ES2206447T3 - Anticuerpo humanizado para heregulina. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN INMUNOGLOBULINAS VARIANTES Y EN PARTICULAR POLIPEPTIDOS DE ANTICUERPOS HUMANIZADOS, JUNTO CON LOS METODOS PARA SU PREPARACION Y USO. TAMBIEN SE PRESENTAN LAS SECUENCIAS DE INMUNOGLOBULINAS Y LOS MODELOS ESTRUCTURALES CONSENSUALES.

Description

Anticuerpo humanizado para heregulina.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos variantes y encuentra aplicación, concretamente, en los campos de la inmunología y el diagnóstico y terapia del cáncer.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos que aparecen en la naturaleza (inmunoglobulinas) comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí mediante enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras unidas a cada una de las cadenas pesadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V_{L}) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que unos restos aminoácidos concretos forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada, véase, por ejemplo Chotia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985).

Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero están implicados en diversas funciones efectoras, como en la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas naturales tienen la misma estructura general, y cada dominio comprende cuatro regiones de marco conservado ("framework region", FR), cuyas secuencias se conservan de algún modo, conectadas mediante tres regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad ("complementary determining region", CDR) (véase Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). Las cuatro regiones de marco conservado adoptan, en gran parte, una configuración en lámina \beta, y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en lámina \beta. Las CDR en cada cadena se mantienen muy próximas mediante las regiones de marco conservado, y con las CDR de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

Los anticuerpos monoclonales se han utilizado ampliamente, en particular los derivados de roedores, incluyendo ratones, aunque con frecuencia son antigénicos en un uso clínico humano. Por ejemplo, una limitación importante en el uso clínico de anticuerpos monoclonales de roedores es una respuesta antiglobulina durante la terapia (Miller, R.A. et al., Blood, 62:988-995 (1983); Schroff, R.W. et al., Cancer Res., 45:879-885 (1985)).

En la técnica se ha intentado solucionar este problema construyendo anticuerpos "quiméricos" en los que un dominio variable de unión a antígeno animal se acopla con un dominio constante humano (Cabilly et al., patente de EEUU nº 4.816.567; Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-646 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985)). La expresión "anticuerpo quimérico" se utiliza en la presente para describir un polipéptido que comprende al menos una porción de unión al antígeno de la molécula del anticuerpo, unida al menos a parte de otra proteína (de forma típica, un dominio constante de inmunoglobulina).

El isotipo del dominio constante humano puede seleccionarse para adaptar el anticuerpo quimérico para su participación en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (véase, por ejemplo, Brüggemann, M. et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987); Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Love et al., Methods in Enzymology, 178:515-527 (1989); Bindon et al., J. Exp. Med., 168:127-142 (1988)).

En una realización típica, estos anticuerpos quiméricos contienen aproximadamente una tercera parte de secuencia de roedor (u otra especie no humana) y, por tanto, son capaces de producir una respuesta antiglobulina significativa en seres humanos. Por ejemplo, en el caso del anticuerpo anti-CD3 murino OKT3, la mayor parte de la respuesta antiglobulina resultante está dirigida contra la región variable, en lugar de la región constante (Jaffers, G.J. et al., Transplantation, 41:572-578 (1986)).

En otro esfuerzo para resolver las funciones de unión al antígeno de los anticuerpos, y para minimizar el uso de secuencias heterólogas en anticuerpos humanos, Winter y sus colegas (Jones, P.T. et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M. et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) sustituyeron las CDR o las secuencias de las CDR de roedores por los correspondientes segmentos de un anticuerpo humano. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "anticuerpo humanizado" es una realización de anticuerpos quiméricos, en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son, de forma típica, anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR, y probablemente algunos restos de FR, se sustituyen por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La promesa terapéutica de este enfoque está apoyada por la eficacia clínica de un anticuerpo humanizado específico para el antígeno CAMPATH-1 con dos pacientes con linfoma no Hodgkin, uno de los cuales había desarrollado previamente una respuesta antiglobulina frente al anticuerpo de rata progenitor (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Hale, G. et al., Lancet, 1:1394-1399 (1988)). Un anticuerpo murino contra el receptor de interleuquina 2 también se ha humanizado recientemente (Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)) como reactivo inmunosupresor potencial. Otras referencias relacionadas con la humanización de anticuerpos incluyen Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2869-2873 (1991); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4181-4185 (1991); Daugherty et al., Nucleic Acids Research, 19(9):2471-2476 (1991)); Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2663-2667 (1991); Junghans et al., Cancer Research, 50:1495-1502 (1990).

En algunos casos, la sustitución de CDR de anticuerpos de roedores por CDR humanas en marcos conservados humanos es suficiente para transferir una alta afinidad de unión al antígeno (Jones, P.T. et al., Nature, 321:522-525 (1986); Verhoeyen, M. et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), mientras que en otros casos ha sido necesario sustituir además uno (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988)) o varios (Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)) restos de la región de marco conservado (FR). Véase también Co et al., supra.

Para un anticuerpo concreto se prevé que un pequeño número de restos de FR es importante para la unión al antígeno. En primer lugar, por ejemplo, se ha demostrado que ciertos anticuerpos contienen unos pocos restos de FR que se ponen en contacto directamente con el antígeno en estructuras cristalinas de complejos de anticuerpo-antígeno (por ejemplo, indicado en Davies, D.R. et al., Ann. Rev. Biochem., 59:439-473 (1990)). En segundo lugar, una serie de restos de FR han sido propuestos por Chothia, Lesk y colegas (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia, C. et al., Nature, 342:877-883 (1989); Tramontano, A. et al., J. Mol. Biol., 215:175-182 (1990)) como que afectan, de modo crítico, a la conformación de CDR concretas y, por tanto, a su contribución a la unión del antígeno. Véase también Margolies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:2180-2184 (1975).

También se sabe que, en algunos casos, un dominio variable de anticuerpo (V_{H} o V_{L}) pueden contener sitios de glicosilación, y que esta glicosilación puede mejorar o suprimir la unión al antígeno; Pluckthun, Biotechnology, 9:545-551 (1991); Spiegelberg et al., Biochemistry, 9:4217-4223 (1970); Wallic et al., J. Exp. Med., 168:1099-1109 (1988); Sox et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 66:975-982 (1970); Margni et al., Ann. Rev. Immunol., 6:535-554 (1988). Sin embargo, normalmente, la glicosilación no influye en las propiedades de unión al antígeno de un anticuerpo; Pluckthun, supra (1991).

La estructura tridimensional de las cadenas de inmunoglobulinas se ha estudiado, y se han publicado las estructuras cristalinas para las inmunoglobulinas intactas, para una diversidad de fragmentos de inmunoglobulinas y para complejos de anticuerpo-antígeno (véase, por ejemplo, Saul et al., Journal of Biological Chemistry, 25:585-597 (1978); Sheriff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8075-8079 (1987); Segal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:4298-4302 (1974); Epp et al., Biochemistry, 14(22):4943-4952 (1975); Marquart et al., J. Mol. Biol., 141:369-391 (1980); Furey et al., J. Mol. Biol., 167:661-692 (1983); Snow y Amzel, Protein: Structure, Function, and Genetics, 1:267-279, Alan R. Liss, Inc. eds. (1986); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., Science, 233:755-758 (1986); Huber et al., Nature, 264:415-420 (1976); Bruccoleri et al., Nature, 335:564-568 (1988) y Nature, 336:266 (1988); Sherman et al., Journal of Biological Chemistry, 263:4064-4074 (1988); Amzel y Poljak, Ann. Rev. Biochem., 48:961-967 (1979); Silverton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5140-5144 (1977); y Gregory et al., Molecular Immunology, 24:821-829 (1987). Se sabe que la función de un anticuerpo depende de su estructura tridimensional, y que las sustituciones de aminoácidos pueden cambiar la estructura tridimensional de un anticuerpo, Snow y Amzel, supra. Con anterioridad se ha demostrado que la afinidad de unión al antígeno de un anticuerpo humanizado puede aumentar mediante mutagénesis basada en la formación de modelos moleculares (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)).

La humanización de un anticuerpo manteniendo la alta afinidad por el antígeno y otras actividades biológicas deseadas es, en la actualidad, difícil de lograr utilizando los procedimientos disponibles. Se necesitan métodos para racionalizar la selección de sitios para la sustitución en la preparación de dichos anticuerpos y, con ello, aumentar la eficacia de la humanización de anticuerpos.

El protooncogén HER2 (receptor 2 del factor del crecimiento epidérmico humano) codifica una proteína-tirosina-quinasa (p185^{HER2}) que está relacionada y es de algún modo homológa al receptor del factor del crecimiento epidérmico humano (véase Coussens, L. et al., Science, 230: 1132-1139 (1985); Yamamoto, T. et al., Nature, 319:230-234 (1986); King, C.R. et al., Science, 229:974-976 (1985)). El HER2 también se conoce en la técnica como c-erbB-2, y a veces con el nombre del homólogo de rata, neu. La amplificación y/o sobreexpresión de HER2 está asociada con múltiples malignidades humanas y parece estar implicado, integralmente, en la progresión de 25-30% de los cánceres de ovario y mama humanos (Slamon, D.J. et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon, D.J. et al., Science, 244:707-712 (1989)). Además, el grado de amplificación se correlaciona inversamente con la mediana del tiempo de supervivencia del paciente observada (Slamon, supra, Science, 1989).

El anticuerpo monoclonal murino conocido como muMAb4D5 (Fendly, B.M. et al., Cancer Res., 50:1550-1558 (1990)), dirigido contra el dominio extracelular (ECD) de p185^{HER2}, inhibe de forma específica el crecimiento de líneas celulares tumorales que sobreexpresan p185^{HER2} en cultivos de monocapas o en agar blando (Hudziak, R.M. et al., Molec. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989); Lupu, R. et al., Science, 249:1552-1555 (1990)). El muMAb4D5 también tiene el potencial de mejorar la sensibilidad de células tumorales frente al factor de necrosis tumoral, una importante molécula efectora en la citotoxicidad de células tumorales mediada por macrófagos (Hudziak, supra, 1989; Shepard, H.M. y Lewis, G.D., J. Clinical Immunology, 8:333-395 (1988)). Por tanto, el muMAb4D5 tiene un potencial para la intervención clínica y la formación de imágenes de carcinomas en los que p185^{HER2} está sobreexpresado. El muMAb4D5 y sus usos se describen en la solicitud PCT WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989. Este anticuerpo murino se depositó en el ATCC y se denominó ATCC CRL 10463. Sin embargo, este anticuerpo puede ser inmunogénico en seres humanos.

Por tanto, un objeto de esta invención es proporcionar anticuerpos humanizados capaces de unirse a p185^{HER2}.

Otros objetos y características de la presente invención resultarán evidentes después de considerar la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere a nuevos polipéptidos según se define en las reivindicaciones 1 y 2, en particular a nuevos anticuerpos humanizados según se define en las reivindicaciones 3 a 10.

La invención también incluye las inmunotoxinas de la reivindicación 11 y los productos farmacéuticos de las reivindicaciones 12 y 13.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de estos polipéptidos, anticuerpos humanizados e inmunotoxinas en la fabricación de un medicamento, y al uso de los anticuerpos humanizados en ensayos de diagnóstico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra la comparación de los restos aminoácidos del dominio V_{L} de muMAb4D5, huMAb4D5, y una secuencia consenso (figura 1A, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente). La figura 1B muestra la comparación de los restos aminoácidos del dominio V_{H} de muMAb4D5, huMAb4D5, y una secuencia consenso (figura 1B, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, respectivamente). Ambas figuras 1A y 1B utilizan el esquema de numeración generalmente aceptado de Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). En ambas figuras 1A y 1B, los restos de CDR determinados según una definición convencional de secuencia (como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)) se indican mediante el primer subrayado bajo las secuencias, y los restos de CDR determinados según una definición estructural (como en Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)) se indican mediante el segundo subrayado, más bajo. Los desapareamientos entre los genes se muestran mediante líneas verticales.

La figura 2 muestra un esquema para la humanización de los V_{L} y V_{H} de muMAb4D5 mediante mutagénesis de conversión de genes.

La figura 3 muestra la inhibición de la proliferación de SK-BR-3 por variantes de MAb4D5. La proliferación celular relativa se determinó como se ha descrito (Hudziak, R.M. et al., Molec. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989)), y los datos (media de determinaciones por triplicado) se presentan como el porcentaje de resultados con cultivos sin tratar para muMAb4D5 (l), huMAb4D5-8 (n) y huMAb4D5-1 (l).

La figura 4 muestra una vista estereoscópica de rastreo de carbono \alpha para un modelo de V_{L} y V_{H} de huMAb4D5-8. Los restos de CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)) se muestran en negrita, y se muestran las cadenas laterales de los restos de V_{H} A71, T73, A78, S93, Y102, y los restos de V_{L} Y55 más R68 (véase la tabla 3).

La figura 5 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de los dominios V_{L} (panel superior) y V_{H} (panel inferior) del anticuerpo monoclonal anti-CD3 murino Ab UCHT1 (muxCD3, Shalaby et al., J. Exp. Med., 175, 217-225 (1992)) con un variante humanizado de este anticuerpo (huxCD3v1). También se muestran las secuencias consenso (los restos o pares de restos que aparecen con más frecuencia) de los subgrupos humanos más importantes, es decir, I de V_{L} \kappa y III de V_{H}, en los que se basan las secuencias humanizadas (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EEUU (1991)). Las secuencias de cadena ligera (muxCD3, huxCD3v1 y hu\kappaI) se corresponden con las SEQ ID NO:16, 17 y 18, respectivamente. Las secuencias de cadena pesada son muxCD3 (SEQ. ID. NO:19), huxCD3v1 y huII (SEQ ID NO:21). Los restos que son distintos en muxCD3 y huxCD3v1 se identifican mediante un asterisco (*), mientras que los que se diferencian entre las secuencias humanizadas y consenso se identifican mediante un signo (#). Los puntos (\bullet) indican que se ha descubierto que un resto en esta posición se pone en contacto con el antígeno en una o más estructuras cristalográficas de los complejos anticuerpo/antígeno (Kabat et al., 1991; Mian, I.S. et al., J. Mol. Biol., 217, 133-151 (1991)). La colocación de los restos de CDR según una definición de secuencia (Kabat et al., 1991), y una definición estructural (Chothia y Lesk, supra, 1987) se muestran mediante una línea y flechas (^) bajo las secuencias, respectivamente.

Descripción detallada de la invención Definiciones

En general, las siguientes expresiones o términos tienen las definiciones indicadas cuando se utilizan en la descripción, los ejemplos y las reivindicaciones.

El anticuerpo monoclonal murino conocido como muMAb4D5 (Fendly, B.M. et al., Cancer Res., 50:1550-1558 (1990)) está dirigido contra el dominio extracelular (ECD) de p185^{HER2}. El muMAb4D5 y sus usos se describen en la solicitud PCT WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989. Este anticuerpo murino se depositó en el ATCC y se denominó ATCC CRL 10463. En esta descripción y reivindicaciones, los términos muMAb4D5, chMAb4D5 y huMAb4D5 representan versiones murinas, quimerizadas y humanizadas del anticuerpo monoclonal 4D5, respectivamente.

Un anticuerpo humanizado para los fines de esta invención es un variante de secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina, o un fragmento de éste, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado, y que comprende una región de FR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana.

En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoácidos introducidos en él procedentes de una fuente que no es humana. Estos restos aminoácidos no humanos se denominan en la presente restos "importados", que, de forma típica, se toman de un dominio de anticuerpo "importado", en particular un dominio variable. Un resto, secuencia o anticuerpo importado tiene una afinidad y/o especificidad deseadas, u otra actividad biológica del anticuerpo deseable, según se analiza en la presente.

En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de al menos uno, y de forma típica dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones de CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, de forma óptima, también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), de forma típica la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contendrá la cadena ligera y también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada.

El anticuerpo humanizado se selecciona de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, el dominio constante es un dominio constante de fijación del complemento en el que se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y la clase es, de forma típica, IgG_{1}. Cuando no se desee esta actividad citotóxica, el dominio constante puede ser de la clase IgG_{2}. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes concretos para optimizar las funciones efectoras deseadas se encuentra dentro de la técnica.

No es necesario que las regiones de FR y CDR del anticuerpo humanizado se correspondan de forma precisa con las secuencias progenitoras, por ejemplo, la CDR importada o la FR consenso pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un resto, de forma que el resto de CDR o FR en ese sitio no se corresponda con el consenso o el anticuerpo importado. Estas mutaciones, sin embargo, no serán muy grandes. Normalmente, al menos 75% de los restos del anticuerpo humanizado se corresponden con los de las secuencias de FR y CDR progenitoras, más a menudo 90%, y lo más preferible más de 95%.

En general, los anticuerpos humanizados preparados mediante el método de esta invención se producen mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales pueden adquirirse con facilidad, y son conocidos por los expertos en la técnica. Existen programas de ordenador disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estos modelos permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno.

Los restos que influyen en la unión al antígeno se definen como restos que son sustancialmente responsables de la afinidad por el antígeno o la especificidad frente al antígeno de una inmunoglobulina candidata, en un sentido positivo o negativo. La invención está dirigida a la selección y combinación de restos de FR a partir de la secuencia consenso e importada, de forma que se logra la característica de la inmunoglobulina deseada. Estas características deseadas incluyen mayor afinidad y especificidad por el antígeno diana, aunque es concebible que en algunas circunstancias puedan resultar deseables los efectos opuestos. En general, los restos de CDR están implicados directa y más sustancialmente en influir en la unión al antígeno (aunque no todos los restos de CDR están implicados de esta manera y, por tanto, no es necesario sustituirlos en la secuencia consenso). Sin embargo, los restos de FR también tienen un efecto significativo y pueden ejercer su influencia de al menos tres maneras: pueden unirse de forma no covalente directamente al antígeno, pueden interaccionar con los restos de CDR, y pueden afectar a la interfase entre las cadenas pesada y ligera.

Un resto que se une de forma no covalente directamente al antígeno es aquel del cual se espera razonablemente que, mediante análisis tridimensional, se una de forma no covalente directamente al antígeno. De forma típica, es necesario atribuir la posición del antígeno con respecto a la colocación espacial de las CDR vecinas, y a las dimensiones y estructura del antígeno diana. En general, es probable que sólo los restos del anticuerpo humanizado que son capaces de formar puentes salinos, enlaces de hidrógeno o interacciones hidrófobas puedan estar implicados en la unión no covalente al antígeno, aunque los restos que tienen átomos que están separados espacialmente del antígeno por 3,2 Angstroms o menos también pueden interaccionar de forma no covalente con el antígeno. Estos restos, de forma típica, son los aminoácidos relativamente mayores que tienen cadenas laterales con un tamaño mayor, como tirosina, arginina y lisina. Los restos de FR de unión al antígeno también, de forma típica, tienen cadenas laterales que están orientadas hacia una envuelta que rodea la cara orientada al disolvente de una CDR, que se extiende aproximadamente 7 Angstroms hacia el disolvente desde el dominio de CDR, y aproximadamente 7 Angstroms a cada lado del dominio de CDR, de nuevo visualizada mediante formación de modelos tridimensionales.

Un resto que interacciona con una CDR es, en general, un resto que afecta a la conformación del esqueleto del polipéptido CDR, o forma un enlace no covalente con una cadena lateral de un resto de CDR. Los restos que afectan a la conformación, normalmente, son los que cambian la posición espacial de cualquier átomo del esqueleto de CDR (N, C\alpha, C, O, C\beta) en más de aproximadamente 0,2 Angstroms. Los átomos del esqueleto de las secuencias de CDR son desplazados, por ejemplo, por restos que interrumpen o modifican estructuras organizadas como láminas beta, hélices o bucles. Los restos que pueden ejercer un efecto profundo sobre la conformación de secuencias vecinas incluyen prolina y glicina, que son capaces de introducir dobleces en el esqueleto. Otros restos que pueden desplazar átomos del esqueleto son los que son capaces de participar en puentes salinos y enlaces de hidrógeno.

Un resto que interacciona con una cadena lateral de CDR es aquel del cual se espera razonablemente que forme un enlace no covalente con una cadena lateral de CDR, en general un puente salino o un enlace de hidrógeno. Estos restos se identifican mediante la colocación tridimensional de sus cadenas laterales. Puede esperarse que se forme un puente salino o iónico entre dos cadenas laterales colocadas a aproximadamente 2,5-3,2 Angstroms entre sí, que porten cargas opuestas, por ejemplo un apareamiento lisinilo y glutamilo. Puede esperarse que se forme un enlace de hidrógeno entre las cadenas laterales de pares de restos, como serilo o treonilo, con aspartilo o glutamilo (u otros restos aceptores de hidrógeno). Estos apareamientos son muy conocidos en la técnica de la química de proteínas, y serán evidentes para el experto en la técnica tras la formación del modelo tridimensional de la inmunoglobulina candidata.

Los restos de inmunoglobulinas que afectan a la interfase entre las regiones variables de la cadena pesada y ligera ("la interfase V_{L}-V_{H}") son los que afectan a la proximidad u orientación de las dos cadenas con respecto a ellas. Ciertos restos implicados en las interacciones intercatenarias ya son conocidos, e incluyen los restos de V_{L} 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 y 98, y los restos de V_{H} 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 y 103 (utilizando la nomenclatura indicada en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). Otros restos han sido recién identificados por los inventores en la presente, e incluyen 43L, 85L, 43H y 60H. Aunque estos restos se indican sólo para IgG, son aplicables a otras especies. En la práctica de esta invención, los restos de anticuerpos importados que puede esperarse que razonablemente estén implicados en las interacciones intercatenarias se seleccionan para la sustitución en la secuencia consenso. Se cree que hasta este momento no se han preparado anticuerpos humanizados con un resto que afecta al interior de la cadena seleccionado de una secuencia de anticuerpo importado.

