各実験で類似したクローンが出現し、それらは別個の置換パターンに分類された。
調べたクローンすべてについて、ＧｌｙおよびＡｌａは位置（ｐｏｓｉｔｏｎ）４（Ｐ４）で好ましいアミノ酸残基であり、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＰｈｅは位置６（Ｐ６）で好ましいアミノ酸残基である。他の位置（例えば、位置２（Ｐ２）、位置３（Ｐ３）および位置５（Ｐ５））で好ましいアミノ酸残基はＰ１で見出されるアミノ酸残基に依存する。位置１（Ｐ１）でＰｒｏ残基を有するクローンについて、ＬｙｓおよびＡｒｇはＰ２で好ましく、ＰｈｅおよびＭｅｔはＰ３で、ＧｌｙはＰ４で、そしてＴｒｐまたはＰｈｅはＰ５で好ましかった。Ｐ１でＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐを有するクローンについて、ＡｓｎおよびＨｉｓはＰ２で好ましく、ＳｅｒおよびＨｉｓはＰ３で、そしてＬｅｕはＰ６で好ましかった。Ｐ１でＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを有するクローンについて、ＧｌｙはＰ２で好ましく、ＬｙｓはＰ３で、ＶａｌはＰ５で、そして疎水性基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）はＰ６で好ましかった。さらに、表８で示されるように、Ｐ１でＴｈｒ残基を有するクローンについて、ＧｌｙはＰ２で好ましく、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、およびＡｓｎはＰ３で好ましく、ＧｌｙはＰ４で好ましく、ＶａｌまたはＴｈｒはＰ５で好ましく、そしてＬｅｕおよびＭｅｔはＰ６で好ましかった。Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＳｅｒ残基をＰ１で有するさらなるクローンはさらに低い周波数でも特定された（表８および表９を参照）。
表９に示す１０のクローンのＶＨドメインを使用してｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）と指定されたｈＭＡＢ−Ａ（２．２）のさらなる最適化変異体を生成した。選択されたクローンの結合をＥＬＩＳＡアッセイによって調べた。簡単に説明すると、ヒスチジン含有ペプチドと結合し、マイクロタイタープレート上にコーティングされた抗体を使用して、Ｈｉｓペプチドで標識された可溶性ｃｙｎｏＡＤＡＭ９（「ｃｙｎｏＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ」）（１μｇ／ｍＬ）またはＨｉｓペプチドで標識された可溶性ｈｕＡＤＡＭ９（１μｇ／ｍＬ）を捕捉し、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）および１０のＣＤＲＨ３ｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）変異体の段階希釈の結合を調べた。ｃｙｎｏＡＤＡＭ９およびｈｕＡＤＡＭ９の結合曲線をそれぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂで提示する。選択されたＶＨドメインの各々を含むｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）変異体は、ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）、ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）、ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）、およびＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）を有するｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対して改善された結合を示し、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）抗体としてｈｕＡＤＡＭ９に対して類似した結合を維持しつつ、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９結合において最大の改善を示す。
ヒト化／さらなる最適化抗体ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ．２）、ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ．２）、ＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ．２）、およびＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ．２）、ならびに親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）の、ｈｕＡＤＡＭ９−ＨｉｓおよびｃｙｎｏＡＤＡＭ９−Ｈｉｓに対する相対的結合親和性は、本質的に前記のようなＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を用いて調査した。これらの研究から算出されたｋａ、ｋｄおよびＫＤを表１０に提示する。
結合研究によって、４つの上位クローンが、親抗体と同じｈｕＡＤＡＭ９に対する高い親和性結合を維持しつつ、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合親和性における１５０〜５５０倍の増強を示すことが証明された。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）およびｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）をさらなる研究のために選択した。
実施例５
抗体ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の免疫組織化学研究
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の細胞特異性をＩＨＣによって調べた。陽性および陰性対照細胞、ならびに正常ヒトおよびカニクイザル組織をｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）（２．５μｇ／ｍＬ）またはアイソタイプ対照（２．５μｇ／ｍＬ）と接触させ、そして染色の程度を可視化した。研究結果を表１１にまとめる。
またＩＨＣ研究を実施して、１２．５μｇ／ｍＬの濃度（５×最適染色濃度）でのヒト化／最適化ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の結合を評価した。陽性および陰性対照細胞、正常ヒト組織、ならびにカニクイザル組織をこの研究では採用した。研究結果を表１２にまとめる。
２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬでのｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）、およびｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）による結合における差異を評価するために、比較ＩＨＣ研究を実施した。陽性および陰性対照細胞、正常ヒト組織、およびカニクイザル組織をこの研究で使用した。研究結果を表１３にまとめる。
２．５μｇ／ｍＬ ５μｇ／ｍＬまたは１２．５μｇ／ｍＬでのｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）、およびｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）ならびにネズミＭＡＢ−Ａによる結合における差を評価するために、さらなる比較ＩＨＣ研究を実施した。陽性および陰性対照細胞、正常ヒト組織、およびカニクイザル組織をこの研究で採用した。研究結果を表１４にまとめる。
したがって結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）が最適濃度でヒト肝細胞および腎細管の全体的に低レベルの着色を示し、陰性対照においては肝細胞および腎細管で反応性のより低い着色強度／頻度が観察されたことを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）は最適濃度でカニクイザル肝細胞および腎細管の同様に低レベルの着色を示し、陰性対照においては腎細管で反応性のより低い着色強度／頻度が観察された。
結果はまた、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）が最適濃度でのヒト肝細胞および腎細管の全体的に低レベルの着色を示し、陰性対照において観察される肝細胞および腎細管における反応性の着色強度／頻度が低いことを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）は最適濃度でのカニクイザル肝細胞および腎細管における同様の低レベルの着色を示した。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）のカニクイザル肺上皮、膵島／上皮および膀胱上皮ではさらなるわずかな知見も対応するヒト組織では観察されず；陰性対照における肺上皮、腎細管、膀胱上皮では、反応性のより低い着色強度／頻度が観察された。
