JP6499087B2 - 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、T細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。さらに、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法、および疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
様々な臨床の場において個々の細胞または特定の細胞タイプの選択的破壊がしばしば望まれる。例えば、健常な細胞および組織を無傷のまま傷つけずに腫瘍細胞を特異的に破壊することは、癌療法の主な目標の一つである。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、前記クロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)シングルドメイン可変重鎖を含む第2の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)シングルドメイン可変重鎖を含む第3の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、前記クロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第2の抗原結合部分であって、前記少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第3の抗原結合部分であって、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
[本発明1001]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分および標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
一方の抗原結合部分が、Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ他方の抗原結合部分がシングルドメイン抗原結合分子を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1002]
シングルドメイン抗原結合分子がシングルドメイン可変重鎖である、本発明1001のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1003]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分がシングルドメイン可変重鎖からなる、本発明1002のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1004]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分および標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
一方の抗原結合部分が、Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ他方の抗原結合部分が、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質である、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1005]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ第2の抗原結合部分が、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質である、本発明1004のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1006]
第2の抗原部分が、2個、3個、4個、または5個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む、本発明1004または1005のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1007]
安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインをさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1008]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1個以下の抗原結合部分を含む、本発明1001〜1006のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1009]
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が互いに融合されており、任意で、ペプチドリンカーを介して互いに融合されている、本発明1001〜1006のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1010]
第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、本発明1001〜1003のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1011]
標的細胞抗原に特異的に結合することができる第3の抗原結合部分を含む、本発明1001〜1010のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1012]
第3の抗原結合部分がシングルドメイン抗原結合分子である、本発明1011のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1013]
シングルドメイン抗原結合分子がシングルドメイン可変重鎖である、本発明1012のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1014]
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、該クロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)シングルドメイン可変重鎖を含む第2の抗原結合部分であって、該シングルドメイン可変重鎖がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)シングルドメイン可変重鎖を含む第3の抗原結合部分であって、該シングルドメイン可変重鎖が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む、本発明1013のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1015]
第3の抗原結合部分が、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質である、本発明1011のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1016]
第3の抗原結合部分が、2個、3個、4個、または5個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質である、本発明1015のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1017]
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、該クロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第2の抗原結合部分であって、該少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第3の抗原結合部分であって、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む、本発明1015または1016のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1018]
第1の抗原結合部分が活性化T細胞抗原に結合し、かつ第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分が同じ標的細胞抗原に結合する、本発明1014または1017のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1019]
Fcドメインが、IgG、具体的には、IgG 1 またはIgG 4 のFcドメインである、本発明1007〜1019のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1020]
FcドメインがヒトFcドメインである、本発明1019のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1021]
Fcドメインが、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む、本発明1007〜1020のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1022]
Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、これより大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、かつFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、これより小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部が配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる、本発明1021のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1023]
Fcドメインが、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す、本発明1007〜1022のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1024]
Fcドメインが、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、本発明1007〜1023のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1025]
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、L234、L235、およびP329の群より選択される1つまたは複数の位置にある、本発明1024のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1026]
Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する3個のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がL234A、L235A、およびP329Gである、本発明1025のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1027]
