ES2845924T3 - Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora (CAR-EC) que comprende: a. un antígeno peptídico que comprende un péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 que se une a un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en una célula efectora; comprendiendo dicho péptido GCN4 una parte de SEQ ID NO: 2 que es de 12 aminoácidos; y b. un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, en el que el antígeno peptídico se injerta o se fusiona con el resto de direccionamiento.

Description

DESCRIPCIÓN
Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
Las inmunoterapias se están convirtiendo en alternativas atractivas a las quimioterapias, incluyendo inmunoterapias que usan la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para “volver a enseñar” al sistema inmunitario a reconocer y eliminar las células tumorales malignas. Las células T modificadas genéticamente expresan receptores de antígenos quiméricos, que generalmente consisten en un endodominio de señalización, un dominio transmembrana CD3-Zeta y un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) extracelular derivado de un anticuerpo monoclonal que proporciona al receptor especificidad para un antígeno asociado a tumor en una célula maligna diana. Tras la unión al antígeno asociado a tumor a través del receptor de antígeno quimérico, la célula T que expresa el receptor de antígeno quimérico (célula T con CAR) monta una respuesta inmunitaria que es citotóxica para la célula maligna. Tales terapias pueden eludir la resistencia a la quimioterapia y se ha demostrado que son activas contra la enfermedad con recidiva/refractaria, dando como resultado remisiones sostenidas para algunos pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia linfoblástica aguda (LLA). Sin embargo, estas terapias requieren investigación y optimización adicionales, ya que provocaron efectos no deseados tales como linfofenia tóxica, hipogammaglobulinemia crónica para dianas hematológicas, citólisis inespecífica mortal para dianas tumorales sólidas, aplasia persistente de células B con el uso de células T con CAR que expresan anticuerpos anti-CD19 y, en algunos casos, la muerte.
Tamada et al. (2012), Clinical Cancer Research, 18(23):6436-6445, dan a conocer la redirección de células T modificadas genéticamente hacia diversos tipos de cáncer usando anticuerpos etiquetados. El documento WO 2008/025558 da a conocer marcadores de afinidad que comprenden una primera y una segunda etiqueta y sus usos. Stone et al. (2012), Oncoinmunology, 1(6):863-873, dan a conocer una escala de sensibilidad para el direccionamiento de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) y acopladores biespecíficos de células T (biTE). Gilham et al. (2012), Trends in Molecular Medicine, 18(7):377-284, dan a conocer el ajuste de células T con CAR para examinar tumores sólidos. El documento WO 2012/055961 da a conocer medios y métodos para tratar el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). R. Kontermann (2012), mAbs, 4(2): 182-197 da a conocer estrategias de doble direccionamiento con anticuerpos biespecíficos.
La introducción de un interruptor, que controla la actividad de la célula T con CAR, permitiría desactivar la actividad de las células T con CAR y las respuestas inmunitarias asociadas después de eliminar las células neoplásicas y permitiría que las células B volvieran a proliferar. Estudios preclínicos recientes han demostrado que los sistemas de células T con CAR pueden controlarse a través de un interruptor basado en anticuerpo, en el que el anticuerpo se une a la célula diana (por ejemplo, célula cancerosa), bloqueando la unión de la célula T con CAR con la célula diana y “desactivando” la actividad de CAR-T. Aunque estos sistemas permiten conceptualmente la selección como diana conmutable de tumores usando células T con CAR, pueden sufrir una serie de limitaciones. El etiquetado no específico de anticuerpos usando cisteínas o lisinas produce productos heterogéneos, lo que incluye variantes que pueden no ser funcionales, tener farmacocinética y/o inmunogenicidad impredecible, y que pueden ser difíciles de optimizar.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora (CAR-EC) que comprende: a) un antígeno peptídico que comprende un péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 que se une a un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en una célula efectora; comprendiendo dicho péptido de GCN4 una parte de SEQ ID NO: 2 que tiene 12 aminoácidos; y b) un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, en la que el antígeno peptídico se injerta o se fusiona con el resto de direccionamiento.
La presente invención se refiere además al interruptor de CAR-EC de la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer.
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el interruptor de CAR-EC de la invención y una sal, excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere además a un kit que comprende el interruptor de CAR-EC de la invención y un CAR-EC que comprende un receptor de antígeno quimérico que se une al antígeno peptídico del interruptor de CAR-EC.
En el presente documento se dan a conocer interruptores de receptor de antígeno quimérico-célula efectora que comprenden: un antígeno peptídico que se une a un receptor de antígeno quimérico en una célula efectora; y un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de un péptido que se produce de manera natural. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de un péptido no humano. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de un péptido eucariótico. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de un péptido, en el que el péptido se expresa por una levadura. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de un factor de transcripción de levadura GCN4. El antígeno peptídico puede comprender un péptido que no se produce de manera natural. El antígeno peptídico puede comprender una etiqueta de péptido sintético. El antígeno peptídico puede basarse en o derivarse de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2-7. El antígeno peptídico puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente el 50% homóloga a una secuencia de péptido seleccionada de SEQ ID NO: 2-7. El resto de direccionamiento puede comprender un péptido de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en: una inmunoglobulina, una inmunoglobulina Fc nula y un Fab, y fragmentos del mismo. El resto de direccionamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti­ CEA, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-BCMA y un anticuerpo anti-CS1, y fragmentos de los mismos. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un par de una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada están codificadas por secuencias de ácido nucleico basadas en o derivadas de pares de secuencias de ácido nucleico seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 8 y 9; SEQ ID NO: 8 y 10; SEQ ID NO: 11 y 12; SEQ ID NO. 13 y 14; SEQ ID NO: 15 y 16; SEQ ID NO: 17 y 18; y SEQ ID NO: 19 y 20. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una par de una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada están codificadas por secuencias de aminoácidos basadas en o derivadas de pares de secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 21 y 22; SEQ ID NO: 23 y 24; SEQ ID NO. 25 y 26; SEQ ID NO: 27 y 28; y SEQ ID NO: 27 y 29. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender un par de una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada están codificadas por secuencias de aminoácidos basadas en o derivadas de pares de secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 30 y 29; SEQ ID NO: 36 y 29; SEQ ID NO: 31 y 28; SEQ ID NO: 27 y 32; SEQ ID NO: 27 y 33; SEQ ID NO: 27 y 34; y SEQ ID NO: 27 y 35. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo terminal del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con una región del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento seleccionada del grupo que consiste en: un extremo N terminal de una cadena ligera, un extremo C terminal de una cadena ligera, un extremo N terminal de una cadena pesada, un extremo C terminal de una cadena pesada de Fab y un extremo C terminal de una cadena pesada de región constante. El antígeno peptídico puede injertarse en el resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en una región del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento seleccionada de un dominio CH1 , un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio CL, un dominio VH, un dominio VL y una región de bisagra. El antígeno peptídico puede injertarse entre dos regiones del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento seleccionadas de un dominio CH1 , un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio CL, un dominio VH, un dominio VL, una cadena pesada, una cadena ligera y una región de bisagra, donde las dos regiones son adyacentes. El antígeno peptídico puede injertarse en un bucle del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en un bucle de un dominio constante del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse entre la región de bisagra y un dominio constante de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede reemplazar a uno o más aminoácidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento sin reemplazar a un aminoácido. El receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender además un ligador que une el antígeno peptídico y el resto de direccionamiento. El ligador puede ser un péptido que une el antígeno peptídico y el resto de direccionamiento, en el que el resto de direccionamiento comprende un polipéptido de direccionamiento. El ligador puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos. El ligador puede comprender una secuencia basada en o derivada de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 38-42. El antígeno peptídico puede comprender un factor de transcripción de levadura GCN4 o un homólogo del mismo y se selecciona el resto de direccionamiento del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CEA y fragmentos de los mismos. La célula diana puede ser una célula cancerosa. La molécula de superficie celular puede ser un antígeno asociado a tumor. La molécula de superficie celular puede seleccionarse del grupo que consiste en: una proteína de grupo de diferenciación, un receptor, una proteína de membrana integral y una glicoproteína. La homogeneidad del interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede ser de al menos aproximadamente el 90%.
Además, en el presente documento se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden: un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora que comprende: un antígeno peptídico que se une a un receptor de antígeno quimérico en una célula efectora; y un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una diana; y una sal, excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se dan a conocer kits que comprenden: un interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora que comprende: un antígeno peptídico que se une a un receptor de antígeno quimérico en una célula efectora; y un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana; y un receptor de antígeno quimérico-célula efectora que comprende un receptor de antígeno quimérico que se une al antígeno peptídico del interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora. El resto de direccionamiento puede comprender un péptido de direccionamiento. El resto de direccionamiento comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico se injerta dentro del resto de direccionamiento. El kit puede comprender un primer interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora y un segundo interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora, en el que el primer interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora comprende un primer antígeno peptídico y un primer resto de direccionamiento y el segundo interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora comprende un segundo antígeno peptídico y un segundo resto de direccionamiento. El primer antígeno peptídico y el segundo antígeno peptídico pueden ser los mismos. El primer resto de direccionamiento puede unirse a una primera molécula de superficie celular en una primera célula diana y el segundo resto de direccionamiento puede unirse a una segunda molécula de superficie celular en una segunda célula diana, en el que la primera molécula de superficie celular y la segunda molécula de superficie celular son diferentes. La célula efectora puede seleccionarse a partir de una célula T, una célula B efectora, una célula citolítica natural, un macrófago y un progenitor de los mismos. La célula efectora puede seleccionarse de una célula T indiferenciada, una célula T madre de memoria, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora, una célula T auxiliar, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T CD8/CD4+, una célula T ap, una célula T y8, una célula T citotóxica, una célula T citolítica natural, una célula citolítica natural, un macrófago.
Además, se dan a conocer en el presente documento receptores de antígenos quiméricos que se unen un antígeno peptídico de un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora. El receptor de antígeno quimérico puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al antígeno peptídico de un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora. El fragmento de anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un antígeno eucariótico. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un péptido que no se produce de manera natural. El fragmento de anticuerpo puede ser un scFv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de un anticuerpo anti-factor de transcripción de levadura GCN4, un anticuerpo anti-Flag®, un anticuerpo anti-HTP y fragmentos de los mismos. El receptor de antígeno quimérico puede codificarse por un polinucleótido basado en o derivado de SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se dan a conocer células efectoras que comprenden un receptor de antígeno quimérico, en las que el receptor de antígeno quimérico se une a un antígeno peptídico de un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora. Las células efectoras pueden ser células T. Las células efectoras pueden comprender uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1.
Además, en el presente documento se dan a conocer vectores que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia que codifica para un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora, en el que el interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora comprende un antígeno peptídico y un resto de direccionamiento, en el que el resto de direccionamiento comprende un péptido y se une a una molécula de superficie celular en una célula diana.
En el presente documento se dan a conocer vectores que comprenden un primer polinucleótido que tiene una primera secuencia que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento; un segundo polinucleótido que tiene una segunda secuencia que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento; y un tercer polinucleótido que tiene una tercera secuencia que codifica para un antígeno peptídico, en el que la expresión del vector produce un interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora. La tercera secuencia puede ser adyacente a una secuencia seleccionada de la primera secuencia y la segunda secuencia. La tercera secuencia puede ubicarse dentro de una secuencia seleccionada de la primera secuencia y la segunda secuencia.
Además, en el presente documento se dan a conocer métodos de producción de un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora, que comprenden expresar a partir de uno o más vectores de polinucleótido: una primera secuencia que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento; una segunda secuencia que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento; y una tercera secuencia que codifica para un antígeno peptídico, en los que la expresión del vector produce un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A ilustra una vista general de la célula T con receptor de antígeno quimérico (célula T con CAR) y la terapia con interruptor de células T con CAR con interruptores dados a conocer en el presente documento. Se aíslan linfocitos de un sujeto y posteriormente se introduce un vector de expresión que codifica para un receptor de antígeno quimérico en los linfocitos para producir células que expresan receptores de antígenos quiméricos. Los linfocitos modificados por ingeniería genética resultantes se administran al sujeto, junto con un interruptor de células T con CAR.
La figura 1B ilustra un interruptor de células T con CAR, que comprende un péptido al que se une el receptor de antígeno quimérico de la célula T con CAR y un anticuerpo de direccionamiento que es selectivo para una célula diana. La unión del interruptor de células T con CAR a la célula T con CAR induce una respuesta inmunitaria que sería citotóxica para la célula maligna también unida al interruptor de células T con CAR.
La figura 2 representa una estructura cristalina 1P4B de PDB de un scFv madurado por afinidad (el gris claro y medio representan la cadena ligera y cadena pesada) unida a un péptido derivado del factor de transcripción de levadura GCN4 (7P-14P) (el gris oscuro representa el péptido GCN4).
La figura 3 muestra la espectrometría de masas de un interruptor de CAR-EC anti-CD19-Fab-GCN4o_i. Calculado: 49533, encontrado: 49537,09.
La figura 4 muestra la citotoxicidad de una célula T con CAR anti-GCN4 con diversos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD 19 con un péptido GCN4 injertado o fusionado en diversas regiones o dominios de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD19.
La figura 5A muestra un gel de SDS-PAGE no reductor de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD19 con un péptido GCN4 injertado o fusionado en diversas regiones o dominios de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
La figura 5B muestra un gel de SDS-PAGE reductor de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD19 con un péptido GCN4 injertado o fusionado en diversas regiones o dominios de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
La figura 6 representa unas posiciones de injerto de péptido GCN4 de levadura en un Fab anti-CD19 (FMC63).
La figura 7 muestra la eficacia in vivo de un interruptor de células T con CAR de péptido GCN4-Fab anti-CD19 y una célula T con CAR anti-GCN4 en un modelo de ratón de tumor de xenoinjerto. La figura 7A muestra la cuantificación de tumores en ratones no tratados frente a tratados. La figura 7B representa el régimen de tratamiento in vivo y la visualización de células tumorales en ratones no tratados frente a tratados.
La figura 8 muestra la citotoxicidad de un interruptor de células T con CAR y células T con CAR anti-GCN4 (anticuerpo anti-BCMA-péptido GCN4 injertado en el dominio constante de cadena ligera) contra células positivas para BCMa (OPM2).
Descripción detallada de la invención
Las terapias actuales de células T con receptores de antígenos quiméricos (células T con CAR) pueden ser poco fiables debido a la falta de medios para controlar la actividad de las células T con CAR. En el presente documento se dan a conocer composiciones y métodos para activar y desactivar selectivamente células T con receptores de antígenos quiméricos, que pueden proporcionar inmunoterapias más seguras y versátiles que las que se están sometiendo a prueba y administrando actualmente. En el presente documento se dan a conocer células efectoras con receptores de antígenos quiméricos (CAR-EC) e interruptores de células efectoras con receptores de antígenos quiméricos (CAR-EC), en los que los interruptores de CAR-EC tienen una primera región a la que se une un receptor de antígeno quimérico en el CAR-EC y una segunda región que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, estimulando de ese modo una respuesta inmunitaria del CAR-EC que es citotóxica para la célula diana unida. En general, el CAR-EC es una célula T. De esta manera, el interruptor de CAR-EC puede actuar como un “ interruptor de encendido” para la actividad de CAR-EC. La actividad puede “desactivarse” reduciendo o cesando la administración del interruptor. Estos interruptores de CAR-EC pueden usarse con CAR-EC dadas a conocer en el presente documento, así como células T con CAR existentes, para el tratamiento de una enfermedad o estado, tal como cáncer, en el que la célula diana es una célula maligna. Tal tratamiento puede denominarse en el presente documento inmunoterapia conmutable, para lo cual se representa una vista general esquemática a modo de ejemplo en la figura 1.
Los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento comprenden una primera región que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, y una segunda región a la que se une un receptor de antígeno quimérico. En general, la primera región es un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento que se une a un antígeno en la célula diana. Alternativa o adicionalmente, la primera región puede comprender una molécula pequeña no peptídica (por ejemplo, vitamina, metabolito). La segunda región, denominada en el presente documento antígeno peptídico de unión a antígeno quimérico (CAR-BP), comprende un péptido. Por simplicidad, el término antígeno peptídico de unión a antígeno quimérico puede denominarse simplemente en el presente documento antígeno peptídico. En general, el CAR-BP se fusiona con un extremo terminal del polipéptido de direccionamiento o se injerta dentro del polipéptido de direccionamiento. La fusión o el injerto del CAR-BP con el polipéptido de direccionamiento puede llevarse a cabo mediante la clonación de uno o más polinucleótidos que codifican para la primera región y la segunda región en un vector de expresión de polinucleótido, en un orden o combinación deseados.
Los métodos de tratamiento de una enfermedad o estado que comprenden administrar los interruptores de CAR-EC, dados a conocer en el presente documento, pueden proporcionar una respuesta valorable, una seguridad mejorada y/o cese de la actividad de CAR-EC reduciendo o cesando la administración del interruptor de CAR-EC. A diferencia de otros enfoques para controlar la actividad de CAR-EC, que “desactivan” la actividad de CAR-EC compitiendo con la molécula de superficie de celular diana por la unión al CAR, los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento generalmente funcionan como activadores de CAR-EC o interruptores “de encendido”.
En el presente documento, se dan a conocer plataformas de CAR-EC que incluyen interruptores de CAR-EC y células efectoras que comprenden receptores de antígenos quiméricos (CAR) universales que pueden unirse a múltiples interruptores de c AR-EC, proporcionando un direccionamiento secuencial a uno o más tipos de células diana (por ejemplo, tratamiento de tumores heterogéneos). El CAR puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de afinidad ultra alta (por ejemplo, scFv) por el interruptor. Los métodos de producción de los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento pueden proporcionar ventajosamente el control de la actividad celular de CAR-EC, valoración de la reactividad inespecífica, supresión del síndrome de lisis tumoral (TLS), atenuación del síndrome de liberación de citocinas (CRS) y/u optimización de la unión al interruptor de CAR-EC por afinidad, valencia, geometría, longitud y/o química a través de injerto/fusión específico de sitio de péptidos/anticuerpos de interruptor de CAR-EC.
A menos que se especifique lo contrario, los términos “interruptor” e “ interruptor de CAR-EC”, tal como se usan en el presente documento, se usan indistintamente y pueden referirse a un interruptor peptídico. La parte de anticuerpo del interruptor de anticuerpo peptídico puede comprender al menos una parte de un anticuerpo o un anticuerpo entero. Por ejemplo, la parte de anticuerpo del interruptor de anticuerpo peptídico puede comprender al menos una parte de una cadena pesada, una parte de una cadena ligera, una parte de una región variable, una parte de una región constante, una parte de una región determinante de complementariedad, o una combinación de las mismas. La parte de anticuerpo del interruptor de anticuerpo peptídico y/o interruptor de anticuerpo de hapteno puede comprender al menos una parte de la región de Fc (fragmento, cristalizable). La parte de anticuerpo del interruptor de anticuerpo de peptídico puede comprender al menos una parte de la región determinante de complementariedad (por ejemplo, CDR1, CDR2, CDR3). La parte de anticuerpo del interruptor de anticuerpo peptídico puede comprender al menos una parte de la región de Fab (fragmento, unión a antígeno). El interruptor peptídico puede ser un interruptor de péptido Fab.
Se exponen ejemplos para dotar a los expertos habituales en la técnica de una divulgación y una descripción completas de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es a la atmosférica o casi.
Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor declarado o valor intermedio en un intervalo declarado y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo indicado se abarca dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse de manera independiente en el intervalo, y cada intervalo en el que cualquiera, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también se abarca dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado. Cuando el intervalo declarado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.