Puesto que no es totalmente posible predecir con anterioridad el impacto exacto de una sustitución, puede resultar necesario realizar la sustitución y ensayar el anticuerpo candidato para la característica deseada. Sin embargo, estas etapas son rutinarias per se y se encuentran dentro de la técnica.

Los restos de CDR y FR se determinan según una definición convencional de secuencia (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), y una definición estructural (como en Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Aunque estos dos métodos producen identificaciones ligeramente diferentes de una CDR, se prefiere la definición estructural, aunque los restos identificados mediante el método de definición de secuencia se consideran restos importantes de FR para la determinación de los restos del marco conservado que hay que importar a la secuencia consenso.

A lo largo de esta descripción se hace referencia al esquema de numeración de Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) y (1991)). En estos compendios, Kabat lista muchas secuencias de aminoácidos para anticuerpos para cada subclase, y lista los aminoácidos que aparecen con más frecuencia para cada posición de los restos en esa subclase. Kabat utiliza un método para asignar un número de resto a cada aminoácidos en una secuencia listada, y este método para asignar números a los restos se ha convertido en convencional en la técnica. En esta descripción se sigue el esquema de numeración de Kabat.

Para los fines de esta invención, para asignar números a los restos en una secuencia de aminoácidos del anticuerpo candidato que no está incluida en el compendio de Kabat, se siguen las siguientes etapas. En general, la secuencia candidata se alinea con cualquier secuencia de inmunoglobulina o cualquier secuencia consenso de Kabat. El alineamiento puede realizarse a mano o mediante ordenador, utilizando programas de ordenador habitualmente aceptados; un ejemplo de estos programas es el programa Align 2 analizado en esta descripción. El alineamiento puede facilitarse utilizando algunos restos aminoácidos que son comunes a la mayoría de las secuencias Fab. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada tienen cada una, de forma típica, dos cisteínas que tienen el mismo número de resto; en el dominio V_{L} las dos cisteínas están, de forma típica, en los números de resto 23 y 88, y en el dominio V_{H} las dos cisteínas están, de forma típica, en los números de resto 22 y 92. Los restos del marco conservado, en general, pero no siempre, tienen aproximadamente el mismo número de restos, pero sin embargo las CDR varían de tamaño. Por ejemplo, en el caso de una CDR de una secuencia candidata que es más larga que la CDR en la secuencia de Kabat con la cual está alineada, se añaden de forma típica sufijos al número de resto para indicar la inserción de más restos (véase, por ejemplo, los restos 100abcde en la figura 5). Para las secuencias candidatas que, por ejemplo, se alinean con una secuencia Kabat para los restos 34 y 36, pero no tienen ningún resto entre ellos para alinearse con el resto 35, el número 35 simplemente no se asigna a un resto.

Por tanto, en la humanización de una secuencia variable importada, cuando se corta una CDR consenso o humana completa y se sustituye por una secuencia CDR importada, (a) el número exacto de restos puede intercambiarse, dejando igual la numeración, (b) pueden introducirse menos restos aminoácidos importados que los cortados, en cuyo caso habrá un hueco en los números de restos, o (c) puede introducirse un número mayor de restos aminoácidos que los cortados, en cuyo caso la numeración implicará el uso de sufijos, como 100abcde.

Las expresiones "secuencia consenso" y "anticuerpo consenso", tal como se utilizan en la presente, se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende los restos aminoácidos que aparecen con más frecuencia en cada posición en todas las inmunoglobulinas de cualquier subclase o estructura subunitaria concretas. La secuencia consenso puede basarse en inmunoglobulinas de una especie concreta o de muchas especies. Se entiende que una secuencia, estructura o anticuerpo "consenso" incluye una secuencia humana consenso según se describe en ciertas realizaciones de esta invención, y se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende los restos aminoácidos que aparecen con más frecuencia en cada posición en todas las inmunoglobulinas de cualquier subclase o estructura subunitaria concreta. Las secuencias consenso empleadas incluyen estructuras humanas consenso y estructuras consenso que consideran otras especies además de la humana.

Las estructuras subunitarias de las cinco clases de inmunoglobulinas en humanos son las siguientes:

Clase	Cadena pesada	Subclases	Cadena ligera	Fórmula
				molecular
IgG	\gamma	\gamma1,\gamma2,\gamma3,\gamma4	\kappa o \lambda	(\gamma_{2}\kappa_{2}), (\gamma_{2}\lambda_{2})
IgA	\alpha	\alpha1, \alpha2	\kappa o \lambda	(\alpha_{2}\kappa_{2})_{n}^{a},
				(\alpha_{2}\lambda_{2})_{n}^{a}
IgM	\mu	ninguna	\kappa o \lambda	(\mu_{2}\kappa_{2})_{5},
				(\mu_{2}\lambda_{2})_{5}
IgD	\delta	ninguna	\kappa o \lambda	(\delta_{2}\kappa_{2}), (\delta_{2}\lambda_{2})
IgE	\varepsilon	ninguna	\kappa o \lambda	(\varepsilon_{2}\kappa_{2}),(\varepsilon_{2}\lambda_{2})
(^{a}_{n} puede ser 1, 2 ó 3)

En las realizaciones preferidas de una secuencia consenso humana IgG\gamma1, las secuencias de dominio variable consenso se derivan de las subclases más abundantes en la compilación de secuencias de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987), es decir, subgrupo I de V_{L} \kappa y grupo III de V_{H}. En estas realizaciones preferidas, el dominio consenso V_{L} tiene la secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQPEDFATYYCQQYNSLPYTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO:3); el dominio consenso V_{H} tiene la secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVAVISENGSDTYYA
DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGGAYSYFDVWGQGTLVTVSS.

Estas secuencias incluyen las CDR consenso, así como los restos FR consenso (véase, por ejemplo, la figura 1).

Aunque no se desea limitarse por ninguna teoría concreta, es posible que estas realizaciones preferidas probablemente sean menos inmunogénicas en un individuo que las subclases menos abundantes. Sin embargo, en otras realizaciones, la secuencia consenso se deriva de otras subclases de dominios variables de inmunoglobulinas humanas. En otras realizaciones, la secuencia consenso se deriva de dominios constantes humanos.

La coincidencia u homología con respecto a una secuencia de aminoácidos especificada se define en la presente como el porcentaje de restos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos especificados, después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología, y no considerando las sustituciones conservadoras como parte de la coincidencia de secuencia. No debe considerarse que las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia especificada afecten a la homología. Todos los alineamientos de secuencias que aparecen en esta invención son estos alineamientos de homología máxima. Aunque estos alineamientos pueden hacerse a mano utilizando métodos convencionales, un programa de ordenador adecuado es el programa "Align 2", que se quiere proteger en U.S. Register of Copyrights (Align 2, de Genentech, Inc., solicitud presentada el 9 de diciembre, 1991).

\newpage

Los restos de anticuerpos importados "no homólogos" son los restos que no son idénticos al resto aminoácido en la posición análoga o correspondiente en una secuencia consenso, después de alinear las secuencias importadas y consenso.

La "propiedad biológica", según se refiere, por ejemplo, a anti-p185^{HER2}, para los fines de la presente, significa una función o actividad de unión al antígeno o efectora in vivo, que es realizada directa o indirectamente por huMAb4D5 (tanto si está en su conformación nativa como desnaturalizada). Las funciones efectoras incluyen la unión de p185^{HER2}, cualquier actividad hormonal o antagonista hormonal, cualquier actividad agonista, antagonista o mitogénica, y cualquier actividad citotóxica. Una función antigénica significa la posesión de un epitopo o sitio antigénico que es capaz de producir una reacción cruzada con anticuerpos producidos contra la secuencia polipeptídica de huMAb4D5.

El huMAb4D5 biológicamente activo se define en la presente como un polipéptido que comparte una función efectora de huMAb4D5. Una función efectora principal conocida de huMAb4D5 es su capacidad para unirse a p185^{HER2}.

Por tanto, los polipéptidos huMAb4D5 biológica y antigénicamente activos que son el objeto de ciertas realizaciones de la invención incluyen la secuencia de nucleótidos traducida entera de huMAb4D5; el huMAb4D5 maduro; sus fragmentos que tienen una secuencia consecutiva de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30 ó 40 restos aminoácidos que comprenden secuencias de muMAb4D5 más restos del FR humano de huMAb4D5; variantes de secuencia de aminoácidos de huMAb4D5, en los que un resto aminoácido se ha insertado N- o C-terminal a huMAb4D5, o dentro de éste, o su fragmento como se definió anteriormente; variantes de secuencia de aminoácidos de huMAb4D5 o su fragmento según se definió anteriormente, en los que un resto aminoácido de huMAb4D5 o su fragmento según se definió anteriormente se ha sustituido por otro resto, incluyendo mutaciones predeterminadas mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida específica de sitio o PCR; derivados de huMAb4D5 o sus fragmentos según se definió anteriormente, en los que huMAb4D5 o sus fragmentos se han modificado de modo covalente mediante sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros medios adecuados, con un resto distinto de un aminoácido que aparece en la naturaleza; y variantes de glicosilación de huMAb4D5 (inserción de un sitio de glicosilación o deleción de cualquier sitio de glicosilación mediante deleción, inserción o sustitución de restos adecuados). Estos fragmentos y variantes excluyen cualquier polipéptido identificado hasta la fecha, incluyendo muMAb4D5 o cualquier fragmento polipeptídico conocido.

Un polipéptido "aislado" significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que pueden interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, por ejemplo, un producto polipeptídico que comprende huMAb4D5 será purificado a partir de un cultivo celular u otro medio sintético (1) hasta más de 95% en peso de proteínas, según se determina mediante el método de Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de fase líquida o gaseosa (como el secuenciador disponible en el mercado de Applied Biosystems modelo 470, 477 ó 473), o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie, o preferiblemente tinte de plata. El huMAb4D5 aislado incluye huMAb4D5 in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del medio natural de huMAb4D5 no está presente. Sin embargo, habitualmente el huMAb4D5 aislado se prepara mediante al menos una etapa de purificación.

Según esta invención, el ácido nucleico de huMAb4D5 es RNA o DNA que contiene más de diez bases que codifican un huMAb4D5 biológica o antigénicamente activo, es complementario con la secuencia de ácido nucleico que codifica este huMAb4D5, o se hibrida con la secuencia de ácido nucleico que codifica este huMAb4D5 y permanece unido de forma estable a él bajo condiciones estrictas, y comprende un ácido nucleico de una región FR humana y CDR de muMAb4D5.

Preferiblemente, el ácido nucleico de huMAb4D5 codifica un polipéptido que comparte al menos 75% de coincidencia de secuencia, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 85%, todavía más preferiblemente 90%, y lo más preferido 95%, con la secuencia de aminoácidos de huMAb4D5. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico que se hibrida con el ácido nucleico de huMAb4D5 contiene al menos 20, más preferiblemente 40 y lo más preferible 90 bases.

Las condiciones estrictas son las que (1) emplean una baja fuerza iónica y altas temperaturas de lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/NaDodSO_{4} al 0/1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante como formamida, por ejemplo formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovina al 0,1%/Ficoll al 0/1%/polivinilpirrolidona al 0/1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x disolución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operablemente en un organismo hospedante concreto. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas, y probablemente otras secuencias que aún no son bien comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un DNA para una presecuencia o conductor de la secreción está unido operablemente a un DNA para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operablemente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operablemente a una secuencia codificadora si está colocado de forma que facilita la traducción. En general, "unido operablemente" significa que las secuencias de DNA que se van a unir son contiguas y, en el caso de un conductor de la secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante acoplamiento en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, entonces se utilizan conectores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Un elemento "exógeno" se define en la presente como una secuencia de ácido nucleico que es extraña a la célula, u homóloga con la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedante en la que el elemento no se encuentra normalmente.

Tal como se utiliza en la presente, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de modo intercambiable y todas estas denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las expresiones "transformantes" y "células transformantes" incluyen las células primarias en cuestión y los cultivos derivados de éstas, independientemente del número de transferencias. También se entiende que la progenie puede tener un contenido en DNA que no sea exactamente idéntico, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica según se seleccionó en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan denominaciones diferenciadas, quedará claro por el contexto.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos monocatenarios o bicatenarios de longitud corta, que se sintetizan de modo químico mediante métodos conocidos (como la química de fosfotriésteres, fosfitas o fosforamiditas, utilizando técnicas en fase sólida como se describe en el documento EP 266.032, publicado el 4 de mayo, 1988, o mediante intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato, según se describe en Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407 (1986)). Después se purifican en geles de poliacrilamida.

La técnica de la "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR", tal como se utiliza en la presente, se refiere en general a un procedimiento en el que cantidades muy pequeñas de un trozo concreto de ácido nucleico, RNA y/o DNA se amplifican según se describe en la patente de EEUU nº 4.683.195, otorgada el 28 de julio, 1987. En general, es necesario disponer de información acerca de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, de forma que puedan diseñarse cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores tendrán una secuencia idéntica o similar a las hebras opuestas del molde que se va a amplificar. Los nucleótidos 5'-terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede utilizarse para amplificar secuencias de RNA específicas, secuencias de DNA específicas a partir del DNA genómico total, y cDNA transcrito a partir del RNA celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, en general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). Tal como se utiliza en la presente, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un método de una reacción de una polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido (DNA o RNA) como cebador, y la utilización de una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico, o para amplificar o generar un trozo específico de un ácido nucleico que es complementario con un ácido nucleico concreto.

Métodos adecuados para practicar la invención

Algunos aspectos de esta invención incluyen obtener un dominio variable de anticuerpo no humano importado, producir una secuencia de anticuerpo humanizada deseada, y humanizar una secuencia génica de un anticuerpo, y se describen a continuación. Un método particularmente preferido para cambiar una secuencia génica, como la conversión génica a partir de una secuencia consenso o no humana, en una secuencia de ácido nucleico humanizada, es el procedimiento de mutágenesis de módulos descrito en el ejemplo 1. Además, se ofrecen métodos para obtener y producir anticuerpos en general, que se aplican igualmente a anticuerpos no humanos nativos, así como a anticuerpos humanizados.

En general, los anticuerpos y dominios variables de anticuerpos de esta invención se preparan de modo convencional en un cultivo de células recombinantes, según se describe con más detalle a continuación. Se prefiere la síntesis recombinante por razones de seguridad y economía, pero se conoce la preparación de péptidos mediante síntesis química y su purificación a partir de fuentes naturales; estas preparaciones se incluyen dentro de la definición de anticuerpos en la presente.

Formación de modelos moleculares

Una etapa integral en el enfoque de los inventores con respecto a la humanización de anticuerpos es la construcción de módelos gráficos por ordenador de anticuerpos importados y humanizados. Estos modelos se utilizan para determinar si las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) pueden transplantarse con éxito desde el marco conservado importado a un marco humano, y para determinar cuáles son los restos del marco conservado del anticuerpo importado, si hay alguno, que es necesario incorporar en el anticuerpo humanizado para mantener la conformación de la CDR. Además, los análisis de las secuencias de los anticuerpos importados y humanizados, y la referencia a los modelos pueden ayudar a discernir qué restos del marco conservado son inusuales y, por tanto, pueden estar implicados en la unión al antígeno o el mantenimiento de la estructura adecuada del anticuerpo.

Todos los modelos de anticuerpos humanizados de esta invención están basados en una única estructura gráfica por ordenador tridimensional que en lo sucesivo se denomina la estructura consenso. Esta estructura consenso es una distinción clave con respecto a los enfoques realizados previamente en la técnica, que de forma típica, empiezan seleccionando una estructura de anticuerpo humana que tiene una secuencia de aminoácidos similar a la secuencia de su anticuerpo importado.

La estructura consenso de una realización de esta invención se construyó en cinco etapas como se describe a continuación.

Etapa 1

Se utilizaron siete estructuras cristalinas de rayos X Fab de Brookhaven Protein Data Bank (entradas 2FB4, 2RHE, 3FAB y 1REI que son estructuras humanas, y 2MCP, 1FBJ y 2HFL que son estructuras murinas). Para cada estructura se utilizaron patrones de unión de hidrógeno y de geometría de la cadena principal de la proteína para asignar cada resto a uno de tres tipos de estructuras secundarias: alfa-hélice, hebra beta u otro (por ejemplo, no hélice y no hebra). Los restos de inmunoglobulina utilizados en la superposición y los incluidos en la estructura consenso aparecen en la tabla 1.

TABLA 1 Restos de inmunoglobulina utilizando en la superposición y los que están incluidos en la estructura consenso

Dominio V_{L}\kappa
Ig^{a}	2FB4	2RHE	2MCP	3FAB	1FBJ	2HFL	1REI	consenso^{b}
								2-11
	18-24	18-24	19-25	18-24	19-25	19-25	19-25	16-17
	32-37	34-39	39-44	32-37	32-37	32-37	33-38	33-39
								41-49
	60-66	62-68	67-72	53-66	60-65	60-65	61-66	59-77
	69-74	71-76	76-81	69-74	69-74	69-74	70-75
	84-88	86-90	91-95	84-88	84-88	85-89	85-89	82-91
								101-105
RMS^{c}		0,40	0,60	0,53	0,54	0,48	0,50

Dominio V_{H}
Ig^{a}	2FB4	2MCP	3FAB	1FBJ	2HFL	Consenso^{b}
						3-8
	18-25	18-25	18-25	18-25	18-25	17-23
	34-39	34-39	34-39	34-39	34-39	33-41
	46-52	46-52	46-52	46-52	46-52	45-51
	57-61	59-63	56-60	57-61	57-61	57-61
	68-71	70-73	67-70	68-71	68-71	66-71
	78-84	80-86	77-83	78-84	78-84	75-82
	92-99	94-101	91-98	92-99	92-99	88-94
						102-108
RMS^{c}		0,43	0,85	0,62	0,91
RMS^{d}	0,91	0,73	0,77	0,92

a Código de cuatro letras para el archivo de Protein Data Bank. b Los números de los restos para las estructuras cristalinas se toman de los archivos de Protein Data Bank. Los números de restos para la estructura consenso son según Kabat et al. c Desviación de raíz media cuadrada en \ring{A} para los átomos (N,C\alpha,C) superpuestos sobre 2FB4. d Desviación de raíz media cuadrada en \ring{A} para los átomos (N,C\alpha,C) superpuestos sobre 2HFL.

Etapa 2

Después de identificar las alfa-hélices y las hebras beta en cada una de las siete estructuras, las estructuras se superpusieron entre sí utilizando el programa de ordenador INSIGHT (Biosym Technologies, San Diego, CA) como sigue: la estructura 2FB4 se eligió de forma arbitraria como la estructura molde (o de referencia). El 2FB4 se mantuvo fijo en el espacio y las otras seis estructuras se rotaron y traducieron en el espacio de forma que sus elementos de estructura secundaria comunes (es decir, alfa-hélices y hebras beta) se orientan de forma que estos elementos comunes estuvieran lo más cerca posible (esta superposición se realizó utilizando fórmulas matemáticas aceptadas en lugar de mover físicamente en realidad las estructuras a mano).

Etapa 3

Con las siete estructuras superpuestas de esta forma, para cada resto en el molde (2FB4) Fab se calcula la distancia entre el átomo de carbono alfa del molde (C\alpha) hasta el átomo C\alpha análogo en cada una de las otras seis estructuras superpuestas. Esto produce una tabla de distancias C\alpha-C\alpha para cada posición del resto en la secuencia. Esta tabla es necesaria para determinar las posiciones de los restos que se van a incluir en el modelo consenso. En general, si todas las distancias C\alpha-C\alpha para una posición concreta de un resto son \leq 1,0\ring{A}, esta posición se incluye en la estructura consenso. Si para una posición dada sólo una estructura cristalina Fab es > 1,0\ring{A}, la posición se incluye pero la estructura cristalina periférica no se incluye en la siguiente etapa (sólo para esta posición). En general, las siete hebras \beta se incluyen en la estructura consenso, mientras que algunos de los bucles que conectan la hebra \beta, por ejemplo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), no se incluyen en vista de la divergencia de C\alpha.

Etapa 4

Para cada resto que se incluye en la estructura consenso después de la etapa 3, se calculó la media de coordenadas para los átomos individuales de la cadena principal N, C\alpha, C, O y C\beta. Debido al procedimiento de cálculo de la media, así como la variación en la longitud del enlace, el ángulo de enlace y el ángulo dihedro entre las estructuras cristalinas, esta estructura "media" contiene algunas longitudes y ángulos de enlace que se desvían de la geometría convencional. Para los fines de esta invención, se entiende que "geometría convencional" incluye las geometrías que habitualmente se aceptan como típicas, como la compilación de longitudes y ángulos de enlace de pequeñas estructuras moleculares en Weiner, S.J. et al., J. Amer. Chem. Soc., 106:765-784 (1984).

Etapa 5

Para corregir estas desviaciones, la etapa final consiste en someter a la estructura "media" a 50 ciclos de minimización de energía (programa DISCOVER, Biosym Technologies) utilizando el parámetro AMBER (Weiner, S.J. et al., J. Amer. Chem. Soc, 106:765-784 (1984)) ajustado de forma que sólo se fijan las coordenadas de C\alpha (es decir, se permite el movimiento del resto de los átomos) (la minimización de la energía se describe a continuación). Esto permite que cualquier longitud y ángulo de enlace desviado adopte una geometría convencional (químicamente aceptable). Véase la tabla II.