Fc受容体がFcγ受容体である、本発明1023〜1026のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1028]
エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害(ADCC)である、本発明1020〜1023のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1029]
以下を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子:
一方が、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子であり、かつ他方が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子である、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分であって、
第1の抗原結合部分が、
(a)Fab軽鎖およびFab重鎖がペプチドリンカーでつながっている単鎖Fab分子、または
(b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子
である、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分;ならびに
安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインであって、該第1のサブユニットおよび該第2のサブユニットがヘテロ二量体形成に静電気的に有利な1つもしくは複数の荷電アミノ酸を含むように改変されている、Fcドメイン。
[本発明1030]
第1のサブユニットがアミノ酸変異E356K、E357K、およびD399Kを含み、かつ第2のサブユニットがアミノ酸変異K370E、K409E、およびK439Eを含む、本発明1029のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1031]
第1のサブユニットがアミノ酸変異K392D、K409Dを含み、かつ第2のサブユニットがアミノ酸変異E356K、D399K(DDKK)を含む、本発明1029のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1032]
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1個以下の抗原結合部分を含む、本発明1029〜1031のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1033]
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が互いに融合されており、任意で、ペプチドリンカーを介して互いに融合されている、本発明1029〜1032のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1034]
第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、本発明1029〜1033のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1035]
第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、本発明1029〜1033のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1036]
第1の抗原結合部分がクロスオーバーFab分子であり、かつ第1の抗原結合部分のFab軽鎖および第2の抗原結合部分のFab軽鎖が互いに融合されており、任意で、ペプチドリンカーを介して互いに融合されている、本発明1034または1035のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1037]
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第2の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている、本発明1029〜1033のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1038]
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端がFcドメインの第1のサブユニットまたは第2のサブユニットのN末端と融合されている、本発明1029〜1033、1035、または1037のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1039]
第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端がFcドメインの第1のサブユニットまたは第2のサブユニットのN末端と融合されている、本発明1029〜1034のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1040]
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、本発明1029〜1032のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1041]
標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子である第3の抗原結合部分を含む、本発明1029〜1040のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1042]
第3の抗原結合部分のFab重鎖のC末端がFcドメインの第1のサブユニットまたは第2のサブユニットのN末端と融合されている、本発明1041のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1043]
第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されており、かつ第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、本発明1041または1042のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1044]
第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されており、かつ第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、本発明1041または1042のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1045]
第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分ならびにFcドメインが免疫グロブリン分子、特に、IgGクラス免疫グロブリンの一部である、本発明1043のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1046]
Fcドメインが、IgG、具体的には、IgG 1 またはIgG 4 のFcドメインである、本発明1029〜1045のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1047]
FcドメインがヒトFcドメインである、本発明1029〜1046のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1048]
Fcドメインが、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す、本発明1029〜1047のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1049]
Fcドメインが、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、本発明1029〜1049のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1050]
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、L234、L235、およびP329の群より選択される1つまたは複数の位置にある、本発明1049のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1051]
Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する3個のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がL234A、L235A、およびP329Gである、本発明1050のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1052]
活性化T細胞抗原がCD3である、前記本発明のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1053]
標的細胞抗原が、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、CD19、CD20、CD33、癌胎児抗原(CEA)、および線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1054]
本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1055]
本発明1054の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1056]
本発明1054の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に、発現ベクター。
[本発明1057]
本発明1054の単離されたポリヌクレオチドまたは本発明1056の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1058]
a)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明1057の宿主細胞を培養する工程、およびb)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
[本発明1059]
本発明1058の方法によって産生された、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
[本発明1060]
本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1061]
医薬として使用するための、本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または本発明1060の薬学的組成物。
[本発明1062]
それを必要とする個体における疾患の治療において使用するための、本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または本発明1060の薬学的組成物。
[本発明1063]
疾患が癌である、本発明1062のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
[本発明1064]
それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬を製造するための、本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
[本発明1065]
個体に、本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む治療的有効量の組成物を投与する工程を含む、個体において疾患を治療する方法。
[本発明1066]
疾患が癌である、本発明1064の使用または本発明1065の方法。
[本発明1067]
T細胞の存在下で、標的細胞を本発明1001〜1053のいずれかのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
[本発明1068]
前記の発明。
定義
以下において特に定めのない限り、当技術分野において一般的に用いられるように用語が本明細書において用いられる。
1表Aの中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって示されたナンバリング規則に従う(以下を参照されたい)。
2表Aに用いられた小文字「b」のある「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されたCDRを指す。
100 x 分数X/Y
のように計算される。式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一マッチとスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。特に定めのない限り、本明細書において用いられる全ての%アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載のように得られる。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子形式
ほとんどの抗体は2本の重鎖および2本の軽鎖で構成される。両鎖は、通常、平らであるか、または凹んでいる抗原結合部位に寄与する。これらの従来の抗体に加えて、ラマ、他のラクダ科の動物、およびサメも、重鎖だけで構成される抗体を産生する。これらの珍しい重鎖抗体の抗原結合部位はシングルドメインだけで形成され、aVH(自律性可変重鎖)またはシングルドメイン可変重鎖と呼ばれる。シングルドメイン可変重鎖は組換えタンパク質として容易に産生される。シングルドメイン可変重鎖の他の有利な特徴には、サイズが小さいこと、溶解度が高いこと、熱安定性があること、リフォールディング能力があること、および組織浸透性が優れていることが含まれる。シングルドメイン抗体は、例えば、Wesolowski et al, Med Microbiol Immunol (2009) 198:157-174に記載されている。シングルドメイン可変重鎖抗体を産生する方法は、例えば、その全体が本明細書において参照として含まれる、WO2012152823およびWO2012056000に記載されている。これらのシングルドメイン可変重鎖抗体には軽鎖がなく、CH1ドメインもない場合がある。従って、シングルドメイン可変重鎖抗体の抗原結合部位はシングルドメインだけで形成される。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、前記Fab分子またはクロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)シングルドメイン可変重鎖を含む第2の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)シングルドメイン可変重鎖を含む第3の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分であって、前記Fab分子またはクロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)シングルドメイン可変重鎖を含む、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)シングルドメイン可変重鎖を含む、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第3の抗原結合部分であって、前記シングルドメイン可変重鎖が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
を含み、式中、「x」は任意のアミノ酸を示し、「」は任意のアミノ酸または欠失を示し、「a」は、無極性側鎖を有するアミノ酸を示し、「p」は、極性側鎖を有する残基を示す。1つの態様において、前記反復ドメインは、アンキリン反復コンセンサス配列
を含み、ここで「x」は任意のアミノ酸を示す。1つの態様において、前記反復ドメインは、アンキリン反復配列モチーフ
を含み、式中、1は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、2は、H、N、およびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、前記Fab分子またはクロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第2の抗原結合部分であって、前記少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む第3の抗原結合部分であって、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab分子、またはFab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分であって、前記Fab分子またはクロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分であって、前記少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質を含む、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第3の抗原結合部分であって、少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む。
本発明の一部の態様において、前記T細胞活性化二重特異性抗原結合分子はFcドメインを含む。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは二量体であり、二量体の各サブユニットはCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。2個のFcドメインサブユニットは互いに安定な会合が可能である。1つの態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は1個以下のFcドメインを含む。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる抗原結合部分を含み、1つの態様においては、Fcドメインの2つのサブユニットの一方または他方と融合されている。従って、Fcドメインの2つのサブユニットは、典型的に、2本の非同一ポリペプチド鎖の中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現およびその後の二量体化は、2つのポリペプチドのいくつかの可能性のある組み合わせをもたらす。従って、組換え産生におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率および純度を改善するために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、望ましいポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利であろう。
(a)Fab軽鎖およびFab重鎖がペプチドリンカーでつながっている単鎖Fab分子、または
(b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子
である、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分と、
安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインであって、前記第1のサブユニットおよび前記第2のサブユニットがヘテロ二量体形成に静電気的に有利な1つもしくは複数の荷電アミノ酸を含むように改変されている、Fcドメインと
を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
Fcドメインは、標的組織における優れた蓄積に寄与する長い血清半減期および好ましい組織-血液分布比を含む好ましい薬物動態学的特性をT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に付与する。しかしながら、同時に、Fcドメインは、抗原を有する好ましい細胞ではなくFc受容体発現細胞へのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくない標的化につながる場合がある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路が同時活性化されるとサイトカインが放出される場合がある。このサイトカイン放出は抗原結合分子のT細胞活性化特性および長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化および全身投与時の重篤な副作用の原因となる。T細胞以外の(Fc受容体を有する)免疫細胞が活性化されると、T細胞が、例えば、NK細胞によって破壊される可能性があるために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の効力がさらに低減する場合がある。
本発明の抗原結合分子は二重特異性である。すなわち、本発明の抗原結合分子は、2種類の特異な抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも2つの抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分は、Fab分子(すなわち、それぞれが可変領域および定常領域を含む重鎖および軽鎖で構成される抗原結合ドメイン)、シングルドメイン抗原結合(SDAB)分子、または少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質(例えば、Darpin)のようなタンパク質スキャフォールドである。1つの態様において、前記Fab分子またはシングルドメイン抗原結合(SDAB)分子はヒトである。別の態様において、前記Fab分子またはシングルドメイン抗原結合(SDAB)分子はヒト化されている。さらに別の態様において、前記Fab分子はヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化T細胞抗原に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分(本明細書において「活性化T細胞抗原結合部分」とも呼ばれる)を含む。特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1個以下の抗原結合部分を含む。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化T細胞抗原との一価結合を提供する。活性化T細胞抗原結合部分は、従来のFab分子もしくは改変されたFab分子、すなわち、単鎖もしくはクロスオーバーFab分子、またはシングルドメイン抗原結合(SDAB)分子、または少なくとも1個のアンキリン反復モチーフを含む結合タンパク質でもよい。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分が複数ある態様において、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分は、好ましくは、改変されたFab分子である。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分(本明細書において「標的細胞抗原結合部分」とも呼ばれる)を含む。ある特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる2つの抗原結合部分を含む。このような特定の態様において、これらの抗原結合部分はそれぞれ、同じ抗原決定基に特異的に結合する。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる2個以下の抗原結合部分を含む。