Cabe señalar que, tal como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de tales células y la referencia a “el péptido” incluye referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, etc.
Las publicaciones comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. En el presente documento nada debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a tal publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, las cuales puede que sea necesario confirmar de manera independiente.
Se proporcionan métodos, kits y composiciones para la producción de plataformas de CAR-EC e interruptores de CAR-EC usados para poner una célula efectora junto con una diana en un sujeto. Estos métodos, kits y composiciones encuentran uso terapéutico en varias enfermedades. Por ejemplo, tumores heterogéneos y neoplasias de células sanguíneas (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda y leucemia linfocítica crónica) pueden tratarse más eficazmente con una plataforma de CAR-EC cuando la longitud, la valencia y la orientación de la unión del interruptor de CAR-EC, así como del resto de direccionamiento celular del interruptor de CAR-EC se optimizan. Los tumores heterogéneos pueden tratarse más eficazmente con múltiples interruptores de CAR-EC que se dirigen a más de un antígeno tumoral. Ventajas, y características de la invención, resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras leer los detalles de las composiciones y los métodos tal como se describe más detalladamente a continuación.
IA. Interruptor peptídico
En el presente documento se dan a conocer interruptores de receptor de antígeno quimérico-célula efectora que comprenden: un antígeno peptídico que se une a un receptor de antígeno quimérico en una célula efectora; y un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una diana. El resto de direccionamiento puede ser un polipéptido de direccionamiento, que comprende un péptido de direccionamiento que se une a la molécula de superficie celular. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento que comprende el péptido de direccionamiento, en el que el péptido de direccionamiento es un sitio de unión a antígeno del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El péptido de direccionamiento puede ser al menos una parte de un fragmento de anticuerpo y la molécula de superficie celular puede ser un antígeno. El resto de direccionamiento puede comprender uno o más péptidos que reconocen y/o se unen a uno o más antígenos. El resto de direccionamiento puede comprender uno o más péptidos que reconocen y/o se unen a un solo antígeno. El antígeno peptídico puede no comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconozca y/o se una a un antígeno.
En el presente documento se dan a conocer además interruptores de CAR-EC que comprenden: un antígeno peptídico que se une a un CAR (CAR-BP) en una célula efectora, en el que el CAR-BP; y un polipéptido de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en el polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, entre aminoácidos elegidos del polipéptido de direccionamiento). El polipéptido de direccionamiento puede fusionarse con un extremo terminal del antígeno peptídico. El polipéptido de direccionamiento puede injertarse en el antígeno peptídico (por ejemplo, entre aminoácidos elegidos del antígeno peptídico).
Se dan a conocer en el presente documento interruptores de CAR-EC que comprenden: un antígeno peptídico que se une a un CAR (CAR-BP) en una célula efectora; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse a partir de una inmunoglobulina, una Fab, un Fab', un F(ab')2 y un scFv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena ligera. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena pesada.
El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VH del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio CL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio Fc del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VL de una IgG. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VH de una IgG. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio CL de una IgG. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio Fc de una IgG. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VL de un Fab. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal de un dominio VH de un Fab. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio CL de un Fab. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal de un dominio CH1 del Fab.
El antígeno peptídico puede injertarse en un sitio interno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento (por ejemplo, entre aminoácidos elegidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento). El antígeno peptídico puede injertarse en una cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio/región constante de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio/región variable de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse en un sitio interno de un Fab. El antígeno peptídico puede injertarse en un sitio interno de una inmunoglobulina (por ejemplo, IgG). El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio del anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo seleccionado de un dominio CL, un dominio CH1 , un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio VL, un dominio VH y un dominio de bisagra. El antígeno peptídico puede injertarse entre dos dominios del anticuerpo o fragmento del mismo seleccionados de un dominio CL, un dominio CH1 , un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio VL, un dominio VH y un dominio de bisagra, donde los dos dominios son adyacentes. El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio CL del anticuerpo o fragmento del mismo. El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio CH1 del anticuerpo o fragmento del mismo. El antígeno peptídico puede injertarse en un dominio de bisagra del anticuerpo o fragmento del mismo. El antígeno peptídico puede injertarse en un bucle del anticuerpo o fragmento del mismo. El antígeno peptídico puede injertarse en un bucle de dominio CL del anticuerpo o fragmento del mismo.
El CAR-BP puede injertarse en el extremo C terminal del anticuerpo o fragmento de anticuerpo y, por tanto, la distancia entre el receptor de antígeno quimérico y la diana puede diferir sustancialmente dependiendo del tamaño del interruptor de CAR-EC (aproximadamente 40 A para scFv, 70 A para Fab y 120 A para IgG). Aunque una distancia mayor puede tener un impacto negativo sobre la eficacia in vitro, el tiempo de residencia aumentado del anticuerpo de longitud completa puede ser superior in vivo.
El CAR-BP puede comprender además un ligador. El ligador puede proporcionar al interruptor de CAR-EC flexibilidad, longitud o geometría óptimas para facilitar una interacción o un efecto del CAR-EC sobre la célula diana. El CAR-BP puede comprender además uno o más ligadores. El CAR-BP puede comprender dos ligadores. El ligador puede comprender un péptido. El ligador puede tener al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud. El uno o más ligadores pueden comprender aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 aminoácidos. El ligador puede estar ubicado en el extremo N terminal o en el extremo C terminal del CAR-BP para injertar el CAR-BP en el polipéptido de direccionamiento. Un primer ligador puede fusionarse con el extremo N terminal del CAR-BP y un segundo ligador puede fusionarse con el extremo C terminal del CAR-BP. El ligador puede estar compuesto por la secuencia (GGGGS)n , (SEQ ID NO.40), en la que n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o más. El ligador puede estar compuesto por la secuencia (GGS)n , (SEQ ID NO.40), en la que n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o más. El c AR-BP puede injertarse en un sitio interno del polipéptido de direccionamiento con un ligador en cualquiera de los extremos del CAR-BP. El ligador puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 40-44.
El antígeno peptídico
El antígeno peptídico (CAR-BP) puede ser un péptido al que se une un receptor de antígeno quimérico (CAR). El antígeno peptídico puede tener alta estabilidad proteolítica y baja inmunogenicidad en humanos en relación con los péptidos en general. El CAR-BP puede seleccionarse de una hormona, una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, una molécula de adhesión celular, un péptido de señalización, un receptor, un péptido de superficie celular y fragmentos de los mismos. El CAR-BP puede ser un peptoide. El CAR-BP puede ser un ácido nucleico peptídico (PNA). El CAR-BP puede ser un ligando o un fragmento del mismo. El ligando puede ser un ligando hormonal. El ligando puede ser un ligando de péptido. El CAR-BP puede ser un péptido cíclico. El CAR-BP puede ser un péptido lineal. El CAR-BP puede tener una longitud de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10, aproximadamente 10 y aproximadamente 20, aproximadamente 20 y aproximadamente 30, aproximadamente 30 y aproximadamente 40, aproximadamente 40 y aproximadamente 50, aproximadamente 50 y aproximadamente 60, aproximadamente 60 y aproximadamente 70, aproximadamente 70 y aproximadamente 80 y aproximadamente 80 y aproximadamente 90 aminoácidos. El CAR-BP puede ser un antígeno. El CAR-BP puede ser un epítopo. El CAR-BP puede ser un epítopo no lineal. El CAR-BP puede comprender además un segundo péptido.
El antígeno peptídico puede no comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 10 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 12 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 15 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 20 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 22 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede comprender menos de 30 aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antígeno peptídico puede no comprender un parátopo de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
En el presente documento se dan a conocer interruptores de célula efectora con receptor de antígeno quimérico que comprenden un resto de direccionamiento y un antígeno peptídico, en los que el resto de direccionamiento es un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un dominio variable. El dominio variable puede seleccionarse de un dominio VH y un dominio VL. El antígeno peptídico puede no estar ubicado en o cerca del extremo N terminal del dominio VH. El antígeno peptídico puede no estar ubicado en o cerca del extremo N terminal del dominio VL.
El antígeno peptídico puede comprender un péptido que no se produce de manera natural. El antígeno peptídico puede comprender un péptido sintético. El antígeno peptídico puede comprender un péptido no animal (por ejemplo, un péptido no expresado en un animal). El antígeno peptídico puede comprender un péptido no mamífero. El antígeno peptídico puede comprender un péptido no humano. El péptido puede comprender un péptido derivado de una planta, una levadura, una bacteria, un reptil, un ave o un insecto.
El antígeno peptídico puede comprender una etiqueta myc. El antígeno peptídico puede comprender etiqueta His. El antígeno peptídico puede comprender una etiqueta HA. El antígeno peptídico puede comprender complejo de peridinina-clorofila-proteína. El antígeno peptídico puede comprender proteína fluorescente verde (GFP). El antígeno peptídico puede comprender proteína fluorescente roja (RFP). El antígeno peptídico puede comprender ficoeritrina (PE). El antígeno peptídico puede comprender estreptavidina. El antígeno peptídico puede comprender avidina. El antígeno peptídico puede comprender peroxidasa del rábano (HRP). El antígeno peptídico puede comprender fosfatasa alcalina. El antígeno peptídico puede comprender glucosa oxidasa. El antígeno peptídico puede comprender glutationa-S-transferasa (GST). El antígeno peptídico puede comprender proteína de unión a maltosa. El antígeno peptídico, mediante un ejemplo no limitante, puede ser una etiqueta c-myc, etiqueta de polihistidina, V5, VSVG, softag 1, softag 3, etiqueta express, etiqueta S, palmitoilación, nitrosilación, etiqueta SUMO, tiorredoxina, poli(NANP), poliarg, proteína de unión a calmodulina, fragmento PurF, cetoesteroide isomerasa, Pap3.30, dominio de plegamiento de histona TAF12, etiqueta FKBP, etiqueta SNAP, etiqueta Halo, péptidos de RNAsa I. El antígeno peptídico puede comprender un sitio de escisión de proteasa. El sitio de escisión de proteasa puede reconocerse por trombina, factor Xa, proteasa TEV o enterocinasa.
El antígeno peptídico puede ser un péptido hidrofílico lineal pequeño. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede comprender un ligador. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser un péptido diana hidrofílico (HTP). El péptido hidrofílico lineal pequeño puede comprender la secuencia GGGGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 5). El péptido hidrofílico lineal pequeño puede comprender la secuencia GGGGSDYKDDDDKP (SEQ ID NO: 6). El péptido hidrofílico lineal pequeño puede consistir esencialmente en la secuencia GGGGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 5). El péptido hidrofílico lineal pequeño puede consistir esencialmente en la secuencia GGGGSDYKDDDDKP (SEQ ID NO: 6). El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 50% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 60% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 70% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 80% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 85% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede ser al menos aproximadamente un 90% homólogo a SEQ ID NO: 5 o 6. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede tener una unión inespecífica reducida en relación con otros péptidos conocidos en la técnica. El péptido hidrofílico lineal pequeño puede tener una unión inespecífica reducida e inestabilidad de proteína de fusión reducida en relación con otros péptidos dados a conocer en el presente documento. El antígeno peptídico puede comprender una etiqueta FLAG® (SEQ ID NO: 7) o un derivado o un homólogo de la misma.
El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido que se produce de manera natural. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido humano. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en un animal seleccionado de un chimpancé, un mono, una rata, un ratón, un ave, un pez, un cerdo, un caballo, una vaca, una cabra, un pollo, un conejo y un conejillo de indias. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido de mamífero. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido no mamífero. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en una planta. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido expresado en una bacteria. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido procariota. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido eucariota. El péptido puede basarse en o derivarse de un péptido expresado por una levadura. El antígeno peptídico puede comprender un péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 o un derivado o un homólogo del mismo. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede comprender la secuencia RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER (SEQ ID NO: 2). El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede comprender la secuencia NYHLENeVa RLKKL (SEQ ID No : 3). El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede consistir esencialmente en la secuencia RMKQl Ep k Ve ELLPKNYHLENEVARLk KlVGER (SEQ ID NO: 2). El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede consistir esencialmente en la secuencia NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 3). El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede comprender una parte de SEQ ID NO. 2. La parte de SEQ ID NO. 2 puede ser de al menos 4 aminoácidos de largo. La parte de SEQ ID NO. 2 puede ser de aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12 o aproximadamente 13 aminoácidos de largo. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 50% homólogo a SEQ ID NO: 2 o 3. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 60% homólogo a SEQ ID NO: 2 o 3. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 70% homóloga a SEQ ID NO: 2 o 3. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 80% homólogo a SEQ ID NO: 2 o 3. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 85% homólogo a SEQ ID NO: 2 o 3. El péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 puede ser al menos aproximadamente un 90% homólogo a s Eq ID NO: 2 o 3. El interruptor de CAR-EC puede comprender un péptido de levadura GCN4 y uno o más ligadores. El interruptor de CAR-EC puede comprender SEQ ID NO. 4.
El resto de direccionamiento
El resto de direccionamiento puede unirse a una molécula de superficie celular en una diana. La molécula de superficie celular puede comprender un antígeno. La molécula de superficie celular puede seleccionarse de una proteína, un resto lipídico, una glicoproteína, un glicolípido, un hidrato de carbono, un polisacárido, un ácido nucleico, un péptido unido a MHC, o una combinación de los mismos. La molécula de superficie celular puede comprender partes (por ejemplo, capas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbras y toxinas) de bacterias, virus y otros microorganismos. La molécula de superficie celular puede expresarse por la célula diana. La molécula de superficie celular puede no expresarse por la célula diana. A modo de ejemplo no limitante, la molécula de superficie celular puede ser un ligando expresado por una célula que no es la célula diana y que está unido a la célula diana o a una molécula de superficie celular de la célula diana. También, mediante un ejemplo no limitante, la molécula de superficie celular puede ser una toxina, una molécula exógena o una proteína viral que está unida a una superficie celular o a un receptor de superficie celular de la célula diana.
El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede ser una inmunoglobulina (Ig). La inmunoglobulina puede seleccionarse de una IgG, una IgA, una IgD, una IgE, una IgM, un fragmento de la misma o una modificación de la misma. La inmunoglobulina puede ser IgG. La IgG puede ser IgG1. La IgG puede ser IgG2. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para modular la unión de FcR de células T endógenas al interruptor de CAR-EC. La IgG puede tener una o más mutaciones de Fc para eliminar la capacidad de unión de Fc a la FcR de células positivas para FcR. La eliminación de la capacidad de unión de Fc puede reducir la posibilidad de reticulación del CAR-EC a células positivas para FcR, en la que la reticulación del CAR-EC a células positivas para FcR activaría el CAR-EC en ausencia de la célula diana. Como tal, la modulación de la unión de FcR de células T endógenas al interruptor de CAR-EC puede reducir una respuesta inmunitaria ineficaz o indeseable. La una o más mutaciones de Fc pueden eliminar un sitio de glicosilación. La una o más mutaciones de Fc pueden seleccionarse de E233P, L234V, L235A, delG236, A327G, A330S, P331S, N297Q y cualquier combinación de las mismas. La una o más mutaciones de Fc pueden ser en IgG1. Las una o más mutaciones de Fc en IgG1 pueden ser L234A, L235A, o ambas. Alternativamente, o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en IgG1 pueden ser L234A, L235E, o ambas. Alternativamente, o adicionalmente, la una o más mutaciones de Fc en IgG1 pueden ser N297A. Alternativamente, o adicionalmente, la una o más mutaciones pueden ser en IgG2. La una o más mutaciones de Fc en IgG2 pueden ser V234A, V237A, o ambas.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede ser una inmunoglobulina Fc nula o un fragmento de la misma.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento de anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo distinta de la forma de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpos en el presente documento incluyen anticuerpos que son componentes más pequeños que existen dentro de anticuerpos de longitud completa, y anticuerpos que se han diseñado por ingeniería genética. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fc, Fab y (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, regiones marco, regiones constantes, cadenas pesadas, cadenas ligeras, moléculas distintas de anticuerpos de armazones alternativos y anticuerpos biespecíficos. A menos que se indique específicamente lo contrario, las declaraciones y reivindicaciones que usan el término “anticuerpo” o “anticuerpos” pueden incluir específicamente “fragmento de anticuerpo” y “fragmentos de anticuerpos”.
El fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede ser un anticuerpo humano, totalmente humano, humanizado, humano diseñado por ingeniería genética, no humano y/o quimérico. El anticuerpo no humano puede humanizarse para reducir la inmunogenicidad para humanos, al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Anticuerpos quiméricos puede referirse a anticuerpos creados a través de la unión de dos o más genes de anticuerpos que originalmente se codificaron para anticuerpos independientes. Un anticuerpo quimérico puede comprender al menos un aminoácido de un primer anticuerpo y al menos un aminoácido de un segundo anticuerpo, en el que los anticuerpos primero y segundo son diferentes. Al menos una parte del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de una especie bovina, una especie humana o una especie murina. Al menos una parte del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de una rata, una cabra, un conejillo de indias o un conejo. Al menos una parte del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de un humano. Al menos una parte del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser de mono cynomolgus.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de un mamífero, ave, pez, anfibio, reptil. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, carnívoros, roedores, elefantes, marsupiales, conejos, murciélagos, primates, focas, osos hormigueros, cetáceos, ungulados de dedos impares y ungulados de dedos pares. El mamífero puede ser un humano, primate no humano, ratón, oveja, gato, perro, vaca, caballo, cabra o cerdo.
El anticuerpo de direccionamiento o un fragmento de anticuerpo puede dirigirse a un antígeno seleccionado de, mediante un ejemplo no limitante, CD19, Her2, CLL-1, CD33, EFg Rv III, CD20, CD22, BCMA o un fragmento de los mismos. El antígeno puede comprender un antígeno silvestre. El antígeno puede comprender una o más mutaciones.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CD22. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-BCMA o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-CS1 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-EGFRvIII o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender rituximab. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CEA o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CLL-1 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD33 o fragmento de anticuerpo. El polipéptido de direccionamiento puede no comprender un anticuerpo anti-EpCAM o fragmento del mismo.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse de cualquier anticuerpo disponible comercialmente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse de adotrastuzumab emtansina, alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab, vedotin, gemtuzumab, ozogamicina, ipilimumab, ibritumomab, tiuxetán, panitumumab, cetuximab, erbitux, rituximab, trastuzumab y fragmentos de los mismos.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia de nucleótidos basada en o derivada de SEQ ID NO. 8. La secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 65%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homóloga a SEQ ID NO. 8. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena pesada del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo puede codificarse por una secuencia basada en o derivada de SEQ ID NO. 9. La secuencia de nucleótidos puede ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente u
Figure imgf000011_0003
5%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%, aproximadamente u
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5%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente u
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5%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homóloga a SEQ ID NO. 9.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo. La cadena ligera del anticuerpo anti-CD19 o fragmento puede comprender una secuencia de aminoácidos basada en o derivada de SEQ ID NO. 27. La secuencia de aminoácidos puede ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%,aproximadamente un 65%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homóloga a SEQ ID NO. 27. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada del anti-CD 19 o fragmento del mismo. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de una IgG anti-CD 19. La cadena pesada de la IgG anti-CD 19 puede comprender una secuencia basada en o derivada de SEQ ID NO. 28. La secuencia de aminoácidos puede ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente u
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5%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 65%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente u
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0%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homóloga a SEQ ID NO. 28. El anticuerpo de direccionamiento o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de un Fab anti-CD 19. La cadena pesada del Fab anti-CD19 puede comprender una secuencia basada en o derivada de SEQ ID NO. 29. La secuencia de aminoácidos puede ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 80%, aproximadamente u
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5%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 60%, aproximadamente u
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5%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homóloga a SEQ ID NO. 29.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-20. El polipéptido de direccionamiento puede basarse en o derivarse de un nucleótido seleccionado de SEQ ID NO: 8-20. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 21-29. El polipéptido de direccionamiento puede basarse en o derivarse de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 21-29.
