JP7291396B2 - 融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 - Google Patents

融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 Download PDF

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本出願は、2016年11月22日に出願された米国特許仮出願第62/425,407号、2016年11月22日に出願された米国特許仮出願第62/425,535号、2016年11月23日に出願された米国特許仮出願第62/425,697号、及び2016年11月23日に出願された米国特許仮出願第62/425,884号の利益を主張するものであり、当該仮出願のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
血液悪性腫瘍または末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準治療では治癒不可能である。更に、従来の治療選択肢は、多くの場合、重大な副作用がある。がん性細胞を拒絶するために患者の免疫系を関わらせる試み、すなわち、がん免疫療法と総称される方法が多くなされてきた。しかしながら、いくつかの障害が、その臨床効果の達成をかなり困難にしている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは、多くの場合、自己由来であるため、がん免疫療法が健康な組織に向かう可能性があり、または免疫原性に乏しい。更に、がん細胞は、複数の機構を用いて、自分自身を見えなくしたり、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
遺伝子操作されたT細胞をがん細胞の適切な細胞表面分子に向け直すことに依拠する、キメラ抗原受容体(CAR)改変自己T細胞治療を用いた最近の発展は、がんを治療するために免疫系の力を利用することにおいて有望な結果を示している。例えば、B細胞成熟抗原(BCMA)特異的CART細胞を用いた進行中の試験による臨床結果は、一部の多発性骨髄腫患者において、部分寛解を示した(このような試験の1つはclinicaltrials.govから識別番号NCT02215967で見出すことができる)。代替的な方法は、自己T細胞を遺伝子操作するために、腫瘍関連ペプチド抗原に対して選ばれたT細胞受容体(TCR)アルファ鎖及びベータ鎖の使用である。これらのTCR鎖は、完全なTCR複合体を形成し、第二の特異性を定義するTCRをT細胞にもたらす。滑膜肉腫患者では、NY-ESO-1-特異的TCRアルファ鎖及びベータ鎖を発現する組み換え自己T細胞を用いることにより、有望な結果が得られた。末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準治療では治癒不可能である。更に、従来の治療選択肢は、多くの場合、重大な副作用がある。がん性細胞を拒絶するために患者の免疫系を関わらせる試み、すなわち、がん免疫療法と総称される方法が多くなされてきた。しかしながら、いくつかの障害が、その臨床効果の達成をかなり困難にしている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは、多くの場合、自己由来であるため、がん免疫療法が健康な組織に向かう可能性があり、または免疫原性に乏しい。更に、がん細胞は、複数の機構を用いて、自分自身を見えなくしたり、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
NKG2Dは、自己腫瘍細胞及びウイルス感染細胞の表面に提示されている様々な細胞ストレス誘導性リガンドに結合すると、免疫監視に関与する活性化共刺激受容体として機能する。NKG2Dは、活性化したキラー(NK)細胞に対して、刺激と共刺激の両方による自然免疫応答をもたらし、細胞傷害活性を導く。NKG2Dは、T細胞活性化を増幅することによって、CD8T細胞媒介性適応免疫応答において、T細胞受容体(TCR)の共刺激受容体として機能し、パーフォリンを介したリガンド発現腫瘍細胞の排除を促進する。NKG2Dシグナル伝達は、最終的にはTNF-アルファの発現に至るカルシウム流入に関与する。NKG2Dは、NK細胞を介した骨髄移植片拒絶反応に関与しており、NK細胞の分化及び生存において制御的役割を果たすと思われる。NKG2Dは、MHCクラスI関連糖タンパク質の様々なサブファミリーに属するリガンドに結合し、これらには、MICA、MICB、RAET1E、RAET1G、ULBP1、ULBP2、ULBP3(ULBP2>ULBP1>ULBP3)及びULBP4が挙げられる。
ROR1は、悪性B細胞(B-CLL)及びマントル細胞リンパ腫(MCL)の細胞表面上に発現する。また、ROR1は、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌及び乳癌の細胞株を含む、特定の他のがん細胞株にも発現することが報告されている。
CD16は、低親和性Fc受容体であり、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球及びマクロファージの表面上にみられる分化分子クラスターである。Fc受容体FcγRIIIa(CD16a)及びFcγRIIIb(CD16b)として特定されている。これらの受容体は、IgG抗体のFc部分に結合し、次いで、NK細胞を活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらす。
組み換えT細胞を用いた患者の治療を成功させるには、CARまたは第2のTCRを発現する遺伝子改変T細胞がin vitro/ex vivoでそれぞれの標的細胞を認識及び破壊する能力に加えて、T細胞が強力な活性化、増殖、経時的な持続性を有することができ、再発性疾患の場合には、「記憶」反応が可能であることを要する。CART細胞の高くて扱いやすい臨床効果は、現在、メソテリン陽性B細胞悪性腫瘍、及びHLA-A2を発現するNY-ESO-1-ペプチド発現滑膜肉腫患者に限られている。遺伝子操作されたT細胞を様々なヒト悪性腫瘍に対してより広く作用するように改良する明確な必要性がある。本明細書に記載されるのは、既存の方法の限界を克服することが見込まれる、細胞表面抗原に特異的な結合ドメインと、CD3イプシロン、CD3ガンマ及びCD3デルタなどのTCRサブユニットとの新規融合タンパク質、ならびにTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖との新規融合タンパク質である。本明細書に記載されるのは、CARよりも標的細胞を効果的に殺傷するが、炎症促進性サイトカインを同等または少ないレベルで放出する、新規融合タンパク質である。炎症促進性サイトカイン値の上昇が養子CAR-T療法の用量制限毒性と関連することから、これらの融合タンパク質及びその使用方法は、CARと比較して、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)の利点を示す。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、TCRアルファ及びTCRベータからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗体またはその断片に結合することができる結合リガンドまたはその断片とを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、結合リガンドは、抗体のFcドメインに結合することができる。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、IgG1抗体に選択的に結合することができる。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、IgG1抗体に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、腫瘍細胞の表面上の細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、抗体またはその断片を含まない。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、ヒトまたはヒト化である。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、結合リガンドによって結合され得る抗体またはその断片をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、細胞から分泌され得る。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、TCRアルファ及びTCRベータからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、細胞の表面上に発現される受容体またはポリペプチドに結合するリガンドまたはその断片を含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、リガンドを含む。いくつかの実施形態において、リガンドは、細胞の受容体に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、細胞の表面上に発現されるポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、細胞の表面上に発現される受容体またはポリペプチドは、ストレス応答受容体またはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、細胞の表面上に発現される受容体またはポリペプチドは、MHCクラスI関連糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、MHCクラスI関連糖タンパク質は、MICA、MICB、RAET1E、RAET1G、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体を含む。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、リガンドまたはその断片の単量体または二量体を含む。いくつかの実施形態において、リガンドまたはその断片は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体である。いくつかの実施形態において、リガンドまたはその断片は、単量体または二量体である。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、抗体またはその断片を含まない。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、CDRを含まない。いくつかの実施形態において、リガンドまたはその断片は、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片である。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、第1のTCRサブユニット及び第2のTCRサブユニットを含み、抗原ドメインは、第1の抗原ドメイン及び第2の抗原ドメインを含み、第1のTCRサブユニットは、第1の抗原ドメインに作動可能に連結され、第2のTCRサブユニットは、第2の抗原ドメインに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、ヒトまたはヒト化である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む、結合リガンドとを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む、結合リガンドとを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む、結合リガンドとを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む、結合リガンドとを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む、結合リガンドとを含み、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCRサブユニットと、抗体またはその断片に結合することができる結合リガンドとを含む、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCRサブユニットと、CD16ポリペプチドまたはその断片を含む結合リガンドとを含む、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメインである抗原結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメインである抗原結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメインである抗原結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメインである抗原結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメインである抗原結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCRサブユニットと、抗ROR1結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む、抗原ドメインとを含み、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結され、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCRサブユニットと、抗原ドメインとを含む、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCRサブユニットと、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片であるリガンドを含む抗原ドメインとを含む、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、TCRサブユニット及び抗原ドメインは、作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、ヒトまたはヒト化である。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、細胞の受容体に結合する。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、細胞の表面上に発現されるポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、ストレス応答受容体またはポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、MHCクラスI関連糖タンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、MHCクラスI関連糖タンパク質は、MICA、MICB、RAET1E、RAET1G、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体を含む。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片の単量体または二量体を含む。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体である。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)リガンドまたはその断片は、単量体または二量体である。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、抗体またはその断片を含まない。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、抗原ドメインは、CDRを含まない。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、第1のTCRサブユニット及び第2のTCRサブユニットを含み、抗原ドメインは、第1の抗原ドメイン及び第2の抗原ドメインを含み、第1のTCRサブユニットは、第1の抗原ドメインに作動可能に連結され、第2のTCRサブユニットは、第2の抗原ドメインに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、コードされたリガンドは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、第2のTFPのTCRサブユニットは、TCRアルファ、TCRベータ、CD3イプシロン、CD3ガンマ及びCD3デルタからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性断片に由来する刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインを更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット、第1の抗体ドメイン及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット、第1の抗体ドメイン及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット、第1の抗体ドメイン及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット、第1の抗体ドメイン及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された組み換え核酸分子であって、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニット、第1の抗体ドメイン及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗CD19結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインであり、いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗CD22結合ドメインである。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD19結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)と、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗BCMA結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)とをコードする、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD19結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)と、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD22結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)とをコードする、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインが作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインが作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第1のTFP、第2のTFP、またはその両方は、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる。いくつかの実施形態において、コードされた第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続されるか、コードされた第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続されるか、または第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、かつコードされた第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインとを含み、(i)、(ii)及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、CD3イプシロン、CD3ガンマもしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、またはその両方は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、第1のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、またはその両方は、scFvまたはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)配列番号25、配列番号27及び配列番号29に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗CD19軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)配列番号31、配列番号33及び配列番号35に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗CD19重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)配列番号37、配列番号39及び配列番号41に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗BCMA軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)配列番号43、配列番号45及び配列番号47に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗BCMA重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、抗CD22抗原結合ドメインは、本明細書に記載される可変領域または本明細書に記載される1つ以上のCDRを含む。
いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP、コードされた第2のTFP、またはその両方は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP及びコードされた第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP及びコードされた第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCRサブユニット及び結合リガンドは、作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、TCRサブユニット及び抗体ドメインは、作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、TFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、コードされた抗原結合ドメインは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインとを含み、(i)、(ii)及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16結合抗体または抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、scFvまたはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書で提供されるNKG2Dリガンドに対して70~100%の配列同一性を有するNKG2Dアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書で提供されるCD16ポリペプチドに対して約70~約100%の配列同一性を有するCD16アミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)本明細書で提供される抗ROR1軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗ROR1軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)本明細書で提供される抗ROR1重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗ROR1重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及び4-1BB(CD137)、ならびにそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、それに対する少なくとも1つから20以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはTFPへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含み、いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、プロテアーゼ切断部位を更に含む。いくつかの実施形態において、それに対する少なくとも1つから20以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または第1のTFP、第2のTFP、もしくはその両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、mRNAである。
いくつかの実施形態において、TFPは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFP、第2のTFP、またはその両方は、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。いくつかの実施形態において、当該ITAMが、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMの代わりに使用される。いくつかの実施形態において、ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMの代わりに使用される。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される核酸分子によってコードされた、単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは、第1の核酸分子によってコードされた第1のポリペプチドと、第2の核酸分子によってコードされた第2のポリペプチドとを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えTFP分子である。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えの第1のTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えの第1のTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えの第1のTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えの第1のTFP分子である。
いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗ROR1結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ROR1結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。いくつかの実施形態において、抗ROR1結合ドメインは、本明細書で提供される抗ROR1軽鎖のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する重鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ROR1結合ドメインは、本明細書で提供される抗ROR1重鎖のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する軽鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、TCR細胞外ドメインは、リンカー配列によって、作動可能に接続される。いくつかの実施形態において、リンカー領域は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、リーダー配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるTFPをコードする配列を含む、核酸である。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、抗CD19結合ドメイン、抗BCMA結合ドメイン、抗CD22結合ドメインまたはこれらの組み合わせを更に含み、scFvまたはVHドメインである。
いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する重鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する軽鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA結合ドメインは、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する重鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA結合ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する軽鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗CD22結合ドメインは、本明細書に記載される可変領域または本明細書に記載される1つ以上のCDRを含む。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、抗BCMA結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、抗CD22結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、共刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、リーダー配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された組み換えTFPをコードする配列を含む、核酸である。
いくつかの実施形態において、核酸は、第1のTFP分子をコードする第1の核酸と、第2のTFP分子をコードする第2の核酸とを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、DNA及びRNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、核酸は、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、in vitro転写された核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、ポリ(A)テールをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、3’UTR配列を更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるTFPをコードする核酸分子を含む、ベクターである。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子をコードする核酸分子を含む、ベクターである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、a)第1のTFPをコードする第1の核酸分子を含む第1のベクターと、b)第2のTFPをコードする第2の核酸分子を含む第2のベクターとを含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、in vitro転写されたベクターである。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、ポリ(A)テールを更にコードする。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、3’UTRを更にコードする。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位を更にコードする。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、または本明細書に記載されるベクターを含む、細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子、本明細書に記載される核酸、または本明細書に記載されるベクターを含む、細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態において、T細胞は、CD8またはCD4T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを、細胞内シグナル伝達ドメインに由来する正のシグナルを備える第2のポリペプチドに会合して含む抑制分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態において、抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、TFP分子は、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、TFP分子は、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、少なくとも2つのTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、TFP分子は、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、単離された組み換えTFP分子は、a)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、b)ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、単離された組み換えTFP分子は、a)ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、b)ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの実施形態において、TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む。いくつかの実施形態において、NKG2Dリガンドまたはその断片は、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、CD16ポリペプチドまたはその断片は、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、抗ROR1結合ドメインは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、リンカー領域は、(G4S)nを含み、n=1~4である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされたTFPと、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質複合体1つ当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた少なくとも2つの異なるTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの実施形態において、TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、ヒトまたはヒト化抗CD20結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP及び第2のTFPと、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質複合体1つ当たり第1のTFP分子及び第2のTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP分子及び第2のTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、TFP分子は、ヒトもしくはヒト化CD16ポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、TFP分子は、ヒトまたはヒト化抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、TFP分子は、ヒトNKG2Dポリペプチドまたはその断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含み、第1のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第2のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第1のTFP分子及び第2のTFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含み、第1のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第2のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第1のTFP分子及び第2のTFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載される核酸、または本明細書に記載されるベクターをT細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、in vitro転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、本明細書に記載されるTFP分子をコードする核酸を含む、RNA改変細胞の集団を作製する方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、in vitro転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子をコードする核酸を含む、RNA改変細胞の集団を作製する方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態において、細胞は、自己T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ROR1の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、NKG2D受容体の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態において、抗NKG2D受容体の発現を伴う疾患は、形成異常、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、抗NKG2D受容体の発現を伴う非がん関連適応症、炎症性疾患、リウマチ様関節炎、大腸炎、セリアック病、腸炎症、多発性硬化症、円形脱毛症、1型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、及び2型糖尿病に関連するメタボリックシンドロームからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗NKG2D受容体の発現を伴う疾患は、感染症である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、CD19、BCMAまたはCD22の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態において、CD19、BCMAまたはCD22発現を伴う疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連適応症、BCMAの発現を伴う非がん関連適応症、及びCD22の発現を伴う非がん関連適応症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ROR1発現を伴う疾患は、形成異常、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びROR1の発現を伴う非がん関連適応症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、疾患は、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、卵巣癌、卵巣ミュラー管混合癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、腎癌、結腸癌、胃癌、自己免疫疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態において、疾患は、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、卵巣癌、卵巣ミュラー管混合癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、腎癌、結腸癌、胃癌、ROR1発現を伴う疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態において、疾患は、ユーイング肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、黒色腫、白血病(例えば、AML、CML及びCLL)、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌、結腸癌、腎癌及び前立腺癌からなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態において、疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、CD19、BCMAまたはCD22発現を伴う疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選択される血液がんである。
いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の有効性を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、腫瘍細胞上の細胞表面結合抗原に特異的に結合する抗体またはその断片と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の有効性を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、抗原ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、リガンドNKG2Dを含む抗原ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、細胞表面結合抗原に結合することができるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、抗ROR1キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)、抗BCMA CAR、抗CD22 CAR、抗CD19 CAR及び抗BCMA CAR、抗CD19CAR及び抗CD22CAR、またはこれらの組み合わせを発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、第2の治療薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、ROR1に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、TFP分子を発現する細胞は、抗NKG2D受容体に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、CD19、BCMAまたはCD22に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、薬剤として使用するための、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、薬剤として使用するための本明細書に記載される単離された核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ROR1の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含み、当該哺乳動物において放出されるサイトカインが、抗ROR1キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、抗NKG2D受容体の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含み、当該哺乳動物において放出されるサイトカインが、リガンドNKG2Dを含む抗原ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、CD19、BCMAまたはCD22の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞を投与することを含み、当該哺乳動物において放出されるサイトカインが、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)、抗BCMA CAR、抗CD22 CAR、抗CD19 CAR及び抗BCMA CAR、抗CD19CAR及び抗CD22CAR、またはこれらの組み合わせを発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない、方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニットと、第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のTFP;及び第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むTCRサブユニットと、第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第2のTFPをコードし、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインは、作動可能に連結され、第1のTFP及び第2のTFPは、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、第2のTFPのTCRサブユニットは、TCRアルファ、TCRベータ、CD3イプシロン、CD3ガンマ及びCD3デルタからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性断片に由来する刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗CD19結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗B細胞成熟抗原(BCMA)結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第1の抗原結合ドメインまたは第2の抗原結合ドメインは、抗CD22結合ドメインである。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD19結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)と、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗BCMA結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)とをコードする、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換え核酸分子であって、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD19結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)と、T細胞受容体(TCR)サブユニット、抗CD22結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)とをコードする、単離された組み換え核酸分子である。
いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット及び第1の抗体ドメインが作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニット及び第2の抗体ドメインが作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第1のTFP、第2のTFP、またはその両方は、T細胞で発現される際にTCRに組み込まれる。いくつかの実施形態において、コードされた第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続されるか、コードされた第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続されるか、または第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、かつコードされた第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインとを含み、(i)、(ii)及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、CD3イプシロン、CD3ガンマもしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、またはその両方は、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、またはその両方は、抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、第1のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトもしくはヒト化抗体ドメイン、またはその両方は、scFvまたはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)配列番号25、配列番号27及び配列番号29に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗CD19軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)配列番号31、配列番号33及び配列番号35に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗CD19重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は、配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号49の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は、配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号51の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)配列番号37、配列番号39及び配列番号41に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗BCMA軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)配列番号43、配列番号45及び配列番号47に対してそれぞれ70~100%の配列同一性を有する、抗BCMA重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、軽鎖可変領域は、配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号53の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、重鎖可変領域は、配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列、または配列番号55の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、抗CD22抗原結合ドメインは、本明細書に記載される可変領域または本明細書に記載される1つ以上のCDRを含む。
いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP、コードされた第2のTFP、またはその両方は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP及びコードされた第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、コードされた第1のTFP及びコードされた第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及び4-1BB(CD137)、ならびにそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、プロテアーゼ切断部位を更に含む。いくつかの実施形態において、それに対する少なくとも1つから20以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または第1のTFP、第2のTFP、もしくはその両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、mRNAである。いくつかの実施形態において、第1のTFP、第2のTFP、またはその両方は、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。いくつかの実施形態において、当該ITAMが、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMの代わりに使用される。いくつかの実施形態において、ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMの代わりに使用される。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される核酸分子によってコードされた、単離されたポリペプチド分子である。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは、第1の核酸分子によってコードされた第1のポリペプチドと、第2の核酸分子によってコードされた第2のポリペプチドとを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えTFP分子である。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含む、単離された組み換えTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えの第1のTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離された組み換えの第1のTFP分子である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えの第1のTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第1のTFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離された組み換えの第1のTFP分子である。
いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメイン、抗BCMA結合ドメイン、抗CD22結合ドメインまたはこれらの組み合わせは、scFvまたはVHドメインである。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する重鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する軽鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA結合ドメインは、配列番号55のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する重鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA結合ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する軽鎖、その機能性断片、またはその少なくとも1つから30以下の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗CD22結合ドメインは、本明細書に記載される可変領域または本明細書に記載される1つ以上のCDRを含む。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及びその少なくとも1つから20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、抗BCMA結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、抗CD22結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。いくつかの実施形態において、単離された組み換えTFP分子は、共刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子は、リーダー配列を更に含む。いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された組み換えTFPをコードする配列を含む、核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、第1のTFP分子をコードする第1の核酸と、第2のTFP分子をコードする第2の核酸とを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、DNA及びRNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、in vitro転写された核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、ポリ(A)テールをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、3’UTR配列を更に含む。いくつかの実施形態において、核酸は、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を更に含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子をコードする核酸分子を含む、ベクターである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、a)第1のTFPをコードする第1の核酸分子を含む第1のベクターと、b)第2のTFPをコードする第2の核酸分子を含む第2のベクターとを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、in vitro転写されたベクターである。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、ポリ(A)テールを更にコードする。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、3’UTRを更にコードする。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位を更にコードする。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子、本明細書に記載される核酸、または本明細書に記載されるベクターを含む、細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態において、T細胞は、CD8またはCD4T細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞は、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを、細胞内シグナル伝達ドメインに由来する正のシグナルを備える第2のポリペプチドに会合して含む抑制分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態において、抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、単離された組み換えTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、単離された組み換えTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子とを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトまたはヒト化CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの実施形態において、TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメインは、第1のリンカー配列によって、第1のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続され、ヒトまたはヒト化抗CD20結合ドメインは、第2のリンカー配列によって、第2のTFP分子のTCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの実施形態において、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)nを含み、n=1~4である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP及び第2のTFPと、少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質複合体1つ当たり第1のTFP分子及び第2のTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP分子及び第2のTFP分子を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含み、第1のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第2のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗BCMA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第1のTFP分子及び第2のTFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含み、第1のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD19結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第2のTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CD22結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、第1のTFP分子及び第2のTFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、本明細書に記載される単離された核酸分子によってコードされた第1のTFP分子及び第2のTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載される核酸、または本明細書に記載されるベクターをT細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、in vitro転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、本明細書に記載される単離された組み換えTFP分子をコードする核酸を含む、RNA改変細胞の集団を作製する方法である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞もしくは細胞集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態において、細胞は、自己T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、CD19、BCMAまたはCD22の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞もしくは細胞集団を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態において、CD19、BCMAまたはCD22発現を伴う疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連適応症、BCMAの発現を伴う非がん関連適応症、及びCD22の発現を伴う非がん関連適応症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、CD19、BCMAまたはCD22発現を伴う疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選択される血液がんである。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の有効性を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、当該哺乳動物において放出されるサイトカインは、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)、抗BCMA CAR、抗CD22 CAR、抗CD19 CAR及び抗BCMA CAR、抗CD19 CAR及び抗CD22 CAR、またはこれらの組み合わせを発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、CD19、BCMAまたはCD22に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、薬剤として使用するための、本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞もしくは細胞集団である。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、CD19、BCMAまたはCD22の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、有効量の本明細書に記載される単離された核酸分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子、本明細書に記載されるポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載されるTFP分子、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される細胞もしくは細胞集団を投与することを含み、当該哺乳動物において放出されるサイトカインが、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)、抗BCMA CAR、抗CD22 CAR、抗CD19 CAR及び抗BCMA CAR、抗CD19CAR及び抗CD22CAR、またはこれらの組み合わせを発現するT細胞の有効量が投与された哺乳動物と比較して、少ない、方法である。
参照による援用
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書で開示されるがん細胞を二重標的化する方法のいくつかを示す図面である。腫瘍細胞抗原標的であるBCMA及びCD19は、例示的な抗原である。図は、T細胞を円で示す。白い円は、CD3イプシロンサブユニットに結合された抗CD19 TFPを有するTFPを形質導入したT細胞の例を示す。黒い円は、CD3イプシロン(ε)またはガンマ(γ)サブユニットに結合された抗BCMA TFPを有するTFPを形質導入したT細胞の例を示す。「黒」及び「白」の細胞を混合して、抗BCMA TFP及び抗CD19 TFPの両方を含むT細胞集団を作製する。灰色の細胞は、2種類のレンチウイルス(すなわち、それぞれが異なる抗腫瘍抗原に対して特異性を有する(すなわち、scFv))を単一のT細胞集団に形質導入すること、または(a)1つのTCRサブユニット上の第1の抗腫瘍抗原scFvと、第2のTCRサブユニット上の第2の抗腫瘍抗原scFvとを有するレンチウイルス、もしくは(b)単一のTCRサブユニットに結合され、作動可能に連結された(例えば、G4Sリンカーによって)第1の抗腫瘍抗原scFv及び第2の抗腫瘍抗原scFvを有するレンチウイルスを単一のT細胞集団に形質導入することのいずれかによって作製された、同時形質導入T細胞集団の例を示す。 2つの例示的な方法を示す図面であり、単一のTCRが二重特異性を有するように作製される。TCRサブユニットであるイプシロン、デルタ、アルファ、ベータ、ガンマ及びイプシロンを細胞膜に沿って左から右に示す。白の楕円は、抗BCMA scFvを表し、網掛けの楕円は、抗CD19 scFvを表す。一実施形態において、scFvは、第1のリンカーを介して互いに作動可能に接続され、例えば、イプシロンサブユニットに連結された第2のリンカーを介してTCRに作動可能に接続される(図において、左のイプシロンサブユニットに示される)。別の実施形態において、scFvは、それぞれTCRサブユニットに作動可能に接続され、本例では、リンカーを介してガンマサブユニットに作動可能に接続された抗CD19 scFvと、リンカーを介してイプシロンサブユニットに作動可能に接続された抗BCMA scFvとを示す(図において、ガンマ及び右のイプシロンに示される)。 FACSによって測定したTFP T細胞の表面発現を示す。図2Aは、実施例5に記載されているNKG2D特異的TFP-T細胞の表面発現を示す。単量体及び二量体NKG2D CD3ε TFP T細胞はいずれも非形質導入(「NT」)と比較して発現を示し、二量体NKG2D TFP T細胞が最も高度に発現された。 FACSによって測定したTFP T細胞の表面発現を示す。図2Bは、抗BCMA及び/または抗CD19を形質導入したT細胞のFACS解析を示す一連の図である。細胞は、CD8(y軸)及び抗Fab(上の列)またはBCMA-Fc(下の列)のいずれか(x軸)の表面発現によってソーティングした。空のベクター、抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3εと抗BCMA-CD3εの両方、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した細胞からの結果を示す。 CD20Raji細胞に抗CD20抗体リツキシマブが結合している模式図を示す。リツキシマブには、CD16 TFPを形質導入したT細胞が結合し、これにより、細胞溶解が誘導される(図3A)。非グリコシル化リツキシマブが使用される場合、CD16 TFPは、抗体に結合することができず、そのため、標的細胞の溶解は誘導されない(図3B)。 図4Aは、CD16(抗CD16、x軸)及びCD3(y軸)について染色した細胞上のTFPの表面発現の確認を示す。非形質導入細胞またはCD16-CD3ε TFP、CD16-CD3γ TFP、CD16-CD3δ TFP及びCD16-CD3β構築物を形質導入した細胞のいずれか(上の列)と、非形質導入細胞、CD16-CD28ζ CAR、CD16-41BBζ CAR及び陽性対照の抗CD19-CD3ε TFPを形質導入した細胞のいずれかが左から右に示されている。 例示的なZenon染色の結果を示す。方法の正確性を実証するために、未染色または抗CD19により染色されるいずれかのRaji細胞(CD19及びCD20の両方を発現する)を、抗CD19 TFPを使用する上記方法に従って処理した。 図4Cは、リツキシマブと非グリコシル化リツキシマブの両方がCD19Raji細胞に結合できたことを示している。 単量体及び二量体の両方の、NKG2D ε-TFP T細胞の構造、及びNKG2D ε-TFP構築物を有するレンチウイルスベクターの図を示す。上のパネルは、単量体または二量体のNKG2D結合因子のいずれかを有するNKG2D特異的サブユニットを含む、完全なT細胞受容体を示す。下のパネルは、構築物のレイアウトの模式図を示す。 ULBP2ペプチドで刺激するとNKG2D-CD3ε TFP-T細胞が増殖することを示す、Zenon染色の図である。OVCAR3及びOVCAR5細胞は、細胞表面上のNKGD2L発現が様々なレベルであるのに対し、AE17マウス細胞株は、NKG2DL発現に対して陰性であった。矢印は、TFP-T細胞の増殖を示す(72時間後のCFSE染料の希釈)。 腫瘍細胞上のNKG2DL抗原発現を示す。OVCAR3及びOVCAR5細胞は、細胞表面上のNKGD2L発現が様々なレベルであるのに対し、AE17マウス細胞株は、NKG2DL発現に対して陰性であった。矢印は、TFP-T細胞の増殖を示す(72時間後のCFSE染料の希釈)。 図7A卵巣癌細胞株OVCAR3及びOVCAR5、ならびに陰性対照のAE17メソテリン細胞株における、5:1のエフェクター細胞:標的細胞比でのNKG2Dリガンド陽性細胞に対する単量体及び二量体NKG2D ε-TFP T細胞活性のRTCA解析の図を示す。図は、NKG2D ε-TFP T細胞が、in vitroで、非形質導入T細胞(NT)を効果的に殺傷しないが、とりわけ、高いエフェクター細胞:標的細胞の比において、NKG2DL卵巣癌細胞を特異的に殺傷することを示す。 図7Bは、卵巣癌細胞株OVCAR3及びOVCAR5、ならびに陰性対照のAE17メソテリン細胞株における、1:1のエフェクター細胞:標的細胞比でのNKG2Dリガンド陽性細胞に対する単量体及び二量体NKG2D ε-TFP T細胞活性のRTCA解析の図を示す。図は、NKG2D ε-TFP T細胞が、in vitroで、非形質導入T細胞(NT)を効果的に殺傷しないが、とりわけ、高いエフェクター細胞:標的細胞の比において、NKG2DL卵巣癌細胞を特異的に殺傷することを示す。 図7Cは、卵巣癌細胞株OVCAR3及びOVCAR5、ならびに陰性対照のAE17メソテリン細胞株における、1:5のエフェクター細胞:標的細胞比でのNKG2Dリガンド陽性細胞に対する単量体及び二量体NKG2D ε-TFP T細胞活性のRTCA解析の図を示す。図は、NKG2D ε-TFP T細胞が、in vitroで、非形質導入T細胞(NT)を効果的に殺傷しないが、とりわけ、高いエフェクター細胞:標的細胞の比において、NKG2DL卵巣癌細胞を特異的に殺傷することを示す。 図8Aは、ルシフェラーゼアッセイで測定した腫瘍細胞溶解を示す一連のグラフである。T細胞には、空の発現ベクターを形質導入するか、次のTFP:抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3ε、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3ε、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した。形質導入したT細胞を、CD19を安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。T細胞を標的HeLa細胞と混合し、一緒に24時間インキュベートした。細胞を遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁した。ルシフェラーゼは、細胞溶解によって放出されるため、ルシフェラーゼ活性が高いほど細胞死の割合が大きくなる。 図8Bは、ルシフェラーゼアッセイで測定した腫瘍細胞溶解を示す一連のグラフである。T細胞には、空の発現ベクターを形質導入するか、次のTFP:抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3ε、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3ε、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した。形質導入したT細胞を、BCMAを安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。T細胞を標的HeLa細胞と混合し、一緒に24時間インキュベートした。細胞を遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁した。ルシフェラーゼは、細胞溶解によって放出されるため、ルシフェラーゼ活性が高いほど細胞死の割合が大きくなる。 図8Cは、ルシフェラーゼアッセイで測定した腫瘍細胞溶解を示す一連のグラフである。T細胞には、空の発現ベクターを形質導入するか、次のTFP:抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3ε、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3ε、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した。形質導入したT細胞を、CD19及びBCMAの両方を安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。T細胞を標的HeLa細胞と混合し、一緒に24時間インキュベートした。細胞を遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁した。ルシフェラーゼは、細胞溶解によって放出されるため、ルシフェラーゼ活性が高いほど細胞死の割合が大きくなる。 図9Aは、図8に示す解析でペレット化した細胞の上清で測定したサイトカイン産生を示す一連のグラフである。Luminex(登録商標)ELISAアッセイを実施して、IFNγ(斜線の付いた棒)及びIL-2(無地の棒)の量を検出及び定量した。上記のように、形質導入したT細胞を、CD19を安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。総サイトカイン産生をY軸に示す。 図9Bは、図8に示す解析でペレット化した細胞の上清で測定したサイトカイン産生を示す一連のグラフである。Luminex(登録商標)ELISAアッセイを実施して、IFNγ(斜線の付いた棒)及びIL-2(無地の棒)の量を検出及び定量した。上記のように、形質導入したT細胞を、BCMAを安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。総サイトカイン産生をY軸に示す。 図9Cは、図8に示す解析でペレット化した細胞の上清で測定したサイトカイン産生を示す一連のグラフである。Luminex(登録商標)ELISAアッセイを実施して、IFNγ(斜線の付いた棒)及びIL-2(無地の棒)の量を検出及び定量した。上記のように、形質導入したT細胞を、CD19及びBCMAの両方を安定的に発現するHeLa細胞とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。総サイトカイン産生をY軸に示す。 実施例9に記載されるReal Time Cytotoxicity Assay(RTCA)の結果を示す一連の図である。細胞傷害性を示す正規化された細胞指数をリアルタイム細胞アナライザー(RTCA)アッセイで決定した。表2は、実施例で使用した構築物についてまとめたものである。 実施例9に記載されるReal Time Cytotoxicity Assay(RTCA)の結果を示す一連の図である。細胞傷害性を示す正規化された細胞指数をリアルタイム細胞アナライザー(RTCA)アッセイで決定した。表2は、実施例で使用した構築物についてまとめたものである。 実施例9に記載されるReal Time Cytotoxicity Assay(RTCA)の結果を示す一連の図である。細胞傷害性を示す正規化された細胞指数をリアルタイム細胞アナライザー(RTCA)アッセイで決定した。表2は、実施例で使用した構築物についてまとめたものである。 実施例9に記載されるReal Time Cytotoxicity Assay(RTCA)の結果を示す一連の図である。細胞傷害性を示す正規化された細胞指数をリアルタイム細胞アナライザー(RTCA)アッセイで決定した。表2は、実施例で使用した構築物についてまとめたものである。 CD16陽性T細胞が、1μg/mlの抗CD20(リツキシマブ)の存在下ではCD20陽性腫瘍溶解に有効であり、非グリコシル化CD20の存在下では有効でないことを示す2つのグラフである。図11Aは、リツキシマブと様々な形質導入T細胞の組み合わせによるRaji細胞溶解を示し、図11Bは、非グリコシル化リツキシマブとの同じ組み合わせを示す。 Raji細胞及びリツキシマブと組み合わせたTFP形質導入T細胞によって産生されるインターフェロンガンマ(IFN-γ、図12A)及びインターロイキン2(IL-2、図12B)のレベルが、CAR形質導入T細胞によって産生される高いサイトカインレベルと比較して、低いことを示す、2つのグラフである。 Dynabeads(商標)+IL-2条件を用いたフローサイトメトリーによるNKG2D ε-TFP T細胞のex vivo増殖の実験設計及び形質導入効率の模式図である。アイソタイプマッチを陰性対照として使用した。 単量体及び二量体NKG2D ε-TFP T細胞の対応する形質導入効率である。アイソタイプマッチを陰性対照として使用した。 複数の固形腫瘍細胞株におけるNKG2Dリガンド発現と、NKG2D ε-TFP T細胞によるin vitro腫瘍細胞溶解を示す。図14Aは、MSTO-MSLN-Luc細胞、OVCAR3-Luc、SaOS2-Luc及びSKOV3-Luc細胞に抗ULBP1、抗ULBP2/5/6、抗ULBP3、抗ULBP4及び抗MICA/B(左から右)を使用して実施した、NKG2Dリガンドに対するZenon染色を示す。各グラフにおいて、上の線は、NKG2Dリガンドであり、中央の線は、アイソタイプコントロールまたは二次抗体単独であり、下の線は、未染色細胞である。 複数の固形腫瘍細胞株におけるNKG2Dリガンド発現と、NKG2D ε-TFP T細胞によるin vitro腫瘍細胞溶解を示す。図14Bは、ルシフェラーゼアッセイを使用した24時間の共培養のNKG2D単量体及び/または二量体ε-TFP T細胞によるin vitro腫瘍溶解を示す。 複数の固形腫瘍細胞株におけるNKG2Dリガンド発現と、NKG2D ε-TFP T細胞によるin vitro腫瘍細胞溶解を示す。図14Cは、A549、A431、U373及びPC-3腫瘍細胞株におけるULBP2/5/6及びMICA/B発現と、ルシフェラーゼアッセイを使用した24時間の共培養のNKG2D二量体ε-TFP T細胞による腫瘍溶解を示す。 複数の固形腫瘍細胞株におけるNKG2Dリガンド発現と、NKG2D ε-TFP T細胞によるin vitro腫瘍細胞溶解を示す。図14Dは、図14Cに示される結果のグラフを示す。 NSGマウスのメソテリン発現腫瘍異種移植におけるNKG2D ε-TFP T細胞のin vivo有効性を示す一連のグラフである。図15Aは、注射日のMSTO-MLSN細胞におけるNKG2Dリガンド(ULBP2/5/6及びMICA/B)発現を示す(腫瘍QC)。 NSGマウスのメソテリン発現腫瘍異種移植におけるNKG2D ε-TFP T細胞のin vivo有効性を示す一連のグラフである。図15Bは、注射日のNT及びNKG2D二量体ε-TFP T細胞におけるNKG2D発現を示す(T細胞QC)。 NSGマウスのメソテリン発現腫瘍異種移植におけるNKG2D ε-TFP T細胞のin vivo有効性を示す一連のグラフである。図15Cは、2回投与の非形質導入(「NT」、左のパネル)またはNKG2D二量体ε-TFP T細胞を用いて2用量:5×10個のNKG2D ε-TFP細胞及び1×10個のNKG2D ε-TFP細胞で処置したマウスの腫瘍体積を示す。T細胞は、試験日0日目と20日目に注射した。グラフ中の各線は、1匹のマウスを表す。 NSGマウスのメソテリン発現腫瘍異種移植におけるNKG2D ε-TFP T細胞のin vivo有効性を示す一連のグラフである。図15Dは、2回投与のNTまたはNKG2D二量体ε-TFP T細胞を用いて処置したマウスの生存率を示す。NT対NKG2D二量体ε-TFP T、P<0.05。
本明細書で提供されるのは、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質またはT細胞集団を使用した、がんなどの疾患を治療するための組成物及び使用方法である。本明細書で使用されるとき、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、TCRを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、当該TCRは、一般に、i)標的細胞上の表面抗原に結合し、ii)典型的に、T細胞の細胞内またはその表面上の同じ場所に位置する場合、インタクトTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。本明細書で提供されるTFPは、キメラ抗原受容体と比較して、大きな利点を提供する。「キメラ抗原受容体」または代替的に「CAR」という用語は、scFvの形での細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書において「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)を含む、組み換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中央にある細胞内シグナル伝達ドメインは、通常、TCR複合体に関連して見出されるCD3ゼータ鎖に由来する。CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、4-1BB(すなわち、CD137)、CD27及び/またはCD28などの少なくとも1つの共刺激分子に由来する1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
一態様において、本明細書に記載されるのは、TCRサブユニットと、抗BCMA、抗CD19、抗CD20、抗CD22などの抗腫瘍抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された核酸分子である。いくつかの実施形態において、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメインを含む。他の実施形態において、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインを含む。更に他の実施形態において、TCRサブユニットは、TCR細胞内ドメインを含む。更なる実施形態において、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインとを含み、(i)、(ii)及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。なお更なる実施形態において、TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマもしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、TCR細胞内ドメインを含む。なお更なる実施形態において、TCRサブユニットは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、またはそれに対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、scFvまたはVドメインを含む。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、(i)本明細書で提供される任意の抗腫瘍関連抗原軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び/または(ii)本明細書で提供される任意の抗腫瘍関連抗原重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2及びHC CDR3のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から30、20もしくは10以下の修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。他の実施形態において、重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から30、20もしくは10以下の修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、TFPは、T細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロンもしくはCD3ガンマ、またはその機能性断片、またはそれに対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から20、10もしくは5以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態において、コードされたTFPは、TCRのアルファ鎖、ベータ鎖もしくはTCRサブユニットCD3イプシロン、CD3ガンマ及びCD3デルタ、またはその機能性断片、またはそれに対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から20、10もしくは5以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、コードされたTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154、その機能性断片(複数可)、ならびにそれに対する少なくとも1つ、2つまたは3つの修飾から20以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
いくつかの場合において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの場合において、共刺激ドメインは、DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及び4-1BB(CD137)、ならびにそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの場合において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。いくつかの場合において、単離された核酸分子は、mRNAである。
いくつかの場合において、TFPは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対して少なくとも1つから20以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。いくつかの場合において、当該ITAMが、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMの代わりに使用される。いくつかの場合において、ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMの代わりに使用される。
いくつかの場合において、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの場合において、ヌクレオチド類似体は、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、T-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、T-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホロアミダイトからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、コードされた抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの場合において、コードされたリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~4である。いくつかの場合において、コードされたリンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、コードされた長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、コードされたリンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、コードされた短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。
本明細書で提供されるのはまた、前述の核酸分子のいずれかによってコードされた単離されたポリペプチド分子である。
本明細書で提供されるのはまた、別の態様において、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、単離されたT細胞受容体融合タンパク質(TFP)分子である。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、scFvまたはVドメインである。他の実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖、またはその機能性断片、または本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から30、20もしくは10以下の修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、T細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロンもしくはCD3ガンマ、またはそれに対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾から20、10もしくは5以下の修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む、TCR細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの場合において、リンカー領域は、(GS)を含み、n=1~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
いくつかの実施形態において、単離されたTFP分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。他の実施形態において、単離されたTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。更に他の実施形態において、単離されたTFP分子は、リーダー配列を更に含む。
本明細書で提供されるのはまた、前述のTFP分子のいずれかをコードする核酸分子を含む、ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、in vitro転写されたベクターである。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸配列は、ポリ(A)テールを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸配列は、3’UTRを更に含む。
また、本明細書で提供されるのは、本記載のベクターのいずれかを含む、細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、CD8またはCD4T細胞である。一実施形態において、CD8細胞は、ガンマ-デルタT細胞である。別の実施形態において、CD8細胞は、NK-T細胞である。他の実施形態において、細胞は、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを、細胞内シグナル伝達ドメインに由来する正のシグナルを備える第2のポリペプチドに会合して含む抑制分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの場合において、抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、単離されたTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原(TAA)結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離されたTFP分子である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、単離されたTFP分子であって、ヒトまたはヒト化抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、TFP分子は、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離されたTFP分子である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞であって、1つ以上のTFP分子を含み、TFP分子は、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞である。別の態様において、細胞は、少なくとも2つの同一でないTFP分子を含む。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、i)ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、ii)少なくとも1つの内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
いくつかの実施形態において、TCRは、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロンまたはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその部分を含む。いくつかの実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によって、TCR細胞外ドメインに接続される。いくつかの場合において、リンカー領域は、(GS)を含み、n=1~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
本明細書で提供されるのはまた、本記載のタンパク質複合体のいずれか1つ当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8またはCD4T細胞である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、TFP分子は、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8またはCD4T細胞の中で、当該細胞において、及び/または当該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団であって、当該集団のT細胞は、本明細書で提供される単離された核酸分子によってコードされた少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8またはCD4T細胞の集団である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本記載のベクターのいずれかをT細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、in vitro転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、本記載のTFP分子のうちの1つ以上をコードする核酸を含む、RNA改変細胞の集団を作製する方法である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、当該哺乳動物に、本記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞の有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、細胞は、自己T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、当該哺乳動物に、本記載のTFP分子のいずれかを含む細胞の有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原発現を伴う疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病などの前がん状態から選択され、あるいは、腫瘍関連抗原の発現を伴う非がん関連適応症である。
いくつかの実施形態において、疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(「B-ALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「T-ALL」)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)を含むがこれらに限定されない1つ以上の急性白血病;慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)を含むがこれらに限定されない1つ以上の慢性白血病;B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞白血病、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び骨髄血液細胞の非有効的産生(または形成異常)によってまとめられる多様な血液状態の集合である「前白血病」、及び腫瘍関連抗原を発現する異型及び/または非典型的がん、悪性腫瘍、前がん性状態または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない腫瘍関連抗原発現を伴う疾患を含むがこれらに限定されない更なる血液がんまたは血液状態;ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、血液がんである。
いくつかの実施形態において、本記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に伴う1つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、本記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞は、腫瘍関連抗原に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
本明細書で提供されるのはまた、薬剤として使用するための、本記載の単離された核酸分子のいずれか、本記載の単離されたポリペプチド分子のいずれか、本記載の単離したTFPのいずれか、本記載のタンパク質複合体のいずれか、本記載のベクターのいずれかまたは本記載の細胞のいずれかである。
定義
別段の定義のない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
「a」及び「an」という用語は、当該冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多いこと(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
本明細書で使用されるとき、「約」は、状況に応じて、また当業者に知られているか、または当業者が知り得ることに応じて、プラスマイナス1パーセント未満または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30または30パーセント超を意味することができる。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定された特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例に従って、1以内または1を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大20%、最大10%、最大5%、または最大1%の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、「約」または「およそ」という用語は、10倍以内、5倍以内、より好ましくは2倍以内の値を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、その特定の値の許容誤差範囲内を意味するとみなされるものとする。「約」という用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有し得る。「約」という用語は、±10%を指し得る。「約」という用語は、±5%を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「対象(subject)」または「対象(subjects)」または「個体」には、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、飼育動物、農業用動物または野生動物、ならびに鳥類及び水生動物が含まれ得るが、これらに限定されない。「患者」は、本明細書で提供される組成物及び方法を必要とする疾患、障害もしくは状態に罹患しているか、その発症リスクがあるか、または別様にそれを必要とする、対象である。
本明細書で使用されるとき、「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善における成功の任意の兆しを指す。治療することは、例えば、疾患もしくは状態の1つ以上の症状の重症度を軽減、遅延もしくは緩和することを含み得、または、患者によって経験される疾患、欠陥、障害もしくは有害な状態などの症状の頻度を減少させることも含み得る。本明細書で使用されるとき、「治療または予防」は、疾患または状態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すために使用されることがあり、限定するものではないが、状態の完全な予防を含む、当該目的に向けた様々な結果を企図する。
本明細書で使用されるとき、「予防すること」は、患者における疾患または状態、例えば、腫瘍形成を防ぐことを指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクのある個体が本発明の方法で治療され、その後、当該腫瘍または他の形態のがんを発症しない場合、その疾患は、当該個体において、少なくともある期間にわたって予防されている。
本明細書で使用されるとき、「治療上有効な量」は、組成物またはその活性成分の量であって、当該組成物が投与される個体に対して、有益な作用をもたらすか、有害で有益でない事象を減少させるのに十分な量である。本明細書における「治療的有効量」は、1つ以上の所望される作用または望ましい(例えば、有益な)作用を生み出す投与のための用量を意味し、かかる投与は、所与の期間にわたって1回以上行われる。正確な用量は、治療の目的に依存し、当業者であれば、既知の技術を使用して見極めることができる。(例えば、Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);及びPickar,Dosage Calculations(1999)参照)。
本明細書で使用されるとき、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、TCRを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、当該TCRは、一般に、i)標的細胞上の表面抗原に結合し、ii)典型的に、T細胞の細胞内またはその表面上の同じ場所に位置する場合、インタクトTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。
本明細書で使用されるとき、「BCMA」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(TNFRSF17)及び分化クラスター269タンパク質(CD269)またはTNFRSF13Aとしても知られる、「B細胞成熟抗原」または「BCMA」または「BCM」を指し、ヒトではTNFRSF17遺伝子にコードされているタンパク質である。BCMAは、B細胞活性化因子(BAFF)を認識するTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。この受容体は、成熟Bリンパ球で優先的に発現され、B細胞発生及び自己免疫応答にとって重要であり得る。この受容体は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリーメンバー13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)に特異的に結合し、NF-κB及びMAPK8/JNK活性化をもたらすことが示されている。BCMAは、リガンドのBAFF及びAPRILに対する非グリコシル化内在性膜受容体である。BCMAのリガンドはまた、APRIL及びBAFFが結合するTACI(膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド相互作用因子)と、BAFFに限定的であるが高親和性を示すBAFF-R(BAFF受容体またはBR3)の更なる受容体にも結合することができる。これらの受容体及び対応するリガンドは、ともに、体液性免疫、B細胞発生及びホメオスタシスの異なる側面を調節する。
BCMAの発現は、典型的に、B細胞系列に限定され、末梢性B細胞の分化を増加させることが報告されている。BCMAは、ヒト形質芽細胞、扁桃、脾臓及び骨髄由来の形質細胞だけでなく、TACI-BAFFR低表現型を有する、扁桃メモリーB細胞及び胚中心B細胞によっても発現される(Darce et al,2007)。BCMAは、ナイーブB細胞及びメモリーB細胞には実質的に存在しない(Novak et al.,2004a and b)。BCMA抗原は、細胞表面上に発現されるので、抗体に接近可能であるが、ゴルジ体においても発現される。その発現プロファイルによって示唆されるように、BCMAシグナル伝達は、典型的にB細胞の生存及び増殖に関連しているが、B細胞分化の後期に重要であるとともに、骨髄形質細胞(O’Connor et al.,2004)及び形質芽細胞(Avery et al.,2003)の長期生存にも重要である。更に、BCMAは、高い親和性でAPRILに結合することから、BCMA-APRILシグナル伝達軸は、B細胞分化の後期において優位的であり、おそらく生理学的に最も関連する相互作用であることが示唆される。
ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、GenBank、UniProt及びSwiss-Protなどの公共データベースで得ることができる。例えば、ヒトBCMAのアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Protアクセッション番号Q02223で得ることができる。ヒトBCMAポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号Q02223-1:
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR(配列番号103)である。
ヒトCD19ポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P15391(またはP15391-2:
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR(配列番号104)である。