結果はまた、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）がヒトまたはカニクイザル組織の最適濃度での着色を示さず、＋／−膀胱移行細胞着色は稀であったことを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）はまた、ヒト肺胞細胞、膵臓導管上皮、腎細管、膀胱移行細胞上皮の５×最適濃度での全体的に低レベルかつ頻繁な着色と、全体的に低レベルのカニクイザル気管支上皮および膀胱移行細胞上皮の５×最適濃度での低レベルの着色とを示した。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）は、試験したヒト正常組織に関して全体的に好ましいＩＨＣプロフィールと、対応するカニクイザル組織に関して類似のプロフィールとを示した。
本明細書に記載された全ての刊行物および特許は、本明細書に個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。本発明を、その具体的な実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修飾が可能であり、本願は、概して、本発明の原理に従い、本発明が関連する技術分野での公知または慣例の実施範囲内であり、本明細書中で前述した本質的な特徴に適用できる本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を対象とすることが意図されていることが理解される。

Claims (48)

  1. ＡＤＡＭ９結合ドメインを含むＡＤＡＭ９結合分子であって、前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含み、前記重鎖可変ドメインがＣＤＲＨ１ドメインとＣＤＲＨ２ドメインとＣＤＲＨ３ドメインとを含み、前記軽鎖可変ドメインがＣＤＲＬ１ドメインとＣＤＲＬ２ドメインとＣＤＲＬ３ドメインとを含み：
    （Ａ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する；または
    （Ｂ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインはＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する；または
    （Ｃ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し；前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する、
    ＡＤＡＭ９結合分子。
  2. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （Ａ）（１）ＭＡＢ−Ａの前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインの前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメイン；ならびに
    （２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
    （Ｂ）（１）ＭＡＢ−Ａの前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメイン；ならびに
    （２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
    （Ｃ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメイン；ならびに
    （２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
    （Ｄ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメイン；ならびに
    （２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４；または
    （Ｅ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；ならびに
    （２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化変異体のＶＬ軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
    を有する、請求項１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  3. ＭＡＢ−Ａの前記最適化変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインが配列番号１５のアミノ酸配列：
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＸ １ ＨＷＶＲＱＡ
    ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥ ＩＩＰＩＸ ２ ＧＨＴＮＹ ＮＥＸ ３ ＦＸ ４ Ｘ ５ ＲＦＴＩ ＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹ
    ＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧ ＹＹＹＹＸ ６ Ｘ ７ Ｘ ８ Ｘ ９ Ｘ １０ Ｘ １１
    ＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴ ＶＳＳ
    を含み、
    ここで：Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６が独立して選択され、
    Ｘ１はＭまたはＩであり；Ｘ２はＮまたはＦであり；
    Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＫまたはＱであり；
    Ｘ５はＳまたはＧであり、Ｘ６はＰ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
    Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
    Ｘ６がＰである場合；Ｘ７がＫまたはＲ；Ｘ８がＦまたはＭ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＷまたはＦ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
    Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合；Ｘ７がＮまたはＨ；Ｘ８がＳまたはＫ；Ｘ９がＧまたはＡ；Ｘ１０がＴまたはＶ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
    Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合；Ｘ７がＧ；Ｘ８がＫ；Ｘ９がＧまたはＡ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＭ、ＬまたはＫ；
    Ｘ６がＴである場合；Ｘ７がＧ；Ｘ８がＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＶまたはＴ；Ｘ１１がＬまたはＭ；
    Ｘ６がＧである場合；Ｘ７がＧ；Ｘ８がＳ；Ｘ９がＧ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＬ；
    Ｘ６がＤである場合；Ｘ７がＳ；Ｘ８がＮ；Ｘ９がＡ；Ｘ１０がＶ；Ｘ１１がＬ
    となるように選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  4. ＭＡＢ−Ａの前記最適化変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインの前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメインおよびＣＤＲＨ３ドメインがそれぞれ：
    （１）配列番号４７（ＳＹＷＸ１Ｈ）
    ここで：Ｘ１はＭまたはＩである；
    （２）配列番号４８（ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５）
    ここで：Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は独立して選択され、
    Ｘ２はＮまたはＦであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；
    Ｘ４はＫまたはＱであり；