En el presente documento se dan a conocer interruptores de célula efectora con receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) que comprenden un antígeno peptídico y un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. Generalmente, la unión de la célula efectora y la célula diana al constructo de interruptor de CAR-EC pone la célula diana en proximidad con la célula efectora lo suficientemente cercana como para que una actividad de la célula efectora tenga un efecto sobre la célula diana. Por ejemplo, cuando la célula T y la célula diana están unidas al interruptor de CAR-EC, la célula T puede producir una respuesta inmunitaria que tiene un efecto citotóxico sobre la célula diana.
Los interruptores de CAR-EC pueden interaccionar con una pluralidad de células diana. La célula diana puede ser una célula infectada. La célula diana puede ser una célula infectada patógenamente. La célula diana puede ser una célula enferma. La célula diana puede ser una célula modificada genéticamente. La célula diana puede no ser una célula huésped. La célula diana puede provenir de un organismo invasor (por ejemplo, levadura, gusano, bacterias, hongo). En el presente documento se dan a conocer además interruptores de CAR-EC que interaccionan con una molécula en una diana no celular. La diana no celular puede ser un virus o una parte del mismo. La diana no celular puede ser un fragmento de una célula. La diana no celular puede ser un componente de matriz extracelular o una proteína.
La célula diana puede derivarse de un tejido. El tejido puede seleccionarse de cerebro, esófago, mama, colon, pulmón, glía, ovario, útero, testículos, próstata, tracto gastrointestinal, vejiga, hígado, timo, hueso y piel. La célula diana puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. Alternativamente, o adicionalmente, la célula diana puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. La glándula endocrina puede ser una glándula linfática, glándula hipofisaria, glándula tiroides, glándula paratiroides, páncreas, gónada o glándula pineal.
La célula diana puede seleccionarse de una célula madre, una célula pluripotente, una célula madre hematopoyética o una célula progenitora. La célula diana puede ser una célula circulante. La célula diana puede ser una célula inmunitaria.
La célula diana puede ser una célula madre cancerosa. La célula diana puede ser una célula cancerosa. La célula cancerosa puede derivarse de un tejido. El tejido puede seleccionarse de, a modo de ejemplo no limitante, un cerebro, un esófago, una mama, un colon, un pulmón, una glía, un ovario, un útero, un testículo, una próstata, un tracto gastrointestinal, una vejiga, un hígado, una tiroides y piel. La célula cancerosa puede derivarse del hueso. La célula cancerosa puede derivarse de la sangre. La célula cancerosa puede derivarse de una célula B, una célula T, un monocito, un trombocito, un leucocito, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo, un linfocito, una célula madre hematopoyética o un progenitor de células endoteliales. La célula cancerosa se deriva de un linfocito B positivo para. La célula cancerosa puede derivarse de una célula madre. La célula cancerosa puede derivarse de una célula pluripotente. La célula cancerosa puede derivarse de una o más glándulas endocrinas. La glándula endocrina puede ser una glándula linfática, glándula hipofisaria, glándula tiroides, glándula paratiroides, páncreas, gónada o glándula pineal.
La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD19. La célula cancerosa puede ser un linfocito B positivo para CD19. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para Her2. La célula positiva para Her2 puede ser una célula de cáncer de mama positiva para Her2. La célula diana puede ser una célula positiva para BCMA. La célula cancerosa puede ser una célula de mieloma múltiple positiva para BCMA. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CS1. La célula positiva para CS1 puede ser una célula de mieloma múltiple. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para EGFRvIII. La célula cancerosa puede ser una célula de glioblastoma positiva para EGFRVIII. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD20. La célula cancerosa puede ser una célula positiva para CD22.
La molécula de superficie celular puede ser un antígeno. El antígeno puede ser al menos una parte de un antígeno de superficie o un marcador de superficie celular en una célula. El antígeno puede ser un receptor o un correceptor en una célula. El antígeno puede referirse a una molécula o fragmento molecular al que puede unirse un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y presentarse un receptor de células T. El término “antígeno” también puede referirse a un inmunógeno. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria adaptativa si se inyecta por sí mismo en un sujeto. El inmunógeno puede inducir una respuesta inmunitaria por sí mismo. El antígeno puede ser un superantígeno, un antígeno dependiente de T o un antígeno independiente de T. El antígeno puede ser un antígeno exógeno. Los antígenos exógenos son normalmente antígenos que han entrado en el cuerpo desde el exterior, por ejemplo por inhalación, ingestión o inyección. Algunos antígenos pueden comenzar como antígenos exógenos y luego convertirse en endógenos (por ejemplo, virus intracelulares). El antígeno puede ser un antígeno endógeno. El antígeno endógeno puede ser un antígeno que se ha generado dentro de las células como resultado del metabolismo celular normal o debido a infecciones patógenas (por ejemplo, virales, bacterianas, fúngicas, parasitarias). El antígeno puede ser un autoantígeno. El autoantígeno puede ser una proteína normal o un complejo de proteínas (y a veces ADN o ARN) que se reconoce por el sistema inmunitario de pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria específica. Estos antígenos, en condiciones normales, no deben ser la diana del sistema inmunitario, pero, debido a factores ambientales y/o genéticos, la tolerancia inmunológica normal para tal antígeno no está presente en estos pacientes. El antígeno puede estar presente o sobreexpresarse debido a un estado o enfermedad. El estado o enfermedad puede ser un cáncer o una leucemia. El estado puede ser una enfermedad o estado inflamatorio. El estado o enfermedad puede ser una enfermedad metabólica. El estado puede ser un trastorno genético.
La molécula de superficie celular puede ser un antígeno que se ha diseñado como antígeno tumoral. Los antígenos tumorales o neoantígenos pueden ser antígenos que presentan las moléculas de MHC I o MHC II en la superficie de células tumorales. Estos antígenos a veces pueden presentarse por células tumorales y nunca por las normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor (TSA) y, en general, son el resultado de una mutación específica del tumor. Más comunes son antígenos que presentan células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumor (TAA). Los linfocitos T citotóxicos que reconocen estos antígenos pueden ser capaces de destruir las células tumorales antes de que proliferen o metastaticen. Los antígenos tumorales también pueden estar en la superficie del tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado, en cuyo caso pueden reconocerse por células B. A menos que se especifique lo contrario, los términos “antígeno tumoral”, “antígeno específico de tumor” y “antígeno asociado a tumor”, se usan indistintamente en el presente documento.
La molécula de superficie celular puede ser un receptor. El receptor puede ser un receptor extracelular. El receptor puede ser un receptor de superficie celular. A modo de ejemplo no limitante, el receptor puede unirse a una hormona, un neurotransmisor, una citocina, un factor de crecimiento o una molécula de reconocimiento celular. El receptor puede ser un receptor transmembrana. El receptor puede ser un receptor ligado a enzimas. El receptor puede ser un receptor acoplado a proteína G (GPCR). El receptor puede ser un receptor de factor de crecimiento. A modo de ejemplo no limitante, el receptor de factor de crecimiento puede seleccionarse de un receptor de factor de crecimiento epidérmico, un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, un receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, un receptor de factor de crecimiento nervioso, un receptor de factor de crecimiento transformante, un receptor de factor de crecimiento de proteína morfogénica ósea, un receptor de factor de crecimiento de hepatocitos, un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular, un receptor de factor de crecimiento de células madre, un receptor de factor de crecimiento de insulina, un receptor de somatomedina, un receptor de eritropoyetina y homólogos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser un receptor de hormonas. El receptor puede ser un receptor de insulina. A modo de ejemplo no limitante, el receptor puede seleccionarse de un receptor eicosanoide, un receptor de prostaglandina, un receptor de estrógeno, un receptor de hormona estimulante del folículo, un receptor de progesterona, un receptor de hormona del crecimiento, un receptor de hormona liberadora de gonadotropina, homólogos de los mismos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser un receptor adrenérgico. El receptor puede ser una integrina. El receptor puede ser un receptor de Eph. El receptor puede ser un receptor de hormona luteinizante. La molécula de superficie celular puede ser al menos aproximadamente un 50% homóloga a un receptor de hormona luteinizante. El receptor puede ser un receptor inmunitario. A modo de ejemplo no limitante, el receptor inmunitario puede seleccionarse de un receptor de reconocimiento de patrones, un receptor de tipo peaje, un receptor de tipo NOD, un receptor activado citolítico, un receptor inhibidor citolítico, un receptor de Fc, un receptor de células B, un receptor del complemento, un receptor de quimiocinas y un receptor de citocinas. A modo de ejemplo no limitante, el receptor de citocinas puede seleccionarse de un receptor de interleucina, un receptor de interferón, un receptor de factor de crecimiento transformante, un receptor de factor de necrosis tumoral, un receptor de factor estimulante de colonias, homólogos de los mismos y fragmentos de los mismos. El receptor puede ser una cinasa receptora. La cinasa receptora puede ser un receptor tirosina cinasa. La cinasa receptora puede ser un receptor serina cinasa. La cinasa receptora puede ser un receptor treonina cinasa. A modo de ejemplo no limitante, la cinasa receptora puede activar una proteína de señalización seleccionada de una Ras, una Raf, una PI3K, una proteína cinasa A, una proteína cinasa B, una proteína cinasa C, una AKT, una AMPK, una fosfolipasa, homólogos de las mismas y fragmentos de las mismas. La cinasa receptora puede activar una vía de señalización de MAPK/ERK. La cinasa receptora puede activar Jak, Stat o Smad.
La molécula de superficie celular puede ser una proteína de superficie celular no receptora. La molécula de superficie celular pueden ser proteínas de grupo de diferenciación. A modo de ejemplo no limitante, la molécula de superficie celular puede seleccionarse de CD34, CD31, CD117, CD45, CD11b, CD15, CD24, CD114, CD182, CD14, CD11a, CD91, CD16, CD3, CD4, CD25, CD8, CD38, CD22, CD61, CD56, CD30, CD13, CD33, fragmentos de los mismos y homólogos de los mismos.
La molécula de superficie celular puede ser una molécula que no comprende un péptido. La molécula de superficie celular puede comprender un lípido. La molécula de superficie celular puede comprender un resto lipídico o un grupo lipídico. El resto lipídico puede comprender un esterol. El resto lipídico puede comprender un ácido graso. El antígeno puede comprender un glicolípido. La molécula de superficie celular puede comprender un hidrato de carbono.
En el presente documento se dan a conocer interruptores de CAR-EC que comprenden (a) un antígeno peptídico de unión a receptor de antígeno quimérico que comprende un péptido de un péptido de factor de transcripción de levadura; y (b) un polipéptido de direccionamiento. El péptido de factor de transcripción de levadura puede ser un péptido GCN4. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena ligera de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un Fab de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-EGFRvIN, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-CD33 y fragmentos de los mismos.
En el presente documento se dan a conocer además interruptores de CAR-EC que comprenden (a) una región de unión a CAR que comprende una etiqueta de péptido diana hidrofílico (HTP); y (b) un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena pesada de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender una cadena ligera de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un Fab de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede comprender un anticuerpo anti-Her2 o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-CD33 y fragmentos de los mismos.
El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada que es al menos un 50% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada que es al menos un 60% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID No .32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada que es al menos un 70% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada que es al menos un 80% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO.
32, Se Q ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena pesada que es al menos un 90% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 38.
El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO. 30, s Eq ID NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena ligera que es al menos un 50% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 30, SEQ iD NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena ligera que es al menos un 60% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 30, SEQ iD NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena ligera que es al menos un 70% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 30, SEQ iD NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena ligera que es al menos un 80% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 30, SEQ iD NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una cadena ligera que es al menos un 90% homóloga a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37.
El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO. 29 y una cadena ligera de SEQ ID No .30. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 29 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 36. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 28 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 31. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 32 y una cadena ligera de SEQ ID No .27. El interruptor de receptor de antígeno quiméricocélula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 33 y una cadena ligera de SEQ ID No .27. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una cadena pesada de SEQ ID NO.
34 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 27. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 35 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 27. El interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora puede comprender una pesada cadena de SEQ ID NO. 38 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 37.
Interruptores de CAR-EC multivalentes
En el presente documento se representan a modo de ejemplo interruptores de CAR-EC que comprenden un antígeno peptídico de unión a receptor de antígeno quimérico (CAR-BP) y un polipéptido de direccionamiento. Sin embargo, un experto en la técnica entendería que estos interruptores podrían además comprender polipéptidos de direccionamiento adicionales y/o CAR-BP adicionales. Uno o más CAR-BP pueden injertarse en uno o más sitios de injerto del polipéptido de direccionamiento. Uno o más CAR-BP pueden fusionarse con uno o más extremos terminales del polipéptido de direccionamiento. Esto puede ser ventajoso, ya que pueden predecirse varios sitios de injerto/fusión para proporcionar una unión óptima del CAR-BP al CAR. Por ejemplo, un primer CAR-BP puede injertarse en un primer dominio del polipéptido de direccionamiento y un segundo CAR-BP puede injertarse en un segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer dominio y el segundo dominio pueden ser los mismos. El primer dominio y el segundo dominio pueden ser diferentes. A modo de ejemplo no limitante, el primer CAR-BP puede injertarse en una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento y un segundo CAR-BP puede injertarse en una cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El primer CAR-BP puede fusionarse con un primer extremo terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo CAR-BP puede fusionarse con un segundo extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. A modo de ejemplo no limitante, el primer CAR-BP puede fusionarse con un extremo C terminal de una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento y un segundo CAR-BP puede fusionarse con un extremo N terminal de una cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El primer CAR-BP puede fusionarse con un extremo terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo c AR-BP puede injertarse dentro de un dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer CAR-BP y el segundo CAR-BP pueden ser iguales o similares, de manera que el interruptor de CAR-EC puede usarse con una célula CAR-EC que expresa un CAR. El primer CAR-BP y el segundo CAR-BP pueden ser diferentes, de manera que el interruptor de CAR-EC puede usarse con una célula c A r -EC que expresa uno o más CAR o múltiples células CAR-EC que expresan diferentes CAR.
Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más CAR-BP. Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender dos o más CAR-BP. Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender tres o más CAR-BP. Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más CAR-BP. El uno o más CAR-BP pueden fusionarse o injertarse en el polipéptido de direccionamiento por medio de uno o más ligadores. Por tanto, los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más ligadores (por ejemplo, L1, L2). Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender dos o más ligadores. Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender tres o más ligadores. Los interruptores peptídicos dados a conocer en el presente documento pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más ligadores.
IB. Interruptor de péptido-molécula pequeña
En el presente documento se dan a conocer además interruptores de CAR-EC que comprenden una región de unión a CAR y un resto de direccionamiento, en la que la región de unión a CAR es un antígeno peptídico de unión a CAR y el resto de direccionamiento es una molécula no peptídica pequeña. La molécula no peptídica pequeña puede ser una molécula de direccionamiento celular, un ligando químico, un ácido nucleico, una vitamina, un sustrato o un análogo de sustrato. La molécula no peptídica pequeña puede no comprender dos aminoácidos, en la que los dos aminoácidos están conectados por un enlace amida. El interruptor de CAR-EC puede comprender además un ligador. El antígeno peptídico de unión a CAR (CAR-BP) y la molécula pequeña pueden estar unidos de manera específica de sitio. El antígeno peptídico de unión a CAR puede comprender un aminoácido no natural. El antígeno peptídico de unión a CAR y la molécula pequeña pueden estar unidos de manera específica de sitio por el aminoácido no natural. La molécula pequeña puede unirse a una molécula de superficie celular en una célula diana. La molécula de superficie celular puede seleccionarse de un antígeno, una proteína, un péptido, un lípido, un esterol, un glicolípido y un marcador de superficie celular. El antígeno peptídico de unión a c Ar puede seleccionarse de etiqueta FLAG®, factor de transcripción de levadura GCN4 y un péptido diana hidrofílico (HTP). La molécula pequeña puede ser ácido 2-[3-(1,3-dicarboxipropil)ureido]pentanodioico. La molécula pequeña puede ser folato. El interruptor de CAR-EC puede comprender además un ligador.
En el presente documento se dan a conocer métodos de producción de interruptores de CAR-EC que comprenden conjugar la región de unión a CAR con el resto de direccionamiento, en los que los interruptores de CAR-EC comprenden una región de unión a CAR y un resto de direccionamiento, en los que la región de unión a CAR es un antígeno peptídico de unión a CAR y el resto de direccionamiento es una molécula pequeña. El método puede comprender además conjugar la molécula pequeña con el ligador para crear un producto intermedio de ligadormolécula pequeña. La molécula pequeña o el producto intermedio de ligador-molécula pequeña puede comprender uno o más grupos funcionales reactivos que pueden reaccionar con un grupo funcional reactivo complementario en el CAR-BP, anterior a su incorporación al interruptor de CAR-EC. El ligador o el producto intermedio de ligador-molécula pequeña puede ser bifuncional. El ligador o el producto intermedio de ligador-molécula pequeña puede ser heterobifuncional.
El producto intermedio de ligador-molécula pequeña o el interruptor de CAR-EC puede ser el producto de una reacción bioortogonal, cuyos ejemplos no limitantes se revisan en Kim etal., Curr Opin Chem Bio 17:412-419 (2013). El producto intermedio de ligador-molécula pequeña, el ligador o el interruptor de CAR-EC puede comprender una oxima, un tetrazol, un aducto de Diels Alder, un heteroaducto de Diels Alder, un producto de reacción de sustitución aromática, un producto de reacción de sustitución nucleofílica, un éster, una amida, un carbamato, un éter, un tioéter o un producto de reacción de Michael. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña, ligador o interruptor de CAR-Ec es un producto de cicloadición, un producto de reacción de metátesis, un producto de reacción de acoplamiento cruzado mediado por metales, un producto de polimerización por radicales, un producto de acoplamiento oxidativo, un producto de reacción de transferencia de acilo o un producto de reacción foto-clic. La cicloadición puede ser una cicloadición de Huisgen. La cicloadición puede ser una cicloadición de Huisgen libre de cobre [3+2]. La cicloadición puede ser una reacción de Diels-Alder. La cicloadición puede ser una heterorreacción de Diels-Alder. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña puede ser el producto de una reacción mediada por enzimas. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña puede ser un producto de una reacción mediada por transglutaminasa, cuyos ejemplos no limitantes se describen en Lin et al., J. Am. Chem. Soc. 128:4542-4543 (2006) y el documento WO 2013/093809. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña, el ligador o el interruptor de CAR-EC puede comprender un puente de disulfuro que conecta dos residuos de cisteína, tal como la tecnología ThioBridge™ de PolyTherics. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña, el ligador o el interruptor de CAR-EC puede comprender un puente de maleimida que conecta dos residuos de aminoácidos. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña, el ligador o el interruptor de CAR-EC puede comprender un puente de maleimida que conecta dos residuos de cisteína.
El producto intermedio de ligador-molécula pequeña o ligador puede comprender un grupo alcoxi-amina (o aminooxilo), grupo azida y/o grupo ciclooctino en uno o más extremos terminales. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña o ligador puede comprender una alcoxi-amina en un extremo terminal y un grupo azida en el otro extremo terminal. El producto intermedio de ligador-molécula pequeña o ligador puede comprender una alcoxi-amina en un extremo terminal y un grupo de ciclooctino en el otro extremo terminal. La alcoxi-amina puede formar una oxima estable con un grupo cetona sobre un aminoácido. La alcoxi-amina puede formar una oxima estable con un grupo cetona sobre un aminoácido no natural. El grupo cetona puede estar en una p-acetilfenilalanina (pAcF).