ヒトCD19をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM001178098で得ることができる。CD19は、例えば、ALL、CLL及び非ホジキンリンパ腫(NHL)を含む、ほとんどのB細胞系列のがんで発現される。CD19を発現する他の細胞については、以下の「CD19の発現を伴う疾患」の定義内で示す。CD19は、正常B細胞の前駆細胞の初期マーカーである。例えば、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)を参照されたい。一例において、TFPの抗原結合部分は、悪性B細胞及び正常B細胞上に発現されるCD19タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、結合する。
本明細書で使用されるとき、「CD22」という用語は、Bリンパ球細胞接着分子(BL-CAM)、シアル酸結合Ig様レクチン2(Siglec-2)及びT細胞表面抗原Leu-14としても知られる、B細胞受容体CD22を指す。CD22は、B細胞間の相互作用を媒介し、B細胞のリンパ組織への局在に関与し得る。CD22は、シアル酸化糖タンパク質に結合し、そのうちの1つは、CD45であり、アルファ-2,6-結合シアル酸に優先的に結合する。シアル酸認識部位は、同じ細胞表面上のシアル酸とのシス相互作用によってマスキングされ得る。リガンド誘導性チロシンリン酸化がなされると、免疫応答は、B細胞抗原受容体シグナル伝達の制御に関与するようである。CD22は、Srcファミリーチロシンキナーゼとの相互作用を介して正の制御を行う役割を果たし、また、SH2ドメインを介して細胞質ホスファターゼを動員し、シグナル伝達分子の脱リン酸化によりシグナル伝達を遮断することによって抑制性受容体としても作用し得る。
CD22標準配列は、ベータアイソフォーム(5つのアイソフォームのうちの1つ)であり、UniProtアクセッション番号P20273-1で見つけることができ、次の配列に対応する:
MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH(配列番号105)。
本明細書で使用されるとき、「ROR1」という用語は、神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体関連1(NTRKR1)またはdJ537F10.1としても知られる、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通型受容体ROR1を指し得る。ROR1は、マウス及びヒトにおいて、ROR1遺伝子にコードされているタンパク質であり、ROR2とともに、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体(ROR)ファミリーのメンバーである。ROR1は、グリコシル化I型膜タンパク質であり、触媒活性を欠く偽キナーゼであり、非標準Wntシグナル伝達経路と相互作用し得る。RORは、2つの別個の細胞外システインリッチドメインと、1つの膜貫通ドメインとを含有する。細胞内部分には、ROR1は、1つのチロシンキナーゼドメイン、2つのセリン/トレオニンリッチドメイン及び1つのプロリンリッチドメインを有する。この遺伝子は、初期胚発生中に高度に発現するが、正常(すなわち、非がん性)成人組織においては非常に低いレベルで発現される。この遺伝子の発現上昇は、B細胞慢性リンパ性白血病に関連している。選択的スプライシングにより、異なるアイソフォームをコードする複数の転写物バリアントが生じる。
ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、GenBank、UniProt及びSwiss-Protなどの公共データベースで得ることができる。例えば、ヒトROR1ポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号Q01973-1:MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVAIPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSAVRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWTEFQQEASLMAELHHPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHGDFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQSKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKRQLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNATTQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPPGYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLLPHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL(配列番号20)である。
ヒトROR1転写物バリアント1をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号XM_017001376で得ることができる。ヒトROR1転写物バリアント2をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号XM_011541526で得ることができる。ヒトROR1転写物バリアント3をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号XM_017001377で得ることができる。低レベルのROR1の発現が脂肪組織で認められ、膵臓、肺及び中間型B細胞のサブセットではより少ない発現が認められる。
本明細書で使用されるとき、「NKG2D」という用語は、NKG2-D II型内在性膜タンパク質、NKG2-D、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーKメンバー1(KLRK)、NK細胞受容体D、NKG2-D活性化NK受容体及びCD314を指す。多くの免疫受容体は、別々のリガンド結合サブユニットとシグナル伝達サブユニットから構成されている。ナチュラルキラー(NK)及びT細胞において、DAP10は、ストレス誘導性及び腫瘍関連性の主要組織適合遺伝子複合体分子MICAの受容体であるNKG2Dとの活性化受容体複合体における細胞表面アダプタータンパク質として特定された。DAP10細胞質ドメイン内のSrc相同2(SH2)ドメイン結合部位は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3-キナーゼ)のp85サブユニットを動員することができ、NKG2D依存性シグナル伝達をもたらした。したがって、NKG2D-DAP10受容体複合体は、MICA担持腫瘍に対するNK細胞及びT細胞の応答を活性化する。
NKG2Dは、膜貫通ドメイン内の正に荷電したアルギニンとアダプターDAP10の膜貫通ドメイン内の負に荷電したアスパラギン酸との会合を介したC型レクチン様II型膜貫通糖タンパク質シグナルを有するホモ二量体である(Charles L.Sentman,Cancer Immunity(1 May 2013)Vol.13,p.8)。ヒトNK細胞及びCD8T細胞において、IL-2、IL-7、IL-12及びIL-15などのガンマ鎖サイトカインのレベルが高くなると、NKG2Dの上昇が観察された。IL-21、IFN-γ及びTGF-βは、NKG2D発現を低下させることが示されている。
NKG2Dリガンド(NKG2DL)には、MHC領域にコードされているMICA/B及びMHCクラスI関連タンパク質の第2ファミリーULBP(レチノイン酸早期転写物(RAET)としても知られる)が含まれる(Bahram et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,6259-6263;Bauer et al.,1999,Science,Jul 30;285(5428):727-9)。MICA/Bタンパク質は、MHCファミリーの一部であるが、抗原を提示せず、β2-ミクログロブリンと会合しない。現在までに、ULBP1~6の6つの遺伝子がULBPファミリーに属するものとして特定されている(Cosman et al.,2001,Immunity Feb;14(2):123-33)。これらの分子は、55~60%相同のアミノ酸配列であり、MICまたはMHCとの関係は等しく遠い。機能上、ULBPは、β2-ミクログロブリンに結合せず、抗原ペプチドを提示せず、α3ドメインを欠いている(Eagle et al.,PLoS One4:1-14,2009;Eagle et al.,Eur J Immunol39:3207-30164:1-14,2009)。ULBPは、GPIアンカーを介して、細胞膜に結合している。
NKG2Dリガンドは、結腸、肝臓、胃、乳房、卵巣及び肺に由来する腫瘍細胞の表面上に発現される。また、AML、ALL、CML、CLLを含む非固形腫瘍でも発現される。NKG2DL発現の上昇は、乳癌患者の再発率の高さと相関する。
ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、GenBank、UniProt及びSwiss-Protなどの公共データベースで得ることができる。例えば、ヒト標準NKG2D配列(アイソフォーム1)は、UniProtアクセッション番号P26718-1に対応し、配列MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(配列番号14)を有する。一実施形態において、TFPに使用される断片は、細胞外ドメイン配列NSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(配列番号110)を含む。
本明細書で使用されるとき、「CD16」という用語は、2つの異なるアイソフォーム:Fcガンマ受容体IIIa(CD16、CD16a、CD16、CD16A、FcG3、FcGR3、FcGRIII、FcR-10、FcRIII、FcRIIIA、IGFR3、IMD20としても知られる)及びFcガンマ受容体IIIb(FCGR3B、UniProtKBQ9ULV2)で発現される、50~80kDaの糖タンパク質を指し得る。膜貫通型は、ヒトNK細胞、マクロファージ及びマスト細胞に認められ、一方、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合型は、好中球に存在する。ヒトCD16抗原は、凝集したIgGに対する低親和性受容体である。膜貫通型は、シグナル伝達、NK細胞活性化及び抗体依存性細胞傷害の役割を担う。
「V158アレル」または「V158バリアント」は、残基158にバリンを有するCD16ポリペプチドを意味する。ヒト集団において、2つの天然CD16アレルがあり、残基158にフェニルアラニン(F)またはバリン(V)を有するものである。IgG1抗体のFc領域に対する親和性は、V158アレルのほうがより高いので、一実施形態において、本明細書で開示されるTFPは、V158 CD16ポリペプチドを含む。2つの「V」アレルを有する患者は、VFまたはFF遺伝子型を有する患者よりも、抗体に基づくがん療法に良好に応答する。本明細書で開示される方法は、VFまたはFF遺伝子型を有する患者において、IgG1治療薬に対する患者の応答を向上させる方法を提供する。例えば、Kudo et al.(2013)Cancer Res;74(1);1-11(参照により本明細書に援用される)を参照されたい。
ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、GenBank、UniProt及びSwiss-Protなどの公共データベースで得ることができる。例えば、ヒトCD16アイソフォームAは、UniProtアクセッション番号P08637であり、配列:MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(配列番号23)を有する。
一実施形態において、CD16 TFP組成物は、配列番号23を含む。別の実施形態において、CD16 TFP組成物は、配列番号24を含み、これは、配列番号23に示される配列のV158変異体であり、配列MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(配列番号24)を有する。FCRG3A(CD16)のV158多型は、高親和性の免疫グロブリンFc受容体をコードし、抗体療法に対する好ましい応答と関係する(例えば、Kudo et al.,Cancer Res;74(1);93-103(2013)参照(参照により本明細書に援用される))。
抗体またはその抗体断片を含むTFP組成物の部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片(sdAb)、マウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体に由来する一本鎖抗体(scFv)を含む、連続するポリペプチド鎖の部分として発現される、様々な形態で存在し得る。(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.;Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.;Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。一態様において、TFP組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。更なる態様において、TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体断片を含む。
「抗原」または「Ag」という用語は、抗体によって特異的に結合され得る分子、または別様に免疫応答を誘発する分子を指し得る。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。本明細書で使用されるとき、「がん抗原」または「がん関連抗原」という用語は、本明細書に記載される併用療法を用いて治療され得る悪性細胞または腫瘍細胞の表面上に発現される、任意のがん細胞マーカーを指し得、これらには、限定するものではないが、5T4、8H9、ανβθインテグリン、αvβ6インテグリン、アルファフェトプロテイン(AFP)、B7-H6、CA-125炭酸脱水酵素9(CA9)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD52、CD123、CD171、癌胎児性抗原(CEA)、EpCAM(上皮細胞接着分子)、E-カドヘリン、EMA(上皮細胞膜抗原)、EGFRvlll、上皮細胞糖タンパク質-2(EGP-2)、上皮細胞糖タンパク質-40(EGP-40)、ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2/neu/EGFR2、ErbB3/HER3、ErbB4、上皮性腫瘍抗原(ETA)、葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児型アセチルコリン受容体(AchR)、葉酸受容体-α、G250/CAIX、ガングリオシド2(GD2)、ガングリオシド3(GD3)、HLA-A1、HLA-A2、高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、IL-13受容体α2(IL-13Rα2)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、k-軽鎖、Lewis Y(LeY)、L1細胞接着分子、黒色腫関連抗原(MAGE-A1)、メソテリン、ムチン-1(MUC1)、ムチン-16(MUC16)、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)リガンド、神経細胞接着分子(NCAM)、NY-ESO-1、腫瘍胎児抗原(h5T4)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、mAb IgEが標的にするTAA、腫瘍関連糖タンパク質-72(TAG-72)、チロシナーゼ、及び血管内皮細胞増殖因子(VEGF)受容体が挙げられる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル起源もしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリンまたはその断片であってよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。
「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」という用語は、抗体の少なくとも一部分またはその組み換えバリアントであって、抗原及びその定義されたエピトープなどの標的に対する認識及び特異的結合を抗体断片に付与するのに十分なインタクト抗体の抗原結合ドメイン、すなわち、抗原決定可変領域を含有するものを指す。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)及びFv断片、一本鎖(sc)Fv(「scFv」)抗体断片、直鎖抗体、単一ドメイン抗体(「sdAb」と略される)(VまたはVのいずれか)、ラクダ科VHHドメイン、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「scFv」という用語は、軽鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片とを含む、融合タンパク質を指し、ここで、軽鎖及び重鎖可変領域は、短いフレキシブルポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、1本のポリペプチド鎖として発現され得、scFvは、その由来であるインタクト抗体の特異性を保持している。
抗体に関する「重鎖可変領域」または「V」(または、単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合、「VHH」)は、フレームワーク領域として知られる隣接するストレッチ間に介在する3つのCDRを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、CDRよりも高度に保存され、CDRを支持するスカフォールドを形成する。
指定されない限り、本明細書で使用されるとき、scFvは、V領域及びV領域を、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に対して、いずれの順序で有してもよく、すなわち、scFvは、V-リンカー-Vを含んでもよいし、V-リンカー-Vを含んでもよい。
抗体またはその抗体断片を含む本発明のTFP組成物の部分は、例えば、単一ドメイン抗体断片(sdAb)または重鎖抗体HCAb242:423-426)を含む、抗原結合ドメインが、連続したポリペプチド鎖の一部分として発現される、様々な形態で存在し得る。一態様において、本発明のTFP組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。更なる態様において、TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体断片を含む。
「抗体重鎖」という用語は、天然に生じる立体構造で抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きいほうを指し、通常、その抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に生じる立体構造で抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さいほうを指す。カッパ(「κ」)軽鎖及びラムダ(「λ」)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組み換え抗体」という用語は、組み換えDNA技術を使用して作製される抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母の発現系によって発現される抗体などを指す。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子であって、抗体タンパク質を発現するDNA分子の合成、または抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるものとし、ここで、DNAまたはアミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能であり、既知である組み換えDNAまたはアミノ酸配列技術を使用して得られるものである。「抗原」または「Ag」という用語は、抗体が特異的に結合することができる分子、または別様に免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。
当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組み換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。したがって、当業者であれば、免疫応答を誘起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、本明細書で使用される用語「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者であれば、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、限定するものではないが、2つ以上の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘起するポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配置されることは容易にわかる。更に、当業者であれば、抗原は、「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成で作製されてもよいし、生体試料に由来してもよいし、ポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは、容易にわかる。かかる生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的要素の液体を挙げることができるが、これらに限定されない。
「抗腫瘍作用」という用語は、様々な手段で明示することができる生物学的作用を指し、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の延長、腫瘍細胞の増殖減少、腫瘍細胞の生存低下、またはがん性状態に伴う様々な生理学的症状の改善が挙げられるが、これらに限定されない。「抗腫瘍作用」はまた、第一に、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体が腫瘍の発生を予防する能力によって明示することができる。
「自己」という用語は、任意の物質であって、それが後に再導入される個体と同一の個体に由来する物質を指す。
「同種異系」という用語は、任意の物質であって、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する物質を指す。2つ以上の個体は、1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系と言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植物を指す。
「がん」という用語は、急速で無秩序な異常細胞の成長を特徴とする疾患を指し得る。がん細胞は、局所的に、または血流及びリンパ系を介して体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例については、本明細書に記載され、前立腺癌、乳癌、黒色腫、肉腫、大腸癌、膵癌、子宮癌、卵巣癌、胃癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胆管癌、扁平上皮細胞肺癌、中皮腫、副腎皮質癌、食道癌、頭頸部癌、肝癌、鼻咽腔癌、神経上皮性癌、腺様嚢胞癌、胸腺腫、慢性リンパ性白血病、グリオーマ、多形膠芽腫、神経芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病などが挙げられるが、これらに限定されない。
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に大きな影響を与えないか、それを変更しない、アミノ酸修飾を指す。かかる保存的修飾としては、アミノ酸の置換、付加及び欠失が挙げられる。修飾は、当該技術分野において知られている標準的技術、例えば、部位特異的変異導入及びPCRによる変異導入によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を含むアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を含むアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖を含むアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を含むアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐状側鎖を含むアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を含むアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。したがって、本発明のTFP内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更されたTFPは、本明細書に記載される機能アッセイを使用して試験することができる。
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、これにより、限定するものではないが、TCR/CD3複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現変更、及び/または細胞骨格構造の再構成などを媒介し得る。
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、T細胞によって発現される分子またはその一部分であって、T細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面に対して刺激を与えるように、TCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列(複数可)を提供するものである。一態様において、一次シグナルは、例えば、ペプチドを担持したMHC分子とTCR/CD3複合体との結合によって開始され、これが、限定するものではないが、増殖、活性化、分化などを含む、T細胞応答の媒介につながる。刺激を与えるように作用する一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは「ITAM」としても知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用なITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても知られる)及びCD66dに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、その表面上に、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を提示する、アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞など)などの免疫系細胞を指す。T細胞は、これらの複合体を、T細胞受容体(TCR)を使用して認識することができる。APCは、抗原を処理し、その抗原をT細胞に提示する。
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、TFP含有細胞、例えば、TFP発現T細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、TFP発現T細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性、及びサイトカインの分泌を含むヘルパーT細胞活性が挙げられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAM(「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」)を含み得る。ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bならびにCD66d DAP10及びDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより、限定するものではないが、増殖などのT細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり、効果的な免疫応答に必要とされる。共刺激分子としては、MHCクラス1分子、BTLA及びTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及び4-1BB(CD137)が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリー:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)及び活性化NK細胞受容体に代表され得る。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の細胞内部分全体もしくは天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能性断片を含み得る。「4-1BB」という用語は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、猿人類などに由来する同等の残基を有する、TNFRスーパーファミリーのメンバーを指し、「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2のアミノ酸残基214~255、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、猿人類などに由来する同等の残基として定義される。
「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNA及びmRNA)または定義されたアミノ酸配列のいずれかと、それに起因する生物学的特性とを有する、生物学的過程で他の高分子及び巨大分子の合成鋳型として機能する、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどの、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子、cDNAまたはRNAは、当該遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が、ある細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり、通常、配列表に記載されているヌクレオチド配列であるコーディング鎖と、遺伝子またはcDNAの転写鋳型として使用されるノンコーディング鎖は、いずれも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするとみなされ得る。
別段の指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重した型であって、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部の型においては、1つ以上のイントロンを含み得るという限りにおいて、イントロンを含み得る。
「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、本明細書において区別なく用いられ、本明細書に記載される化合物、配合物、物質または組成物の特定の生物学的結果または治療的結果を達成するのに有効な量を指す。
「内因性」という用語は、有機体、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。
「外因性」という用語は、有機体、細胞、組織もしくは系の外から導入されるか、または外部で産生される任意の物質を指す。
「発現」という用語は、プロモーターによって動作される特定のヌクレオチド配列の転写及び/または翻訳を指す。
「転移ベクター」という用語は、組成物であって、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞内部に送達するために使用することができる、組成物を指す。多数のベクターが当該技術分野において知られており、限定するものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられる。したがって、「転移ベクター」という用語には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、核酸の細胞内への移送を促進する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどを更に含むものと解釈されるものとする。ウイルス性転移ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは、発現するための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはin vitro発現系内で供給され得る。発現ベクターとしては、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドのものまたはリポソーム内に含まれたもの)及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)を含む、当該技術分野において知られている全てのものが挙げられる。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスのなかでも独特であり、宿主細胞のDNAに大量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV及びFIVは、全てのレンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、特に、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)に記載される自己不活化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用することができるレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(商標)遺伝子送達技術、LentigenのLENTIMAX(商標)ベクター系などが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者には既知である。
「相同」または「同一性」という用語は、2つの高分子間、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子などの2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。2つの分子の両方のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、その2つの分子は、当該位置で相同または同一である。2配列間の相同性は、一致または相同位置の数の一次関数であり、例えば、2つの配列中の位置の半分(例えば、10サブユニット長のポリマー中5つの位置)が相同である場合、2つの配列は、50%相同であり、位置の90%(例えば、10のうち9)が一致または相同の場合、2つの配列は、90%相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体断片)であって、レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来残基で置き換えられているものである。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体/抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にもみられない残基を含み得る。これらの改変により、抗体または抗体断片の性能を更に洗練及び最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインのほぼ全てを含み、CDR領域の全てまたはほぼ全ては、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、FR領域の全てまたはかなりの部分は、ヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的に、ヒト免疫グロブリンの定常領域(Fc)の少なくとも一部分を含み得る。更なる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525,1986;Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988;Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992を参照されたい。
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、分子全体がヒト起源であるか、またはヒト型の抗体もしくは免疫グロブリンに対して同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
「単離された」という用語は、天然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同核酸またはペプチドは、「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在することもできる。
本発明との関係において、一般に存在する核酸塩基についての以下の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
「作動可能に連結された」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたDNA配列は、互いに隣接し得、例えば、2つのタンパク質コーディング領域を連結するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)または胸骨内注射、腫瘍内または注入技術を含む。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)及びその高分子を指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、明確に示された配列はもちろんのこと、保存的に修飾されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、SNP及び相補的配列も暗黙的に包括する。特に、縮重コドン置換は、1つ以上の選択したコドン(または全てのコドン)の3番目の位置を、混合塩基及び/またはデオキシイノシン残基で置き換えた配列を生成することによって達成することができる(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);及びRossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、区別なく使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結された2つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当該技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも一般的に呼ばれる短鎖と、当該技術分野において、通常、タンパク質と呼ばれ、多数の種類が存在する長鎖との両方を指す。「ポリペプチド」は、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。
「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の場合において、この配列は、エンハンサー配列と、遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントとを含み得る。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現するものであってよい。
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されている場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で、当該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されている場合、プロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合に実質的に限り、当該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子によってコードまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されている場合、細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合に実質的に限り、当該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
scFvとの関係において使用される「リンカー」及び「フレキシブルポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン及び/またはセリン残基などのアミノ酸から構成され、単独でまたは組み合わせて使用して、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを連結するためのペプチドリンカーを指す。一実施形態において、フレキシブルポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)を含み、nは、1以上の整数である。例えば、n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9及びn=10である。一実施形態において、フレキシブルポリペプチドリンカーは、(GlySer)または(GlySer)を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、リンカーは、(GlySer)、(GlySer)または(GlySer)の複数の繰り返しを含む。WO2012/138475(参照により本明細書に援用される)に記載されているリンカーもまた、本発明の範囲内である。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
本明細書で使用されるとき、5’キャップ(RNAキャップ、RNA 7-メチルグアノシンキャップまたはRNA m7Gキャップとも称される)は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの「フロント」または5’末端に付加される修飾グアニンヌクレオチドである。5’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びリボヌクレアーゼからの保護に不可欠である。キャップ付加は、転写と対であり、転写と同時に生じるため、互いに影響し合う。転写の開始直後に、合成中のmRNAの5’末端は、RNAポリメラーゼと会合しているキャップ合成複合体に結合する。この酵素複合体は、mRNAキャッピングに必要とされる化学反応を媒介する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、mRNAの機能性、例えば、その安定性または翻訳効率を調節するために改変され得る。
本明細書で使用されるとき、「in vitro転写RNA」は、in vitroで合成されたRNA、好ましくは、mRNAを指す。一般に、in vitro転写RNAは、in vitro転写ベクターから生成される。in vitro転写ベクターは、in vitro転写RNAを生成するために使用される鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「ポリ(A)」は、ポリアデニル化によってmRNAに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の好ましい実施形態において、ポリAは、50~5000、好ましくは64超、より好ましくは100超、最も好ましくは300または400超である。ポリ(A)配列は、mRNAの機能性、例えば、局在化、安定性または翻訳効率を調節するために、化学的または酵素的に改変され得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントがメッセンジャーRNA分子に共有結合することを指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーRNA(mRNA)分子が3’末端でポリアデニル化される。3’ポリ(A)テールは、ポリアデニル酸ポリメラーゼという酵素の作用を介してプレmRNAに付加される、アデニンヌクレオチドの長い配列(多くの場合、数百)である。高等真核細胞において、ポリ(A)テールは、ポリアデニル化シグナルの特定配列を含有する転写物に付加される。mRNAに結合したポリ(A)テール及びタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護するのに役立つ。ポリアデニル化はまた、転写の終結、mRNAの核からの輸送、及び翻訳に重要である。ポリアデニル化は、DNAのRNAへの転写の直後に核内で生じるが、その後、細胞質内で更に生じることもある。転写の終結後、mRNA鎖は、RNAポリメラーゼと会合しているエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は、通常、切断部位の近傍に塩基配列AAUAAAが存在することを特徴とする。mRNAの切断後、切断部位の遊離3’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日または数週間にわたる非統合導入遺伝子の発現を指し、ここで、発現期間は、導入遺伝子がゲノムに組み込まれた場合、または宿主細胞の安定したプラスミドレプリコン内に含まれる場合の遺伝子発現の期間よりも短い。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へシグナルを伝達することに関与する、様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞膜を通ってシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体を含む。
「対象」という用語は、免疫応答が誘起され得る生体(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことが意図される。
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然状態では通常会合している他の細胞型から分離されている細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の場合において、この用語は、単に、その天然状態において天然に会合している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの態様において、細胞は、in vitroで培養される。他の態様において、細胞は、in vitroで培養されない。
本明細書で使用される「治療的(therapeutic)」という用語は、治療(treatment)を意味する。治療効果は、病態の軽減、抑制、寛解または根絶によって得られる。
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患または病態の防止または保護的治療を意味する。
本発明との関係において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性疾患抗原」または「過剰増殖性疾患に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性疾患に共通する抗原を指す。特定の態様において、本発明の過剰増殖性疾患抗原は、限定するものではないが、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、NHL、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、及び腺癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌などを含む、がんに由来する。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸によってトランスフェクトされ、形質転換され、または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
「特異的に結合する」という用語は、抗体、抗体断片または特定のリガンドが、試料中に存在する同族結合パートナー(例えば、BCMA、NKG2D、ROR1など)を認識して結合するが、試料中の他の分子を必然的及び実質的に認識も結合もしないことを指す。
「結合リガンド」という用語は、一般に、ポリペプチド(例えば、タンパク質)、ポリヌクレオチド(例えば、DNA、RNAまたはDNAとRNAのハイブリッド)、分子、化合物、その断片及び/またはそのハイブリッドを指す。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、ポリヌクレオチドを含み得、ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、生物学的分子または非生物学的分子を含み得る。いくつかの実施形態において、生物学的分子または非生物学的分子は、天然分子または人工分子であり得る。結合リガンドの非限定的な例としては、タンパク質、炭水化物、脂質または核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、抗体またはその断片(例えば、IgAアイソタイプ抗体、IgDアイソタイプ抗体、IgEアイソタイプ抗体、IgGアイソタイプ抗体、IgMアイソタイプ抗体、IgWアイソタイプ抗体、IgYアイソタイプ抗体)に会合、結合及び/または連結し得る。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、抗体のFcドメインであり得る(例えば、結合リガンドは、Fc受容体である)。例えば、いくつかの実施形態において、結合リガンドは、IgG1抗体に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、抗体またはその断片に会合する能力、結合する能力、及び/または連結する能力があり得る。一実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリヌクレオチドまたはその断片を含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリペプチドを含み得、CD16ポリペプチドは、天然CD16ポリペプチド配列と少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%相同である配列を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリペプチドを含み得、CD16ポリペプチドは、天然CD16ポリペプチド配列と最大で約99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%または10%相同である配列を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリヌクレオチドを含み得、CD16ポリヌクレオチドは、天然CD16ポリヌクレオチド配列と少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%相同である配列を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、CD16ポリヌクレオチドを含み得、CD16ポリヌクレオチドは、天然CD16ポリヌクレオチド配列と最大で約99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%または10%相同である配列を含む。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、複数のサブユニットを含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、複数のサブユニットを含み得、サブユニットは、同じであり得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、複数の異なるサブユニットを含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、複数のサブユニットを含み得、サブユニットの少なくとも2つは、異なり得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、九量体または十量体を含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、約10個を超えるサブユニットを含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、ポリマーを含み得る。いくつかの実施形態において、結合リガンドは、非ヒト(例えば、霊長類)、ヒト、またはヒト化であり得る。
範囲:本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記述は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるものではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能な部分範囲の全てを具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、1~6などの範囲の記述は、その範囲内の個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6だけでなく、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの部分範囲を具体的に開示しているとみなされるものとする。別の例として、95~99%の同一性などの範囲は、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するものを含み、96~99%、96~98%、96~97%、97~99%、97~98%及び98~99%の同一性などの部分範囲を含む。これは、当該範囲の幅にかかわらず適用される。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、一態様において、TFPは、1つ以上の腫瘍関連抗原(「TAA」)、例えば、ヒトTAAに特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列は、TCRサブユニットまたはその一部分をコードする核酸配列と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある、組み換えDNA構築物を包含する。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内因性(あるいは、1つ以上の外因性、または内因性と外因性の組み合わせ)TCRサブユニットと会合し、機能的TCR複合体を形成することができる。別の態様において、TFPは、IgG1またはIgG4抗体のTc領域に特異的に結合するCD16断片を含む。
一態様において、本発明のTFPは、別名では抗原結合ドメインと呼ばれる、標的特異的結合因子を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を画定する標的抗原の種類及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択され得る。したがって、本発明のTFPの抗原結合ドメインに対する標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染症、細菌感染症及び寄生虫感染症;自己免疫疾患;ならびにがん性疾患(例えば、悪性疾患)に関連するものが挙げられる。