さらに、本発明は、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)または組換え産生によって入手することができる。組換え産生の場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、前記のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは従来の手順を用いて容易に単離および配列決定することができる。1つの態様において、本発明のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルと共にT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA法、合成法、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載の技法を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部でもよく、核酸断片でもよい。発現ベクターには、プロモーターおよび/または他の転写制御エレメントもしくは翻訳制御エレメントと機能的に会合して、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コード領域)がクローニングされている発現カセットが含まれる。本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するのであればコード領域の一部とみなされることがある。だが、いかなる隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域などはコード領域の一部でない。2種類以上のコード領域が1つのポリヌクレオチド構築物、例えば、1つのベクターに存在してもよく、別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の(異なる)ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターが1つのコード領域を含有してもよく、2種類以上のコード領域を含有してもよい。例えば、本発明のベクターは1種類または複数種のポリペプチドをコードしてもよく、1種類または複数種のポリペプチドは翻訳後または翻訳と同時にタンパク質切断を介して最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)またはその変種もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合された状態で、または融合されていない状態で異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されるわけではない。機能的な結合とは、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くように遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が1つまたは複数の調節配列と結合している時の結合である。プロモーター機能が誘導されることで、望ましい遺伝子産物をコードするmRNAが転写されるのであれば、および2つのDNA断片間の連結の内容が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げない、またはDNA鋳型が転写される能力を妨げないのであれば、2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合しているプロモーター)は「機能的に結合している」。従って、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸を転写することができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合している。プロモーターは、予め決められた細胞でのみ大幅なDNA転写を誘導する細胞特異的プロモーターでもよい。細胞特異的転写を誘導するように、プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書において開示される。様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、最初期プロモーターとイントロン-A)、シミアンウイルス40(例えば、初期プロモーター)、ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス)などがあるが、それに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、それに限定されるわけではない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギα-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)が含まれる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳制御エレメントには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント(特に、内部リボソーム挿入部位すなわち「IRES」。CITE配列とも呼ばれる)が含まれるが、これに限定されない。発現カセットはまた、他の特徴、例えば、複製起点、および/または染色体組み込みエレメント、例えば、レトロウイルス末端反復配列(LTR)、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)も含んでよい。
本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の物理的/化学的特性および/または生物学的活性を、当技術分野において公知の様々なアッセイによって特定、スクリーニング、または特徴付けすることができる。
Fc受容体または標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性は、実施例に示された方法に従って、BIAcore装置(GE Healthcare)などの標準的な計器を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)によって求めることができる。受容体または標的タンパク質は組換え発現によって入手されてもよい。または、異なる受容体または標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー(FACS)によって評価されてもよい。結合親和性を測定するための実例となる、かつ例示的な具体的な態様が、以下において、および下記の実施例において説明される。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的活性は、実施例に記載されるような様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性には、例えば、T細胞増殖の誘導、T細胞におけるシグナル伝達の誘導、T細胞における活性化マーカー発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の溶解の誘導、ならびに腫瘍退縮の誘導および/または生存の改善が含まれ得る。
さらなる局面において、本発明は、例えば、以下の任意の治療方法において使用するための、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、下記の治療剤を含む。
本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を治療方法において使用することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、例えば、癌治療において使用することができる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において1種類または複数種の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は少なくとも1種類のさらなる治療剤と同時投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体において症状または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療されている特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分を含んでもよい。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害薬剤、細胞アポトーシスアクチベーター、またはアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の態様において、さらなる治療剤は、抗癌剤、例えば、微小管阻害剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスアクチベーター、または血管新生阻害剤である。
本発明の別の局面において、前記の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および容器に貼られている、または容器に関連するラベルまたは添付文書を備える。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バック(IV solution bag)などが含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態の治療、予防、および/もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物、または単独の組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バックまたは皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1種類の活性薬剤は本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するのに用いられることを示す。さらに、製造物品は、(a)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が中に入れられている第1の容器;および(b)さらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む組成物が中に入れられている第2の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造物品は、ある特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに備えてもよい。または、もしくはさらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、無菌注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、およびデキストロース液を含む第2の(または第3の)容器をさらに備えてもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