II. Receptor de antígeno quimérico (CAR)
En el presente documento se dan a conocer interruptores de CAR-EC que regulan las actividades de una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). El receptor de antígeno quimérico puede comprender un dominio extracelular, dominio transmembrana y dominio intracelular. El dominio extracelular puede unirse al antígeno peptídico (por ejemplo CAR-BP) del interruptor de CAR-EC. El dominio extracelular puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al CAR-BP del interruptor de CAR-EC (un CAR-anticuerpo). El CAR-anticuerpo puede comprender al menos una parte de un anticuerpo. En algunos casos, el CAR-anticuerpo no es un anticuerpo de longitud completa. El CAR-anticuerpo puede comprender al menos una parte de una inmunoglobulina o fragmento de la misma. La inmunoglobulina o fragmento de la misma puede seleccionarse del grupo que consiste en un scFv, un discFV, un bi-scFv, un Fab, un Fc, un F(ab')2 , un pFC', un nanocuerpo, un aficuerpo, un DARPin, un diacuerpo, un camélido, un receptor de células T modificado por ingeniería genética y un monocuerpo. La inmunoglobulina puede seleccionarse del grupo que consiste en una IgA1, una IgA2, una IgD, una IgM, una IgE, una IgG1, una IgG2, una IgG3 y una IgG4. El CAR-anticuerpo puede comprender al menos una parte de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). El CAR-anticuerpo puede ser anticuerpo humano, totalmente humano, humanizado, humano modificado por ingeniería genética, no humano y/o quimérico.
El CAR-anticuerpo puede tener una afinidad de unión por el CAR-BP de menos de aproximadamente 0,01 pM, aproximadamente 0,02 pM, aproximadamente 0,03 pM, aproximadamente 0,04 pM, 0,05 pM, aproximadamente 0,06 pM, aproximadamente 0,07 pM, aproximadamente 0,08 pM, aproximadamente 0,09 pM, aproximadamente 0,1 pM, aproximadamente 0,2 pM, 0,3 pM, aproximadamente 0,4 pM, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 0,6 pM, aproximadamente 0,7 pM, aproximadamente 0,8 pM, aproximadamente 0,9 pM o aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 7 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 0,01 nM, aproximadamente 0,02 nM, aproximadamente 0,03 nM, aproximadamente 0,04 nM, aproximadamente 0,05 nM, aproximadamente 0,06 nM, aproximadamente 0,07 nM, aproximadamente 0,08 nM, aproximadamente 0,09 nM, aproximadamente 0,1 nM, aproximadamente 0,2 nM, aproximadamente 0,3 nM, aproximadamente 0,4 nM, aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente 0,6 nM, aproximadamente 0,7 nM, aproximadamente 0,8 nM, aproximadamente 0,9 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 9 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 12 nM, aproximadamente 14 nM, aproximadamente 16 nM, aproximadamente 18 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 22 nM, aproximadamente 24 nM, aproximadamente 26 nM, aproximadamente 28 nM o aproximadamente 30 nM.
El CAR-anticuerpo puede reconocer un péptido sintético (que no se produce de manera natural). El CAR-anticuerpo puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce una etiqueta FLAG® o un fragmento de la misma. El CAR-anticuerpo puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce un factor de transcripción de levadura GCN4 o un fragmento del mismo. El CAR-anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-HTP o un fragmento del mismo.
El dominio transmembrana y/o el dominio intracelular del CAR pueden comprender al menos una parte de un dominio de señalización citoplásmico. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de una molécula de señalización seleccionada del grupo que comprende CD3zeta, CD28, y 4-1BB. El dominio intracelular puede comprender un receptor de Fc o una parte del mismo. El receptor de Fc o parte del mismo puede ser CD16 o una parte del mismo. La molécula de señalización puede comprender CD3zeta. La molécula de señalización puede comprender CD28. La molécula de señalización puede comprender 4-1BB. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD3zeta. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD28, el dominio intracelular puede comprender al menos una parte de 4-1BB, el dominio intracelular puede comprender al menos una parte de OX-40, el dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD30, el dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD40, el dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD2. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD27. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de PD-1. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de ICOS. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de antígeno-1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1). El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de CD7. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de LIGHT. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de NKG2C. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de B7-H3. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de un dominio de señalización citoplásmico de una o más moléculas de señalización. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de dos o más dominios de señalización citoplásmicos. Los dos o más dominios de señalización citoplásmicos pueden ser de dos o más moléculas de señalización diferentes. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de tres o más dominios de señalización citoplásmicos. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de cuatro o más dominios de señalización citoplásmicos. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de un ligando que se une a una o más moléculas de señalización. El dominio intracelular puede comprender al menos una parte de un ligando que se une a CD83.
III. Células efectoras con receptores de antígenos quiméricos (CAR-EC)
Los métodos, plataformas y kits dados a conocer en el presente documento pueden comprender una o más células efectoras con receptores de antígenos quiméricos (CAR-EC) o usos de las mismas. Las células efectoras con receptores de antígenos quiméricos dadas a conocer en el presente documento expresan un receptor de antígeno quimérico. El receptor de antígeno quimérico (CAR) puede ser cualquier CAR dado a conocer en el presente documento. En los casos en que los métodos, plataformas o kits comprenden dos o más células efectoras, las dos o más células efectoras pueden ser del mismo tipo de célula. Las dos o más células efectoras pueden ser de un tipo de célula diferente. Las dos o más células efectoras pueden ser del mismo linaje celular. Las dos o más células efectoras pueden ser de linajes celulares diferentes. Las dos o más células efectoras pueden comprender dos o más CAR idénticos. Las dos o más células efectoras pueden comprender dos o más c A r diferentes. Las dos o más células efectoras pueden comprender dos o más CAR similares.
La célula efectora puede ser una célula T. La célula efectora puede ser una célula de un linaje de célula T. La célula efectora puede ser una célula T madura. La célula efectora puede ser una célula T precursora. La célula efectora puede ser una célula T citotóxica. La célula efectora puede ser una célula T indiferenciada. La célula efectora puede ser una célula T de célula madre de memoria (Tmsc). La célula efectora puede ser una célula T de memoria central (Tcm). La célula efectora puede ser una célula T efectora (TE). La célula efectora puede ser una célula T CD4+. La célula T puede ser una célula T CD8+. La célula efectora puede ser una célula CD4+ y CD8+. La célula efectora puede ser una célula T alfa-beta. La célula efectora puede ser una célula T gamma-beta. La célula efectora puede ser una célula T citolítica natural. La célula efectora puede ser una célula T auxiliar.
Aunque las realizaciones preferidas de la presente divulgación describen métodos, kits y plataformas que comprenden células T, un experto en la técnica también puede entender que pueden usarse otros tipos de células en lugar de una célula T. La célula efectora puede ser una célula efectora que tiene un efecto sobre una diana o célula diana cuando se pone en proximidad a la diana o célula diana. La célula efectora puede ser una célula que tiene un efecto citotóxico sobre una diana o célula diana cuando se pone en proximidad de la diana o célula diana. La célula efectora puede ser una célula inmunitaria. La célula efectora puede seleccionarse de una célula B, un monocito, un trombocito, un leucocito, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo o un linfocito. La célula efectora puede ser un linfocito. La célula efectora puede ser un macrófago. La célula efectora puede ser una célula fagocítica. La célula efectora puede ser una célula B efectora. La célula efectora puede ser una célula citolítica natural. La célula efectora puede aislarse o derivarse de un sujeto que padece una enfermedad o estado. La célula efectora puede ser una célula derivada de un sujeto que va a tratarse con un interruptor de CAR-EC o plataforma de CAR-EC dado a conocer en el presente documento.
La célula T puede expresar un receptor de antígeno quimérico codificado por uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. El polinucleótido puede ser al menos aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. El polinucleótido puede ser al menos aproximadamente un 70% idéntico a uno o más polinucleótidos basados en o derivados de s Eq ID NO: 1. El polipéptido codificado por uno o más polinucleótidos puede basarse en o derivarse de SEQ ID NO: 1. El polipéptido puede codificarse por un polinucleótido que es al menos aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. El polinucleótido puede expresarse constitutivamente. El polinucleótido puede expresarse condicionalmente.
En el presente documento se dan a conocer métodos para producir una célula efectora con receptor de antígeno quimérico (CAR-EC), comprendiendo los métodos introducir uno o más polinucleótidos que codifican para un receptor de antígeno quimérico o un complejo de receptor de antígeno quimérico en una célula efectora. La célula efectora puede ser una célula T. Introducir uno o más polinucleótidos que codifican para un receptor de antígeno quimérico o complejo de receptor de antígeno quimérico en una célula efectora puede comprender transfectar la célula efectora con los uno o más polinucleótidos. Introducir uno o más polinucleótidos que codifican para un receptor de antígeno quimérico o un complejo de receptor de antígeno quimérico en una célula efectora puede comprender infectar viralmente la célula efectora con uno o más virus que comprenden los uno o más polinucleótidos que codifican para un receptor de antígeno quimérico dado a conocer en el presente documento. El virus puede ser un lentivirus. El virus puede ser un adenovirus. El virus puede ser un retrovirus. El virus puede ser un virus adenoasociado. El virus puede ser un virus adenoasociado autocomplementario (VAAac). El virus puede ser un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) modificado. El virus puede ser un virus del virus del herpes simple (VHS) modificado. Otros métodos para producir el CAR-EC pueden comprender un método de transferencia de uno o más polinucleótidos que codifican para un receptor de antígeno quimérico en una célula, en los que los métodos comprenden añadir a la célula un transposón, una nucleasa de dedos de zinc, una TALEN o una CRISPR. El transposón puede ser un transposón bella durmiente. El uno o más polinucleótidos pueden basarse en o derivarse de SEQ ID NO: 1.
IV. Plataforma de CAR-EC
En el presente documento se dan a conocer plataformas de célula efectora con receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) que comprenden una célula efectora, en las que la célula efectora comprende un polinucleótido que codifica para un receptor de antígeno quimérico (CAR); y un interruptor de célula efectora con receptor de antígeno quimérico (CAR-EC), en el que el interruptor de CAR-EC comprende un antígeno peptídico de unión a CAR y un polipéptido de direccionamiento y en el que el interruptor de CAR-EC se une a una molécula de superficie celular en una célula diana. El interruptor de CAR-EC puede seleccionarse de cualquier interruptor de CAR-Ec dado a conocer en el presente documento.
Las plataformas de CAR-EC pueden comprender dos o más interruptores de CAR-EC. Las plataformas de CAR-EC pueden comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más interruptores de CAR-EC. Las plataformas de CAR-CE pueden comprender más de 20, más de 25, más de 30, más de 35, más de 40, más de 45 o más de 50 interruptores de CAR-EC. Los dos o más interruptores pueden seleccionarse de uno o más interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento o una combinación de los mismos.
Las plataformas de CAR-EC dadas a conocer en el presente documento pueden comprender además un primer interruptor de CAR-EC y un segundo interruptor de CAR-EC, en el que el primer interruptor de CAR-EC comprende un primer CAR-BP y un primer polipéptido de direccionamiento y el segundo interruptor de CAR-EC comprende un segundo CAR-BP y un segundo polipéptido de direccionamiento. El primer CAR-BP y el segundo CAR-BP pueden ser los mismos. El primer CAR-BP y el segundo CAR-BP pueden ser diferentes. El primer CAR-BP y el segundo CAR-BP pueden ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homólogos. El primer polipéptido de direccionamiento y el segundo polipéptido de direccionamiento pueden ser los mismos. El primer polipéptido de direccionamiento y el segundo polipéptido de direccionamiento pueden ser diferentes. El primer polipéptido de direccionamiento y el segundo polipéptido de direccionamiento pueden ser aproximadamente un 99%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5% o aproximadamente un 2% homólogos.
V. Kits, vectores y polinucleótidos
En el presente documento se dan a conocer kits que comprenden uno o más interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. El kit puede comprender además dos o más interruptores de CAR-EC. El kit puede comprender tres interruptores de CAR-EC. El kit puede comprender aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 interruptores de CAR-EC. El kit puede emplearse para investigación biológica. El kit puede usarse para diagnosticar una enfermedad o un estado. El kit puede usarse para el tratamiento de una enfermedad o estado. Los interruptores de CAR-EC del kit pueden usarse con células CAR-EC dadas a conocer en el presente documento o células T con CAR existentes usadas o sometidas a prueba clínicamente. El kit puede comprender además una o más células efectoras. El kit puede comprender además una o más células CAR-EC. La célula CAR-EC puede ser una célula T. La célula T puede expresar uno o más CAR. El kit puede comprender además un polinucleótido que codifica para uno o más CAR. El kit puede comprender además un vector que comprende un polinucleótido que codifica para uno o más CAR. El CAR puede seleccionarse de cualquiera de los CAR dados a conocer en el presente documento. El kit puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican para un interruptor de CAR-EC dado a conocer en el presente documento o una parte del mismo (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido).
En el presente documento se dan a conocer además vectores y polinucleótidos que codifican para interruptores de CAR-Ec o partes de los mismos, en los que el interruptor de CAR-EC comprende un antígeno peptídico de unión a receptor de antígeno quimérico y un polipéptido de direccionamiento, en el que el péptido de direccionamiento se une a una molécula de superficie celular sobre una célula diana. Los polinucleótidos pueden ser ADN. Los polinucleótidos pueden ser ARN. A menos que se especifique otra cosa, los términos “polinucleótido” y “vector”, tal como se usan en el presente documento, se usan indistintamente. El polipéptido de direccionamiento puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El vector puede comprender una secuencia que codifica para una cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los vectores pueden comprender una secuencia que codifica para una cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los vectores pueden comprender la secuencia que codifica para la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo y la secuencia que codifica para la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La cadena ligera y la cadena pesada pueden expresarse a partir del mismo vector. La cadena ligera y la cadena pesada pueden expresarse a partir de dos vectores independientes.
En el presente documento se dan a conocer vectores y polinucleótidos que codifican para receptores de antígenos quiméricos, en los que los receptores de antígenos quiméricos comprenden un dominio extracelular que se une a un péptido de un interruptor de célula efectora con receptor de antígeno quimérico. El dominio extracelular puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse a un antígeno peptídico de un interruptor de célula efectora con receptor de antígeno quimérico. El antígeno peptídico puede ser un péptido de levadura. El péptido de levadura puede ser GCN4. Fab o partes del mismo pueden estar codificados por uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. Los CAR o partes de los mismos pueden estar codificados por un polinucleótido al menos aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. Los CAR o partes de los mismos codificados por un polinucleótido pueden ser al menos aproximadamente un 70% idénticos a uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1. En el presente documento se dan a conocer vectores que comprenden uno o más polinucleótidos basados en o derivados de SEQ ID NO: 1.
Los vectores que comprenden secuencias que codifican para receptores de antígenos quiméricos y/o interruptores de célula efectora con receptor de antígeno quimérico y partes de los mismos, dados a conocer en el presente documento, pueden seleccionarse de cualquier vector de expresión disponible comercialmente. El vector de expresión puede ser un vector de expresión procariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión eucariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión de mamíferos. El vector de expresión puede ser un vector de expresión viral. El vector de expresión puede tener un promotor constitutivo para la expresión constitutiva de las secuencias que codifican para de interruptor de CAR-EC y/o CAR. El vector de expresión puede tener un promotor inducible para la expresión condicional de las secuencias que codifican para interruptor de CAR-EC y/o CAR.
VI. Uso terapéutico
En el presente documento se dan a conocer métodos, plataformas y kits para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un interruptor de célula efectora con receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el interruptor de CAR-EC comprende: un antígeno peptídico de unión a CAR; y un resto de direccionamiento. En el presente documento se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar uno cualquiera de los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento.
Los métodos pueden comprender administrar una célula CAR-EC y uno o más interruptores de CAR-EC. Los métodos pueden comprender administrar aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más interrupciones de CAR-EC. Los métodos pueden comprender administrar dos o más interruptores de CAR-EC. Los dos o más interruptores de CAR-EC pueden comprender el mismo antígeno peptídico de unión a CAR. Los dos más interruptores de CAR-EC pueden comprender el mismo polipéptido de direccionamiento celular. Los dos o más interruptores de CAR-EC pueden comprender uno o más antígenos peptídicos de unión a CAR diferentes. Los dos más interruptores de CAR-EC pueden comprender uno o más polipéptidos de direccionamiento celular diferentes. Los métodos pueden comprender una pluralidad de células CAR-EC y uno o más interruptores de CAR-EC.
En el presente documento se dan a conocer métodos de tratamiento de una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un interruptor de célula efectora-receptor de antígeno quimérico (CAR-EC) al sujeto, en el que el interruptor de CAR-EC comprende: un antígeno peptídico de unión a receptor de antígeno quimérico (CAR-BP); y un resto de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana. El CAR-BP, mediante un ejemplo no limitante, puede seleccionarse de una etiqueta FLAG®, un factor de transcripción de levadura GCN4 y un péptido diana hidrofílico (HTP). El resto de direccionamiento, mediante un ejemplo no limitante, puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-CS1, un anticuerpo anti-BCMA, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CLL-1 y un anticuerpo anti-CD33.
Los métodos pueden comprender la administración de una o más células efectoras con receptores de antígenos quiméricos. Los métodos pueden comprender la administración de una o más células T. Las una o más células efectoras se pueden seleccionarse de una célula T que se selecciona de una célula T indiferenciada, una célula T de célula madre de memoria, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora, una célula T auxiliar, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T CD8/CD4+, una célula T ap, una célula T y8, una célula T citotóxica, una célula T citolítica natural, una célula citolítica natural, un macrófago.
El interruptor de CAR-EC puede tener un efecto terapéutico que es al menos parcialmente dependiente de poner una célula efectora en proximidad de una célula diana. El efecto terapéutico sobre la indicación prevista del interruptor de CAR-EC puede ser al menos parcialmente debido a que el interruptor de CAR-EC recluta una célula efectora para la célula diana. El efecto terapéutico sobre la indicación prevista del interruptor de CAR-EC puede deberse predominantemente al reclutamiento por el interruptor de CAR-EC de una célula efectora para la célula diana. El efecto terapéutico del interruptor de CAR-Ec puede ser al menos parcialmente dependiente de la estimulación de una respuesta inmunitaria en la célula CAR-EC.
La administración del interruptor de CAR-EC puede no tener ningún efecto terapéutico sin que además se administre una célula efectora. El interruptor de CAR-EC puede no tener un efecto terapéutico significativo, deseable y/o previsto sin que además se administre una célula efectora. El interruptor de CAR-EC puede no tener ningún efecto terapéutico hacia una indicación prevista de la plataforma de CAR-EC sin que además se administre una célula efectora. Una parte o componente del interruptor de CAR-EC (por ejemplo, CAR-BP o resto de direccionamiento) puede no tener un efecto terapéutico hacia la indicación prevista del interruptor de CAR-EC sin que se conjugue con una segunda parte o componente del interruptor de CAR-EC (por ejemplo, CAR-BP o resto de direccionamiento). La dosis de una parte o componente del interruptor de CAR-EC (por ejemplo CAR-BP o resto de direccionamiento) cuando se administra como parte de la plataforma de CAR-EC para proporcionar un efecto terapéutico puede no tener un efecto terapéutico cuando se administra la parte o componente del interruptor de CAR-EC solo a esa dosis. Puede que no esté previsto que la parte o componente del interruptor de CAR-EC tenga ningún efecto terapéutico además de reclutar la célula T para la célula diana. La administración de la parte o componente del interruptor de CAR-EC solo puede tener un efecto terapéutico sobre la célula diana, en la que el efecto terapéutico es insignificante en relación con el efecto terapéutico de administrar el interruptor de CAR-EC y la célula CAR-EC. La administración de la parte o componente del interruptor de CAR-EC puede tener un efecto terapéutico sobre la célula diana, en la que el efecto terapéutico es menor que el efecto terapéutico de administrar el interruptor de CAR-EC y la célula CAR-Ec .