TABLA II Media de las longitudes y ángulos de enlace para estructuras consenso "medias" (antes) y con minización de energía (después de 50 ciclos)

	V_{L \kappa} antes	V_{L \kappa} después	V_{H} antes (\ring{A})	V_{H} después	Geometría
	(\ring{A})	(\ring{A})		(\ring{A})	convencional
					(\ring{A})
N-C\alpha	1,459(0,012)	1,451(0,004)	1,451(0,023)	1,452(0,004)	1,449
C\alpha-C	1,515(0,012)	1,523(0,005)	1,507(0,033)	1,542(0,005)	1,522
O = C	1,208(0,062)	1,229(0,003)	1,160(0,177)	1,231(0,003)	1,229
C-N	1,288(0,049)	1,337(0,002)	1,282(0,065)	1,335(0,004)	1,335
C\alpha-C\beta	1,508(0,026)	1,530(0,002)	1,499(0,039)	1,530(0,002)	1,526
	(*)	(*)	(*)	(*)	(*)
C-N-C\alpha	123,5(4,2)	123,8(1,1)	125,3(4,6)	124,0(1,1)	121,9
N-C\alpha-C	110,0(4,0)	109,5(1,9)	110,3(2,8)	109,5(1,6)	110,1
C\alpha-C-N	116,6(4,0)	116,6(1,2)	117,6(5,2)	116,6(0,8)	116,6

TABLA II (continuación)

	V_{L \kappa} antes	V_{L \kappa} después	V_{H} antes	V_{H} después	Geometría
	(\ring{A})	(\ring{A})		(\ring{A})	convencional
					(\ring{A})
O = C-N	123,1(4,1)	123,4(0,6)	122,2(4,9)	123,3(0,4)	122,9
N-C\alpha-C\beta	110,3(2,1)	109,8(0,7)	110,6(2,5)	109,8(0,6)	109,5
C\beta-C\alpha-C	111,4(2,4)	111,1(0,7)	111,2(2,2)	111,1(0,6)	111,1

Los valores entre paréntesis son desviaciones estándar. Nótese que aunque algunas longitudes y ángulos de enlace no cambian de modo apreciable después de la minimización de la energía, las desviaciones estándar correspondientes se reducen debido a las geometrías desviadas que adoptan valores convencionales después de la minimización de la energía. Los valores de la geometría convencional son del campo de fuerza AMBER según se ejecutan en DISCOVER (Biosym Technologies).

La estructura consenso posiblemente dependa de la estructura cristalina elegida como molde, sobre la cual se superpusieron las demás. Como ensayo, se repitió el procedimiento completo utilizando la estructura cristalina con la peor superposición frente a 2FB4, es decir, la estructura Fab 2HFL, como el nuevo molde (referencia). Las dos estructuras consenso se comparan favorablemente (desviación de raíz media cuadrada de 0,11\ring{A} para todos los átomos N, C\alpha y C).

Nótese que la estructura consenso sólo incluye coordenadas de la cadena principal (átomos N, C\alpha, C, O, C\beta) sólo para los restos que son parte de una conformación común a las siete estructuras cristalinas de rayos X. Para las estructuras Fab, éstas incluyen las hebras \beta comunes (que comprenden dos láminas \beta) y unos cuantos bucles no CDR que conectan a estas hebras \beta. La estructura consenso no incluye CDR o cadenas laterales, ambas de las cuales varían en su conformación en las siete estructuras. Además, nótese que la estructura consenso incluye sólo los dominios VL y VH.

Esta estructura consenso se utiliza como arquetipo. No es particular de ninguna especie, y sólo tiene la forma básica sin cadenas laterales. Comenzando a partir de esta estructura consenso puede construirse cualquier modelo de Fab importado, humano o humanizado como sigue. Utilizando la secuencia de aminoácidos de los dominios VL y VH del anticuerpo concreto de interés se emplea un programa de gráficos por ordenador (como INSIGHT, Biosym Technologies) para añadir cadenas laterales y CDR a la secuencia consenso. Cuando se añade una cadena lateral se elige su conformación basándose en estructuras cristalinas Fab conocidas (véase la sección de antecedentes para publicaciones de estas estructuras cristalinas) y bancos de rotámeros (Ponder, J.W. y Richards, F.M., J. Mol. Biol., 193:775-791 (1987)). El modelo también se construye de forma que los átomos de la cadena lateral se colocan de forma que no colisionen con otros átomos de Fab.

Se añaden las CDR al modelo (que ahora tiene el esqueleto más las cadenas laterales) como sigue. El tamaño (es decir, el número de aminoácidos) de cada CDR importada se compara con estructuras CDR canónicas tabuladas por Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989), y que se derivan de cristales Fab. Cada secuencia de CDR también se analiza para determinar la presencia o ausencia de ciertos restos aminoácidos específicos que Chothia identificó como estructuralmente importantes: por ejemplo, los restos de la cadena ligera 29 (CDR1) y 95 (CDR3), y los restos de la cadena pesada 26, 27, 29 (CDR1) y 55 (CDR2). Para la CDR2 de la cadena ligera y la CDR3 de la cadena pesada, sólo se compara el tamaño de la CDR con la estructura canónica de Chothia. Si el tamaño y la secuencia (es decir, la inclusión de restos estructuralmente importantes específicos según indica Chothia et al.) de las CDR importadas concuerda en tamaño y tiene los mismos restos estructuralmente importantes que los de una CDR canónica, entonces la conformación de la cadena principal de la CDR importada en el modelo se considera la misma que la de la CDR canónica. Esto significa que a la secuencia importada se le asigna la configuración estructural de la CDR canónica, que entonces se incorpora en el modelo que se está desarrollando.

Sin embargo, si no puede asignarse ninguna CDR canónica que se corresponda con la CDR importada, entonces puede haber dos opciones. En primer lugar, utilizando un programa como INSIGHT (Biosym Technologies), se puede realizar una búsqueda en Brookhaven Protein Data Bank para encontrar bucles con un tamaño similar al de la CDR importada, y estos bucles pueden evaluarse como conformaciones posibles para la CDR importada en el modelo. Como mínimo, estos bucles deben mostrar una conformación en la que ningún átomo del bucle se solapa con otros átomos de la proteína. En segundo lugar, se pueden utilizar programas disponibles que calcular las posibles conformaciones en bucle, considerando un tamaño de bucle dado, utilizando métodos como los descritos en Bruccoleri et al., Nature, 335:564-568 (1988).

Cuando todas las CDR y las cadenas laterales se han añadido a la estructura consenso para producir el modelo final (importado, humano o humanizado), el modelo se somete preferiblemente a una minimización de energía utilizando programas que están disponibles en el mercado (por ejemplo, DISCOVER, Biosym Technologies). Estas técnicas utilizan fórmula matemáticas complejas para refinar el modelo, realizando tareas como comprobar que todos los átomos están a las distancias apropiadas entre sí, y comprobar que las longitudes y ángulos de enlace están dentro de límites químicamente aceptables.

Los modelos de una secuencia de anticuerpo humanizado, importado o humano se utilizan en la práctica de esta invención para comprender el impacto de restos aminoácidos seleccionados sobre la actividad de la secuencia de la cual se está realizando el modelo. Por ejemplo, este modelo puede mostrar restos que pueden ser importantes para la unión al antígeno, o para mantener la conformación del anticuerpo, según se analiza con más detalle a continuación. La formación de modelos también puede utilizarse para explorar el impacto potencial de cambiar cualquier resto aminoácido en la secuencia del anticuerpo.

Métodos para obtener una secuencia de anticuerpo humanizado

En la práctica de esta invención, la primera etapa en la humanización de un anticuerpo importado es derivar una secuencia de aminoácidos consenso en la cual incorporar las secuencias importadas. Después se genera un modelo para estas secuencias utilizando los métodos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones de esta invención, las secuencias humanas consenso se derivan de las subclases más abundantes en la compilación de secuencias de Kabat et al. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), es decir, el subgrupo I de V_{L \kappa} y el grupo III de V_{H}, y tienen las secuencias indicadas en las definiciones anteriores.

Aunque estas etapas pueden realizarse en diferente orden, de forma típica, una estructura para el anticuerpo humanizado candidato se crea transfiriendo al menos una CDR desde la secuencia importada no human a la estructura consenso humana, después de eliminar la correspondiente CDR humana entera. El anticuerpo humanizado puede contener sustituciones humanas de restos importados no humanos dentro de las CDR, según se define mediante la variabilidad de la secuencia (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), o según se define mediante la variabilidad estructural (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Por ejemplo, huMAb4D5 contiene sustituciones humanas de los restos de muMAb4D5 en tres posiciones dentro de las CDR según define mediante la variabilidad de la secuencia (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), pero no según se define mediante la variabilidad estructural (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)): V_{L}-CDR1 K24R, V_{L}-CDR2 R54L y V_{L}-CDR2 T56S.

Se investigan de forma individual las diferencias entre los restos del marco conservado consenso humanos e importados no humanos para determinar su posible influencia en la conformación de la CDR y/o la unión al antígeno. La investigación de estas posibles influencias se realiza, de forma deseable, mediante formación de modelos, mediante estudio de las características de los aminoácidos en posiciones particulares, o se determina de forma experimental mediante la evaluación de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos concretos.

En ciertas realizaciones preferidas de esta invención se fabrica un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuepo no humano importado y un anticuerpo humano, utilizando las etapas de:

a. obtener las secuencias de aminoácidos de al menos una porción de un dominio variable de un anticuerpo importado y de un dominio variable humano consenso;

b. identificar las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) en las secuencias del dominio variable importado y humano;

c. sustituir una secuencia de aminoácidos de una CDR importada por la correspondiente secuencia de aminoácidos de una CDR humana;

d. alinear las secuencias de aminoácidos de la región de marco conservado (FR) del anticuerpo importado y la correspondiente FR del anticuerpo consenso;

e. identificar restos de FR del anticuerpo importado en las secuencias de FR alineadas que no son homólogos con los correspondientes restos del anticuerpo consenso;

f. determinar si puede esperarse razonablemente que el resto aminoácido importado no homólogo tenga al menos uno de los siguientes efectos:

1. se une directamente de forma no covalente al antígeno,

2. interacciona con una CDR; o

3. participa en la interfase V_{L}-V_{H}; y

\newpage

g. para cualquier resto aminoácido del anticuerpo importado no homólogo del cual se espera razonablemente que tenga al menos uno de estos efectos, sustituir ese resto por el correspondiente resto aminoácido en la secuencia FR del anticuerpo consenso.

Opcionalmente se determina si cualquiera de los restos no homólogos identificados en la etapa (e) está expuesto sobre la superficie del dominio, o enterrado dentro de éste, y si el resto está expuesto pero no tiene ninguno de los efectos identificados en la etapa (f), y se puede mantener el resto consenso.

Además, en ciertas realizaciones los correspondientes restos del anticuerpo consenso identificados en la etapa (e) anterior se seleccionan del grupo que consiste en 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 58L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H, 91H, 92H, 93H y 103H (utilizando el sistema de numeración indicado en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)).

En realizaciones preferidas, el método de esta invención comprende las etapas adicionales de buscar las secuencias del dominio variable importadas, no humanas y consenso (cualquiera de ellas o todas) para los sitios de glicosilación, determinar si puede esperarse razonablemente que la glicosilación sea importante para la unión al antígeno y la actividad biológica deseadas del anticuerpo (es decir, determinar si el sitio de glicosilación se une al antígeno o cambia una cadena lateral de un resto aminoácido que se une al antígeno, o si la glicosilación potencia o debilita la unión al antígeno, o si es importante para mantener la afinidad del anticuerpo). Si la secuencia importada porta el sitio de glicosilación, se prefiere sustituir ese sitio por los correspondientes restos en la secuencia humana consenso si se espera razonablemente que el sitio de glicosilación sea importante. Si sólo la secuencia consenso, y no la importada, porta el sitio de glicosilación, se prefiere eliminar ese sitio de glicosilación o sustituirlo por los correspondientes restos aminoácidos de la secuencia importada.

Otra realización preferida de los métodos de esta invención comprende alinear las secuencias de FR del anticuerpo importado y del anticuerpo consenso, identificar los restos de FR del anticuerpo importado que no son homólogos con la secuencia de FR consenso alineada, y para cada uno de estos restos de FR del anticuerpo importado no homólogos determinar si el correspondiente resto del anticuerpo consenso representa un resto que se conserva mucho en todas las especies en ese sitio, y si se conserva, preparar un anticuerpo humanizado que comprende el resto aminoácido del anticuerpo consenso en ese sitio.

En ciertas realizaciones alternativas, no es necesario utilizar la formación de modelos y las etapas de evaluación descritas anteriormente, y en su lugar, se realizan las etapas de obtener la secuencia de aminoácidos de al menos una porción de un dominio variable del anticuerpo importado no humano que tiene una CDR y una FR, obtener la secuencia de aminoácidos de al menos una porción de un dominio variable del anticuerpo humano consenso que tiene una CDR y una FR, sustituir la CDR no humana por la CDR humana en el dominio variable del anticuerpo humano consenso, y después sustituir un resto aminoácido por el resto aminoácido consenso en al menos uno de los siguientes sitios:

a. (en la FR del dominio variable de la cadena ligera) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 58L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, o

b. (en la FR del dominio variable de la cadena pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H, 91H, 92H, 93H y 103H.

Preferiblemente, el resto no CDR sustituido en el sitio FR consenso es el resto que se encuentra en la posición correspondiente del anticuerpo no humano. Si se desea, se pueden utilizar las otras etapas del método descritas anteriormente para determinar si puede esperarse razonablemente que un resto aminoácido concreto tenga efectos no deseados, y remediar estos efectos.

Si después de fabricar un anticuerpo humanizado según las etapas anteriores y ensayar su actividad no se está satisfecho con el anticuerpo humanizado, preferiblemente se reestudian los efectos potenciales de los aminoácidos en las posiciones específicas indicadas anteriormente. Además, resulta deseable reinvestigar cualquier resto enterrado del cual se espera razonablemente que afecte a la interfase V_{L}-V_{H} pero que puede no afectar directamente a la conformación de la CDR. También resulta deseable reevaluar el anticuerpo humanizado utilizando las etapas de los métodos según se reivindica en la presente.

En ciertas realizaciones de esta invención, los restos aminoácidos en la secuencia humana consenso se sustituyen por otros restos aminoácidos. En realizaciones preferidas, los restos de una secuencia importada no humana particular se sustituyen, aunque hay circunstancias en las que se desean evaluar los efectos de otros aminoácidos. Por ejemplo, si después de fabricar un anticuerpo humanizado según las etapas anteriores y ensayar su actividad no se está satisfecho con el anticuerpo humanizado, se pueden comparar las secuencias de otras clases o subgrupos de anticuerpos humanos, o clases o subgrupos de anticuerpos de la especie no humana concreta, y determinar qué otras cadenas laterales de aminoácidos y restos aminoácidos se encuentran en posiciones particulares y sustituir estos otros restos.

Anticuerpos

Ciertos aspectos de esta invención están dirigidos a anticuerpos naturales y a anticuerpos monoclonales, según se ilustra en los ejemplos a continuación, y por hibridomas de anticuerpos depositados en el ATCC (según se describe a continuación). Por tanto, se pretende que las referencias a lo largo de esta descripción al uso de anticuerpos monoclonales incluyan el uso de anticuerpos naturales o nativos, así como de anticuerpos humanizados y quiméricos. Tal como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" incluye el dominio variable del anticuerpo y otros dominios del anticuerpo separables, a menos que se excluya de forma específica.

Según ciertos aspectos de esta invención, los anticuerpos que se van a humanizar (anticuerpos importados) se aislan a partir de líneas celulares híbridas continuas formadas por la fusión de linfocitos inmunológicos cebados con anticuerpos, con células de mieloma.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de esta invención se obtienen mediante selección de rutina. En general, se generan anticuerpos policlonales frente a un antígeno en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos diana con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa de agujero, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de restos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos lisina), glutaraldehído, anhídrico succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N = C = NR, en el que R y R^{1} son diferentes grupos alquilo.

La vía y programa del animal hospedante o de las células productoras de anticuerpos cultivadas, en general, se realizan dentro de las técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos. Aunque con frecuencia se emplean ratones como modelo de ensayo, se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluyendo sujetos humanos o células productoras de anticuerpos obtenidas de éstos, pueden manipularse según los procesos de esta invención para servir como base para la producción de líneas celulares híbridas de mamífero, incluyendo el ser humano.

Los animales se inmunizan de forma típica contra conjugados inmunogénicos o derivados combinando 1 mg o 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, a los animales se les aplica un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado en adjuvante completo de Freund (u otro adyuvante adecuado) mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después los animales se sangran y el suero se ensaya para determinar la valoración del antígeno. Los animales se refuerzan hasta que la valoración alcanza un valor de meseta. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o mediante un agente de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden fabricarse en un cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además se utilizan agentes de agregación, como alumbre, para potenciar la respuesta inmunológica.

Después de la inmunización, se preparan anticuerpos monoclonales recuperando células linfoides inmunológicas (de forma típica células del bazo o linfocitos de tejido de nódulo linfático) de animales inmunizados e inmortalizando las células de manera convencional, por ejemplo, mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con virus de Epstein-Barr (EB) y seleccionando los clones que expresan el anticuerpo deseado. La técnica de hibridomas descrita en primer lugar por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976) se ha aplicado con amplitud para producir líneas celulares híbridas que segregan altos niveles de anticuerpos monoclonales contra muchos antígenos específicos.

Es posible fusionar células de una especie con otra. Sin embargo, es preferible que la fuente de células productoras de anticuerpos inmunizadas y el mieloma sean de la misma especie.

Las líneas celulares híbridas pueden mantenerse en cultivo in vitro en medio de cultivo celular. Las líneas celulares de esta invención pueden seleccionarse y/o mantenerse en una composición que comprende la línea celular continua en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). De hecho, cuando se establece la línea celular de hibridoma, puede mantenerse sobre una diversidad de medios nutricionalmente adecuados. Además, las líneas celulares híbridas pueden almacenarse y conservarse mediante una cualquiera de las maneras convencionales, incluyendo congelar y conservar en nitrógeno líquido. Las líneas celulares congeladas puede revivirse y cultivarse indefinidamente comenzando de nuevo con la síntesis y secreción del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo segregado se recupera del sobrenadante del cultivo del tejido mediante métodos convencionales, como precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares. Los anticuerpos descritos en la presente también se recuperan a partir de cultivos de células de hibridoma mediante métodos convencionales, para la purificación de IgG o IgM, según sea el caso, que, hasta ahora, se han utilizado para purificar estas inmunoglobulinas a partir de plasma reunido, por ejemplo, procedimientos de precipitación en etanol o polietilenglicol. Los anticuerpos purificados se esterilizan mediante filtración, y opcionalmente se conjugan con un marcador detectable como una enzima o un marcador de espín para utilizar en ensayos de diagnóstico del antígeno en muestras de ensayo.

Aunque, de modo rutinario, se utilizan anticuerpos monoclonales de roedores como fuente del anticuerpo importado, la invención no se limita a ninguna especie. Además, pueden utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452 (1985)) escindiendo los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con la especificidad del antígeno apropiada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano con la actividad biológica apropiada (como la capacidad para activar el complemento humano y mediar en ADCC); estos anticuerpos están dentro del alcance de esta invención.

Las técnicas para crear versiones de DNA recombinante de regiones de unión al antígeno de moléculas de anticuerpo (conocidos como fragmentos Fab) que evitan la generación de anticuerpos se incluyen dentro de la práctica de esta invención. Se extraen moléculas de RNA mensajero específico del anticuerpo, de células del sistema inmunológico procedentes de un animal inmunizado, se transcriben en DNA complementario (cDNA) y se clona el cDNA en un sistema de expresión bacteriano. Un ejemplo de esta técnica adecuada para la práctica de esta invención ha sido desa-
rrollada por investigadores en Scripps/Stratagene, e incorpora un sistema de vector lambda de bacteriófago patentado que contiene una secuencia conductora que provoca que la proteína Fab expresada migre hacia el espacio periplásmico (entre la membrana celular bacteriana y la pared celular), o sea segregada. Se puede generar y seleccionar con rapidez un gran número de fragmentos Fab funcionales que se unen al antígeno. Estos fragmentos Fab con especificidad por el antígeno se incluyen de forma específica en el término "anticuerpo", como se define, analiza y reivindica en la presente.

Variantes de secuencia de aminoácidos

Los variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y polipéptidos de esta invención (denominados en la presente polipéptidos diana) se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el DNA que codifica el polipéptido diana, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido diana deseado. Estos variantes incluyen, por ejemplo, variantes humanizados de anticuerpos no humanos, así como deleciones, inserciones o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos concretas. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede realizarse para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del polipéptido diana, como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación, alterando cualquier característica de anclaje a membrana y/o alterando la posición intracelular del polipéptido diana insertando, delecionando o afectando de otra manera cualquier secuencia conductora del polipéptido diana nativo.

En el diseño de variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos diana, la posición del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de la(s) característica(s) del polipéptido diana que se va(n) a modificar. Los sitios para la mutación pueden modificarse de modo individual o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo en primer lugar con aminoácidos conservadores elegidos y después con selecciones más radicales dependiendo de los resultados obtenidos, (2) delecionando el resto diana, o (3) insertando restos de la misma o diferente clase adyacentes al sitio en la posición, o combinaciones de las opciones 1-3. En ciertas realizaciones, estas elecciones vienen guiadas por los métodos para crear secuencias humanizadas indicados anteriormente.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del polipéptido diana que son posiciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", según se describe en Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). En este caso, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el medio acuoso circundante dentro o fuera de la célula. Los dominios que muestran sensibilidad funcional frente a las sustituciones entonces se refinan introduciendo más u otros variantes en los sitios de la sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario determinar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para optimizar la actuación de una mutación en un sitio concreto, puede realizarse una mutagénesis aleatoria o barrido de alanina en la región o codón diana y los variantes del polipéptido diana expresados se seleccionan para determinar la combinación óptima de actividad deseada.