組換えDNA法
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のように、DNAを操作するために標準的な方法を使用した。分子生物学用試薬を製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242に示されている。
DNA配列を二本鎖配列決定によって決定した。
必要に応じて、望ましい遺伝子セグメントが、適切なテンプレートを用いてPCRによって作製されたか、またはGeneart AG(Regensburg, Germany)によって自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成された。正確な遺伝子配列を入手できなかった場合、オリゴヌクレオチドプライマーを、最も近いホモログからの配列に基づいて設計した。遺伝子を、適切な組織に由来するRNAからRT-PCRによって単離した。独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントを標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、濃度をUV分光法によって求めた。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位が備わった設計にした。全ての構築物を、真核細胞においてタンパク質を分泌するように向けるリーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列が備わった設計にした。SEQ ID NO 154〜162は例示的なリーダーペプチドおよびそれらをコードする各ポリヌクレオチド配列を示す。
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。簡単に述べると、血液を滅菌PBSで希釈し、注意深くHistopaque 勾配(Sigma, H8889)の上に層状に積み重ねた。450xgで室温で30分間、遠心分離した後に(ブレーキのスイッチをオフにした)、中間期(interphase)を含有するPBMCの上にある血漿の一部を捨てた。PBMCを新たな50ml Falconチューブに移し、チューブをPBSで総体積50mlまで満たした。混合物を400xg、室温で10分間、遠心分離した(ブレーキのスイッチをオンにした)。上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(350xg、4℃で10分間の遠心分離工程)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、アッセイ開始までインキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。PBMCからのT細胞濃縮は、Miltenyi BiotecのNaive CD8+ T cell isolation Kit(#130-093-244)を用いて製造業者の説明書に従って行ったが、CD8+T細胞の最後の単離工程を省いた(初代ヒトpanT細胞の単離についての説明も参照されたい)。
脾臓をC57BL/6マウスから分離し、MACS緩衝液(PBS+0.5%BSA+2mM EDTA)を含有するGentleMACS C-チューブ(Miltenyi Biotech #130-093-237)に移し、製造業者の説明書に従ってGentleMACS Dissociatorで解離してシングル細胞懸濁液を得た。残存している解離しなかった組織粒子を除去するために、細胞懸濁液をプレセパレーション(pre-separation)フィルターに通した。400xg、4℃で4分間、遠心分離した後に、赤血球を溶解するためにACK溶解緩衝液を添加した(室温で5分間のインキュベーション)。残存している細胞をMACS緩衝液で2回洗浄し、計数し、マウスpanT細胞の単離に使用した。負の(磁気)選択を、Miltenyi BiotecのPanT Cell Isolation Kit(#130-090-861)を用いて製造業者の説明書に従って行った。結果として生じたT細胞集団を自動計数し(ViCell)、すぐに、さらなるアッセイに使用した。
以下の通りに、健常なカニクイザルドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)を密度遠心分離によって調製した。ヘパリン添加血液を滅菌PBSで1:3に希釈し、Lymphoprep培地(Axon Lab #1114545)を滅菌PBSで90%まで希釈した。2体積の希釈血液を1体積の希釈密度勾配の上に層状に積み重ねた。ブレーキなしで、PBMC画分を520xg、室温で30分間、遠心分離によって分離した。PBMCバンドを新しい50ml Falconチューブに移し、遠心分離によって滅菌PBSで400xg、4℃で10分間、洗浄した。血小板を除去するために低速遠心分離(150xg、4℃で15分間)を1回、行い、結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、さらなるアッセイのために、すぐに使用した。
MCSPを標的とする二重特異性抗原結合分子を評価するために、以下の腫瘍細胞株:悪性黒色腫の転移部位に由来し、高レベルのヒトMCSPを発現するヒト黒色腫細胞株WM266-4(ATCC#CRL-1676);および中程度のレベルのヒトMCSPを発現するヒト黒色腫細胞株MV-3(The Radboud University Nijmegen Medical Centreからの寄贈品)を使用した。
二重特異性抗原結合分子の調製、精製、および特徴付け
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、それぞれのベクターはEBV OriP配列を含有した。
Fc受容体および標的抗原の結合の表面プラズモン共鳴分析
方法
全ての表面プラズモン共鳴(SPR)実験を、Biacore T100においてランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて25℃で行った。
アッセイ設定を図16Aに示した。異なるFc変種とヒトFcγRIIIa-V158およびマウスFcγRIVとの相互作用を分析するために、標準的なアミンカップリングキット(Biacore, Freiburg/Germany)を用いて約6,500共鳴単位(RU)の抗Penta His抗体(Qiagen)の直接カップリングをCM5チップ上でpH5.0で行った。ヒトFcγRIIIa-V158-K6H6およびマウスFcγRIV-aviHis-ビオチンをそれぞれ4nMおよび10nMで60秒間捕捉した。
Fc変種とヒトFcγRIIIaおよびマウスFcγRIVとの相互作用を表面プラズモン共鳴によってモニタリングした。分析した全Fc変異体について、捕捉されたヒトFcγRIIIa-V158-K6H6およびマウスFcγRIV-aviHis-ビオチンとの結合は野生型(wt)Fcドメインを有する構築物と比較して有意に低下した。
標準的なカップリング手順を用いて1650共鳴単位(RU)のビオチン化MCSP D3ドメインをセンサーチップSAに直接カップリングすることによって、T細胞二重特異性構築物と腫瘍抗原およびヒトCD3εとの同時結合の分析を行った。ヒトEGFRを、標準的なアミノカップリング手順を用いて固定化した。8000RUをpH5.5でCM5センサーチップ上に固定化した。アッセイ設定を図16Bに示した。
腫瘍抗原およびヒトCD3εとの同時結合を表面プラズモン共鳴によって分析した(図17、図18)。全構築物が腫瘍抗原およびCD3に同時に結合することができた。構築物の大部分について、ヒトCD3εを注射した後の結合レベル(RU)は、構築物のみを注射した後に達した結合レベルより高かった。このことは、腫瘍抗原およびヒトCD3εの両方が構築物に結合したことを反映している。
二重特異性構築物と細胞上にあるそれぞれの標的抗原との結合
異なる二重特異性構築物と、ジャーカット細胞(ATCC #TIB-152)上にあるCD3および標的細胞上にあるそれぞれの腫瘍抗原との結合をFACSによって確かめた。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べた。1ウェルあたり15万〜20万個の細胞(0.1%BSAを含有するPBSに溶解した; 90μl)を丸底96ウェルプレートにプレートし、示された濃度の二重特異性構築物および対応するIgG対照(10μl)と4℃で30分間インキュベートした。より明確に比較するために、全構築物およびIgG対照を同じモル濃度に対して基準化した。インキュベートした後、細胞を遠心分離し(5分、350xg)、0.1%BSAを含有するPBS 150μlで洗浄し、再懸濁し、12μl/ウェルのFITC結合またはPE結合二次抗体と4℃でさらに30分間インキュベートした。結合した構築物を、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いて検出した。「(scFv)2」分子を、FITC結合抗His抗体(Lucerna, #RHIS-45F-Z)を用いて検出した。他の全ての分子について、FITCまたはPEが結合したAffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcγ断片特異的(それぞれ、Jackson Immuno Research Lab #109-096-098/ワーキング溶液1:20、または#109-116-170/ワーキング溶液1:80)を使用した。120μl/ウェルの0.1%BSA含有PBSを添加し、350xgで5分間、遠心分離することによって、細胞を洗浄した。150μl/ウェルの0.1%BSA含有PBSを用いて、もう1回、洗浄工程を行った。特に定めのない限り、細胞を100μl/ウェルの固定緩衝液(BD#554655)で4℃で15分間、暗所で固定し、400xgで6分間、遠心分離し、試料をFACS CantoIIで測定するまで200μl/ウェルの0.1%BSA含有PBSの中に保持した。EC50値をGraphPad Prism ソフトウェアを用いて計算した。第1の実験では、ヒトMCSPおよびヒトCD3を標的とする異なる二重特異性構築物を、ヒトT細胞白血病細胞であるジャーカット上に発現しているヒトCD3またはColo-38ヒト黒色腫細胞上にあるヒトMCSPとの結合についてフローサイトメトリーによって分析した。
二重特異性構築物会合時の初代ヒトT細胞上にある表面活性化マーカーのFACS分析
ヒトMCSP発現腫瘍細胞の存在下で、CD8+T細胞上にある初期表面活性化マーカーCD69または後期活性化マーカーCD25をアップレギュレートする能力について、ヒトMCSP-ヒトCD3を標的とする精製された二重特異性「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)および「(scFv)2」分子をフローサイトメトリーによって試験した。