一態様において、TFP媒介性T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをTFPに組み込むことによって、目的の抗原に向かわせることができる。
一態様において、抗原結合ドメインを含むTFPの部分は、BCMAを標的にする抗原結合ドメインを含む。別の態様において、抗原結合ドメインは、ヒトROR1を標的にする。別の態様において、抗原結合ドメインは、ヒトNKG2Dを標的にする。別の態様において、TFPは、抗原結合ドメインとしてCD16ポリペプチドを含み、標的は、抗TAA抗体であり、次いで、抗TAA抗体は、TAAを標的にする。
TFPは、CD16部分、例えば、ヒトCD16部分を含み、CD16タンパク質またはその断片の配列は、TCRサブユニットまたはその一部分をコードする核酸配列と隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内因性(あるいは、1つ以上の外因性、または内因性と外因性の組み合わせ)TCRサブユニットと会合し、機能的TCR複合体を形成することができる。一態様において、CD16 TFPは、別名ではFcγ受容体と呼ばれる、標的特異的結合因子を含む。CD16 TFPは、承認済み抗がんモノクローナル(IgG)抗体とともに作用するように選択され得、これにより、抗体の特異性と、抗体誘発性エフェクター機能を媒介する免疫細胞とを組み合わせることができる。Fcドメインは、Fab領域によって定められた特異性とCD16 TFPとの間の橋渡しとして作用する。例えば、CD16 TFPは、標準治療薬である抗CD20抗体リツキシマブと組み合わせることができる。CD20は、免疫系B細胞の表面上に主に認められる。リツキシマブは、B細胞を破壊することから、B細胞の過活動、機能不全または過剰数を特徴とする疾患を治療するために使用される。これには、多くのリンパ腫、白血病、移植拒絶反応及び自己免疫疾患が含まれ得る。したがって、TFPと組み合わせる抗体の標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染症、細菌感染症及び寄生虫感染症;自己免疫疾患;ならびにがん性疾患(例えば、悪性疾患)に関連するものが挙げられる。CD16部分は、リンカーを介してTFPに結合され得る。別の実施形態において、リンカー配列は、(GlySer)などのグリシンとセリンの繰り返しセットを含み、nは、1以上の整数である。一実施形態において、リンカーは、(GlySer)または(GlySer)であり得る。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインであって、例えば、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びその機能性断片、例えば、限定するものではないが、重鎖可変ドメイン(V)、軽鎖可変ドメイン(V)及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)などの単一ドメイン抗体、ならびに当該技術分野において抗原結合ドメインとして機能することが知られている、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、DARPINなどの代替スカフォールドであり得る。同様に、標的抗原を特異的に認識及び結合する天然または合成リガンドを、TFPの抗原結合ドメインとして使用することができる。いくつかの場合において、抗原結合ドメインは、TFPが最終的に使用される種と同じ種に由来するのが有益である。例えば、ヒトでの使用において、TFPの抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体もしくはヒト化抗体断片、またはヒト抗体もしくはヒト抗体断片、またはマウス抗体もしくはマウス抗体断片を含む。一実施形態において、ヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)、及び/または本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインは、1つ以上、例えば、3つ全てのLC CDR及び1つ以上、例えば、3つ全てのHC CDRを含む。一実施形態において、ヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗TAA結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、2つの可変重鎖領域を有し、それぞれが本明細書に記載されるHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含む。一実施形態において、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト軽鎖可変領域及び/または本明細書に記載されるヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも2つの本明細書に記載されるヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む、scFvである。一実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン(例えば、scFvまたはVH nb)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾(例えば、置換)から30、20もしくは10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、もしくは本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域、及び/または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つもしくは3つの修飾(例えば、置換)から30、20もしくは10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、もしくは本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して95~99%の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、scFvであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば、本明細書に記載されるリンカーを介して、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。一実施形態において、ヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、(Gly-Ser)リンカーを含み、nは、1、2、3、4、5または6、好ましくは、3または4である。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域のいずれかであり得る。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
いくつかの態様において、非ヒト抗体は、ヒト化されており、この場合、抗体の特定の配列または領域が、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはその断片に対する類似性を増すように改変されている。一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化されている。
ヒト化抗体は、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して作製することができ、これらには、限定するものではないが、CDRグラフト化(例えば、欧州特許第EP239,400号;国際公開第WO91/09967号ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号及び同第5,585,089号参照。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)、ベニアリングまたはリサーフェーシング(例えば、欧州特許第EP592,106号及び同第EP519,596号;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498;Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814;及びRoguska et al.,1994,PNAS,91:969-973参照。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)、鎖シャフリング(例えば、米国特許第5,565,332号参照。当該特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される)、ならびに例えば、米国特許出願公開第US2005/0042664号、米国特許出願公開第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開第WO9317105号、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23 Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)及びPedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)に開示されている技術(これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)が挙げられる。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変えるために、例えば、改善するために、CDRドナー抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野においてよく知られている方法によって特定され、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングし、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、配列比較により特定の位置で他と異なるフレームワーク残基を特定することによってなされる(例えば、Queen et al.,米国特許第5,585,089号;及びRiechmann et al.,1988,Nature,332:323参照。これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される)。
ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト起源に由来して残留する1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、典型的に「移入」可変ドメインに由来する。本明細書において提供される場合、ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する1つ以上のCDR及びフレームワーク領域を含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分がヒト生殖細胞系に由来する。抗体または抗体断片をヒト化する技術は、当該技術分野において多数知られており、Winter及び共同研究者らの方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))に従い、齧歯類のCDRまたはCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって、基本的に実施することができる(すなわち、CDRグラフト化(EP239,400;PCT国際公開第WO91/09967;及び米国特許第4,816,567号、同第6,331,415号、同第5,225,539号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第6,548,640。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される))。かかるヒト化抗体及び抗体断片において、インタクトなヒト可変ドメインの実質的に小さい部分が、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、多くの場合、いくつかのCDR残基と、場合により、いくつかのフレームワーク(FR)残基とが、齧歯類抗体の類似部位に由来する残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体及び抗体断片のヒト化はまた、ベニアリングもしくはリサーフェーシング(EP592,106;EP519,596;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498;Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805-814(1994);及びRoguska et al.,PNAS,91:969-973(1994))または鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)によって達成することもでき、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減らすことである。いわゆる「ベストフィット」法では、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)とする(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987);これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される)。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる(例えば、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997);Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993)参照。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される)。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、4つ全てのフレームワーク領域は、V4-4-59生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する1、2、3、4または5つの修飾、例えば、置換を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、4つ全てのフレームワーク領域は、VK3-1.25生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する1、2、3、4または5つの修飾、例えば、置換を含む。
いくつかの態様において、抗体断片を含む本発明のTFP組成物の部分は、標的抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念上のヒト化産物について分析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された免疫グロブリン候補配列から推定される三次元高次構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、当該免疫グロブリン候補配列の機能における残基の予想される役割の分析、例えば、免疫グロブリン候補が標的抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、FR残基は、標的抗原に対する親和性の増加などの所望の抗体または抗体断片の特性が達成されるように、レシピエント配列及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与している。
一態様において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、断片、例えば、一本鎖可変断片(scFv)またはラクダ科重鎖(VH)である。一態様において、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)、または二機能性(例えば、二重特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一態様において、本発明の抗体及びその断片は、野生型または親和性が向上された腫瘍関連抗原タンパク質に結合する。
また、本明細書で提供されるのは、標的抗原(例えば、BCMA、または融合部分結合ドメインの標的に関して本明細書に別途記載される任意の標的抗原)に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書に記載されるV(またはVH)ドメインのアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により、Vドメインのアミノ酸配列バリアントであるVドメインを調製することと、任意選択的に、このようにして調製されたVドメインと1つ以上のVドメインとを組み合わせることと、VドメインもしくはV/Vの組み合わせまたは複数の組み合わせを試験して、特定の結合メンバーまたは1つ以上の所望の特性を任意選択的に有する目的の標的抗原(例えば、BCMA、NKG2D、ROR1、またはCD16 TFP+抗TAA抗体の組み合わせのTAA標的)に特異的な抗体抗原結合ドメインを特定することとを含む、方法である。
いくつかの場合において、Vドメイン及びscFvは、当該技術分野において知られている方法によって調製することができる(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423-426及びHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883参照)。scFv分子は、フレキシブルポリペプチドリンカーを使用して、V領域とV領域を連結させることによって、調製することができる。scFv分子は、最適化された長さ及び/またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。リンカーの長さは、scFvの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカー(例えば、5~10アミノ酸)が採用される場合、鎖内の折り畳みは阻害される。鎖間折り畳みもまた、2つの可変領域を一緒にして、機能的エピトープ結合部位を形成するために必要である。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。リンカーの配列及び大きさの例については、例えば、Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号、ならびにPCT国際公開第WO2006/020258号及び同第WO2007/024715号を参照されたい。これらは、参照により本明細書に援用される。
scFvは、V領域とV領域との間に、約10、11、12、13、14、15または15を超える残基のリンカーを含む。リンカー配列は、任意の天然アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、(GlySer)などのグリシンとセリンの繰り返しセットを含み、nは、1以上の整数である。一実施形態において、リンカーは、(GlySer)または(GlySer)であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持または向上させ得、活性試験において、優れた有効性をもたらす。いくつかの場合において、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。いくつかの場合において、長いリンカー配列は、(GS)を含み、n=2~4である。いくつかの場合において、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。いくつかの場合において、短いリンカー配列は、(GS)を含み、n=1~3である。
安定性及び変異
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv)の安定性は、従来の対照scFv分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を基準にして評価することができる。一実施形態において、ヒト化またはヒトscFvは、本記載のアッセイにおいて、親のscFvよりも約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃または約15℃高い熱安定性を有する。
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvの熱安定性が改善されると、続いて、腫瘍関連抗原TFP構築物全体も改善され、抗腫瘍関連抗原TFP構築物の治療特性の向上につながる。抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvの熱安定性は、従来の抗体と比較して、少なくとも約2℃または3℃改善し得る。一実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較して、1℃改善した熱安定性を有する。別の実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較して、2℃改善した熱安定性を有する。別の実施形態において、scFvは、従来の抗体と比較して、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃または15℃改善した熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書で開示されるscFv分子と、当該scFvのV及びVが由来する抗体のscFv分子またはFab断片との間で行うことができる。熱安定性は、当該技術分野において知られている方法を使用して測定することができる。例えば、一実施形態において、Tを測定することができる。Tの測定方法及びタンパク質の安定性を決定する他の方法は、以下に記載される。
scFv中の変異(可溶性scFvのヒト化または変異導入から生じるもの)は、scFvの安定性を変え、scFv及び抗腫瘍関連抗原TFP構築物の全体的な安定性を改善する。ヒト化scFvの安定性は、T、変性温度及び凝集温度などの測定値を使用して、マウスscFvと比較される。一実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1つの変異を含み、この変異scFvにより、抗腫瘍関連抗原TFP構築物に改善された安定性がもたらされる。別の実施形態において、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の変異を含み、この変異scFvにより、腫瘍関連抗原TFP構築物に改善された安定性がもたらされる。
一態様において、TFPの抗原結合ドメインは、本明細書に記載される抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原抗体断片の所望の機能特性を保持する。特定の一態様において、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。更なる態様において、当該抗体断片は、scFvを含む。
様々な態様において、TFPの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、V及び/またはV)内、例えば、1つ以上のCDR領域内及び/または1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって改変される。特定の一態様において、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。更なる態様において、当該抗体断片は、scFvを含む。
当業者であれば、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列の点では異なる(例えば、野生型と異なる)が、所望の活性の点では変わらないように更に修飾され得ることが理解されよう。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらす追加のヌクレオチド置換をタンパク質に施すことができる。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置き換えることができる。別の実施形態において、一続きのアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/または組成が異なる構造的に類似の一続きのアミノ酸で置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える保存的置換がなされ得る。
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐状側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列における同一性パーセントは、同一である2つ以上の配列を指す。2つの配列は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手動アラインメント及び目視確認により判定して、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大の一致を得るように比較及び整列したとき、当該2つの配列が特定の割合で同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するのであれば、「実質的に同一」である(例えば、特定の領域にわたって、または特定されていない場合は、配列全体にわたって、60%の同一性、任意選択により70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性)。任意選択により、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長(または10アミノ酸長)である領域、またはより好ましくは、100~500もしくは1000以上のヌクレオチド長(または20、50、200以上のアミノ酸長)である領域にわたって存在する。
配列比較については、典型的に1つの配列が参照配列として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、サブ配列座標を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。比較のための配列のアラインメント法は、当該技術分野においてよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施(GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA;Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)または手動アラインメント及び目視確認(例えば、Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biology参照)によって実施することができる。配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402;及びAltschul et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410にそれぞれ記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公的に利用可能である。
一態様において、本発明は、機能的に等価な分子を生成する、出発抗体または断片(例えば、scFv)のアミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、TFPに含まれる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvのVまたはVは、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvの出発VまたはVフレームワーク領域と少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を保持するように修飾され得る。本発明は、機能的に等価な分子を生成するために、TFP構築物全体の修飾、例えば、TFP構築物の様々なドメインの1つ以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。TFP構築物は、出発TFP構築物と少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を保持するように修飾され得る。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然起源または組み換え起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、特に、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様において、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することができる。本発明に特に有用な細胞外ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマもしくはCD3デルタ、あるいは、代替的な実施形態において、CD28、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の細胞外領域(複数可)を含み得る。
膜貫通ドメイン
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされた細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。代替的な実施形態において、TFPは、TFPの細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した1つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通の由来であるタンパク質の細胞外領域に会合する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または15までのアミノ酸)及び/または膜貫通タンパク質の由来であるタンパク質の細胞内領域に会合する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または15までのアミノ酸)を含み得る。一態様において、膜貫通ドメインは、TFPの他のドメインのうちの1つと会合するものであり、使用される。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、かかるドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小に抑えるように、選択され、またはアミノ酸置換によって修飾され得る。一態様において、膜貫通ドメインは、TFP-T細胞表面上の別のTFPとホモ二量体化することができる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小に抑えるように、修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然起源または組み換え起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様において、膜貫通ドメインは、TFPが標的に結合しているときはいつでも細胞内ドメイン(複数可)にシグナル伝達することができる。本発明に特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の膜貫通領域(複数可)を含み得る。
いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、TFPの細胞外領域、例えば、TFPの抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン(Ig)ヒンジ、例えば、IgG4ヒンジまたはCD8aヒンジであり得る。
リンカー
任意選択により、2~20アミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーにより、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域との連結が形成され得る。グリシン-セリンのダブレットが特に好適なリンカーを提供する。例えば、一態様において、リンカーは、GGGGSGGGGS(配列番号101)のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号102)のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、リンカーは、GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号1)のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、リンカーは、AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号2)のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、リンカーは、配列AAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号3)を有する長いリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、GGTGGAGGCGGTTCTGGTGGAGGCGGTTCGGATGGCGGAGGTTCA(配列番号66)のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態において、リンカーは、GGAGAGGGTAAATCTTCCGGATCTGGTTCCGAAAGCAAGGCTAGC(配列番号73)のヌクレオチド配列によってコードされる。
細胞質ドメイン
TFPの細胞質ドメインは、TFPがCD3ガンマ、デルタまたはイプシロンのポリペプチドを含有するのであれば、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得るものであり、一般に、TCRアルファ及びTCRベータサブユニットは、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、TFPが導入された免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、その細胞を特殊な機能を発揮させるようにするタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全てが採用され得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される限りにおいて、かかる短縮部分は、エフェクター機能のシグナルを伝達するのであれば、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
本発明のTFPに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するT細胞受容体(TCR)と共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント及び同じ機能性を有する任意の組み換え配列が挙げられる。
TCRのみを介して生成されるシグナルは、ナイーブT細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナル及び/または共刺激シグナルが必要であることが知られている。したがって、ナイーブT細胞の活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列:TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)と、抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを与えるもの(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)とによって媒介されると言える。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的または抑制的のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を制御する。刺激を与えるように作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本発明に特に有用である、ITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dのものが挙げられる。一実施形態において、本発明のTFPは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたITAMドメイン、例えば、天然ITAMドメインと比較して活性が変更された(例えば、増大または減少された)変異ITAMドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び/または短縮されたITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、1、2、3、4またはそれ以上のITAMモチーフを含む。
TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインのみを含んでもよいし、本発明のTFPとの関係において有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)と組み合わせてもよい。例えば、TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むTFPの一部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の有効な応答に必要である。かかる分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、CD27の共刺激は、in vitroにおけるヒトTFP-T細胞の増殖、エフェクター機能及び生存率を向上させることが示されており、in vivoにおけるヒトT細胞の持続性及び抗腫瘍活性を増強する(Song et al.Blood.2012;119(3):696-706)。
本発明のTFPの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または特定の順序で互いに連結され得る。任意選択により、例えば、2~10アミノ酸長(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長)の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーにより、細胞内シグナル伝達配列間の連結が形成され得る。
一実施形態において、グリシン-セリンのダブレットを好適なリンカーとして使用することができる。一実施形態において、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを好適なリンカーとして使用することができる。
一態様において、本明細書に記載されるTFP発現細胞は、第2のTFP、例えば、異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的(例えば、CD22)または異なる標的(例えば、CD123)に対するものを含む第2のTFPを更に含み得る。一実施形態において、TFP発現細胞が2つ以上の異なるTFPを含む場合、異なるTFPの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第1及び第2のTFPを発現する細胞は、第1のTFPの抗原結合ドメインを、例えば、断片、例えば、scFvとして有し得、これは、第2のTFPの抗原結合ドメインと会合しないものであり、例えば、第2のTFPの抗原結合ドメインは、VHHである。
別の態様において、本明細書に記載されるTFP発現細胞は、別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を高める作用物質を更に発現し得る。例えば、一実施形態において、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、PD1は、いくつかの実施形態において、TFP発現細胞の免疫エフェクター応答の開始能力を低下させ得る。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態において、抑制分子を阻害する作用物質は、第1のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、これは、細胞に正のシグナルをもたらす第2のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。一実施形態において、作用物質は、第1のポリペプチド、例えば、PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4及びTIGITなどの抑制分子またはこれらのいずれかの断片(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分)と、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインを含むもの(例えば、4-1BB、CD27またはCD28、例えば、本明細書に記載されるもの)及び/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)である第2のポリペプチドとを含む。一実施形態において、作用物質は、PD1またはその断片(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部分)の第1のポリペプチドと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載されるCD28シグナル伝達ドメイン及び/または本明細書に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)の第2のポリペプチドとを含む。PD1は、CD28、CTLA-4、ICOS及びBTLAも含むCD28受容体ファミリーの抑制性メンバーである。PD-1は、活性化されたB細胞、T細胞及び骨髄細胞上に発現される(Agata et al.1996 Int.Immunol 8:765-75)。PD1の2つのリガンド、PD-L1及びPD-L2は、PD1に結合すると、T細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al.2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1は、ヒトがんに豊富に含まれている(Dong et al.2003 J Mol Med 81:281-7;Blank et al.2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314;Konishi et al.2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1の局所的相互作用を阻害することによって、逆転させることができる。
一実施形態において、作用物質は、抑制分子の細胞外ドメイン(ECD)を含み、例えば、プログラム死1(PD1)を、膜貫通ドメインと、任意選択により、41BB及びCD3ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインとに融合することができる(本明細書においてPD1 TFPとも呼ばれる)。一実施形態において、PD1 TFPは、本明細書に記載される抗腫瘍抗原TFPと組み合わせて使用される場合、T細胞の持続性を改善する。一実施形態において、TFPは、PD1の細胞外ドメインを含む、PD1 TFPである。あるいは、プログラム死リガンド1(PD-L1)またはプログラム死リガンド2(PD-L2)に特異的に結合するscFvなどの抗体または抗体断片を含有するTFPが提供される。
別の態様において、本発明は、TFP発現T細胞、例えば、TFP-T細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態において、TFP発現T細胞の集団は、異なるTFPを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態において、TFP-T細胞の集団は、本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するTFPを発現する第1の細胞と、異なる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、第1の細胞によって発現されるTFP内の抗腫瘍関連抗原結合ドメインとは異なる本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するTFPを発現する第2の細胞とを含み得る。別の例として、TFP発現細胞の集団は、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載されるものを含むTFPを発現する第1の細胞と、腫瘍関連抗原以外の標的(例えば、別の腫瘍関連抗原)に対する抗原結合ドメインを含むTFPを発現する第2の細胞とを含み得る。
別の態様において、本発明は、細胞の集団であって、集団中の少なくとも1つの細胞が、本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原ドメインを有するTFPを発現し、第2の細胞が、別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を高める作用物質を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子は、例えば、いくつかの実施形態において、TFP発現細胞の免疫エフェクター応答の開始能力を低下させ得る。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態において、抑制分子を阻害する作用物質は、第1のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、これは、細胞に正のシグナルをもたらす第2のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。
本明細書で開示されるのは、TFPをコードする、in vitro転写されたRNAを作製する方法である。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができる、TFPをコードするRNA構築物を含む。トランスフェクションに使用するmRNAを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のin vitro転写(IVT)、それに続くポリA付加により、3’及び5’非翻訳配列(「UTR」)、5’キャップ及び/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現される核酸、ならびに典型的に50~2000塩基長のポリAテールを含有する構築物をもたらすことを伴い得る。このようにして作製されたRNAは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一態様において、鋳型は、TFPに対する配列を含む。
一態様において、抗腫瘍関連抗原TFPは、メッセンジャーRNA(mRNA)によってコードされる。一態様において、抗腫瘍関連抗原TFPをコードするmRNAは、TFP-T細胞の産生のために、T細胞に導入される。一実施形態において、in vitro転写されたRNA TFPは、一過性トランスフェクションの形態で細胞に導入することができる。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で生成された鋳型を使用するin vitro転写によって生成される。任意起源に由来する目的のDNAを、PCRにより、適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用して、in vitro mRNA合成用の鋳型に直接変換することができる。DNAの起源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列または任意の他の適切なDNA起源であってよい。in vitro転写に望ましい鋳型は、本発明のTFPである。一実施形態において、PCRに使用されるDNAは、オープンリーディングフレームを含有する。DNAは、有機体のゲノムに由来する天然DNA配列由来であってよい。一実施形態において、核酸は、5’及び/または3’非翻訳領域(UTR)の一部または全部を含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態において、PCRに使用されるDNAは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、PCRに使用されるDNAは、5’及び3’UTRを含む、ヒト核酸配列である。あるいは、DNAは、天然に発生する有機体では通常発現されない人工DNA配列であり得る。例示的な人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒に連結される遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結されるDNAの部分は、単一の有機体に由来しても、複数の有機体に由来してもよい。
トランスフェクションに使用されるmRNAのin vitro転写用の鋳型を、PCRを使用して生成する。PCRの実施方法は、当該技術分野においてよく知られている。PCRに使用されるプライマーは、PCR用の鋳型として使用されるDNAの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、プライマー配列中の大部分もしくは全ての塩基が相補的であるか、または1つ以上の塩基が非相補的もしくは不一致である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRに使用されるアニーリング条件下で、アニーリングまたは目的のDNA標的とのハイブリット形成が可能である。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分と実質的に相補的になるように設計され得る。例えば、プライマーは、細胞内で通常転写される核酸の部分(オープンリーディングフレーム)を、5’及び3’UTRを含めて増幅するように設定することができる。プライマーはまた、目的の特定ドメインをコードする核酸の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、ヒトcDNAのコーディング領域を、5’及び3’UTRの全てまたは部分を含めて増幅するように設定される。PCRに有用なプライマーは、当該技術分野においてよく知られている合成法によって作製することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるDNA配列の上流にある、DNA鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含有する、プライマーである。「上流」は、増幅されるDNA配列に対して、コーディング鎖の5側の位置を指すために本明細書で使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流にある、二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含有する、プライマーである。「下流」は、増幅されるDNA配列に対して、コーディング鎖の3’側の位置を指すために本明細書で使用される。
PCRに有用な任意のDNAポリメラーゼを本明細書で開示される方法に使用することができる。試薬及びポリメラーゼは、多数の供給源から市販されている。
また、安定性及び/または翻訳効率を促進する能力を持つ化学構造を使用することができる。RNAは、好ましくは、5’及び3’UTRを有する。一実施形態において、5’UTRは、1~3,000ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加される5’及び3’UTR配列の長さは、限定するものではないが、UTRの異なる領域にアニーリングするPCR用プライマーを設計することを含む、種々の方法によって変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するのに必要な5’及び3’UTRの長さを改変することができる。
5’及び3’UTRは、目的の核酸に対して天然に生じる内因性5’及び3’UTRであり得る。あるいは、目的の核酸にとって内因性でないUTR配列を、フォワード及びリバースプライマーに組み込むことによって、または鋳型の任意の他の改変によって、付加することができる。目的の核酸にとって内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安全性及び/または翻訳効率を改変するために有用であり得る。例えば、3’UTR配列内のAUに富むエレメントは、mRNAの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、3’UTRは、当該技術分野においてよく知られているUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性を増大させるように選択または設計され得る。
一実施形態において、5’UTRは、内因性核酸のコザック配列を含有し得る。あるいは、目的の核酸にとって内因性でない5’UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、この5’UTR配列を付加することによって、コンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、いくつかのRNA転写物の翻訳の効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために、全てのRNAに必要とされるわけではない。多くのmRNAに対するコザック配列の要件は、当該技術分野において知られている。他の実施形態において、5’UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定である、RNAウイルスの5’UTRであり得る。他の実施形態において、3’または5’UTRに様々なヌクレオチド類似体を使用して、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
遺伝子クローニングを必要としないDNA鋳型からのRNA合成を可能にするには、転写プロモーターが、転写される配列の上流のDNA鋳型に結合する必要がある。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加される場合、当該RNAポリメラーゼプロモーターは、PCR産物中、転写されるオープンリーディングフレームの上流に組み込まれる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、本明細書に別途記載されるようなT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当該技術分野において知られている。
好ましい実施形態において、mRNAは、5’末端のキャップと、3’ポリ(A)テールの両方を有し、これらは、細胞内でのmRNAのリボソーム結合、翻訳開始及び安定性を決定する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNAにおいて、RNAポリメラーゼは、真核細胞内での発現に好適でない長いコンカテマー産物を生成する。3’UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、通常サイズのmRNAをもたらすが、転写後にポリアデニル化されても、真核生物のトランスフェクションに効果的でない。