En el presente documento se dan a conocer usos de interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita. En el presente documento se dan a conocer además usos de interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.
En el presente documento se da a conocer el uso de un interruptor que comprende un antígeno peptídico que se une a un CAR (CAR-BP) en una célula efectora; y un polipéptido de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana para tratar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita. En el presente documento se da a conocer además el uso de un interruptor que comprende un antígeno peptídico (CAR-BP) que se une a un CAR en una célula efectora, en el que el CAR-BP; y un polipéptido de direccionamiento que se une a un antígeno en una diana en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.
En el presente documento se da a conocer el uso de un interruptor de CAR-EC que comprende un CAR-BP, en el que el CAR-BP comprende un péptido diana hidrofílico (HTP) o derivado del mismo y un polipéptido de direccionamiento, en el que el polipéptido de direccionamiento comprende un anticuerpo CD19 o fragmento del mismo; y una célula efectora que comprende un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo anti-HTP, en el que el anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo se une a CD19 en una célula B para tratar un mieloma múltiple.
En el presente documento se da a conocer el uso de un interruptor de CAR-EC que comprende un CAR-BP, en el que el CAR-BP comprende un factor de transcripción de levadura GCN4 o derivado del mismo y un polipéptido de direccionamiento, en el que el polipéptido de direccionamiento comprende un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo; y una célula efectora que comprende un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo anti-GCN4, en el que el anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo se une a CD19 en un linfoblasto, linfocito o célula B, para tratar una leucemia linfoblástica aguda, una leucemia linfocítica crónica o un linfoma de células B.
La enfermedad o estado puede ser un trastorno proliferativo celular. El trastorno proliferativo celular puede seleccionarse de un tumor sólido, un linfoma, una leucemia y un liposarcoma. El trastorno proliferativo celular puede ser agudo, crónico, recurrente, resistente, acelerado, en remisión, en estadio I, en estadio II, en estadio III, en estadio IV, juvenil o adulto. El trastorno proliferativo celular puede seleccionarse de leucemia mielógena, leucemia linfoblástica, leucemia mieloide, leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica, leucemia neutrofílica, síndrome mielodisplásico, linfoma de células B, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes, linfoma de células mixtas, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Hodgkin, linfoma linfocítico pequeño recurrente, tricotricoleucemia, mieloma múltiple, leucemia basofílica, leucemia eosinofílica, leucemia megacarioblástica, leucemia monoblástica, leucemia monocítica, eritroleucemia, leucemia eritroide y carcinoma hepatocelular. El trastorno proliferativo celular puede comprender una neoplasia hematológica. La neoplasia hematológica puede comprender una neoplasia de células B. El trastorno proliferativo celular puede comprender una leucemia linfocítica crónica. El trastorno proliferativo celular puede comprender una leucemia linfoblástica aguda. El trastorno proliferativo celular puede comprender un linfoma de Burkitt positivo para CD19.
La enfermedad o estado puede ser un cáncer, una infección patógena, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o trastorno genético.
En algunos casos, la una o más enfermedades comprenden un cáncer. El cáncer puede comprender un cáncer recurrente y/o resistente. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas, linfomas o leucemias.
El cáncer puede comprender un cáncer neuroendocrino. El cáncer puede comprender un cáncer de páncreas. El cáncer puede comprender un cáncer de páncreas exocrino. El cáncer puede comprender un cáncer de tiroides. El cáncer de tiroides puede comprender un cáncer medular de tiroides. El cáncer puede comprender un cáncer de próstata.
El cáncer puede comprender un cáncer epitelial. El cáncer puede comprender un cáncer de mama. El cáncer puede comprender un cáncer de endometrio. El cáncer puede comprender un cáncer de ovario. El cáncer de ovario puede comprender un cáncer de ovario del estroma. El cáncer puede comprender un cáncer de cuello uterino.
El cáncer puede comprender un cáncer de piel. El cáncer de piel puede comprender un cáncer de piel neo-angiogénico. El cáncer de piel puede comprender un melanoma.
El cáncer puede comprender un cáncer de riñón.
El cáncer puede comprender un cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede comprender un cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer de pulmón puede comprender un cáncer de pulmón de células no pequeñas.
El cáncer puede comprender un cáncer colorrectal. El cáncer puede comprender un cáncer gástrico. El cáncer puede comprender un cáncer de colon.
El cáncer puede comprender un cáncer cerebral. El cáncer cerebral puede comprender un tumor cerebral. El cáncer puede comprender un glioblastoma. El cáncer puede comprender un astrocitoma.
El cáncer puede comprender un cáncer hematológico. El cáncer hematológico puede comprender una leucemia. La leucemia puede comprender una leucemia mieloide. El cáncer puede comprender un linfoma. El linfoma puede comprender un linfoma no Hodgkin.
El cáncer puede comprender un sarcoma. El sarcoma puede comprender un sarcoma de Ewing.
Los sarcomas son cánceres de hueso, cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos u otro tejido conjuntivo o de soporte. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, cáncer de hueso, fibrosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, schwannoma vestibular bilateral, osteosarcoma, sarcomas de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma de parte blanda alveolar, angiosarcoma, filoides de cistosarcoma, dermatofibrosarcoma, tumor desmoide, sarcoma epitelioide, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, linfosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma y sarcoma sinovial).
Los carcinomas son cánceres que comienzan en las células epiteliales, que son células que cubren la superficie del cuerpo, producen hormonas y constituyen glándulas. A modo de ejemplo no limitante, los carcinomas incluyen cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, cáncer de vagina, cáncer vulvar, cáncer de útero, cáncer oral, cáncer de pene, cáncer testicular, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del estroma gastrointestinal, adenocarcinoma, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de la región anal, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, cáncer de la uretra, cáncer de la pelvis renal, cáncer del uréter, cáncer de endometrio, cáncer del cuello uterino, cáncer de la glándula hipofisaria, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, glioma troncoencefálico y tumores del eje espinal. En algunos casos, el cáncer es un cáncer de piel, tal como un carcinoma de células basales, escamoso, melanoma, no melanoma o queratosis actínica (solar).
En algunos casos, el cáncer es un cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede comenzar en las vías respiratorias que se ramifican fuera de la tráquea para suministrar a los pulmones (bronquios) o los pequeños sacos aéreos del pulmón (los alvéolos). Los cánceres de pulmón incluyen carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de pulmón de células pequeñas y mesoteliomia. Ejemplos de NSCLC incluyen carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. El mesotelioma puede ser un tumor canceroso del revestimiento del pulmón y la cavidad torácica (pleura) o revestimiento del abdomen (peritoneo). El mesotelioma puede deberse a la exposición al amianto. El cáncer puede ser un cáncer cerebral, como un glioblastoma.
Alternativamente, el cáncer puede ser un tumor del sistema nervioso central (SNC). Los tumores del SNC pueden clasificarse como gliomas o no gliomas. El glioma puede ser glioma maligno, glioma de alto grado, glioma pontino intrínseco difuso. Los ejemplos de gliomas incluyen astrocitomas, oligodendrogliomas (o mezclas de elementos de oligodendroglioma y astrocitoma) y ependimomas. Los astrocitomas incluyen, pero no se limitan a, astrocitomas de bajo grado, astrocitomas anaplásicos, glioblastoma multiforme, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitoma pleomórfico y astrocitoma de células gigantes subependimales. Los oligodendrogliomas incluyen oligodendrogliomas de bajo grado (u oligoastrocitomas) y oligodendriogliomas anaplásicos. Lo no gliomas incluyen meningiomas, adenomas hipofisarios, linfomas primarios del SNC y meduloblastomas. En algunos casos, el cáncer es un meningioma.
La leucemia puede ser una leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica o leucemia mielocítica crónica. Los tipos adicionales de leucemias incluyen tricoleucemia, leucemia mielomonocítica crónica y leucemia mielomonocítica juvenil.
Los linfomas son cánceres de los linfocitos y pueden desarrollarse a partir de o bien linfocitos B o bien T. Los dos tipos principales de linfoma son el linfoma de Hodgkin, anteriormente conocido como enfermedad de Hodgkin, y linfoma no Hodgkin. El linfoma de Hodgkin está marcado por la presencia de la célula de Reed-Sternberg. Los linfomas no Hodgkin son todos los linfomas que no son linfoma de Hodgkin. Los linfomas no Hodgkin pueden ser linfomas indolentes y linfomas agresivos. Linfomas no Hodgkin incluyen, pero no se limitan a, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa (MALT), linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico de células B grandes, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de células B de zona marginal (NMZL), linfoma de zona marginal esplénica (SMZL), linfoma extranodal de células B de zona marginal, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de derrame primario y granulomatosis linfomatoide.
El cáncer puede comprender un tumor sólido. El cáncer puede comprender un sarcoma. El cáncer puede seleccionarse de un grupo que consiste en un cáncer de vejiga, un cáncer de mama, un cáncer de colon, un cáncer de recto, un cáncer de endometrio, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un melanoma, un mieloma, un cáncer de tiroides, un cáncer de páncreas, un glioma, un glioma maligno del cerebro, un glioblastoma, un cáncer de ovario y un cáncer de próstata. El cáncer puede tener expresión de antígeno no uniforme. El cáncer puede tener expresión de antígeno modulada. El antígeno puede ser un antígeno de superficie. El cáncer puede no comprender un mieloma. El cáncer puede no comprender un melanoma. El cáncer puede no comprender un cáncer de colon. El cáncer puede ser leucemia linfoblástica aguda (LLA). El cáncer puede ser recidiva de LLA El cáncer puede ser LLA resistente. El cáncer puede ser recidiva de LLA resistente. El cáncer puede ser leucemia linfocítica crónica (CLL). El cáncer puede ser recidiva de CLL. El cáncer puede ser CLL resistente. El cáncer puede ser recidiva de CLL resistente.
El cáncer puede comprender un cáncer de mama. El cáncer de mama puede ser cáncer de mama triple positivo (positivo para receptor de estrógeno, receptor de progesterona y Her2). El cáncer de mama puede ser cáncer de mama triple negativo (negativo para receptor de estrógeno, receptor de progesterona y Her2). El cáncer de mama puede ser positivo para receptor de estrógeno. El cáncer de mama puede ser negativo para receptor de estrógeno. El cáncer de mama puede ser positivo para receptor de progesterona. El cáncer de mama puede ser negativo para receptor de progesterona. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama negativo para Her2. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama Her2 de baja expresión. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama positivo para Her2. Las líneas celulares que expresan Her2 se han caracterizado bien por la densidad de antígeno, que refleja la caracterización inmunohistoquímica clínica que clasifica las neoplasias como 0 (<20.000 antígenos Her2 por célula), 1+ (100.000 antígenos Her2 por célula), 2+ (500.000 antígenos Her2 por célula) y 3+ (>2.000.000 antígenos Her2 por célula). La presente invención proporciona el interruptor de CAR-EC de la invención para su uso en métodos de tratamiento de cánceres de mama de estas clasificaciones. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her20. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her2 1+. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her2 2+. El cáncer de mama puede comprender un cáncer de mama clasificado como Her23+.
La enfermedad o estado puede ser una infección patogénica. Las infecciones patogénicas pueden estar provocadas por uno o más patógenos. En algunos casos, el patógeno es una bacteria, hongos, virus o protozoo.
Los patógenos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio o Yersinia. En algunos casos, la enfermedad o estado provocado por el patógeno es tuberculosis y la muestra heterogénea comprende moléculas extrañas derivadas de la bacteria Mycobacterium tuberculosis y moléculas derivadas del sujeto. En algunos casos, la enfermedad o estado está provocado por una bacteria y es tuberculosis, neumonía, que pueden estar provocadas por bacterias tales como Streptococcus y Pseudomonas, una enfermedad transmitida por los alimentos, que puede estar provocada por bacterias como “Shigella, Campylobacter y Salmonella, y una infección tal como tétanos, fiebre tifoidea, difteria, sífilis y lepra. La enfermedad o estado puede ser vaginosis bacteriana, una enfermedad de la vagina provocada por un desequilibrio de la flora bacteriana natural. Alternativamente, la enfermedad o estado es una meningitis bacteriana, una inflamación bacteriana de las meninges (por ejemplo, las membranas protectoras que cubren el cerebro y la médula espinal). Otras enfermedades o estados provocados por bacterias incluyen, pero no se limitan a, neumonía bacteriana, una infección del tracto urinario, gastroenteritis bacteriana e infección bacteriana de la piel. Los ejemplos de infecciones bacterianas de la piel incluyen, pero no se limitan a, impétigo que pueden estar provocado por Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes; erisipela que puede estar provocada por una infección bacteriana por estreptococos de la epidermis profunda con diseminación linfática; y celulitis que puede estar provocada por la flora normal de la piel o por bacterias exógenas.
El patógeno puede ser un hongo, tal como Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis y Stachybotrys. Los ejemplos de enfermedades o estados provocados por un hongo incluyen, pero no se limitan a, tiña inguinal, infección por levadura, dermatofitosis y pie de atleta.
El patógeno puede ser un virus. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a, adenovirus, virus de Coxsackie, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, B y C), virus del herpes simple (tipo 1 y 2), citomegalovirus, virus del herpes, VIH, virus influenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma, virus de parainfluenza, poliovirus, virus sincitial respiratorio, virus de la rubéola y virus de la varicela-zoster. Los ejemplos de enfermedades o estados provocados por virus incluyen, pero no se limitan a, resfriado, gripe, hepatitis, sida, varicela, rubéola, paperas, sarampión, verrugas y poliomielitis.
El patógeno puede ser un protozoo, tal como Acanthamoeba (por ejemplo, A. astronyxis, A. castellanii, A. culbertsoni, A. hatchetti, A. polyphaga, A. rhysodes, A. healyi, A. divionensis), Brachiola (por ejemplo, B connori, B. vesicularum), Cryptosporidium (por ejemplo, C. parvum), Cyclospora (por ejemplo, C. cayetanensis), Encephalitozoon (por ejemplo, E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis), Entamoeba (por ejemplo, E. histolytica), Enterocytozoon (por ejemplo, E. bieneusi), Giardia (por ejemplo, G. lamblia), Isospora (por ejemplo, I. belli), Microsporidium (por ejemplo, M. africanum, M. ceylonensis), Naegleria (por ejemplo, N. fowleri), Nosema (por ejemplo, N. algerae, N. ocularum), Pleistophora, Trachipleistophora (por ejemplo, T. anthropophthera, T. hominis) y Vittaforma (por ejemplo, V. corneae).
La enfermedad o estado puede ser una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad relacionada con la autoinmunidad. Un trastorno autoinmunitario puede ser un mal funcionamiento del sistema inmunitario del cuerpo que provoca que el cuerpo ataque a sus propios tejidos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades relacionadas con la autoinmunidad incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico (APS), anemia aplásica autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, celiaquía, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, fascitis eosinofílica, eritema nodular, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, artritis juvenil, diabetes, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, lupus (LES), enfermedad mixta del tejido conjuntivo (MCTD), esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, poliarteritis nodular, síndromes poliglandulares autoinmunitarios tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, recaída de policondritis, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad de esperma y testicular, síndrome de persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
La enfermedad o estado puede ser una enfermedad inflamatoria. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, alveolitis, amiloidosis, angitis, espondilitis anquilosante, necrosis avascular, enfermedad de Basedow, parálisis de Bell, bursitis, síndrome del túnel carpiano, enfermedad celíaca, colangitis, condromalacia rotuliana, hepatitis activa crónica, síndrome de fatiga crónica, síndrome de Cogan, displasia congénita de cadera, costocondritis, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, tendinitis de Quervain, artritis asociada a la diabetes, hiperostosis esquelética idiopática difusa, lupus discoide, síndrome de Ehlers-Danlos, fiebre mediterránea familiar, fascitis, fibrosis/fibromialgia, hombro congelado, quistes ganglionarios, arteritis de células gigantes, gota, enfermedad de Graves, síndromes de enfermedad reumática asociados al VIH, artritis asociada hiperparatiroidea, artritis infecciosa, síndrome intestinal inflamatorio/síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Lyme, síndrome de Marfan, enfermedad de Mikulicz, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, síndrome de dolor miofascial, osteoartritis, osteomalacia, osteoporosis y osteoporosis inducida por corticosteroides, enfermedad de Paget, reumatismo palindrómico, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Plummer, polimialgia reumática, polimiositis, pseudogota, artritis psoriásica, fenómeno/síndrome de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, ciática (radiculopatía lumbar), esclerodermia, escorbuto, artritis de células falciformes, síndrome de Sjogren, estenosis espinal, espondilolistesis, enfermedad de Still, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Takayasu (arteritis de Takayasu), tendinitis, codo de tenista/golfista, artritis asociada a la tiroides, dedo en gatillo, colitis ulcerosa, granulomatosis de Wegener y enfermedad de Whipple.
Métodos de tratamiento dados a conocer en el presente documento pueden comprender actividad inespecífica tal como se mide por los niveles de citocinas. El método puede reducir la actividad inespecífica, tal como se mide por los niveles de citocinas, en comparación con otras terapias de CAR-EC. El método puede reducir la actividad inespecífica tal como se mide por niveles de interferón gamma. Otras actividades inespecíficas que pueden reducirse incluyen linfofenia tóxica, citólisis mortal de dianas tumorales sólidas e hipogammaglobulinemia crónica para dianas hematológicas. Pueden usarse métodos de tratamiento y composiciones dados a conocer en el presente documento para tratar un cáncer que comprende aplasia de células B mediada por CD19. Los métodos y composiciones pueden minimizar la aplasia de células B mediada por CD19. El método puede evitar la aplasia de células B a largo plazo.
Las plataformas, métodos y composiciones de CAR-EC dados a conocer en el presente documento pueden usare para tratar un tumor heterogéneo o una neoplasia de células sanguíneas heterogénea en un sujeto que lo necesita. El marcador de “células pan-B” CD20 es el antígeno seleccionado como diana lo más prevalentemente para las neoplasias de células B y el anticuerpo rituximab aprobado por la FDA es un componente vital en el tratamiento de muchas leucemias y linfomas. Sin embargo, se producen mecanismos de resistencia relacionados con la modulación de la expresión del antígeno CD20 en un número significativo de pacientes. Está claro que el direccionamiento con antígeno o bien CD19 o bien CD20 solo es insuficiente para una terapia curativa. Los métodos dados a conocer en el presente documento proporcionan la construcción y administración de dos o más interruptores con diferentes especificidades (por ejemplo, un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD19 y un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD20). Los métodos dados a conocer en el presente documento proporcionan la construcción y administración de dos o más interruptores con diferentes especificidades (por ejemplo, un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD19 y un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD22). Esta metodología puede ofrecer una ventaja significativa frente a la propensión a la recidiva en la práctica clínica, al tiempo que se evita la pérdida persistente de células B. Un tumor heterogéneo o neoplasia de células sanguíneas heterogénea también puede tratarse con un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD19 y un interruptor de CAR-EC con anticuerpo anti-CD22. Uno o más interruptores de CAR-EC pueden administrarse secuencial o simultáneamente.