CD3二重特異性構築物によってヒトpanT細胞が活性化した時のインターフェロン-γ分泌
ヒトMCSPおよびヒトCD3を標的とする精製された「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)が、ヒトMCSP陽性U-87MG細胞の存在下でT細胞活性化を誘導する能力を分析した。これは、上清へのヒトインターフェロン(IFN)-γの放出によって測定した。対照として、同じモル濃度まで調節した抗ヒトMCSP IgGおよび抗ヒトCD3 IgGを使用した。簡単に述べると、ヒトMCSP発現U-87MGグリア芽細胞腫星状細胞腫標的細胞(ECACC 89081402)を細胞解離緩衝液を用いて回収し、洗浄し、AIM-V培地(Invitrogen #12055-091)に再懸濁した。1ウェルあたり20000個の細胞を丸底96ウェルプレートにプレートし、最終濃度1nMとなるように、それぞれの抗体希釈液を添加した。5:1の最終E:T比となるように、バフィーコートから単離したヒトpanTエフェクター細胞を添加した。37℃、5%CO2で18.5時間、一晩インキュベートした後に、アッセイプレートを350xgで5分間、遠心分離し、上清を新鮮な96ウェルプレートに移した。上清中のヒトIFN-γレベルを、ELISAによって製造業者の説明書に従って(Becton DickinsonのBD OptEIAヒトIFN-γ ELISA Kit II, #550612)測定した。
T細胞上にあるCD3および腫瘍細胞上にあるMCSPまたはEGFRを標的とする架橋二重特異性構築物によって媒介される方向付け直されたT細胞性細胞傷害性(LDH放出アッセイ)
第1の一連の実験では、抗原結合部分と細胞上にあるそれぞれの標的抗原が結合することで構築物が架橋された時に、CD3およびMCSPを標的とする二重特異性構築物が腫瘍標的細胞のT細胞性アポトーシスを誘導する能力を分析した(図27〜38)。
CD107a/bアッセイ
ヒトMCSPおよびヒトCD3の両方を標的とする精製された「2+1 IgG scFab」構築物(SEQ ID NO 5、17、19)および「(scFv)2」分子がヒトMCSP発現腫瘍細胞の存在下または非存在下でCD107aおよび細胞内パーフォリンレベルをアップレギュレートする能力をフローサイトメトリーによって試験した。
増殖アッセイ
ヒトCD3およびヒトMCSPを両方とも標的とする精製された「2+1 IgG scFab」(SEQ ID NO 5、17、19)および「(scFv)2」分子がヒトMCSP発現腫瘍細胞の存在下または非存在下でCD8+T細胞またはCD4+T細胞の増殖を誘導する能力をフローサイトメトリーによって試験した。
サイトカイン放出アッセイ
ヒトMCSPおよびヒトCD3を両方とも標的とする、精製された「2+1 IgG scFab」構築物(SEQ ID NO 5、17、19)および「(scFv)2」分子が腫瘍標的細胞の存在下または非存在下でT細胞性の新規サイトカイン分泌を誘導する能力を分析した。
抗MCSP抗体M4-3/ML2の親和性成熟
親和性成熟はオリゴヌクレオチド指定突然変異手順を介して行った。この手順のために、重鎖変種M4-3および軽鎖変種ML2を、Hoogenboom, (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137)に記載のものと同様のファージミドベクターにクローニングした。最初に、古典的なホモロジーモデリングを介して前記抗体の3Dモデルを作製し、次いで、重鎖および軽鎖の相補性決定領域 (CDR)の溶媒接近可能残基を特定することによって、無作為化される残基を特定した。表4に示したようにトリヌクレオチド合成に基づく無作為化を有するオリゴヌクレオチドをElla-biotech(Munich, Germany)から購入した。3つの独立したサブライブラリーを古典的PCRを介して作製した。これらはCDR-H1と一緒にCDR-H2、またはCDR-L1と一緒にCDR-L2を含んだ。CDR-L3を異なるアプローチで無作為化した。これらのライブラリーのDNA断片を制限消化および連結を介してファージミドにクローニングし、その後に電気穿孔処理してTG1細菌に導入した。
このように作製された抗体変種を、繊維状ファージ粒子から、それぞれの粒子の中にパッケージングされたM13の遺伝子III産物との融合として一価でディスプレイした。次いで、ファージディスプレイされた変種を生物学的活性(ここでは結合親和性)についてスクリーニングした。さらなる開発のために、1つまたは複数の改善された活性を有する候補を使用した。ファージディスプレイライブラリーを作製する方法は、Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093)に記載されている。
親和性成熟変種の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有した。
ProteOn分析
アミンカップリングによって抗ヒトF(ab')2断片特異的捕捉用抗体(Jackson ImmunoResearch #109-005-006)をCM5チップ上で固定化し、その後に細菌上清または精製Fab調製物からのFabを捕捉する、ProteOn XPR36装置(BioRad)を25℃で用いる表面プラズモン共鳴によってKDを測定した。簡単に述べると、供給業者の説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare)をN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。抗ヒトF(ab')2断片特異的捕捉用抗体を10mM酢酸ナトリウム、pH5.0で50μg/mlに希釈した後に、約10.000応答単位(response unit)(RU)までのカップリング捕捉用抗体となるように10μl/分の流速で注入した。捕捉用抗体を注入した後に、反応しなかった基をブロックするために1Mエタノールアミンを注入した。反応速度測定のために、細菌上清からのFabまたは精製Fabを10μl/分の流速で300秒間、注入し、捕捉ベースライン安定化のために300秒間、解離させた。捕捉レベルは100〜500RUであった。後の工程において、ヒトMCSP(D3ドメイン)-avi-his分析物を、HBS-EP+(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%Surfactant P20、pH7.4)で希釈した(100nM〜250pMの範囲のクローン親和性に応じて)単一濃度または濃度シリーズのいずれかとして50μl/分の流速で25℃で注入した。グリシンpH1.5を90ul/分で30秒間注入した後にNaOHを同じ流速で20秒間注入することによってセンサーチップ表面を再生した。会合速度(kon)および解離速度(koff)は、単純1:1ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(ProteOn XPR36 Evaluation SoftwareまたはScrubber software(BioLogic))を用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算した。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算した。このデータを用いて、親和性成熟変種と親抗体との比較結合親和性を求めた。表6aは、これらのアッセイから作成したデータを示す。
親和性成熟IgGの親和性およびアビディティを求める表面プラズモン共鳴(SPR)実験を、Biacore T200においてランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて25℃で行った。
抗MCSP抗体としてM4-3(C1)ML2(G3)および抗CD3抗体としてヒト化CH2527を含有するMCSP TCB(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 逆)の調製
結果として生じた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
抗CEA抗体としてCH1A1A 98/99 2F1、抗CD3抗体としてヒト化CH2527を含有するCEA TCB(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 逆)の調製
結果として生じた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
GA903 TCBとMCSP発現細胞およびCD3発現細胞との結合
GA903 TCBの結合を、MCSP発現ヒト悪性黒色腫細胞株(A375)およびCD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において試験した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1%BSA)に溶解して2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレート中で漸増濃度のMCSP TCB(2.6pM〜200nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、すぐに、FACS CantoII(Software FACS, Diva)を用いたFACSによって、DAPI陰性生細胞をゲーティングすることによって分析した。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を入手した(図74A、A375細胞との結合、EC50=3381pM; 図74B、ジャーカット細胞との結合)。
MCSP TCB抗体によって誘導されたT細胞性死滅
MCSP TCB抗体によって媒介されるT細胞性死滅を、異なるレベルのMCSPを発現する1パネルの腫瘍細胞株(A375=MCSP高、MV-3=MSCP中、HCT-116=MCSP低、LS180=MCSP陰性)を用いて評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着したままにした。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮な血液を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上に層状に積み重ねた。450xgで室温で30分間、遠心分離した後に、PBMCを含有する中間層(interphase)の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(1pM〜10nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5%CO2で24時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0%)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。結果から、MCSP TCBはMCSP+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導したが、MCSP-細胞株の死滅を誘導しなかったことが分かる。図75A〜D。GraphPadPrism5を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表10に示した。
MCSP TCB抗体によって誘導されたMCSP発現腫瘍細胞のT細胞性死滅後のCD8+エフェクター細胞およびCD4+エフェクター細胞上にあるCD25およびCD69のアップレギュレーション