Existen dos variables principales en la construcción de variantes de secuencia de aminoácidos: la posición del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. En general, la posición y naturaleza de la mutación elegida dependerá de la característica del polipéptido diana que se va a modificar.

Las deleciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos no se prefieren, en general, puesto que se cree que el mantenimiento de la configuración general de un anticuerpo es necesario para su actividad. Cualquier deleción se selecciona de forma que conserve la estructura del anticuerpo diana.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples restos aminoácidos. Las inserciones dentro de la secuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia del polipéptido diana) pueden variar, en general, de aproximadamente 1 a 10 restos, más preferiblemente de 1 a 5, y lo más preferible de 1 a 3. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen el polipéptido diana con un resto metionilo N-terminal, un artefacto de la expresión directa del polipéptido diana en un cultivo de células recombinantes bacterianas, y la fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga con el N-terminal de la molécula del polipéptido diana para facilitar la secreción del polipéptido diana maduro a partir de las células hospedantes recombinantes. Estas secuencias señal en general se obtienen, y por tanto son homólogas, a partir de la especie de célula hospedante prevista. Las secuencias adecuadas incluyen STII o Ipp para E. coli, factor alfa para levaduras, y señales víricas como herpes gD para células de mamífero.

Otros variantes de inserción del polipéptido diana incluyen la fusión del N- o C-terminal del polipéptido diana de polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos como beta-lactamasa, o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o una proteína de levaduras, y las fusiones C-terminales con proteínas que tienen una semivida larga, como las regiones constantes de inmunoglobulinas (u otras regiones de las inmunoglobulinas), albúmina o ferritina, según se describe en el documento WO 89/02922, publicado el 6 de abril, 1989.

Otro grupo de variantes son los variantes de sustitución de aminoácidos. Estos variantes tienen al menos un resto aminoácido eliminado en la molécula del polipéptido diana, y otro resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los sitios identificados como el(los) sitio(s) activo(s) del polipéptido diana, y los sitios en los que los aminoácidos que se encuentran en el polipéptido diana de diversas especies son sustancialmente diferentes en términos de tamaño de la cadena lateral, carga y/o hidrofobicidad. Otros sitios para la sustitución se describen a continuación, considerando el efecto de la sustitución sobre la unión al antígeno, la afinidad y otras características de un anticuerpo diana particular.

Otros sitios de interés son aquellos en los que restos concretos de los polipéptidos diana obtenidos de diversas especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica del polipéptido diana. Estos sitios, en especial los que se encuentran dentro de una secuencia de al menos tres otros sitios conservados de forma idéntica, se sustituyen de una manera relativamente conservadora. Si estas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen otros cambios y los productos se seleccionan hasta que se obtiene el efecto deseado.

Se realizan modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del polipéptido diana seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los restos que aparecen en la naturaleza se dividen en grupos basándose en las propiedades de la cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras suponen intercambiar un miembro de una de estas clases por otro. Estos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del polipéptido diana que son homólogas con otros anticuerpos de la misma clase o subclase o, más preferiblemente, en las regiones no homólogas de la molécula.

Cualquier resto cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del polipéptido diana también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamientos aberrantes.

El DNA que codifica los variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido diana se prepara mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan al aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que aparecen en la naturaleza), o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida específica de sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de módulos de un variante preparado antes o una versión no variante del polipéptido diana. Un método particularmente preferido de mutagénesis por conversión de genes se describe a continuación en el ejemplo 1. Estas técnicas pueden utilizar ácido nucleico del polipéptido diana (DNA o RNA), o un ácido nucleico complementario con el ácido nucleico del polipéptido diana.

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método preferido para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción de DNA del polipéptido diana. Esta técnica es muy conocida en la técnica, según se describe en Adelman et al., DNA, 2:183 (1983). Brevemente, el DNA del polipéptido diana se altera hibridando un oligonucleótido que codifica una mutación deseada con un molde de DNA, en el que el molde es una forma monocatenaria de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de DNA nativa o inalterada del polipéptido diana. Después de la hibridación, se utiliza una DNA-polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde que, por tanto, incorpora el cebador de oligonucleótido, y codificará una alteración seleccionada en el DNA del polipéptido diana.

En general, se utilizan oligonucleótidos con una longitud de al menos 25 nucleótidos. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios con el molde en cualquier lado del(los) nucleótido(s) que codifica(n) la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibride de forma adecuada con la molécula molde de DNA monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan con facilidad utilizando técnicas conocidas en la técnica, como la descrita por Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

También puede generarse un molde de DNA monocatenario desnaturalizando DNA de plásmido bicatenario (u otro) utilizando técnicas convencionales.

Para la alteración de la secuencia de DNA nativa (para generar variantes de secuencia de aminoácidos, por ejemplo), el oligonucleótido se hibrida con el molde monocatenario bajo condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima que polimeriza DNA, normalmente el fragmento Klenow de la DNA-polimerasa I, se añade entonces para sintetizar la hebra complementaria del molde, utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. Por tanto, se forma una molécula heterodúplex, de manera que una hebra del DNA codifica la forma mutada del polipéptido diana, y la otra hebra (el molde original) codifica la secuencia nativa inalterada del polipéptido diana. Esta molécula heterodúplex entonces se transforma en una célula hospedante adecuada, normalmente un procariota como E. coli JM101. Después de cultivar las células, se colocan en placas sobre agarosa y se seleccionan utilizando el cebador oligonucleótido marcado de forma radiactiva con 32-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el DNA mutado. La región mutada entonces se elimina y se coloca en un vector apropiado para la producción de proteínas, en general un vector de expresión del tipo que se emplea de forma típica para la transformación de un hospedante apropiado.

El método descrito inmediatamente arriba puede modificarse de modo que se crea una molécula homodúplex en la que ambas hebras del plásmido contienen la(s) mutación(es). Las modificaciones son como sigue: el oligonucleótido monocatenario se reasocia con el molde monocatenario como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP) se combina con una tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que puede obtenerse en Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Después de la adición de la DNA-polimerasa a esta mezcla se genera una hebra de DNA idéntica al molde, excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva hebra de DNA contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión por endonucleasas de restricción.

Después de hacer una mella en la hebra molde del heterodúplex bicatenario con una enzima de restricción apropiada, la hebra molde puede digerirse con una nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada más allá de la región que contiene el(los) sitio(s) que se va(n) a mutar. La reacción entonces se detiene para dejar una molécula que sólo es parcialmente monocatenaria. Entonces se forma un homodúplex de DNA bicatenario completo utilizando DNA-polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP y DNA-ligasa. Esta molécula homodúplex entonces puede transformarse en una célula hospedante adecuada, como E. coli JM101, según se describió anteriormente.

Puede generarse DNA que codifica variantes del polipéptido diana con más de un aminoácido que está sustuido, mediante varias maneras. Si los aminoácidos están colocados cerca en la cadena polipeptídica, se pueden mutar de forma simultánea utilizando un oligonucleótido que codifica todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácido están colocados a cierta distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En lugar de esto, puede emplearse uno de dos métodos alternativos.

En el primer método, se genera un oligonucleótido distinto para cada aminoácido que se va a sustituir. Los oligonucleótidos entonces se reasocian con el DNA molde monocatenario de forma simultánea, y la segunda hebra de DNA que se sintetiza a partir del molde codifica todas las sustituciones de aminoácidos deseadas.

El método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes únicos: se utiliza DNA de tipo salvaje para el molde, se reasocia con este molde un oligonucleótido que codifica la(s) primera(s) sustitución(es) de aminoácidos deseada(s), y entonces se genera la molécula de DNA heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el DNA mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como molde. Además, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) otra(s) sustitución(es) de aminoácidos deseada(s) entonces se reasocia con este molde, y la hebra resultante de DNA ahora codifica mutaciones de la primera y segunda ronda de mutagénesis. Este DNA resultante puede utilizarse como molde en una tercera ronda de mutagénesis y así sucesivamente.

La mutagénesis por PCR también resulta adecuada para fabricar variantes de aminoácidos del polipéptido diana. Aunque el siguiente análisis hace referencia a DNA, se entiende que la técnica también puede aplicarse al RNA. La técnica de PCR en general se refiere al siguiente procedimiento (véase Erlich, supra, el capítulo por R. Higuchi, pp. 61-70): cuando se utilizan pequeñas cantidades de DNA molde como material de partida en la PCR, pueden emplearse cebadores que se diferencian ligeramente en secuencia de la correspondiente región en el DNA molde para generar cantidades relativamente elevadas de un fragmento de DNA específico que se diferencia de la secuencia molde sólo en las posiciones en las que los cebadores se diferencian del molde. Para la introducción de una mutación en un DNA de plásmido, uno de los cebadores se diseña para que solape la posición de la mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un tramo de la secuencia de la hebra opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede estar colocada en cualquier parte a lo largo del DNA del plásmido. Sin embargo, se prefiere que la secuencia del segundo cebador esté colocada en los 200 nucleótidos a partir del primero, de forma que, al final, la región amplificada completa del DNA rodeado por los cebadores puede secuenciarse con facilidad. La amplificación mediante PCR utilizando un par de cebadores como el que se acaba de describir produce una población de fragmentos de DNA que se diferencian en la posición de la mutación especificada por el cebador, y probablemente en otras posiciones, puesto que el copiado de los moldes es un tanto susceptible a errores.

Si la razón entre molde a material producto es muy baja, la inmensa mayoría de los fragmentos de DNA producto incorpora la(s) mutación(es) deseada(s). Este material producto se utiliza para sustituir la región correspondiente en el plásmido que actuó como molde de PCR, empleando la tecnología de DNA convencional. Pueden introducirse mutaciones en posiciones separadas de modo simultáneo utilizando un segundo cebador mutante, o realizando una segunda PCR con diferentes cebadores mutantes y acoplando los dos fragmentos de PCR resultantes de forma simultánea al fragmento del vector en un acoplamiento en tres (o más) partes.

En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, un DNA de plásmido molde (1 \mug) se linealiza mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tiene un sitio de reconocimiento exclusivo en el DNA del plásmido fuera de la región que se va a amplificar. De este material se añaden 100 ng a una mezcla PCR que contiene tampón PCR, que contiene los cuatro desoxinucleótidos trifosfato y está incluida en los kits de GeneAmp® (obtenidos en Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA), y 25 pmol de cada cebador oligonucleótido, hasta un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se cubre con 35 \mul de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se coloca brevemente sobre hielo, y después se añade 1 \mul de DNA-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/\mul, obtenida en Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) por debajo de la capa de aceite mineral. La mezcla de reacción entonces se inserta en un ciclador térmico de DNA (obtenido en Perkin-Elmer Cetus) programado como sigue: 2 min a 55ºC, después 30 seg a 72ºC, después 19 ciclos de: 30 seg a 94ºC, 30 seg a 55ºC, y 30 seg a 72ºC.

Al final del programa, el vial de reacción se retira del ciclador térmico y la fase acuosa se traslada a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 vol) y se precipita el etanol, y el DNA se recupera mediante procedimientos convencionales. Este material posteriormente se somete a los tratamientos apropiados para la inserción en un vector.

Otro método para preparar variantes, la mutagénesis de módulos, se basa en la técnica descrita por Wells et al. (Gene, 34:315 (1985)). El material de partida es un plásmido (u otro vector) que comprende el DNA del polipéptido diana que se va a mutar. El(los) codón(es) en el DNA del polipéptido diana que se va(n) a mutar se identifica(n). Debe haber un sitio exclusivo de endonucleasa de restricción a cada lado del(los) sitio(s) de mutación identificado(s). Si no existen estos sitios de restricción pueden generarse utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en las posiciones adecuadas en el DNA del polipéptido diana. Después de haber introducido los sitios de restricción en el plásmido, el plásmido se corta en estos sitios para linealizarse. Un oligonucleótido bicatenario que codifica la secuencia de DNA entre los sitios de restricción, pero que contiene la(s) mutación(es) deseada(s), se sintetiza utilizando procedimientos convencionales. Las dos hebras se sintetizan por separado y después se hibridan entre sí utilizando técnicas convencinales. Este oligonucleótido bicatenario se denomina módulo. Este módulo se diseña para que tenga extremos 3' y 5' que sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de forma que puedan acoplarse directamente al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de DNA del polipéptido diana mutada.

Inserción de DNA en un vehículo de clonación

El cDNA o DNA genómico que codifica el polipéptido diana se inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del DNA) o para la expresión. Hay muchos vectores disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de 1) si se va a usar para la amplificación de DNA o para la expresión de DNA, 2) el tamaño del DNA que se va a insertar en el vector, y 3) la célula hospedante que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de DNA o expresión de DNA) y de la célula hospedante con la que es compatible. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de la replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de fin de la transcripción.

(a) Componente de secuencia señal

En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del DNA del polipéptido diana que se inserta en el vector.

Los polipéptidos diana de esta invención pueden expresarse no sólo directamente, sino también como una fusión con un polipéptido heterólogo, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de ruptura específico en el N-terminal del polipéptido o proteína maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA del polipéptido diana que se inserta en el vector. Se incluyen dentro del alcance de esta invención los polipéptidos diana con cualquier secuencia señal nativa delecionada y sustituida por una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser reconocida y procesada (es decir, rota por una peptidasa señal) por la célula hospedante. Para células hospedantes procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del polipéptido diana nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o conductores de enterotoxina II estables frente al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal del polipéptido diana nativo puede sustituirse por la invertasa de levaduras, factor alfa, o conductores de fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero, la secuencia señal nativa es satisfactoria, aunque pueden resultar adecuadas otras secuencias señal de mamífero.

(b) Componente de origen de la replicación

Los vectores de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células hospedantes seleccionadas. En general, en los vectores de clonación esta secuencia permite al vector replicarse independientemente del DNA cromosómico del hospedante, e incluye orígenes de la replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son muy conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente de origen de la replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede utilizarse, de forma típica, sólo porque contiene el promotor temprano).

La mayoría de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en al menos una clase de organismos pero pueden transfectarse a otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli, y después el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero para la expresión, aunque no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula hospedante.

El DNA también puede amplificarse mediante inserción en el genoma del hospedante. Esto se realiza con facilidad utilizando una especie de Bacillus como hospedante, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que es complementaria con una secuencia que se encuentra en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector produce una recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA del polipéptido diana. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico que codifica el polipéptido diana es más compleja que la de un vector replicado de forma exógena, porque se requiere una digestión con enzimas de restricción para escindir el DNA del polipéptido diana.

(c) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonación deben contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospedantes transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedantes no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, los genes que codifican la D-alanina-racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedante. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia al fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet.: 1:327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209:1422 (1980)) o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos anteriores emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia al fármaco G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina apropiados, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del polipéptido diana, como dihidrofolato-reductasa (DHFR) o timidina-quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo una presión de selección, en la que sólo los transformantes están exclusivamente adaptados para sobrevivir, en virtud de haber captado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes bajo unas condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo con ello a una amplificación del gen de selección y del DNA que codifica el polipéptido diana. La amplificación es el proceso mediante el cual los genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. A partir del DNA amplificado se sintetizan cantidades crecientes del polipéptido diana.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Cuando se emplea DHFR de tipo salvaje, una célula hospedante apropiada es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Las células transformadas entonces se exponen a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, múltiples copias de otro DNA que comprende los vectores de expresión, como el DNA que codifica el polipéptido diana. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier otro hospedante adecuado, por ejemplo, ATCC nº CCL61 CHO-K1, independientemente de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se emplea un gen DHFR mutante que es muy resistente a Mtx (documento EP 117.060). Como alternativa, células hospedantes (en particular, hospedantes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de DNA que codifican el polipéptido diana, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable, como aminoglicósido-3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante el crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EEUU nº 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); o Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de una lesión trp1 en el genoma de la célula hospedante de levadura proporciona entonces un medio eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

(d) Componente de promotor

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y está unido operablemente al ácido nucleico del polipéptido diana. Los promotores son secuencias sin traducir colocadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (en general en aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico concreta, como la que codifica el polipéptido diana, al cual están operablemente unidas. Estos promotores, de forma típica, se dividen en dos clases, promotores inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician mayores niveles de transcripción del DNA bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento, se conoce un gran número de promotores reconocidos por una diversidad de células hospedantes potenciales. Estos promotores están operablemente unidos al DNA que codifica el polipéptido diana mediante la eliminación del promotor del DNA progenitor mediante digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia del promotor aislada en el vector. La secuencia del promotor del polipéptido diana nativo y muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para dirigir la amplificación y/o expresión del DNA del polipéptido diana. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, puesto que, en general, permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos del polipéptido diana expresado, comparado con el promotor del polipéptido diana nativo.

Los promotores adecuados para utilizar con hospedantes procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); y Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980), y documento EP 36.776), y promotores híbridos como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Sin embargo, resultan adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo con ello a un experto en la técnica acoplarlos operablemente al DNA que codifica el polipéptido diana (Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980)) utilizando conectores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos, en general, también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma operable al DNA que codifica el polipéptido diana.

Las secuencias promotoras adecuadas para utilizar con hospedantes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); y Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-quinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener una transcripción controlada por las condiciones del crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión en levaduras se describen más a fondo en Hitzeman et al., documento EP 73.657A. También se utilizan, de forma ventajosa, potenciadores de levaduras con promotores de levaduras.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT colocada aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli-A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias se insertan, de forma adecuada, en vectores de expresión de mamíferos.

La transcripción del polipéptido diana a partir de vectores en células hospedantes de mamífero es controlada por promotores obtenidos a partir de genomas de virus como virus de polioma, virus de la viruela aviar (documento del Reino Unido 2.211.504, publicado el 5 de julio, 1989), adenovirus (como adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y, más preferiblemente, el virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque de calor, y de promotores que normalmente están asociados con la secuencia polipeptídica diana, con la condición de que estos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedante.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restricción HindII E (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)). Un sistema para expresar DNA en hospedantes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector como se describe en el documento U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en el documento U.S. 4.601.978. Véase también Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión de cDNA que condifica interferón inmunológico en células de mono; Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión de cDNA de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina-quinasa del virus del herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen de interferón \beta1 humano en células de ratón y conejo cultivadas; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(e) Componente de elemento potenciador

La transcripción de DNA que codifica el polipéptido diana de esta invención por eucariotas superiores a menudo se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de actuación cis del DNA, normalmente de aproximadamente 10-300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose encontrado 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)) con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell, 33:729 (1983)), así como dentro de la secuencia codificadora en sí misma (Osborne et al., Mol. Cell. Bio., 4:1293 (1984)). En la actualidad se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, de forma típica se utiliza un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el extremo tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede introducirse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto al DNA del polipéptido diana, pero preferiblemente se coloca en una posición 5' del promotor.

(f) Componente de fin de la transcripción

Los vectores de expresión utilizandos en células hospedantes eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para el fin de la transcripción y para estabilizar el mRNA. Estas secuencias normalmente se encuentran disponibles del extremo 5', y a veces de regiones no traducidas 3' de DNA o cDNA vírico o eucariota. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el polipéptido diana. Las regiones no traducidas 3' también incluyen sitios de fin de la transcripción.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente, y las secuencias codificadoras y control deseadas, emplea técnicas de acoplamiento convencionales. Los plásmidos o fragmentos de DNA aislados se rompen, se adaptan y reacoplan en la forma deseada para generar los plásmidos requiridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en plásmidos construidos se utilizan las mezclas de acoplamiento para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y los transformantes formados con éxito se seleccionan mediante la resistencia a la ampicilina o tetraciclina cuando resulte apropiado. Se preparan los plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian mediante el método de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981), o mediante el método de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

Particularmente útiles en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero de DNA que codifica el polipéptido diana. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse de forma eficaz en una célula hospedante, de forma que la célula hospedante acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula hospedante, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por DNA clonados, así como la rápida selección de estos polipéptidos para obtener unas propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para identificar análogos y variantes del polipéptido diana que tienen actividad del tipo del polipéptido diana.

Otros métodos, vectores y células hospedantes adecuados para su adaptación a la síntesis del polipéptido diana en un cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; documento EP 117.060; y documento EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión en cultivos de células de mamífero del polipéptido diana es pRK5 (documento EP publicado nº 307.247) o pSVI6B.

Selección y transformación de células hospedantes

Las células hospedantes adecuadas para clonar o expresar los vectores de la presente son las células procariotas, de levaduras o de eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados incluyen eubacterias, como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacillus como B. subtilis, especies de Pseudomonas como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, o Serratia marcescens. Un hospedante preferido E. coli para la clonación es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque resultan adecuadas otras cepas como E. coli B, E. coli \chi1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Preferiblemente la célula hospedante debe segregar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Como alternativa, son adecuados los métodos in vitro de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones con polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, como hongos filamentosos o levaduras, son hospedantes adecuados para vectores que codifican polipéptidos diana. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es la que se emplea de modo más habitual entre los microorganismos hospedantes eucariotas inferiores. Sin embargo se encuentra disponible, habitualmente, una serie de géneros, especies y cepas diferentes, y resultan útiles en la presente, como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); documento EP 139,383, publicado el 2 de mayo, 1985), hospedantes de Kluyveromyces (documento U.S. 4.943.529) como, por ejemplo, K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, y K. marxianus, Yarrowia (documento EP 402.226), Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)), Candida, Trichoderma reesia (documento EP 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)), y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357, publicado el 10 de enero, 1991), y hospedantes de Aspergillus, como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al. Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)), y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)).