El interruptor de CAR-EC puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El uno o más agentes terapéuticos adicionales puede seleccionarse de un grupo que consiste en una inmunoterapia, una quimioterapia y un esteroide. El uno o más agentes terapéuticos adicionales puede ser un fármaco quimioterápico. El fármaco quimioterápico puede ser un agente alquilante, un antimetabolito, una antraciclina, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor mitótico, un corticosteroide o un agente de diferenciación. El fármaco quimioterápico puede seleccionarse de actinomicina-D, bleomicina, altretamina, bortezomib, busulfán, carboplatino, capecitabina, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, etopósido, estramustina, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitbina (Gemzar), hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán (Camptosar), ixabepilona, L-asparaginasa, lomustina, mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, paclitaxel (Taxol), pemetrexed, pentostatina, estreptozocina, temozolomida, tenipósido, tioguanina, tiotepa, topotecán (Hycamtin), vincristina, vinblastina, vinorelbina, retinoides, tretinoína (ATRA o Atralin®), bexaroteno (Targretin®) y trióxido de arsénico (Arsenox®). La quimioterapia puede administrarse como una píldora para tragar, como una inyección en el músculo o tejido graso, por vía intravenosa, tópica o directamente en una cavidad corporal.
El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprender un inhibidor de la angiogénesis. El inhibidor de la angiogénesis puede seleccionarse de bevacizumab, itraconazol, carboxiamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN alfa, IL-12, factor plaquetario 4, suramina, SU5416, trombobospondina, un antagonista de VEGFR, un esteroide angiostático con heparina, factor inhibitorio de la angiogenesis derivado de CAR-EC, inhibidores de metaloproteasa la matriz, angiostatina, endostatina, sorafenib, sunitinib, pazopanib, everolimús, 2-metoxiestradiol, tecogalán, tetratiomolibdato, talidomida, prolactina, inhibidor de avP3, linomida, tasquinimod, VEGFR-1 soluble, NRPO-1 soluble, angiopoyetina 2, vasostatina, calreticulina, TIMP, CDAI, Meth-1, Meth-2, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, CXCL10, IL-4, IL-12, IL-18, protrombina, fragmento de antitrombina III, prolactina, VEGI, SPARC, osteopontina, maspina, canstatina, proteína relacionada con proliferina y restina.
El uno o más agentes terapéuticos adicionales puede comprender una terapia hormonal. La terapia hormonal puede seleccionarse de un antiestrógeno (por ejemplo, fulvestrant (Faslodex®), tamoxifeno, toremifeno (Fareston®)); un inhibidor de aromatasa (por ejemplo, anastrozol (Arimidex®), exemestano (Aromasina®), letrozol (Femara®)); una progestina (por ejemplo, acetato de megestrol (Megace®)); un estrógeno; un antiandrógeno (por ejemplo, bicalutamida (Casodex®), flutamida (Eulexin®), nilutamida (Nilandron®)); una hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) o un agonista o análogo de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) (por ejemplo, leuprolida (Lupron®), goserelina (Zoladex®)).
El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprenden un esteroide. El esteroide puede ser un corticosteroide. El esteroide puede ser cortisol o un derivado del mismo. El esteroide puede seleccionarse de prednisona, metilprednisolona (Solumedrol®) o dexametasona.
El interruptor de CAR-EC puede administrarse con una o más terapias adicionales. La una o más terapias adicionales pueden comprender terapia láser. La una o más terapias adicionales pueden comprender radioterapia. La una o más terapias adicionales pueden comprender cirugía.
En el presente documento se dan a conocer plataformas, kits y métodos para tratar una enfermedad o estado en un sujeto. El sujeto puede ser un sujeto sano. El sujeto puede estar padeciendo una enfermedad o estado. El sujeto puede estar padeciendo más de una enfermedad o estado. El sujeto puede estar padeciendo leucemia linfocítica crónica. El sujeto puede estar padeciendo leucemia linfoblástica aguda. El sujeto puede ser un animal. El sujeto puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un humano, un chimpancé, un gorila, un mono, un bovino, un caballo, un asno, una mula, un perro, un gato, un cerdo, un conejo, una cabra, una oveja, una rata, un hámster, un conejillo de indias o un ratón. El sujeto puede ser un ave o un pollo. El sujeto puede ser un humano. El sujeto puede ser un niño. El niño puede estar padeciendo leucemia linfoblástica aguda. El sujeto puede tener menos de 6 meses de edad. El sujeto puede tener aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años, aproximadamente 11 años, aproximadamente 12 años, aproximadamente 13 años, aproximadamente 14 años, aproximadamente 15 años, aproximadamente 18 años, aproximadamente 20 años, aproximadamente 25 años, aproximadamente 30 años, aproximadamente 35 años, aproximadamente 40 años, aproximadamente 45 años, aproximadamente 50 años, aproximadamente 55 años, aproximadamente 60 años, aproximadamente 65 años, aproximadamente 70 años, aproximadamente 75 años, aproximadamente 80 años, aproximadamente 85 años, aproximadamente 90 años, aproximadamente 95 años, aproximadamente 100 años o aproximadamente 105 años.
VII. Método de aclaramiento de células efectoras
En el presente documento se dan a conocer además métodos de aclaramiento de células CAR-EC en un sujeto, que comprende administrar un interruptor de desactivación de CAR-EC. El interruptor de desactivación de CAR-EC puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se dirige a un marcador de superficie celular en la célula efectora. El interruptor de desactivación de CAR-EC puede comprender un péptido al que se une el CAR del CAR-EC. El interruptor de desactivación de CAR-EC puede comprender un CAR-BP al que se une el CAR del CAR-EC.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o péptido del interruptor de desactivación de CAR-EC puede conjugarse con un fármaco o una toxina. El fármaco o la toxina pueden seleccionarse de maitansina (por ejemplo, DM1, DM4), monometilauristatina E, monometilauristatina F, Ki-4.dgA, dolastatina 10, caliqueamicina, SN-38, duocarmicina, irinotecán, ricina, saporina, gelonina, proteína antiviral de Phytolacca americana, exotoxina A de Pseudomonas Aeruginosa o toxina de la difteria. La toxina puede comprender un veneno, una toxina bacteriana (por ejemplo, toxinas bacterianas que provocan tétanos, difteria), una toxina vegetal o una toxina animal. La toxina puede ser un veneno de serpiente. La toxina puede comprender vinblastina. La toxina puede comprender auristatina. La toxina puede estar contenida en una vesícula recubierta con membrana de liposoma. Cuando la toxina está contenida en una vesícula recubierta con membrana de liposoma, el anticuerpo se une a la vesícula.
El marcador de superficie celular puede ser una proteína viral o fragmento de la misma. Alternativa o adicionalmente, la célula efectora expresa una proteína viral o fragmento de la misma que no es un marcador de superficie celular. La célula efectora que expresa una proteína viral o fragmento de la misma puede dirigirse con un fármaco. Cuando la célula efectora comprende una proteína viral o fragmento de la misma, el fármaco puede seleccionarse de un grupo que comprende abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, boceprevirertet, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, un inhibidor de la entrada, famciclovir, un fármaco antirretroviral de combinación de dosis fija, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, un inhibidor de la fusión, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidor de la integrasa, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogo de nucleósido, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de la proteasa, raltegravir, un inhibidor de la transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, un fármaco retroviral de potenciador sinérgico, aceite de árbol de té, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zacitabina, zanamivir o zidovudina. El fármaco puede ser ganciclovir. El fármaco puede ser aciclovir.
VIII. Composiciones farmacéuticas
En el presente documento se da a conocer una composición farmacéutica que comprende uno o más de los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento. Las composiciones pueden comprender además una o más sales, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Sales, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en las presentes composiciones farmacéuticas incluyen portadores, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservantes, colorantes, aromatizantes y agentes diluyentes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes de aumento de volumen, tampones, vehículos de suministro, agentes de tonicidad, codisolventes, agentes humectantes, agentes complejantes, agentes de tamponamiento, antimicrobianos y tensioactivos.
Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son portadores apropiados a modo de ejemplo. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, plurónicos o polietilenglicol (PEG). También a modo de ejemplo, los agentes potenciadores de la tonicidad adecuados incluyen haluros de metales alcalinos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio), manitol, sorbitol y similares. Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y similares. El peróxido de hidrógeno también puede usarse como conservante. Codisolventes adecuados incluyen glicerina, propilenglicol y PEG. Agentes complejantes adecuados incluyen cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxi-propil-beta-ciclodextrina. Los tensioactivos o agentes humectantes adecuados incluyen ésteres de sorbitán, polisorbatos tal como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal y similares. Los tampones pueden ser tampones convencionales tales como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato o Tris-HCl. El tampón acetato puede tener un pH de aproximadamente 4-5,5, y el tampón Tris puede ser de aproximadamente pH 7-8,5. Agentes farmacéuticos adicionales se exponen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990.
La composición puede estar en forma líquida o en una forma liofilizada o secada por congelación y puede incluir uno o más lioprotectores, excipientes, tensioactivos, aditivos estructurales de alto peso molecular y/o agentes de aumento de volumen (véase, por ejemplo, la patentes estadounidenses n.os 6.685.940, 6.566.329 y 6.372.716). En una realización, se incluye un lioprotector, que es un azúcar no reductor tal como sacarosa, lactosa o trehalosa. La cantidad de lioprotector generalmente incluida es tal que, tras la reconstitución, la formulación resultante será isotónica, aunque también pueden ser adecuadas formulaciones hipertónicas o ligeramente hipotónicas. Además, la cantidad de lioprotector debe ser suficiente para evitar una cantidad inaceptable de degradación y/o agregación de la proteína tras la liofilización. Concentraciones de lioprotector a modo de ejemplo para azúcares (por ejemplo, sacarosa, lactosa, trehalosa) en la formulación preliofilizada son de desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 400 mM. En otra realización, se incluye un tensioactivo, tal como por ejemplo, tensioactivos no iónicos y tensioactivos iónicos tales como polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); fenil éteres de poli(etilenglicol) (por ejemplo, Triton); dodecilsulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; octilglucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil-o estearilsulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil-o estearil-sarcosina; linoleílo, miristil-o cetilbetaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil- de sodio o metilofeil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etileno y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.). Cantidades a modo de ejemplo de tensioactivo que pueden estar presentes en la formulación preliofilizada son de aproximadamente el 0,001-0,5%. Los aditivos estructurales de alto peso molecular (por ejemplo, cargas, aglutinantes) pueden incluir, por ejemplo, goma arábiga, albúmina, ácido algínico, fosfato de calcio (dibásico), celulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, dextrano, dextrina, dextratos, sacarosa, tilosa, almidón pregelatinizado, sulfato de calcio, amilosa, glicina, bentonita, maltosa, sorbitol, etilcelulosa, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de disodio, pirosulfito de disocio, poli(alcohol vinílico), gelatina, glucosa, goma guar, glucosa líquida, azúcar comprimible, silicato de aluminio y magnesio, maltodextrina, poli(óxido de etileno), polimetacrilatos, povidona, alginato de sodio, tragacanto, celulosa microcristalina, almidón y ceína. Concentraciones a modo de ejemplo de aditivos estructurales de alto peso molecular son de desde el 0,1% hasta el 10% en peso. En otras realizaciones, puede incluirse un agente de aumento de volumen (por ejemplo, manitol, glicina).
Las composiciones pueden ser adecuadas para la administración parenteral. Composiciones a modo de ejemplo son adecuadas para inyección o perfusión en un animal por cualquier vía disponible para el trabajador cualificado, tales como vías intraarticular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional. Una formulación parenteral normalmente será una disolución acuosa isotónica estéril, libre de pirógenos, que contiene opcionalmente conservantes farmacéuticamente aceptables.
Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de líquidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Véase, generalmente, Remington's Pharmaceutical Science, 16a Ed., Mack Eds., 1980.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden formularse para el suministro controlado o sostenido de manera que proporciona una concentración local del producto (por ejemplo, bolo, efecto de depósito) y/o una mayor estabilidad o semivida en un entorno local particular. Las composiciones pueden comprender la formulación de interruptores de CAR-EC, polipéptidos, ácidos nucleicos o vectores dados a conocer en el presente documento con preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc., así como agentes tales como una matriz biodegradable, microesferas inyectables, partículas microcapsulares, microcápsulas, perlas de partículas bioerosionables, liposomas y dispositivos de suministro implantables que proporcionan la liberación controlada o sostenida del agente activo que luego puede suministrarse como una inyección de depósito. Se conocen técnicas para formular tales medios de suministro sostenido o controlado y se han desarrollado y usado una variedad de polímeros para la liberación y el suministro controlados de fármacos. Tales polímeros son normalmente biodegradables y biocompatibles. Los hidrogeles poliméricos, que incluyen los formados por la formación de complejos de segmentos de polipéptidos o polímeros enantioméricos, e hidrogeles con propiedades sensibles a la temperatura o al pH, pueden ser deseables para proporcionar el efecto de depósito de fármacos debido a las condiciones leves y acuosas implicadas en el atrapamiento de agentes proteicos bioactivos (por ejemplo, anticuerpos que comprenden un CDR3 ultralargo). Véase, por ejemplo, la descripción de micropartículas poliméricas porosas de liberación controlada para el suministro de composiciones farmacéuticas en el documento WO 93/15722. Materiales adecuados para este propósito incluyen polilactidas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 3.773.919), polímeros de poli-(ácidos a-hidroxicarboxílicos), tales como ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988A), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) , y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Otros polímeros biodegradables incluyen poli(lactonas), poli(acetales), poli(ortoésteres) y poli(ortocarbonatos). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688­ 92 (1985)). El propio portador, o sus productos de degradación, deben ser no tóxicos en el tejido diana y no deben agravar además el estado. Esto puede determinarse mediante examen rutinario en modelos animales del trastorno diana o, si no se dispone de tales modelos, en animales normales. La microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida se ha realizado exitosamente con hormona del crecimiento humana (rhGH), interferón (rhIFN-), interleucina-2 y MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, “Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,” en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: Nueva York, 1995), págs. 439-462; documentos WO 97/03692, w O 96/40072, WO 96/07399; y patente estadounidense n° 5.654.010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas se desarrollaron usando polímero de poli-ácido láctico-co-glicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, los ácidos láctico y glicólico, pueden aclararse rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede depender de su peso molecular y composición. Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer,” en: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), págs. 1-41. Los ejemplos adicionales de composiciones de liberación sostenida incluyen, por ejemplo, el documento EP 58.481A, la patente estadounidense n° 3.887.699, el documento EP 158.277A, la patente canadiense n° 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 [1982] , Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000], y Dai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005].
También se contemplan polímeros bioadhesivos para su uso en o con composiciones de la presente divulgación. Los bioadhesivos son materiales sintéticos y que se producen de manera natural capaces de adherirse a sustratos biológicos durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, carbopol y policarbófilo son ambos derivados sintéticos reticulados del poli(ácido acrílico). Los sistemas de suministro de bioadhesivos basados en sustancias que se producen de manera natural incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, también conocido como hialuronano. El ácido hialurónico es un mucopolisacárido que se produce de manera natural que consiste en residuos de D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. El ácido hialurónico se encuentra en la matriz de tejido extracelular de los vertebrados, incluyendo en los tejidos conjuntivos, así como en el líquido sinovial y en el humor vítreo y acuoso del ojo. Se han usado derivados esterificados del ácido hialurónico para producir microesferas para su uso en el suministro que son biocompatibles y biodegradables (véase, por ejemplo, Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12:727-730; documentos EP 517,565; WO 96/29998; Illum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141).
Pueden usarse tanto matrices poliméricas biodegradables como no biodegradables para suministrar composiciones de la presente divulgación, y tales matrices poliméricas pueden comprender polímeros naturales o sintéticos. Se prefieren matrices biodegradables. El período de tiempo durante el cual se produce la liberación se basa en la selección del polímero. Normalmente, la liberación durante un período que oscila entre unas pocas horas y de tres a doce meses es lo más deseable. Los polímeros sintéticos a modo de ejemplo que pueden usarse para formar el sistema de suministro biodegradable incluyen: polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), polivinil éteres, poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, polianhídridos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato-acetato de celulosa, ftalato -acetato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio de sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli (acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno y polivinilpirrolidona. Los polímeros naturales a modo de ejemplo incluyen alginato y otros polisacáridos, incluyendo dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas de manera rutinaria por los expertos en la técnica), albúmina y otras proteínas hidrofílicas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrofóbicas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan o bien por hidrólisis enzimática o bien por exposición a agua in vivo, por erosión superficial o en volumen. El polímero opcionalmente tiene la forma de un hidrogel (véanse, por ejemplo, los documento WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney, et al., Macromolecules, 1993, 26, 581-587) que puede absorber hasta aproximadamente un 90% de su peso en agua y además, opcionalmente se reticula con iones multivalentes u otros polímeros.
Los sistemas de suministro incluyen también sistemas no poliméricos que son lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-di-y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos fabricados por compresión que usan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que el producto está contenido en una forma dentro de una matriz tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.os 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152 y (b) sistemas de difusión en los que un producto permea a una velocidad controlada a partir de un polímero tal como se describe en las patentes estadounidenses. n.os 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Pueden prepararse liposomas que contienen el producto mediante métodos conocidos, tales como por ejemplo (documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; JP 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324).
Alternativa o adicionalmente, las composiciones pueden administrarse localmente mediante implantación en el área afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado un interruptor de CAR-EC dado a conocer en el presente documento. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de un interruptor de CAR-EC, ácido nucleico o vector dados a conocer en el presente documento puede realizarse directamente a través del dispositivo mediante bolo, o mediante administración continua, o mediante catéter usando infusión continua.
Una composición farmacéutica que comprende un interruptor de CAR-EC dado a conocer en el presente documento puede formularse para inhalación, tal como por ejemplo, como un polvo seco. Las disoluciones de inhalación también pueden formularse en un propelente licuado para el suministro de aerosoles. En otra formulación más, las disoluciones pueden nebulizarse. Una composición farmacéutica adicional para la administración pulmonar incluye las descritas, por ejemplo, en el documento WO 94/20069, que da a conocer el suministro pulmonar de proteínas modificadas químicamente. Para el suministro pulmonar, el tamaño de partícula debe ser adecuado para el suministro al pulmón distal. Por ejemplo, el tamaño de partícula puede ser de desde 1 |im hasta 5 |im; sin embargo, pueden usarse partículas más grandes, por ejemplo, si cada partícula es bastante porosa.
Determinadas formulaciones que contienen interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento pueden administrarse por vía oral. Las formulaciones administradas de esta manera pueden formularse con o sin los portadores usados habitualmente en la composición de forma de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de un agente de unión selectivo. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.
Otra preparación puede implicar una cantidad eficaz de un interruptor de CAR-EC dado a conocer en el presente documento en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Pueden determinarse formulaciones farmacéuticas preferidas y/o adecuadas en vista de la presente divulgación y del conocimiento general de la tecnología de formulación, dependiendo de la vía de administración prevista, el formato de suministro y la dosificación deseada. Independientemente de la forma de administración, una dosis eficaz puede calcularse según el peso corporal del paciente, el área de superficie corporal o el tamaño del órgano. El refinamiento adicional de los cálculos para determinar la dosificación adecuada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones descritas en el presente documento se realiza de manera rutinaria en la técnica y está dentro del ámbito de tareas realizadas habitualmente en la técnica. Las dosificaciones adecuadas pueden determinarse mediante el uso de datos adecuados de dosis-respuesta.