線状DNA鋳型において、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3’末端を鋳型の最終残基を超えて伸長することができる(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985);Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
ポリA/TストレッチをDNA鋳型に組み込む従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こすことがあり、このことが、細菌細胞から得たプラスミドDNA鋳型に欠失及び他の異常が高度に混入していることが多い理由である。これにより、クローニング手順は、面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないことがよくある。そのため、クローニングを行わずにポリA/T3’ストレッチを含むDNA鋳型を構築できる方法が非常に望ましい。
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、100Tテール(50~5000Tの大きさであってよい)などのポリTテールを含有するリバースプライマーを使用することによるPCR中、またはDNAライゲーションもしくはin vitro組み換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法によるPCR後に、生成され得る。ポリ(A)テールはまた、RNAに安定性を与え、その分解を減少させる。一般に、ポリ(A)テールの長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ(A)テールは、100~5000アデノシンである。
RNAのポリ(A)テールは、E.coliポリAポリメラーゼ(E-PAP)などのポリ(A)ポリメラーゼの使用により、in vitro転写後に更に伸長され得る。一実施形態において、ポリ(A)テールの長さを100ヌクレオチドから300~400ヌクレオチドに増やすことは、RNAの翻訳効率を約2倍にする。更に、3’末端に異なる化学基を結合することは、mRNA安定性を増大させ得る。かかる結合は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含有し得る。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、ATP類似体をポリ(A)テールに組み込むことができる。ATP類似体は、RNAの安定性を更に増大させ得る。
5’キャップを付けることもまた、RNA分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、当該技術分野において知られ、本明細書に記載される技術を使用してもたらされる(Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001);Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001);Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
本明細書で開示される方法によって生成されるRNAはまた、配列内リボソーム進入部位(IRES)配列を含有し得る。IRES配列は、任意のウイルス、染色体または人工設計配列であってよく、mRNAへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する。細胞の透過性及び生存を促進する因子、例えば、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などを含有し得る、細胞エレクトロポレーションに好適な任意の溶質が含まれ得る。
RNAは、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems(Cologne,Germany))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments(Boston,Mass.))もしくはGene Pulser II(BioRad(Denver,Colo.))、Multiporator(Eppendort(Hamburg Germany))、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのパーティクルガン送達系(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)参照)が挙げられるがこれらに限定されない、商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に組み込むことができる。
TFPをコードする核酸構築物
本発明はまた、本明細書に記載される1つ以上のTFP構築物をコードする核酸分子を提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、DNA構築物として提供される。発現プラスミド中に、結合因子、リンカー及びTFPをコードする例示的なDNA配列は、付録Aに開示される。
所望の分子をコードする核酸配列は、当該技術分野において知られている組み換え方法を使用して、例えば、当該遺伝子を発現する細胞由来のライブラリーをスクリーニングすること、当該遺伝子を含むことがわかっているベクターからその遺伝子を抽出すること、または当該遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することなどによって、標準的な技術を使用して、得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングではなく、合成的に生成することができる。
本発明はまた、本発明のDNAが挿入されているベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期間安定した統合及び娘細胞におけるその伝播が可能であるため、長期間の遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも更なる利点を有する。また、低免疫原性という更なる利点も有する。
別の実施形態において、本発明の所望のTFPをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。
別の実施形態において、TFP構築物の1つ以上のドメイン(例えば、細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメイン)は、クラスター化された規則的な間隔のある短い回文の繰り返し配列(CRISPR(登録商標)、例えば、米国特許第8,697,359号参照)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN、例えば、米国特許第9,393,257号参照)、メガヌクレアーゼ(12~40塩基対からなる二本鎖DNA配列を含む大きな認識部位を有する天然エンドデオキシリボヌクレアーゼ)、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN、例えば、Urnov et al.,Nat.Rev.Genetics(2010)v11,636-646)法などの遺伝子編集技術を使用して操作される。このように、キメラ構築物は、立体構造またはシグナル伝達能力などの各サブユニットの所望の特徴を組み合わせるように操作することができる。Sander & Joung,Nat.Biotech.(2014)v32,347-55;及びJune et al.,2009 Nature Reviews Immunol.9.10:704-716も参照されたい。この各々は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、TFPサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインのうちの1つ以上は、2つ以上の天然TCRサブユニットドメインの態様を有するように操作される(すなわち、キメラである)。
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫付与及び遺伝子療法に使用され得る。遺伝子送達法は、当該技術分野において知られている(例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号参照。その全体が参照により本明細書に援用される)。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療用ベクターを提供する。
核酸は、多数の種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドが挙げられるがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に利点のあるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及びシークエンシングベクターが挙げられる。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも1つの有機体で機能する複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択マーカーを含有する(例えば、WO01/96584;WO01/29058;及び米国特許第6,326,193号)。
多数のウイルスベースの系が哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系の便利なプラットフォームを提供する。当該技術分野において知られている技術を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージすることができる。次いで、組み換えウイルスを単離し、対象の細胞にin vivoまたはex vivoのいずれかで送達することができる。多数のレトロウイルス系が当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当該技術分野において知られている。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
更なるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらの要素は、開始部位から30~110bp上流の領域に位置しているが、プロモーターの多くが開始部位の下流にも機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔は、多くの場合、柔軟性があり、要素が互いに逆転または移動しても、プロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、50bpまで離れるように増やすことができるが、それ以降は活性が低下し始める。個々の要素は、プロモーターに応じて、協調的または独立的に機能して転写を活性化し得ると思われる。
哺乳動物のT細胞においてTFP導入遺伝子を発現することができるプロモーターの一例は、EF1aプロモーターである。天然EF1aプロモーターは、アミノアシルtRNAのリボソームへの酵素的送達に関与する伸長因子1複合体のアルファサブユニットの発現を誘導する。EF1aプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドに広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのTFP発現を誘導するのに有効的であることが示されている(例えば、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)参照)。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、当該配列に作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで誘導することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列、例えば、限定するものではないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長い末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、Epstein-Barrウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子1aプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターもまた使用することができる。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、その発現が望まれる場合にはオンにし、または発現が望まれない場合にはその発現をオフにすることができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
TFPポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有し得、これにより、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞の集団から発現細胞を特定及び選択することが容易になる。他の態様において、選択マーカーは、DNAの別々の小片上に担持させて、同時トランスフェクション手順に使用してもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞中での発現を可能にするように適切な調節配列に隣接し得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされたと思われる細胞の特定、及び調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織中に存在しないか、または発現されていない遺伝子であり、その発現がある程度簡単に検出できる特性、例えば、酵素活性によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、そのDNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82)。好適な発現系はよく知られており、既知の技術を使用して調製してもよいし、商業的に入手してもよい。一般に、最も高いレポーター遺伝子発現レベルを示す最小5’フランキング領域を含む構築物がプロモーターとして特定される。かかるプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、これを使用して、プロモーターによる転写調節能力について、作用物質を評価することができる。
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は、当該技術分野において知られている。発現ベクターとの関係において、当該ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫の細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
宿主細胞へポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び/または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている(例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY参照)。宿主細胞へポリヌクレオチドを導入するための1つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクター及びRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導され得る(例えば、米国特許第5,350,674号及び同第5,585,362号参照)。
宿主細胞へポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質系が含まれる。in vitro及びin vivoでの送達担体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。他の最先端の核酸の標的送達法、例えば、標的化ナノ粒子または他の好適なサブミクロンサイズの送達系によるポリヌクレオチドの送達も利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達担体は、リポソームである。脂質配合物の使用は、宿主細胞へ核酸を導入するために企図される(in vitro、ex vivoまたはin vivo)。別の態様において、核酸は、脂質と会合され得る。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に挿入され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソーム内に捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と配合され、脂質中の懸濁液として含有され、ミセルとともに含有もしくは複合体を形成し、または脂質と別様に会合され得る。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクター会合組成物は、溶液中において、いかなる特定の構造にも限定されない。例えば、二層構造、ミセル、または「崩壊した」構造で存在し得る。また、溶液中に単に散在していてもよく、サイズも形状も均一でない凝集体を場合によって形成する。脂質とは、天然脂質でも合成脂質でもよい脂肪性物質のことである。例えば、脂質には、細胞質内で天然に生じる脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に適した脂質は、民間の供給元から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma(St.Louis,Mo)から入手でき、リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories(Plainview,N.Y.)から入手でき、コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから入手でき、ジミリスチルホスファチジルグリセロールは(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc,(Birmingham,Ala.)から入手できる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質ストック溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層及び多重層の脂質担体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内側の水性媒体とを備えた小胞構造を有することを特徴とし得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると、自然に形成される。脂質成分は、自己再編成を経た後、閉鎖構造を形成し、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を捕捉する(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を取る組成物も企図される。例えば、脂質は、ミセル構造を取ってもよいし、脂質分子の不均一な凝集体として単に存在してもよい。リポフェクタミン-核酸複合体もまた企図される。
宿主細胞における組み換えDNA配列の存在を確認するためには、宿主細胞へ外因性核酸を導入するために使用される方法、または他の場合には細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法にかかわらず、様々なアッセイを実施することができる。かかるアッセイには、例えば、当業者によく知られた、サザン及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCRなどの「分子生物学的」アッセイ;特定のペプチドの有無を検出することなどによる「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)または本発明の範囲に含まれる作用物質を特定するための本明細書に記載されるアッセイによるものが含まれる。
本発明は、TFPをコードする核酸分子を含むベクターを更に提供する。一態様において、TFPベクターは、細胞、例えば、T細胞に直接形質導入することができる。一態様において、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクター、例えば、1つ以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物が挙げられるがこれらに限定されないベクターである。一態様において、ベクターは、哺乳動物のT細胞においてTFP構築物を発現することができる。一態様において、哺乳動物のT細胞は、ヒトT細胞である。
T細胞源
増殖及び遺伝子改変に先立って、T細胞源を対象から得る。「対象」という用語は、免疫応答が誘起され得る生体(例えば、哺乳動物)を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、多数の起源から得ることができる。本発明の特定の態様において、当該技術分野において入手可能な様々なT細胞株が使用され得る。本発明の特定の態様において、T細胞は、Ficoll(登録商標)分離などの当業者に知られている様々な技術を使用して、対象から採取した血液単位から得ることができる。好ましい一態様において、個体の循環血液に由来する細胞がアフェレーシスによって取得される。アフェレーシス産物は、典型的に、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。一態様において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿分画を除去し、後続の処理工程に適切な緩衝液または媒体中に細胞を入れるために、洗浄され得る。本発明の一態様において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。代替的な態様において、洗浄液は、カルシウムを欠いており、かつマグネシウムを欠いてもよく、または全てではないにしても多くの二価カチオンを含み得ない。カルシウム不存在下での最初の活性化工程は、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、当業者に知られている方法、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離器(例えば、COBE(登録商標)2991細胞処理装置、Baxter CytoMate(登録商標)、またはHaemonetics(登録商標)Cell Saver(登録商標)5)を製造元の説明書に従って使用することによって、達成することができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca不含Mg不含PBSであるPlasmaLyte(登録商標)Aなど、または緩衝剤含有もしくは不含の他の食塩水中に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
一態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、単球を除去することによって、例えば、Percoll(商標)密度勾配による遠心分離または対向流遠心溶出によって、末梢血リンパ球から単離される。T細胞の特定のサブ集団、例えば、CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA及びCD45ROT細胞などを、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって、更に単離することができる。例えば、一態様において、T細胞は、所望のT細胞のポジティブ選択に十分な時間、Dynabeads(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tなどの抗CD3/抗CD28(例えば、3×28)結合ビーズとのインキュベーションによって単離される。一態様において、当該時間は、約30分である。更なる態様において、時間は、30分~36時間の範囲またはそれより長い時間及びその間の全ての整数値である。更なる態様において、時間は、少なくとも1、2、3、4、5または6時間である。好ましい更に別の一態様において、時間は、10~24時間である。一態様において、インキュベーション時間は、24時間である。腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離する場合などの、他の細胞型と比較してT細胞がわずかである任意の状況では、より長いインキュベーション時間を用いてT細胞を単離してもよい。更に、より長いインキュベーション時間を用いることで、CD8T細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、T細胞をCD3/CD28ビーズに結合させる時間を単に短縮または延長することによって、及び/またはビーズとT細胞の比率を増加もしくは減少させることによって(本明細書において更に記載されるように)、培養開始時または工程中の他の時点で、T細胞のサブ集団を優先的に選択または反選択することができる。更に、ビーズまたは他の表面上の抗CD3及び/または抗CD28抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点で、T細胞のサブ集団を優先的に選択または反選択することができる。当業者であれば、本発明との関係において、複数ラウンドの選択も使用され得ることを認識するであろう。特定の態様において、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を活性化及び増殖工程に使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞はまた、更なるラウンドの選択にかけることもできる。
ネガティブ選択によるT細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせで達成することができる。1つの方法は、ネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介したセルソーティング及び/または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によってCD4細胞を濃縮する場合、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含む。特定の態様において、典型的に、CD4、CD25+、CD62Lhi、GITR及びFoxP3を発現する制御性T細胞を濃縮またはポジティブ選択することが望ましい場合がある。あるいは、特定の態様において、制御性T細胞は、抗C25結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって除去される。
一実施形態において、IFN-γ、TNF-アルファ、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムB及びパーフォリン、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの1つ以上を発現するT細胞集団が選択され得る。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、PCT国際公開第WO2013/126712号に記載されている方法によって決定することができる。
ポジティブまたはネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞濃度及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)を変えることができる。特定の態様において、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズと細胞の混合体積を大幅に減少させる(例えば、細胞の濃度を上げる)ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、20億細胞/mLの濃度が使用される。一態様において、10億細胞/mLの濃度が使用される。更なる態様において、1億細胞/mL超が使用される。更なる態様において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、または5000万細胞/mLの細胞濃度が使用される。更なる一態様において、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億細胞/mLからの細胞濃度が使用される。更なる態様において、1億2500万または1億5000万細胞/mLの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖の増加をもたらし得る。更に、高い細胞濃度を使用すると、CD28ネガティブT細胞などの、目的の標的抗原の発現が弱い細胞を効率的に捕捉することができ、または多数の腫瘍細胞が存在する試料(例えば、白血球血液、腫瘍組織など)から細胞を効率的に捕捉することができる。かかる細胞集団は、治療上の価値を有し得、これを得ることが望ましいであろう。例えば、高い細胞濃度を使用すると、通常、CD28の発現が弱いCD8T細胞の効率的な選択が可能となる。
関連する態様において、より低い細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。T細胞と表面(例えば、ビーズなどの粒子)の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小に抑えられる。これは、粒子に結合する所望の抗原を豊富に発現する細胞を選択する。例えば、CD4T細胞は、CD28を高レベルで発現し、希釈濃度でCD8T細胞よりも効率的に捕捉される。一態様において、使用される細胞の濃度は、5×10/mLである。他の態様において、使用される濃度は、約1×10/mL~1×10/mL及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様において、細胞は、回転装置上で、様々な長さの時間、2~10℃または室温のいずれかで、様々な速度でインキュベートされ得る。
刺激のためのT細胞は、洗浄工程後に凍結することもできる。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続の融解工程は、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球を除去することによって、より均一な産物をもたらす。血漿及び血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野において知られており、本文脈で有用であるが、1つの方法は、20%DMSO及び8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または10%デキストラン40及び5%ブドウ糖、20%ヒト血清アルブミン及び7.5%DMSO、もしくは31.25%Plasmalyte-A、31.25%ブドウ糖5%、0.45%NaCl、10%デキストラン40及び5%ブドウ糖、20%ヒト血清アルブミンならびに7.5%DMSOを含有する培地、または他の好適な細胞凍結培地、例えば、Hespan(登録商標)及びPlasmaLyte(登録商標)Aを含有するものを使用することを含み、次いで、細胞を-80℃まで1/分の速度で凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存する。-20℃または液体窒素中での制御されていない即時凍結と同様に、他の制御凍結法も使用され得る。特定の態様において、凍結保存細胞は、本明細書に記載されるように融解及び洗浄され、室温で1時間静置され、その後、本発明の方法を使用して活性化される。
また、本発明との関係において企図されるのは、本明細書に記載される増殖した細胞が必要とされ得る時よりも前の時点における対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の採取である。したがって、増殖される細胞源は、任意の必要な時点で採取することができ、T細胞などの所望の細胞が、本明細書に記載されるものなどのT細胞療法から恩恵を受け得る様々な疾患または状態に対するT細胞療法での後の使用のために、単離及び凍結され得る。一態様において、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。特定の態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、疾患をまだ発症していない全般的に健康な対象から採取され、目的の細胞が、後の使用のために単離及び凍結される。特定の態様において、T細胞は、増殖され、凍結され、その後、使用され得る。特定の態様において、試料は、本明細書に記載される特定の疾患の診断の直後に、任意の治療に先立って、患者から採取される。更なる態様において、細胞は、作用物質、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸エステル及びタクロリムス(FK506)、抗体または他の免疫消失薬、例えば、アレムツズマブ、抗CD3抗体、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン(旧FR901228)、ならびに放射線照射による治療が挙げられるがこれらに限定されない様々な関連療法に先立って対象から得た血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本発明の更なる態様において、T細胞は、対象に機能性T細胞を戻す治療の後に、患者から直接得られる。これについて、ある特定のがん治療、特に、免疫系に損傷を与える薬物による治療後であり、患者が当該治療から通常回復する期間中の治療の直後に得られるT細胞は、ex vivoでの増殖能力に関する質が最適であり、または改善され得ることが観察された。同様に、本明細書に記載される方法を使用したex vivo操作の後、これらの細胞は、生着及びin vivo増殖の向上に好ましい状態にあり得る。したがって、この回復期中に、T細胞、樹状細胞または他の造血系細胞を含む血液細胞を採取することは、本発明の範囲内であることが意図される。更に、特定の態様において、動員(例えば、GM-CSFによる動員)及び移植前処置を使用して、対象において、特に、治療法後の所定の時間幅中、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び/または増殖が促進される状態を作り上げることができる。例示的な細胞型としては、T細胞、B細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
T細胞の活性化及び増殖
T細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号及び同第7,572,631号に記載されるような方法を概ね使用して、活性化及び増殖させることができる。
一般に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体に関連するシグナルを刺激する作用物質が結合した表面と、T細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触により増殖し得る。特に、T細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上に固定化された抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)との接触によって、刺激することができる。T細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触され得る。CD4T細胞またはCD8T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体及び抗CD28抗体である。抗CD28抗体の例としては、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone(Besancon,France))が挙げられ、当該技術分野において一般的に知られている他の方法を使用してもよい(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998;Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999;Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。
さらされた刺激時間が異なるT細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血の単核細胞産物は、細胞傷害性または抑制性T細胞集団(TC、CD8)よりも多く、ヘルパーT細胞集団(TH、CD4)を有する。CD3及びCD28受容体を刺激することによるT細胞のEx vivo増殖は、約8~9日目以前には、主にTH細胞からなるT細胞集団をもたらすが、約8~9日目以降には、T細胞集団は、次第に増加するTC細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離された場合、このサブセットを更に多く増殖させることが有益であり得る。
更に、CD4及びCD8マーカーに加えて、細胞増殖工程中、他の表現型マーカーは、大幅に変化するが、大部分は再現性がよい。したがって、かかる再現性により、活性化したT細胞産物を特定の目的のために調整することが可能になる。
抗腫瘍関連抗原TFPが構築されたら、様々なアッセイを使用して、当該分子の活性、例えば、限定するものではないが、抗原刺激後にT細胞を増殖させる能力、再刺激がない状態でT細胞の増殖を維持する能力、ならびに適切なin vitro及び動物モデルにおける抗がん活性を評価することができる。抗腫瘍関連抗原TFPの作用を評価するアッセイは、以下に更に詳述される。
一次T細胞におけるTFP発現のウェスタンブロット解析を使用して、単量体及び二量体の存在を検出することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。極めて簡潔に述べれば、TFPを発現するT細胞(CD4とCD8T細胞の1:1混合物)を、10日を超えてin vitroで増殖させ、溶解し、還元条件下でSDS-PAGEを行う。TFPは、TCR鎖に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって検出される。同じT細胞サブセットを非還元条件下でのSDS-PAGE解析に使用すると、共有結合した二量体形態の評価が可能となる。
抗原刺激後のTFPT細胞のin vitro増殖は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、CD4とCD8T細胞の混合物をアルファCD3/アルファCD28及びAPCにより刺激し、続いて、プロモーターの制御下でGFPを発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、分析する。例示的なプロモーターとしては、CMV IE遺伝子、EF-1アルファ、ユビキチンCまたはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。GFP蛍光は、CD4及び/またはCD8T細胞サブセットの培養6日目に、フローサイトメトリーによって評価される(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。あるいは、0日目に、CD4とCD8T細胞の混合物をアルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズにより刺激し、1日目に、TFPを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを、2Aリボソームスキッピング配列を使用したeGFPとともに使用して、TFPを形質導入する。
再刺激がない状態で持続するTFPT細胞の増殖もまた測定することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。簡潔に述べれば、0日目に、アルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズにより刺激し、1日目に、指定のTFPを形質導入し、その後、培養の8日目に、Coulter Multisizer III粒子計測器を使用して、平均T細胞体積(fl)を測定する。
また、動物モデルを使用してTFP-T活性を測定することもできる。例えば、免疫不全マウスのがんを処置するために、ヒトBCMA特異的TFPT細胞を使用する異種移植モデルである(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。極めて簡潔に述べれば、がんの確立後、マウスを処置群に無作為化する。異なる数の改変T細胞を1:1の比でがん担持NOD/SCID/γ-/-マウスに同時注入する。マウス由来の脾臓DNA中の各ベクターのコピー数をT細胞の注入後の様々な時点で評価する。動物のがんを週間隔で評価する。末梢血腫瘍関連抗原がん細胞数を、アルファ腫瘍関連抗原-ゼータTFPT細胞またはモック形質導入T細胞を注入したマウスで測定する。これらの群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。加えて、T細胞を注入して4週間後のNOD/SCID/γ-/-マウスの末梢血CD4及びCD8T細胞の絶対数も解析することができる。マウスにがん細胞を注入し、3週間後、eGFPに連結されたTFPをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによってTFPを発現するように改変されたT細胞を注入する。T細胞は、注入前にモック形質導入細胞と混合することによって、45~50%入力GFP+T細胞に正規化して、フローサイトメトリーによって確認する。動物のがんを1週間間隔で評価する。TFP+T細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
用量依存的なTFP処置応答を評価することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。例えば、がんを確立してから35~70日後の末梢血を、TFP T細胞もしくは同数のモック形質導入T細胞を21日目に注入したマウス、またはT細胞を注入しなかったマウスにおいて得る。35日目及び49日目に、末梢血+がん細胞数の決定のために各群のマウスを無作為に採血し、次いで、屠殺する。残りの動物は、57日目及び70日目に評価する。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)に先に記載されている。簡潔に述べれば、TFP媒介性増殖の評価は、マイクロタイタープレート上で、洗浄したT細胞を、BCMAまたはCD32及びCD137(KT32-BBL)を発現する細胞と、最終T細胞:BCMA発現細胞の比が2:1になるように混合することによって実施される。BCMA細胞を発現する細胞には、使用前に、ガンマ線を照射する。抗CD3(クローンOKT3)及び抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体を、KT32-BBL細胞を含む培地に添加し、T細胞増殖を刺激するための陽性対照とする。これは、これらのシグナルが、ex vivoにおける長期間のCD8T細胞増殖をサポートするからである。T細胞は、CountBright(商標)蛍光ビーズ(Invitrogen)及びフローサイトメトリーを製造元による記載のとおりに使用して、培地中で計数される。TFP+T細胞は、eGFP-2Aが連結されたTFP発現レンチウイルスベクターで改変されたT細胞を使用して、GFP発現によって特定される。GFPを発現しないTFP+T細胞については、TFP+T細胞は、ビオチン化組み換えBCMAタンパク質及び二次アビジン-PEコンジュゲートにより検出される。T細胞上のCD4及びCD8発現はまた、特異的なモノクローナル抗体(BD Biosciences)により同時に検出される。サイトカインの測定は、ヒトTH1/TH2サイトカインサイトメトリックビーズアレイキット(BD Biosciences)を製造元の説明書に従って使用して、再刺激してから24時間後に採取した上清で実施される。FACScalibur(商標)フローサイトメーターを使用して蛍光を評価し、製造元の説明書に従ってデータを解析する。
細胞傷害性は、標準的な51Cr放出アッセイによって評価することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)参照)。簡潔に述べれば、標的細胞に、37℃で2時間、頻繁に振盪しながら、51Cr(NaCrOとして、New England Nuclear)をロードし、完全RPMIで2回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。完全RPMIを含むウェル中で、エフェクターT細胞を標的細胞と、様々なエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で混合する。培地のみ(自然放出、SR)またはトリトン-X100界面活性剤の1%溶液(完全放出、TR)を含む追加のウェルも用意する。37℃で4時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。次いで、放出される51Crをガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co.(Waltham,Mass.))を使用して測定する。各条件を少なくとも3連で実施し、溶解率を式:溶解(%)=(ER-SR)/(TR-SR)(式中、ERは、各実験条件についての51Cr放出の平均を表す)を使用して算出する。
イメージング技術を使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるTFPの特異的輸送及び増殖を評価することができる。かかるアッセイは、例えば、Barrett et al.,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)に記載されている。簡潔に述べれば、NOD/SCID/γc-/-(NSG)マウスにがん細胞を静注し、その7日後、TFP構築物のエレクトロポレーションから4時間後のT細胞を静注する。T細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルス構築物で安定的にトランスフェクトされており、マウスを生物発光について撮像する。あるいは、がん異種移植モデルにおけるTFP+T細胞の単回注射による治療有効性及び特異性を以下のように測定することができる。NSGマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入を行ったがん細胞を注射し、その7日後、BCMA TFP をエレクトロポレーションしたT細胞を単回尾静脈注射する。注入後の様々な時点で、動物を撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップを、5日目(処置の2日前)及び8日目(TFP+PBLの24時間後)に生成することができる。
本明細書の実施例の項に記載されるもの及び当該技術分野において知られているものを含む他のアッセイもまた、本明細書で開示される抗TAA TFP構築物を評価するために使用することができる。
治療用途
腫瘍抗原関連疾患または障害
本明細書において例及び実施形態を提供してきたが、例えば、ROR1関連疾患及び/または抗ROR1抗体及びそのための使用に関する、更なる技術及び実施形態については、2013年1月13日に出願された米国特許第9,217,040号;2011年11月30日に出願された米国特許第9,758,586号;2011年6月17日に出願された国際公開第WO2012076066号;Mato,A.& Porter,D.(2015)Blood 126(4),478-485;Choi,M.,et al.(2015)Clinical Lymphoma,Myeloma & Leukemia 15(S1),S167-S169;Cui,B.,et al.(2015)Cancer Research 73(12),3649-3660;Yu,J.,et al.(2015)Journal of Clinical Investigation 10(1172),1-34;Borcherding,N.,et al.(2014)Protein Cell 5(7),496-502;Zhang,S.,et al.(2012)The American Journal of Pathology 181(6),1903-1910;Hudecek,M.,et al.(2010)Blood 116(22),4532-4541;ならびにDeniger,D.,et al.(2015)PLoS ONE 10(6),1-19に見出すことができ、これらは、その全体が参照により本明細書に援用される。
一態様において、本発明は、TAA、例えば、ROR1またはNKG2Dリガンド(NKG2DL)の発現を伴う疾患を治療するための方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部がNKG2DLについて陰性であり、腫瘍の一部がNKG2DLについて陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、TFPは、NKG2DLの発現の上昇を伴う疾患について治療を受けたことがある対象を治療するのに有用であり、ここで、NKG2DLのレベルの上昇について治療を受けたことがある対象は、NKG2DLのレベルの上昇を伴う疾患を呈する。
一態様において、本発明は、哺乳動物のT細胞における発現用のプロモーターに作動可能に連結されたTAA結合TFPを含むベクターに関する。一態様において、本発明は、NKG2DL発現腫瘍を治療する際に使用するための組み換えT細胞、例えば、NKG2D TFPを発現する組み換えT細胞を提供し、ここで、NKG2D TFPを発現する組み換えT細胞は、NKG2D TFP-Tと呼ばれる。一態様において、NKG2D TFP-Tは、表面上に少なくとも1つのNKG2DLを発現している腫瘍細胞と接触することができ、これにより、TFP-Tは、腫瘍細胞を標的にし、腫瘍成長を阻害する。
二重特異性TFP
腫瘍細胞上の1つの標的、例えば、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123などを指向するがん治療薬により治療された多くの患者は、代替のシグナル伝達経路及びフィードバックループなどの回避機構が活性化されるにつれて、経時的に抵抗性になる。二重特異性治療薬は、回避経路としてしばしば互いに代用される標的を組み合わせることによって、これに対処しようとするものである。2つ以上の腫瘍関連抗原に特異的なTCRを有する治療用T細胞集団は、有望な併用療法である。
抗TAA TFP-T細胞、二重特異性抗TAA TFP T細胞、または抗TAA抗体と組み合わせたCD-16TFP T細胞の腫瘍関連抗原標的
例示的な腫瘍関連抗原としては、腫瘍胎児抗原(例えば、胎児組織及びがん性体細胞に発現されるもの)、腫瘍ウイルス抗原(例えば、腫瘍形成性形質転換ウイルスによってコードされるもの)、過剰発現/蓄積抗原(例えば、正常組織及び新生物組織の療法によって発現され、新生物において発現レベルが非常に高いもの)、がん-精巣抗原(例えば、がん細胞ならびに精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現されるもの)、系統限定抗原(例えば、単一のがん組織型によって主に発現されるもの)、変異抗原(例えば、遺伝子突然変異または転写における変化の結果としてがんによって発現されるもの)、翻訳後に改変された抗原(例えば、グリコシル化における腫瘍関連改変など)、及びイディオタイプ抗原(例えば、腫瘍細胞が特定のクローン型を発現する、高度に多型の遺伝子に由来するもの、例えば、クローン性異常に起因するB細胞、T細胞リンパ腫/白血病におけるもの)が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な腫瘍関連抗原としては、アルファ-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA-1、CSNK1A1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、MART2、MATN、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、I型ミオシン、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARアルファ融合タンパク質、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1または-SSX2融合タンパク質、TGF-ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、D393-CD20n、サイクリン-A1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、LY6K、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12m、MAGE-C1、MAGE-C2、mucink、NA88-A、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b/GAGED2a、遺伝子/タンパク質、CEA、gp100/Pmel17、マンマグロビン-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、チロシナーゼ、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、HLA-DOB、ヘプシン、IDO1、IGF2B3、IL13Rアルファ2、小腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フォエトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、レングシン、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、ミッドカイン、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、TPBG、VEGF及びWT1の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、本発明は、少なくとも1つの腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患を治療するための方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原について陰性であり、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原について陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本発明の抗体またはTFPは、当該腫瘍抗原の発現の上昇を伴う疾患について治療を受けたことがある対象を治療するのに有用であり、ここで、腫瘍関連抗原のレベルの上昇について治療を受けたことがある対象は、腫瘍関連抗原のレベルの上昇を伴う疾患を呈する。
一態様において、本発明は、哺乳動物のT細胞における発現用のプロモーターに作動可能に連結された抗腫瘍関連抗原抗体またはTFPを含むベクターに関する。一態様において、本発明は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を治療する際に使用するための腫瘍関連抗原TFPを発現する組み換えT細胞を提供し、ここで、腫瘍関連抗原TFPを発現する組み換えT細胞は、腫瘍関連抗原TFP-Tと呼ばれる。一態様において、本発明の腫瘍関連抗原TFP-Tは、表面上に本発明の少なくとも1つの腫瘍関連抗原TFPを発現している腫瘍細胞と接触することができ、これにより、TFP-Tは、腫瘍細胞を標的にし、腫瘍成長を阻害する。
一態様において、本発明は、腫瘍関連抗原発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、本発明の腫瘍関連抗原抗体またはTFP T細胞と接触させることを含み、これにより、TFP-Tが、抗原に応答して活性化され、がん細胞を標的にし、腫瘍成長が阻害される、方法に関する。
一態様において、本発明は、対象のがんを治療する方法に関する。方法は、がんが対象において治療されるように、本発明の腫瘍関連抗原抗体、二重特異性抗体、またはTFP T細胞を対象に投与することを含む。本発明の腫瘍関連抗原TFP T細胞によって治療可能ながんの一例は、腫瘍関連抗原の発現を伴うがんである。一態様において、がんは、骨髄腫である。一態様において、がんは、リンパ腫である。一態様において、がんは、結腸癌である。
いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原抗体またはTFP療法は、1つ以上の追加の治療法と組み合わせて使用され得る。いくつかの場合において、かかる追加の治療法は、化学療法剤、例えば、シクロホスファミドを含む。いくつかの場合において、かかる追加の治療法は、外科的切除または放射線治療を含む。
一態様において、本明細書で開示されるのは、T細胞がTFPを発現するように遺伝子改変され、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の一方法である。注入される細胞は、レシピエントにおいて、腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、TFP発現T細胞は、in vivoで複製可能であり、長期間持続することから、持続的な腫瘍制御につながり得る。様々な態様において、患者に投与されるT細胞またはその子孫は、患者へのT細胞の投与後、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年または5年間、患者内で存続する。
いくつかの場合において、本明細書で開示されるのは、T細胞がTFPを一過性に発現するように、例えば、in vitro転写RNAによって、改変され、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の一種である。注入される細胞は、レシピエントにおいて、腫瘍細胞を殺傷することができる。したがって、様々な態様において、患者に投与されるT細胞は、患者へのT細胞の投与後、1ヶ月未満、例えば、3週間、2週間または1週間、存在する。
いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、TFP発現T細胞によって誘起される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答でも受容免疫応答でもよく、あるいは直接対間接免疫応答によるものであってもよい。一態様において、TFPを形質導入したT細胞は、腫瘍関連抗原を発現するヒトがん細胞に反応して特定の炎症性サイトカインの分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性腫瘍関連抗原阻害に抵抗し、バイスタンダー殺傷を媒介し、及び/または確立されたヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、腫瘍関連抗原発現腫瘍の不均一な領域内の無抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞に対して先に反応している腫瘍関連抗原再指向性T細胞による間接的破壊を受ける可能性がある。
一態様において、本発明のヒトTFP改変T細胞は、哺乳動物におけるex vivo免疫付与及び/またはin vivo療法のためのワクチンの一種であり得る。一態様において、哺乳動物は、ヒトである。
ex vivo免疫付与に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、次のうちの少なくとも1つがin vitroで行われる:i)細胞の増殖、ii)TFPをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存。
Ex vivo手順は、当該技術分野においてよく知られており、以下でより詳細に論じる。簡潔に述べれば、哺乳動物(例えば、ヒト)から細胞を単離し、本明細書で開示されるTFPを発現するベクターにより細胞を遺伝子改変する(すなわち、in vitroでの形質導入またはトランスフェクション)。このTFP改変細胞を哺乳動物のレシピエントに投与すると、治療上の利益を得ることができる。哺乳動物のレシピエントは、ヒトであり得、TFP改変細胞は、レシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系または異種であり得る。
造血幹細胞及び前駆細胞のex vivo増殖手順は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第5,199,942号に記載されており、これを本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法は、当該技術分野において知られており、したがって、本発明は、いかなる特定のex vivo細胞増殖方法に限定されない。簡潔に述べれば、T細胞のex vivo培養及び増殖は、(1)末梢血採取物または骨髄外植体から哺乳動物由来のCD34+造血幹細胞及び前駆細胞を採取することと、(2)かかる細胞をex vivoで増殖させることとを含む。米国特許第5,199,942号に記載される細胞成長因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3及びc-kitリガンドなどの他の因子も、細胞の培養及び増殖に使用することができる。
ex vivo免疫付与における細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者の抗原に対する免疫応答を誘起するin vivo免疫付与のための組成物及び方法を提供する。
一般に、本明細書に記載されるように活性化及び増殖された細胞を、免疫不全の個体で生じる疾患の治療及び予防に利用することができる。特に、本発明のTFP改変T細胞は、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患、障害及び状態の治療に使用される。特定の態様において、本発明の細胞は、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患、障害及び状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、本発明は、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患、障害及び状態の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療上有効な量の本発明のTFP改変T細胞を投与することを含む、方法を提供する。
一態様において、本発明の抗体またはTFP-T細胞は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患を治療するために使用され得、または前がん状態である。一態様において、がんは、骨髄腫である。一態様において、がんは、リンパ腫である。一態様において、がんは、結腸癌である。更に、腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患には、例えば、腫瘍関連抗原を発現する、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原の発現を伴う非がん関連適応症は、抗原によって異なるが、例えば、感染症、自己免疫疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギー及び喘息)及び移植であるが、これらに限定されない。
本発明の抗体またはTFP改変T細胞は、単独で、または希釈剤及び/またはIL-2、IL-7、IL-12、IL-15もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として、投与され得る。
本発明はまた、腫瘍関連抗原発現細胞集団の増殖を阻害するための方法または当該細胞集団を減少させるための方法であって、腫瘍関連抗原発現細胞を含む細胞集団を、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原TFP-T細胞と接触させることを含む、方法を提供する。特定の態様において、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するための方法または当該がん細胞集団を減少させるための方法であって、腫瘍関連抗原発現がん細胞集団を、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞と接触させることを含む、方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するための方法または当該がん細胞集団を減少させるための方法であって、腫瘍関連抗原発現がん細胞集団を、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞と接触させることを含む、方法を提供する。特定の態様において、本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞は、細胞及び/またはがん細胞の分量、数、量または割合を、多発性骨髄腫もしくは腫瘍関連抗原発現細胞に関連する別のがんを有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%または少なくとも99%減少させる。一態様において、対象は、ヒトである。
本発明はまた、腫瘍関連抗原発現細胞(例えば、腫瘍関連抗原を発現するがん)に関連する疾患を予防、治療及び/または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞を投与することを含む、方法を提供する。一態様において、対象は、ヒトである。腫瘍関連抗原発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫障害(狼瘡など)、炎症性障害(アレルギー及び喘息など)及びがん(血液がんまたは腫瘍関連抗原を発現する非定型がんなど)が挙げられる。
本発明はまた、腫瘍関連抗原発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び/または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞を投与することを含む、方法を提供する。一態様において、対象は、ヒトである。
本発明は、腫瘍関連抗原発現細胞に関連するがんの再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体及び/またはTFP-T細胞を投与することを含む、方法を提供する。一態様において、方法は、それを必要とする対象に、腫瘍関連抗原発現細胞に結合する本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP-T細胞の有効量を、別の治療法の有効量と組み合わせて投与することを含む。
併用療法
本明細書に記載される抗体またはTFP発現細胞は、他の既知の作用物質及び治療法と組み合わせて使用してもよい。本明細書で使用されるとき、「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害による苦痛を受けている間に、2つ(またはそれ以上)の異なる治療が対象に送達されること、例えば、対象が障害の診断を受けた後、障害が治癒もしくは排除される前、または治療が別の理由で中止されるまで、2つ以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態において、1つの治療の送達は、第2の送達の開始時にも変わらず行われるため、投与に関しては重複がある。これは、本明細書において、「同時」または「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態において、1つの治療の送達は、もう1つの治療の送達が始まる前に終了する。いずれの場合のいくつかの実施形態において、治療は、併用投与のため、より効果的である。例えば、第2の治療は、より効果的であり、例えば、同等の効果が、第2の治療が少なくてもみられるか、または、第2の治療が、第1の治療なく第2の治療が施される場合にみられるよりも、症状を大幅に軽減するか、または、類似の状況が第1の治療でみられる。いくつかの実施形態において、送達は、障害に関係する症状または他のパラメータの軽減が、他の治療なしで送達される1つの治療から観察される軽減よりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加であるか、全体的に相加であるか、相加を超えるものであり得る。送達は、送達された第1の治療の効果が、第2の治療の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
CD16 TFP T細胞との併用療法のための抗がん抗体
本明細書で開示されるCD16 TFPは、抗がん抗体と組み合わせて投与される。腫瘍細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原に対する任意のIgG1またはIgG4抗がん抗体が、本明細書に開示される組み合わせ及び方法における使用に好適である。かかる抗体には、限定するものではないが、5T4、8H9、ανβθインテグリン、αvβ6インテグリン、アルファフェトプロテイン(AFP)、B7-H6、CA-125炭酸脱水酵素9(CA9)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD52、CD123、CD171、癌胎児性抗原(CEA)、EpCAM(上皮細胞接着分子)、E-カドヘリン、EMA(上皮細胞膜抗原)、EGFRvlll、上皮細胞糖タンパク質-2(EGP-2)、上皮細胞糖タンパク質-40(EGP-40)、ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2/neu/EGFR2、ErbB3/HER3、ErbB4、上皮性腫瘍抗原(ETA)、葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児型アセチルコリン受容体(AchR)、葉酸受容体-α、G250/CAIX、ガングリオシド2(GD2)、ガングリオシド3(GD3)、HLA-A1、HLA-A2、高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、IL-13受容体α2(IL-13Rα2)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、k-軽鎖、Lewis Y(LeY)、L1細胞接着分子、黒色腫関連抗原(MAGE-A1)、メソテリン、ムチン-1(MUC1)、ムチン-16(MUC16)、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)リガンド、神経細胞接着分子(NCAM)、CTLA-4、PD-1、PD-L1、NY-ESO-1、腫瘍胎児抗原(h5T4)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、mAb IgEが標的にするTAA、腫瘍関連糖タンパク質-72(TAG-72)、チロシナーゼ、及び血管内皮細胞増殖因子(VEGF)受容体が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、腫瘍関連抗原は、正常(すなわち、非がん性)組織の細胞の細胞表面上に発現されない抗原である。別の実施形態において、腫瘍関連抗原は、当該抗原が腫瘍細胞上に発現されるレベルよりも極めて低いレベルで、正常組織の細胞の細胞表面上に発現される(例えば、細胞当たりの受容体が少ない)。
他の組み合わせ
いくつかの実施形態において、「少なくとも1つの追加の治療薬」には、TFP発現細胞が含まれる。また、同じもしくは異なる標的抗原または同一標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する、複数のTFPを発現するT細胞を提供する。また、T細胞の第1のサブセットが第1のTFPを発現し、T細胞の第2のサブセットが第2のTFPを発現する、T細胞の集団を提供する。
本明細書に記載されるTFP発現細胞及び少なくとも1つの追加の治療薬は、同じまたは別個の組成物で同時投与されてもよいし、順次投与されてもよい。順次投与の場合、本明細書に記載されるTFP発現細胞を第1に投与することができ、追加の作用物質を第2に投与することができ、または投与の順番を逆にすることができる。
更なる態様において、本明細書に記載されるTFP発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸エステル、抗体もしくは他の免疫消失薬、例えば、アレムツズマブ、抗CD3抗体、または他の抗体療法、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、タクロリムス(フジマイシン)、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン(FR901228としても知られる)、サイトカイン、及び放射線照射、Izumoto et al.2008 J Neurosurg 108:963-971に記載されているペプチドワクチンと組み合わせて治療レジメンに使用され得る。
一実施形態において、対象は、TFP発現細胞の投与に伴う副作用を軽減または改善する作用物質が投与され得る。TFP発現細胞の投与に伴う副作用としては、サイトカイン放出症候群(CRS)、及びマクロファージ活性化症候群(MAS)とも呼ばれる血球貪食性リンパ組織球症(HLH)が挙げられるが、これらに限定されない。CRSの症状としては、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などが挙げられる。したがって、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるTFP発現細胞を対象に投与することと、TFP発現細胞による治療から生じる可溶性因子のレベル上昇を管理する作用物質を更に投与することとを含み得る。一実施形態において、対象において上昇する可溶性因子は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-6及びIL-8のうちの1つ以上である。したがって、この副作用を治療するために投与される作用物質は、これらの可溶性因子のうちの1つ以上を中和する作用物質であり得る。かかる作用物質としては、ステロイド、TNFαの阻害剤及びIL-6の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。TNFα阻害剤の一例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標)の名称で上市されている)である。IL-6阻害剤の一例は、トシリズマブ(ACTEMRA(登録商標)の名称で上市されている)である。
一実施形態において、対象は、TFP発現細胞の活性を高める作用物質が投与され得る。例えば、一実施形態において、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、プログラム死(PD1)は、いくつかの実施形態において、TFP発現細胞の免疫エフェクター応答の開始能力を低下させ得る。抑制分子の例としては、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及びTGFRベータが挙げられる。抑制分子の阻害、例えば、DNA、RNAまたはタンパク質レベルでの阻害によるものは、TFP発現細胞の性能を最適化し得る。実施形態において、抑制核酸、例えば、抑制核酸、例えば、dsRNA、例えば、siRNAまたはshRNAを使用して、TFP発現細胞中の抑制分子の発現を阻害することができる。一実施形態において、阻害剤は、shRNAである。一実施形態において、抑制分子は、TFP発現細胞内で阻害される。これらの実施形態において、抑制分子の発現を阻害するdsRNA分子は、TFPの構成要素、例えば、全ての構成要素をコードする核酸に連結される。一実施形態において、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、作用物質は、PD1、PD-L1、PD-L2またはCTLA4に結合する抗体または抗体断片であり得る(例えば、イピリムマブ(MDX-010及びMDX-101とも呼ばれ、YERVOY(登録商標)として上市されているもの);Bristol-MyersSquibb;トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体、かつてチシリムマブとして知られていたもの、CP-675,206))。一実施形態において、作用物質は、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子3(TIM3)に結合する抗体または抗体断片である。一実施形態において、作用物質は、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)に結合する抗体または抗体断片である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるTFP T細胞と組み合わせて使用するのに好適な作用物質は、骨髄抑制細胞を調節する作用物質、例えば、CCR2抗体である。他の治療法としては、例えば、ナノ粒子療法が当該技術分野において知られている。
いくつかの実施形態において、TFP発現細胞の活性を高める作用物質は、例えば、第1のドメイン及び第2のドメインを含み、第1のドメインは、抑制分子またはその断片であり、第2のドメインは、正のシグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるような細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、正のシグナルに関連するポリペプチドは、CD28、CD27、ICOSの共刺激ドメイン、例えば、CD28、CD27及び/またはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載される、例えば、CD3ゼータのドメインを含み得る。一実施形態において、融合タンパク質は、TFPを発現するのと同じ細胞によって発現される。別の実施形態において、融合タンパク質は、細胞、例えば、抗腫瘍関連抗原TFPを発現しないT細胞によって発現される。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるTFP発現細胞、例えば、複数のTFP発現細胞を、1つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などなどの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様において、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、治療される(または予防される)疾患に適した方法で投与され得る。適切な用量は臨床試験によって決定され得るが、投与量及び投与回数は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度などの因子によって決定される。
一実施形態において、医薬組成物は、夾雑物、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残存した抗CD3/抗CD28被覆ビーズ、マウス抗体、保存ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される夾雑物を実質的に含まないものであり、例えば、検出可能なレベルの夾雑物がない。一実施形態において、細菌は、Alcaligenes faecalis、Candida albicans、Escherichia coli、Haemophilus influenza、Neisseria meningitides、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、及びStreptococcus pyogenes group Aからなる群から選択される少なくとも1つである。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、及び状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるT細胞を含む医薬組成物は、10~10細胞/kg体重、いくつかの場合では10~10細胞/kg体重の用量(これらの範囲内の全ての整数値を含む)で投与され得ると一般的に言うことができる。また、T細胞組成物は、当該用量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することによって、投与することができる(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988参照)。
特定の態様において、活性化されたT細胞を対象に投与し、その後続いて再採血し(またはアフェレーシスが行われる)、本発明に従ってT細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖されたT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。この工程は、数週間ごとに複数回実施され得る。特定の態様において、T細胞は、10cc~400ccの採取血液から活性化され得る。特定の態様において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90ccまたは100ccの採取血液から活性化される。
目的の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、移入または移植を含む、任意の簡便な方法で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、患者に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与され得る。一態様において、本発明のT細胞組成物は、患者に、皮内または皮下注射によって投与される。一態様において、本発明のT細胞組成物は、i.v.注射によって投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注入してもよい。
例示的な特定の態様において、対象は、白血球除去療法を受けてもよく、ここで、白血球は、ex vivoで収集、濃縮、または除去され、目的の細胞、例えば、T細胞が選択及び/または単離される。これらのT細胞単離物は、当該技術分野において知られている方法によって増殖され、1つ以上の本発明のTFP構築物が導入され得るように処理され、これにより、本発明のTFP発現T細胞が作製され得る。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法による標準治療と、それに続く末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の態様において、移植の後または移植と同時に、対象は、本発明の増殖されたTFP T細胞の注入を受ける。更なる態様において、増殖された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に施される上記治療の用量は、治療対象の状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化する。ヒト投与に対する用量の増減は、当該分野で認められている慣行に従って行うことができる。例えば、アレムツズマブ(CAMPATH(登録商標))の用量は、一般に、成人患者に対して1~約100mgの範囲であり、通常、1~30日間の期間にわたって毎日投与される。好ましい1日用量は、1~10mg/日であるが、いくつかの場合において、40mg/日までのより大きな用量が使用されてもよい(米国特許第6,120,766号に記載されている)。
一実施形態において、TFPは、例えば、in vitro転写を使用してT細胞に導入され、対象(例えば、ヒト)は、本発明のTFP T細胞の初回投与と、本発明のTFP T細胞の1回以上の後続投与を受け、ここで1回以上の後続投与は、先の投与後15日未満、例えば、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3または2日に行われる。一実施形態において、週当たり1回を超える本発明のTFP T細胞の投与を対象(例えば、ヒト)に行い、例えば、週当たり2、3または4回の本発明のTFP T細胞の投与がなされる。一実施形態において、対象(例えば、ヒト対象)は、週当たり1回を超えるTFP T細胞の投与を受け(例えば、2、3または4回/週)(本明細書においてサイクルとも呼ばれる)、続いて1週間はTFP T細胞の投与を受けず、その後、1回以上のTFP T細胞の追加投与(例えば、週当たり1回を超えるTFP T細胞の投与)が対象になされる。別の実施形態において、対象(例えば、ヒト対象)は、1回を超えるサイクルのTFP T細胞を受け、各サイクルの間隔は、10、9、8、7、6、5、4、または3日未満である。一実施形態において、TFP T細胞は、週当たり3回投与するために1日おきに投与される。一実施形態において、本発明のTFP T細胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間またはそれ以上にわたって投与される。
一態様において、腫瘍関連抗原TFP T細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを使用して生成される。当該方法で生成されたTFP-T細胞は、安定したTFP発現を有する。
一態様において、TFP T細胞は、形質導入後、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15日間、TFPベクターを一過性に発現する。TFPの一過性発現は、RNA TFPベクターの送達によって生じさせることができる。一態様において、TFP RNAは、エレクトロポレーションによって、T細胞に形質導入される。
一過性発現TFP T細胞(特に、マウスscFvを担持するTFP T細胞)を使用して治療される患者において生じ得る潜在的な問題は、複数回治療後のアナフィラキシーである。
本理論に束縛されるものではないが、かかるアナフィラキシー応答は、体液性抗TFP応答、すなわち、抗IgEアイソタイプを有する抗TFP抗体を発生している患者で引き起こされる可能性があると考えられている。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が10~14日の間中断されると、IgGアイソタイプ(アナフィラキシーを引き起こさないもの)からIgEアイソタイプへのクラススイッチを受けると思われる。
一過性TFP療法(RNA形質導入によって生じるものなど)の過程で、患者が抗TFP抗体応答を起こすリスクが高い場合、TFP T細胞注入の中断は、10~14日間を超えるべきではない。
以下の実験的な実施例を参照しながら、本発明を更に詳述する。これらの実施例は、例示のみを目的に提供されるものであり、特に指定されない限り、限定を意図しない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるものではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるものとする。当業者であれば、更なる説明なく、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用することができ、特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘するものであり、本開示の残余の部分を限定するものとして理解されるべきではない。
実施例1:TFP構築物
抗TAA TFP構築物は、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号2)または長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号3)のいずれかをコードするDNA配列によって、CD3またはTCR DNA断片に連結された1つ以上の抗TAA scFv DNA断片またはCD16断片を、例えば、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって作製する。CAR構築物は、抗TAA抗体(例えば、NKG2Dまたは抗ROR1)、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン及びCD3ゼータをコードする合成DNAを、例えば、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって作製する。本明細書で開示されるCD3ε TFP構築物は、完全配列(配列番号4)を基準にしてN末端が切断されている配列番号97に記載の配列を含む。
抗ROR1、NKG2Dなど。TFPは、上記のとおりに作製される。例えば、作製する抗ROR1TFP構築物は、p510_抗ROR1_LL_TCRα(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体α鎖)、p510_抗ROR1_LL_TCRαC(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗ROR1_LL_TCRβ(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗ROR1_LL_TCRβC(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗ROR1_LL_CD3γ(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗ROR1_LL_CD3(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒトCD3鎖)、p510_抗ROR1_LL_CD3ε(抗ROR1 scFv-長いリンカー-ヒトCD3ε鎖)、p510_抗ROR1_SL_TCRβ(抗ROR1 scFv-短いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗ROR1_SL_CD3γ(抗ROR1 scFv-短いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗ROR1_SL_CD3(抗ROR1 scFv-短いリンカー-ヒトCD3鎖)、p510_抗ROR1_SL_CD3ε(抗ROR1 scFv-短いリンカー-ヒトCD3ε鎖)である。
抗ROR1 CAR構築物であるp510_抗ROR1_28ζは、抗ROR1、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン及びCD3ゼータをコードする合成DNAを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって作製する。
2つのscFvが両方とも同じTCRで発現される、二重特異性TFP構築物を作製する。一実施形態において、第1の抗腫瘍抗原scFv DNA断片は、p510ベクター((System Biosciences(SBI))にXbaI及びEcoR1部位で、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLEまたは長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLEのいずれかをコードするDNA配列によって、CD3またはTCR DNA断片に連結される。別の実施形態において、第2の抗腫瘍抗原scFv DNA断片は、SLまたはLLによって、第1の抗腫瘍抗原断片に作動可能に連結される。
別の実施形態において、第1の発現構築物中、第1の抗腫瘍抗原scFv DNA断片は、SLまたはLLのいずれかをコードするDNA配列によって第1のCD3またはTCR断片に連結され、第2の発現構築物中、第2の抗腫瘍抗原scFv DNA断片は、SLまたはLLのいずれかをコードするDNA配列によって第1のCD3またはTCR断片に連結される。例えば、それぞれのウイルス発現構築物中、抗CD20または抗CD22抗原scFv DNA断片は、CD3ε DNA断片に作動可能に連結され、抗CD19 scFv DNA断片は、CD3γ scFv DNA断片に作動可能に連結される。CD3ε/CD3ε、CD3ε/CD3β、CD3ε/CD3δ、CD3ε/CD3αなどのCD3サブユニットの任意の組み合わせを使用することができる。
一実施形態において、両方のウイルス発現構築物を使用して、T細胞の同じ集団に形質導入することにより、T細胞の1つの集団が2つ以上の腫瘍関連抗原に特異的なTFPを有するようにする。別の実施形態において、ウイルス発現構築物をそれぞれ使用して、T細胞の別個の集団に形質導入し、形質導入したT細胞の2つの集団を使用前に混合する。二重特異性T細胞集団を作製する例示的な戦略を図1A及び1Bに示す。
一実施形態において、抗腫瘍関連抗原CAR構築物は、比較物として作製される。p510_抗腫瘍関連抗原_28ζ CARは、抗腫瘍関連抗原、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン及びCD3ゼータをコードする合成DNAを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって作製する。
抗BCMA TFP構築物は、リンカー:GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号1)をコードするDNA配列によってCD3 DNA断片に連結された抗BCMA scFv DNA断片を、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター(SBI)にクローニングすることによって作製した。作製した抗BCMA TFP構築物は、p510_抗BCMA_CD3γ(抗BCMA scFv(またはVH)-リンカー-ヒトCD3γ鎖)及びp510_抗BCMA_CD3ε(抗BCMA scFv(またはVH)-リンカー-ヒトCD3ε鎖)であった。
完全長BCMAを合成し、p514(SBI)にBamHI及びNheI部位でクローニングして、構築物p514_BCMAを作製し、これを使用して安定した標的細胞株を作製した。
抗CD19 TFP構築物は、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号2)または長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号3)のいずれかをコードするDNA配列によってCD3またはTCR DNA断片に連結された抗CD19 scFv DNA断片を、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって作製した。
作製した抗CD19 TFP構築物は、p510_抗CD19_LL_TCRα(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体α鎖)、p510_抗CD19_LL_TCRαC(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗CD19_LL_TCRβ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗CD19_LL_TCRβC(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3γ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3δ(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3δ鎖)、p510_抗CD19_LL_CD3ε(抗CD19 scFv-長いリンカー-ヒトCD3ε鎖)、p510_抗CD19_SL_TCRβ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3γ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3γ(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3γ鎖)、p510_抗CD19_SL_CD3ε(抗CD19 scFv-短いリンカー-ヒトCD3ε鎖)であった。
抗CD19 CAR構築物であるp510_抗CD19_28ζは、抗CD19、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン及びCD3ゼータをコードする合成DNAを、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって作製した。
抗BCMA、抗CD19、抗CAIX及び抗FAP構築物をコードする例示的な構築物の配列は、参照により本明細書に援用される同時係属の国際特許出願第PCT/US2016/033416号に開示されている。
抗CD22 TFP構築物は、短いリンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLEまたは長いリンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLEのいずれかをコードするDNA配列によってCD3またはTCR DNA断片に連結された抗CD19 scFv DNA断片を、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって作製した。
実施例2:抗体配列
抗体配列の生成
ヒトTAAポリペプチド(複数可)に特異的に結合することができる抗体ポリペプチド及びその断片またはドメインを提供する。抗TAA抗体は、様々な技術を使用して作製することができる(例えば、(Nicholson et al,1997)参照)。マウス抗TAA抗体が出発材料として使用される場合、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療、すなわち、TFP.TAA構築物を形質導入したT細胞による治療を受ける対象において、マウス特異的残基がヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘起し得る臨床環境では、マウス抗TAA抗体のヒト化が望ましい。ヒト化は、マウス抗TAA抗体由来のCDR領域を、適切なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークにグラフト化し、任意選択により、CDR及び/またはフレームワーク領域に他の改変を含めることによって、達成される。本明細書で提供される場合、抗体及び抗体断片の残基ナンバリングは、Kabatに従う(Kabat E.A.et al,1991;Chothia et al,1987)。
ヒトBCMAポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号Q02223である。ヒトROR1ポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号Q01973-1である。ヒトNKG2Dポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P26718-1(アイソフォーム1)である。ヒトIgGのFc部分に特異的に結合することができるポリペプチド及びその断片またはドメインを提供する。
scFvの作製
ヒトまたはヒト化抗TAA IgGを使用して、TFP構築物のscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化V及びVドメインをコードするDNA配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFv中に現れるV及びVドメインの順序は様々であり(すなわち、V-VまたはV-Vの配向)、「G4S」または「GS」サブユニットの3つのコピー(GS)が、これらの可変ドメインを接続してscFvドメインを生成する。抗BCMA scFvプラスミド構築物は、任意のFlag、Hisまたは他の親和性タグを有し得、これをHEK-293または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteonを使用するカイネティクス解析及びTAA発現細胞の染色が含まれる。
例示的な抗ROR1のVL及びVHドメイン、CDRならびにこれらをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第9,316,646号、米国特許出願公開第2016/0208018号及び国際特許公開第WO2016016344号に記載されているものであってよく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。他の例示的な抗ROR1のVL及びVHドメイン、CDRならびにこれらをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、次のモノクローナル抗体:マウス抗ROR1抗体2H6、マウス抗ROR1抗体2A2、ならびに次のポリクローナル抗体:抗ROR1ヤギ抗ROR1抗体カタログ番号:AF2000(R&D Systems)、抗体番号ABIN2869437、マウス抗ROR1抗体番号ABIN969385、抗ROR1抗体番号ABIN1108893、及びウサギポリクローナル抗ROR1抗体カタログ番号ABIN359929(Antibodies Online)のものであってよい。
例示的な抗BMCA及び抗CD19抗体は、同時係属の国際特許公開第WO/2016/187349号に開示されており、参照により本明細書に援用される。例示的な抗BMCA及び抗CD19のV及びVドメインのCDRならびにこれらをコードするヌクレオチド配列を以下にそれぞれ示す。
CD16結合因子
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるCD16 TFPは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本明細書で開示されるCD16 TFPは、配列番号106に記載されるように、CD16の細胞外ドメインのみを含む。
抗ROR1
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体またはその断片は、ラクダ抗体などの単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。一実施形態において、本明細書で開示されるTFP構築物に使用される抗ROR1 sdAbは、配列番号80~96のいずれかによってコードされる。他の実施形態において、抗ROR1抗体またはその断片は、scFvである。例示的な抗ROR1結合因子は、配列番号65によってコードされ、scFv「2-7」をVH_リンカー_VLの配向でコードする。別の例示的な結合因子は、配列番号69によってコードされ、scFv「2-9」をVH_リンカー_VLの配向でコードする。別の例示的な結合因子は、配列番号79によってコードされ、scFv「3-6」をVL_リンカー_VHの配向でコードする。
NKG2Dリガンド(NKG2DL)のNKG2D結合因子
いくつかの実施形態において、NKG2DL結合因子は、単量体であり、例えば、配列番号107に記載される配列によってコードされるものである。他の実施形態において、NKG2DL結合因子は、二量体であり、例えば、配列番号108に記載される配列によってコードされるものである。
抗CD19
抗CD19軽鎖CDR1
コーディング配列:AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA(配列番号25)
アミノ酸配列:RASQDISK(配列番号26)
抗CD19軽鎖CDR2
コーディング配列:ATCTACCATACATCAAGATTA(配列番号27)
アミノ酸配列:IYHTSRL(配列番号28)
抗CD19軽鎖CDR3
コーディング配列:CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG(配列番号29)
アミノ酸配列:QQGNTLPYT(配列番号30)
抗CD19重鎖CDR1
コーディング配列:GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC(配列番号31)
アミノ酸配列:GVSLPDYGVS(配列番号32)
抗CD19重鎖CDR2
コーディング配列:GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC(配列番号33)
アミノ酸配列:VIWGSETTYYNSAL(配列番号34)
抗CD19重鎖CDR3
コーディング配列:CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC(配列番号35)
アミノ酸配列:HYYYGGSYAMDY(配列番号36)
抗CD19軽鎖可変領域
コーディング配列:GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(配列番号37)
アミノ酸配列:DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(配列番号38)
抗CD19重鎖可変領域
コーディング配列:GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号39)
アミノ酸配列:EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号40)
抗BCMA
抗BCMA軽鎖CDR1
コーディング配列:AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT(配列番号41)
アミノ酸配列:KSSQSLVHSNGNTYLH(配列番号42)
抗BCMA軽鎖CDR2
コーディング配列:AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC(配列番号43)
アミノ酸配列:KVSNRFS(配列番号44)
抗BCMA軽鎖CDR3
コーディング配列:GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC(配列番号45)
アミノ酸配列:AETSHVPWT(配列番号46)
抗BCMA重鎖CDR1
コーディング配列:AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC(配列番号47)
アミノ酸配列:KASGYSFPDYYIN(配列番号48)
抗BCMA重鎖CDR2
コーディング配列:TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC(配列番号49)
アミノ酸配列:WIYFASGNSEYNQKFTG(配列番号50)
抗BCMA重鎖CDR3
コーディング配列:CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG(配列番号51)
アミノ酸配列:LYDYDWYFDV(配列番号52)
抗BCMA重鎖可変領域
コーディング配列:CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTTTTGCGCGAGCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC(配列番号53)
アミノ酸配列:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS(配列番号54)
抗BCMA軽鎖可変領域
コーディング配列:GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGCGAGCATTAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATAAAGTGAGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGGATTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCGCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGC(配列番号55)
アミノ酸配列:DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(配列番号56)
抗CD22の例示的な配列
抗CD22軽鎖CDR1
アミノ酸配列:QDIHGY(配列番号57)
抗CD22軽鎖CDR2
アミノ酸配列:YTS(配列番号58)
抗CD22軽鎖CDR3
アミノ酸配列:QQGNTLPWT(配列番号59)
抗CD22重鎖CDR1
アミノ酸配列:GFAFSIYD(配列番号60)
抗CD22重鎖CDR2
アミノ酸配列:ISSGGGTT(配列番号61)
抗CD22重鎖CDR3
アミノ酸配列:ARHSGYGTHWGVLFAY(配列番号62)
抗CD22軽鎖可変領域
アミノ酸配列:EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWQGTLVTVSA(配列番号63)
抗CD22重鎖可変領域
アミノ酸配列:GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(配列番号64)
TCRサブユニット源
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットは全て、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含有する。ヒトTCR複合体は、CD3イプシロンポリペプチド、CD3ガンマポリペプチド、CD3デルタポリペプチド、CD3ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトCD3イプシロンポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P07766である。ヒトCD3ガンマポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P09693である。ヒトCD3デルタポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P043234である。ヒトCD3ゼータポリペプチドの標準配列は、UniProtアクセッション番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖の標準配列は、UniProtアクセッション番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域の標準配列は、UniProtアクセッション番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域の配列は、P04435である。
ヒトCD3イプシロンポリペプチドの標準配列は、MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号4)である。一実施形態において、TFPにおいて使用されるヒトCD3イプシロン断片は、DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号97)である。
ヒトCD3ガンマポリペプチドの標準配列は、MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号5)である。一実施形態において、TFPにおいて使用されるヒトCD3ガンマ断片は、QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号107)である。
ヒトCD3デルタポリペプチドの標準配列は、MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(配列番号6)である。一実施形態において、TFPにおいて使用されるヒトCD3デルタ断片は、FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(配列番号108)である。
ヒトCD3ゼータポリペプチドの標準配列は、MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号7)である。一実施形態において、TFPにおいて使用されるヒトCD3ゼータ断片は、RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号109)である。
ヒトTCRアルファ鎖の標準配列は、MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(配列番号8)である。
ヒトTCRアルファ鎖C領域の標準配列は、PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号9)である。
ヒトTCRアルファ鎖V領域CTL-L17の標準配列は、MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(配列番号10)である。
ヒトTCRベータ鎖C領域の標準配列は、EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号11)である。
ヒトTCRベータ鎖V領域のCTL-L17標準配列は、MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(配列番号12)である。
ヒトTCRベータ鎖V領域YT35の標準配列は、MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(配列番号13)である。