Las células hospedantes adecuadas para la expresión en polipéptidos diana glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Estas células hospedantes son capaces de actividades de procesamiento y glicosilación complejas. En principio, cualquier cultivo de células de eucariotas superiores puede ser factible, tanto si es un cultivo de vertebrados o de invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células de hospedantes de insecto opcionales procedentes de hospedantes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Véase, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., eds., volumen 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985). Una diversidad de estas cepas víricas están disponibles para consulta del público, por ejemplo, el variante L-1 de Autographa californica NPV, y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden utilizarse como el virus en la presente según la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Pueden utilizarse cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. De forma típica, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que se han manipulado previamente para contener el DNA del polipéptido diana. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el DNA que codifica el polipéptido diana se traslada a la célula vegetal hospedante de forma que se transfecta y, en condiciones apropiadas, expresa el DNA del polipéptido diana. Además se encuentran disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con células vegetales, como el promotor de nopalina-sintasa y secuencias señal de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). Además, segmentos de DNA aislados de la región cadena arriba del gen 780 de T-DNA son capaces de activar o aumentar los niveles de transcripción de genes que se expresan en plantas en tejido vegetal que contiene DNA recombinante. Véase el documento EP 321.196, publicado el 21 de junio, 1989.

Sin embargo, el interés ha sido mayor por las células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual en años recientes (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)). Los ejemplos de líneas celulares de hospedantes mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónica humana (células 293 ó 293 subclonadas para crecer en un cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humanas (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células hospedantes preferidas son células de riñón embriónicas humanas 293 y células de ovario de hámster chino.

Las células hospedantes se transfectan y preferiblemente se transforman con los vectores de clonación o expresión descritos anteriormente de esta invención, y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula hospedante tanto si se expresa o no, de hecho, cualquier secuencia codificadora. Un experto en la técnica conoce numerosos métodos de transfección, por ejemplo CaPO_{4} y electroporación. Una transfección con éxito se reconoce, en general, cuando se produce alguna indicación del funcionamiento de este vector dentro de la célula hospedante.

La transformación significa introducir DNA en un organismo, de forma que el DNA puede replicarse, como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedante utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, según se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra, se utiliza, en general, para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular importantes. Se utiliza la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transformación de ciertas células vegetales, según se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983), y el documento WO 89/05859, publicado el 29 de junio, 1989. Para células de mamífero sin estas paredes celulares se prefiere el método de precipitación de fosfato de calcio descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al., supra. Los aspectos generales de las transformaciones en sistemas de células hospedantes de mamífero han sido descritas por Axel en el documento U.S. 4.399.216, otorgado el 16 de agosto, 1983. Las transformaciones en levaduras se realizan, de forma típica, según el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977), y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir DNA en células, como mediante inyección nuclear, electroporación o fusión de protoplastos.

Cultivo de las células hospedantes

Las células procariotas utilizadas para producir el polipéptido diana de esta invención se cultivan en medios adecuados según se describe en general en Sambrook et al., supra.

Las células hospedantes de mamífero utilizadas para producir el polipéptido diana de esta invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el mercado como medio de Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedantes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979): Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980); documentos U.S. 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762 ó 4.560.655; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; patente de EEUU re. 30.985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células hospedantes. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores del crecimiento (como insulina, transferrina o factor del crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamycin™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos que normalmente están presentes a concentraciones finales en la escala micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario en las concentraciones apropiadas que es conocido por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las que se utilizaron previamente con la célula hospedante seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la técnica.

Las células hospedantes indicadas en esta descripción incluyen células en cultivo in vitro, así como células que se encuentran dentro de un animal hospedante.

También se prevé que los polipéptidos diana de esta invención puedan producirse mediante recombinación homóloga, o con métodos de producción recombinante utilizando elementos control introducidos en células que ya contienen DNA que codifica el polipéptido diana, que actualmente se utilizan en la técnica. Por ejemplo, un elemento promotor/potenciador poderoso, un supresor, o un elemento modulador de la transcripción exógeno se inserta en el genoma de la célula hospedante prevista con la proximidad y orientación suficientes para influir en la transcripción del DNA que codifica el polipéptido diana deseado. El elemento control no codifica el polipéptido diana de esta invención, pero el DNA está presente en el genoma de la célula hospedante. Después se seleccionan las células que fabrican el polipéptido diana de esta invención, o unos niveles mayores o menores de expresión, según se desee.

Detección de la amplificación/expresión de genes

La amplificación/expresión de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante análisis de la transferencia Southern, análisis de la transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), análisis de la transferencia de puntos (análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de forma apropiada, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente. Pueden emplearse diversos marcadores, de forma más habitual radioisótopos, en particular ^{32}P. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas, como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucléotido. La biotina actúa entonces como sitio para unirse a la avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores, como radionúclidos, fluorescentes, enzimas y similares. Como alternativa, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y puede realizarse un ensayo en el que el dúplex se une a la superficie, de forma que después de la formación del dúplex sobre la superficie puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

La expresión de genes, como alternativa, puede medirse mediante métodos inmunológicos, como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y ensayo de cultivos celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con técnicas de tinción inmunohistoquímica se prepara una muestra de células, de forma típica mediante deshidratación y fijación, seguido de una reacción con anticuerpos marcados específicos del producto génico acoplado, y normalmente los marcadores son detectables de forma visual, como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible adecuada para utilizar en la presente invención se describe en Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido diana nativo o contra un péptido sintético basado en las secuencias de DNA proporcionadas en la presente, según se describe más a fondo en la sección 4 a continuación.

Purificación del polipéptido diana

El polipéptido diana se recupera preferiblemente a partir del medio de cultivo como un polipéptido segregado, aunque también puede recuperarse a partir de lisados de células hospedantes cuando se expresa directamente sin una señal secretora.

Cuando el polipéptido diana se expresa en una célula recombinante que no sea de origen humano, el polipéptido diana está completamente exento de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el polipéptido diana de las proteínas o polipéptidos de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas con respecto al polipéptido diana. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los restos celulares en partículas. Las fracciones de las membranas y de las proteínas solubles entonces se separan. El polipéptido diana entonces puede purificarse a partir de la fracción de las proteínas solubles y a partir de la fracción de las membranas del lisado del cultivo, dependiendo si el polipéptido diana está unido a la membrana. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A-sefarosa para eliminar los contaminantes como IgG.

Los variantes del polipéptido diana en los que se han deleccionado, insertado o sustituido restos se recuperan de la misma manera, tomando en cuenta cualquier cambio sustancial en las propiedades provocado por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión del polipéptido diana con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o vírico, facilita la purificación; una columna de inmunoafinidad que contiene un anticuerpo contra el antígeno (o que contiene el antígeno, en el que el polipéptido diana es un anticuerpo) puede utilizarse para adsorber la fusión. Pueden emplearse columnas de inmunoafinidad, como una columna de anticuerpo policlonal de conejo anti-polipéptido diana, para absorber el variante del polipéptido diana uniéndolo al menos a uno de los epitopos inmunológicos restantes. Un inhibidor de proteasas, como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. Un experto en la técnica apreciará que los métodos de purificación adecuados para el polipéptido diana nativo pueden requerir modificaciones para tomar en cuenta los cambios en el carácter del polipéptido diana o sus variantes después de su expresión en un cultivo de células recombinantes.

Modificaciones covalentes de los polipéptidos diana

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos diana se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluido dentro del alcance de esta invención es un fragmento del polipéptido diana. Los fragmentos del polipéptido diana que tienen hasta aproximadamente 40 restos aminoácidos pueden prepararse de forma conveniente mediante síntesis química, o mediante ruptura enzimática o química del polipéptido diana o variante del polipéptido diana de longitud completa. Otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido diana, o sus fragmentos, se introducen en la molécula haciendo reaccionar restos aminoácidos específicos del polipéptido diana, o sus fragmentos, con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas, o con los restos N- o C-terminales.

Los restos cisteinilo se hacen reaccionar, de modo más habitual, con \alpha-haloacetatos (y las correspondientes aminas), como ácido cloroacético o cloroacetamida, para producir derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos cisteinilo también se derivatizan mediante una reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)-propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos histidilo se derivatizan mediante una reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, debido a que este agente es relativamente específico de la cadena lateral histidilo. También resulta útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Se hacen reaccionar los restos lisinilo y amino terminales con succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen \alpha-amino incluyen imidoésteres como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentandiona; y reacción con glioxilato catalizada con transaminasa.

Los restos arginilo se modifican mediante una reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butandiona, 1,2-ciclohexandiona y ninhidrina. La derivatización de restos arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{s} del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden hacerse reaccionar con los grupos de lisina, así como el grupo epsilon-amino de la arginina.

Se puede realizar una modificación específica de restos tirosilo, siendo de especial interés la introducción de marcadores espectrales en los restos tirosilo mediante una reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. De forma más habitual, se utiliza N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los restos tirosilo se yodan utilizando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para utilizar en radioinmunoensayos, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante una reacción con carbodiimidas (R'- N = C = N - R'), en las que R y R' son grupos alquilo diferentes, como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en restos asparaginilo y glutaminilo mediante una reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil para unir el polipéptido diana a una superficie o matriz de soporte insoluble en agua para utilizar en el método para purificar anticuerpos anti-polipéptido diana, y viceversa. Los agentes de unión que se utilizan habitualmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo, como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales, como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes, como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]-propioimidato producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Como alternativa, se emplean matrices insolubles en agua reactivas, como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno, y los sustratos reactivos descritos en los documentos U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440, para la inmovilización de proteínas.

Los restos glutaminilo y asparaginilo con frecuencia se desamidan para formar los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente. Como alternativa, estos restos se desamidan en condiciones ácidas suaves. Cualquiera de las formas de estos restos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido diana incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativa del polipéptido. Alterar significa delecionar uno o más restos carbohidrato que se encuentran en el polipéptido diana nativo y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido diana nativo.

La glicosilación de polipéptidos puede estar, de forma típica, N-unida u O-unida. La glicosilación N-unida se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-unida se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un ácido hidroxiamino, de forma más habitual serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido diana se realiza, de forma conveniente, alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-unidos). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más restos serina o treonina a la secuencia del polipéptido diana nativo (para los sitios de glicosilación O-unidos). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido diana se altera preferiblemente mediante cambios a nivel de DNA, en particular mutando el DNA que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas, de forma que se generan codones que traducen los aminoácidos deseados. La(s) mutación(es) del DNA puede(n) realizarse utilizando los métodos descritos anteriormente bajo el encabezamiento "Variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido diana".

Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en el polipéptido diana es mediante acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajosos, porque no requieren la producción del polipéptido en una célula hospedante que tenga las capacidades de glicosilación para la glicosilación N- y O-unida. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el(los) azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfihidrilo libres, como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre, 1987, y en Aplin y Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)).

La eliminación de los restos carbohidrato presentes en el polipéptido diana nativo puede realizarse de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometansulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la ruptura de la mayoría o de todos los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), pero dejando el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)), y en Edge et al. (Anal. Biochem., 118:131 (1981)). La ruptura enzimática de los restos carbohidrato sobre los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglicosidasas, según se describe en Thotakura et al. (Meth. Enzymol., 138:350 (1987)).

La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales puede evitarse utilizando el compuesto tunicamicina, según se describe en Duskin et al. (J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)). La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido diana comprende unir el polipéptido diana a diversos polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera que se indica en los documentos U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337.

El polipéptido diana también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A., ed. (1980).

Las preparaciones de polipéptido diana también son útiles para generar anticuerpos, para seleccionar compañeros de unión, como patrones en ensayos para detectar el polipéptido diana (por ejemplo, marcando el polipéptido diana para utilizarlo como patrón en un radioinmunoensayo, un inmunoensayo de enzimas ligados o un ensayo de radiorreceptores), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de unión a receptor de tipo competitivo, cuando se marcan con yodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de espín y similares.

Puesto que a menudo es difícil predecir con anticipación las características de un variante del polipéptido diana, se apreciará que se necesitará algún tipo de selección del variante recuperado para seleccionar el variante óptimo. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la molécula del polipéptido diana, como la afinidad por un antígeno o anticuerpo dado, se mide mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. El variante se ensaya para detectar cambios en la supresión o potenciación de su actividad mediante comparación con la actividad observada para el polipéptido diana en el mismo ensayo. Otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o polipéptido, como la estabilidad redox o térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a la degradación proteolítica, estabilidad en un cultivo de células recombinantes o en plasma, o la tendencia a agregarse con vehículos o en multímeros, se ensayan mediante métodos muy conocidos en la técnica.

Diagnóstico y usos relacionados de los anticuerpos

Los anticuerpos de esta invención son útiles en ensayos de diagnóstico para la expresión del antígeno en células o tejidos específicos. Los anticuerpos se marcan de forma detectable y/o se inmovilizan sobre una matriz insoluble.

Los anticuerpos de esta invención encuentran otro uso en la purificación por afinidad del antígeno a partir de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes. Los ensayos de diagnóstico adecuados para el antígeno y sus anticuerpos dependen del antígeno o anticuerpo concreto. En general, estos ensayos incluyen ensayos competitivos y de "sandwich", y ensayos de inhibición estérica. Los métodos competitivos y de "sandwich" emplean una etapa de separación de fases como parte integral del método, mientras que los ensayos de inhibición estérica se realizan en una única mezcla de reacción. De forma fundamental, se utilizan los mismos procedimientos para el ensayo del antígeno y para las sustancias que se unen al antígeno, aunque ciertos métodos serán preferidos dependiendo del peso molecular de la sustancia que se está ensayando. Por tanto, la sustancia que se va a ensayar se denomina, en la presente, un analito, independientemente de su estado como antígeno o anticuerpo, y las proteínas que se unen al analito se denominan compañeras de unión, tanto si son anticuerpos, receptores de la superficie celular o antígenos.

Los métodos analíticos para el antígeno o sus anticuerpos utilizan uno o más de los siguientes reactivos: un análogo del analito marcado, un análogo del analito inmovilizado, un compañero de unión marcado, un compañero de unión inmovilizado y conjugados estéricos. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores".

El marcador utilizado (y esto también resulta útil para marcar el antígeno de ácido nucleico para utilizarlo como sonda) es cualquier funcionalidad detectable que no interfiere con la unión del analito y su compañero de unión. Se conocen numerosos marcadores para utilizar en inmunoensayos, y los ejemplos incluyen restos que pueden detectarse directamente, como marcadores de fluorocromo, quimioluminiscentes y radiactivos, así como restos, como enzimas, que pueden hacerse reaccionar o se derivatizan para ser detectados. Los ejemplos de estos marcadores incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H y ^{131}I, los fluoróforos como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EEUU nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peróxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido-oxidasas, por ejemplo, glucosa-oxidasa, galactosa-oxidasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina-oxidasa, acoplados con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un tinte precursor como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

Se encuentran disponibles métodos convencionales para unir estos marcadores de forma covalente a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, pueden utilizarse agentes acopladores como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidina bis-diazotizada y similares para marcar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Véase, por ejemplo, las patentes de EEUU nº 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982). Los marcadores preferidos en la presente son enzimas como peroxidasa de rábano y fosfatasa alcalina.

La conjugación de este marcador, incluyendo las enzimas, al anticuerpo es un procedimiento manipulador convencional para los expertos en la técnica en las técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis, volumen 73 (Academic Press, Nueva York, Nueva York, 1981), pp. 147-166. Estos métodos de unión son adecuados para utilizar con los anticuerpos y polipéptidos de esta invención.

En ciertos métodos de ensayo se requiere la inmovilización de los reactivos. La inmovilización supone separar el compañero de unión de cualquier analito que permanece libre en disolución. Esto se realiza, de forma convencional, insolubilizando el compañero de unión o el análogo del analito antes del procedimiento de ensayo, como mediante adsorción a una superficie o matriz insoluble en agua (Bennich et al., documento U.S. 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, utilizando entrecruzamiento con glutaraldehído), o mediante la insolubilización del compañero o análogo después, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.

Otros métodos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de "sandwich", están bien establecidos y se utilizan con amplitud en la industria del diagnóstico comercial.

Los ensayos competitivos se basan en la capacidad de un análogo de trazador para competir con el analito de la muestra de ensayo por un número limitado de sitios de unión sobre un compañero de unión común. El compañero de unión en general se insolubiliza antes o después de la competición, y después el trazador y el analito unidos al compañero de unión se separan del trazador y analito no unidos. Esta separación se realiza mediante decantación (en la que el compañero de unión se preinsolubiliza) o mediante centrifugación (en la que el compañero de unión se precipita después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido, según se mide mediante la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito y se comparan con los resultados del ensayo para determinar, de forma cuantitativa, la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando se utilizan enzimas como marcadores detectables.

Otra especie de ensayo competitivo, denominado ensayo "homogéneo", no requiere una separación de fases. En este caso, se prepara un conjugado de una enzima con el analito y se utiliza de forma que cuando el antianalito se une al analito, la presencia del antianalito modifica la actividad enzimática. En este caso, el antígeno o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan mediante un puente orgánico bifuncional con una enzima, como peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para utilizar con un anticuerpo, de forma que la unión del anticuerpo inhibe o potencia la actividad enzimática del marcador. Este método, per se, se practica con amplitud con el nombre de EMIT.

Se utilizan conjugados estéricos en métodos de impedimento estérico para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan mediante la unión covalente de un hapteno de bajo peso molecular con un analito pequeño, de forma que el anticuerpo contra el hapteno es incapaz sustancialmente de unir el conjugado al mismo tiempo que el antianalito. Con este procedimiento de ensayo, el analito presente en la muestra de ensayo se une al antianalito, permitiendo con ello que el antihapteno se una al conjugado, produciendo un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en la fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo.

Los ensayos de "sandwich" son particularmente útiles para la determinación del antígeno o anticuerpo. En los ensayos de "sandwich" secuenciales se utiliza un compañero de unión inmovilizado para adsorber el analito de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo se elimina, por ejemplo, mediante lavado, el analito unido se utiliza para adsorber el compañero de unión marcado, y el material unido entonces se separa del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito de la muestra de ensayo. En los ensayos de "sandwich" "simultáneos", la muestra de ensayo no se separa antes de añadir el compañero de unión marcado. Un ensayo de "sandwich" secuencial que utiliza un anticuerpo monoclonal antiantígeno como un anticuerpo, y un anticuerpo policlonal antiantígeno como el otro anticuerpo, resulta útil para ensayar muestras para detectar una actividad de antígeno concreta.

Los anteriores son sólo ejemplos de ensayos de diagnóstico para los anticuerpos importados y humanizados de esta invención. Otros métodos actuales o desarrollados con posterioridad para la determinación de esos analitos se incluyen dentro del alcance de la presente, incluyendo los bioensayos descritos anteriormente.

Inmunotoxinas

Esta invención también está dirigida a derivados inmunoquímicos de los anticuerpos de esta invención, como inmunotoxinas (conjugados del anticuerpo y un resto citotóxico). Los anticuerpos que portan las funciones efectoras apropiadas, como los que portan sus dominios constantes, también se utilizan para inducir la lisis mediante el proceso del complemento natural, y para interaccionar con las células citotóxicas dependientes del anticuerpo que normalmente están presentes.

Por ejemplo, anticuerpos purificados esterilizados mediante filtración se conjugan opcionalmente con una citotoxina, como ricina, para utilizar en la terapia del SIDA. La solicitud de patente de EEUU nº de serie 07/350.895 ilustra métodos para fabricar y utilizar inmunotoxinas para el tratamiento de la infección por VIH. Los métodos de esta invención, por ejemplo, son adecuados para obtener anticuerpos humanizados para utilizar como inmunotoxinas para emplear en la terapia del SIDA.

El resto citotóxico de la inmunotoxina puede ser un fármaco citotóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o un fragmento enzimáticamente activo de dicha toxina. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se utilizan son la cadena A de difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. En otra realización, los anticuerpos se conjugan con fármacos anticancerígenos de molécula pequeña como cis-platina o 5FU. Los conjugados del anticuerpo monoclonal y estos restos citotóxicos se preparan utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales. Los ejemplos de estos reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres como HCl de adipimidato de dimetilo, ésteres activos como suberato de disuccinimidilo, aldehídos como glutaraldehído, compuestos de bis-azido como bis-(p-azidobenzoil)hexandiamida, derivados de bis-diazonio como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina, diisocianatos como 2,6-diisocianato de tolileno, y compuesto de flúor bis-activos como 1,5-difluro-2,4-dinitrobenceno. La porción lisante de una toxina puede unirse al fragmento Fab de los anticuerpos.

Pueden fabricarse inmunotoxinas mediante una diversidad de modos, según se analiza en la presente. Pueden utilizarse los reactivos de entrecruzamiente habitualmente conocidos para producir conjugados estables.

De forma ventajosa, anticuerpos monoclonales que se unen de forma específica al dominio del antígeno que se expone sobre la superficie de células infectadas, se conjugadan a la cadena A de la ricina. De forma aún más ventajosa, la cadena A de la ricina se desglicosila y se produce mediante medios recombinantes. Un método ventajoso para fabricar la inmunotoxina de la ricina se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987).

Cuando se utilizan para destruir células humanas infectadas in vitro para fines de diagnóstico, los conjugados se añaden, de forma típica, al medio de cultivo celular a una concentración de al menos aproximadamente 10 nM. La formulación y vía de administración para el uso in vitro no son críticas. Normalmente se utilizan formulaciones acuosas que son compatibles con el medio de cultivo o perfusión. La citotoxicidad puede leerse mediante técnicas convencionales.