    Ｘ５はＳまたはＧである；
    （３）配列番号４９（ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ）
    ここで：Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、およびＸ１１は：
    （Ａ）Ｘ６がＰである場合：
    Ｘ７はＫまたはＲ；Ｘ８はＦまたはＭ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＷまたはＦ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
    （Ｂ）Ｘ６がＦ、ＹまたはＷである場合：
    Ｘ７はＮまたはＨ；Ｘ８はＳまたはＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＴまたはＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
    （Ｃ）Ｘ６がＩ、ＬまたはＶである場合：
    Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ；Ｘ９はＧまたはＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＭ、ＬまたはＫ；
    （Ｄ）Ｘ６がＴである場合：
    Ｘ７はＧ；Ｘ８はＫ、ＭまたはＮ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶまたはＴ；そしてＸ１１はＬまたはＭ；
    （Ｅ）Ｘ６がＧである場合：
    Ｘ７はＧ；Ｘ８はＳ；Ｘ９はＧ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ；そして
    （Ｆ）Ｘ６がＤである場合：
    Ｘ７はＳ；Ｘ８はＮ；Ｘ９はＡ；Ｘ１０はＶ；そしてＸ１１はＬ
    のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  5. ＭＡＢ−Ａの前記最適化変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインが：
    （１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（１）（配列番号１６）；
    （２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２）（配列番号１７）；
    （３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（３）（配列番号１８）；
    （４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（４）（配列番号１９）；
    （５）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）；
    （６）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）；
    （７）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）；
    （８）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）；
    （９）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）；
    （１０）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）；
    （１１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）；
    （１２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）；
    （１３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）；および
    （１４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）
    からなる群から選択される、請求項４に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  6. 前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが配列番号５３の前記アミノ酸配列：
    ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳ ＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴ ＩＳＣＸ １２ ＡＳＱＳＶＤ
    ＹＸ １３ ＧＤＳＹＸ １４ ＮＷＹ ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬ ＬＩＹＡＡＳＤＬＥＳ
    ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ ＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹ
    ＹＣＱＱＳＸ １５ Ｘ １６ Ｘ １７ ＰＦ ＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩ Ｋ
    ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は独立して選択され、そして
    Ｘ１２はＫまたはＲであり；Ｘ１３はＤまたはＳであり；Ｘ１４はＭまたはＬであり；Ｘ１５はＨまたはＹであり；Ｘ１６はＥまたはＳであり；そしてＸ１７はＤまたはＴである
    を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  7. ＭＡＢ−Ａの前記最適化変異体の前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメインおよびＣＤＲＬ３ドメインがそれぞれ：
    （１）配列番号６６の前記アミノ酸配列（Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ）
    ここで：Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は独立して選択され、
    Ｘ１２はＫまたはＲであり；Ｘ１３はＤまたはＳであり；そしてＸ１４はＭまたはＬである；
    （２）配列番号１３（ＡＡＳＤＬＥＳ）；および
    （３）配列番号６７（ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ）
    ここで：Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１７は独立して選択され、
    Ｘ１５がＨまたはＹであり；Ｘ１６がＥまたはＳであり；Ｘ１７がＤまたはＴである
    のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  8. ＭＡＢ−Ａの前記最適化変異体の前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが：
    （１）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（１）（配列番号５４）；
    （２）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２）（配列番号５５）；
    （３）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（３）（配列番号５６）；
    （４）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（４）（配列番号５７）；
    （５）ｈＭＡＢ−Ａ ＶＬ（２Ａ）（配列番号２０）
    からなる群から選択される、請求項７に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  9. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （Ａ）（１）アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含むＣＤＲＨ１ドメイン；
    （２）アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ２ドメイン；もしくは
    （３）アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含むＣＤＲＨ３ドメイン；
    または
    （Ｂ）（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含むＣＤＲＬ１ドメイン；
    （２）アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲＬ２ドメイン；もしくは