IX. Métodos de producción del interruptor de CAR-EC
En el presente documento se dan a conocer métodos para producir interruptores de CAR-EC que comprenden expresar uno o más polipéptidos a partir de uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que tienen una o más secuencias que codifican para un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora o una parte del mismo, en el que el interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora comprende un antígeno peptídico (CAR-BP) y un polipéptido de direccionamiento. El resto de direccionamiento puede comprender un polipéptido de direccionamiento. En general, los métodos comprenden fusionar o injertar un polinucleótido que codifica para el CAR-BP con un polinucleótido que codifica para el polipéptido de direccionamiento. La fusión o el injerto pueden llevarse a cabo mediante cualquier método de clonación convencional conocido por un experto en la técnica. La fusión o el injerto de los polinucleótidos que codifican para el CAR-BP y el polipéptido de direccionamiento puede comprender la digestión enzimática de los polinucleótidos, ligamiento de los polinucleótidos y/o amplificación de los polinucleótidos.
El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal del polipéptido de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal del polipéptido de direccionamiento. El antígeno peptídico puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo N terminal del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento. El antígeno peptídico puede fusionarse con un extremo C terminal del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fusionado” puede referirse a unir un extremo terminal del CAR-BP con un extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-BP puede fusionarse con el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento sin reemplazar o retirar ningún aminoácido del polipéptido de direccionamiento. La fusión del CAR-BP con el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento puede comprender retirar o reemplazar aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. La retirada o el reemplazo de aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento puede comprender retirar o reemplazar de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos en el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-BP puede fusionarse con el extremo terminal del polipéptido de direccionamiento a través de un ligador. El ligador puede fusionarse con el CAR-BP para producir un producto intermedio de CAR-BP-ligador. El ligador puede fusionarse con un extremo N terminal de CAR-BP para producir el producto intermedio de CAR-BP-ligador. El ligador puede fusionarse con un extremo C terminal de c AR-BP para producir el producto intermedio de CAR-BP-ligador. El producto intermedio de CAR-BP-ligador puede fusionarse con el polipéptido de direccionamiento. El producto intermedio de CAR-BP-ligador puede fusionarse con el extremo N terminal del polipéptido de direccionamiento. El producto intermedio de CAR-BP-ligador puede fusionarse con el extremo C terminal del polipéptido de direccionamiento. Un primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede fusionarse con el extremo N terminal del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador puede fusionarse con el extremo C terminal del polipéptido de direccionamiento. El CAR-BP del primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede ser el mismo o similar al CAR-BP del segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador. El CAR-BP del primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede ser diferente del CAR-BP del segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ injertado” puede referirse a la inserción de un CAR-BP dentro de un polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, entre dos aminoácidos del polipéptido de direccionamiento). El CAR-BP puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento sin reemplazar o retirar ningún aminoácido del polipéptido de direccionamiento. El injerto del CAR-BP dentro del polipéptido de direccionamiento puede comprender retirar o reemplazar aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento. La retirada o el reemplazo de aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento puede comprender retirar o reemplazar de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos dentro del polipéptido de direccionamiento. El CAR-BP puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento a través de un ligador. El CAR-BP puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento a través de dos ligadores. El ligador puede fusionarse con el extremo N terminal de CAR-BP para producir un producto intermedio de CAR-BP-ligador. El ligador puede fusionarse con el extremo C terminal de CAR-BP para producir un producto intermedio de CAR-BP-ligador. Un primer ligador puede fusionarse con el extremo N terminal de CAR-BP y un segundo ligador puede fusionarse con el extremo C terminal de CAR-BP para producir un producto intermedio CAR-BP-ligador. El producto intermedio de CAR-BP-ligador puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento. Un primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador puede injertarse dentro del polipéptido de direccionamiento. El primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede injertarse dentro de un primer dominio del polipéptido de direccionamiento y un segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador puede injertarse dentro de un segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer dominio del polipéptido de direccionamiento puede ser el mismo que el segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El primer dominio del polipéptido de direccionamiento puede ser diferente del segundo dominio del polipéptido de direccionamiento. El CAR-BP del primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede ser el mismo o similar al CAR-BP del segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador. El CAR-BP del primer producto intermedio de CAR-BP-ligador puede ser diferente del CAR-BP del segundo producto intermedio de CAR-BP-ligador. A menos que se especifique de otro modo, los términos “injerto” e “inserto”, tal como se usan en el presente documento, se usan de manera intercambiable.
El resto de direccionamiento puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera o fragmentos de las mismas. Los métodos pueden comprender expresar una cadena pesada en la que el antígeno peptídico se fusiona con un extremo terminal de la cadena pesada. Los métodos pueden comprender expresar una cadena pesada en la que se injerta el antígeno peptídico dentro de la cadena pesada. Los métodos pueden comprender expresar una cadena ligera en la que el antígeno peptídico se fusiona con un extremo terminal de la cadena ligera. Los métodos pueden comprender expresar una cadena ligera en la que se injerta el antígeno peptídico dentro de la cadena ligera.
Los métodos pueden comprender además la clonación de uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o el antígeno peptídico para dar un vector de expresión. Los métodos pueden comprender además el ligamiento del uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico para dar un vector de expresión. El vector de expresión puede ser un vector de expresión procariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión eucariota. El vector de expresión puede ser un vector de expresión de mamíferos. El vector de expresión puede ser un vector de expresión viral. Los métodos pueden comprender además validar la clonación del uno o más polinucleótidos que codifican para el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico para dar el vector de expresión que comprende secuenciar el vector de expresión, realizar una electroforesis en gel del vector y/o visualizar el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico en un gel de SDS-page.
Los métodos pueden comprender además amplificar un polinucleótido que codifica para el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico y clonar el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico para dar el vector de expresión. Amplificar el polinucleótido que codifica para el polipéptido de direccionamiento y/o el antígeno peptídico puede comprender sintetizar oligonucleótidos al menos parcialmente complementarios al gen. Los oligonucleótidos pueden ser lo suficientemente complementarios al gen como para hibridarse con el polinucleótido. Los oligonucleótidos pueden comprender secuencias de ligador. Las secuencias de ligador pueden seleccionarse de SEQ ID NO: 40-44.
Los métodos pueden comprender además transfectar o infectar una célula con el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además expresar el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico en la célula. Los métodos pueden comprender además expresar el polipéptido de direccionamiento y/o antígeno peptídico en un sistema libre de células. Los métodos pueden comprender además producir un virus que comprende el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además propagar el virus. Los métodos pueden comprender además infectar una célula con el virus que comprende el vector de expresión. Los métodos pueden comprender además propagar la célula.
En el presente documento se dan a conocer métodos de injerto del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el antígeno peptídico o el péptido de direccionamiento para producir un interruptor de CAR-EC. El método puede comprender injertar el CAR-BP en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el CAR-BP en un extremo N terminal, extremo C terminal o sitio interno del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-BP puede injertarse en un dominio CL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El CAR-BP puede injertarse a un bucle del dominio CL del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el CAR-BP. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en un extremo N terminal, extremo C terminal o sitio interno del CAR-BP. El método puede comprender injertar el CAR-BP en el péptido de direccionamiento. El método puede comprender injertar el CAR-BP en un extremo N terminal, extremo C terminal o sitio interno del péptido de direccionamiento. El método puede comprender injertar el péptido de direccionamiento en el CAR-BP. El método puede comprender injertar el péptido de direccionamiento en un extremo N terminal, extremo C terminal o sitio interno del CAR-BP.
El CAR-BP, péptido de direccionamiento, anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender uno o más ligadores, donde el ligador está ubicado en el extremo N terminal y/o extremo C terminal del CAR-BP, péptido de direccionamiento, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El método puede comprender injertar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el CAR-BP o el péptido de direccionamiento a través del ligador. El ligador puede comprender (GSSSS)n .
Injertar puede comprender producir un interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico. Producir el interruptor de CAR-EC que codifica un ácido nucleico puede comprender una o más reacciones en cadena de la polimerasa. Producir el interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico puede comprender una o más digestiones enzimáticas de ácido nucleico. La digestión enzimática puede ser específica de sitio. Producir el interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico puede comprender uno o más ligamientos. Los métodos de producción del interruptor de CAR-EC pueden comprender incorporar el interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico para dar un vector de interruptor de CAR-EC. El vector puede ser un vector de expresión. El vector de expresión puede comprender un promotor constitutivo, un promotor inducible y/o un promotor condicional. El interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico o vector de interruptor de CAR-EC puede expresarse en una célula y el interruptor de CAR-EC resultante aislarse y purificarse. La célula puede ser una célula procariota. La célula puede ser una E. coli. La célula puede ser una célula eucariota. La célula puede ser una célula de mamífero. El interruptor de CAR-EC que codifica para un ácido nucleico o vector de interruptor de CAR-EC puede expresarse en un sistema libre de células. Alternativa o adicionalmente, el interruptor de CAR-EC puede sintetizarse a partir de aminoácidos libres.
Purificación de interruptores de CAR-EC y partes de los mismos
En el presente documento se dan a conocer métodos de purificación de interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento, que comprenden separar los interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento de componentes de un sistema de producción de interruptores de CAR-EC (por ejemplo, residuos celulares, aminoácidos libres). La purificación del interruptor de CAR-EC puede comprender el uso de una o más columnas concentradoras, electroforesis, filtración, centrifugación, cromatografía o una combinación de los mismos. La cromatografía puede comprender la cromatografía de exclusión molecular. Los métodos de cromatografía adicionales incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, unión metálica metales, cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía de líquidos de alta resolución o cromatografía de líquidos de alta presión. La electroforesis puede comprender electroforesis desnaturalizante o electroforesis no desnaturalizante.
Los interruptores de CAR-EC pueden comprender una o más etiquetas de péptido. Los métodos de purificación de interruptores de CAR-EC pueden comprender unir una o más etiquetas de péptido de los interruptores de CAR-EC a un agente de captura. El agente captura puede seleccionarse de un anticuerpo, una columna, una perla y una combinación de los mismos. La una o más etiquetas pueden escindirse por una o más proteasas. Los ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, etiqueta FLAG®, HA, c-myc, V5, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta de péptido puede ser el CAR-BP. La etiqueta de péptido puede ser HTP. La etiqueta de péptido puede ser factor de transcripción de levadura GCN4.
Los métodos pueden comprender además liofilización o ultracentrifugación de los CAR-BP, polipéptidos de direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC.
La pureza de los CAR-BP, polipéptidos direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. La pureza de los CAR-BP, polipéptidos de direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 85%. La pureza de los c AR-BP, polipéptidos de direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 90%. La pureza de los CAR-Bp , polipéptidos de direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 95%. La pureza de los CAR-Bp , polipéptidos de direccionamiento y/o los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 97%.
Los métodos de producción de interruptores de CAR-EC dados a conocer en el presente documento pueden comprender producir interruptores de CAR-EC que son estructuralmente homogéneos. El método de producción del interruptor de CAR-EC a partir de un polinucleótido puede dar como resultado uno o más interruptores de CAR-EC que tienen la misma o similar forma, características, afinidades de unión (por ejemplo, por el CAR o la diana), geometría y/o tamaño. La homogeneidad de los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. La homogeneidad de los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 85%. La homogeneidad de los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 90%. La homogeneidad de los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 95%. La homogeneidad de los interruptores de CAR-EC puede ser igual o superior al 97%. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural antes de administrar la célula a un sujeto. La homogeneidad puede ser una homogeneidad estructural previa a modificaciones del interruptor de CAR-EC por actividades celulares (metilación, acetilación, glicosilación, etc.). Estos altos porcentajes de homogeneidad pueden proporcionar un efecto más predecible del interruptor de CAR-EC. Estos altos porcentajes de homogeneidad pueden proporcionar menos efectos inespecíficos del interruptor de CAR-EC, cuando se combina con un CAR-EC para tratar un estado en un sujeto.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustrativos son representativos de realizaciones de las aplicaciones de software, sistemas y métodos descritos en el presente documento y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.
Ejemplo 1 - Producción y evaluación de una plataforma de CAR-T conmutable
La solubilidad, estabilidad, afinidad y potencial de epítopos reactivos cruzados en el proteoma humano de anticuerpos desarrollados se consideraron al elegir un antígeno peptídico de interruptor de CAR-EC. Basándose en estos criterios, se eligió un epítopo de aminoácidos lineal del factor de transcripción de levadura GCN4 (7P14P). Los anticuerpos de cadena sencilla con afinidades que varían entre 2,6 nM y 5,2 pM permiten optimizar el CAR-EC mediante cinética de unión. Adicionalmente, estos anticuerpos se encuentran entre los anticuerpos de cadena sencilla anti-péptidos de mayor afinidad para epítopos lineales. La constante de disociación (Kd) para el epítopo GCN4 elegido (7P14P) que tiene una secuencia de NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO. 3) y scFv de unión a GCN4 (52SR4) es 5,2 pM.
Se desarrolló un péptido diana hidrofílico (HTP) pequeño, basado en la etiqueta FLAG® usada comúnmente. FLAG® tiene baja antigenicidad, es altamente soluble y se ha fusionado con numerosas proteínas con poco impacto en el plegamiento o la estabilidad de proteínas. Al modificar FLAG a HTP, se incorporó un residuo de prolina después de la lisina terminal en un esfuerzo por aumentar la estabilidad proteolítica. Se desarrollan anticuerpos contra este epítopo mediante inmunización tradicional de ratones y humanización posterior o mediante el cribado con fagos de una biblioteca humana. La cinética de unión de scFv evolucionados se caracteriza por completo y se crean y se someten a prueba CAR-EC de péptido para determinar la especificidad inespecífica tal como se describe.
Evaluación de una plataforma de CAR-T conmutable en un modelo de xenoinjerto
Para evaluar la eficacia, se usan modelos de xenoinjerto de ratón para comparar estas plataformas conmutables con las desarrolladas previamente por plataformas de interruptor de CAR-T. Con este fin, se usan líneas celulares RS4;11, NALM-6, Raji u otras líneas celulares positivas para CD19 para establecer modelos tumorales en ratones con inmunodeficiencia combinada no obesos con diabetes grave (NOD-SCID-y-7-, NSG). Los CAR-T se suministran por administración intravenosa. El hallazgo de intervalo de dosis se lleva a cabo para el interruptor anti-CD19 de péptido, y se compara con un control de Fab de CD19 silvestre. La eficacia se evalúa basándose en la carga tumoral y la supervivencia global. Los ratones se monitorizan con extracciones semanales de sangre para monitorizar la proliferación de CAR-EC en sangre periférica. La caracterización inmunofenotípica detallada de los CAR-EC se enfoca en fenotipos efectores, de memoria, senescentes (diferenciados terminalmente) o anergizados definidos según parámetros fenotípicos convencionales usando citometría de flujo multicanal.
La eficacia de los interruptores basados en Fab e IgG se suministran a dosificaciones adecuadas según los datos observados de PK y se comparan. IgG es la más eficaz en este modelo por su largo tiempo de residencia in vivo. La exploración adicional sobre esta idea se lleva a cabo en el modelo singénico.
Se obtienen muestras primarias de LLA o CLL derivadas de pacientes y para generar modelos de xenoinjerto en ratones NSG. Las muestras primarias se caracterizan para la expresión de CD19 mediante citometría de flujo. La leucemia se establece en ratones durante 2-3 semanas antes de la administración de la terapia. La eficacia frente a CAR-T-19 se evalúa monitorizando los recuentos de blastos CD19+ de LLA en sangre periférica. En el caso de que la leucemia no se controle o se elimine, los blastos proliferados se someten a inmunofenotipado (buscando específicamente la pérdida de expresión del antígeno CD19, véase a continuación, para el estudio adicional). También se monitoriza la persistencia de CAR-EC (aunque no se espera que esto último difiera sustancialmente de RS4; xenoinjertos basados en 11).
Evaluación de una plataforma CAR-T conmutable en un modelo singénico
Aunque los modelos de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes permiten la medición de la eficiencia de la plataforma conmutable, este modelo no es óptimo para evaluar un método para aliviar la linfopenia a largo plazo asociada a la terapia de CART-19. Se someten a prueba CAR-EC conmutables en cuanto a la capacidad de revertir la aplasia de células B en un modelo de ratón de linfoma de células B inmunocompetente. Para crear un CAR-T sustituto murino, el receptor quimérico basado en péptido modificado por ingeniería genética se clona en un vector retroviral basado en leucemia murina de Moloney para su transducción en esplenocitos murinos. Se usan los dominios de señalización derivados de murino CD28 y CD3z. El anticuerpo anti-CD19 humano no reacciona de manera cruzada con CD19 de ratón; por lo tanto, se obtiene el hibridoma de rata anti-CD19 de ratón 1D3 (a partir de la ATCC) y se secuencian las regiones variables. Esta secuencia se clona en un vector de expresión para la fusión de péptidos para crear el interruptor y se clona en un receptor de antígeno quimérico para crear un sustituto de ratón de c AR-T-19.
Después de la optimización de la transducción y evaluación de la eficacia in vitro, se usa la línea celular Myc5-CD19 para establecer linfoma de células B en ratones C57BL/6 silvestres. Se administran CAR-EC e interruptores con programas de dosificación basados en estudios de xenoinjerto y ensayos in vitro con sistema sustituto. Es de particular interés en este modelo comparar interruptores basados en Fab e IgG en cuanto a la tasa de desaparición de Myc5-CD19 y supresión de células B. Al igual que con los estudios de xenoinjertos, se monitoriza la proliferación de CAR-T y se lleva a cabo la caracterización inmunofenotípica ex vivo. Después de la erradicación de las células de linfoma, se detiene la administración del interruptor y se monitoriza la reproliferación de las células B en sangre periférica. Se espera que tanto el CAR-T-19 sustituto como el CAR-T conmutable sustituto permitan la remisión a largo plazo, pero solo la plataforma conmutable permite la repoblación de células B. La infiltración de CAR-T en órganos principales se monitoriza mediante histología en cohortes predefinidas y se realiza análisis celular después de terapia. Se sigue la persistencia a largo plazo de CAR-EC en ausencia de estimulación.
Evaluación de una plataforma de CAR-T conmutable en un modelo de cáncer heterogéneo
Un primer interruptor que contiene un anticuerpo de direccionamiento anti-CD 19 y un segundo interruptor que contiene el anticuerpo de direccionamiento anti-CD20 rituximab se usan secuencial o simultáneamente para seleccionar como diana diferentes antígenos en el mismo paciente usando un solo CAR-T transferido adoptivamente en un esfuerzo por combatir la recidiva de LLA atribuida a una variante de escape de CD19 durante la terapia con CAR-T-19.
Un interruptor anti-CD20 se crea de manera análoga al interruptor anti-CD19 usando las características óptimas determinadas en el ejemplo 3. Se construye un CAR-T-20 basado en rituximab para la comparación. La eficacia se somete a prueba in vitro frente a las líneas celulares IM-9 y Daudi positivas para CD20. Para crear un linfoblasto de células B heterogéneo, la línea celular K562 derivada de leucemia mielógena crónica (que es negativa para CD20 y CD19) se transduce de manera estable con el antígeno CD19 usando un vector lentiviral. Se obtienen clones monocelulares a través de clasificación por flujo para obtener una población con expresión de CD19 homogénea. Esta línea celular se transduce con CD20 y se clasifica por alto (CD20alto) o bajo (CD20bajo) nivel de expresión de antígeno. La activación y citotoxicidad del CAR-T conmutable en mezclas de Cd 19+c D20‘ y CD19+CD20alto o CD19+CD20bajo se evalúan in vitro usando los interruptores de CD19 y CD20 (administración simultánea o secuencial). El método proporciona la oportunidad de estudiar el porcentaje más bajo de células CD20alto o CD20bajo en una población que son necesarias para estimular el CAR-T con el interruptor de rituximab. Esto puede ser más fisiológicamente relevante que una población homogénea. Entonces, este sistema se somete a prueba en un modelo de ratón con xenoinjerto. Se usan una mezcla de CD19+CD20' y CD19+CD20+ para establecer el xenoinjerto. Alternativamente, se usan muestras primarias de LLA derivadas de paciente para este experimento si se encuentra que es heterogéneo para la expresión de CD19 o CD20 en el estudio inicial de xenoinjerto. Se administran CAR-EC conmutables con el interruptor anti-CD20 para eliminar la población CD19+CD20+ y permitir el crecimiento de las células CD19+CD20'. Para demostrar la viabilidad del redireccionamiento del mismo CAR-T, posteriormente se dosifica el interruptor anti-CD19 y se monitoriza el crecimiento del xenoinjerto restante. Se evalúan tumores para determinar la expresión de antígeno en cohortes de ratones sacrificados o en blastos primarios. También se evalúa el direccionamiento simultáneo. El tratamiento se compara con CAR-T-19, CAR-T-20, o ambos simultáneamente.