Los productos radiofarmaceúticos citotóxicos para tratar células infectadas pueden fabricarse conjugando isótopos radiactivos (por ejemplo, I, Y, Pr) a los anticuerpos. De forma ventajosa, se utilizan isótopos que emiten partículas alfa. La expresión "resto citótoxico", tal como se utiliza en la presente, pretende incluir estos isótopos.

En una realización preferida, la cadena A de la ricina se desglicosila o se produce sin oligosacáridos, para disminuir su eliminación por mecanismos de eliminación irrelevantes (por ejemplo, el hígado). En otra realización, la ricina completa (cadena A más cadena B) se conjuga con el anticuerpo si puede bloquearse la propiedad de unión a la galactosa de la cadena B ("ricina bloqueada").

En otra realización, se fabrican conjugados de la toxina con fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Debido a su tamaño relativamente pequeño, estos fragmentos pueden penetrar mejor en el tejido para alcanzar las células infectadas.

En otra realización, liposomas fusogénicos se llenan con un fármaco citotóxico, y los liposomas se revisten con anticuerpos que se unen de forma específica al antígeno concreto.

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

Ciertos aspectos de esta invención implican anticuerpos que (a) se dirigen contra un antígeno concreto, y (b) pertenecen a una subclase o isotipo que es capaz de mediar en la lisis de células a las cuales se une la molécula de anticuerpo. De forma más específica, estos anticuerpos deben pertenecer a una subclase o isotipo que, después de formar complejos con proteínas de la superficie celular, activan el complemento del suero y/o median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediante la activación de células efectoras, como células asesinas naturales o macrófagos.

Se sabe que la actividad biológica de los anticuerpos está determinada, en gran medida, por los dominios constantes o región Fc de la molécula del anticuerpo (Uananue y Benacerraf, Textbook of Immunology, 2ª edición, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)). Esto incluye su capacidad para activar el complemento y para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) realizada por los leucocitos. Los anticuerpos de diferentes clases y subclases se diferencian a este respecto, así como los anticuerpos de la misma subclase pero de diferentes especies; según la presente invención, se preparan anticuerpos de las clases que tienen la actividad biológica deseada. La preparación de estos anticuerpos implica la selección de dominios constantes de los anticuerpos y su incorporación en el anticuerpo humanizado mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de ratón de clase IgG3 e IgG2a son capaces de activar el complemento del suero después de su unión a células diana que expresan el antígeno afín y, por tanto, los anticuerpos humanizados que incorporan las funciones efectoras IgG3 e IgG2a resultan deseables para ciertas aplicaciones terapéuticas.

En general, los anticuerpos de ratón de la subclase IgG2a e IgG3 y, a veces, IgG1, pueden mediar en la ADCC, y los anticuerpos de la subclase IgG3, IgG2a e IgM se unen y activan el complemento del suero. La activación del complemento requiere, en general, la unión de al menos dos moléculas de IgG muy cercanas sobre la célula diana. Sin embargo, la unión de una sola molécula de IgM activa el complemento del suero.

La capacidad de cualquier anticuerpo concreto para mediar en la lisis de la célula diana mediante la activación del complemento y/o ADCC puede ensayarse. Las células de interés se cultivan y se marcan in vitro; el anticuerpo se añade al cultivo celular junto con el complemento del suero o las células inmunológicas que pueden activarse mediante los complejos de antígeno-anticuerpo. La citolisis de las células diana se detecta mediante la liberación del marcador a partir de las células lisadas. De hecho, pueden seleccionarse anticuerpos utilizando el suero del propio paciente como fuente del complemento y/o las células inmunológicas. El anticuerpo que es capaz de activar el complemento o mediar en la ADCC en el ensayo in vitro puede utilizarse, entonces, de forma terapéutica en ese paciente concreto.

Esta invención incluye, de modo específico, los dominios del anticuerpo Fc consenso preparados y utilizados según las indicaciones de esta invención.

Usos terapeúticos de los anticuerpos y otros usos

Cuando se utilizan para una terapia in vivo, los anticuerpos de la presente invención se administran al paciente en cantidades terapéuticamente eficaces (es decir, cantidades que tienen el efecto terapéutico deseado). Normalmente se administran por vía parenteral. La dosis y régimen de dosificación dependerá del grado de infección, las características del anticuerpo o inmunotoxina concreta utilizada, por ejemplo, su índice terapéutico, el paciente, y la historia del paciente. De forma ventajosa, el anticuerpo o inmunotoxina se administra de forma continua durante un periodo de 1-2 semanas, por vía intravenosa para tratar células en la vasculatura, y por vía subcutánea e intraperitoneal para tratar nódulos linfáticos regionales. Opcionalmente, la administración se realiza durante el desarrollo de una terapia adjunta, como ciclos combinados de radiación, tratamiento quimioterapéutico, o la administración de factor de necrosis tumoral, interferón u otro agente citoprotector o inmunomodulador.

Para la administración parenteral, los anticuerpos se formulan en forma de dosificación unitaria inyectable (disolución, suspensión, emulsión) junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable parenteral. Estos vehículos son, de forma inherente, no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de estos vehículos son agua, disolución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, y albúmina de suero humana al 5%. También pueden utilizarse vehículos no acuosos, como aceites no volátiles y oleato de etilo. Pueden emplearse liposomas como vehículos. El vehículo puede contener cantidades menores de aditivos, como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes. Los anticuerpos se formulan, de forma típica, en estos vehículos a unas concentraciones desde aproximadamente 1 mg/ml a 10 mg/ml.

El uso de anticuerpos IgM puede preferirse para ciertas aplicaciones, aunque, sin embargo, las moléculas de IgG, por ser más pequeñas, pueden ser más capaces que las moléculas de IgM para localizar ciertos tipos de células infectadas.

Existen pruebas de que la activación del complemento in vivo conduce a una diversidad de efectos biológicos, incluyendo la inducción de una respuesta inflamatoria y la activación de macrófagos (Uananue y Benecerraf, Textbook of Immunology, 2ª edición, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)). La mayor vasodilación que acompaña a la inflamación puede aumentar la capacidad de diversos agentes para localizar células infectadas. Por tanto, las combinaciones de antígeno-anticuerpo del tipo especificado por esta invención pueden utilizarse de modo terapéutico de muchas maneras. Además, pueden utilizarse antígenos purificados (Hakomori, Ann. Rev. Immunol., 2:103 (1984)) o anticuerpos antiidiotípicos (Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:2864 (1985); Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:216 (1984)) que se relacionan con estos antígenos, para inducir una respuesta inmunológica activa en pacientes humanos. Esta respuesta incluye la formación de anticuerpos capaces de activar el complemento humano y de mediar en la ADCC y, mediante estos mecanismos, provocar la destrucción de células infectadas.

Opcionalmente, los anticuerpos de esta invención son útiles para inmunizar de forma pasiva a pacientes, por ejemplo mediante la administración de anticuerpos anti-VIH humanizados.

Las composiciones de anticuerpos utilizadas en terapia se formulan y las dosificaciones se establecen de una manera coherente con la buena práctica médica, tomando en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de administración de la composición, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Las composiciones de anticuerpo se preparan para la administración según la descripción de la preparación de polipéptidos para la administración, a continuación.

Depósito de materiales

Según se describe anteriormente, los cultivos de muMAb4D5 se han depositado en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EEUU (ATCC).

Este depósito se realizó según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Objetivo de Tramitación de Patentes y sus Regulaciones (Tratado de Budapest).

Con respecto a las designaciones para las que se quiere una patente europea, una muestra del microorganismo depositado estará disponible hasta la publicación de la mención de la otorgación de la patente europea, o hasta la fecha en la que la solicitud se rechaza o se retira, o se cree que se va a retirar, sólo para entregar dicha muestra a un experto nombrado por la persona que pide la muestra (norma 28(4) EPC).

El cesionario de la presente solicitud ha aceptado que si los cultivos en depósito mueren, o se pierden o destruyen cuando se cultivan bajo condiciones adecuadas, serán sustituidos inmediatamente tras la notificación por un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de la cepa depositada no debe considerarse una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados por la autoridad de cualquier gobierno, según sus leyes sobre patentes.

La anterior solicitud escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica practicar la invención. El alcance de la presente invención no debe limitarse por los constructos depositados, puesto que las realizaciones depositadas pretenden sólo ilustrar ciertos aspectos de la invención, y cualquier constructo que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. El depósito de material de la presente no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de practicar la invención, ni debe considerarse que limita el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representan.

Se entiende que la aplicación de las indicaciones de la presente invención a un problema o situación específicos está dentro de las capacidades de un experto en la técnica, a la luz de las indicaciones contenidas en la presente. Los ejemplos de productos de la presente invención y de procesos representativos para su aislamiento, uso y fabricación aparecen a continuación, pero no se debe considerar que limitan la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Humanización de muMAb4D5

Se indica la quimerización de muMAb4D5 (chMAb4D5), y la rápida y simultánea humanización de los genes de la región variable de la cadena pesada (V_{H}) y ligera (V_{L}), utilizando una nueva estrategia de "mutagénesis de conversión de genes". Ocho variantes humanizados (huMAb4D5) se construyeron para demostrar la importancia de varios restos de FR identificados mediante la formación de modelos moleculares de la invención, o que previamente se habían propuesto como críticos para la conformación de CDR concretas (véase Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia, C. et al., Nature, 342:877-883 (1989); Tramontano, A. et al., J. Mol. Biol., 215:175-182 (1990)). La expresión transitoria eficaz de variantes humanizados en células que no son de mieloma permite a los inventores investigar con rapidez la relación entre la afinidad de unión por el ECD de p185^{HER2} y la actividad antiproliferativa contra células de carcinoma que sobreexpresan p185^{HER2}.

Materiales y métodos Clonación de genes de la región variable

Los genes V_{H} y V_{L} de muMAb4D5 se aislaron mediante una amplificación mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del mRNA procedente del correspondiente hibridoma (Fendly, B.M. et al., Cancer Res., 50:1550-1558 (1990)), según se describe en Orlandi et al. (Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-3837 (1989)). Se utilizó la secuencia amino-terminal de V_{H} y V_{L} de muMAb4D5 para diseñar los cebadores de PCR de la cadena sentido, mientras que los cebadores de PCR de la cadena antisentido se basan en las secuencias consenso de restos del marco conservado murino (Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-3837 (1989); Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), que incorporan sitios de restricción para la clonación direccional mostrada por el subrayado y listada después de las secuencias:

V_{L} sentido, 5'-TCCGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ. ID NO:7), EcoRV;

V_{L} antisentido, 5'-GTTTGATCTCCAGCTTGGTACCHSCDCCGAA-3' (SEQ. ID NO:8), Asp718;

V_{H} sentido, 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ. ID NO:9), PstI; y

V_{H} antisentido, 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ. ID NO:10), BstEII;

en las que H = A, C o T; S = C o G; D = A, G o T; M = A o C; R = A o G; y W = A o T. Los productos de la PCR se clonaron en pUC119 (Vieira, J. y Messing, J., Methods Enzymol., 153:3-11 (1987)) y cinco clones para cada dominio variable secuenciados mediante el método didesoxi (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)).

Formación de modelos moleculares

Se construyeron los dominios V_{H} y V_{L} de muMAb4D5 de forma separada a partir de coordenadas consenso basadas en siete estructuras Fab del banco de datos de proteínas Brookhaven (entradas 1FB4, 2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL y 1REI). El fragmento Fab KOL (Marquart, M. et al., J. Mol. Biol., 141:369-391 (1980)) se eligió en primer lugar como molde para los dominios V_{H} y V_{L}, y después se superpusieron otras estructuras sobre esta estructura utilizando sus coordenadas de átomos de la cadena principal (programa INSIGHT, Biosym Technologies). La distancia desde el molde C\alpha al C\alpha análogo en cada una de las estructuras superpuestas se calculó para cada posición de los restos. Si todas (o casi todas) las distancias C\alpha-C\alpha para un resto concreto son \leq 1\ring{A}, entonces esa posición se incluye en la estructura consenso. En la mayoría de los casos, los restos del marco conservado de la lámina \beta cumplen estos criterios, mientras que los bucles CDR no. Para cada uno de los restos seleccionados, las coordenadas medias para los átomos individuales N, C\alpha, C, O y C\beta se calcularon y después se corrigieron para las desviaciones resultantes con geometría de enlaces no convencional mediante 50 ciclos de minimización de la energía utilizando el programa DISCOVER (Biosym Technologies) con el campo de fuerza AMBER (Weiner, S.J. et al., J. Amer. Chem. Soc., 106:765-784 (1984)) y las coordenadas de C\alpha fijadas. Las cadenas laterales de restos altamente conservados, como los restos cisteína con enlace disulfuro, entonces se incorporaron en la estructura consenso resultante. Después se incorporaron las secuencias de V_{H} y V_{L} de muMAb4D5, comenzando con los restos CDR y utilizando las tabulaciones de las conformaciones de CDR de Chothia et al. (Chothia, C. et al., Nature, 342:877-883 (1989)) como guía. Se eligieron las conformaciones de cadena lateral basándose en las estructuras cristalinas de Fab, bancos de rotámeros (Ponder, J.W. y Richards, F.M., J. Mol. Biol., 193:775-791 (1987)) y consideraciones de plegamiento. Puesto que a V_{H}-CDR3 no se le pudo asignar una conformación de esqueleto concreta con estos criterios, se crearon dos modelos a partir de una búsqueda de bucles de tamaño similar utilizando el programa INSIGHT. Se derivó un tercer modelo utilizando consideraciones de exposición al disolvente y plegamiento. Cada modelo entonces se sometió a 5000 ciclos de minimización de energía.

En la humanización de muMAb4D5, las secuencias humanas consenso se derivaron, en primer lugar, de las subclases más abundantes en la compilación de secuencias de Kabat et al. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), es decir, el subgrupo I de V_{L} \kappa y el grupo III de V_{H}, y se generó un modelo molecular para estas secuencias utilizando los métodos descritos anteriormente. Se creó una estructura para huMAb4D5 transfiriendo las CDR desde el modelo de muMAb4D5 a la estructura humana consenso. Todos los variantes de huMAb4D5 contenían sustituciones humanas de los restos de muMAb4D5 en tres posiciones dentro de las CDR, según se define mediante la variabilidad de secuencia (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), pero no según se define mediante la variabilidad estructural (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)): K24R de V_{L}-CDR1, R54L de V_{L}-CDR2, y T56S de V_{L}-CDR2. Las diferencias entre muMAb4D5 y los restos del marco conservado consenso humano (figura 1) se modelaron de forma individual para investigar su posible influencia sobre la conformación de CDR y/o la unión al ECD de p185^{HER2}.

Construcción de genes quiméricos

Los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de chMAb4D5 se ensamblaron de forma separada en vectores fágmidos previamente descritos que contienen el promotor y potenciador del citomegalovirus humano, un intrón 5' y una señal de poliadenilación de SV40 (Gorman, C.M. et al., DNA & Prot. Engin. Tech., 2:3-10 (1990)). De forma breve, segmentos de genes que codifican V_{L} de muMAb4D5 (figura 1A) y C_{L} de la cadena ligera \kappa1 de REI humana (Palm, W. y Hilschmann, N., Z. Physiol. Chem., 356:167-191 (1975)) se unieron de forma precisa como si fueran genes de V_{H} de muMAb4D5 (figura 1B) y de la región constante \gamma1 humana (Capon, D.J. et al., Nature, 337:525-531 (1989)) mediante subclonación simple (Boyle, A., en Current Protocols in Molecular Biology, capítuclo 3 (F.A. Ausubel et al., eds., Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nueva York, 1990)) y mutagénesis dirigida específica de sitio (Carter, P., en Mutagenesis: A Practical Approach, capítulo 1 (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1991)). Se eligió el isotipo \gamma1 porque se ha descubierto que es el isotipo humano preferido para portar la ADCC y la citotoxicidad dependiente del complemento utilizando series apareadas de anticuerpos quiméricos (Brüggemann, M. et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987)) o anticuerpos humanizados (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988)). Los fragmentos V_{H} y V_{L} generados mediante PCR (figura 1) posteriormente se mutagenizaron de forma que representan, de forma fiel, la secuencia de muMAb4D5 determina a nivel de proteína: Q1E de V_{H}, V104L de V_{L}, y T109A (los variantes se denominan con el resto aminoácido y el número, seguidos del aminoácido de sustitución). Las regiones constantes \gamma1 humanas son idénticas a las indicadas en Ellison et al. (Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res., 13:4017-4079 (1982)), excepto por las mutaciones E359D y M361L (numeración Eu, como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), que se instalaron para convertir el anticuerpo desde el alotipo A, que en la naturaleza resulta raro, al alotipo no A, mucho más habitual (Tramontano, A. et al., J. Mol. Biol., 215:175-182 (1990)). Esto es un intento de reducir el riesgo de que anticuerpos antialotipo interfieran con la terapia.

Construcción de genes humanizados

Los genes que codifican el fragmento Fd de la cadena ligera y la cadena pesada de chMAb4D5 (dominios V_{H} y C_{H}1) se subclonaron juntos en pUC119 (Vieira, J. y Messing, J., Methods Enzymol., 153:3-11 (1987)) para crear pAK1 y simultáneamente humanizado en una única etapa (figura 2). De forma breve, se diseñaron series de 6 oligonucleótidos contiguos para humanizar V_{H} y V_{L} (figura 1). Estos oligonucleótidos tienen una longitud de 28 a 83 nucleótidos, contienen de cero a 19 desapareamientos con el molde de anticuerpo murino, y están restringidos a tener 8 ó 9 restos perfectamente apareados en cada extremo para estimular una reasociación y acoplamiento eficaces de los oligonucleótidos adyacentes. Las series de oligonucleótidos de humanización de V_{H} y V_{L} (5 pmol cada uno) se fosforilaron con ATP o con \gamma-^{32}P-ATP (Carter, P., Methods Enzymol., 154:382-403 (1987)) y se reasociaron de forma separada con 3,7 pmol de molde pAK1 en 40 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y MgCl_{2} 10 mM enfriando desde 100ºC hasta la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min. Los oligonucleótidos reasociados se unieron mediante incubación con DNA-ligasa de T4 (12 unidades; New England Biolabs) en presencia de 2 \mul de ATP 5 mM y 2 \mul de DTT 0,1 M durante 10 minutos a 14ºC. Después de una electroforesis sobre un gel de secuenciación de acrilamida al 6%, los oligonucleótidos ensamblados se localizaron mediante autorradiografía y se recuperaron mediante electroelución. Los oligonucleótidos ensamblados (aproximadamente 0,3 pmol cada uno) se reasociaron simultáneamente con 0,15 pmol de pAK1 monocatenario que contiene desoxiuridina preparado según Kunkel et al. (Kunkel, T.A. et al. Methods Enzymol., 154:367-382 (1987)) en 10 \mul de Tris-HCl 40 mM (pH 7,5) y MgCl_{2} 16 mM, como anteriormente. Se construyó un DNA heterodúplex extendiendo los cebadores con DNA-polimerasa de T7 y se transformó en E. coli BMH 71-18 mutL, como se ha descrito previamente (Carter, P., en Mutagenesis: A Practical Approach, capítulo 1 (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1991)). La mezcla de DNA fágmido resultante se enriqueció, en primer lugar, para huV_{L} mediante purificación de restricción utilizando XhoI, y después para huV_{H} mediante selección de restricción utilizando StuI, según se describe en Carter, P., en Mutagenesis: A Practical Approach, capítulo 1 (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1991); y en Wells, J.A. et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A, 317:415-423 (1986). Los clones resultantes que contienen ambos genes huV_{L} y huV_{H} se identificaron mediante secuenciación de nucleótidos (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)) y se denominaron pAK2. Se generaron otros variantes humanizados mediante mutagénesis dirigida específica de sitio (Carter, P., en Mutagenesis: A Practical Approach, capítulo 1 (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1991)). Los segmentos de los genes V_{L} y V_{H} de muMAb4D5 en los vectores de expresión transitoria descritos anteriormente se sustituyeron entonces de forma precisa por sus versiones humanizadas.

Expresión y purificación de variantes de MAb4D5

Los vectores de expresión de cDNA de cadena ligera y pesada de MAb4D5 se cotransfectaron en una línea celular de riñón embriónico humana transformada con adenovirus, 293 (Graham F.L. et al., J. Gen. Virol., 36:59-72 (1977)) utilizando un procedimiento de alta eficacia (Gorman, C.M. et al., DNA & Prot. Engin. Tech., 2:3-10 (1990); Gorman, C., en DNA Cloning, volumen II, pp. 143-190 (D.M. Glover, ed., IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985)). Los medios se recogieron a diario durante 5 días y las células se realimentaron con medio exento de suero. Los anticuerpos se recuperaron del medio y se purificaron mediante afinidad sobre proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia), según describe el fabricante. El anticuerpo eluido se intercambió de tampón a una disolución salina tamponada con fosfato mediante filtración en gel G25, se concentró mediante ultrafiltración (Centriprep-30 o Centricon-100, Amicon), se esterilizó mediante filtración (Millex-GV, Millipore) y se conservó a 4ºC. Se determinó la concentración de anticuerpo utilizando ELISA de unión al antígeno y de inmunoglobulina total. El patrón utilizado fue huMAb4D5-5, cuya concentración se determinó mediante análisis de la composición de aminoácidos.