TCRドメイン及びscFvからのTFPの作製
例示的な二重特異性TFPは、BCMA及びCD19に対する結合特異性を有するscFvを含むTFPである。別の例示的な二重特異性TFPは、BCMA及びCD20に対する結合特異性を有するscFvを含むTFPである。別の例示的な二重特異性TFPは、BCMA及びCD22に対する結合特異性を有するscFvを含むTFPである。別の例示的な二重特異性TFPは、CD19及びCD22に対する結合特異性を有するscFvを含むTFPである。
抗TAA scFv(例えば、NKG2D、ROR1など)は、GS、(GS) (GS)または(GS)などのリンカー配列を使用して、CD3イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に組み換えによって連結される。様々なリンカー及びscFvの構造が使用される。TFPの作製には、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖を、完全長ポリペプチドまたはその定常ドメインのみのいずれかで使用する。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の任意の可変配列がTFPの作製に好適である。
CD19 scFvは、上に記載されるようなリンカー配列を使用して、第2のCD3イプシロンまたは他のTCRサブユニットに組み換えによって連結される。
CD16ペプチドは、GS、(GS) (GS)または(GS)などのリンカー配列を使用して、CD3イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に組み換えによって連結される。様々なリンカー及びscFvの構造が利用される。TFPの作製には、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖を、完全長ポリペプチドまたはその定常ドメインのみのいずれかで使用した。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の任意の可変配列がTFPの作製を可能にする。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサープロモーター)、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にする要素(例えば、SV40起点及びColE1または当該技術分野において知られている他のもの)ならびに選択を可能にする要素(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む、発現ベクターが提供される。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物(複数可)は、1つ以上のレンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、発現は、TAA+標的細胞に応答する形質導入T細胞のエフェクターT細胞応答の量及び質に基づいて評価される。エフェクターT細胞応答には、細胞拡大、増殖、倍増、サイトカイン産生及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が含まれるが、これらに限定されない。
単一または二重特異性TFPレンチウイルス転移ベクターを使用して、VSVgシュードタイプ化レンチウイルス粒子中にパッケージ化されるゲノム材料を生成する。レンチウイルス転移ベクターDNAを、Lipofectamine(登録商標)試薬と組み合わせて、VSVgの3つのパッケージング成分gag/pol及びrevと混合し、これらを一緒に293細胞にトランスフェクトする。24時間後及び48時間後、培地を回収し、濾過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を-80℃で保存する。形質導入単位の数は、SupT1細胞(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、(ATCC(登録商標)CRL-1942(商標))での滴定によって決定される。再指向性二重特異性TFP T細胞は、新鮮なナイーブT細胞を抗CD3×抗CD28ビーズで24時間活性化し、次いで、適切な数の形質導入単位を加え、所望の割合の形質導入T細胞を得ることによって作製される。これらの改変T細胞を、細胞が休止してサイズが小さくなるまで増殖させ、この時点で、これらの細胞を後の分析のために凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Coulter Counter(登録商標)Multisizer(商標)3(Beckman Coulter)を使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(細胞表面上にTFP.BCMAを表現するもの)の割合及びその発現の相対的蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合とその相対的蛍光強度とを比較することによって、TFPの相対的発現レベルを調べる。
いくつかの実施形態において、複数のウイルスベクターを用いたT細胞形質導入によって、複数のTFPが導入される。
CD16ウイルス調製
ウイルス調製の力価が高ければ、T細胞表面上のCD16 TFP発現がより高くなることが予測される。表1は、HEK-293細胞から単離された様々な構築物のウイルス力価を示す。
Figure 0007291396000001
ヒト化TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力及びサイトカイン分泌の評価
TFP.TAA T細胞が、細胞表面上に発現されるTFPを産生し、標的腫瘍細胞を殺傷し、増殖し、サイトカインを分泌する機能的能力は、当該技術分野において知られているアッセイを使用して決定される。
ヒトPBMC(例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブT細胞は、T細胞、CD4及びCD8リンパ球に対するネガティブ選択によって得られる)をヒトインターロイキン-2(IL-2)で処理し、次いで、抗CD3×抗CD28ビーズにより、例えば、10%RPMI中、37℃、5%COで活性化し、その後、TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを利用して、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のTFPの存在を確認する。サイトカイン(例えば、IFN-γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定される。
実施例3:ヒトALLマウスモデルにおけるヒトTFP T細胞の有効性
初代ヒトALL細胞は、in vitroで培養する必要なく、免疫不全マウス(例えば、NSGまたはNOD)で成長することができる。同様に、培養したヒトALL細胞株は、かかるマウスで白血病を誘導することができる。ALL担持マウスを使用して、例えば、モデルHALLX5447において、ヒトTFP.TAA T細胞の有効性を試験することができる。このモデルで読み出す情報は、ALL細胞の静脈内(i.v.)注入後における、i.v.投与されたヒトTFP.TAA T細胞の非存在及び存在下でのマウスの生存率である。
実施例4:in vivo固形腫瘍異種移植マウスモデルにおけるヒトTFP T細胞治療
ヒトTFP.TAA T細胞の有効性はまた、ヒトTAAを発現するヒト細胞株由来の皮下固形腫瘍を担持する免疫不全マウスモデルで試験することもできる。ヒトTFP.TAA T細胞治療に応答した腫瘍の縮小は、測径器による腫瘍サイズの測定によって、またはGFP発現腫瘍細胞によって放出されるGFP蛍光シグナルの強度を観察することのいずれかによって評価することができる。
初代ヒト固形腫瘍細胞は、in vitroで培養する必要なく、免疫不全マウスで成長することができる。例示的な固形がん細胞としては、The Cancer Genome Atlas(TCGA)及び/またはBroad Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE、Barretina et al.,Nature 483:603(2012)参照)に示される固形腫瘍細胞株が挙げられる。例示的な固形がん細胞としては、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、腎癌、子宮内膜癌、または胃癌から単離された初代腫瘍細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、治療対象のがんは、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、卵巣ミュラー管混合癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌及び乳腺癌からなる群から選択される。これらのマウスを使用して、ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるTFP.腫瘍関連抗原T細胞の有効性を試験することができる(例えば、Morton et al.,Nat.Procol.2:247(2007)参照)。1×10~1×10個の初代細胞(コラゲナーゼ処理したECマトリックス材料中バルク腫瘍懸濁物)または腫瘍断片(ECマトリックス材料中の初代腫瘍断片)の皮下移植または皮下注射後、腫瘍を200~500mmになるまで成長させてから治療を開始する。
実施例5:TFPを形質導入したT細胞の調製
レンチウイルス作製
適切な構築物をコードするレンチウイルスを以下のように調製する。5×10個のHEK-293FT細胞を100mmのディッシュに播種し、70~90%コンフルエントに達するまで一晩置く。指定のDNAプラスミド2.5μg及び20μLのLentivirus Packaging Mix(ALSTEM、カタログ番号VP100)を、0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM(登録商標)I Mediumに希釈し、緩やかに混合する。別の試験管に、30μLのNanoFect(登録商標)トランスフェクション試薬(ALSTEM、カタログ番号NF100)を、0.5mLの血清を含まないDMEMまたはOpti-MEM I Mediumで希釈し、緩やかに混合する。次いで、NanoFect/DMEM及びDNA/DMEM溶液を一緒に混合し、10~15秒間ボルテックス処理し、その後、DMEM-プラスミド-NanoFect混合物を室温で15分間インキュベートする。前工程から得た完全なトランスフェクション複合体を細胞のプレートに滴加し、振盪してトランスフェクション複合体をプレート上に均等に分散させる。次いで、プレートを、加湿した5%CO2のインキュベータ内で37℃で一晩インキュベートする。翌日、上清を10mLの新しい培地に置き換え、20μLのViralBoost(商標)(500×、ALSTEM、カタログ番号VB100)を追加する。次いで、プレートを37℃で更に24時間インキュベートする。次いで、レンチウイルスを含有する上清を50mLの滅菌蓋付きコニカル遠心管に採取し、氷上に置く。4℃で15分、3000rpmで遠心分離後、澄明な上清を低タンパク質結合性0.45μm滅菌フィルターで濾過し、続いて、ウイルスを4℃で1.5時間、25,000rpmで超遠心分離(Beckmann、L8-70M)することによって単離する。ペレットを取り出し、DMEM培地中に再懸濁し、Lenti-X(商標)qRT-PCR Titrationキット(Clontech(登録商標);カタログ番号631235)を使用する定量RT-PCRによってレンチウイルス濃度/力価を確立する。DNaseIでの処理によって、あらゆる残余プラスミドDNAを取り除く。ウイルスストック調製物は、直ちに感染に使用するか、または、等分して後の使用のために-80℃で保存する。
レンチウイルス力価を確立するために、異なる量のウイルス調製物をJurkat細胞に形質導入した。次いで、形質導入から24時間後に、形質導入したJurkat細胞からDNAを単離した。ウイルス力価を、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)及びアルブミン(内部定量対照)に特異的な社内設計プライマー/プローブを用いる定量リアルタイムPCRによって決定した。
T細胞単離
末梢血単核細胞(PBMC)を全血またはバフィーコートから調製する。全血は、10mLのヘパリンバキュテイナーに採取し、直ちに処理するか、または4℃で一晩保存する。およそ10mLの抗凝固処理した全血を、50mLのコニカル遠心管中、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液(PBS、pH7.4、Ca2+/Mg2+不含)と総体積20mLになるよう混合する。次いで、この血液/PBS混合物20mLを、15mLのFicoll-Paque(登録商標)PLUS(GE Healthcare、17-1440-03)の表面の上に静かに置き、その後、室温、400gで、30~40分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。
バフィーコートは、Research Blood Components(Boston,MA)から購入する。LeucoSep(商標)試験管(Greiner bio-one)を15mLのFicoll-Paque(登録商標)(GE Health Care)を加えることによって調製し、1000gで1分間遠心分離する。バフィーコートは、PBS(pH7.4、Ca2+またはMg2+不含)で1:3に希釈する。希釈したバフィーコートをLeucoSep試験管に移し、1000gで15分間、ブレーキをかけずに遠心分離する。希釈血漿/Ficollの界面に見られるPBMCを含有する細胞層を、Ficoll(登録商標)の混入が最小になるように、慎重に取り出す。次いで、PBMCを40mLのPBSで3回洗浄し、室温で200gで10分間遠心分離することによって、残余のFicoll、血小板及び血漿タンパク質を除去する。次いで、細胞を血球計算盤で計数する。次いで、CD4及びCD8T細胞を、バイアル当たり30~50×10個の細胞の濃度で、凍結培地(90%FBS+10%DMSO中で凍結する。
T細胞活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製したPBMCを抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズで24時間刺激し、その後、ウイルス形質導入を行う。新たに単離したPBMCをCAR-T培地(AIM V-AlbuMAX(BSA、Life Technologies)、5%AB血清ならびに1.25μg/mLのアンホテリシンB(Gemini Bioproducts)、100U/mLのペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシン含有)でhuIL-2なしで1回洗浄し、その後、300IU/mLのヒトIL-2、IL-7またはIL-15(1000×ストックから;Invitrogen)を含むCAR-T培地中に1×10細胞/mLの最終濃度で再懸濁する。
あるいは、凍結CD4/CD8T細胞を予め温めておいたDMEM+10%FBS中で融解し、遠心分離し、次いで、300IU/mLのhuIL2(Thermo Fisher(登録商標))を添加した完全T細胞増殖培地中に1×106細胞/mLの最終濃度で再懸濁する。T細胞の活性化に使用する前に、抗ヒトCD28及び抗ヒトCD3抗体結合磁気ビーズ(Dynabeads(登録商標)、Thermo Fisher)を、磁気ラックを使用して、滅菌した1×PBS(pH7.4)で3回洗浄し、溶液からビーズを分離する。次いで、25μLのビーズ(1×10個のビーズ)を1mLのT細胞懸濁液に移すことによって、T細胞とビーズを1:1の比で混合する。次いで、ビーズ/細胞混合物を、TC無処理12ウェルプレートの単一ウェルに分注し、37℃、5%CO2で、24時間インキュベートする。
活性化の前に、抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズ(例えば、Invitrogen、Life Technologiesから入手可能)を、磁気ラックを使用して、1mLの滅菌した1×PBS(pH7.4)で3回洗浄し、溶液からビーズを分離し、その後、300IU/mLのヒトIL-2を含むCAR-T培地中に再懸濁して、最終濃度4×10ビーズ/mLにした。次いで、25μLのビーズ(1×10個のビーズ)を1mLのPBMCに移すことによって、ビーズ対細胞比1:1でPBMC及びビーズを混合する。次いで、所望数のアリコートを、低付着または無処理の12ウェル細胞培養プレートの単一ウェルに分注し、37℃、5%CO2で、24時間インキュベートした後、ウイルス形質導入を行う。
T細胞の形質導入及び増殖
PBMCの活性化に続き、細胞を37℃、5%COで、24時間、インキュベートする。次いで、レンチウイルスを氷上で融解し、10μg/mlのポリブレン(Sigma)の存在下、指定のMOIで、活性化したT細胞に加えた。細胞を室温で100分間、200gでレンチウイルスとスピノキュレーションした。形質導入された細胞を更に24時間インキュベートし、その後、更にレンチウイルスの形質導入を行った。2回目のレンチウイルス形質導入後、300IU/mLのhIL-2を添加したT細胞増殖培地でT細胞を増殖させ、5×10細胞/mLで一日おきに継代培養した。
いくつかの場合において、活性化されたPBMCは、in vitro転写された(IVT)mRNAとともにエレクトロポレーションを行う。300IU/mlの組み換えヒトIL-2(R&D System)の存在下で、ヒトPBMCをDynabeads(登録商標)(Thermo Fisher(登録商標))と1:1の比で3日間刺激する。ビーズは、エレクトロポレーションの前に除去する。細胞を洗浄し、5%hAB血清(Gemini Bio-Products)及び1%抗生物質を含むOPTI-MEM(登録商標)培地(Thermo Fisher)またはAimV培地(Invitrogen)中に、2.5×10細胞/mLの濃度で、再懸濁する。200μLの細胞懸濁液(5×10個の細胞)をギャップ2mmのElectroporation Cuvettes Plus(商標)(Harvard Apparatus BTX)に移し、氷上で予冷する。この細胞懸濁液に、10μgのIVT TFP mRNAを加える。次いで、mRNA/細胞混合物に対して、ECM830 Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)を使用して、200Vで20ミリ秒間、エレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーションの直後に、細胞を新しい細胞培養培地(AIM V AlbuMAX(登録商標)(BSA)血清不含培地+5%ヒトAB血清+300IU/ml IL-2)に移し、37℃でインキュベートする。
細胞染色によるTFP発現の検証
レンチウイルスの形質導入またはmRNAのエレクトロポレーションに続いて、TFP、例えば、ROR1、NKG2D、CD16または二重特異性TFPの発現をフローサイトメトリーによって確認する。T細胞を、抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD4パシフィックブルー(クローン、RPAT4)、抗CD8-APCCY7(クローン)及び例えば、ヒトNKG2D/CD314-APC(R&D systems、ロット番号LCO061321)ならびにそれぞれのアイソタイプコントロール(BD biosciences)を使用して染色する。
NKG2D TFP T細胞集団
T細胞を3mLの染色用緩衝液(PBS、4%BSA)で3回洗浄し、1×10細胞/ウェルでPBS中に再懸濁する。死細胞を排除するために、細胞をLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Aqua Dead Cell Stain(Invitrogen)とともに氷上で30分間インキュベートする。細胞をPBSで2回洗浄し、50μLの染色緩衝液中に再懸濁する。Fc受容体をブロッキングするために、1μLの1:100に希釈した正常ヤギlgG(BD Bioscience)を各試験管に加え、氷中で10分間インキュベートする。1.0mLのFACS緩衝液を各試験管に加え、よく混合し、細胞を300gで5分間遠心分離することによってペレットにする。scFv TFPの表面発現は、Zenon(登録商標)R-Phycoerythrin標識ヒトNKG2D IgG1 FcまたはヒトIgG1アイソタイプコントロールによって検出する。1μgの抗体をそれぞれの試料に加え、氷上で30分インキュベートする。次いで、細胞を2回洗浄し、BD bioscienceの抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD4パシフィックブルー(クローンRPA-T4)、抗CD8 APCCy7(クローンSK1)を使用して、表面マーカーを染色する。フローサイトメトリーをBD-LSRII Fortessa(登録商標)X20(BD Biosciences)を使用して実施し、データをFACS divaソフトウェアを使用して取得し、FlowJo(登録商標)(Treestar,Inc.(Ashland,OR))で解析する。
例示的な結果を図2Aに示す。これは、CD8(抗CD8 APCCy7、y軸)及びNKG2D(「NKG2D」)(Zenon(登録商標)R-Phycoerythrin標識hNKG2D IgG、x軸)について染色した活性化PBMC細胞の表面発現解析を示す。非形質導入細胞またはNKG2D-CD3ε、NKG2D-CD28ζ及びNKG2D-41BBζ構築物を形質導入した細胞のいずれかが左から右に示されている。CD8,NKG2D細胞の割合を各パネルの右上隅に示す。
二重特異性TFP T細胞集団
抗CD19または抗BCMA scFvを担持するTFPの表面発現は、ビオチン化ヤギ抗マウスF(ab’)(Thermo Fisher)を用いて、試料当たり4.5μg、4℃、30分間で検出される。染色用緩衝液で3回洗浄した後、細胞をPE結合ストレプトアビジン(BD Biosciences、1:1000の希釈)で染色する。抗腫瘍関連抗原(Ag)scFvを担持するTFPの表面発現も同様にAg Fc融合タンパク質での染色によって検出される。Ag Fc融合タンパク質、例えば、BCMA-Fc融合タンパク質は、社内で発現させ、Zenon(登録商標)-PE(Thermo Fisher)を製造元のプロトコルに従って用いて標識する。T細胞をLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Aqua Dead Cell Stainで染色し、ヒトBD Fc Block(商標)でブロッキングし、次いで、試料当たり1μgの標識BCMA_Fc融合試料で染色する。
T細胞マーカー(CD3、CD4、CD8)を、APCマウス抗ヒトCD3抗体(クローンUCHT1、BD Biosciences、1:100の希釈)、PerCP/Cy5.5マウス抗ヒトCD8抗体(クローンSK1、BD Biosciences、1:100の希釈)及びPacific Blue(商標)マウス抗ヒトCD4抗体(クローンRPA-T4、BD Biosciences、1:1000の希釈)で4℃で30分間染色する。染色用緩衝液で2回洗浄した後、次いで、細胞をLSRFortessa(商標)X20(BD Biosciences)にかける。データをFACSDiva(登録商標)を使用して取得し、FlowJo(登録商標)(Treestar,Inc.(Ashland,OR))で解析する。
結果を図2Bに示す。これは、TCRの発現を確認するものであった。細胞は、CD8(y軸)及び抗Fab(上の列)またはBCMA-Fc(下の列)のいずれか(x軸)の表面発現によってソーティングした。空のベクター、抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3εと抗BCMA-CD3εの両方、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した細胞からの結果を示す。
CD16 TFP T細胞集団
CD16(FcγRIIIa)は、主に、NK細胞、好中球、単球、マクロファージ及び白血球に存在する。しかしながら、T細胞とは異なり、NK細胞は、循環リンパ球のごくわずかな割合(5~15%)でしかない。加えて、NK細胞は、ほとんどの従来の遺伝子トランスフェクション/形質導入技術に対して耐性があり、ワクシニアウイルスによる短時間の一過性形質導入が達成されているだけである。しかしながら、外因性T細胞は、より容易に形質導入され、本明細書で開示される方法によって増殖可能であり、これにより、外因性T細胞は、併用療法での抗がん治療薬に対する患者の免疫応答を高めるのに更に適したものになる。
レンチウイルスの形質導入またはmRNAのエレクトロポレーションに続いて、CD16 TFPの発現を、抗CD16-PE抗体及びIgG1k-PE抗体(それぞれカタログ番号555407及び555749;いずれもBD Pharmingen)を使用したフローサイトメトリーによって確認する。T細胞を3mLの染色用緩衝液(PBS、4%BSA)で3回洗浄し、1×10細胞/ウェルでPBS中に再懸濁する。死細胞を排除するために、細胞をLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Aqua Dead Cell Stain(Invitrogen)とともに氷上で30分間インキュベートする。細胞をPBSで2回洗浄し、50μLの染色緩衝液中に再懸濁する。Fc受容体をブロッキングするために、1μLの1:100に希釈した正常ヤギlgG(BD Bioscience)を各試験管に加え、氷中で10分間インキュベートする。1.0mLのFACS緩衝液を各試験管に加え、よく混合し、細胞を300gで5分間遠心分離することによってペレットにする。
図3は、CD20+Raji細胞に抗CD20抗体リツキシマブが結合している模式図を示す。リツキシマブには、CD16 TFPを形質導入したT細胞が結合し、これにより、細胞溶解が誘導される(図3A)。非グリコシル化リツキシマブが使用される場合、CD16 TFPは、抗体に結合することができず、そのため、標的細胞の溶解は誘導されない(図3B)。
CD16 TFPによって検出されるがん抗原の表面発現は、Zenon(登録商標)R-Phycoerythrin標識ヒト抗CD20 IgG1 Fc(例えば、リツキシマブ)または非グリコシル化形態の抗CD20抗体によって検出される。非グリコシル化形態のCD20は、腫瘍細胞表面上のCD20抗原に結合する機能的scFvを有するが、そのFc部分にNからGへの置換を伴うN-グリコシル化変異のため、CD16TFPまたはCARに結合しない。1μgの抗CD20もしくは非グリコシル化抗CD20のそれぞれまたはZenon R-Phycoerythrin単独を、Raji細胞とともに、30分間、氷上でインキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーをLSRFortessa(登録商標)X20(BD Biosciences)を使用して実施し、データをFACS divaソフトウェアを使用して取得し、FlowJo(登録商標)(Treestar,Inc.(Ashland,OR))で解析する。
FACS確認の例示的な結果を図4Aに示す。CD16(抗CD16、x軸)及びCD3(y軸)について染色した細胞を示す。非形質導入細胞またはCD16-CD3ε TFP、CD16-CD3γ TFP、CD16-CD3δ TFP及びCD16-CD3β構築物を形質導入した細胞のいずれか(上の列)と、非形質導入細胞、CD16-CD28ζ CAR、CD16-41BBζ CAR及び陽性対照の抗CD19-CD3ε TFPを形質導入した細胞のいずれかが左から右に示されている。CD3,CD16細胞の割合を各パネルの右上隅に示す。
例示的なZenon染色の結果を図4Bに示す。方法の正確性を実証するために、未染色または抗CD19により染色されるいずれかのRaji細胞(CD19及びCD20の両方を発現する)を、抗CD19 TFPを使用する上記方法に従って処理した。図4Cは、リツキシマブと非グリコシル化リツキシマブの両方がCD19+Raji細胞に結合できたことを示している。
実施例6:フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
抗腫瘍抗原標的に対して陽性または陰性のいずれかである標的細胞を、蛍光色素のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識する。これらの標的細胞を、形質導入なし、対照のCAR-T構築物による形質導入、またはTFPによる形質導入のいずれかを行ったエフェクターT細胞と混合する。指定のインキュベーション期間後、それぞれのエフェクター/標的細胞培養物について、CFSE標識標的細胞の生死細胞及び陰性対照の標的細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定する。各T細胞+標的細胞培養物における標的細胞の生存率(%)を、標的細胞のみを含有するウェルを基準として算出する。
エフェクターT細胞、または抗がん作用物質とエフェクターT細胞の組み合わせ(例えば、抗がん抗体とCD16 TFP)の細胞傷害活性は、エフェクター細胞と標的細胞のコインキュベーション後における、エフェクターT細胞ありまたはなしの標的細胞中の生存標的細胞の数を、フローサイトメトリーを使用して比較することによって測定する。抗腫瘍抗原TFPまたはCAR-T細胞との実験において、標的細胞は、腫瘍抗原陽性細胞であり、陰性対照として使用される細胞は、腫瘍抗原陰性細胞である。
標的細胞を1回洗浄し、PBS中に1×10細胞/mLで再懸濁する。蛍光色素のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)(Thermo Fisher(登録商標))を0.03μMの濃度で細胞懸濁液に加え、細胞を室温で20分間インキュベートする。完全細胞培養培地(RPMI-1640+10%HI-FBS)を反応体積の5倍の体積で細胞懸濁液に加えることによって標識反応を止め、室温で更に2分間、細胞をインキュベートする。細胞を遠心分離によってペレットにし、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen)+5%AB血清(Gemini Bioproducts)中に2×10細胞/mLで再懸濁する。50マイクロリットルのCFSE標識標的細胞懸濁液(10,000細胞に相当)をU底96ウェルプレート(Corning)の各ウェルに加える。
抗腫瘍抗原TFP構築物を形質導入したエフェクターT細胞を、陰性対照の非形質導入T細胞とともに洗浄し、細胞傷害性培地中に2×10細胞/mLまたは1×10細胞/mLで再懸濁する。50μLのエフェクターT細胞懸濁液(100,000または50,000細胞に相当)を、播種した標的細胞に加え、総体積100μL中、エフェクター対標的比がそれぞれ10:1または5:1になるようにする。次いで、培養物を混合し、遠心し、37℃、5%COで4時間インキュベートする。このインキュベーションの直後、この培養した細胞に、7AAD(7-アミノアクチノマイシンD)(BioLegend)を製造元の推奨のとおりに加え、フローサイトメトリーをBD Fortessa X-20(BD Biosciences)により実施する。フローサイトメトリーのデータの解析をFlowJo(登録商標)ソフトウェア(TreeStar,Inc.)を使用して実施する。
RPMI-8226標的細胞の生存率(%)は、エフェクターT細胞及び標的細胞を含む試料における生存RPMI-8226標的細胞(CFSE+7-AAD-)の数を、標的細胞のみを含む試料における生存RPMI-8226(CFSE+7-AAD-)細胞の数で除することによって算出する。エフェクター細胞の細胞傷害性は、RPMI-8226の殺傷率(%)=100%-RPMI-8226細胞の生存率(%)として算出する。
抗腫瘍抗原-28ζ CAR構築物を形質導入したT細胞は、非形質導入T細胞または非腫瘍関連抗原特異的CAR対照を形質導入したT細胞のいずれかと比較した場合、腫瘍抗原発現細胞に対して細胞傷害性を示し得る。しかしながら、抗腫瘍関連抗原-CD3εを形質導入したT細胞は、抗腫瘍関連抗原CAR対照よりも、標的に対して効果的な細胞傷害性を誘導し得る。抗腫瘍関連抗原-CD3γ TFPもまた、5~10:1のエフェクター:標的比で、抗腫瘍関連抗原-CARで観察される細胞傷害性よりも高く強力な細胞傷害性を媒介し得る。抗腫瘍関連抗原-TCRα TFP及び抗腫瘍関連抗原-TCRβ TFPでもある程度の細胞傷害性が観察され得る。代替ヒンジ領域を用いて構築された抗腫瘍関連抗原TFPでも同様の結果が得られ得る。この場合でも、腫瘍関連抗原を発現する標的細胞に対する細胞傷害性は、抗腫瘍関連抗原-CARを形質導入したT細胞よりも、抗腫瘍関連抗原-CD3ε TFPまたは抗腫瘍関連抗原-CD3γ TFPを形質導入したT細胞のほうが大きいだろう。
実施例7:リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性:NKG2D TFP T細胞
NKG2D TFPも同様に、リアルタイム細胞傷害性アッセイ(RTCA)フォーマットにおいて、NKG2D CARよりも優れた細胞傷害性を示し得る。RTCAアッセイは、専用96ウェルプレートの各ウェルで接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終読み出し値を細胞指数と呼ばれる値で示すものである。細胞指数の変化は、コインキュベートしたT細胞エフェクターによる標的細胞の殺傷の結果として、標的細胞単層が破壊されることを示す。したがって、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞とエフェクターT細胞の両方を含むウェルの細胞指数の変化と、標的細胞のみを含むウェルの細胞指数の変化を比較して評価することができる。
接着性標的細胞を、DMEM、10%FBS、1%抗生物質抗真菌剤(Life Technologies)で培養する。RTCAを準備するために、例えば、DMEM培地50μLをE-プレート(ACEA Biosciences,Inc、カタログ番号:JL-10-156010-1A)の適切なウェルに加える。次いで、プレートをRTCA MP装置(ACEA Biosciences,Inc.)に入れ、適切なプレートレイアウト及びアッセイスケジュールをRTCA2.0ソフトウェアに製造元のマニュアルに記載のとおりに入力する。ベースライン測定は、100回の測定について15分毎に実施する。次いで、体積100μL中1×10個の標的細胞を各アッセイウェルに加え、細胞を15分間静置する。プレートを読み取り装置に戻し、読み取りを再開する。
翌日、エフェクターT細胞を洗浄し、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen)+5%AB血清(Gemini Bioproducts;100-318))中に再懸濁する。次いで、プレートを装置から取り出し、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640+5%AB血清)中に懸濁したエフェクターT細胞を100,000細胞または50,000細胞で各ウェルに加え、エフェクター対標的比がそれぞれ10:1または5:1になるようにする。次いで、プレートを装置に戻す。測定を100回の測定については2分毎に行い、その後、1,000回の測定については15分毎に行う。
RTCAアッセイにおいて、NKG2Dを形質導入した細胞の殺傷は、NKG2D-28ζ CARを形質導入したT細胞によって観察され得、エフェクター細胞の添加後における、細胞単独または対照のCAR構築物を形質導入したT細胞とコインキュベートした細胞に対する細胞指数の時間依存的減少によって示される。しかしながら、NKG2D-CD3ε TFPを発現するT細胞による標的細胞の殺傷は、NKG2D CARで観察される殺傷よりも深く、迅速であり得る。例えば、NKG2D-CD3ε TFPを形質導入したT細胞の添加から4時間以内に、NKG2DLを発現する標的細胞の殺傷が本質的に完遂し得る。他のCD3及びTCR構築物を含むいくつかのTFP構築物を形質導入したT細胞では、殺傷はほとんどまたは全く観察され得ない。代替ヒンジ領域を用いて構築されたNKG2D TFPでも同様の結果が得られ得る。NKG2Dを形質導入した標的細胞に対する細胞傷害性は、NKG2D-CARを形質導入したT細胞よりも、NKG2D-CD3ε TFPまたはNKG2D-CD3γ TFPを形質導入したT細胞のほうが大きいだろう。
TFPを形質導入したT細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用されるウイルス量(MOI)に対して用量依存的であり得る。NKG2DL陽性細胞の殺傷増加は、NKG2D-CD3ε TFPレンチウイルスのMOIの増加とともに観察され、TFP形質導入と細胞傷害性との関係を更に強め得る。
NKG2D TFP構築物は、リンカー:GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号1)をコードするDNA配列によってCD3ε DNA断片に連結されたNKG2D scFv DNA断片を、XbaI及びEcoRI部位でp510ベクター(SBI)にクローニングすることによって作製する。作製されるNKG2D TFP構築物は、例えば、p510_抗NKG2D_SS1_CD3ε(NKG2D SS1 scFv-リンカー-ヒトCD3ε鎖)である。
完全長NKG2Dは、pCMV6_XL4_NKG2D(Origene)からPCR増幅し、単量体またはリンカーを含む二量体は、Gibson Recombination反応を介してXbaI及びEcoRI制限酵素消化したp527a(pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro)(SBI)にクローニングする。
RTCA用の標的細胞は、例えば、NKG2DHeLa細胞(子宮頸部腺癌、ATCC(登録商標)CCL-2(商標))であり、NKG2D陰性PC-3細胞(前立腺癌、ATCC(登録商標)CRL-1435(商標))が陰性対照として使用される。接着性標的細胞を、10%FBS及び1%抗生物質抗真菌剤を含むDMEM(Life Technologies)で培養する。
次いで、細胞傷害性を示す、正規化された細胞指数を決定する。活性化したPBMCは、未処理、形質導入なし、または空のベクター、NKG2D TFP)、CD28ζもしくは41BBζシグナル伝達ドメインを含むNKG2D CARの形質導入がなされる。
標的NKG2D陽性HeLa細胞は、陰性対照と比較して、抗NKG2D TFPを形質導入したT細胞によって効果的に殺傷される。対照的に、NKG2D陰性PC-3細胞は、いずれの構築物によっても効果的に殺傷されない。
抗NKG2D CAR及びTFP構築物を発現するT細胞の活性化は、NKG2D及びNKG2DK562細胞を使用して実施する。上記のとおり、活性化したPBMCに50MOIのLVを2日間連続して形質導入し、増殖させる。形質導入後8日目に、PBMCの共培養液を、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen)+5%AB血清(Gemini Bioproducts;100-318)中、E:T比1:1(各細胞型0.2×10個)で標的細胞(NKG2Dを過剰発現するK562細胞)と組み合わせた。BCMAを過剰発現するK562細胞を陰性対照として使用した。共培養開始から24時間後、細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、Live/Dead Aquaにより氷上で30分間染色する。Fc受容体をブロッキングするために、ヒトFcブロック(BD)を加え、室温で10分間インキュベートする。その後、細胞を、BD Biosciencesの抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD8 APCcy7(クローンSK1)、抗CD69-Alexa Fluor(登録商標)700(クローンFN50)及び抗CD25-PE(クローンBC96、eBioscience)で染色する。細胞を2回洗浄し、BD LSRII-Fortessaによって解析する。データを、上記のとおり、FlowJo(登録商標)解析ソフトウェア(Treestar,Inc.)を使用して解析する。
T細胞は、形質導入しないもの、空のベクターを形質導入したもの、抗NKG2D-CD3ε TFP、抗NKG2D-28ζ CARまたは抗NKG2D-41BBζ CARを形質導入したもののいずれかである。示されるように、抗NKG2D CAR及びTFP構築物を発現するT細胞は、NKG2D細胞と培養することによって活性化されるが、NKG2D-細胞では活性化されない。データは、NKG2D発現細胞がT細胞を特異的に活性化させる能力があることを示す。
T細胞の活性化は、グランザイムB産生の分析によって同様に評価され得る。T細胞を上記のとおりに培養及び増殖し、グランザイムBの細胞内染色を製造元のキット説明書(Gemini Bioproducts;100-318)に従って行う。細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、ヒトFcブロックで10分間ブロッキングする。表面抗原について、細胞を抗CD3 APC(クローン、UCHT1)及び抗CD8 APCcy7(クローンSK1)により、4℃で30分間染色する。次いで、細胞を固定/透過処理溶液(BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilizationキット カタログ番号554714)により4℃で20分間固定し、続いて、BD Perm/Wash緩衝液で洗浄した。その後、細胞を抗Granzyme B Alexafluor700(クローンGB11)で染色し、BD Perm/Wash緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁する。データをBD LSRII-Fortessaで取得し、FlowJo(登録商標)(Tree star Inc.)を使用して解析する。
T細胞は、形質導入しないもの、空のベクターを形質導入したもの、抗NKG2D-CD3ε TFP、抗NKG2D-28ζ CARまたは抗NKG2D-41BBζ CARを形質導入したもののいずれかである。抗NKG2D CAR及びTFP構築物を発現するT細胞は、NKG2D細胞と培養することによって活性化されるが、NKG2D-細胞では活性化されない。NKG2Dリガンド細胞及びNKG2Dリガンド細胞において、各構築物のグランザイムB陽性細胞の割合を決定する。
実施例8:リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性:CD16 TFP T細胞
標的細胞及び形質導入したT細胞の調製をNKG2Dについて上に記載したとおりに実施する。
RTCAアッセイにおいて、Agを形質導入した細胞の殺傷は、CD16-28ζ CARを形質導入したT細胞によって観察され得、エフェクター細胞の添加後における、細胞単独または対照のCAR構築物を形質導入したT細胞とコインキュベートした細胞に対する細胞指数の時間依存的減少によって示される。しかしながら、CD16-CD3ε TFPを発現するT細胞による標的細胞の殺傷は、CD16 CARで観察される殺傷よりも深く、迅速であり得る。例えば、CD16-CD3ε TFPを形質導入したT細胞及び抗TAA抗体の添加から4時間以内に、Agを発現する標的細胞の殺傷が本質的に完遂し得る。他のCD3及びTCR構築物を含むいくつかのTFP構築物を形質導入したT細胞では、殺傷はほとんどまたは全く観察され得ない。代替ヒンジ領域を用いて構築されたCD16 TFPでも同様の結果が得られ得る。Agを形質導入した標的細胞に対する細胞傷害性は、CD16-CARを形質導入したT細胞よりも、CD16-CD3ε TFPまたはCD16-CD3γ TFPを形質導入したT細胞のほうが大きいだろう。
抗TAA抗体と組み合わせた、CD16 TFPを形質導入したT細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用されるウイルス量(MOI)に対して用量依存的であり得る。Ag陽性細胞の殺傷増加は、CD16-CD3ε TFPレンチウイルスのMOIの増加及び抗Ag抗体の用量増加とともに観察され、TFP形質導入と細胞傷害性との関係を更に強め得る。
CD16 TFP構築物は、リンカー:GGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号1)をコードするDNA配列によってCD3ε DNA断片に連結されたCD16 DNA断片を、XbaI及びEcoRI部位でp510ベクター(SBI)にクローニングすることによって作製する。
RTCA用の標的細胞は、例えば、Ag陽性HeLa細胞(子宮頸部腺癌、ATCC(登録商標)CCL-2(商標))であり、Ag陰性細胞、例えば、PC-3細胞(前立腺癌、ATCC(登録商標)CRL-1435(商標))が陰性対照として使用される。接着性標的細胞を、10%FBS及び1%抗生物質抗真菌剤を含むDMEM(Life Technologies)で培養する。
次いで、細胞傷害性を示す、正規化された細胞指数を決定する。活性化したPBMCは、未処理、形質導入なし、または空のベクター、CD16 TFP、CD28ζもしくは41BBζシグナル伝達ドメインを含むCD16 CARの形質導入がなされる。
標的Ag陽性HeLa細胞は、陰性対照と比較して、CD16 TFPを形質導入したT細胞と組み合わせた抗Ag抗体によって効果的に殺傷される。対照的に、Ag陰性PC-3細胞は、いずれの構築物によっても効果的に殺傷されない。
抗CD16 CAR及びTFP構築物を発現するT細胞の活性化は、CD16及びCD16K562細胞を使用して実施される。上記のとおり、活性化したPBMCに50MOIのLVを2日間連続して形質導入し、増殖させる。形質導入後8日目に、PBMCの共培養液を、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen)+5%AB血清(Gemini Bioproducts;100-318)中、E:T比1:1(各細胞型0.2×10個)で標的細胞(CD16を過剰発現するK562細胞)と組み合わせた。BCMAを過剰発現するK562細胞を陰性対照として使用した。共培養開始から24時間後、細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、Live/Dead Aquaにより氷上で30分間染色する。Fc受容体をブロッキングするために、ヒトFcブロック(BD)を加え、室温で10分間インキュベートする。その後、細胞を、BD Biosciencesの抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD8 APCcy7(クローンSK1)、抗CD69-Alexa Fluor(登録商標)700(クローンFN50)及び抗CD25-PE(クローンBC96、eBioscience)で染色する。細胞を2回洗浄し、BD LSRII-Fortessaによって解析する。データを、上記のとおり、FlowJo(登録商標)解析ソフトウェア(Treestar,Inc.)を使用して解析する。
T細胞は、形質導入しないもの、空のベクターを形質導入したもの、CD16-CD3ε TFP、CD16-28ζ CARまたはCD16-41BBζ CARを形質導入したもののいずれかである。示されるように、CD16 CAR及びTFP構築物を発現するT細胞は、Ag+細胞及び有効量の抗Ag抗体と培養することによって活性化されるが、Ag-細胞では活性されない。データは、Ag発現細胞が抗Ag抗体の存在下でT細胞を特異的に活性化させる能力があることを示す。
T細胞の活性化は、グランザイムB産生の分析によって同様に評価され得る。T細胞を上記のとおりに培養及び増殖し、グランザイムBの細胞内染色を製造元のキット説明書(Gemini Bioproducts;100-318)に従って行う。細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、ヒトFcブロックで10分間ブロッキングする。表面抗原について、細胞を抗CD3 APC(クローン、UCHT1)及び抗CD8 APCcy7(クローンSK1)により、4℃で30分間染色する。次いで、細胞を固定/透過処理溶液(BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilizationキット カタログ番号554714)により4℃で20分間固定し、続いて、BD Perm/Wash緩衝液で洗浄した。その後、細胞を抗Granzyme B Alexafluor700(クローンGB11)で染色し、BD Perm/Wash緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁する。データをBD LSRII-Fortessaで取得し、FlowJo(登録商標)(Tree star Inc.)を使用して解析する。
T細胞は、形質導入しないもの、空のベクターを形質導入したもの、CD16-CD3ε TFP、CD16-28ζ CARまたはCD16-41BBζ CARを形質導入したもののいずれかである。CD16 CAR及びTFP構築物を発現するT細胞は、Ag細胞と培養することによって活性化されるが、Ag細胞では活性されない。Ag細胞及びAg細胞において、各構築物のグランザイムB陽性細胞の割合を決定する。
実施例9:NKG2D TFP-T細胞は、in vitroで、抗原特異的に増殖し、NKG2Dリガンドを発現する腫瘍細胞を溶解する。
NKG2D TFP T細胞のin vitroにおける有効性を更に評価するために、TFP T細胞の3群:単量体NKG2D-CD3ε、二量体NKG2D-CD3ε及び形質導入なしを試験した。単量体及び二量体NKG2D TFPの模式図を図5に示す。
材料及び方法
レンチウイルス作製
レンチウイルスを293TN Producer Cell Line(System Biosciences,Inc.、LV900A-1)の一過性トランスフェクションによって調製し、TFP及びCAR構築物を、CD3イプシロン鎖に融合したNKG2D受容体配列の単量体または二量体を使用して作製した(付録A参照)。
T細胞の単離及びレンチウイルスの形質導入
CD4及びCD8T細胞をLeukopack(登録商標)試料(HemaCare、ドナーID:W313716040891)から精製した。白血球除去療法の試料を、CD4及びCD8 MACSビーズを用いて、自動cliniMACS(登録商標)Prodigy自動システム(Miltenyi)を製造元の説明書に従って使用して、CD4及びCD8T細胞濃縮に供した。
T細胞を、1:1の比でDynabeadsを使用して活性化し、5%ヒトAB血清(Gemini Bio Products、カタログ番号100-318)及び1%Penicillin-Streptomycin(Gibco、カタログ番号15240-062)を含むAimV培地(Invitrogen)中に、300IU/mlのIL-2(Peprotech)の存在下で維持した。Dynabeadで活性化したT細胞に、ポリブレン(5μg/ml)の存在下、レンチウイルスをそれぞれ10MOI(Jurkat細胞を使用して滴定したウイルス)で形質導入し、形質導入から24時間後に100×Gで100分間、1回、スピノキュレーションした。
形質導入効率の決定
形質導入効率をフローサイトメトリーによって決定した。T細胞を、抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD4-パシフィックブルー(クローン、RPAT4)、抗CD8-APCCY7(クローン)、ヒトNKG2D/CD314-APC(R&D systems、ロット番号LCO061321)及びそれぞれのアイソタイプコントロール(BD biosciences)を使用して染色した。細胞をBD-LSRII Fortessa(登録商標)X20を使用して解析した。
細胞株及び腫瘍細胞表面上の抗原発現:
卵巣癌細胞株OVCAR3及びOVCAR5をATCCから購入した。AE17中皮腫細胞株をSigmaから購入した。全細胞株を製造元の説明書に従って成長させた。腫瘍細胞表面上の抗原発現を、抗MICA/B-R-フィコエリトリン(PE)(BD Pharmingen(商標)、ロット番号6049687)、抗ULBP-2/5/6-PE(R&D systems、ロット番号LWE0716091)、IgG1 kアイソタイプコントロール-PE(BD Pharmingen、ロット番号6070641)を使用して決定した。細胞表面染色を標準プロトコルを使用して実施し、BD-LSRII Fortessa(登録商標)X20を使用して解析した。
抗原特異的T細胞の増殖の決定:
増殖アッセイを次のとおりに実施した:100μlの1X PBS中、100μg/ウェルのULBP2-Fc(R&D systems、ロット番号GMI0316041)またはIgGコントロールを高結合96ウェルプレートに4℃で一晩コーティングした。プレートを1X PBSで洗浄し、1%BSAを用いて4℃で20分間ブロッキングし、1X PBSで再度洗浄した。1ウェル当たり5000個のCFSC標識T細胞を播種し、37℃で3日間インキュベートした。4日目に、細胞の生死染色を確立されたプロトコルに従って実施し、BD-LSRII Fortessa(登録商標)X20を使用して解析した。
抗原特異的腫瘍溶解の決定:
96ウェルRTCAプレートで、卵巣癌細胞株OVCAR3もしくはOVCAR5または中皮腫細胞株AE17を、NKG2D CD3e TFPまたは非形質導入T細胞とE:T比1:5、1:1及び5:1で共培養した。生存している接着性腫瘍細胞の存在を、RTCAプレートの底部の電極によって捕捉された電気インパルスとして記録した。非接着性の死細胞は、電極によって記録されないことから、細胞数は、確立された標準プロトコル後、低下する。
結果
T細胞をCD4及びCD8T細胞で濃縮し、指定のレンチウイルスベクターを形質導入した(図6)。上記のように、CD3及びCD28 Dynabeadsを使用してT細胞を刺激し、IL-2の存在下で培養した。図7A~Cは、MSTO-MSLN-Luc細胞、OVCAR3-Luc、SaOS2-Luc及びSKOV3-Luc細胞に抗ULBP1、抗ULBP2/5/6、抗ULBP3、抗ULBP4及び抗MICA/B(左から右)を使用した、NKG2Dリガンドに対するZenon染色を示す。各グラフにおいて、上の図は、抗NKG2Dリガンドであり、中央の図は、アイソタイプコントロールまたは二次抗体単独であり、下の図は、未染色細胞である。
モノ及びジNKG2D CD3ε TFPの形態を抗NKG2D表面染色によって評価した。本発明者らのデータは、モノNKG2D CD3ε TFPバリアントと比較した場合、ジNKG2D CD3ε TFPバリアントが最も効率的に表面上に発現されるのに対し、アイソタイプコントロールは、全てのT細胞群に対して陰性であることを明示した(図2A参照)。
NKG2D CD3ε TFP T細胞の抗原特異性を決定するために、CFSC標識T細胞を、3日間の培養期間、プレート上にコーティングされたULBP-2と共培養した。二量体NKG2D CD3ε TFP T細胞は、非形質導入T細胞とは異なり、60ng/mlもの低い濃度で抗原の存在下増殖する(図6A中、赤い矢印で示す)。モノNKG2D CD3ε TFP T細胞は、250ng/mlの抗原濃度まで増殖する(図6A中、矢印で示す)。ジNKG2D CD3ε TFPの増殖能力の増大は、モノNKG2D CD3e TFPと比較してT細胞表面上のジNKG2D CD3eの表現が多いことに起因し得る。形質導入条件または非形質導入条件のいずれも、プレートに結合したアイソタイプコントロールの存在下では増殖しない。
NKG2D CD3ε TFP T細胞の抗原特異的腫瘍溶解能力を評価するために、エフェクター細胞及び腫瘍細胞をE:T比1:5、1:1及び5:1で共培養した。表面上にNKG2DLを発現した卵巣癌細胞を、NKG2DL発現に関するフローサイトメトリー解析によって評価した。OVCAR3及びOVCAR5は、アイソタイプコントロールまたは未染色試料と比較して、MICA/B及びULBP2/5/6の両方に対して陽性であった。AE17マウス腫瘍細胞株は、NKG2DL抗原発現に対して陰性であり、フローサイトメトリーによって評価した場合、PEチャネルのアイソタイプコントロールまたは未染色試料と同様のプロファイルを有した(図6B)。
RTCAアッセイによって評価した抗原特異的腫瘍溶解能力は、二量体NKG2D CD3ε TFP T細胞及び単量体NKG2D CD3ε TFP T細胞が1:5の比では同程度に抗原陽性腫瘍細胞を溶解することを示したのに対し、1:1及び5:1の比では、モノNKG2D CD3ε TFPは、ジNKH2D CD3ε T細胞と比較して、TFP発現が低いため、遅延した腫瘍溶解を示した(図7A~C)。抗原陰性AE17マウス腫瘍細胞株または非形質導入T細胞の条件では腫瘍溶解は観察されなかった。
これらの結果は、非形質導入T細胞と比較して、モノ及びジNKG2D CD3ε TFP T細胞に抗原特異的増殖及び腫瘍溶解があることを示している。
実施例10:ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイ:二重特異性TFP T細胞
ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイ(「Luc-Cyto」アッセイ)は、共培養後の残存生標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することによって、TFP T細胞の細胞傷害性を評価するものである。Luc-Cytoアッセイに使用した標的細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定的に形質導入されたHeLa-BCMAt細胞及びHeLa-CD19t細胞であった。ホタルルシフェラーゼをコードするDNAは、GeneArt(登録商標)(Thermo Fisher(登録商標))によって合成されたものであり、単一プロモーターレンチウイルスベクターpCDH527A-1(System Bioscience)のマルチクローニングサイトに挿入した。ホタルルシフェラーゼを保有するレンチウイルスを、セクション1.1に記載の手順と同じ手順でパッケージ化した。次いで、HeLa-BCMAt細胞及びHeLa-CD19t細胞に、レンチウイルスを保有するホタルルシフェラーゼ構築物を24時間形質導入した後、ピューロマイシン(5μg/mL)で選択した。HeLa-BCMAt-ルシフェラーゼ細胞またはHeLa-CD19t-ルシフェラーゼ細胞の生成を、Bright-Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega)を用いて細胞内のルシフェラーゼ酵素活性を測定することによって確認した。
結果を図8に示す。T細胞には、空の発現ベクターを形質導入するか、次のTFP:抗CD19-CD3ε、抗BCMA-CD3ε、抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3ε、抗CD19-CD3ε/抗BCMA-CD3γ、抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3ε、または抗CD19-CD3ε+抗BCMA-CD3γを形質導入した。形質導入したT細胞を、CD19を安定的に発現するHeLa細胞(図8A)、BCMAを安定的に発現するHeLa細胞(図8B)、またはCD19及びBCMAの両方を安定的に発現するHeLa細胞(図8C)とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。標的細胞(本アッセイの場合、HeLa-BCMAt-ルシフェラーゼまたはHeLa-CD19t-ルシフェラーゼ)を96-ウェルプレートに5000細胞/ウェルで播種した。TFP T細胞を所望のエフェクター対標的比で標的細胞に加えた。次いで、細胞の混合物を37℃、5%COで24時間培養し、その後、生標的細胞内のルシフェラーゼ酵素活性をBright-Glo(登録商標)Luciferase Assay Systemによって測定した。細胞を遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁した。ルシフェラーゼは、細胞溶解によって放出されるため、ルシフェラーゼ活性が高いほど細胞死の割合が大きくなる。図に示されるように、二重特異性TFP T細胞集団は、単一の構築物単独のいずれよりも大きな割合の細胞を殺傷した。
実施例11:Luminex(登録商標)によるIL-2及びIFN-γ分泌:二重特異性TFP T細胞
標的細胞に接触したエフェクター細胞によるサイトカイン放出のレベルを検出するために、2-Plexアッセイを、ヒトサイトカインMagnetic Buffer Reagent Kit(Invitrogen、LHB0001M)をヒトIL-2 Magnetic Bead Kit(Invitrogen、LHC0021M)及びヒトIFN-γ Magnetic Bead Kit(Invitrogen、LHC4031M)とともに使用して実施した。サイトカイン産生を、図8に示す解析でペレット化した細胞の上清で測定した。
結果を図9に示し、IFNγ(斜線の付いた棒)及びIL-2(無地の棒)の量を示す。上記のように、形質導入したT細胞を、CD19を安定的に発現するHeLa細胞(図9A)、BCMAを安定的に発現するHeLa細胞(図9B)、またはCD19及びBCMAの両方を安定的に発現するHeLa細胞(図9C)とともにインキュベートした。「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。総サイトカイン産生をY軸に示す。図に示されるように、二重特異性TFPで処理した細胞からのサイトカイン産生は、単一特異性TFPのものより高くなかった。ほとんどの場合、サイトカインの産生は低く、これは、本明細書に記載される改変T細胞による治療を受ける患者に対して毒性の増大がない可能性を示している。
実施例12:ELISAによるIL-2及びIFN-γ分泌:NKG2D TFP T細胞
同種抗原を担持するT細胞の認識と関連するエフェクターT細胞活性化及び増殖の別の尺度は、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)などのエフェクターサイトカインの産生である。
ヒトIL-2に対するELISAアッセイ(カタログ番号EH2IL2、Thermo Scientific(登録商標))及びIFN-γ カタログ番号KHC4012、Invitrogen)を製品挿入物の記載のとおりに実施する。一例において、50μLの再構成した標準または試料を二連で96ウェルプレートの各ウェルに加え、続いて50μLのBiotinylated Antibody Reagentを加える。プレートを静かに数回タッピングすることによって、試料を混合する。次いで、標準も試料も含まないウェルの全てに50μLのStandard Diluentを加え、プレートを接着プレートカバーで慎重に密閉し、その後、室温で3時間インキュベート(20~25℃)する。次いで、プレートカバーを取り外し、プレートのなかを空にし、各ウェルをWash Bufferで満たす。この洗浄手順を合計3回繰り返し、プレートを紙タオルまたは他の吸収材料上で乾かす。調製した100μLのStreptavidin-HRP Solutionを各ウェルに加え、新しいプレートカバーを付け、その後、室温で30分間インキュベートする。プレートカバーを再び取り外し、プレートの内容物を捨て、100μLのTMB Substrate Solutionを各ウェルに加える。室温の暗所で30分間反応させ、その後、100μLのStop Solutionを各ウェルに加える。プレートを評価する。反応停止から30分以内に、吸光度を、450nm及び550nmに設定したELISAプレートリーダーで測定する。450nmの値から550nmの値を引き、未知試料中のIL-2量をIL-2標準曲線から得た値を基準として算出する。
あるいは、2-Plexアッセイを、ヒトサイトカインMagnetic Buffer Reagent Kit(Invitrogen、LHB0001M)をヒトIL-2 Magnetic Bead Kit(Invitrogen、LHC0021M)及びヒトIFN-γ Magnetic Bead Kit(Invitrogen、LHC4031M)とともに使用して実施する。簡潔に述べれば、25μLのヒトIL-2及びIFN-γ抗体ビーズを96ウェルプレートの各ウェルに加え、次のガイドラインを使用して洗浄する:1×洗浄液200μLでの洗浄2回、プレートをMagnetic 96-well plate Separator(Invitrogen、A14179)に接触させて配置、ビーズを1分間沈降、及び液体のデカント。次いで、50μLのIncubation Bufferを、100μLの再構成した標準とともに2連で、または50μLの試料(細胞傷害性アッセイの上清)及び50μLのAssay Diluentとともに3連で、プレートの各ウェルに加え、合計体積150μLにする。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で2時間、600rpmで混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、100μLのヒトIL-2及びIFN-γビオチン化検出抗体を各ウェルに加える。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で1時間、600rpmで混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、100μLのStreptavidin-R-Phycoerythrinを各ウェルに加える。試料を暗所にて、軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて、室温で30分間、600rpmで混合する。同じ洗浄ガイドラインを使用してプレートを3回洗浄し、液体をデカントした後、試料を1×洗浄液150μL中に再懸濁する。試料を軌道半径3mmのオービタルシェーカーを用いて3分間600rpmで混合し、4℃で一晩保存する。その後、同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、試料を1×洗浄液150μL中に再懸濁する。
プレートをMAGPIX System(Luminex)及びxPONENTソフトウェアを使用して読み取る。データ解析は、MILLIPLEX Analystソフトウェアを使用して実施し、これにより、標準曲線及びサイトカイン濃度を得る。
非形質導入細胞または対照のCARを形質導入したT細胞と比較して、NKG2D TFPを形質導入したT細胞は、NKG2Dを内因的に発現する細胞またはNKG2Dを形質導入した細胞のいずれかと共培養した場合、IL-2及びIFN-γの両方を高レベルで産生し得る。対照的に、NKG2D陰性細胞または非形質導入細胞との共培養では、TFPを形質導入したT細胞からのサイトカイン放出は、ほとんどまたは全くもたらされ得ない。先の細胞傷害性データと一致して、代替ヒンジ領域を用いて構築されたNKG2D TFPは、NKG2Dを担持する標的細胞と共培養した場合、同様の結果をもたらし得る。
先の細胞傷害性データと一致して、NKG2D-CD3ε及びNKG2D-CD3γは、各TFP構築物のうち、最大レベルのIL-2及びIFN-γをもたらし得る。しかしながら、NKG2D-CD3ε TFP及びNKG2D-CD3γ TFPを形質導入したT細胞によるサイトカイン産生は、当該TFPが極めて高い標的細胞殺傷レベルを示すにもかかわらず、NKG2D-28ζ CARを発現するT細胞の産生と同程度であり得る。TFPがCARよりも効果的に標的細胞を殺傷する一方で、炎症促進性サイトカインの放出は同等または低レベルであり得るという可能性は、これらのサイトカインのレベル上昇が養子CAR-T療法の用量制限毒性と関連していることから、CARと比較して、TFPの潜在的な利点を表す。
活性化したPBMCに50MOIのレンチウイルスを2日間連続して形質導入し、増殖させる。形質導入後8日目に、PBMCの共培養液を、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen)+5%AB血清(Gemini Bioproducts;100-318)中、E:T比1:1(各細胞型0.2×10個)で標的細胞(NKG2Dを過剰発現するK562細胞)と組み合わせた。BCMAを過剰発現するK562細胞を陰性対照として使用した。24時間後、細胞のIFN-γ及びIL-2発現を上記のとおりELISAによって解析する。NKG2D CAR及びTFP構築物を発現するT細胞は、IFN-γ及びIL-2の両方の産生によって示されるように、NKG2D細胞と共培養することによって活性化されるが、NKG2D細胞では活性されない。これは、NKG2D発現細胞がT細胞を特異的に活性化させる能力があることを更に示す。
実施例13:リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性:二重特異性TFP T細胞
RTCAは、専用96ウェルプレートの各ウェルで接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終読み出し値を細胞指数と呼ばれる値で示すものである。細胞指数の変化は、コインキュベートしたT細胞エフェクターによる標的細胞の殺傷の結果として、標的細胞単層が破壊されることを示す。したがって、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞とエフェクターT細胞の両方を含むウェルの細胞指数の変化と、標的細胞のみを含むウェルの細胞指数の変化を比較して評価することができる。
本実施例で使用した標的細胞は、切断型BCMAを発現するHeLa細胞(HeLa-BCMAt、細胞内ドメイン欠失)または切断型CD19を発現するHeLa細胞(HeLa-CD19t、細胞内ドメイン欠失)であった。ヒトBCMAtまたはCD19tをコードするDNAは、GeneArt(登録商標)(Thermo Fisher)によって合成されたものであり、EF1aプロモーターの制御下にある、選択マーカーとしてネオマイシンを保有する二重プロモーターレンチウイルスベクターpCDH514B(System Bioscience)のマルチクローニングサイトに挿入した。次いで、BCMAtまたはCD19tをコードするベクターを保有するレンチウイルスを上記と同じ手順でパッケージ化した。次いで、HeLa細胞にレンチウイルスを保有するBCMAtまたはCD19t構築物を24時間形質導入した後、G418(1mg/mL)で選択した。選択されたHeLa-BCMAt細胞またはHeLa-CD19t細胞によるBCMAtまたはCD19tの発現は、抗ヒトBCMA抗体(BioLegend、クローン番号19A2;Miltenyi、クローン番号REA315)または抗ヒトCD19抗体(BD Bioscience)をそれぞれ用いるFACS解析によって確認した。
RTCAのために、標的細胞(HeLa-BCMAtまたはHeLa-CD19t)を96ウェルポリエチレンテレフタレート(PET)E-Plate(登録商標)(ACEA Biosciences,Inc.)に10,000細胞/ウェルで播種した。二重特異性TFP T細胞を試験するために、HeLa-BCMAt細胞及びHeLa-CD19t細胞を最終数10,000細胞/ウェルになるように1:1の比で混合した。次いで、プレートをxCELLigence(登録商標)RTCA MP装置(ACEA Biosciences,Inc.)に入れ、ベースライン測定を100回の測定について15分毎に行った。次いで、プレートを装置から取り出し、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640+5%AB血清)中に懸濁したエフェクターT細胞を60,000細胞で各ウェルに加え、エフェクター対標的比を6:1にした。次いで、プレートを装置に戻した。測定を100回の測定については2分毎に行い、その後、1000回の測定については15分毎に行った。
結果を図10に示す。図10の凡例を以下の表に示す。
Figure 0007291396000002
右側の列の表において、「/」は、抗BCMA TFPを含むウイルスと抗CD19 TFPを含むウイルスの2つのウイルスをT細胞集団に形質導入したアッセイを指し、「+」は、抗BCMA TFPを形質導入したT細胞集団と抗CD19 TFPを形質導入したT細胞集団の2つの集団を組み合わせた使用を指す。
図10Aは、CD19を発現するHeLa細胞を示し、二重構築物を含む抗BCMA及び抗CD19 TFP T細胞が、抗BCMA TFP T細胞単独を含む細胞よりも、良好かつ迅速に細胞を殺傷したことを示す。単一特異性抗CD19 TFP対照は、二重特異性TFP T細胞と同等の活性を有した。
図10Bは、BCMA-を発現するHeLa細胞を示し、二重構築物を含む抗BCMA及び抗CD19 TFP T細胞が、抗CD19 TFP T細胞単独を含む細胞よりも、良好かつ迅速に細胞を殺傷したことを示す。単一特異性抗BCMA TFP対照は、二重特異性TFP T細胞と同等の活性を有した。
図10Cは、BCMA及びCD19を発現するHeLa細胞を示し、二重特異性構築物「εε」の能力を単一特異性TFPと比較して測定する。示されるように、二重特異性TFP T細胞は、2つのウイルスまたは2つのT細胞集団混合のいずれの形質導入にかかわらず、単一特異性TFP T細胞集団単独のいずれよりも著しく高い活性を有した。
図10Dは、BCMA及びCD19を発現するHeLa細胞を示し、二重特異性構築物「εγ」の能力を単一特異性TFPと比較して測定する。示されるように、二重特異性TFP T細胞は、2つのウイルスまたは2つのT細胞集団混合のいずれの形質導入にかかわらず、単一特異性TFP T細胞集団単独のいずれよりも著しく高い活性を有した。
実施例14:フローサイトメトリーによるCD107aの露出
T細胞活性化の更なるアッセイは、休止細胞の細胞質細胞溶解性顆粒の膜に存在するリソソーム膜タンパク質(LAMP-1)である、CD107の表面発現である。細胞溶解活性の必要条件であるエフェクターT細胞の脱顆粒は、活性化により誘導される顆粒のエキソサイトーシスの結果、CD107aの細胞表面への動員をもたらす。したがって、CD107aの露出は、細胞傷害性と密接に相関し、サイトカイン産生に加えて、T細胞活性化の更なる尺度をもたらす。
標的細胞とエフェクター細胞を別々に洗浄し、細胞傷害性培地(RPMI+5%ヒトAB血清+1%抗生物質抗真菌剤)中に再懸濁する。アッセイは、U底96ウェルプレート(Corning)で、0.5μL/ウェルのPE/Cy7標識抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体(クローン-H4A3、BD Biosciences)の存在下、最終体積100μLで、2×10個のエフェクター細胞と2×10個の標的細胞とを合わせることによって実施する。次いで、培養物を37℃、5%COで1時間インキュベートする。このインキュベーションの直後、1:10希釈の分泌阻害剤のモネンシン10μL(1000×溶液、BD GolgiStop(商標))を、細胞を乱さないように各ウェルに慎重に加える。次いで、プレートを37℃、5%COで更に2.5時間インキュベートする。このインキュベーションに続いて、細胞を、APC抗ヒトCD3抗体(クローンUCHT1、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8抗体(クローンSK1、BD Biosciences)及びPacific Blue抗ヒトCD4抗体(クローンRPA-T4、BD Biosciences)で染色し、次いで、37℃、5%COで30分間インキュベートする。次いで、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、(100μLのFACS緩衝液及び100ulのIC固定緩衝液中に再懸濁し、その後、解析する。
T細胞表面上のCD107aの露出をフローサイトメトリーによって検出する。フローサイトメトリーは、LSRFortessa(商標)X20(BD Biosciences)により実施し、フローサイトメトリーのデータの解析は、FlowJoソフトウェア(Treestar,Inc.(Ashland,OR))を使用して実施する。CD107であるCD3ゲート内のCD8エフェクター細胞のパーセンテージを各エフェクター/標的細胞培養物について測定する。
先の細胞傷害性及びサイトカインデータと一致して、腫瘍関連抗原を発現する標的細胞と、抗腫瘍関連抗原-28ζ CARを形質導入したエフェクターT細胞との共培養は、腫瘍関連抗原陰性標的細胞とインキュベートしたエフェクターと比較して、CD107a表面発現の増加を誘導し得る。同じ条件下で比較すると、抗腫瘍関連抗原-CD3ε LL TFPまたは抗腫瘍関連抗原-CD3γ LL TFPを発現するエフェクターは、5~7倍のCD107a発現の誘導を示し得る。代替ヒンジ領域を用いて構築された抗腫瘍関連抗原TFPは、腫瘍関連抗原を担持する標的細胞と共培養した場合、同様の結果をもたらし得る。
実施例15:in vivoマウスでの有効性試験
抗腫瘍関連抗原TFPを形質導入したエフェクターT細胞がin vivoで抗腫瘍応答を達成する能力を評価するために、抗腫瘍関連抗原-28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原-CD3ε LL TFPまたは抗腫瘍関連抗原-CD3γ LL TFPのいずれかを形質導入したエフェクターT細胞を、前もって腫瘍関連抗原+ヒトがん細胞株を接種したNOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)マウスに養子移入する。
試験の開始前に少なくとも6週齢である雌のNOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)マウスをThe Jackson Laboratory(ストック番号005557)から入手し、実験使用前の3日間、順化させる。接種用のヒト腫瘍関連抗原発現細胞株は、対数増殖期培養に維持し、その後、生細胞数を決定するために回収し、トリパンブルーで計数する。腫瘍接種の当日に、細胞を300gで5分間遠心分離し、予め温めておいた滅菌PBS中に0.5~1×10細胞/100μLのいずれかで再懸濁する。養子移入用に、非形質導入T細胞または抗腫瘍関連抗原-28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原-CD3ε LL TFPもしくは抗CD3γ LL TFP構築物を形質導入したT細胞のいずれかを調製する。試験0日目に、実験群当たり10匹の動物に対して、0.5~1×10個の腫瘍関連抗原発現細胞を静脈内接種した。3日後、100μLの滅菌PBS中の5×10個のエフェクターT細胞集団を各動物に静脈内移入した。動物に関する詳細な臨床観察を安楽死まで毎日記録する。体重測定を死亡または安楽死まで毎週行う。試験物質及び対照物質の養子移入から35日後に全ての動物を安楽死させる。試験中に瀕死状態を呈する動物は全て、獣医と相談の上、本試験の責任者の判断で安楽死させる。
非形質導入T細胞と比較して、抗腫瘍関連抗原-28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原-CD3ε LL TFPまたは抗腫瘍関連抗原-CD3γ LL TFPのいずれかを形質導入したT細胞の養子移入は、メソテリン発現細胞株腫瘍担持マウスの生存を延長させ得、抗腫瘍関連抗原CAR及びTFPを形質導入したT細胞の両方が、これらのマウスモデルにおいて、標的細胞の殺傷を媒介し、これに付随して生存を延長することができることを示し得る。まとめると、これらのデータは、TFPが、in vitro及びin vivoの両方で、第一世代CARに優る抗原特異的殺傷を示すキメラ受容体を作製するための代替プラットフォームとなることを示し得る。
実施例16:CD16 TFPは、腫瘍細胞抗原及び抗腫瘍抗原抗体の存在下で、腫瘍細胞溶解及びサイトカイン産生を誘導する。
ルシフェラーゼ標識Raji細胞(ホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入したRaji-FFLuc腫瘍細胞)をCD16 TFP T細胞と1:10の比、例えば、5000個の腫瘍細胞+50,000個のTFP T細胞)で組み合わせた。リツキシマブまたは非グリコシル化リツキシマブを1μg/mlで加え、細胞と抗体の混合物を37℃で24時間インキュベートした。細胞を遠心し、上清及びペレットを回収した。ペレットを再懸濁し、ルシフェリン基質とともにインキュベートし、SpectraMax(登録商標)プレートリーダーで読み取った。ルシフェラーゼは、溶解した細胞からしか得られないので、ルシフェラーゼシグナルと溶解は同等とみなされる。
図11は、無抗体対照と比較した、様々な構築物を形質導入したT細胞による本アッセイの結果を示す。Raji細胞を、リツキシマブ及び次のT細胞:培地単独(抗体なし、白い棒)、陰性対照としてT細胞を含まないRaji細胞、陰性対照として形質導入していないT細胞、CD16-CD3ε TFP、CD16-CD3γ TFP、CD16-CD3δ TFP、CD16-CD3β TFP、CD16-CD28ζ CAR、CD16-41BBζ CAR、及び陽性対照として既知の活性を有する抗CD19-CD3ε TFPとともにインキュベートした。図11Aに見られるように、TFP及びCARは全て、様々な程度で標的細胞集団の溶解を誘導することができた。陰性対照は、あったとしても、最小限の溶解であった。CD16 TFPの中では、CD16-CD3ε TFP及びCD16-CD3γが最も強力であった。陽性対照の抗CD19 TFPは、このTFPが標的細胞に直接結合するので、「抗体なし」対照群(白い棒)で溶解を誘導した。
図11Bは、同じアッセイを示すが、非グリコシル化リツキシマブ抗体を用いた。予想したとおり、CD16は、非グリコシル化形態に結合しないので、リツキシマブとは無関係に機能する抗CD19 TFP陽性対照を除いて、T細胞構築物のいずれについても、細胞溶解はほとんど検出されなかった。
上記の方法から回収した上清をLuminex(登録商標)ELISAアッセイに使用して、IFNγ及びIL-2の量を検出及び定量した。図12A(IFNγ)及び図12B(IL-2)に示されるように、TFP T細胞は、そのCAR T細胞対応物よりも極めて低いサイトカイン濃度を誘導した。これは、過剰なサイトカイン産生が患者に望ましくない副作用を引き起こすので、治療薬として魅力的である。
実施例17:複数の悪性腫瘍に対するNKG2D-TFP T細胞のin vitro及びin vivo有効性
正常なドナー由来のNKG2D ε-TFP T細胞を調製して、NKG2Dリガンドを発現する複数の固形腫瘍細胞株に対するNKG2D ε-TFP T細胞のin vitro及びin vivoでの抗腫瘍効果を試験した。精製した正常ドナーCD4及びCD8 T細胞をprodigyによって回収し、NKG2D CD3ε-TFP T細胞をex vivoで増大させ、Dynabeads+IL-2またはTransAct+IL-7/15の存在条件下で、10日間形質導入した。in vitro及びin vivo抗腫瘍活性を、NKG2Dリガンドを発現する複数の腫瘍細胞株を使用して解析した。レンチウイルスベクター及びレンチウイルスを上記の実施例に記載のとおりに調製した。
NKG2D単量体または二量体CD3ε-TFP T細胞の調製
ND13(HemaCare、ドナーID:W313716040891)またはND15(HemaCare、ドナーID:W313717041459)由来の凍結CD4またはCD8T細胞を、0日目に、5%ヒトAB血清(Gemini Products、100-318)、300IU/mLのrhIL-2(Peprotech、200-02)及び1%抗生物質(Invitrogen、ロット番号1734036)を添加したT細胞増殖培地(AIM-V(登録商標)+AlbuMAX(登録商標)(BSA)(1×)(Gibco、31035-025)または3%ヒトAB血清(Gemini Products、100-318)、12.5ng/mLのIL-7(Miltenyi、カタログ番号130-095-363)及び12.5ng/mlのIL-15(Miltenyi、カタログ番号130-095-765)ならびに1%抗生物質(Invitrogen)を含むTexMACS(商標)培地(Miltenyi、ロット番号5151126094)のいずれかに再懸濁した。Dynabeads+IL-2条件で活性化させたT細胞については、Dynabeads Human T-activator CD3/CD28(Gibco、00415447、ロット1785079)を1×滅菌PBSで3回洗浄した。次いで、50μL(1×10個のビーズ)のビーズ懸濁液を1mLのT細胞懸濁液(1×10細胞/mL)に移すことによって、ビーズをT細胞に1:1の比で加えた。次いで、1mLのビーズ/細胞混合物を48ウェルプレートの単一ウェルに分注し、37℃、5%COでインキュベートした。TransAct+IL-7/15条件で活性化させたT細胞については、40μL(1×10個のビーズ)のビーズ懸濁液を1mLのT細胞懸濁液(1×10細胞/mL)に移すことによって、ビーズをT細胞に1:1の比で直接加えた。1日目に、指定のMOIでレンチウイルスの形質導入を実施し、レンチウイルスを添加していないT細胞を非形質導入群(NT)とした。プレートを、ウェル中の細胞を乱さないように、37℃のインキュベータに戻した。形質導入T細胞を、300IU/mLのrhIL-2を添加したT細胞増殖培地または12.5ng/mlのIL-7及び12.5ng/mlのIL-15を添加したTexMACS(商標)に維持した。形質導入T細胞を5×10細胞/mLの濃度まで48時間毎に継代培養した。活性化後10日目に、SD1(抗メソテリン)CD3ε-TFP T細胞及び非形質導入T細胞を計数し、表現型を調べ、更なる分析のために液体窒素中に保存した。
腫瘍細胞
MSLN細胞株MSTO-211H(ATCC(登録商標)CRL-2081(商標))をATCCから入手した。MSLN高発現細胞株MSTO-211H-FL MSLNを、完全長MSLNをコードするレンチウイルスベクターをMSTO-211H(ATCC、CRL-2081(商標))に安定的に形質導入することによって作製した。OVCAR3(ATCC HTB-161(商標))、SaOS2(ATCC HTB-85(商標))、SKOV3(ATCC HTB-77(商標))、A549(ATCC-CCL 185(商標))、A431(ATCC CRL-1555(商標))、U373(ATCC HTB-17(商標))、PC-3(ATCC CRL-1435(商標))。ルシフェラーゼを発現する細胞株を、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを細胞に形質導入することによって作製した。形質導入後、ピューロマイシン(5μg/mL)またはG418(5mg/mL)を加えることによって安定発現株を選択した。全細胞株及びその誘導体をATCC推奨培地に維持した。
FACSによる形質導入効率及びT細胞活性化の決定
更なる詳細を得るために、SOP 005 T細胞の表現型染色パネルショートを参照する。簡潔に述べれば、T細胞からビーズを除去し(Dynabeads+IL-2条件で増殖させた場合)、PBSで2回洗浄してから、固定可能生死判定溶液(PBSで1:1000に希釈)で染色した。PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットを100μLの抗体染色ミックス中に再懸濁した。抗体染色ミックスは、100μL/試料FACS緩衝液中に次の抗体:ヒトFcブロック(1μL/試料)、CD4-パシフィックブルー(Biolegend、カタログ番号300521、ロット番号B231611、1μL/試料)、CD8-PerCPcy5.5(Biolegend、カタログ番号344710、ロット番号B226362、1μL/試料)、NKG2D-APC(R&D、カタログ番号:FAB139A、ロット番号LCO0613121、1μL/試料)、ULBP1-APC(R&D、カタログ番号:FAB139A、ロット番号LCO0613121、1μL/試料)、ULBP2/5/6-PE(R&D、FAB1298P、ロット番号LWE0716091、1μL/試料)、ULBP4-APC(R&D、カタログ番号:FAB6285A、ロット番号ADXO0117041、1μL/試料)、MICA/B-AF488(ebioscience、カタログ番号:53-5788-42、ロット番号:E10683-1633、1μL/試料)を用いて調製する。一致するアイソタイプコントロール抗体(1μL/試料)を用いて、アイソタイプコントロールミックスを調製する。暗所にて4℃、少なくとも30分間インキュベートする。室温、600×gで2分間遠心分離し、上清を捨て、200μLのFACS緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁する。洗浄を2回繰り返し、試料をBD LSR FortessaX-20 Cell Analyzerにかける。
腫瘍細胞溶解:ルシフェラーゼレポーター(Luc)アッセイ
標的細胞上のNKG2Dリガンド発現を確認し、NKG2D単量体または二量体ε-TFP T細胞の発現を、品質管理として、Lucアッセイの日にフローサイトメトリーによって確認した。標的細胞の単一懸濁液をR10培地で調製した。100μL中1×10個の細胞を丸底96ウェルプレートに加えた。TFP T細胞を融解し、ビーズを除去し(Dynabeads+IL-2条件でex vivo増殖させた場合)、洗浄し、その後、サイトカインを含まないT細胞培養培地で再懸濁した。所望数のT細胞(100μL中)をエフェクター対標的比がそれぞれ5:1、1:1及び1:5になるように加えた。各T細胞型について、試験する比率で3連で調製した。次いで、細胞を37℃、5%COで24時間培養した。24時間共培養した後、プレートを300×gで2分間遠心分離し、細胞をペレットにした。Luminex(登録商標)アッセイのために、各ウェルの100μLの培養上清を慎重に取り出した。Bright-Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega、E2650、ロット0000223852)の100μLのアッセイ緩衝液を各ウェルに加えた。各ウェルの内容物を静かに上下にピペッティングすることによって混合した。細胞・試薬混合物を、細胞を完全に溶解させるために、室温で3分間、暗所に放置した。各ウェルの200μLの細胞溶解物をGreiner-One白色壁96ウェルプレートに移した。発光をSpectraMax(登録商標)M5プレートリーダー(Molecular Devices)によって相対発光量(RLU)で測定した。腫瘍溶解率(%)を以下に示す式によって算出した。
Figure 0007291396000003
MSTO-FL MSLNを用いた皮下異種移植マウスモデル及びin vivo評価
マウスモデルは、Abpro(Woburn,MA)で実施した。雌の6週齢NSGマウス(The Jackson Laboratory、ストック番号005557)を以下のND試験に使用した条件と同じ条件下で最低3日間順化させた。MSTO-211H-FLMSLN-Luc細胞を1×10細胞/100μLの濃度で滅菌PBS中に再懸濁した。次いで、PBS細胞懸濁液を氷冷Matrigel(登録商標)と1:1で混合し、各マウスにつき最終注射体積を200μLにした。得られたPBS/Matrigel細胞懸濁液は、マウスの後側腹部に皮下投与するまで、氷上に維持した。腫瘍成長をCaliper測定により腫瘍体積としてモニタリングした。腫瘍体積は、次のとおりに算出した:
腫瘍体積=1/2(長径×短径
腫瘍細胞の注射から13日後、動物を腫瘍体積(200~300mm)に従って無作為化し、3群に分け、Dynabeads+IL-2条件でex vivo増殖させたND13由来のNKG2D二量体ε-TFP T細胞を注射した。T細胞の注射日を試験0日目とみなした。T細胞は、滅菌PBS中、1×10または5×10細胞/100μLの濃度でそれぞれ0日目及び20日目に2回調製した。次いで、細胞懸濁液をマウスに尾静脈を介して静脈内注射した。
TransAct+IL-7/15条件によるNKG2D二量体CD3ε-TFP T細胞のex vivo増殖中及び抗原結合中のCD4及びCD8比、NKG2Dリガンド発現
TransAct+IL-7/15条件を使用して作製したNKG2D二量体CD3ε-TFP T細胞について、増殖後3、6、8、10日目に、細胞を計数し、CD3、CD4、CD8及びNKG2Dリガンド(NKG2DL)を染色した。抗原結合時のNKG2Dリガンド発現について、EGFRvIII-TFP T細胞及びK562親細胞またはK562-EGFRvIII細胞を1:1の比で24時間共培養した。次いで、NKG2Dリガンド発現をフローサイトメトリーによって測定し、CD4及びCD8T細胞でゲーティングして解析した。
Dynabeads+IL-2条件でのNKG2D単量体及び二量体ε-TFP(商標)T細胞のex vivo増殖
NKG2Dは細胞表面上で二量体化することから、NKG2D細胞外ドメイン(ECD)を逆の順序でTFPのCD3ε形態とともにコードするレンチウイルスを用いて、NKG2Dリガンド特異的TFP T細胞を調製した。単量体及び二量体融合物を作製した。NKG2D単量体及び二量体CD3ε-TFP構造及びプラスミド設計を上記図5に示した。Dynabeads+IL-2条件を用いたex vivo増殖の実験計画を図13Aに示す。ND13(HemaCare(商標)(Van Nuys,CA)のW313716040891)を使用して、NKG2D単量体及び二量体CD3ε-TFP T細胞の両方を作製した。増殖10日目に、CD4及びCD8集団のNGK2Dの存在について表面染色することによって、NKG2D単量体及び二量体ε-TFPの形質導入効率を決定した(図13B)。NKG2D単量体の形質導入効率は約18%であり、二量体は約78%であった。NKG2D二量体CD3ε-TFPは、NKG2D単量体CD3ε-TFPと比較して、より高い形質導入効率を示した。
NKG2D単量体または二量体CD3ε-TFP細胞のin vitro有効性は、ルシフェラーゼレポーター腫瘍細胞溶解アッセイを使用して試験した。アッセイの日に、MSTO-211H-FLMSLN-Luc(中皮腫/卵巣癌/膵癌/肺癌)、OVCAR3-Luc及びSKOV3-Luc(卵巣癌)、SaOS2(骨肉腫)細胞株(図14A)上のリガンド発現(ULBP-1、ULBP2/5/6、ULBP-3、ULBP-4、MICA/B)を確認し、A549-Luc(肺癌)、A431(皮膚癌)、U373(膠芽腫)及びPC-3(前立腺癌)細胞株上のULBP2/5/6及びMICA/Bを確認した(図14C)。NKG2D 単量体及び二量体CD3ε-TFP T細胞のいずれも異なるレベルの腫瘍殺傷を示した。5:1のエフェクター対標的比で全ての細胞株と共培養した場合のNKG2D二量体CD3ε-TFP T細胞、1:1エフェクター対標的比で全ての細胞株と共培養した場合のNKG2D二量体CD3ε-TFP T細胞で、強力な腫瘍細胞溶解が観察され、または、5:1のエフェクター対標的比で全ての細胞株と共培養した場合のNKG2D単量体CD3ε-TFP T細胞は、24時間後、30~50%の殺傷を示す。これらの細胞株と共培養した場合、NT T細胞ではいずれも腫瘍溶解は観察されなかった(図14B及び14C)。
異種移植リガンド発現腫瘍マウスモデルにおけるNKG2D二量体ε-TFP T細胞のin vivo有効性
MSTO-211H-FLMSLN-Lucを使用してs.c.異種移植NKG2Dリガンド発現腫瘍マウスモデルを確立し、腫瘍体積を週2回測定した。腫瘍での標的発現及びT細胞でのTFP発現のQCを注射日にそれぞれ実施した(図15A及び15B)。腫瘍注射後13日目に、平均腫瘍体積は、200~300mmに達した。10日目に、ND13(HemaCare(商標)(Van Nuys,CA)のW313716040891)に由来する、Dynabeads+IL-2で増殖させたNKG2D二量体ε-TFP T細胞を融解し、形質導入効率を確認した。マウス当たり1×10または5×10個のNKG2D二量体ε-TFP T細胞または一致する非形質導入T細胞を、0日目及び20日目に2回、静脈内注射し、その後、腫瘍体積をモニタリングした。用量5×10細胞でのNKG2D二量体ε-TFP T細胞による処置は、42日間の観察にわたって部分的な保護を示す。マウス10匹中4匹で腫瘍がなくなり、42日目まで腫瘍がない状態を維持し、10匹中1匹は、約100mmの腫瘍体積を保持した。NT細胞で処置したマウスと5×10NKG2D二量体ε-TFP T細胞で処置したマウスとの間には、生存率に有意な差が示された。用量1×10でのNKG2D二量体ε-TFPによる処置では、腫瘍成長を制御できなかった。(図15C及び15D)。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、かかる実施形態は、例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変更及び置換を想起するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。
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Claims (33)

  1. 配列を含む組み換え核酸分子であって、該組み換え核酸分子が、
    (a)第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、
    (i)(1)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
    (2)膜貫通ドメインと、
    (3)CD3ε鎖またはCD3γ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインと、
    を含む、第1のTCRサブユニットと、
    (ii)第1の抗腫瘍抗原結合ドメインを含む第1のヒト抗体、ヒト化抗体、またはマウス抗体のドメインと
    を含む、第1のTFP;及び
    (b)第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、
    (i)(1)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
    (2)膜貫通ドメインと、
    (3)CD3ε鎖またはCD3γ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインと、
    を含む、第2のTCRサブユニットと、
    (ii)第2の抗腫瘍抗原結合ドメインを含む第2のヒト抗体、ヒト化抗体、またはマウス抗体ドメインと
    を含む、第2のTFP
    をコードし、
    前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが前記第1のTFPの前記第1のTCRサブユニットのN末端に作動可能に連結され、前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが前記第2のTFPの前記第2のTCRサブユニットのN末端に作動可能に連結され、前記第1のTFP及び前記第2のTFPが、T細胞で発現される際に内因性TCR複合体に組み込まれる、組み換え核酸分子。
  2. 配列を含む組み換え核酸分子であって、該組み換え核酸分子が、
    (a)T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)であって、
    (i)(1)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
    (2)膜貫通ドメインと、
    (3)CD3ε鎖またはCD3γ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインと、
    を含む、第1のTCRサブユニットと、
    (ii)第1の標的に対して特異性を有する第1の抗腫瘍抗原結合ドメインと
    を含む、TFP;及び
    (b)第1の標的とは異なっておりかつそれから離れている第2の標的に対して特異性を有する第2の抗腫瘍抗原結合ドメイン
    をコードし、
    (A)前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが、前記第1のTCRサブユニットのN末端に作動可能に連結された前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインのN末端に作動可能に連結されるか、または(B)前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが、前記第1のTCRサブユニットのN末端に作動可能に連結された前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインのN末端に作動可能に連結され、
    前記TFPがT細胞で発現される際に内因性TCR複合体に組み込まれる、組み換え核酸分子。
  3. (a)前記第1のTCRサブユニットの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び前記第2のTCRサブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインが、異なるTCR鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来するものであるか、または
    (b)前記第1のTCRサブユニット及び前記第2のTCRサブユニットが同じものである、
    請求項1に記載の組み換え核酸分子。
  4. (a)前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗CD19結合ドメインであり、前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗CD22結合ドメインまたは抗CD20結合ドメインであるか、
    (b)前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗メソテリン結合ドメインであり、前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗MUC16結合ドメインであるか、または
    (c)前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗CD19結合ドメインであり、前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが抗BCMA結合ドメインである、
    請求項1~3のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子。
  5. 前記組み換え核酸分子がプロテアーゼ切断部位を更にコードする、請求項1~4のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子。
  6. 前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメイン、前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメイン、またはその両方が、
    (a)scFvまたはVHドメインであり、または
    (b)抗体またはその断片を含まず、かつ細胞の表面上に発現される受容体またはポリペプチドに結合するリガンドである、
    請求項1~5のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子。
  7. 前記第1のTCRサブユニットの膜貫通ドメインがTCR膜貫通ドメインであり、前記第1のTCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインが、1つのTCR鎖に由来する、請求項1~6のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子。
  8. 前記第2のTCRサブユニットの膜貫通ドメインがTCR膜貫通ドメインであり、前記第2のTCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインが、1つのTCR鎖に由来する、請求項1または3~7のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子。
  9. (i)前記第1のTFPの第1のTCRサブユニット及び前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが第1のリンカー配列によって作動可能に連結され、(ii)前記第2のTFPの第2のTCRサブユニット及び前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが第2のリンカー配列によって作動可能に連結され、または(iii)前記第1のTFPの第1のTCRサブユニット及び前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが第1のリンカー配列によって作動可能に連結され、かつ前記第2のTFPの第2のTCRサブユニット及び前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが第2のリンカー配列によって作動可能に連結される、請求項1に記載の組み換え核酸分子。
  10. 前記第1のリンカー配列または前記第2のリンカー配列が(GS)を含み、n=1~4である、請求項9に記載の組み換え核酸分子。
  11. 前記TFPの第1のTCRサブユニット及び前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメインが第1のリンカー配列によって作動可能に連結され、及び(i)前記TFPの第1のTCRサブユニット及び前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが第2のリンカー配列によって作動可能に連結され、または(ii)前記第1の抗腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の抗腫瘍抗原結合ドメインが第2のリンカー配列によって作動可能に連結される、請求項2に記載の組み換え核酸分子。
  12. 前記第1のリンカー配列または前記第2のリンカー配列が(GS)を含み、n=1~4である、請求項11に記載の組み換え核酸分子。
  13. (i)それぞれ配列番号26、配列番号28、及び配列番号30、抗CD19軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び(ii)それぞれ配列番号32、配列番号34、及び配列番号36、抗CD19重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  14. 前記組み換え核酸分子が抗CD19軽鎖可変領域及び抗CD19重鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号38の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号40の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  15. (i)それぞれ配列番号42、配列番号44、及び配列番号46、抗BCMA軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び(ii)それぞれ配列番号48、配列番号50、及び配列番号52、抗BCMA重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  16. 前記組み換え核酸分子が抗BCMA軽鎖可変領域及び抗BCMA重鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号56の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号54の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  17. (i)それぞれ配列番号57、配列番号58、及び配列番号59、抗CD22軽鎖結合ドメインの軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3のアミノ酸配列、及び(ii)それぞれ配列番号60、配列番号61、及び配列番号62、抗CD22重鎖結合ドメインの重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  18. 前記組み換え核酸分子が抗CD22軽鎖可変領域及び抗CD22重鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、配列番号63の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号64の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95~100%の同一性を有する配列を含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  19. 前記膜貫通ドメインが、TCRα鎖、TCRβ鎖、TCRζ鎖、CD3εTCRサブユニット、CD3γTCRサブユニット、CD3δTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、またはその機能性断片からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  20. 共刺激ドメインをコードする配列を更に含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  21. 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、ならびに4-1BB(CD137)からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項20に記載の組み換え核酸分子。
  22. リーダー配列を更にコードする、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  23. プロモーターを更に含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  24. 前記組み換え核酸が、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’-O-アミノプロピル、2’-デオキシ、2’-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)、2’-O-ジメチルアミノエチル(2’-O-DMAOE)、2’-O-ジメチルアミノプロピル(2’-O-DMAP)、2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)修飾、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’-アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’-フルオロN3-P5’-ホスホロアミダイトからなる群から選択されるヌクレオチド類似体を含む、請求項1または2に記載の組み換え核酸分子。
  25. 請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子を含むベクター。
  26. DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項25に記載のベクター。
  27. 請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子、または請求項25または26に記載のベクターを含む、ヒトT細胞。
  28. CD8またはCD4T細胞である、請求項27に記載のヒトT細胞。
  29. (a)請求項27または28に記載のヒトT細胞と、
    (b)薬学的に許容可能な賦形剤と
    を含む医薬組成物。
  30. 腫瘍関連抗原の発現を伴う疾患を処置するための薬剤の調製における、請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子、請求項25または26に記載のベクター、請求項27または28に記載のヒトT細胞、または請求項29記載の医薬組成物の使用。
  31. CD19、BCMA、またはCD22発現を伴う疾患を処置するための薬剤の調製における、請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子、請求項25または26に記載のベクター、請求項27または28に記載のヒトT細胞、または請求項29に記載の医薬組成物の使用であって、前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、CD19の発現を伴う非がん関連適応症、BCMAの発現を伴う非がん関連適応症、及びCD22の発現を伴う非がん関連適応症からなる群から選択される、使用。
  32. 疾患を処置するための薬剤の調製における、請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子、請求項25または26に記載のベクター、請求項27または28に記載のヒトT細胞、または請求項29に記載の医薬組成物の使用であって、前記疾患が、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、卵巣癌、卵巣ミュラー管混合癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、腎癌、結腸癌、胃癌、自己免疫疾患、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるがんである、使用。
  33. 疾患を処置するための薬剤の調製における、請求項1~24のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子、請求項25または26に記載のベクター、請求項27または28に記載のヒトT細胞、または請求項29に記載の医薬組成物の使用であって、前記疾患が、ユーイング肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、黒色腫、白血病、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌、結腸癌、腎癌、及び前立腺癌からなる群から選択されるがんである、使用。
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