MCSP TCB抗体によって媒介されるMCSP発現MV-3腫瘍細胞のT細胞性死滅後のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD25(後期活性化マーカー)およびCD69(初期活性化マーカー)を認識する抗体を用いたFACS分析によって評価した。抗体および死滅アッセイ条件は本質的に前記(実施例14)の通りであり、同じ抗体濃度範囲(1pM〜10nM、3回繰り返した)、10:1のE:T比、および24時間のインキュベーション時間を使用した。
MCSP TCB抗体によって誘導されたMCSP発現腫瘍細胞のT細胞性死滅後のヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
MCSP TCB抗体によって誘導されたMCSP発現MV-3腫瘍細胞のT細胞性死滅後のヒトPBMCによるサイトカイン分泌を、死滅アッセイ後の細胞上清のFACS分析によって評価した。
・MCSP+A375細胞と良好な結合を示した
・MCSP+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導し、MCSP-細胞株の死滅を誘導しなかった
・死滅後に、CD8+T細胞およびCD4+T細胞上にある活性化マーカー(CD25、CD69)の強力かつ標的特異的なアップレギュレーションを誘導した
・死滅時にIL-2、IFN-g、TNF-a、GrB、およびIL-10の分泌を誘導した(IL-4の分泌を誘導しなかった)
CEA TCBとCEA発現細胞およびCD3発現細胞との結合
CEA TCBの結合を、CEA発現結腸腺癌細胞(LS180)およびCD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において試験した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1%BSA)に溶解して2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレート中で漸増濃度のCEA TCB(3pM〜200nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、すぐに、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いたFACSによって、DAPI陰性生細胞をゲーティングすることによって分析した。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を入手した(図78A、LS180細胞との結合;図78B、ジャーカット細胞との結合)。
CEA TCB抗体によって誘導されたT細胞性死滅
CEA TCB抗体によって媒介されるT細胞性死滅を、MKN45(高CEA)、LS180(中CEA)、およびHT-29(低CEA)ヒト腫瘍細胞において評価した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と24時間インキュベートした時に死滅を検出した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着したままにした。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮な血液を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上に層状に積み重ねた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.2pM〜20nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5%CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0%)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。結果から、CEA TCBは、CEA+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導したことが分かる。図79A〜C。GraphPadPrism5を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表11に示した。
CEA TCB抗体によって誘導されたCEA発現腫瘍細胞のT細胞性死滅後のCD8+エフェクター細胞およびCD4+エフェクター細胞上にあるCD25およびCD69のアップレギュレーション
CEA TCB抗体によって媒介されるCEA発現LS180腫瘍細胞のT細胞性死滅後のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD25(後期活性化マーカー)およびCD69(初期活性化マーカー)を認識する抗体を用いたFACS分析によって評価した。抗体および死滅アッセイ条件は本質的に前記(実施例18)の通りであり、同じ抗体濃度範囲(0.2pM〜20nM、3回繰り返した)、10:1のE:T比、および24時間のインキュベーション時間を使用した。
CEA TCBによって誘導されたCEA発現腫瘍細胞のT細胞性死滅後のヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
CEA TCBによって誘導されたCEA発現LS180腫瘍細胞のT細胞性死滅後のヒトPBMCによるサイトカイン分泌を、死滅アッセイ後の細胞上清のFACS分析によって評価した。
・CEA+細胞と良好な結合を示した
・CEA+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導した
・死滅後に、CD8+T細胞およびCD4+T細胞上にある活性化マーカー(CD25、CD69)の強力かつ標的特異的なアップレギュレーションを誘導した
・死滅時にIL-2、IFN-g、TNF-a、GrB、およびIL-10の分泌を誘導した(IL-4の分泌を誘導しなかった)
非結合抗体としてDP47 GS、抗CD3抗体としてヒト化CH2527を含有するDP47 GS TCB(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA 逆=「非標的化TCB」)の調製
前記の実験では「非標的化TCB」を対照として使用した。この二重特異性抗体はCD3eに結合するが、他のいかなる抗原とも結合せず、従って、T細胞を、いかなる標的細胞とも架橋することができない(その後に、死滅を誘導することができない)。従って、このアッセイでは、非特異的なT細胞活性化をモニタリングするために「非標的化TCB」を負の対照として使用した。
結果として生じた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列は、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングされている。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
aVH TCBの結合を、MCSP発現ヒト黒色腫細胞株(MV-3)およびCD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において試験した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1%BSA)に溶解して2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレート中で漸増濃度のaVH TCB(2pM〜170nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、すぐに、FACS CantoII(Software FACS, Diva)を用いてFACSによって分析した。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を入手した(図87A、MV3細胞との結合; 図87B、ジャーカット細胞との結合)。
aVH TCB抗体によって媒介されるT細胞性死滅を、MCSP発現ヒト黒色腫腫瘍細胞(MV-3)およびヒトPBMCを用いて24時間および48時間のインキュベーションで評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着したままにした。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮な血液を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上に層状に積み重ねた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(110pM〜80nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5%CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0%)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。結果から、aVH TCBは、MCSP+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導したことが分かる。図88A、B。GraphPadPrism5を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表16に示した。
図87. aVH TCBとMV-3細胞(MCSP+)(A)およびジャーカット(CD3+細胞)(B)との結合。
図88. 24時間(A)および48時間(B)のインキュベーション後に検出された、aVH TCB抗体によって誘導されたMV-3黒色腫細胞のT細胞性死滅。(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC)
結果として生じた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列は、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングされている。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
Darpin TCBの結合を、Her2発現ヒト黒色腫細胞株(KPL-4)およびCD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において試験した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1%BSA)に溶解して2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレート中で漸増濃度のDarpin TCB(3pM〜200nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、すぐに、FACS CantoII(Software FACS, Diva)を用いてFACSによって分析した。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を入手した(図91A、KPL-4細胞との結合; 図91B、ジャーカット細胞との結合)。