Ensayo de proliferación celular

Se investigó el efecto de los variantes de MAb4D5 sobre la proliferación de la línea celular de adenocarcinoma mamario humana, SK-BR-3, como se ha descrito previamente (Fendly, B.M. et al., Cancer Res., 50:1550-1558 (1990)) utilizando concentraciones saturantes de MAb4D5.

Medidas de afinidad

Se determinó la afinidad de unión al antígeno de los variantes de MAb4D5 utilizando una forma segregada del ECD de p185^{HER2} preparada como se describe en Fendly, B.M. et al., J. Biol. Resp. Mod., 9:449-455 (1990). De forma breve, el anticuerpo y el ECD de p185^{HER2} se incubaron en disolución hasta que se alcanzó el equilibrio. La concentración de anticuerpo libre entonces se determinó mediante ELISA utilizando el ECD de p185^{HER2} inmovilizado, y se empleó para calcular la afinidad (K_{d}) según Friguet et al. (Friguet, B. et al., J. Immunol. Methods, 77:305-319 (1985)).

Resultados Humanización de muMAb4D5

Los segmentos de los genes V_{H} y V_{L} de muMAb4D5 se clonaron, en primer lugar, mediante PCR y se secuenciaron (figura 1). Los genes variables entonces se humanizaron simultáneamente mediante mutagénesis de conversión de genes utilizando oligonucleótidos preensamblados (figura 2). Un oligonucleótido 311-mero que contiene 39 desapareamientos con el molde dirige 24 cambios simultáneos en los aminoácidos, requeridos para humanizar V_{L} de muMAb4D5. La humanización de V_{H} de muMAb4D5 requiere 32 cambios de aminoácidos que se instalaron en un 361-mero que contiene 59 desapareamientos con el molde de muMAb4D5. Dos de los 8 clones secuenciados codifican, de forma precisa, huMAb4D5-5, aunque uno de estos clones contiene una única imperfección de un nucleótido. Los otros 6 clones estaban esencialmente humanizados, pero contenían un pequeño número de errores: < 3 cambios de nucleótidos y < 1 única deleción de un nucleótido por kilobase. Se construyeron otros variantes humanizados (tabla 3) mediante mutagénesis específica dirigida a sitio de huMAb3D5-5.

Los niveles de expresión de los variantes de huMAb4D5 están en el intervalo desde 7 a 15 \mug/ml, según se considera mediante ELISA que utiliza ECD de p185^{HER2} inmovilizado. Una recogida sucesiva de cinco placas de 10 cm permite producir desde 200 \mug a 500 mg de cada variante en una semana. Los anticuerpos purificados por afinidad sobre proteína A producen una única banda en un gel de SDS-poliacrilamida teñido con azul de Coomassie, con una movilidad coherente con la esperada M_{r} de aproximadamente 150 kDa. Una electroforesis bajo condiciones reductoras produce 2 bandas coherentes con la esperada M_{r} de las cadenas pesada (48 kDa) y ligera (23 kDa) libre (no se muestra). El análisis de la secuencia amino-terminal (10 ciclos) produce la secuencia mixta esperada (véase la figura 1) a partir de una combinación equimolar de cadenas ligeras y pesadas (no se muestra).

Variantes de huMAb4D5

En general, los restos FR se eligen a partir de secuencias humanas consenso (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)) y de restos de CDR de muMAb4D5. Se construyeron otros variantes sustituyendo restos humanos seleccionados en huMAb4D5-1 por sus homólogos de muMAb4D5. Son los restos 71, 73, 78, 93 más 102 de V_{H}, y los restos 55 más 66 de V_{L}, identificados mediante la formación de modelos molecular. El resto 71 de V_{H} ha sido propuesto previamente por otros (Tramontano, A. et al., J. Mol. Biol., 215:175-182 (1990)) como crítico para la conformación de V_{H}-CDR2. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos entre las moléculas del variante de huMAb4D5 aparecen en la tabla 3, junto con su afinidad de unión al ECD de p185^{HER2} y las actividades antiproliferativas máximas contra células SK-BR-3. Se obtuvieron valores muy similares de K_{d} para la unión de variantes de MAb4D5 a células SK-BR-3 o al ECD de p185^{HER2} (tabla 3). Sin embargo, las estimaciones de K_{d} derivadas de la unión de variantes de MAb4D5 al ECD de p185^{HER2} fueron más reproducibles con menores errores estándar y consumen cantidades mucho menores de anticuerpo que las medidas de unión con células enteras.

El variante humanizado más potente diseñado mediante formación de modelos moleculares, huMAb4D5-8, contiene 5 restos de FR procedentes de muMAb4D5. Este anticuerpo se une al ECD de p185^{HER2} con 3 veces más de fuerza que el muMAb4D5 (tabla 3) y tiene una actividad antiproliferativa comparable con células SK-BR-3 (figura 3). Por contraste, huMAb4D5-1 es el variante de muMAb4D5 más humanizado pero el menos potente, creado simplemente instalando las CDR de muMAb4D5 en las secuencias humanas consenso. El huMAb4D5-1 se une al ECD de p185^{HER2} con 80 veces menos de fuerza que el anticuerpo murino, y no tiene actividad antiproliferativa detectable a la mayor concentración de anticuerpo investigada (16 \mug/ml).

La actividad antiproliferativa de los variantes de huMAb4D5 contra células SK-BR-3 que sobreexpresan p185^{HER2} no se correlaciona simplemente con su afinidad de unión por el ECD de p185^{HER2}. Por ejemplo, la instalación de tres restos murinos en el dominio V_{H} de huMAb4D5-2 (D73T, L78A y A93S) para crear huMAb4D5-3 no cambia la afinidad de unión al antígeno, pero confiere una significativa actividad antiproliferativa (tabla 3).

La importancia del resto 71 de V_{H} (Tramontano, A. et al., J. Mol. Biol., 215:175-182 (1990)) está apoyada por el aumento en 5 veces observado en la afinidad por el ECD de p185^{HER2} tras la sustitución de R71 en huMAb4D5-1 por el correspondiente resto murino, alanina (huMAb4D5-2). Por contraste, la sustitución de L78 de V_{H} en huMAb4D5-4 por el resto murino, alanina (huMAb4D5-5), no cambia significativamente la afinidad por el ECD de p185^{HER2} ni cambia la actividad antiproliferativa, sugiriendo que el resto 78 no tiene importancia funcional crítica para huMAb4D5 ni para su capacidad para interaccionar de forma apropiada con el dominio extracelular de p185^{HER2}.

El resto 66 de V_{L} normalmente es una glicina en las secuencias de cadena \kappa humana y murina (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)), pero en la cadena ligera k de muMAb4D5 una arginina ocupa esta posición. Es probable que la cadena lateral del resto 66 afecte a la conformación de V_{L}-CDR1 y V_{L}-CDR2, y al giro en horquilla en 68-69 (figura 4). Coherente con la importancia de este resto, la mutación G66R de V_{L} (huMAb4D5-3 \rightarrow huMAb4D5-5) aumenta la afinidad por el ECD de p185^{HER2} en 4 veces con un aumento concomitante en la actividad antiproliferativa.

A partir de la formación de modelos moleculares parece que la cadena lateral de tirosilo en el resto 55 de V_{L} de muMAb4D5 puede estabilizar la conformación de V_{H}-CDR3, o proporcionar una interacción en la interfase V_{L}-V_{H}. Esta última función puede depender de la presencia de Y102 de V_{H}. En el contexto de huMAb4D5-5, las mutaciones E55Y de V_{L} (huMAb4D5-6) y V102Y de V_{H} (huMAb4D5-7) aumentan individualmente la afinidad por el ECD de p185^{HER2} en 5 veces y 2 veces, respectivamente, mientras que juntas (huMAb4D5-8) aumentan la afinidad en 11 veces. Esto resulta coherente con el papel propuesto para Y55 de V_{L} e Y102 de V_{H}.

Función inmunológica secundaria de huMAb4D5-8

El muMAb4D5 inhibe el crecimiento de células tumorales de tumor de mama humanas que sobreexpresan p185^{HER2} (Hudziak, R.M. et al., Molec. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989)). El anticuerpo, sin embargo, no ofrece la posibilidad de efectos citotóxicos directos sobre el tumor. Esta posibilidad surge en huMAb4D5-8 como resultado de su elevada afinidad (K_{d} = 0,1 \muM) y su subtipo IgG_{1} humano. La tabla 4 compara la ADCC mediada por huMAb4D5-8 con muMÄb4D5 en una línea celular epitelial pulmonar normal, WI-38, que expresa un nivel bajo de p185^{HER2}, y en SK-BR-3, que expresa un elevado nivel de p185^{HER2}. Los resultados demuestran que: (1) huMAb4D5 tiene una capacidad muy potenciada para realizar la ADCC, comparado con su progenitor murino; y (2) esta actividad puede ser selectiva para tipos celulares que sobreexpresan p185^{HER2}.

Análisis

El muMAb4D5 es potencialmente útil para la terapia humana, puesto que es citostático contra las líneas tumorales de mama y de ovario humanas que sobreexpresan la tirosina-quinasa de tipo receptor p185^{HER2} codificada por HER2. Puesto que ambos carcinomas de mama y de ovario son enfermedades crónicas, se anticipa que la molécula variante de MAb4D5 óptima para la terapia tendrá una baja inmunogenicidad y será citotóxica, en lugar de tener un efecto sólo citostático. La humanización de huMAb4D5 debe alcanzar estos objetivos. Los inventores han identificado 5 variantes de huMAb4D5 diferentes que se unen con fuerza al ECD de p185^{HER2} (K_{d} \leq 1 nM) y que tienen una significativa actividad antiproliferativa (tabla 3). Además, el huMAb4D5-8, pero no el muMAb4D5, media en la ADCC contra líneas celulares tumorales humanas que sobreexpresan p185^{HER2} en presencia de células efectoras humanas (tabla 4), según se anticipa para un isotipo \gamma1 humano (Brüggemann, M. et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987); Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988)).

La rápida humanización de huMAb4D5 fue facilitada por la estrategia de mutagénesis de conversión de genes desarrollada en la presente, utilizando oligonucleótidos largos preensamblados. Este método requiere menos de la mitad del DNA sintético que la síntesis génica total, y no requiere sitios de restricción convenientes en el DNA diana. El método de los inventores parece más sencillo y más fiable que un protocolo variante indicado recientemente (Rostapshov, V.M. et al., FEBS Lett., 249:379-382 (1989)). La expresión transitoria de huMAb4D5 en células 293 de riñón embriónico humanas permite el aislamiento de unos cuantos cientos de microgramos de variantes de huMAb4D5 para la caracterización rápida mediante ensayos de inhibición del crecimiento y de afinidad de unión al antígeno. Además, diferentes combinacione de cadenas ligera y pesada se ensayan con rapidez mediante cotransfección de los correspondientes vectores de expresión de cDNA.

El papel crucial de la formación de modelos moleculares en la humanización de muMAb4D5 se ilustra mediante el variante huMAb4D5-8 diseñado, que se une al ECD de p185^{HER2} con 250 veces más fuerza que el simple variante de intercambio de bucle de CDR, huMAb4D5-1. Se ha demostrado previamente que la afinidad de unión al antígeno de un anticuerpo humanizado puede aumentarse mediante mutagénesis basada en la formación de modelos moleculares (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)). En la presente se ha extendido este trabajo previo realizado por otros con un anticuerpo humanizado diseñado que se une al antígeno con 3 veces más de fuerza que el anticuerpo de roedor progenitor. Aunque este resultado es gratificante, la evaluación del éxito de la formación de modelos moleculares debe esperar el resultado de la determinación de la estructura mediante rayos X. A partir del análisis de variantes de huMAb4D5 (tabla 3) es evidente que su actividad antiproliferativa no es una simple función de su afinidad de unión por el EDC de p185^{HER2}. Por ejemplo, el variante huMAb4D5-8 une p185^{HER2} con 3 veces más fuerza que muMAb4D5, pero el variante humanizado es ligeramente menos potente para bloquear la proliferación de las células SK-BR-3. Otros variantes de huMAb4D5 se están construyendo en la actualidad en un intento para identificar restos que disparen la actividad antiproliferativa y en un intento para potenciar esta actividad.

Además de mantener la unión fuerte al receptor y la capacidad para inhibir el crecimiento celular, el huMAb4D5-8 también confiere una función inmunológica secundaria (ADCC). Esto permite una actividad citotóxica directa de la molécula humanizada en presencia de células efectoras humanas. La aparente selectividad de la actividad citotóxica para los tipos celulares que sobreexpresan p185^{HER2} permite la evolución de un enfoque clínico sencillo para los cánceres humanos caracterizados por la sobreexpresión del protooncogén HER2.

TABLA 3 Afinidad de unión por el ECD de p185^{HER2} y actividades antiproliferativas de variantes de MAb4D5

	Resto V_{H}*	Resto V_{L}*
	71	73	78	93	102	55	66
Variante de	FR3	FR3	FR3	FR3	CDR3	CDR2	FR3	K_{d}^{1}	Prolifer.
de MAb4D5								nm	celular
									relativa^{2}
huMAb4D5-1	R	D	L	A	V	E	G	25	102
huMAb4D5-2	Ala	D	L	A	V	E	G	4,7	101
huMAb4D5-3	Ala	Thr	Ala	Ser	V	E	G	4,4	66
huMAb4D5-4	Ala	Thr	L	Ser	V	E	Arg	0,82	56
huMAb4D5-5	Ala	Thr	Ala	Ser	V	E	Arg	1,1	48
huMAb4D5-6	Ala	Thr	Ala	Ser	V	Tyr	Arg	0,22	51
huMAb4D5-7	Ala	Thr	Ala	Ser	Tyr	E	Arg	0,62	53
huMAb4D5-8	Ala	Thr	Ala	Ser	Tyr	Tyr	Arg	0,10	54
muMAb4D5	Ala	Thr	Ala	Ser	Tyr	Tyr	Arg	0,30	37

* Los restos humanos y murinos se muestran con el código de aminoácidos de una letra y de tres letras, respectivamente.

^{1} Los valores de K_{d} para el ECD de p185^{HER2} se determinaron utilizando el método de Friguet et al. (43), y se estimó que el error estándar de cada estimación es \leq \pm 10%.

^{2} La proliferación de células SK-BR-3 incubadas durante 96 horas con variantes de MAb4D5 se muestra como el porcentaje del control sin tratar según se describe (Hudziak, R.M. et al., Molec. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989)). Los datos representan el máximo efecto antiproliferativo para cada variante (véase la figura 3A) calculado como la media de las determinaciones por triplicado con una concentración de MAb4D5 de 8 \mug/ml. Todos los datos se toman del mismo experimento, con un error estándar estimado de \leq \pm 15%.

TABLA 4 Selectividad de la citotoxicidad de células tumorales dependiente de anticuerpos mediada por huMAb4D5-8

	Razón efector:	WI-38*	SK-BR-3
	diana^{1}	muMAb4D5	huMAb4D5-8	muMAb4D5	huMAb4D5-8
A.^{2}	25:1	<1,0	9,3	7,5	40,6
	12,5:1	<1,0	11,1	4,7	36,8
	6,25:1	<1,0	8,9	0,9	35,2
	3,13:1	<1,0	8,5	4,6	19,6
B.	25:1	<1,0	3,1	6,1	33,4
	12,5:1	<1,0	1,7	5,5	26,2
	6,25:1	1,3	2,2	2,0	21,0
	3,13:1	<1,0	0,8	2,4	13,4

* Se compara la sensibilidad frente a ADCC de dos líneas celulares humanas (WI-38, epitelio pulmonar normal; y SK-BR-3, línea celular tumoral de mama humana). WI-38 expresa un nivel bajo de p185^{HER2} (0,6 pg por \mug de proteína celular) y SK-BR-3 expresa un nivel elevado de p185^{HER2} (64 pg de p185^{HER2} por \mug de proteína celular), según se determina mediante ELISA (Fendly et al., J. Biol. Resp. Med., 9:449-455 (1990)).

^{1} Los ensayos de ADCC se realizaron como se describe en Brüggemann et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987). Las razones entre efector a diana eran de linfocitos de sangre periférica humana activada con IL-2 a fibroblastos WI-38 o células tumorales SK-BR-3 en placas de microvaloración de 96 pocillos durante 4 horas a 37ºC. Los valores dados representan el porcentaje de lisis celular específica según se determina mediante la liberación de ^{51}C. El error estándar estimado en estas determinaciones por cuadruplicado es \leq \pm 10%.

^{2} Las concentraciones de anticuerpos monoclonales utilizadas fueron 0,1 \mug/ml (A) y 0,1 \mug/ml (B).

Ejemplo 2 Modificación de un fragmento biespecífico F(ab')_{2} humanizado

Este ejemplo demuestra la construcción de un anticuerpo biespecífico humanizado (BsF(ab')_{2}v1) mediante la expresión por separado en E. coli de cada brazo Fab', seguido del acoplamiento químico dirigido in vitro. Se demostró que BsF(ab')_{2}v1 (anti-CD3/anti-p185^{HER2}) redirige la actividad citotóxica de CD3^{+}CTL in vitro contra la línea celular de tumor de mama humana, SK-BR-3, que sobreexpresa el producto p185^{HER2} del protooncogén HER2. Este ejemplo demuestra la estrategia de humanización minimalista de instalar los menos restos murinos posibles en un anticuerpo humano para reclutar una afinidad de unión al antígeno y unas propiedades biológicas comparables a las del anticuerpo progenitor murino. Esta estrategia resultó muy acertada para el brazo anti-p185^{HER2} de BsF(ab')_{2}v1. Por contraste, BsF(ab')_{2}v1 se une a células T a través de su brazo anti-CD3 de forma mucho menos eficaz que el BsF(ab')_{2} quimérico, que contiene los dominios variables del anticuerpo anti-CD3 progenitor murino. Los inventores han construido otros fragmentos BsF(ab')_{2} que contienen brazos anti-CD3 variantes con restos murinos seleccionados restaurados para intentar mejorar la unión del anticuerpo a las células T. Uno de estos variantes, BsF(ab')_{2}v9, se creó sustituyendo seis restos en el segundo bucle hipervariable del dominio variable de cadena pesada de anti-CD3 de BsF(ab')_{2}v1 con sus homólogos procedentes del anticuerpo anti-CD3 progenitor murino. El BsF(ab')_{2}v9 se une a las células T (Jurkat) de forma mucho más eficaz que el BsF(ab')_{2}v1, y de forma casi tan eficaz como el BsF(ab')_{2} quimérico. Esta mejora en la eficacia de unión a las células T del BsF(ab')_{2} humanizado es una etapa importante en su desarrollo como agente terapéutico potencial para el tratamiento de cánceres que sobreexpresan p185^{HER2}.

Los anticuerpos biespecíficos (BsAb) con especificidades para antígenos asociados a tumores y marcadores de superficie sobre células efectoras inmunológicas han demostrado ser eficaces para redirigir las células efectoras para destruir dianas tumorales in vitro e in vivo (indicado por Fanger, M.W. et al., Immunol. Today, 10:92-99 (1989); Fanger, M.W. et al., Immunol. Today, 12:51-54 (1991); y Nelson, H., Cancer Cells, 3:163-172 (1991)). Los fragmentos BsF(ab')_{2} a menudo se han utilizado con preferencia a BsAb intactos en la citotoxicidad celular redirigida para evitar el riesgo de destruir células circunstantes inocentes que se unen a la región Fc del anticuerpo. Otra ventaja de los BsF(ab')_{2} frente a los BsAb intactos es que, en general, son mucho más sencillos de preparar sin moléculas monoespecíficas contaminantes (indicado por Songsivilai, S. y Lachmann, P.J., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990), y Nolan, O. y O'Kennedy, R., Biochim. Biophys. Acta, 1040:1-11 (1990)).

Los fragmentos BsF(ab')_{2} se construyen, de forma tradicional, mediante acoplamiento químico dirigido de fragmentos Fab' obtenidos mediante proteolisis limitada más reducción suave del Ab monoclonal de roedor progenitor (Brennan, M. et al., Science, 229:81-83 (1985); y Glennie, M.J. et al., J. Immunol., 139:2367-2375 (1987)). Se descubrió que uno de estos fragmentos BsF(ab')_{2} (antígeno asociado antiglioma/anti-CD3) tenía eficacia clínica en pacientes con glioma (Nitta, T. et al., Lancet, 335:368-371 (1990), y otro BsF(ab')_{2} (quelato antiindio/antígeno anticarcinoembriónico) permite la formación de imágenes clínicas de carcinoma colorrectal (Stickney, D.R. et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm., 2:1-13 (1989)). Es probable que los BsF(ab')_{2} futuros destinados a aplicaciones clínicas se construyan a partir de anticuerpos que son humanos o al menos "humanizados" (Riechmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988)) para reducir su inmunogenicidad (Hale, G. et al., Lancet, i:1394-1399 (1988)).