Ejemplo 2. Construcción de CAR
Los CAR se construyeron tal como sigue:
Se diseñó LV-EF1a-GCN4-BBZ para seleccionar como diana el epítopo 7P14P del factor de transcripción de levadura GCN4 (secuencia RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER (SEQ ID NO. 2) donde se ha mostrado que los aminoácidos subrayados se unen al scFv c11L32Ser en la estructura cristalina 1P4B de PDB. El scFv se construyó a partir del anticuerpo scFv 52SR4 (mutante de alta afinidad con secuencia similar a c11L32Ser) a partir de la referencia: Zahnd, C., Spinelli, S., Luginbuhl, B., Amstutz, P., Cambillau, C., y Pluckthun, A. (2004) Directed in vitro evolution and crystallographic analysis of a peptide-binding single chain antibody fragment (scFv) with low picomolar affinity, The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877.
Ejemplo 3. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-Fab-GCN4HC1
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de cadena pesada de Fab de CD19 se generó mediante ligamiento de la cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA) sin fragmento Fc. Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (Ny HLENEVARLKL = Se Q ID NO: 3) se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD1-Fab-GCN4HC1 injertando GCN4 en la cadena pesada madura del Fab de CD19 tras S135 de la cadena pesada de Fab de CD19. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-Fab-GCN4HC1 mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena ligera de CD19-Fab y GCN4-CD19-HC1, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron entonces a 125 rpm en un entorno del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. El anti-CD1-Fab-GCN4HC1 se purificó por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD1-Fab-GCN4HC1 (carril 7) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 4. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-IgG-GCN4HC1
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de cadena pesada de IgG de CD19 se generó por ligamiento en marco de la cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA). Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVARLKL = SEQ ID NO: 3) se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-IgG-GCN4HC1 insertando GCN4 tras S135 de la cadena pesada madura de la IgG de c D19. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-IgG-GCN4HC1 mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena ligera de CD19-IgG y cadena pesada de GCN4-CD19, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc).
Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron entonces a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. La cadena pesada de GCN4-CD19 se purificó por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-IgG-GCN4HC1 (carril 3) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 5. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-Fab-GCN4c-term
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de cadena pesada de Fab de CD19 se generó mediante ligamiento de cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA) sin el fragmento de Fc. Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVARLKL = Se Q ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en el extremo N-terminal de GCN4 se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-FAB-GCN4o-term fusionando el ligador-GCN4 con el extremo C terminal de la cadena pesada de Fab en C223. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-FAB-GCN4o-term mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena ligera CD19-Fab y anti-CD19-Fab-GCN4o-term, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó anti-CD19-Fab-GCN4o-term por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-FAB-GCN4o-Term (carril 9) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 6. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-IaG-GCN4h¡.sanm
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de la cadena pesada de IgG de CD19 se generó por ligamiento en marco de la cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA). Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVAr Lk L = SEQ ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en el extremo N-terminal de GCN4 y GGS (SEQ ID NO. 42, en la que n=1) en C-terminal de GCN4 (“ ligador-GCN4-ligador”) se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-IgG-GCN4bisagra mediante el injerto del ligador-GCN4-ligador entre el extremo C terminal de la cadena pesada de Fab en C223 y la región de bisagra. Por tanto, el ligador-GCN4-ligador extiende la región de bisagra de la IgG, imitando una estructura de IgG3 con una región de bisagra alargada. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-IgG-GCN4bisagra mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena ligera de CD19-IgG y cadena pesada de bisagra de GCN4-CD19, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó la IgG de bisagra de GCN4-CD19 por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-IgG-GCN4bisagra (carril 5) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 7. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-IaG-GCN4a.i
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de la cadena pesada de IgG de CD19 se generó por ligamiento en marco de la cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA). Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVAr Lk L = SEQ ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en ambos extremos se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-IgG-GCN4oL1 reemplazando K169 en la región CL de cadena ligera de CD19 por GCN4 con secuencias de ligador en ambos extremos. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-IgG-GCN4CL1 mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena pesada de CD19-IgG y cadena ligera de GCN4-CD19-CL1, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó anti-CD19-IgG-GCN4CL1 por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-IgG-GCN4CL1 (carril 4) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 8. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-FAB-GCN4ci.i
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de cadena pesada de Fab de CD19 se generó mediante ligamiento de cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA) sin el fragmento de Fc. Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVARLKL = Se Q ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en ambos extremos se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-FAB-GCN4CL1 reemplazando K169 en la región CL de cadena ligera de CD19 por GCN4 con secuencias de ligador en ambos extremos. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-Fab-GCN4CL1 mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena pesada de CD19-Fab y cadena ligera de GCN4-CD19-CL, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células h Ek 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó anti-CD19-FAB-GCN4CL1 por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles SDS-PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-FAB-GCN4CL1 (carril 8) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 9. Clonación, expresión y purificación de anti-CD19-Fab-GCN4i ci-N-term
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de cadena pesada de Fab de CD19 se generó mediante ligamiento de cadena pesada de Fab de CD19 amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA) sin el fragmento de Fc. Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo CD19 se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVARLKL = Se Q ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en el extremo C-terminal de GCN4 se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-CD19-FAB-GCN4LC1-N-term fusionando el ligador-GCN4 con el extremo N terminal de la cadena ligera de Fab. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-CD19-FAB-GCN4LC1-N-term mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena ligera de CD19-Fab y GCN4-CD19-C-term, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3 x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 |ig de plásmido de cadena ligera y 15 |ig de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 |il de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó anti-CD19-Fab-GCN4LC1-N-term por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL). Las proteínas purificadas se analizaron por geles de s Ds -PAGE. Las figuras 5A y 5B muestran imágenes de geles de SDS de anti-CD19-FAB-GCN4LC1-N-term (carril 10) en condiciones no reductoras y reductoras (con DTT 50 mM), respectivamente.
Ejemplo 10. Citotoxicidad de interruptores de CAR-EC de anti-CD19 Fab-GCN4g.i, anti-CD19 IgGFcnula-GCN4 y anti-CD19 Fab-GCN4g -term
Se crearon interruptores de CAR-EC peptídicos fusionando 14 aminoácidos de la secuencia 7P14P de péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 (definido en Zahnd et al. (2004) Directed in vitro evolution and crystallographic analysis of a peptide-binding single chain antibody fragment (scFv) with low picomolar affinity, The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877). Los 14 aminoácidos se eligieron basándose en los definidos en la estructura cristalina 1P4B del péptido de GCN47P14P con scFvC11L32ser. Los interruptores se construyeron o bien fusionando la secuencia peptídica de GCN4 con el extremo C terminal de la cadena pesada del anticuerpo Fab o bien fusionando la secuencia peptídica de GCN4 en el bucle CL de la cadena ligera del anticuerpo Fab o IgG. Todas las expresiones se llevaron a cabo en células CHO o HEK.
Para crear un interruptor de CAR-T anti-CD19 basado en péptido GCN4 injertado (SEQ ID NO: 30), el péptido NYHLENEVARLKKL (SEQ ID NO: 3), que se sugirió que es el epítopo de unión mínimo según la estructura cristalina (PDB: 1P4B) (véase la figura 2) del péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 (7P14P) RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKLKLVGER (SEQ ID NO: 2), se injertó en el clon FMC63 anti-Fab de CD19 humano de ratón. El injerto se realizó reemplazando K63 (contado a partir del extremo N terminal de la región constante, que sería K169 al contar a partir del extremo N terminal de la proteína madura) de la cadena ligera por la secuencia Gg GGSNYHLENEVARLk KlGGGS (SEQ ID NO. 4) - el epítopo de GCN4 flanqueado por ligadores de GGGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1). La espec. de masas de anti-CD19 Fabou-GCN4 se proporciona a continuación (figura 3). Alternativamente, el péptido se injerta en la cadena pesada (SEQ ID NO: 29).
La actividad citotóxica del interruptor de Fabou-GCN4 anti-CD19 se evaluó con las PBMC humanas transducidas con LV-EF1a-GCN4 (52SR4) para crear CAR-T-GCN4 a razones de E:T de 10:1 y 24 horas de incubación. La actividad se evaluó frente a NALM-6 (CD19+), RS4;11 (CD19+), o RPMI-8226 (CD19-) (tabla 1). La actividad del interruptor de IgG (FcNula) se evaluó frente a RS4;11 (CD19+) o K562 (CD19‘) (tabla 2). La actividad del interruptor C-terminal se evaluó frente a RS4;11 (CD19+) o K562 (CD19-) (tabla 3).
Tabla 1. Citotoxicidad del interruptor de FaboL1-GCN4 anti-CD19
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Tabla 2. Citotoxicidad del interruptor de IgGFcNula-GCN4 anti-CD19
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Tabla 3. Citotoxicidad del interruptor de Fabo term-GCN4 anti-CD19
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Ejemplo 11. Citotoxicidad de diversos interruptores de CAR-EC anti-CD19-GCN4 con GCN4 injertado/fusionado en diferentes regiones de un anticuerpo anti-CD19 o fragmento de anticuerpo
Las actividades citotóxicas de diversos interruptores de CAR-EC anti-CD19-GCN4 injertados/fusionados en diferentes regiones de anticuerpos anti-CD19 FMC63 o fragmentos de anticuerpos se evaluaron con las PBMC humanas transducidas con LV-EF1A-GCN4 (52SR4) para crear CAR-T-GCN4 a razones de E:T de 10:1 y 24 horas de incubación. Los interruptores sometidos a prueba fueron Faba_i-GCN4 anti-CD19 (“Fab de CL1), anti-CD19-GCN4 Fabc-Term (“Fab C-Term), IgGHC1-GCN4 anti-CD19 (“IgG de HC1”), IgGa_-GCN4 anti-CD19 (“IgG de CL1”), IgGbisagra-GCN4 anti-CD19 (“ IgG de bisagra”)), IgGWT-GCN4 anti-CD19 (“ IgG Wt”), FabHC1-GCN4 anti-CD19 (“Fab de HC1”) y FABN-term lc1-GCn 4 anti-CD19 (“Fab de LC1 N-term”). Las actividades se evaluaron frente a RS4;11 (CD19+) (figura 4, tabla 4). La figura 6 representa las posiciones de injerto de los interruptores descritos en este ejemplo. Las posiciones de injerto de CL1 y HC1 se aplicaron a ambos formatos de Fab e IgG. El injerto de extremo N terminal se muestra como injertado en la cadena ligera, sin embargo, el injerto N-terminal no está restringido a la cadena ligera o Fab y también puede injertarse en la cadena pesada así como el formato de IgG. La posición C-term en el Fab es isostérica con la IgG de bisagra. En este contexto, todos los constructos de Fab son monovalentes y todos los constructos de IgG son bivalentes, pero estos no son requisitos necesarios para interruptores de CAR-EC en general.
Tabla 4. Citotoxicidad de interruptores de anti-CD19-GCN4
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Ejemplo 12. Eficacia in vivo del interruptor de CAR-EC anti-CD19-FAB-GCN4CL1 y células CAR-T anti-GCN4 (células swiCAR T) en un modelo de ratón de tumor de xenoinierto.
Para evaluar la actividad in vivo de células swiCAR-T, se realizó un estudio piloto con un modelo de tumor de xenoinjerto ortopópico (líquido) basado en células NALM-6 luciferizadas. En este modelo, las células swiCAR T demostraron regresión después de solo 5 días de tratamiento diario con 0,5 mg/kg de Fab de CL1 anti-CD19 (GCN4). El tratamiento con el Fab anti-CD19 silvestre con células swiCAR T no fue capaz de mediar en la regresión tumoral (no significativo por ANOVA unidireccional). Estos resultados demuestran la capacidad de redirigir las células swiCAR T in vivo. Detalles del experimento: 106 células NALM-6 luciferizadas se inyectaron por vía intravenosa en ratones con inmunodeficiencia combinada con diabetes grave no obesos (NOD-SCID-y-/-, NSG). Seis días después, 30x106 células swiCAR T o células CART-19 (transducidas al 50%) se infundieron por vía intravenosa. La dosificación de aCD19-Fab-GCN4-CL1 (i.v.) comenzó el mismo día, q.d. 0,5 mg/kg. Después de 5 días de dosificación (día 11), en los ratones se inyectó luciferina y se obtuvieron imágenes en un sistema de obtención de imágenes in vivo (IVIS), n=3 o 4, radiancia promedio (p/s/cm2/sr) representada gráficamente medida por ratón, y media EEM representada gráficamente, **p <0,05, ANOVA unidireccional. La diferencia entre ausencia de tratamiento y swiCAR-T Fab WT no es estadísticamente significativa. Los resultados se muestran en la figura 7A.
Eiemplo 13. Clonación, expresión y purificación de anti-BCMA-IgG-GCN4ou
Clonación: El vector de expresión de mamíferos de la cadena pesada de IgG de CD19 se generó por ligamiento en marco de la cadena pesada de IgG anti-BCMA amplificada (VH y CH1) al vector de estructura principal Pfuse-hIgG1-FC (InviVogen, CA). Un gen que codifica para la cadena ligera de anticuerpo BCMA se amplificó y clonó en el vector PfuSE sin el fragmento de Fc de hIgG1. Un gen que codifica para GCN4 (NYHLENEVAr Lk L = SEQ ID NO: 3) con ligador de GGGGS (SEQ ID NO: 40, en la que n=1) en ambos extremos se sintetizó como oligonucleótidos. Posteriormente, se crearon proteínas de fusión anti-BCMA-IgG-GCN4cL1 mediante el injerto de GCN4 con secuencias de ligador en ambos extremos en la región CL de la cadena ligera anti-BCMA. Los vectores de expresión de mamíferos resultantes se confirmaron por secuenciación del ADN.
Expresión y purificación: Se expresó anti-BCMA-IgG-GCN4cL1 mediante transfección transitoria de células HEK 293 FreeStyle con vectores de expresión de cadena pesada de BCMA-IgG y cadena ligera de GCN4-BCMA-CL1, según el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 28 ml de células HEK 293 FreeStyle que contenían 3x107 células en un matraz de agitación de 125 ml. Se añadieron 15 pg de plásmido de cadena ligera y 15 pg de plásmido de cadena pesada diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM en 1 ml de Opti-MEM que contenía 60 pl de 293fectina (Invitrogen, Inc). Después de la incubación de los plásmidos con 293fectina durante 30 min, se añadió la mezcla lipoplex a la suspensión celular. Las células se agitaron a 125 rpm en un ambiente del 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo que contenía proteínas secretadas se recogió a las 48 y 96 horas después de la transfección. Se purificó anti-BCMA-IgG-GCN4cL1 por cromatografía de proteína G (Thermo Fisher Scientific, IL).
Ejemplo 14. Citotoxicidad del interruptor de CAR-EC anti-BCMA-IgG-GCN4cLi con GCN4 injertado en la cadena ligera de un anticuerpo anti-BCMA o fragmento de anticuerpo
La actividad citotóxica del interruptor de CAR-EC anti-BCMA-IgG-GCN4cLi se evaluó con las PBMC humanas transducidas con LV-EF1a-GCN4 (52SR4) para crear CAR-T-GCN4 a razones de E:T de 10:1 y 24 horas de incubación. La eficiencia de transducción de las PBMC fue de aproximadamente el 50%. Las actividades se evaluaron frente a OPM2 (BCMA+), cuantificando lactato deshidrogenasa debido a citólisis de células diana (figura 8, tabla 5).
Tabla 5. Citotoxicidad del interruptor de CAR-EC anti-BCMA-IgG-GCN4CL1 y células CAR-T anti-GCN4
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Si bien las realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en el presente documento, resultará obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo.
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un interruptor de receptor de antígeno quimérico-célula efectora (CAR-EC) que comprende:
    a. un antígeno peptídico que comprende un péptido de factor de transcripción de levadura GCN4 que se une a un receptor de antígeno quimérico anti-GCN4 en una célula efectora; comprendiendo dicho péptido GCN4 una parte de SEQ ID NO: 2 que es de 12 aminoácidos; y
    b. un resto de direccionamiento que se une a una molécula de superficie celular en una célula diana, en el que el antígeno peptídico se injerta o se fusiona con el resto de direccionamiento.
  2. 2. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1, en el que el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento.
  3. 3. El CAR-EC según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en: una inmunoglobulina, una inmunoglobulina Fc nula y un Fab, y fragmentos de los mismos.
  4. 4. El CAR-EC según la reivindicación 2, en el que el resto de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-EGFRvIII, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-BCMA y un anticuerpo anti-CS1, y fragmentos de los mismos.
  5. 5. El CAR-EC según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento comprende un par de una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada están preferiblemente codificadas por secuencias de ácido nucleico basadas en o derivadas de pares de secuencias de ácido nucleico seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 8 y 9; SEQ ID NO: 8 y 10; SEQ ID NO: 11 y 12; SEQ ID NO. 13 y 14; SEQ ID NO: 15 y 16; SEQ ID NO: 17 y 18; y SEQ ID NO: 19 y 20.
  6. 6. El CAR-EC según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento comprende un par de una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera y la cadena pesada están preferiblemente codificadas por secuencias de aminoácidos basadas en o derivadas de pares de secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 21 y 22; SEQ ID NO: 23 y 24; SEQ ID NO. 25 y 26; SEQ ID NO: 27 y 28; SEQ ID NO: 27 y 29; SEQ ID NO: 30 y 29; SEQ ID NO: 36 y 29; SEQ ID NO: 31 y 28; SEQ ID NO: 27 y 32; SEQ ID NO: 27 y 33; SEQ ID NO: 27 y 34; y SEQ ID NO: 27 y 35.
  7. 7. El CAR-EC según la reivindicación 1, en el que el antígeno peptídico se fusiona con un extremo terminal del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento.
  8. 8. El CAR-EC según la reivindicación 1, en el que el antígeno peptídico se fusiona con una región del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento seleccionado del grupo que consiste en: un extremo N terminal de una cadena ligera, un extremo C terminal de una cadena ligera, un extremo N terminal de una cadena pesada, un extremo C terminal de una cadena pesada de Fab y un extremo C terminal de una cadena pesada de región constante.
  9. 9. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1, en el que el antígeno peptídico se injerta en el resto de direccionamiento.
  10. 10. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 9, en el que el resto de direccionamiento comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de direccionamiento.
  11. 11. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1, que comprende además un ligador que une el antígeno peptídico y el resto de direccionamiento.
  12. 12. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1, en el que la célula diana es una célula cancerosa.
  13. 13. El interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de un cáncer.
  14. 14. Una composición farmacéutica que comprende el interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1 y una sal, excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. Un kit que comprende el interruptor de CAR-EC según la reivindicación 1 y un CAR-EC que comprende un receptor de antígeno quimérico que se une al antígeno peptídico del interruptor de CAR-EC.
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