Darpin TCB抗体によって媒介されるT細胞性死滅を、Her2発現ヒト黒色腫腫瘍細胞(KPL4)およびヒトPBMCを用いて24時間および48時間のインキュベーションで評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着したままにした。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮な血液を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上に層状に積み重ねた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(2pM〜20nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5%CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0%)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。結果から、Darpin TCBは、Her2+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導したことが分かる。図92A、B。GraphPadPrism5を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表19に示した。
結果として生じた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列は、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングされている。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
hIgG1 DDKK TCBの結合を、MCSP発現ヒト黒色腫細胞株(MV-3)およびCD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において試験した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1%BSA)に溶解して2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレート中で漸増濃度のhIgG1 DDKK TCB(2pM〜170nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1%BSAで2回洗浄し、すぐに、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いてFACSによって分析した。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を入手した(図95A、MV-3細胞との結合、EC50=12803pM; 図95B、ジャーカット細胞との結合)。
hIgG1 DDKK TCB抗体によって媒介されるT細胞性死滅を、MCSP発現ヒト黒色腫腫瘍細胞(MV-3)およびヒトPBMCを用いて24時間および48時間のインキュベーションで評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着したままにした。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮な血液を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上に層状に積み重ねた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10%FCSおよび1%L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5%CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.02pM〜20nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5%CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100%)は、標的細胞を1%TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0%)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。結果から、hIgG1 DDKK TCBは、MCSP+標的細胞株の強力かつ標的特異的な死滅を誘導したことが分かる。図96A、B。GraphPadPrism5を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表22に示した。
Claims (28)
- 活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分および標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分を含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる第1の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ標的細胞抗原に特異的に結合することができる第2の抗原結合部分がシングルドメイン可変重鎖からなる、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - 安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインをさらに含む、請求項1記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が互いに融合されている、請求項1または2記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が互いにペプチドリンカーを介して融合されている、請求項3記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分のシングルドメイン可変重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、請求項1記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 標的細胞抗原に特異的に結合することができる第3の抗原結合部分を含み、該第3の抗原結合部分がシングルドメイン可変重鎖である、請求項1〜5のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン;
b)Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーFab分子を含む第1の抗原結合部分であって、該クロスオーバーFab分子のFab重鎖のC末端がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第1の抗原結合部分;
c)シングルドメイン可変重鎖を含む第2の抗原結合部分であって、該シングルドメイン可変重鎖がFcドメインのサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、第2の抗原結合部分;ならびに
d)シングルドメイン可変重鎖を含む第3の抗原結合部分であって、該シングルドメイン可変重鎖が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、第3の抗原結合部分
を含む、請求項6記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - 第1の抗原結合部分が活性化T細胞抗原に結合し、かつ第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分が同じ標的細胞抗原に結合する、請求項7記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、IgG、具体的には、IgG1またはIgG4のFcドメインである、請求項2、7、または8のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがヒトFcドメインである、請求項9記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む、請求項2または7〜10のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す、請求項2または7〜11のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項2または7〜12のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、EUナンバリングシステムによるL234、L235、およびP329の群より選択される1つまたは複数の位置にある、請求項13記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する3個のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がEUナンバリングシステムによるL234A、L235A、およびP329Gである、請求項14記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fc受容体がFcγ受容体である、請求項12〜15のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害(ADCC)である、請求項12記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 活性化T細胞抗原がCD3である、請求項1〜17のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 標的細胞抗原が、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、CD19、CD20、CD33、癌胎児抗原(CEA)、および線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)からなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1〜19のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項20記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
- 請求項20記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に、発現ベクター。
- 請求項20記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項22記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- a)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項23記載の宿主細胞を培養する工程、およびb)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1〜19のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項25記載の薬学的組成物。
- それを必要とする個体における疾患の治療において使用するための、請求項1〜19のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項25記載の薬学的組成物。
- 疾患が癌である、請求項27記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
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