En fechas recientes se ha demostrado una ruta fácil para un fragmento BsF(ab')_{2} totalmente humanizado diseñado para la inmunoterapia tumoral (Shalaby, M.R. et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)). Este enfoque implica la expresión separada en E. coli de cada brazo Fab', seguido del acoplamiento químico dirigido tradicional in vitro para formar el BsF(ab')_{2}. Un brazo de BsF(ab')_{2} es una versión humanizada (Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992a); y Carter, P. et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992b)) del Ab monoclonal murino 4D5, que está dirigido contra el producto p185^{HER2} del protooncogén HER2 (c-erbB-2) (Fendly, B.M. et al., Cancer Res., 50:1550-1558 (1989)). La humanización del anticuerpo 4D5 se muestra en el ejemplo 1 de esta solicitud. El segundo brazo es un anticuerpo anti-CD3 mínimamente humanizado (Shalaby et al., supra), que se creó instalando los bucles CDR de los dominios variables del Ab monoclonal progenitor murino UCHT1 (Beverley, P.C.L. y Callard, R.E., Eur. J. Immunol., 11:329-334 (1981)) en el anticuerpo humanizado anti-p185^{HER2}. Se demostró que el fragmento BsF(ab')_{2} que contiene el variante humanizado anti-CD3 más potente (v1), mediante citometría de flujo, se unía de forma específica a una diana tumoral que sobreexpresa p185^{HER2}, y a células mononucleares de sangre periférica humana que portan CD3. Además, BsF(ab')_{2}v1 potencia los efectos citotóxicos de CTL humano activado en 4 veces contra células tumorales SK-BR-3 que sobreexpresan p185^{HER2}. El ejemplo describe los esfuerzos para mejorar la afinidad de unión al antígeno del brazo anti-CD3 humanizado mediante el reclutamiento acertado de un pequeño número de otros restos murinos en los dominios variables anti-CD3 mínimamente humanizados.

Materiales y métodos Construcción de mutaciones en los genes de la región variable anti-CD3

Se ha descrito la construcción de genes que codifican los dominios de cadena ligera (V_{L}) y pesada (V_{H}) variables del variante 1 (v1) anti-CD3 humanizados en el fágmido pUC119 (Shalaby et al., supra). Se generaron otros variantes anti-CD3 utilizando un método de mutagénesis específica dirigida a sitio eficaz (Carter, P., Mutagenesis: a practical approach (M. J. McPherson, ed.), capítulo 1, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1991)) utilizando oligonucleótidos desapareados que instalan o eliminan sitios de restricción exclusivos. Los oligonucleótidos utilizados se listan a continuación, utilizando minúsculas para indicar mutaciones dirigidas. Los cambios correspondientes en la codificación se indican mediante el aminoácido inicial en un código de una letra, seguido por el resto numerado según Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EEUU (1991), después el aminoácido sustituido y, por último, la identidad del variante anti-CD3:

HX11, 5' GTAGATAAATCCtctAACACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ. ID. NO:11), V_{H} K75S, v6;

HX12, 5' GTAGATAAATCCAAAtctACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ. ID. NO:12), V_{H} N76S, v7;

HX13, 5' GTAGATAAATCCtcttctACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ. ID. NO:13), V_{H} K75S:N76S, v8;

X14, 5' CTTATAAAGGTGTTtCcACCTATaaCcAgAaatTCAAGGatCGTTT

CACgATAtcCGTAGATAAATCC 3' (SEQ. ID. NO:14), V_{H} T57S:A60N:D61Q:S26K:V63F:G65D, v9;

LX6, 5' CTATACCTCCCGTCTgcatTCTGGAGTCCC 3' (SEQ. ID. NO:15), V_{L} E55H, v11.

Los oligonucleótidos HX11, HX12 y HX13 eliminan cada uno un sitio para BspMI, mientras que LX6 elimina un sitio para XhoI, y HX14 instala un sitio para EcoRV (negrita). El variante v10 anti-CD3 se construyó a partir de V9 mediante mutagénesis específica dirigida a sitio utilizando el oligonucleótido HX13. Los mutantes se verificaron mediante secuenciación de didesoxinucleótidos (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)).

Expresión en E. coli de fragmentos Fab'

El plásmido de expresión pAK19 para la cosecreción del fragmento Fd' de cadena ligera y cadena pesada del variante humanizado más preferido anti-p185^{HER2}, HuMAb4D5-8, se describe en Carter et al., 1992b, supra. Brevemente, la unidad de expresión de Fab' es bicistrónica con ambas cadenas bajo el control transcripcional del promotor phoA. Los genes que codifican los dominios V_{L} y V_{H} humanizados se condensan con precisión en su extremo 5' con un segmento génico que codifica la secuencia señal de enterotoxina II estable frente al calor, y en su extremo 3' con los genes del dominio constante humanos k_{1} C_{L} e IgG1 C_{H}1, respectivamente. Al gen C_{H}1 le sigue inmediatamente una secuencia que codifica la secuencia bisagra CysAlaAla, y le sigue un fin de la transcripción de bacteriófago \lambda t_{0}. Los plásmidos de expresión de Fab' para los variantes anti-CD3 quiméricos y humanizados (v1 a v4, Shalaby et al., supra; v6 a v12 en este estudio) se crearon a partir de pAK19 mediante la sustitución precisa de los segmentos génicos de V_{L} y V_{H} anti-p185^{HER2} por los que codifican los variantes murinos y humanizados correspondientes del anticuerpo anti-CD3, respectivamente, mediante subclonación y mutagénesis específica dirigida a sitio. El plásmido de expresión de Fab' para el variante anti-CD3 humanizado más potente identificado en este estudio (v9) se denomina pAK22. El fragmento Fab' anti-p185^{HER2} se segregó a partir de la cepa 25F2 de E. coli K12 que contiene el plásmido pAK19 cultivado durante 32 a 40 horas a 37ºC en un fermentador de 10 litros aireado. La densidad celular final era 120-150 DO_{550}, y la valoración del Fab' anti-p185^{HER2} soluble y funcional es 1-2 g/litros según ELISA de unión al antígeno (Carter et al., 1992b, supra). Los variantes de Fab' anti-CD3 se segregaron a partir de E. coli que contenía los plásmidos de expresión correspondientes utilizando protocolos de fermentación muy similares. Las mayores valoraciones de expresión de los variantes anti-CD3 quiméricos y humanizados eran 200 mg/litro y 700 mg/litro, respectivamente, según ELISA de inmunoglobulinas totales.

Construcción de fragmentos BsF(ab')_{2}

Los fragmentos Fab' se recuperaron directamente de pastas de fermentación de E. coli, en la forma de tiol libre (Fab'-SH) mediante purificación por afinidad sobre la proteína G de Streptococcus a pH 5 en presencia de EDTA (Carter et al., 1992b, supra). Los fragmentos BsF(ab')_{2} unidos mediante tioéter (anti-p185^{HER2}/anti-CD3) se construyeron mediante el procedimiento de Glennie et al., supra, con las siguientes modificaciones. El Fab'-SH anti-p185^{HER2} en Tris-acetato 100 mM, EDTA 5 mM (pH 5,0) se hizo reaccionar con 0,1 volúmenes de N,N'-1,2-fenilendimalemida (o-PDM) 40 mM en dimetilformamida durante aproximadamente 1,5 horas a 20ºC. El exceso de o-PDM se eliminó mediante purificación en proteína G del derivado de maleimida de Fab' (Fab'-mal), seguido de un intercambio de tampón en acetato de sodio 20 mM, EDTA 5 mM (pH 5,3) (tampón de acoplamiento) utilizando concentradores Centriprep-30 (Amicon). La concentración total de los variantes Fab' se estimó a partir de la absorbancia medida a 280 nM (HuMAb3D5-8 Fab' e^{0,1%} = 1,56, Carter et al., 1992b, supra). El contenido en tiol libre de las preparaciones Fab' se estimó mediante reacción con 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), según se describe en Creighton, T.E., Protein structure: a practical approach (T.E. Creighton, ed.), capítulo 7, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1990). Cantidades equimolares de Fab'-mal anti-p185^{HER2} (suponiendo una reacción cuantitativa de Fab'-SH con o-PDM) y cada variante Fab'-SH anti-CD3 se acoplaron a una concentración combinada de 1 a 2,5 mg/ml en el tampón de acoplamiento durante 14 a 48 horas a 4ºC. La reacción de acoplamiento se ajustó a cisteína 4 mM a pH 7,0 y se incubó durante 15 minutos a 20ºC para reducir cualquier F(ab')_{2} unido mediante enlace disulfuro no deseado que se hubiera formado. Estas condiciones de reducción son suficientes para reducir los enlaces disulfuro dentro de la cadena pesada sin apenas reducción del enlace disulfuro entre las cadenas ligera y pesada. Cualquier tiol libre generado entonces se bloquea con yodoacetamida 50 mM. El BsF(ab')_{2} se aisló de la reacción de acoplamiento mediante cromatografía de exclusión de tamaño S100-HR (Pharmacia) (2,5 cm x 100 cm) en presencia de PBS. Las muestras BsF(ab')_{2} se hicieron pasar a través de un filtro de 0,2 mm, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se conservaron a -70ºC.

Otros variantes creados combinando mutaciones en estos tres sitios se describen a continuación.

Preparación de fragmentos de BsF(ab')_{2}

Se recuperaron fragmentos Fab' anti-CD3 y anti-p185^{HER2} solubles y funcionales directamente de las correspondientes pastas de fermentación de E. coli con la única cisteína bisagra predominantemente en la forma de tiol libre (Fab'-SH al 75-100%) mediante purificación por afinidad sobre proteína G de Streptococcus a pH 5 en presencia de EDTA (Carter et al., 1992b, supra). Se construyeron entonces los fragmentos de BsF(ab')_{2} unidos mediante tioéter mediante acoplamiento dirigido utilizando o-PDM según se describe en Glennie et al., supra. Un brazo siempre es el variante anti-p185^{HER2} humanizado más potente, HuMAb4D5-8 (Carter et al., 1992a, supra), y el otro es un variante quimérico o humanizado del anticuerpo anti-CD3. El Fab'-SH anti-p185^{HER2} se hizo reaccionar con o-PDM para formar el derivado de maleimida (Fab'-mal), y después se acopló al Fab'-SH en cada variante anti-CD3. Entonces se purificó el F(ab')_{2} del Fab' sin reaccionar mediante cromatografía de exclusión de tamaño, según se muestra para una preparación representativa (BsF(ab')_{2} v8) en datos que no aparecen. El fragmento F(ab')_{2} representa aproximadamente 54% de la cantidad total de fragmentos de anticuerpos (en masa) según la integración de los picos del cromatograma.

El análisis de SDS-PAGE de esta preparación de BsF(ab')_{2} v8 bajo condiciones no reductoras produce una banda principal con la movilidad esperada (M_{r} aproximadamente 96 kD), así como varias bandas muy minoritarias (los datos no aparecen). El análisis de la secuencia amino-terminal de la banda principal después de una electrotransferencia sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (Matsudaira, P., J. Biol. Chem., 262:10035-10038 (1987)) produjo la secuencia mixta esperada a partir de una mezcla estequiométrica 1:1 de cadenas ligeras y pesadas (V_{L}/V_{H}: D/E, I/V, Q/Q, M/L, T/V, Q/E, S/S), esperada para BsF(ab')_{2}. La región amino-terminal de ambas cadenas ligeras es idéntica, al igual que ambas cadenas pesadas, y se corresponde con las secuencias de FR humanas consenso. Los inventores han demostrado previamente que F(ab')_{2} construido mediante acoplamiento químico dirigido porta ambas especificidades de antígeno anti-p185^{HER2} y anti-CD3 (Shalaby et al., supra). El nivel de contaminación de BsF(ab')_{2} con F(ab')_{2} monoespecífico es probable que sea muy bajo puesto que reacciones de acoplamiento simuladas con Fab'-mal anti-p185^{HER2} o Fab'-SH anti-CD3 por sí solos no producen cantidades detectables de F(ab')_{2}. Además, la reacción de acoplamiento se sometió a una etapa de reducción suave, seguida de una alquilación para eliminar cantidades traza de F(ab')_{2} unido mediante enlace disulfuro que puedan estar presentes. Una SDS-PAGE del F(ab')_{2} purificado bajo condiciones reductoras produce dos bandas principales con la movilidad electroforética y secuencia amino-terminal anticipadas para la cadena ligera libre y los dímeros de cadena pesada unida mediante tioéter.

Una densitometría de barrido de láser de una preparación de F(ab')_{2} acoplada con o-PDM sugiere que las especies minoritarias juntas representan aproximadamente 10% de la proteína. Estos contaminantes minoritarios se caracterizaron mediante análisis de la secuencia amino-terminal y se identificaron provisionalmente basándose en la estequiometría de las secuencias de la cadena ligera y pesada, y su movilidad electroforética (los datos no aparecen). Estos datos son coherentes con los contaminantes minoritarios, que incluyen F(ab')_{2} imperfectos en los que falta el enlace disulfuro entre las cadenas ligera y pesada en uno o ambos brazos, las cantidades traza de Fab', y una cadena pesada unida mediante tioéter a una cadena ligara.

Unión de BsF(ab')_{2} a células Jurkat

La unión de BsF(ab')_{2} que contiene diferentes variantes anti-CD3 a células Jurkat (leucemia de células T aguda humana) se investigó mediante citometría de flujo (los datos no aparecen). El BsF(ab')_{2} v9 se une con más eficacia a las células Jurkat que la molécula progenitora, BsF(ab')_{2} v1, y casi con tanta eficacia como el BsF(ab')_{2} quimérico. La instalación de otros restos murinos en anti-CD3 v9 para crear v10 (V_{H} K75S:N76S) y v12 (V_{H} K75S:N76S más V_{L} E55H) no mejoró la unión del BsF(ab')_{2} correspondiente a las células Jurkat. El reclutamiento de estos restos murinos en anti-CD3 v1 tampoco mejoró la unión a las células Jurkat: V_{H} K75S (v6), V_{H} N76S (v7), V_{H} K75S:N76S (v8), V_{L} E55H (v11) (no aparecen). Se eligió el BsF(ab')_{2} para su posterior estudio, puesto que es de los variantes más eficaces para unirse a las células Jurkat y contiene menos restos murinos en el brazo humanizado anti-CD3. Un F(ab')_{2} anti-p185^{HER2} monoespecífico no mostró una unión significativa a las células Jurkat, lo cual resulta coherente con que la interacción está mediada a través del brazo anti-CD3.

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Análisis

Se eligió una estrategia minimalista para humanizar el brazo anti-p185^{HER2} (Carter et al., 1992a, supra) y anti-CD3 (Shalaby et al., supra) del BsF(ab')_{2} en este estudio en un intento para minimizar la inmunogenicidad potencial del anticuerpo humanizado resultante en la aplicación clínica. Por tanto, se intentó instalar el número mínimo de restos de CDR y FR murinos en el contexto de las secuencias del dominio variable humano consenso, según se requiere para reclutar una afinidad de unión al antígeno y unas propiedades biológicas comparables con el anticuerpo progenitor murino. En primer lugar se utilizó la formación de modelos moleculares para predecir los restos de FR que puedan ser importantes para la unión al antígeno y, en segundo lugar, para predecir los restos de CDR murinos que puedan no ser requeridos. Entonces se construyó un pequeño número de variantes humanizados para ensayar estas predicciones.

La estrategia de humanización de los inventores tuvo mucho éxito para el anticuerpo anti-p185^{HER2}, en la que se identificó que uno de ocho variantes humanizados (HuMAb4D5-8, IgG1) se unía al antígeno p185^{HER2} con aproximadamente 3 veces más fuerza que el anticuerpo murino progenitor (Carter et al., 1992a, supra). El HuMAb4D5-8 contiene un total de cinco restos de FR murinos y nueve restos de CDR murinos, incluyendo los restos 60-65 de V_{H} de CDR2, que fueron descartados a favor de sus homólogos humanos. Por contraste, BsF(ab')_{2} v1, que contiene el variante anti-CD3 humanizado más potente de los cuatro que se construyeron en origen (Shalaby et al., supra) se une a las células J6 con una afinidad (K_{d}) de 140 nM que es aproximadamente 70 veces más débil que la del correspondiente BsF(ab')_{2} quimérico.

En la presente se ha restaurado la unión a las células T del anti-CD3 humanizado cerca del variante quimérico sustituyendo seis restos humanos en V_{H} CDR2 por sus homólgos murinos: T57S:A60N:D61Q:S62K:V63F:G65D (anti-CD3 v9, figura 5). Parece más probable que estos restos murinos potencien la unión al antígeno indirectamente influyendo en la conformación de los restos en la parte N-terminal de V_{H} CDR2, en lugar de ponerse en contacto directamente con el antígeno. En primer lugar, se ha descubierto que sólo los restos N-terminales de V_{H} CDR2 (50-58) se ponen en contacto con el antígeno en una o más de ocho estructuras cristalográficas de complejos de antígeno/anticuerpo (Kabat et al., supra; y Mian, I.S. et al., J. Mol. Biol., 217:133-151 (1991), figura 5). En segundo lugar, la formación de modelos moleculares sugiere que los restos en la parte C-terminal de V_{H} CDR2 están al menos parcialmente enterrados (figura 5). El BsF(ab')_{2} v9 se une a las células de tumor de mama SK-BR-3 con igual eficacia que BsF(ab')_{2} v1 y el BsF(ab')_{2} quimérico, según se anticipó, puesto que el brazo anti-185^{HER2} es idéntico en todo a estas moléculas (Shalaby et al., supra, no se muestra).

El nuevo enfoque de los inventores a la construcción de fragmentos BsF(ab')_{2} utiliza un sistema de expresión de E. coli que segrega fragmentos Fab' humanizados con una valoración de gramo por litro, y permite su recuperación directa como Fab'-SH (Carter et al., 1992b, supra). El acoplamiento químico dirigido tradicional de los fragmentos Fab'-SH se utiliza entonces para formar BsF(ab')_{2} in vitro (Brennan et al., supra; y Glennie et al., supra). Esta vía para obtener Fab'-SH obvia los problemas que son inherentes a su generación a partir de anticuerpos intactos: las diferencias en la susceptibilidad hacia la proteolisis y la ruptura no específica que producen una heterogeneidad, un bajo rendimiento, así como una reducción parcial que no es completamente selectiva para los enlaces disulfuro bisagra. La estrategia de utilizar Fab'-SH derivado de E. coli que contiene una única cisteína bisagra suprime algunas fuentes de heterogeneidad en la preparación de BsF(ab')_{2}, como la formación de enlaces disulfuro intra-bisagra y la contaminación con el anticuerpo progenitor intacto, mientras que disminuye en gran medida otras fuentes, por ejemplo, la formación de fragmentos F(ab')_{2}.

Los fragmentos BsF(ab')_{2} construidos en la presente están unidos mediante tioéter, como se describió originariamente en Glennie et al., supra, teniendo en cuenta el ensayo in vivo futuro de estas moléculas. Los enlaces tioéter, a diferencia de los enlaces disulfuro, no son susceptibles a la ruptura por cantidades traza de tiol, que conducen a la proposición de que F(ab')_{2} unido mediante tioéter puede ser más estable que F(ab')_{2} unido mediante disulfuro in vivo (Glennie et al., supra). Esta hipótesis está apoyada por los experimentos farmacocinéticos preliminares realizados por los inventores en ratones normales, que sugieren que BsF(ab')_{2} v1 unido mediante tioéter tiene un tiempo de residencia plasmático 3 veces más largo que BsF(ab')_{2} v1 unido mediante un único enlace disulfuro. Se descubrió que los BsF(ab')_{2} quiméricos unidos mediante disulfuro y tioéter eran indistinguibles en su eficacia de unión celular y para redirigir la citotoxicidad de CTL, lo cual sugiere que el acoplamiento dirigido con o-PDM no compromete la unión de BsF(ab')_{2} a cualquier antígeno (no se muestra). No obstante, la naturaleza del enlace no parece ser crítica, puesto que un BsF(ab')_{2} unido mediante disulfuro (anti-p185^{HER2} murino/anti-CD3 murino), ha demostrado en fechas recientes (Nishimura et al., Int. J. Cancer, 50:800-804 (1992)) tener una potente actividad antitumoral en ratones "nude". El estudio previo de los inventores (Shalaby et al., supra), junto con éste y el de Nishimura, T. et al., supra, mejora el potencial para utilizar BsF(ab')_{2} en inmunoterapia dirigida de cánceres que sobreexpresan p185^{HER2} en humanos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de inmunoglobulinas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: disquete de 360 kb, de 13,3 cm

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/715272

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 junio, 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Adler, Carolyn R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.324

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 709P1

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 415/225-2614

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(B)

TELEFAX: 415/952-9881

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(C)

TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

2

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

5

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCCGATATCC AGCTGACCCA GTCTCCA

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTTGATCTC CAGCTTGGTA CCXXCXCCGA A

\hfill

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGTXXAXCT GCAGXAGTCX GG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CCAG

\hfill

34

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTAGATAAAT CCTCTAACAC AGCCTATCTG CAAATG

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTAGATAAAT CCAAATCTAC AGCCTATCTG CAAATG

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTAGATAAAT CCTCTTCTAC AGCCTATCTG CAAATG

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 68 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTTATAAAGG TGTTTCCACC TATAACCAGA AATTCAAGGA TCGTTTCACG

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATATCCGTAG ATAAATCC

\hfill

68

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTATACCTCC CGTCTGCATT CTGGAGTCCC

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 129 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

14

15

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 454 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

17

18

Claims (15)

1. Un polipéptido que comprende la siguiente secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT.

2. Un polipéptido que comprende la siguiente secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

3. Un anticuerpo humanizado que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia polipeptídica según la reivindicación 1, y un dominio V_{H} que comprende la secuencia polipeptídica según la reivindicación 2.

4. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DDSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

5. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

6. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

7. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

8. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSS.

9. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS.

10. Un anticuerpo humanizado, que comprende un dominio V_{L} que comprende la secuencia:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLT
ISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT;

y un dominio V_{H} que comprende la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA
DTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS.

11. Una inmunotoxina, que comprende un conjugado de un anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, y un resto citotóxico.

12. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, un anticuerpo humanizado o una inmunotoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un polipéptido, un anticuerpo humanizado o una inmunotoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para usar como un producto farmacéutico.

14. El uso de un polipéptido, un anticuerpo humanizado o una inmunotoxina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la fabricación de un medicamento.

15. El uso de un anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en ensayos de diagnóstico, con la condición de que el ensayo no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.