    （３）アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ３ドメイン
    を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  10. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが、前記アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含む前記ＣＤＲＨ１ドメインと、前記アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含む前記ＣＤＲＨ２ドメインと、前記アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含む前記ＣＤＲＨ３ドメインとを含む、請求項９に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  11. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが、前記アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含む前記ＣＤＲＬ１ドメインと、前記アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含む前記ＣＤＲＬ２ドメインと、前記アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含む前記ＣＤＲＬ３ドメインとを含む、請求項９または１０のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  12. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （Ａ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）；または
    （Ｂ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）；または
    （Ｃ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）およびｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）
    を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  13. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６２、１３および１４、
    （ｂ）それぞれ、配列番号８、３５および１０ならびに配列番号６３、１３および１４；
    （ｃ）それぞれ、配列番号８、３６および１０ならびに配列番号６３、１３および１４；および
    （ｄ）それぞれ、配列番号３４、３６および１０ならびに配列番号６４、１３および６５
    からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  14. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５５；
    （ｂ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５６；
    （ｃ）それぞれ、配列番号１８および配列番号５６；ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号１９および配列番号５７
    からなる群から選択される配列と少なとも９０％、少なとも９５％、または少なとも９９％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１３に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  15. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５５；
    （ｂ）それぞれ、配列番号１７および配列番号５６；
    （ｃ）それぞれ、配列番号１８および配列番号５６；ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号１９および配列番号５７
    からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１４に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  16. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインがＭＡＢ−Ａと比較して、カニクイザルＡＤＡＭ９に対する結合親和性において少なとも１５０倍の増強を有し、ヒトＡＤＡＭ９に対する高い親和性結合を保持する、請求項１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  17. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号８、３５および３７ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｂ）それぞれ、配列番号８、３５および３８ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｃ）それぞれ、配列番号８、３５および３９ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｄ）それぞれ、配列番号８、３５および４０ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｅ）それぞれ、配列番号８、３５および４１ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｆ）それぞれ、配列番号８、３５および４２ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｇ）それぞれ、配列番号８、３５および４３ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｈ）それぞれ、配列番号８、３５および４４ならびに配列番号６２、１３および１４；
    （ｉ）それぞれ、配列番号８、３５および４５ならびに配列番号６２、１３および１４；および
    （ｊ）それぞれ、配列番号８、３５および４６ならびに配列番号６２、１３および１４
    からなる群から選択される配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン、およびＣＤＲＨ３ドメインならびにＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、およびＣＤＲＬ３ドメインを含む、請求項１６に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  18. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号２０および配列番号５５；
    （ｂ）それぞれ、配列番号２１および配列番号５５；
    （ｃ）それぞれ、配列番号２２および配列番号５５；
    （ｄ）それぞれ、配列番号２３および配列番号５５；
    （ｅ）それぞれ、配列番号２４および配列番号５５；
    （ｆ）それぞれ、配列番号２５および配列番号５５；
    （ｇ）それぞれ、配列番号２６および配列番号５５；
    （ｈ）それぞれ、配列番号２７および配列番号５５；
    （ｉ）それぞれ、配列番号２８および配列番号５５；および
    （ｊ）それぞれ、配列番号２９および配列番号５５
    からなる群から選択される配列に対して少なとも９０％、少なとも９５％、または少なとも９９％同一である配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１９に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  19. 前記ＡＤＡＭ９結合ドメインが：
    （ａ）それぞれ、配列番号２０および配列番号５５；
    （ｂ）それぞれ、配列番号２１および配列番号５５；
    （ｃ）それぞれ、配列番号２２および配列番号５５；
    （ｄ）それぞれ、配列番号２３および配列番号５５；
    （ｅ）それぞれ、配列番号２４および配列番号５５；
    （ｆ）それぞれ、配列番号２５および配列番号５５；
    （ｇ）それぞれ、配列番号２６および配列番号５５；
    （ｈ）それぞれ、配列番号２７および配列番号５５；
    （ｉ）それぞれ、配列番号２８および配列番号５５；および
    （ｊ）それぞれ、配列番号２９および配列番号５５
    からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１８に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  20. 前記分子が単一特異性ＡＤＡＭ９結合抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  21. 前記分子が二重特異的抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  22. 前記分子がダイアボディであり、前記ダイアボディが、２、３、４または５つのポリペプチド鎖を含む共有結合した複合体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  23. 前記分子が三価結合分子であり、前記三価結合分子が３、４、５、またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合した複合体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  24. 前記分子がアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  25. 前記ＡＤＡＭ９結合分子がＦｃ領域を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  26. 前記Ｆｃ領域が：
    （ａ）ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域の親和性を低減する１以上のアミノ酸修飾；および／または
    （ｂ）前記ＡＤＡＭ９結合分子の血清半減期を増強する１以上のアミノ酸修飾
    を含む変異体Ｆｃ領域である、請求項２１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  27. ＦｃγＲについての前記変異体Ｆｃ領域の前記親和性を低減する前記１以上のアミノ酸修飾が：
    （Ａ）Ｌ２３４Ａ；
    （Ｂ）Ｌ２３５Ａ；または
    （Ｃ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ
    を含み、
    ナンバリングがＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである、請求項２６に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  28. 前記ＡＤＡＭ９結合分子の前記血清半減期を増強する前記１以上のアミノ酸修飾が：
    （Ａ）Ｍ２５２Ｙ；
    （Ｂ）Ｍ２５２ＹおよびＳ２５４Ｔ；
    （Ｃ）Ｍ２５２ＹおよびＴ２５６Ｅ；
    （Ｄ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ；または
    （Ｅ）Ｋ２８８ＤおよびＨ４３５Ｋ
    を含み；
    ナンバリングがＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである、請求項２６または２７のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  29. 前記分子が二重特異的であり、ＡＤＡＭ９のエピトープと免疫特異的結合可能であるエピトープ結合部位と、エフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープと免疫特異的結合可能であるエピトープ結合部位とを含む、請求項１〜２０または２２〜２８のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  30. 前記分子が、ＡＤＡＭ９のエピトープと免疫特異的結合が可能な２つのエピトープ結合部位と、エフェクター細胞の表面上に存在する分子のエピトープと免疫特異的結合可能な２つのエピトープ結合部位とを含む、請求項２２に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  31. 前記分子が三重特異的であり：
    （ａ）ＡＤＡＭ９のエピトープと免疫特異的結合が可能なエピトープ結合部位と、
    （ｂ）エフェクター細胞の表面上に存在する第一分子のエピトープと免疫特異的結合が可能なエピトープ結合部位と、
    （ｃ）エフェクター細胞の表面上に存在する第二分子のエピトープと免疫特異的結合が可能なエピトープ結合部位と、
    を含む、請求項１〜１９または２３〜２８のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  32. 前記分子が、ＡＤＡＭ９およびエフェクター細胞の前記表面上に存在する前記分子と同時に結合できる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  33. エフェクター細胞の前記表面上に存在する前記分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲ、またはＮＫＧ２Ｄである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  34. 前記エフェクター細胞が細胞毒性Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  35. エフェクター細胞の前記表面上に存在する前記分子がＣＤ３である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  36. エフェクター細胞の前記表面上に存在する前記第一分子がＣＤ３であり、エフェクター細胞の前記表面上に存在する前記第二分子がＣＤ８である、請求項３１に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  37. 前記ＡＤＡＭ９結合分子がＡＤＡＭ９を発現する細胞および細胞毒性Ｔ細胞の配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）を媒介する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子。
  38. 請求項１〜３７のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子の有効量と、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  39. ＡＤＡＭ９の発現に関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患または状態の治療における請求項１〜３７のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子または請求項３８に記載の医薬組成物の使用。
  40. 前記ＡＤＡＭ９の発現に関連するか、または前記ＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる前記疾患または状態ががんである、請求項３９に記載の使用。
  41. 前記がんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、骨髄がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、甲状腺がん、睾丸がん、および子宮がんからなる群から選択される、請求項４０に記載の使用。
  42. 前記非小細胞肺がんが扁平上皮癌、腺癌、または未分化大細胞がんである、請求項４１に記載の使用。
  43. 前記結腸直腸がんが、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮癌である、請求項４１に記載の使用。
  44. 対象におけるＡＤＡＭ９の発現に関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる疾患または状態を治療するための方法であって、前記対象に請求項１〜３７のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ９結合分子または請求項３８に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
  45. 前記ＡＤＡＭ９の発現に関連するか、または前記ＡＤＡＭ９の発現によって特徴づけられる前記疾患または状態ががんである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記がんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、骨髄がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、甲状腺がん、睾丸がん、および子宮がんからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記非小細胞肺がんが、扁平上皮癌、腺癌、または未分化大細胞がんである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記結腸直腸がんが、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮癌である、請求項４６に記載の方法。
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